CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2005 Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře
Mléko a sýry 2005
Praha – leden 2005
Editor:
Štětina J., Čurda L.
Vydavatel:
Česká společnost chemická, Odborná skupina pro potravinářskou a agrikulturní chemii Novotného lávka 5 116 68 Praha 1
ISBN 80-86238-48-2 EAN 978-80-86238-48-7
OBSAH Výsledky 9. ročníku Celostátních přehlídek sýrů Čurda Ladislav, Štětina Jiří................................................................................................................ 13 Nové poznatky o mikrobiologii sýrů prezentované na IDF symposiu v Praze v roce 2004 Plocková Milada, Chumchalová Jana, Giesová Markéta .................................................................. 21 Výživová doporučení pro obyvatelstvo České republiky Dostálová Jana, Hrubý Stanislav, Turek Bohumil............................................................................. 25 Sledování vlivu genetické varianty κ-kaseinu na technologické vlastnosti sýrů Marková Marie, Snášelová Jana, Buchvaldková Tereza, Kott Tomáš .............................................. 28 Individuální syřitelnost mléka holštýnských dojnic a její vztah k pořadí a stádiu laktace Čejna Vladimír, Chládek Gustav ....................................................................................................... 33 Vplyv doplnkových kultúr laktobacilov na dynamiku prekysávania a zrenia polotvrdých syrov Kontová Marcela, Greifová Mária, Hudáček Jaroslav, Drončovský Maroš...................................... 38 Význam identifikace laktokoků ve spojitosti s jejich autolytickou schopností Kozáková Drahomíra, Kučerová Kateřina, Šviráková Eva, Holubová Jitka, Plocková Milada........ 44 Novinky technológie výroby syrov a balenia mliečnych výrobkov Harhovský Milan ............................................................................................................................... 50 Výskyt biogenních amínů v sýrech Černý Vladimír, Křížek Martin, Kvasničková Eva, Havlíková Šárka............................................... 53 Hodnocení volných mastných kyselin v bazénových vzorcích syrového kravského mléka Kopunecz Pavel, Štěpánková Jitka ................................................................................................... 56 Technologické vlastnosti nebovinných mliek Boroš Vladimír, Herian Karol ........................................................................................................... 61 Výsledky senzorického hodnocení kozích sýrů vyráběných na farmě Šustová Květoslava, Mášová Hana, Kuchtík Jan............................................................................... 65 Kvantitatívna analýza potenciálneho antimikrobiálneho pôsobenia Lactobacillus rhamnosus VT1 v mlieku Valík Ľubomír, Lauková Denisa, Polka Peter, Bajúsová Barbora .................................................... 68 Vplyv Lactobacillus rhamnosus VT1 a teploty na dynamiku rastu Listeria monocytogenes 272 Petríková Jana, Lauková Denisa, Valík Ľubomír ............................................................................. 73 Vliv pH na antimikrobiální aktivitu mastných kyselin a jejich derivátů s polyoly Bartošová Eva, Prekop Jiří, Janšová Jitka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ......................................... 78 Enzymová aktivita bakterií používaných při výrobě jogurtů s probiotickými vlastnostmi Trojanová Iva, Rada Vojtěch, Vlková Eva ....................................................................................... 83 Vliv Aw a teplotního šoku na Streptococcus thermophilus Komárková Eliška, Erban Vladimír .................................................................................................. 88 Vliv galaktooligosacharidů na růst bakterií mléčného kvašení Čurda Ladislav, Holubová Jitka, Rudolfová Jana, Němečková Irena .............................................. 93
3
Plakátová sdělení: Povrchová mikroflóra plesňového syra Niva Čanigová Margita, Kusá Silvia ......................................................................................................... 99 Změny v mikrobiálním i chemickém složení vysokodohřívaných sýrů Černý V., Erban V., Šatná Z., Šatný A., Komárková E., Ledvinka P.............................................. 104 Stanovení obsahu tuku a laktózy v mléce pomocí FT-NIR Dračková Michaela, Hadra Luboš, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka ...................................... 107 Působení Laktocidu a Optiform+Purac na růst laktobacilů pocházejících z lahůdkových výrobků Fialová Jana, Chumchalová Jana, Míková Kamila ......................................................................... 110 Vliv pH a stupně hydrolýzy na pěnicí vlastnosti enzymatických hydrolyzátů koncentrátu syrovátkových proteinů Gallier Sophie, Dryáková Adriena, Čurda Ladislav ....................................................................... 114 Posúdenie rastu Listeria monocytogenes v LEB bujóne vplyvom rôznych podmienok Greifová Mária, Greif Gabriel, Šovčíková Andrea, Gažová Zdenka, Horáková Katarína ............. 119 Využití NIR spektroskopie k analýze mléka Hadra Luboš, Dračková Michaela, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka ........................................ 124 Měření syřitelnosti mléka pomocí nefelo-turbidimetrického snímače Chládek Gustav, Čejna Vladimír .................................................................................................... 127 Obsah vápnika v surovom mlieku a mliečnych výrobkoch mliekarne vyrábajúcej tvrdé, dlhozrejúce syry Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír .......................................................................................... 131 Vplyv Lactobacillus rhamnosus VT1 a teploty na dynamiku rastu Bacillus cereus Koreňová Janka, Lauková Denisa, Valík Ľubomír, Petríková Jana ............................................... 135 Fenotypické rozlišení poddruhů Lactococccus lactis subsp. lactis a Lactococcus lactis subsp. cremoris Kučerová Kateřina, Kozáková Drahomíra, Šviráková Eva, Plocková Milada ............................... 140 Vliv různých přísad na senzorickou jakost ochucených tvarohů Lachová Hana, Vítová Eva, Tykvart Jan, Loupancová Blanka ...................................................... 144 Změny obsahů mastných kyselin a dalších aromatických látek sýra Niva Loupancová Blanka, Vítová Eva, Zemanová Jana, Lachová Hana ................................................. 149 Aplikace metody PCR pro důkaz přítomnosti kravského mléka v kozích sýrech Mašková Eva, Paulíčková Ivana ..................................................................................................... 155 Vliv jahodového aroma na senzorické hodnocení mléka Panovská Zdeňka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila, Košulič Pavel ......................................... 160 Možnosti využití NIR spektroskopie při analýze sýrů Růžičková Jana, Mlček Jiří, Šustová Květoslava ........................................................................... 164 Použití kyseliny mléčné a jejích derivátů v mlékárenském průmyslu. Straková Markéta ............................................................................................................................ 168 Genotypická charakterizace vybraných kmenů Lactococcus lactis subsp. lactis a Lactococcus lactis subsp. cremoris Šviráková Eva, Kučerová Kateřina, Kozáková Drahomíra, Plocková Milada ............................... 171
4
Možnosti vzniku kontaminantů interakcí aromatických složek s chlorovou vodou Uvíra Roman., Pudil František., Janda Václav ................................................................................ 178 Zhodnocení vlivu počtu somatických buněk na syřitelnost a jakost sýřeniny ovčího mléka Zajícová Pavlína, Kuchtík Jan ........................................................................................................ 184 Správna výrobná prax (HACCP) a hygienický režim v prvovýrobe mlieka pre zabezpečenie kvalitnej suroviny na výrobu zdravotne nezávadných mliečnych produktov Foltys Vladimír, Lehutová Soňa, Kirchnerová Katarína ................................................................. 187 Aplikace AFM pro studium vlastností kaseinu Trčková Jana, Helstad Kristina, Dejmek Petr, Štětina Jiří............................................................... 192
5
