Chemokine en inflammatoire cytokine-veranderingen gedurende de heling van chronische wonden. DAVID P FIVENSON, MD; DUYEN T. FARIA, DO; BRIAN J. NICKOLOFF, MD, PHD; PETER J. POVERINI, DDS; STEVEN KUNKEL, PHD; MARIE BURDICK, MS; ROBERT M. STRIETER, MD
Annemie Viane Wondheling is een complex proces dat het resultaat is van een samenspel van processen zoals coagulatie, inflammatie, angiogenese en epithelialisatie. Er werd aangetoond dat in de familie van de chemokines leden zitten die krachtige regulatoren zijn van vele van deze paden. Omdat we eerder aangetoond hebben dat chemokines verblijven in biologische wondverbanden, bestudeerden we de concentraties van CXC- en CC -chemokines, tesamen met inflammatoire sleutelmediatoren, bij een groep patiënten die behandeld werden voor chronische veneuze beenulcera (CVIU). Na 8 weken vertoonden alle patiënten een opmerkelijke klinische heling van hun ulcera ( gemiddeld 63,3% vermindering van grootte ), en 2 op de 10 patiënten waren volledig genezen. In het wondvocht dat uit de verbanden gehaald werd, zaten hoge concentraties van Plaatjesfaktor-4 en Interferon-χgeïnduceerd proteïne, met een neiging tot stijgen in de verhouding van de som van de angiogene versus de angiostatische CXC -chemokines (p=0,082) in de weefsels gehaald uit het midden van de ulcera tijdens het sluiten van de wonde. Neutrofiel-activerende-peptide-2 en Interleukine-8 stonden in voor de meeste veranderingen in angiogene chemokines van het wondvocht, met significante verschillen zowel in vergelijking met basisniveaus als met plasmaniveau van de patiënt, en vastgesteld op verschillende tijdstippen tussen week 0 en week 8. Het gehalte van angiostatische chemokines, Interferon- χ geïnduceerd proteïne 10 en Plaatjes-aktiverende-faktor-4, daalde het meest significant tussen week 0 en week 3, in vergelijking met plasma niveaus. De vastgestelde shift naar angiogene CXC chemokines suggereert dat effectieve heling van CVIU waarschijnlijk het ulcusbed ‘beweegt’ naar een toestand die meer leidt naar epithelialisatie, wat karakteristiek is voor de proliferatieve faze van de wondheling. In de stalen van het wondvocht waren CC -chemokines ook gestegen van bij het begin, als we het vergeleken met het niveau in het vooruitgang van patiëntenplasma. Macrofage inflammatoire proteïne-1ß -(MIP-1β) en Gereguleerd op aktivatie, normale t uitgedrukte en gesekreteerde (RANTES)- niveaus daalden tijdens de heling, terwijl er significante stijgingen waren in het weefselgehalte van Monocyt-chemoattractieve-proteïne-1α (MCP-1α) gedurende de eerste 4 weken van de behandeling (p ≤0,05 voor beiden). Toevallig was er met deze veranderingen ook een gestage verhoging in de ratio van Interleukin-1β/Interleukin-1-receptor -antagonist -proteïne (IRAP) in de weefsels van het ulcuscentrum, wat ook verband hield met de genezing (p<0,05) in vergelijking met een dalende ratio in de wondrand, en een bifasische respons in de wondvochten. Deze bevindingen suggereren dat geavanceerde wondzorgtechnieken het ulcus helpen veranderen van een chronische inflammatoire toestand naar een toestand die meer karakteristiek is voor de laatinflammatoire /vroeg-proliferatieve faze van de wondheling. Chemokines kunnen een kritische rol spelen in de pathogenese van chronische veneuze ulcera, door hun invloed op angiogenese en/of de inflammatoire reakties in de zone van de verwonding. (WOUND REP REG 1997 ;5 :310-22)
Normale wondheling sluit een gecoördineerd samenspel in van cellen, extracellulaire matrix, en een steeds uitbreidende lijst van mediatoren. De cellulaire fysiologie van de wondheling omvat de gecoördineerde stimulatie van bloedvatgroei (angiogenese), proliferatie van keratinocyten en
fibroblasten, produktie van epitheliale en endotheliale zones van het basaal membraan, en bindweefsels (vb collagenen, grondstof). 1-4. In de huid zijn er 3 goed te herkennen fasen van wondheling : de inflammatoire fase, de weefselformatie of proliferatieve fase en de weefselremodelleringsfase. Hoewel deze fasen niet noodzakelijk wederkerig exclusief zijn, zijn ze iets of wat te onderscheiden en laten ze de onderzoeker toe om met een verstandige aanpak de normale versus de abnormale wondheling te verstaan. Chronische wonden schijnen – tenminste gedeeltelijk – gemedieerd te worden door een slechte werking van de cytokines. 1,2. Sommige onderzoekers suggereerden ook dat niet-heling te wijten is aan een ontwrichting van de preciese coördinatie van de temporale uitdrukking van deze mediatoren, en niet noodzakelijk aan de volledige afwezigheid van 1 bepaalde mediator.7. Eén van de meest alledaagse chronische wonden is de chronische veneus insufficiënte ulcus (CVIU).Bij een onderzoek in 1985, bleek CVIU 500.000 patiënten te treffen en kostte ze de Gezondheidszorg in de US meer dan 250 miljoen dollar per jaar. Bij de potentieel belangrijke mediatorenfamilies die te maken hebben met het orkestreren van effektieve wondheling en bij de mikpunten voor ontregeling in de pathogenese van chronische wonden, horen de chemokines. 6, 8, 9 . Zoals hun naam laat uitschijnen, werden deze faktoren oorspronkelijk beschreven wegens hun belangijke invloeden op de chemotaxie. De chemokines bestaan uit een aantal wel onderscheiden 8- tot 10- kd cytokines die voor 20% tot 55% een overeenkomst vertonen in hun aminozuursekwentie. 8. Alle chemokines hebben 4 cysteïne- resten die 2 disulfide bruggen vormen. Leden van de CXC-chemokine-subfamilie zijn gelokaliseerd op chromosoom 4, en delen 2 in stand gehouden cysteïnes die gescheiden worden door 1 niet-in stand gehouden aminozuur, vandaar de naam C-X-C. Tot deze familie behoren Interleukine-8 (IL -8), Groei-gereguleerd-genprodukt (GROα), Plaatjes-basisch-proteïne en zijn afgescheiden produkten (Bindweefsel-activerend peptide (CTAP-III)), β-thromboglobuline (βTG), Neutrofiel -activerend peptide-2 (NAP 2), Interferon-γteweegbrengende-proteïne (IR10), Epitheliale-neutrofiel-activerende peptide-78 (ENA-78), Granulocyt-chemotactische- proteïne-2 (GCP2), en Monokine-γ-interferon-teweegbrengend gen (MIG). 