CONTENS Results of 9th National Cheese Show Čurda Ladislav, Štětina Jiří................................................................................................................ 13 New knowledge on cheese microbiology presented on IDF symposium in Prague in 2004 Plocková Milada, Chumchalová Jana, Giesová Markéta .................................................................. 21 Dietary guidelines in Czech republic Dostálová Jana, Hrubý Stanislav, Turek Bohumil............................................................................. 25 Research of the effect of κ– casein genetic variance on technological cheese properties Marková Marie, Snášelová Jana, Buchvaldková Tereza, Kott Tomáš .............................................. 28 A coagulation time of individual milk samples and its relationship with a number and phase of lactation in holstein cows Čejna Vladimír, Chládek Gustav ....................................................................................................... 33 Effect of protective lactobacilli cultures on dynamics of souring and ripening of semihard cheeses Kontová Marcela, Greifová Mária, Hudáček Jaroslav, Drončovský Maroš...................................... 38 Significance of lactococci identification in connection with their autolytic activity Kozáková Drahomíra, Kučerová Kateřina, Šviráková Eva, Holubová Jitka, Plocková Milada........ 44 New by technology of cheese production and milk product packaging Harhovský Milan ............................................................................................................................... 50 Occurrence of biogenic amines in cheese Černý Vladimír, Křížek Martin, Kvasničková Eva, Havlíková Šárka............................................... 53 Evaluation of free fatty acids in bulk milk samples of raw cow milk Kopunecz Pavel, Štěpánková Jitka ................................................................................................... 56 Technological properties of non-bovine milks Boroš Vladimír, Herian Karol ........................................................................................................... 61 Results of sensory evaluted of goat‘s cheese manufactured on farmhouse Šustová Květoslava, Mášová Hana, Kuchtík Jan............................................................................... 65 Quantitative study of potential antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus VT1 in milk Valík Ľubomír, Lauková Denisa, Polka Peter, Bajúsová Barbora .................................................... 68 Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth dynamics of Listeria monocytogenes 272 Petríková Jana, Lauková Denisa, Valík Ľubomír ............................................................................. 73 The dependence of pH on the antimicrobial activity of fatty acids and their derivatives with polyols Bartošová Eva, Prekop Jiří, Janšová Jitka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ......................................... 78 Enzymatic activity of bacteria used in the production of jogurts with probiotic properties Trojanová Iva, Rada Vojtěch, Vlková Eva ....................................................................................... 83 Effect of the AW and the heat shock on the Streptococcus thermophilus Komárková Eliška, Erban Vladimír .................................................................................................. 88 The influence of galactooligosaccharides on the growth of lactic acid bacteria Čurda Ladislav, Holubová Jitka, Rudolfová Jana, Němečková Irena .............................................. 93 7
Posters: The superficial microflora of blue cheese Niva Čanigová Margita, Kusá Silvia ......................................................................................................... 99 Changes in Microbiological and Chemical Composition in Hard Cheeses Černý V., Erban V., Šatná Z., Šatný A., Komárková E., Ledvinka P.............................................. 104 Determination of fat and lactose in milk by FT-NIR Dračková Michaela, Hadra Luboš, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka ...................................... 107 Effect of Laktocid and Optiform + Purac on the growth of Lactobacilli indigenous from delicacy product Fialová Jana, Chumchalová Jana, Míková Kamila ......................................................................... 110 The influence of pH and Hydrolysis Degree on foaming properties of enzymatic WPC hydrolysates Gallier Sophie, Dryáková Adriena, Čurda Ladislav ....................................................................... 114 Evaluation of growth of Listeria monocytogenes in LEB broth under various conditions Greifová Mária, Greif Gabriel, Šovčíková Andrea, Gažová Zdenka, Horáková Katarína ............. 119 Use of near-infrared spectroscopy to milk analysis Hadra Luboš, Dračková Michaela, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka ........................................ 124 Determination of coagualtion time with the aid of nephelo-turbidimeter Chládek Gustav, Čejna Vladimír .................................................................................................... 127 The calcium content in raw milk and milk products of milk factory producing hard, long time ripening cheeses Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír .......................................................................................... 131 Effect Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth dynamics of Bacillus cereus Koreňová Janka, Lauková Denisa, Valík Ľubomír, Petríková Jana ............................................... 135 Phenotypical subspecies differentiation of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris Kučerová Kateřina, Kozáková Drahomíra, Šviráková Eva, Plocková Milada ............................... 140 The influence of various additives on sensory quality of flavoured cream cheese Lachová Hana, Vítová Eva, Tykvart Jan, Loupancová Blanka ...................................................... 144 Content changes of fatty acids and the other aromatic substances in Niva cheese Loupancová, Blanka Vítová Eva, Zemanová Jana, Lachová Hana ................................................. 149 Application of PCR method for the detection of cow milk in goats’ cheeses Mašková Eva, Paulíčková Ivana ..................................................................................................... 155 The effect of strawberry aroma on perception of fat and taste in milk Panovská Zdeňka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila, Košulič Pavel ......................................... 160 The possibility of application of the ft NIR spectroscopy in the analysis of cheese Růžičková Jana, Mlček Jiří, Šustová Květoslava ........................................................................... 164 Usage of lactic acid and their derivates in dairy industry. Straková Markéta ............................................................................................................................ 168 Genotypical characterization of selected strains of Lactococcus lactis susbs. lactis and Lactococcus lactis subsp. cremoris Šviráková Eva, Kučerová Kateřina, Kozáková Drahomíra, Plocková Milada ............................... 171 8
Possible contaminants produced by interaction of aroma compounds with chlorinated water Uvíra Roman., Pudil František., Janda Václav ................................................................................ 178 Evaluation of the effect of somatic cell counts on rennetability and quality of rennet curdling of sheep milk Zajícová Pavlína, Kuchtík Jan ........................................................................................................ 184 Proper production practice (HACCP) and hygienic regime in primary milk production to produce good quality raw material for production of milk products of health sustaining quality Foltys Vladimír, Lehutová Soňa, Kirchnerová Katarína ................................................................. 187 Application of AFM for study of casein Trčková Jana, Helstad Kristina, Dejmek Petr, Štětina Jiří............................................................... 188
9
Přednášky
VÝSLEDKY 9. ROČNÍKU CELOSTÁTNÍCH PŘEHLÍDEK SÝRŮ Čurda Ladislav, Štětina Jiří Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha RESULTS OF 9TH NATIONAL CHEESE SHOW Summary: The 9th National Cheese Show was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 13 and 19 of January 2009 in Prague. 73 hard, semi-hard, mould, white and fresh cheeses of 17 producers competed in this year’s show. Competitive samples of cheeses were divided into 11 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three members assessed each cheese. Altogether 165 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (8 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the show. The National Cheese Show was accompanied by a seminar called „Milk and Cheeses 2005“ with a scientific programme involving 18 lectures and 22 poster presentations.
9. ročník Celostátních přehlídek sýrů se uskutečnil ve dnech 13. a 19. ledna 2005, 20. ledna 2005 pak seminář Mléko a sýry. Organizátorem obou akcí je Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT společně s Českomoravským svazem mlékárenským a Českou společností chemickou, konaly se pod záštitou rektora VŠCHT prof. Ing. Vlastimila Růžičky, CSc., který přehlídky osobně zahájil. Hodnocení sýrů Systém hodnocení vzorků zůstává bez podstatných změn od 6. ročníku a byl blíže popsán ve sborníku z r. 2002 a v Mlékařských listech č. 69. Nová kategorie neochucených čerstvých a termizovaných sýrů byla hodnocena na rozdíl od ostatních kategorií neanonymně. Hodnocení sýrů komisemi expertů proběhlo 13. 1. 2005 na VŠCHT. Při veřejném hodnocení (19. 1. 2005) každý sýr posuzovaly komise složené ze zástupců sýráren, studentů, novinářů a dalších hostů - celkem 165 hodnotitelů Diplomy byly uděleny na základě odborného hodnocení. Hodnocení zahraničních sýrů proběhlo stejným způsobem jako loni. Na hodnocení se podíleli členové všech expertních komisí včetně členů departážní komise (celkem 40 hodnotitelů). Sýry byly zařazeny do 5 kvalitativních kategorií: vynikající, výborný, velmi dobrý, průměrný a podprůměrný. Každý hodnotitel mohl navrhnout 3 sýry na ocenění diplomem. Konečné rozhodnutí o udělení diplomů provedla departážní komise. Při veřejném hodnocení nebyly zahraniční sýry posuzovány v komisích, ale byly vystaveny společně s českými sýry. Vzorky V letošním ročníku soutěžilo v 11 kategoriích 73 vzorků ze 17 českých sýráren. Tuzemské vzorky byly doplněny 8 vzorky sýrů z dovozu od 5 dovozových firem. Ani letos se přes veškerou snahu nepodařilo získat pro hodnocení vzorky ze Slovenska – pouze jedna sýrárna (Agrofarma Červený Kameň) se prezentovala na výstavě (Tabulka VI). K nejsilněji obsazeným kategoriím patřily tradičně obě kategorie eidamských sýrů (20 - 30% t.v.s. a 40 – 50 % t. v s.), kategorie sýrů s plísní na povrchu a nově zařazená skupina neochucených čerstvých a termizovaných sýrů. Letos se na rozdíl od loňského ročníku podařilo otevřít i kategorii tvrdých a polotvrdých sýrů s dobou zrání minimálně 3 měsíce. V dalších kategoriích (sýry s tvorbou ok, typu Moravský blok, uzené sýry, sýry s plísní v těstě a speciality) bylo hodnoceno 5 – 7 vzorků. Nejméně obsazenou kategorií 13
tak byly bílé sýry (3 vzorky), i když bylo zrušeno omezení na polotvrdé a tvrdé sýry. Rozdělení vzorků do kategorií je uvedeno v tab. I. V tab. II je pak přehled zúčastněných výrobců, resp. přihlašovatelů sýrů. Tabulka I Rozdělení hodnocených sýrů do kategorií. Po čet vzo rků
Katego rie
ČR
Zahraniční
1
Eidam ské sýry 2 0 -3 0 % t.v s.
8
2
Eidam ské sýry 4 0 -5 0 % t.v s.
10
3
Po lo tvrdé a tvrdé sýry zrající m in. 3 m ěsíce
5
4
Sýry s tvo rbo u o k
6
5
Sýry typu M o ravský blo k
6
6
U zené sýry
7
1
7
Sýry s plísní na po vrchu
8
2
8
Sýry s plísní v těstě
5
2
9
Bílé sýry
3
1
10
Čerstvé a term izo vané sýry neo chucené
9
11
Speciality
6
2
Celkem
73
8
Tabulka II Přehled přihlašovatelů sýrů a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích. Přihlašovatel Česká republika Agricol, s.r.o., Polička Jaroměřická mlékárna, a.s. Krkonošské sýrárny, a.s. KROMILK, s.r.o., Kroměříž MADETA, a.s. MILTRA B, s.r.o., Městečko Trnávka Mlékárna Klatovy, a.s. Mlékárna Olešnice, RMD Olešnice na Moravě Mlékárna Otínoves, s.r.o. Mlékárna Polná, s.r.o. Moravia Lacto a.s., Jihlava Niva, s.r.o., Dolní Přím Orrero, a.s., Litovel PLASTCOM, a.s., mlékárna Příšovice Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany Pribina, s.r.o., Přibyslav Provital milk, a.s., provoz Plzeň Vzorky z ČR celkem Dovozce zahraničních sýrů ACCOM, s.r.o. BEL Sýry Česko, a.s. IMCO, s.r.o. Lactalis Europe Centrale Et Orientale, s.r.o. SEAFOOD s.r.o. Sýry z dovozu celkem
Počet sýrů 2 9 5 4 16 4 6 1 1 3 4 1 1 7 6 1 2 73 1 1 2 2 2 8
1
2
3
4
5
1 1 2
1 2 1
1
1
1 1
1 1 1
1 1 2
5
1
1
Kategorie 6 7
8
9
1 1 1
3
10
11
1
1
4 1
2
1 1
1 1
1
1 1 1
1
1
1
3 1
1
1 2
1
1
2 4 1 2
8
10
5
6
6
7
2
8
5
3
9
2
0
0
6
1 1 1
1 1
1 2
0
14
0
0
1
0
1
2
2
Výsledky V odborném a veřejném hodnocení bylo 58, resp. 51 % vzorků hodnoceno jako výborné nebo velmi dobré (tab. III). Pro účely zařazení do kategorií při veřejném hodnocení je v tab. III použito bodové hodnocení, i když pořadí bylo sestaveno neparametrickým způsobem. Porovnání četností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nejčastěji objevilo hodnocení 80 body, průměrné hodnocení se lišilo nepatrně (74,1 a 74,2 bodu), stejně jako medián (75 a 76 bodů). Celkové výsledky přehlídek jsou shrnuty v tab. IV, hodnocení vzorků z dovozu je uvedeno v tab. V. Tučně jsou vyznačené vzorky, které obdržely diplom. Celkem bylo tuzemským sýrům uděleno 22 diplomů. Ve dvou kategoriích byly uděleny diplomy za dvě druhá místa, protože se bodové hodnocení sýrů shodovalo. V kategorii specialit nebylo pořadí sestavováno, diplomy po posouzení departážní komisí získaly nejlépe hodnocené vzorky určitého typu. Departážní komise posuzovala také 1 vzorek ze 2. kategorie, kde paralelní komise expertů nedospěly k požadované shodě v průměrném hodnocení. Hodnocení departážní komise leželo mezi výsledky obou komisí expertů, proto bylo ponecháno