8-11. IL-8, ENA-78, NAPα, en GROα delen allemaal een Glu-Leu-Arg (ELR) motief dat voorafgaat aan de eerste cysteïne in de N-staart. 8,10.Deze ELR+ CXC-chemokines werden in verband gebracht met een significante angiogenese-funktie in vitro en ook met gedeelde mogelijkheden om zowel de proliferatie als de migratie van de keratinocyten te stimuleren. 11-12. Dit ELR motief ontbreekt bij CXC-chemokines waaronder IP10, MIG, en Plaatjesfactor-4 (PF4) (hier wordt naar verwezen als ELR-CXC-chemokines). Het werd aangetoond dat dit motief angiostatisch is. 12-15. De chemokine- subfamilie van genen zijn gelokaliseerd op chromosoom 17, en hebben aangrenzende bewaarde cysteïne- aminozuurrestanten, vandaar de benaming CC. Deze eiwitten omvatten Monocyt-chemoattractante eiwitten 1 tot 4 (MCP -1 tot –4), Macrofaag-inflammatoire proteïne-1α en –1β (MIP-1α en MIP-1β), Gereguleerd door aktivatie, normaal T uitgedrukte en gesekreteerde (RANTES), en 1-309. Leden van deze subfamilie werden oorspronkelijk beschreven voor hun chemotactische aktiviteit op monocyten en macrofagen.8. De invloeden van CCchemokines werden recent ook uitgebreid tot T-cel-chemotaxis en mitogenese, fibrogenese en controle van HIV-infectie. 10,13,16. Deze chemokines werden ook in verband gebracht met een reeks belangrijke funkties met betrekking tot wondheling. 8,11,17-20. In deze studie onderzochten we de niveaus in weefsel en wondvocht van representatieve proinflammatoire, anti-inflammatoire, en macrofaag-verwante cytokines, samen met representatieve CXC- en CC -chemokines, bij een serie patiënten met CV1U. We meldden dat de angiostatische chemokines PF4 en IP10 abnormaal gestegen zijn, zowel in weefsels als in wondvocht in de aanvangsfase, in vergelijking met normale huidwaarden. Deze ELR-chemokines bleven hoog gedurende een observatieperiode van 8 weken, maar we vonden dat ze daalden naargelang de hoeveelheden ELR+ chemokines die betrekking hebben op klinische wondheling. We meldden ook dat CVIU gekenmerkt worden door afwijkend hoge niveaus van de pro-inflammatoire mediator, IL -
1β. Het is aangetoond dat genezing in verband gebracht wordt met een verschuiving naar macrofageen anti-inflammatoire cytokine-profielen, die parallel lopen met het verloop naar latere stadia van de wondheling. Genezing werd in verband gebracht met dalingen van IL-1β, MIP-1β, en RANTES, tesamen met stijgingen in IL-1β receptor-antagonist-proteïne (IRAP), IL -10, MIP-1α, en MCP-1. Deze gegevens suggereren dat CVIU kunnen veroorzaakt worden door het hardnekkig voortduren van een chronisch inflammatoire toestand, die het normale verloop van wondheling verhindert. Onze resultaten doen vermoeden dat de chemokines belangrijk zouden kunnen zijn in de pathogenese van CVIU, en een verandering in hun relatieve verhoudingen zou een belangrijk deel kunnen zijn van de veranderingen die ontstaan als een CVIU begint te genezen.
Materiaal en methoden. Alle patiënten die meededen aan het onderzoek in de studie gaven, na geïnformeerd te zijn, hun geschreven toestemming om deel te nemen, met protocols die goedgekeurd waren door het Henry Ford Committee voor Gezondheidssysteem en Mensenrechten. De diagnose van CVIU werd bevestigd door fotoplegthymografie ( < 20sec) en enkel-bracchiale-index ( > 0,65). Alle patiënten ondergingen een profylactische antibioticakuur van 2 weken, en lokale debridering werd uitgevoerd met curettage van de ondermijnde wondranden, om de gedevitaliseerde weefsels en fibrine te verwijderen, voordat de beginfase geëvauleerd werd. Elke patiënt werd geëvalueerd in de beginfase en daarna wekelijks, met foto’s en merktekens van de oppervlaktezones op acetaatpapier om de wondoppervlakte te berekenen. Elke wonde werd verbonden met een standaardverband - een laag niet-klevend verband bedekt met een hydrofoam kussen (Allevyn, Smith & Nephew United, Largo, Fla.),- en daarna ingepakt met een gegradueerd drukverband van gaas gedrenkt in zinkoxydepasta.Een biopsie van 2mm diameter van de normale beenhuid (boven de knie), van de ulcusrand en van het ulcuscentrum werd uitgevoerd in de startfase. Biopsies van de ulcusrand en van het centrum werden herhaald respectievelijk op week 4 en week 8. In het begin (WO) en wekelijks gedurende 8 weken (W1 tot W8) werd de centrale 2 cm diameter van het hydrofoamverband dat direkt op het ulcuscentrum lag, verzameld en bewaard op –70°C voor daaropvolgende extractie van het wondvocht.
Voorbereiding van het specimen Stalen van het wondvocht werden geëxtraheerd uit Allevyn- verbanden door homogenisatie in 2ml van het bufferstaal (steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) die een cocktail bevatte van 1% phenylmethylsulfonyl-fluoride, 0,001% pijnstiller, 0,001% aprotinine, 0 001% leupeptine, 0,001% pepstatine A), gevolgd door sonicatie. 15. Eerder werd aangetoond dat deze techniek leidt tot herstel van levensvatbare hoeveelheden cytokines. We deden ook pilootstudies waarbij gezuiverde chemokines toegevoegd werden aan Allevyn-verband, en daarna met sukses weer opnieuw geëxtraheerd werden met hoge herstelcijfers. 21.Weefselstalen werden op dezelfde wijze bewerkt door homogenisatie in 2ml van het bufferstaal. Alle stalen werden gecentrifugeerd om resten te verwijderen, en daarna gefilterd door 1,2-µm filters (German Sciences, Ann Arbor, Mich.) voor ze geanalyseerd werden. De totale proteïne-inhoud van elk weefselstaal werd bepaald met de Lowry methode om verschillen in opbrengst tussen de stalen te normaliseren.
ELISA- kwantificatie van chemokines en cytokines. IL-8, IP-10, ENA-78, GROα, PF4, NAP2, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, RANTES, IL-10,
Transformerende-groeifaktor-β (TGF- β), IL -1β, IRAP, IL-6 en Tumor-necrosis-factor-α (TNF -α) werden bepaald door gebruik te maken van een dubbele binding –ELISA-methode. 11,18,19 . Microtiterplaatjes van 96 well met vlakke bodem werden bedekt met 50µ L/well anticytokineantilichamen van konijnen (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo.) (1 µ/ml in 0,6 mol/L NaCl, 0,26 mol/L H3SO 4 en 0,08 N NaOH, pH 9,6, gedurende 16 uur aan 4°C), en werden dan gewassen met PBS (pH 7,5) dat 0,05% Tween –20 (Sigma) bevatte (wasbuffer). Niet-specifieke bindingsplaatsen op microtiterplaten werden geblokkeerd met 2% serumalbumine van rund in PBS en geïncubeerd gedurende 90 minuten aan 37°C. De platen werden 4 keer gespoeld met wasbuffer, en de stalen werden toegevoegd (50 µl/well) en geïncubeerd gedurende 1 uur aan 37°C. De platen werden 4 keer gewassen. Patterson, D.R., Everett, J.J., Burns, G.L., an- Marvin, J.A. (1992). Hypnosis for file treatment of burn pain. JoLee, V.K. & Marvin, J.A. (1993). Psychological effects of severe burn injuries. Psychological bulletin, 113,2,362-378. Pattersona verbetering van de totale proteïne-inhoud. De individuele stalen werden in verband gebracht met het genezingspercentage, zoals het vastgesteld werd door de verandering van oppervlaktezone met de wekelijkse acetaatafbakeningen. Spearman’s rang- correlatie-coëfficiënten werden veralgemeend omdat de gegevens niet normaal verdeeld waren. De gemiddelde veranderingen in de individuele staalzones (ulcusrand, ulcuscentrum, en wondvocht afkomstig van de verbanden) werden na verloop van tijd geanalyseerd door de test van Student. Weefselstalen werden vergeleken tussen week 0 en week 4. Gemiddelde wondvochtveranderingen werden geanalyseerd tussen week 0 en week 8. Omdat veel van deze gegevens niet normaal verdeeld waren, worden mediane waarden voorgesteld. Basisverschillen in gemiddelde en mediaan, tussen deze zones, werden ook geanalyseerd volgens de gepaarde t-test van Student of volgens Wilcoxons tekens-rangtest voor gegevens, die uitgaat van een normale verdeling. De t-testen werden vrij geïnterpreteerd wegens de algemene bescheiden schaalgrootte. Significantie werd gedefiniëerd als p ( 0,05 , en significante trends werden bepaald als 0,10 ( p > 0,05. Wondvochtniveaus werden vergeleken met weefselniveaus en plasmaniveaus op het gebied van individuele cytokines versus tijd, op het gebied van de verhouding van de som van ELR+ tot ELR- chemokines en op het gebied van de verhouding van IL-1( tot IRAP. Er werd geen analyse gedaan van de biologische activiteit in de herstelde wondvochtproteïnes. Daarom vertegenwoordigen weefsel - en plasmawaarden een enkel punt in de tijd. Wondvochtniveaus vertegenwoordigen elk verzamelingen van 7 dagen, tenzij er verlies was door proteolytische degradatie.
Resultaten Veertien patiënten werden geëvalueerd in het begin; met 10 van hen werd wekelijks verder gegaan gedurende 8 weken. De grootte van de beenulcera bij deze patiënten was 2,0 tot 85,4 cm², met een gemiddelde oppervlakte van 26,5 ( 6,6 cm². Metingen van de ulcera in week 8 toonde een variatie van volledig genezen (n = 2) tot 50,8 cm² met een gemiddelde grootte van 12,4 ( 3,7 cm². Dit kwam overeen met een gemiddelde afname in ulcusoppervlakte van 46,8 ( 17,5% (mediaan = 63,3%) tijdens deze studie van 8 weken bij deze 10 patiënten. Na 6 maand waren er nog eens 2 patiënten genezen (n = 5), en de drie laatsten hadden een gemiddelde ulcusgrootte van 7,8 cm².
CXC-chemokines bij de onbehandelde CVIU (beginfase) In alle stalen was de Neutrofiel-aktiverende peptide-2 (NAP2) de ELR+ CXC-chemokine met het hoogste gehalte in het weefsel, en de Plaatjesfactor-4 (PF4) was de hoogste ELR -CXC-
chemokine (Tabel 1). De uitgeproken aanwezigheid van PF4 in normale huid was onverwacht, omdat plaatjesaktivatie (de normale bron van PF4) niet karakteristiek is bij normale huid. 12.
In het begin werden alle CVIU gekenmerkt door gehalten aan PF4 en Interferon-(teweegbrengende-proteïne 10 (IP 1O), die veel hoger waren dan deze van Interleukine-8 (IL 8),Groeiregulerend-genprodukt(GRO(), NAP2 en Epitheliale-neutrofiel-aktiverende-peptide 78 (ENA-78) (Tabel 1). Om hun gezamenlijk effekt te bestuderen, werden de som van de proteïneniveaus van de ELR+, ELR -chemokines berekend voor elk staal, evenals de verhouding van de ELR+/ELR- chemokines. Tabel 1 toont dat de ELR+/ELR- verhouding in het begin niet statistisch significant was (p = 0,16) tussen de ulcuszones. Geen enkele chemokine toonde in het begin statistisch verschillende niveaus tussen de ulcusrand en het ulcuscentrum. De mediane ratio in de normale huid was in het begin 1,90, terwijl plasma van CVIU-patiënten en van gezonde controlegroepen (deze gegevens zijn niet getoond), een mediane ELR+/ELR- had van ongeveer 0,50. Tabel 1 stelt deze gegevens beknopt voor. Enkel het gehalte aan GRO( in het ulcuscentrum toonde een significante trend t.o.v. normale huid in het begin, terwijl zowel PF4 als IP10 significant waren t.o.v. normale huid. Vergelijking tussen ulcusranden en normale huid toonde significante trends voor alle CXC-waarden, behalve voor GRO( en ENA -78. Men vond ook significante verschillen tussen IP10, PF4, NAP2, IL-8 en de som van ELR+ en ELR - chemokines en hun onderliggende verhouding, van de wondvochten van in het begin en van het normale plasma. CXC-chemokine-veranderingen tijdens het begin van de wondheling bij CVIU. Tijdens de 8 weken durende observatieperiode, werden belangrijke veranderingen vastgesteld in de verhouding ELR+/ELR-, in de stalen van wondvocht en weefsel. Deze werden in verband gebracht met het genezingspercentage. In Figuur 1 worden de veranderingen in ELR+/ELR- ratio vergeleken met de genezing in de wondvochten (Figuur 1,A), het ulcuscentrum, en de ulcusrand (Figuur 1,B). Hier blijkt er een compartimentaal effekt te zijn dat verband houdt met de sluiting van de wonde. In de wondranden is er een stabilisering van de ELR+/ELR- ratio naarmate de oppervlakte kleiner wordt, terwijl de wondmiddens een gelijkmatige stijging vertonen van deze ratio. Op het einde van de 8 weken durende observatie, toonden alleen veranderingen in IL-8 gehalte van het wondvocht een significante trend (p = 0,09) ; toch waren verscheidene CXCchemokine-niveaus significant verschillend van deze tijdens het begin (Figuur 2). Vooral de NAP2veranderingen van week 2 tot week 5 waren significant verschillend van de waarden in het begin (p ( O,O5), terwijl de veranderingen in IL -8 (week 2 tot week 4, 8) significante trends aantoonden (0,1 ( p ( 0,05) (Figuur 2). Noch IP10 of PF4, noch hun som, was significant veranderd op welk tijdstip dan ook, vergeleken met de beginwaarden.