původní hodnocení. Podobně jako v loňském roce byly nejlépe hodnoceny eidamy společnosti MILTRA B s. r. o., Městečko Trnávka a Krkonošských sýráren a. s., Jičín. Druhé místo v kategorii sýrů s tvorbou ok obhájil Zámecký sýr (Jaroměřická mlékárna a. s.) a první místo mezi moravskými bloky výrobek Mlékárny Klatovy a. s., druhý byl v této kategorii stejně jako loni Moravský blok z mlékárny Moravia Lacto a. s., Jihlava. Také první místo mezi sýry s plísní na povrchu patří znovu Kamadetu (Madeta a. s.) a stejný výrobce opakovaně získal ocenění mezi specialitami za Blaťácké zlato s pepřem. Z 22 udělených diplomů získalo diplom i v loňském roce 7 sýrů. K nejúspěšnějším výrobcům letos patří Madeta a. s. a Jaroměřická mlékárna a. s., kteří získali tři a více diplomů. K bodově nejlépe hodnoceným patřilo Blaťácké zlato, Eidamský uzený sýr (Mlékárna Polná s. r. o.) a Moravský blok (Mlékárna Klatovy a. s.) – tyto sýry získaly v odborném hodnocení více než 90 bodů. Ve veřejném hodnocení, kde se ke zpracování používá neparametrické vyhodnocení, byl nejlépe hodnocený Sedlčanský Vltavín (Povltavské mlékárny, a.s., Sedlčany) následovaný Eidamským uzeným sýrem (Mlékárna Polná, s.r.o.) a Moravským blokem (Mlékárna Klatovy, a.s.). Shoda odborného a veřejného hodnocení je poměrně dobrá. Dokládá to např.skutečnost, že ve všech kategoriích sýry, které získaly v odborném hodnocení 1. místo byly ve veřejném hodnocení opět na prvním nebo na druhém místě (s výjimkou kategorie čerstvých a termizovaných sýrů). V kategorii uzených sýrů bylo celé pořadí u obou hodnocení téměř shodné (záměna pouze na 5. a 6. místě s minimálním bodovým rozdílem). Mezi českými sýry byl bez vědomí organizátorů hodnocen v kategorii sýrů s tvorbou ok také sýr polské výroby, který pod názvem Domkářský sýr přihlásila Madeta, a. s. Tento sýr, zakoupený v síti Kaufland, byl ve své kategorii hodnocen jako nejhorší, i v celkovém pořadí obsadil v odborném hodnocení poslední a ve veřejném hodnocení předposlední místo. Je potěšitelné, že i veřejná komise spolehlivě rozpoznala nekvalitní výrobek. Vysokou kvalitou se vyznačovaly vzorky sýrů z dovozu dodané firmami Lactalis Europe Centrale Et Orientale s. r. o., SEAFOOD s. r. o., IMCO s. r. o., BEL Sýry Česko a. s. a Accom s. r. o. Osm sýrů bylo hodnoceno v tomto případě neanonymně všemi členy expertních komisí. Zasvěcený výklad k nim podal pan Ladislav Likler. Jednoznačným vítězem se stal ovčí sýr Roquefort (Lactalis Europe Centrale Et Orientale s. r. o.), diplom dále získal měkký sýr Brillat Savarin se 72 % t. v s. (SEAFOOD s. r. o.) a kozí sýr Soignon Buche Affinée (IMCO s. r. o.). Výsledky hodnocení jsou uvedeny v tab. V. Odpolední odborný program přehlídek sýrů zahrnoval několik zajímavých přednášek, např. Ing. J. Kopáček, CSc. (ČMSM) seznámil účastníky se světovým mlékárenským summitem v Austrálii a doc. Ing. M. Plocková, CSc. (VŠCHT Praha) informovala o nových poznatcích z mikrobiologie sýrů, které byly prezentovány na IDF symposiu v Praze. Na přehlídky tradičně navazuje seminář Mléko a sýry. Na semináři se 137 registrovanými účastníky zaznělo celkem 18 přednášek a bylo prezentováno 22 plakátových sdělení. Renomé semináře bezesporu zvyšuje účast zahraničních hostů. Letos vystoupil s velmi zajímavou přednáškou o synerezi sýřeniny prof. Petr Dejmek P. (Department of Food Engineering, Lund 15
University, Sweden). Dr. Magnus Larsson (Arla Foods Innovation, Sweden) pak informoval o výsledcích výzkumu modelových sýrů bez tuku vyrobených z koncentrátu kaseinu získaného membránovými postupy. Bohatá byla v letošním ročníku přehlídek a semináře také prezentace firem, dodávajících technologie, laboratorní zařízení a suroviny pro potravinářský průmysl. Účastníci veřejného hodnocení měli možnost ochutnat soutěžní sýry z dovozu na výstavě v menze Studentský dům, která vedle sýrů z dovozu představila i další sýry našich výrobců – celkem 88 sýrů od 20 dodavatelů (viz přehled v tab. VI). Organizátoři doufají, že příští jubilejní 10. Celostátní přehlídky sýrů i seminář Mléko a sýry 2006 budou nejméně stejně úspěšné jako letošní ročník.
Tabulka III Rozdělení hodnocených sýrů do kvalitativních kategorií Bodové
Kvalitativní kategorie
Odborné hodnocení Veřejné hodnocení
hodnocení
počet vz.
%
počet vz.
%
Výborný (ideální typ) Velmi dobrý
90 - 100 75 - 89
3 38
4 52
0 37
0 51
Průměrný (standardní kvalita) Podprůměrný Nevyhovující
50 - 74 30 - 49 < 30
28 4 0
38 5 0
35 1 0
48 1 0
Obr. 1 Porovnání relativních četností hodnocení expertů a při veřejném hodnocení.
25
Hodnocení expertů Veřejné hodnocení
15 10 5
Bodové hodnocení
16
0 10
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0 0
Relativní četnost [%]
20
Tabulka IV Výsledky Celostátních přehlídek sýrů
Tabulka IV - pokračování Výsledky Celostátních přehlídek sýrů
Tabulka V Výsledky Celostátních přehlídek sýrů – zahraniční vzorky Sýr
Dovozce
Leerdammer Smoked Cheddar Cheese Soignon Buche Affinée Coulommiers Paladin Roquefort Brillat Savarin Pyramide Valenccy
BEL Sýry Česko a. s. IMCO spol. s r. o. IMCO spol. s r. o. Lactalis Europe Centrale Et Orientale, s. r. o. ACCOM s. r. o. Lactalis Europe Centrale Et Orientale, s. r. o. SEAFOOD s. r. o. SEAFOOD s. r. o.