Nochtans, in vergelijking met het plasma van elke patiënt in het begin, werden significante verschillen genoteerd gedurende de 8 weken durende observatie voor IP10 (week 0 tot 7), PF4 (week 0 tot 3 en 6), de ELR-som (week 0 tot 8, p ( 0,05), IL-8 (week 0 tot 2, 7, en 8), NAP2 (week 0, en 2 tot 4), en GRO( (week 1 tot 3) (Figuur 2). De absolute veranderingen in weefselwaarden tussen week 0 en 4 voor IP10 (p = 0,079), en de ELR+ som (p = 0,080) bleken ook een significante trend te vertonen in de stalen van ulcusranden, terwijl alleen de veranderingen in NAP2 (p = 0,060) en ELR+som (p = 0,067) bijna significant waren voor dezelfde periode, in de stalen van het ulcuscentrum. Aldus blijkt elke chemokine een uniek expressieprofiel te hebben gedurende het wondhelingsproces. Stijgingen in IL-8, GRO( en NAP2, samen met dalingen van IP-10 en PF4, resulteren in een netto stijging van ELR+ chemokine-waarden als de wonde begint te sluiten.
Strikte statistische analyse toonde een statistisch significant verband aan tussen het percentage wondsluiting, en de verminderingen in PF4 en de totale ELR- (p ( 0,05 voor elk) van de stalen van het ulcuscentrum. De stijgende ratio van ELR+/ELR- die men vond in het ulcuscentrum, toonde een significante trend in verhouding tot de graad van wondsluiting (p = 0,08), terwijl geen van de andere trends die voor deze mediatoren genoteerd werden in zowel de huid als de wondverbanden, significant waren in relatie tot de heling. In normale huid waren ook fluctuerende niveaus van deze mediatoren gedurende de wondheling. Dit zou doen veronderstellen dat er systemische effekten kunnen toegeschreven worden aan het proces van de wondheling. Genezing van CVIU op een distale plaats werd geassocieerd aan een neiging tot significantie in de daling van de normale huidniveaus van IL-8, NAP2, en de som van de ELR+chemokines tussen week 0 en week 4 (p respektievelijk = 0,07, 0,08, en 0,08). Inflammatoire cytokine-niveaus in de onbehandelde CVIU. Basisgehalten van de CC-chemokines MCP-1, MIP-1(,MIP-(, RANTES, worden samengevat in Tabel 2, samen met niet-chemokine-cytokines die belangrijk zijn in het op gang brengen en reguleren van weefselinflammatie (IL-1(, IRAP, IL-6, IL-10,TGF-(, en TNF-(). Gestegen IL -6gehalten bleken een neiging te hebben tot significantie in de ulcusmiddens in vergelijking met normale huid (p = 0,089), terwijl de IL -6-niveaus variabel waren in de randstalen en in de wondvochten. IL-6 was de enige cytokine die significant was in de verschillen tussen beginwaarden van het ulcuscentrum versus de randweefselstalen (p = 0,089). TNF-(-niveaus in de beginstalen van de verbanden waren significant gestegen (p ( 0,05), maar waren in het algemeen niet opspoorbaar in de geanalyseerde kleine weefselbiopsies. IL-10-waarden varieerden ook enorm, en waren erg hoog in sommige verbandstalen van het begin (gemiddelde WO IL -10 in wondvocht = 45,9 (140,5, mediaan = 0,069 ; Figuur 3), terwijl ze nauwelijks te detecteren waren in weefselstalen. TGF-(gehalten in wondvocht waren lager dan verwacht werd op basis van andere rapporten over de rol van TGF-( in de wondheling. 1,7. Alleen de wondvocht-niveaus van TGF-( waren significant gestegen in vergelijking met de normale plasmawaarden van de patiënt in het begin (px(x0,05). IL-1(-waarden waren hoger in het begin in de ulcusweefsels en de stalen van het wondvocht (Tabel 2 en Figuur 4,A en 4,B), in vergelijking met normale huid of plasma. De verschillen tussen de rand en het centrum van het ulcus waren significant (p ( 0,05 voor beiden, Figuur 4,B), terwijl wondvochtniveaus een significante trend vertoonden (p = 0,055). De natuurlijke inhibitor van IL-1, IRAP, vertoonde een significante trend naar lagere niveaus in het begin, enkel in de weefsels, vergeleken met normale huid of plasma. Gebruikte men de verhouding van IL -1(/IRAP om de balans tussen deze pro- en anti-inflammatoire mediatoren te vergelijken, dan was deze verhouding signifcant gestegen in de ulcusrand en in het centrum, maar niet in de wondvochtstalen, vergeleken met normale huid en plasma in de beginfaze (rand, p = 0,016 ; centrum, p = 0,074 ; wondvocht, p = 0,338 ; Tabel 2). Cytokine-trends gedurende de behandeling van CVIU Veranderingen in IL -6-waarden in de ulcusrand tussen de beginfaze en week 4, vertoonden ook een significante trend (p = 0,06). De wondvochtniveaus van IL-10 stegen geleidelijk na week 3 (11,2% mediane heling, Figuur 3) ; nochtans was geen enkele van deze veranderingen significant ten opzichte van het begin. TGF -(-niveaus in normale huid stegen tegen week 4 (gegevens niet getoond), terwijl veranderingen gedurende de bestudeerde periode verwaarloosbaar waren voor ulcusranden, ulcusmiddens, en wondvochtniveaus (Tabel 2). TNF-( en IL-1( waren altijd significant verschillend van plasmaniveaus van in het begin. De IL-1(/IRAP- ratio bleek een bifasisch responsprofiel te volgen in de wondvochten, als men het vergeleek met de heling (Figuur 4,A) en was significant verschillend van zijn basiswaarden gedurende week 2 tot week 7 (p ( 0,05). De IL-1(/IRAP-ratio vertoonde een significante stijging van de weefsels in het ulcuscentrum, en hield statistisch verband met de graad van wondsluiting (Figuur 4,B ; p ( 0,05). Deze ratio daalde tussen het begin en week 4
in de ulcusranden, maar deze veranderingen hielden niet significant verband met de heling (Figuur 4,B). CC-Chemokine-niveaus in de beginfase en gedurende het proces van de wondheling. In het begin waren MCP-1, MIP-1(, en MIP-1( zowel in de weefsels als in het wondvocht gestegen in vergelijking met normale huid-en plasmawaarden (Tabel 2). MIP-1( daalde gedurende het helingsproces tot ongeveer week 4, en vertoonde vervolgens een stijging naar het einde van de observatie toe (resultaten niet getoond). Gedurende de heling was er een lichte stijging van MIP-1 in de weefsels (resultaten niet getoond). Alleen de stijging van MIP-1( in het ulcusmidden (tussen week 0 en week 4) was significant (p ( 0,05) en enkel de veranderingen van MCP-1-niveaus in normale huid correleerden met de wondsluiting (p ( 0,05). Dus volgden de krachtiger macrofaag-chemoattractanten (MCP -1 en MIP-1() een trend naar geleidelijke stijging in ulcusniveaus ge durende de heling, terwijl het tegengestelde gebeurde voor MIP-1(, dat de T-cellen pre-dominant beïnvloedt. Wondvocht uit de verbandstalen vertoonden geen significante trends voor de CC-chemokines gedurende de bestudeerde periode van 8 weken, vergeleken met de beginwaarden. RANTES was significant hoger in de beginfase, enkel in de wondvochtstalen (p ( 0,05) in vergelijking met weefsel- of plasmaniveaus, maar het neeg ook naar lagere waarden tijdens de wondsluiting. Als men de wondvochtniveaus van de CC-chemokines vergeleek met plasmaniveaus, werden individuele expressieprofielen duidelijk, zoals men zag met de CXC-chemokines. Er werden ook veranderingen genoteerd in RANTES, die altijd significant verschilden van plasmagehalten (p ( 0,005). Significante verschillen werden ook gezien in MIP-1( (week 1 en 3 tot 8), en MIP- 1( (weken 1,5 en 8) ten opzichte van de basisgehalten in het wondvocht.
Discussie In deze studie onderzochten we weefsel-en wondvochtniveaus van de recent getypeerde familie der chemo-attractanten, de chemokines, bij een gecontroleerde reeks patiënten met CVIU, die allen behandeld werden met een standaard compressief verband. De CC-chemokine-subfamilie heeft voornamelijk effekt op mononucleaire celfunktie, en zou belangrijk kunnen blijken te zijn in de middenste en latere fasen van de wondheling ; daarentegen beïnvloedt de CXC-chemokinesubfamilie allereerst de neutrofielen en de lymfocyten, waarbij zowel angiogene als angiostatische proteïnen gekenmerkt worden. Nochtans hebben beide subfamilies, zoals bij de meeste cytokines, ook multifunktionele leden, met invloed op praktisch elk celtype in het antwoord van het wondherstel. We beschrijven een dynamisch cytokine-profiel dat kan helpen om inzicht te geven in de pathogenese van CVIU. We vonden dat CVIU in het begin gekenmerkt worden door een CXC -chemokine-fenotype dat de anti-angiogene effekten van PF4 en IP10, de zogenaamde ELR-chemokines, overweldigend sterk bevordert. De predominante ELR-chemokine in onbehandelde CVIU was PF4, terwijl de predominante ELR+chemokine NAP2 was. Deze bevindingen waren dezelfde als deze voor de normale patiëntenhuid en –plasma, evenals voor de relatieve gehalten gevonden bij CXC-chemokines in normaal menselijk plasma en vocht van broncho-alveolaire lavage. 11. Vocht van chronische wonden bij deze patiënten, hadden een gemiddelde basislijn van PF4 die 14 maal hoger was dan dat in normaal menselijk plasma, en bijna 77 maal hoger dan dat van normaal broncho-alveolair lavagevocht. 8,10,11. Het was in het bijzonder interessant om relatief hoge gehalten aan PF4 in de normale huid van de patiënt terug te vinden ( gemiddelde = 4416 ( 2158 ng/ml/mg; mediaan = 2046) vergeleken zowel met hun plasma ( gemiddelde = 60,762 ( 12,670 ng/ml, mediaan = 66,549) als met normaal menselijk plasma ( gemiddelde = 4425 ( 616,9 ng/ml),
omdat men niet verwachtte dat plaatjesaktivatie (de eerste bron van PF4) een belangrijke gebeurtenis was in de normale huid. 14. Aldus blijkt systemische upregulatie van CXC -expressie aanwezig te zijn, ondanks de aard van de CVIU. Wondvochtresultaten vertegenwoordigen de accumulatie in het verband van materiaal gedurende 7 dagen. Omdat er geen vaststelling was gemaakt van de stabiliteit van de chemokines in deze omgeving gedurende 7 dagen, is het mogelijk dat significante niveaus van cytokines niet vertegenwoordigd zijn in deze wondvochtwaarden. De stalen van normale huid van de patiënten hadden een mediaan van 210,2 ng/ml van IP10 vergeleken met de onbehandelde CVIU, die gingen van 0,51 ng/ml/mg in de wondvochten tot 74,1 ng/ml/mg in de ulcusmiddens en 127,2 ng/ml/mg in de ulcusranden. Ook dit was een onverwachte paradox, omdat men zou verwachten dat Interferon-((IFN-() teweegbrengende proteïne hoger was in het ontstoken, niet helende CVIU-centrum, en veel lager in normale huid (die relatief verstoken is van geaktiveerde T-cellen die IFN-( produceren. 22.) Eerder al werd aangetoond dat IFN-( een krachtige inhibitor is van de groei van zowel fibroblast als endotheel, en het werd effektief bevonden in de behandeling van keloid en hemangiomen. 23,28. Chronische wonden worden gekenmerkt door een polymorf infiltraat van leucocyten, waarbij lymfocyten en neutrofielen overheersen, en macrofagen relatief schaars zijn. 22. Deze histopathologie is analoog aan vele akute en subakute inflammatoire processen. We vonden dat de enige ELR+chemokine waarvan het gehalte hoger was dan in de normale huid, bij de onbehandelde CVIU, IL-8 was ; de andere CXC-chemokines waren allemaal gestegen in de normale huid van de patiënt. Hoewel er geen direkte metingen van angiogenese waren uitgevoerd bij deze reeks patiënten met CVIU, kan men voorspellen dat angiogenese verhinderd werd door de overweldigende niveaus van de ELR-chemokines, ondanks de upregulatie van IL-8 in de onbehandelde ulcera. IL -8 is een krachtige, pro-inflammatoire chemo-attractant voor neutrofielen en T-cellen, en men weet dat IL -8 gestegen is in chronische wonden. 2,4,7. We associeerden genezing met een relatieve shift in de verhouding van ELR+ en ELR -chemokines ; toch overheersten de algemene anti-angiogene effekten van PF4 en IR10, zoals het geval is in normaal menselijk plasma. Bij de individuele chemokines was er een vroege piek in de IL-8 gehalten, gevolgd door een progressieve toename van NAP2 en GRO(. Dit volgde weer ons hypothetisch model met de pro-inflammatoire mediatoren, dat de infiltratie van T-cellen en neutrofielen zou kunnen vergemakkelijken, samenvallend met de ontbinding van de inflammatie en het begin van de wondsluiting.