Kategorie sýrů: 4. Sýry s tvorbou ok 6. Uzené sýry 7. Sýry s plísní na povrchu 8. Sýry s plísní v těstě 11. Speciality
Kategorie 4 6 7 7 8 8 11 11
t. v s. suš. [%] Modus [%] 45 60 2 50 3 45 1 50 52 2 50 3 50 52 1 72 1 50 2
Medián 2 2 1,5 2 3 1 1 2
Návrhy na diplom 10 4 17 11 3 39 26 13
Kvalitativní kategorie: 1. Vynikající 2. Výborný 3. Velmi dobrý 4. Průměrný 5. Podprůměrný
Tabulka VI Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a semináře Mléko a sýry 2005 Společnost, sýrárna (výrobce) Agricol s.r.o., Polička Jaroměřická mlékárna a.s. Krkonošské sýrárny a.s., Jičín
KROMILK s.r.o., Kroměříž
MADETA a.s., České Budějovice
Mlékárna Klatovy a.s.
Sýr Eidamská cihla Eidamská cihla Zámecký sýr Fénix - termizovaný smetanový sýr Krkonošský eidam Krkonošský eidam Krkonošský eidam Krkonošský eidam strouhaný Krkonošský eidam strouhaný Krkonošský eidam uzený Krkonošský eidam uzený strouhaný Moravský bochník Nezrající čerstvý sýr Krajanka - zálesák Krajanka - termizovaný smetanový sýr Žervé klasik smetanový sýr termizovaný Madeland holandského typu Madeland light holandského typu Primátor Jihočeský eidam plátkový Jihočeský eidam plátkový Jihočeský uzený sýr Uzený sýr plátkový Strouhaný sýr na pizzu a saláty Strouhaný sýr speciál jemný Strouhaný sýr light Bláťácké zlato Bláťácké zlato se zeleným pepřem Bláťácké zlato s vlašskými ořechy Akawi - bílý sýr Jadel - bílý sýr Cottage - čerstvý sýr ve smetaně Šumava -eidam 30% Šumava -eidam 40% Šumava -eidam 45% Šumava -eidam uzený 40% Šumava -moravský blok 45% Šumava -polotvrdý sýr 50%
19
tvs (%) 30 40 45 26* 20 30 45 30 45 45 45 45 60 24* 26* 15* 45 30 45 30 45 44 44 44 45 30 48 48 48 42 40 30 40 45 40 45 50
Tabulka VI - pokračování Seznam sýrů vystavených v průběhu Celostátních přehlídek sýrů a semináře Mléko a sýry 2005 Společnost, sýrárna (výrobce) Mlékárna Olešnice, RMD Olešnice na Moravě Mlékárna Otínoves s.r.o. Mlékárna Polná s.r.o.
Moravia Lacto a.s., Jihlava
Niva s.r.o., Dolní Přím PLASTCOM a.s., mlékárna Příšovice
Povltavské mlékárny a.s., Sedlčany
Provital milk a.s., provoz Plzeň
AGROFARMA s.r.o., Červený Kameň, SR
ACCOM s.r.o. BEL Sýry Ćesko a.s. IMCO spol. s r.o. Lactalis Europe Centrale Et Orientale s.r.o. SEAFOOD s.r.o.
Sýr Imperial - čerstvý tvarohový sýr Imperial s pažitkou Sýr Niva Zlatá Praha Balkánský sýr Koliba Eidamský sýr Eidamský sýr uzený MP sýr eidam s česnekem MP sýr eidam s bazalkou MP sýr eidam s paprikou a pepřem Selský sýr Excellent pažitka Excellent mix zelený pepř a chilli Excellent uzený s česnekem Moravský blok Niva -sýr s plísní uvnitř hmoty Gaston s bazalkou Gaston s bazalkou (oválek - porcovaný) Gaston s bazalkou (plátkový sýr) Gaston s pepřem (oválek - porcovaný) Gaston se zeleným pepřem (plátkový sýr) Eidamský uzený sýr (cihla) Eidamský uzený blok Eidamský bloček Bergtilster - přírodní pikantní sýr plátkový Alpdamer (plátkový sýr) Pikantní pomazánka z tvarohu a kousky hermelínu - se salámem Pikantní pomazánka z tvarohu a kousky hermelínu - s česnekem Lučina - Jogurtina Lučina Camembert - Karel IV Harlekýn Zahraniční sýry Bryndza - zimná plnotučná Ovčí sýr Feta Slovenská Feta Gazdovský Oštiepok údený Gazdovský polooštiepok neúdený Gazdovský polooštiepok údený Gazdovská Parenice údená Paladin Leerdammer Smoked Cheddar Cheese Soignon Buche Affinée Coulommiers Roquefort Pyramide Valenccy Brillat Savarin
* - absolutní obsah tuku
20
tvs (%) 8* 8* 52 50 50 45 45 45 45 45 45 50 45 45 45 45 50 50 50 50 50 50 45 45 45 35 45 24* 23,5* 21* 27* 48 48
48 45 48 40 40 40 38 50 45 50 45 50 50 50 72
NOVÉ POZNATKY O MIKROBIOLOGII SÝRŮ PREZENTOVANÉ NA IDF SYMPOSIU V PRAZE V ROCE 2004 Plocková Milada, Chumchalová Jana, Giesová Markéta Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha NEW KNOWLEDGE ON CHEESE MICROBIOLOGY PRESENTED ON IDF SYMPOSIUM IN PRAGUE IN 2004
Summary: IDF Symposium on Cheese, Ripening, Characterization and Technology was held 21-25 March 2004 in Prague. There were given over 50 lectures and presented 200 posters there. More than 350 specialists both from scientific research and cheese technology from 40 countries discussed in 11 sessions different actual topics such as - Cheese authenticity; Characterization of casein breakdown in cheese; Microbial ecology of cheese; Determination of enzyme and microbial activities in cheese; Starter, adjunct, surface bacteria, yeast and moulds; Cheese yield etc. In microbiological sessions the role of microorganisms during cheese ripening, study of population dynamic and selection of new strains with desirable properties to ensure safety and quality of cheeses were discussed. The necessity of application of molecular genetic methods for identification of lactic acid bacteria was referred. The examples of successful application of PCR methods for identification of NSLAB lactobacilli in cheese realized at the Department of Dairy and Fat Technology, ICT Prague were presented. Ve dnech 21.-25.3.2004 se v Praze uskutečnilo IDF Symposium on Cheese, Ripening, Characterization and Technology na němž bylo předneseno více než 50 přednášek a prezentováno přes 200 posterových sdělení. Více než 350 odborníků zastupujících vědecko-výzkumný i výrobní sektor téměř ze 40 států celého světa zde rokovalo v 11 níže uvedených odborných sekcích v nichž zazněla následující zajímavá témata: A. Authenticita sýrů, globální přístup k charakterizaci sýrů: Možnost kvantitativního stanovení podílu mléka různých živočišných druhů (kravské, ovčí, kozí) užitého pro výrobu sýrů pomocí isoelektrické fokusace, HPLC a PCR, využití analytických metod (stanovení celkového dusíku, D(-) kyseliny mléčné, druhového zastoupení mikroorganismů, skladby stopových prvků, obsahu různých izotopů prvků, obsahu volných těkavých mastných kyselin a enzymů) pro posouzení geografického původu sýrů. B. Senzorická analýza: Instrumenty používané pro hodnocení senzorické jakosti sýrů, hodnocení vlivu rostlinného tuku, směsi bílkovin a homogenizačního tlaku na distribuci tukových kuliček v mléce a na senzoriku sýrů vyrobených z této suroviny. C. Spektroskopie a chemometrie: Kvantitativní stanovení složek sýrů pomocí NIR spektroskopie, multivariační analýza dat. D. Charakterizace degradace kaseinu v sýrech: Metody sledování degradace kaseinu v sýrech pomocí panelu hodnotitelů, instrumentálně analytickými metodami a imunochemicky, vliv vysokotlakého ošetření mléka na degradaci kaseinu v průběhu zrání sýrů vedoucí k urychlení zracího procesu. E. Vznik buketu sýra, jeho regulace , omezení a chemické aspekty: Role bakterií mléčného kvašení (BMK) při degradaci bílkovin na peptidy, aminokyseliny a aromatické degradační produkty aminokyselin a lipidů na volné mastné kyseliny a jejich transformaci na estery.