Normale wondheling sluit een gecoördineerd samenspel in van cellen, extracellulaire matrix, en een steeds de gecoördineerde stimulatie van bloedvatgroei (angiogenese), proliferatie van keratinocyten en fibroblasten, produktie van epigen in het slecht genezende centrale deel van de wonde, terwijl een dalende behoefte aan angiogenese in de wondranden epitheliale migratie toelaat. 5,6. Het is aangetoond dat IP10 keratinocytengroei stimuleert, 15,24,25 ; en een teveel aan zijn inducer IFN-( is betrokken bij de hyperproliferatieve toestand die we zien bij psoriasis. 25,26. Dus kunnen lokale stijgingen van IP10 in de wondrand de keratinocyten helpen aansporen om te delen en te migreren, samen met een dalend effekt op de angiogenese. Anti-angiogene effekten van de interferonen kent men klinisch het beste wegens hun gebruik bij de behandeling van hemangioma bij kinderen. 27,28. Een ander interessant resultaat was dat er een overeenstemmende daling bleek te zijn in de niveaus van NAP2 en IL-8 (respektievelijk p = 0,083 en 0,007) in de normale huidstalen die achtereenvolgens werden afgenomen bij patiënten in deze klinische proef. Samen met de stijgingen van PF4 in het plasma en de normale huid van deze patiënten zoals eerder beschreven, staaft dit de veronderstelling dat het in gang zetten van de wondheling bij CVIU meer zou kunnen zijn dan een lokaal fenomeen, omdat significante veranderingen in de verspreiding van inflammatoire mediatoren overal voorkomen in de afdelingen van huid en bloedvaten.
Bij onbehandelde CVIU vonden we een lichte stijging van de 4 bestudeerde chemokines, zowel in het ulcusweefsel als in de wondvochten. MIP-1(, MIP-1(, MCP-1, en RANTES zijn allemaal chemotactisch voor T-cellen, en werden recent in verband gebracht met chronische T-celgemedieerde inflammatoire ziekten, waaronder rheumatoïde artritis, pulmonaire fibrosis, en chronische niet-progressieve HIV-infektie. 8,16,18. Hoewel er geen veranderingen werden ontdekt die significant verband hielden met de genezing, was er een tendens tot daling van de MIP-1(- en RANTES-gehalten, analoog met de vermindering in de andere pro-inflammatoire cytokines die voordien beschreven werden. Deze wonden hadden ook de neiging om verhoogde waarden van MCP-1 en MIP-1( te hebben (de krachtiger macrofaag-chemotaxis) , in relatie met de heling. 20. Dus zag men een parallele shift van mediatoren van een pro-inflammatoire status naar een toestand van inflammatie-ontbinding, tussen deze 4 CC-chemokines en de shifts die men observeerde tussen de angiogene en angiostatische CXC-chemokines bij CVIU in behandeling. Men toonde aan dat de gehalten aan IL-1( en IL-6 die gestegen waren in de startfaze van deze ulcera, daalden zodra de genezing begon. Naarmate de wond verder sloot gedurende deze 8 weken durende trial, kwam er een omkering in de verhouding van IL-1( tot zijn inhibitor, IRAP, voornamelijk in de weefsels van het ulcuscentrum (p ( 0,05). Dus, juist als de angiostatische CXCchemokines verminderen bij het begin van de therapie van CVIU, dalen ook de relatieve niveaus van IL-1(. We suggeren dat deze ratio’s een van de meest sensitieve immunologische parameters van de genezing zou kunnen zijn,en van de gelijktijdig optredende ontbinding van de chronische inflammatoire toestand zoals die te vinden is in CVIU. Het wordt ook voorgesteld dat de verdwijning van de inflammatie verband zou houden met de heling, door veranderingen in de IL -10-niveaus gedurende het helingsproces, met een stijging in de eerste 4 tot 5 weken samenlopend met een vooruitgang naar heling toe. Hoewel niet statistisch significant, is het interessant dat het meeste van de ontdekte IL-10 uit de wondvochten kwam en niet uit de weefselstalen.Preliminaire data suggeren dat deze hoge niveaus van IL-10 in chronisch wondvocht, niet funktioneel zouden zijn, en dat sommige afvalprodukten zouden kunnen verantwoordelijk zijn voor de variabele niveaus, ontdekt door ELISA, bij sommige patiënten. 29. Deze veranderingen in de pro-en anti-inflammatoire cytokines en chemokines wijzen allen op een shift in de dynamica van de CVIU gedurende het in gang zetten van de wondheling. Deze shift beweegt zich van een chronische, pro-inflammatoire toestand gekarakteriseerd door hoge waarden TNF-(, IL-1(, IL -6, IL-8, RANTES, en MIP-1( (allen gekend voor hun effekten op vroegere componenten van het pad), naar een toestand die gekenmerkt is door stijgingen van antiinflammatoire cytokines die de ontbinding van de inflammatie stimuleren door het recruteren van mononucleaire fagocyten en het bevorderen van angiogenese en het inleiden van keratinocytenmigratie en fibrogenesis. Stijgingen van IRAP en IL-10 stoppen onmiddelijk de proinflammatoire effekten van IL-1(, IL-2, en IFN(. 30,31. Bij het interpreteren van deze veranderingen kan gesuggereerd worden dat de verstoring van de heling in verband zou kunnen gebracht worden met vroege elementen van het inflammatoir proces (zoals polymorfonucleaire leucocyten, lymfocyten) en gemedieerd zou kunnen worden door onevenwichten in de niveaus van sommige van deze cytokines.Behandeling wordt geassocieerd met dalingen van sommige van deze inflammatoire mediatoren, samen met sijgingen van die mediatoren die de kenmerken bevorderen die typisch zijn voor de proliferatieve en rijpende fazen van het wondherstel. Ons onderzoek toont aan dat stijgende monocyt-en macrofage cytokines, wiens rol het is om inflammatoire reakties ‘ op te dweilen ‘, voortgang naar wondherstel toelaten. Toenemende niveaus van sommige van deze inflammatoire mediatoren (bvb. IL-10, MCP-1, TGF-(, IRAP, IP10) zouden ook een rol kunnen spelen bij het op gang brengen van de proliferatie van fibroblasten en keratinocyten, noodzakelijk voor het wondherstel en de remodellering. 1,2,24,30,32.