21
F. Startérové, přídavné a povrchové kultury bakteriální, kvasinkové a plísňové: Složení povrchových kultur pro rychlou tvorbu mazu na povrchu sýra, interakce mezi přítomnými mikroorganismy, aminotransferasová aktivita laktobacilů, tvorba esterů za účasti heterofermentativních laktobacilů a kvasinek. G. Mikrobiální ekologie sýrů: Kontrola zrání sýrů pomocí kontroly přítomných mikroorganismů a jejich vzájemných interakcí. H. Stanovení enzymových a mikrobiálních aktivit v sýrech: Význam lyse mikroorganismů pomocí autolysinů nebo endolysinů pro zrání sýrů, analýza proteolytických a glykolytických enzymů pomocí MALDI TOF přístroje. I. Metody inkorporace enzymů do sýrů: Využití různých způsobů inkorporace enzymů rozdílného původu (nativní mléčné, syřidlové, mikrobiální ze zákysových kultur i NSLAB) do mléka pro výrobu sýrů, prací vody, solné lázně, soli pro suché solení. J. Výtěžnost sýrů: Využití technologií vysokého tlaku, mikrofiltrace a ultrafiltrace při výrobě sýrů a jejich vliv na výtěžnost sýrů. K. Ekonomické aspekty výroby sýrů včetně zužitkování syrovátky. Výroba sýrů spojena s produkcí syrovátky, jejíž zpracování je nákladné. Posouzeny možnosti zpracování syrovátky v různě velkých sýrárnách. V oblasti mikrobiologie sýrů, která byla diskutována v sekcích E-I, byla pozornost věnována především následujícím problémům: Podrobně byla diskutována role MO při zrání sýrů. Samotné zrání je chápáno jako komplexní proces ovlivněný MO přítomnými v matrici sýra. Rozmanitost MO přispívá ke složitosti a komplexnosti procesu zrání a k rozvoji unikátních organoleptických charakteristik tradičních sýrů. Interakce mezi MO (kompetice, kooperace, antagonismus) ovlivňující přežívání, růst a aktivity MO. Nově je nahlížena i role bakteriocinů BMK, které při výrobě a zrání sýrů plní nejen roli biologických konzervačních látek tlumících růst a životaschopnost technologicky nežádoucích i patogenních bakterií, ale i kontrolují růst NSLAB a podporují lysi buněk zákysových kultur ovlivňující proteolysu a s ní spojený rozvoj chuti a vůně sýra. Mikrobiální ekologie sýrů se věnovala studiu diversity kmenů MO v různých variantách sýrů vyrobených v různých mlékárnách, studiu populační dynamiky v průběhu zracího procesu sýrů, sledování perzistence kmenů uvnitř sýrařských provozů a hledání původu NSLAB a konečně selekci nových kmenů BMK se zvýrazněnými protektivními vlastnostmi (antiklostridiální aktivitou) pro zlepšení bezpečnosti a jakosti sýrů. Pozornost byla zaměřena jednak na regionální speciality, často vyráběné z nepasterovaného mléka, charakterizované velmi heterogenní sekundární mikroflorou ovlivněnou geografickými a technologickými faktory, které jsou zodpovědné za velkou rozmanitost sýrů, u těchto sýrů jsou senzorické vlastnosti často výraznější než u sýrů vyráběných ve velkovýrobních závodech, jednak na sýry průmyslově vyráběné ve velkokapacitních sýrárnách z pasterovaného nebo mikrofiltrovaného mléka mající často méně výraznou chuť a vůni, která však může být zvýrazněna užitím přídavných kultur složených z kmenů s definovanými specifickými aktivitami, které byly izolovány z tradičních sýrů výborné jakosti. Pokrok v mikrobiologii sýrů je výrazně spjat s pokrokem v molekulárně genetických technikách užívaných pro identifikaci BMK, které umožňují identifikace na úrovni druhů (ITSPCR, TTGE, Rep-PCR, ribotypizace) i kmenů (plasmidový profil, PFGE profil, RAPD-PCR). 22
Příkladem použití molekulárně genetických metod k identifikaci laktobacilů ze skupiny NSLAB používaných na ústavu technologie mléka a tuků jsou ITS-PCR, RAPD-PCR (viz obr.1 a 2) a RepPCR.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 Kb Ladder 100 bp Ladder Lb. paracasei SF1 Lb. paracasei SF2 Lb. paracasei SF21 Lb. paracasei O1 Lb. paracasei O2 Lb. paracasei O3 Lb. paracasei O5 Lb. paracasei O11
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Lb. casei 154 Lb. rhamnosus VT1 Lb. casei NCDO161 Lb. paracasei subsp. paracasei LMG13552 Lb. paracasei subsp. tolerans LMG9191 Lb. plantarum LHI10 Lb. plantarum NCDO1752 Lb. plantarum 1246 1 Kb Ladder 100 bp Ladder
Obr. 1 Molekulárně genetické postupy vhodné pro identifikaci laktobacilů ze skupiny NSLAB - metoda ITS-PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 Kb Ladder Lb. paracasei O1 Lb. paracasei O2 Lb. paracasei O3 Lb. paracasei O5 Lb. paracasei O11 Lb. paracasei SF1 Lb. paracasei SF2 Lb. paracasei SF21 Lb. casei 154
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Lb. rhamnosus VT1 Lb. casei NCDO161 Lb. paracasei subsp. paracasei LMG13552 Lb. paracasei subsp. tolerans LMG9191 Lb. plantarum LHI10 Lb. plantarum 1246 Lb. plantarum NCDO1752 1 Kb Ladder 100 bp Ladder prázdná
Obr. 2 Molekulárně genetické postupy vhodné pro identifikaci laktobacilů ze skupiny NSLAB - metoda RAPD-PCR 23
V blízké budoucnosti lze očekávat následující trendy v mikrobiologii sýrů: • další pokrok v molekulárně-genetických metodách pro přesnější identifikaci všech typů mikroorganismů přítomných v sýrech, • matematickou analýzu kinetiky růstu a přežívání mikroorganismů přítomných v matrici sýra, • intensivní využití bioinformatiky pro vyhledávání specifických genů a genových klastrů v mikroorganismech používaných pro výrobu sýrů, • využití metod genetického inženýrství pro přípravu nové generace produkčních mikroorganismů s definovanými aktivitami, • detailní poznání metabolismu funkčních mikroorganismů, které umožní nové zdravotní, technologické a marketingové výhody pro výrobu sýrů. Poděkování: Práce byla podpořena z grantu MSM 6046137305. Kontaktní adresa: Milada Plocková, (
[email protected]), Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6
24
VÝŽIVOVÁ DOPORUČENÍ PRO OBYVATELSTVO ČESKÉ REPUBLIKY Dostálová Jana1, Hrubý Stanislav2, Turek Bohumil3 1 Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha; 2IPVZ, Praha; 3SZÚ Praha DIETARY GUIDELINES IN CZECH REPUBLIC Summary: Dietary guidelines for Czech population formulated by Czech Nutrition Society in 2004 are presented. The new dietary guidelines include several recommendations connected with consumption of milk and milk products e.g. decrease consumption of full fat milk and milk products with high fat content, consume preferably milk and milk products with low fat content, especially fermented milk products, use salt only moderately, prefer salt fortified with iodine for culinary use and various food products. It is recommended to decrease content of trans fatty acids in spread fats including spread fats with milk fat (e.g. AB, Zlatá Haná etc.) Výživa je nejdůležitějším ze všech faktorů životního prostředí, které ovlivňují zdravotní stav populace. Z těchto důvodů jsou ve všech vyspělých zemích již po desetiletí vydávána výživová doporučení pro obyvatelstvo, která odrážejí současný stav vědomostí na tomto poli a jejichž účelem je snížit předčasný výskyt onemocnění závislých na výživě (kardiovaskulární onemocnění, některá nádorová onemocnění, diabetes mellitus II.typu, vysoký tlak a obezita). Výživová doporučení jsou formulována na základě doporučených výživových dávek, které udávají množství nezbytně potřebných živin pro určité skupiny obyvatelstva. Jsou předkládána buď slovní formou nebo formou grafickou (především ve formě potravinových pyramid) a jsou průběžně inovována. V příspěvku je prezentována nejnovější verze výživových doporučení pro obyvatelstvo České republiky, kterou vypracovala Společnost pro výživu v roce 2004. Tato výživová doporučení zahrnují i doporučení ke spotřebě mléčných výrobků např. doporučení ke snížení spotřeby živočišných potravin s vysokým podílem tuku jako je plnotučné mléko a mléčné výrobky s vysokým obsahem tuku, doporučení k udržení, eventuálně k rozšíření, nabídky mléčných výrobků s nízkým obsahem mléčného tuku, zejména zakysaných mléčných výrobků, dále k rozšíření výběru potravin s nižším obsahem soli a k používání soli obohacené jodem při výrobě potravin. Výrobců směsných roztíratelných tuků se týká doporučení ke snížení obsahu trans nenasycených mastných kyselin v jedlých tucích. Úplný text Výživových doporučení pro obyvatelstvo České republiky V současné době přetrvává v České republice vysoký, v řadě případů předčasný, výskyt neinfekčních onemocnění hromadného výskytu, a to zejména aterosklerózy s různými orgánovými komplikacemi, hypertenze, nádorů, především plic a tlustého střeva, obezity, diabetu II. typu, dny, osteoporózy a dalších chorob, které zvyšují nemocnost a zejména pak úmrtnost naší populace proti jiným zemím. V řadě příčin, které vedou k tomuto stavu, má největší význam nesprávná výživa. V nutričních parametrech by mělo být , v souladu s výživovými cíli pro Evropu, které stanovil Regionální úřad pro Evropu WHO, dosaženo následujících změn: - upravení příjmu celkové energetické dávky u jednotlivých populačních skupin v souvislosti s pohybovým režimem tak, aby bylo dosaženo rovnováhy mezi jejím příjmem a výdejem pro udržení optimální tělesné hmotnosti v rozmezí BMI 20-25 - snížení příjmu tuku u dospělé populace tak, aby celkový podíl tuku v energetickém příjmu nepřekročil 30 % optimální energetické hodnoty (tzn. u lehce pracujících dospělých cca 70 g na den), u vyššího energetického výdeje 35 % 25
-
dosažení podílu nasycených, monoenových a polyenových mastných kyselin <1:1,4:>0,6 v celkové dávce tuku, poměru mastných kyselin řady n-6:n-3 maximálně 5:1 a příjmu trans nenasycených mastných kyselin do 2 % celkového energetického příjmu snížení příjmu cholesterolu na max. 300 mg za den (s optimem 100 mg na 1000 kcal) snížení spotřeby jednoduchých cukrů na maximálně 10 % celkové energetické dávky (tzn. u dospělých lehce pracujících cca 60 g na den), při zvýšení podílu polysacharidů snížení spotřeby kuchyňské soli (NaCl) na 5–7 g za den a preferenci používání soli obohacené jodem zvýšení příjmu kyseliny askorbové (vitaminu C) na 100 mg denně zvýšení příjmu vlákniny na 30 g za den zvýšení příjmu dalších ochranných látek jak minerálních, tak vitaminové povahy a dalších přírodních nutrientů, které by zajistily odpovídající antioxidační aktivitu a další ochranné procesy v organizmu (zejména Zn, Se, Ca, J, Cr, karotenů, vitaminu E, ochranných látek obsažených v zelenině apod.). K dosažení těchto cílů by mělo dojít ve spotřebě potravin k následujícím změnám:
-
-
-
-
snížení příjmu živočišných tuků a zvýšení podílu rostlinných olejů v celkové dávce tuku, z nich pak zejména oleje olivového a řepkového, pokud možno bez tepelné úpravy pro zajištění optimálního složení mastných kyselin přijímaného tuku zvýšení spotřeby zeleniny a ovoce včetně ořechů (vzhledem k vysokému obsahu tuku musí být příjem ořechů v souladu s příjmem ostatních zdrojů tuku, aby nedošlo k překročení celkového příjmu tuku) se zřetelem k přívodu ochranných látek, významných v prevenci nádorových i kardiovaskulárních onemocnění, ale též ve vztahu ke snižování přívodu energie a zvýšení obsahu vlákniny ve stravě. Denní příjem zeleniny a ovoce by měl dosahovat až 600 g, včetně zeleniny tepelně upravené, přičemž poměr zeleniny a ovoce by měl být cca 2:1 zvýšení spotřeby luštěnin jako bohatého zdroje kvalitních rostlinných bílkovin s nízkým obsahem tuku, nízkým glykemickým indexem a vysokým obsahem ochranných látek zvýšení spotřeby výrobků z obilovin s vyšším podílem složek celého zrna z důvodů snížení příjmu energie a zvýšení příjmu ochranných látek výrazné zvýšení spotřeby ryb a rybích výrobků, zejména mořských, se zřetelem k významnému postavení této potravinové komodity v intervenčních nutričních opatřeních v prevenci kardiovaskulárních chorob a chorob z nedostatku jodu snížení spotřeby živočišných potravin s vysokým podílem tuku (např. vepřový bok, plnotučné mléko a mléčné výrobky s vysokým obsahem tuku, uzeniny, lahůdkářské výrobky, některé cukrářské výrobky, trvanlivé a jemné pečivo apod.) snížení spotřeby vajec na cca 200 kusů ročně, tj. nejvýše 4 kusy týdně