Het granulatieweefsel dat typisch is voor een normaal helende wonde, is voornamelijk het resultaat van proliferatie van de vaatjes, geïnduceerd door cytokines, en moet gebeuren voor epitheelmigratie. We zien een totale verschuiving naar het pro-angiogene effekt van gestegen ELR+chemokines, samen met een compartimentale verandering die de cellulaire dynamica weerspiegelt bij de bestudeerde CVIU. Zodra de wonde begint te genezen en effektief granulatieweefsel wordt gemaakt, verandert de inflammatoire situatie naar een toestand die typisch is voor het proliferatieve stadium van de heling (d.w.z. door macrofagen en fibroblasten overheersd). Keratinocyten beginnen naar binnen te migreren vanuit de wondranden, en de aansporing voor angiogenese wordt gestopt (zoals aangetoond wordt door de stabilisering van de relatieve gehalten aan ELR-chemokines in de wondranden, tijdens de behandeling). Déze mediatoren overheersen die de funkties van macrofagen, fibroblasten en keratinocyten vermeerderen. De hypothese die we voorstellen is dat de oorzaken van CVIU waarschijnlijk multifaktorieel zijn, maar dat hun voornaamste kenmerk, het onvermogen om te genezen, waarschijnlijk verband houdt met het hardnekkig volhouden van de chronische inflammatoire toestand, gecombineerd met een relatief tekort aan angiogenese. Dynamische veranderingen worden voorgesteld, die tonen dat deze ulcera zullen genezen met passende compressieve verbandtherapie en wondzorg. We tonen ook dat heling gekenmerkt wordt door een verandering van de chronische pro-inflammatoire toestand naar een situatie waarbij de inflammatie verdwijnt en de cytogenese verhoogt, gelijklopend met een stijging in de relatieve niveaus van angiogene chemokines in de niet-genezende delen van deze ulcera.
Dankbetuiging Deels gesteund door een onbeperkte subsidie vanwege Smith and Nephew United, Largo, Florida, en door Nationale Instituten voor Gezondheidssudsidiëring Nos. CA66180 (RMS) en CA69569 (RMS).
ENKELE BEMERKINGEN
Het onderzoek zoals dit in het artikel geïllustreerd wordt, werd uitgevoerd bij slechts een klein aantal patiënten met bovendien chronische wonden in de vorm van veneus insufficiënte ulcera. Laten we cytokines eens situeren in de moleculaire celbiologie : cytokines zijn glucoproteïnen die in minimale concentraties (nanomolair ) funktioneel zijn. Ze vormen een netwerk om informatie door te geven in de cel en zo celfunkties bij te sturen. We kunnen cytokines onderverdelen in 2 groepen : de pro-inflammatoire en de anti-inflammatoire cytokines. De eerste groep wordt voornamelijk geproduceerd door geaktiveerde macrofagen. Hiertoe behoren IL-1, TNF(, IL-6, IFN-(…De tweede groep is afkomstig van de T-cellen en omvat IL-4, IL-10, IL13. Bij de pro-inflammatoire cytokines horen ook de chemokines. De naam komt van chemo-attractante cytokines of chemo tactische cytokines. Zij binden aan specifieke receptoren op het celoppervlak, en worden geproduceerd door o.a. IL -1, TNF-(, IFN-(, PDGF. Als secundaire cytokines maken ze zelf geen andere cytokines aan. De chemokine-moleculen hebben allemaal eenzelfde structuur, nl. cysteïneresten die disulfide-bruggen maken in de tertiaire structuur van de proteïne. We kunnen hen onderverdelen in 3 subgroepen : de alpha-groep of CXC-chemokines waar X om het even welk aminozuur voorstelt dat tussen de eerste en de tweede van de vier cysteïne-resten zit ; de bèta-groep of CC-chemokines waar de vier cysteïne-resten niet gescheiden zijn ; de laatst ontdekte groep is de gamma-groep waar slechts één paar cysteïne-resten zit, de Cchemokines. De CXCchemokines kunnen een ELR-motief hebben of niet, d.w.z. een binding van Glutaminezuur, Leucine en Arginine voor hun eerste cysteïne in de N-staart. De aanwezigheid van dit motief (bij de ELR+chemokines) zou de angiogenese bevorderen. Dit is het geval bij MIP-2, ENA-78 en IL-8. De ELR-chemokines (PF4, IGP10) hebben dit motief niet en zouden angiostatisch werken. Hun rol en deze van andere mediatoren wordt nog verder onderzocht, in de hoop een beter inzicht te krijgen in de wondheling en de mogelijkheden te onderzoeken hier positief in te grijpen. Zo beschreef Hogaboam in september ’99 hoe de regeneratie van een muizenlever bevorderd werd door exogene toediening van ELR+chemokines. Het onderzoek van deze paper licht slechts een klein tipje van de sluier op van wat gebeurt als chronische wonden evolueren naar genezing. Het is en blijft echter een zandkorreltje in vergelijking met de woestijn die nog moet ontdekt worden.
BIBLIOGRAFIE
1. Falanga V. Chronic wounds:pathophysiologic and experimental considerations. J Invest Dermatol 1993 ; 100:721-5. 2. Jyung RW, Mustoe TA. Role of cytokines in wound repair. In : Oppenheim J, editor. Clinical applications of cytokines. New-York : Oxford Univ Press ; 1993.p.307-29. 3. Mauviel A, Uitto J. The exracellular matrix in wound healing : role of cytokines network. Wounds 1993 ;5 :137-52. 4. Li V, Barnhill R. Angiogenesis in dermatology : pathophysiology and clinical implications. Prog Derm 1995 ;29 :1-12. 5. Margolis DJ, Cohen JH. Management of chronic venous leg ulcers : a literature guided approach. Clinics Dermatol 1994 ;12 :19-26. 6. Davidson JM. Wound repair. In : Gallin JI ? Goldstein IM, Snyderman R, editors. Inflammation : basic principles and clinical correlates, New-York : Raven PRESS.1992.p. ? ? ? 7. Falanga V. Growth factors and wound healing. Dermatol clinics 1993 ;11 :667-75. 8. Streiter RM, Kunkel SL. Chemokines and the lung. In :Cristal R, West j, Weibel E, Barnes ? ? ?, editors. The lung : scientific foundations. 2nd ed. New York :Raven press ; 1996.p. ? ? ? 9. Walz A, Baggiolini M. generation of the neutrophil-activating peptide NAP2 from platelet basic protein or connective tissue-activating peptide III through monocyte proteases. J Exp Med 1990 ;171 :449-54. 10. Baggliolini M, Dewald B, Moser B. Interleukin-8 and related chemotactic cytokines-CXC and CC chemokines. Adv Immunol 1994 ;55 :97-149. 11. Strieter RM, Lukacs NW, Standiford TJ, KUNKEL SL. Cytokines and lung inflammation. Thorax 1993 ;48 :765-9. 12. Koch Ae, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, Elner SG, Strieter RM. Interleukin-8 (IL -8) as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science 1992 ;258 :1798-801 13. Taub dd, Oppenheim JJ. Review of the chemokine meeting : the THIRD International Symposium of Chemotactic Cytokines. Cytokine 1993 ;5 :175-9. 14. Maione Te, Gray GS, Petro J, Hunt AJ, Donner AL, Bauer SI, Carson HF, Sharpe FJ. Inhibition of angiogenesis by combinant human platelet factor-4. Science 1990 ;247 :77-9. 15. Streiter RM, Kunkel SL, Arenberg DA, Burdick MD, Polverini PJ. Interferon (-inudible protein 10 (IP10) a member of the CXC chemokine family is an inhibitor of angiogenesis. Biachem Biophys Res Comm 1995 ;210 :51-7. 16. Cochi F, deVico AL, Garzino-Demo A, Arya SK, Gallo RC, Lusso P. identification of RANTES, MIP-1( and MIP-1( as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+T cells. Science 1995 ;270 :1811-5. 17. DiPietro LA, Polverini PJ. Angiogenic macrophages produce the angiogenic inhibitor thrombospondin 1. Am J Pathol 1993 ;143 :678-84 18. Kasama Tn Streiter RM, Lukacs Nw, Lincoln PM, Burdick MD, Kunkel SL. Interleukin 10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type II collageninduced arthritis. J Clin Invest 1995 ;95 :2868-76. 19. Kasama Tn Streiter RM, Lukacs Nw, Lincoln PM, Burdick MD, Kunkel SL. Regulation of neutrophil-derived chemokine expression by IL -10, J Immunol 1994 ;152 :3559-69. 20. Fahey TJ, Sherry B, Tracey KJ, van Deventer S, Jones WG, Minei JP, Morgello S, Shires GT, Cerami A. cytokine production in a model of wound healing : the appearance of MIP-1,
MIP-2, cachectin/TNF and IL-1. Cytokine 1990 ;2 :92-9. 21. Fivenson DP, Faria DT, Nickoloff BJ, Poverini PJ, Strieter RM. Biological wound dressings function as a reservoir for C-X-C chemokines in chronic venous ulcer therapy [abstract]. Clin Res 1994 ;42 :232. 22. Herrick SE, Sloan P, McGurk M, Freak L, McCollum CN, Ferguson MWJ. Sequential changes in the histologic pattern and extracelluar matrix deposition during healing of chronic venous ulcers. Am J Pathol 1992 ;141 :1085-95. 23. Granstein RD, Rook A, Flotte TJ, Amento EP. A controlled trial of intralesional recombinant gamma interferon in the treatment of keloidal scarring. Arch Dermatol 1990 ;126 :1295-8. 24. Luster AD, Leder P. IP10, a C-X-C-chemokine, elicits a potent thymus-dependent antitumor response in vivo. J Exp Med 1993 ;178 :1057-65. 25. Gottlieb AB, Luster AD, Posnett DN, Carter DM. Detection of (-interferon-intuced protein (IP-10) in pdoriatic scales. J Exp Med 1988 ;168 :941-8. 26. Uyermura K, Yamamura M, Fivenson DP, Modlin Rl, Nickoloff BJ. The cytokine network in lesional and lesion-free psoriatic skin is characterized by a T-helper type 1 cell mediated response. J Invest Dermatol 1993 ;101 :701-5. 27. Sidky YA, bordon EC. Inhibition of angiogenesis by interferons : effects on tumor- and lymphocyte-induced vascular responses. Cancer Res 1987 ;47 :5155-61. 28. Vitale MK, Willwerth-Fortin J, Robbins K. management of children on interferon therapy. Pediatr Nurs 1993 ;19 :230-4. 29. Hou Z, Faria DT, StrieterRM, Ladin DA, Fivenson DP.Suppressive effects of IL -10 on T-cell mitogenesis in chronic wound fluid [abstract]. J Invest Dermatol 1996 ;106 :941. 30. Kim J, Modlin RL, Dubinett Dm, McHugh T, Nickoloff BJ, Uyemura k. IL -10 production in cutaneous basal and squamous cell cardinoma : a mechanism for evading the local T cell immune response. J Immunol 1995 ;155 :2240-7. 31. De Haan P, Sampat S, van der Raaij EM, Bruynzeel I, Boorsma DM, Willemze R, Stoof TJ. Effect of calcitriol on growth, differentiation, chemokine mRNA expression of cultured keratinocytes and on keratinocyte – T cell binding. Acte Derm Venereol Suppl (Stockh) 1994 ;186 :52-4. 32. Hammerberg C, Arend WP, Fecher GJ, Chan LS, Berger AE, Haskill JS, Voorhees JJ, Cooper KD. Interleukin-1 receptor antagonist in normal and psoriatic epidermis. J Clin Invest 1992 ;90 :571-83.