zajištění správného pitného režimu, zejména u dětí a starých osob, tzn. denní příjem minimálně 1,5 až 2 litrů vhodných druhů nápojů (při zvýšené fyzické námaze nebo zvýšené teplotě okolí přiměřeně více), přednostně neslazených cukrem, nejlépe s přirozenou ovocnou složkou. alkoholické nápoje je nutno konzumovat umírněně, aby denní příjem alkoholu nepřekročil u mužů 30 g (přibližně 300 ml vína nebo 0,8 l piva nebo 70 ml lihoviny), u žen 20 g (přibližně 200 ml vína nebo 0,5 l piva nebo 50 ml lihoviny) V kulinářské technologii je třeba se zaměřit: na racionální přípravu stravy, zejména na snižování ztrát vitaminů a jiných ochranných látek. Preferovat vaření a dušení a zamezit tak zvýšenému příjmu toxických produktů vznikajících při smažení, pečení a grilování, zejména u potravin s vyšším podílem živočišných bílkovin (maso, ryby) a zvýšenému příjmu tuku ze smažených či fritovaných pokrmů 26
-
na preferenci technologií s nižším množstvím přidaného tuku a volit vhodný druh tuku podle druhu technologického postupu na zachování dostatečného podílu syrové stravy, zejména zeleniny a ovoce na zvýšení spotřeby zeleninových salátů, zejména s přídavkem olivového nebo řepkového oleje a na rozšíření sortimentu zeleninových a luštěninových pokrmů na doplňování stravy vhodnými doplňky nebo obohacenými potravinami (např. používat sůl s jodem) při zjištění výrazného nedostatku některých nutričních faktorů V oblasti výroby potravin je třeba:
-
snížit obsah trans mastných kyselin v jedlých tucích i ve výrobcích, kde se jedlé tuky používají snížit obsah cukru v nápojích a některých potravinách např. v džemech, kompotech, ale i v některých druzích pečiva, cukrářských výrobcích a zmrzlině rozšířit sortiment výrobků z obilovin s vyšším podílem složek celého zrna udržet, eventuálně ještě rozšířit, nabídku mléčných výrobků s nízkým obsahem mléčného tuku, zejména zakysaných mléčných výrobků rozšířit nabídku zeleninových salátů, zejména čerstvých rozšířit nabídku luštěnin, zejména připravených pro rychlou kulinární úpravu rozšířit výběr potravin s nižším obsahem soli k výrobě potravin používat sůl s jodem zajistit odpovídající označování potravin se všemi informacemi, které jsou rozhodující pro spotřebitele k usměrňování jeho výživy.
Základním požadavkem je samozřejmě dosažení všech parametrů zdravotní nezávadnosti potravin a pokrmů, při zachování principů bezpečnosti potravin. Je nutno dodržovat správný stravovací režim: jíst pravidelně - tři hlavní denní jídla s maximálním energetickým obsahem pro snídani 20 %, oběd 35 % a večeři 30 % a dopolední a odpolední svačinu s maximálně 5-10 energetickými % a pauzou přibližně 3 hodiny mezi jednotlivými denními jídly. Při tvorbě jídelníčku je třeba věnovat pozornost, jak výběru potravin, tak jejich úpravě. Strava by měla být dostatečně pestrá a přiměřená věku, fyzickému zatížení a zdravotnímu stavu Ke konečné formulaci Výživových doporučení pro obyvatelstvo ČR přispěli svými připomínkami: Fórum zdravé výživy, MUDr. Lydie Ryšavá, PhD., doc. MUDr. Miroslav Stránský, prof. MUDr. Josef Šimek, DrSc. a MUDr. Vladimír Zikmund, CSc. Znění VD bylo projednáno a schváleno presidiem a správní radou Společnosti pro výživu v listopadu 2004
27
SLEDOVÁNÍ VLIVU GENETICKÉ VARIANTY κ-KASEINU NA TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI SÝRŮ a a a b Marková Marie , Snášelová Jana , Buchvaldková Tereza , Kott Tomáš b a VÚM MILCOM a.s., VÚŽV RESEARCH OF THE EFFECT OF κ– CASEIN GENETIC VARIANCE ON TECHNOLOGICAL CHEESE PROPERTIES
Summary: The subject of this work was the research of the effect κ-casein genetic variance on the technological cheese properties. With the method PCR – RFLP, the Holstein´s cow was genotyped in the κ-casein locus. Five κ-casein genetic variances AA, AB, AE, BE and BB was selected. From taken away milk a low scalded cheese was made on the pilot plant. Manufactured cheeses were analyzed for the depth and extent of ripening, sensory evaluation, yield and essential amino-acids determination. The highest yield was obtained in κ-casein genetic variance BE. Sensory character evaluation showed the best flavour characteristic in BB variance. The lowest extent of ripening was indicated in κ-casein AB, as well as the highest level of essential amino-acids after 90 days of ripening. The high level of cystein was found in BE variance. V rámci projektu 0176, který se zabývá produkcí a kvalitou mléka a jeho technologickými vlastnostmi v závislosti na genotypu dojnic, financovaného MZe ČR byl sledován vliv genetické varianty κ-kaseinu na technologické vlastnosti sýrů. Metodou PCR – RFLP ve VÚŽV se genotypovalo stádo dojnic holštýnského plemene v lokusu κ-kaseinu. U vybraných zvířat byly provedeny odběry mléka a u jednotlivých vzorků byly stanoveny technologické vlastnosti a provedeny poloprovozní výroby nízkodohřívaných sýrů. U evropských plemen skotu je známo 5 alel lokusu κ-kaseinu (A-E). Tyto alely jsou příkladem substitučního polymorfismu. To znamená, že vznikají záměnou jednoho nukleotidu v řetězci DNA, čímž vznikne řetězec bílkoviny lišící se od původní záměnou jedné nebo více aminokyselin. Taková strukturální změna neovlivňuje zásadně nutriční hodnotu proteinu, ale může ovlivnit fyzikálně chemické vlastnosti kaseinových bílkovin jako jsou doba a teplota denaturace, velikost micel a vazba na vápenatých a fosforečných iontů. Alela κ-kaseinu E vykazuje negativní vliv na technologickou kvalitu mléka a horší výtěžnost po záhřevu. Tato alela ovlivňuje negativně i celkový obsah bílkovin. Kvantitativní ukazatele mléčné užitkovosti však negativně neovlivňuje. Ze sýrařského hlediska je nejzajímavější alela κ-kaseinu B, pro kterou platí obecná závislost mezi přítomností a lepší kvalitou a výtěžností sýřeniny, vyšším obsahem Ca a dalších minerálních látek. Kvantitativní ukazatele dojivosti jsou ke genotypu κ-kaseinu BB v negativní korelaci. Frekvevence variant κ-kaseinu se liší pro jednotlivá plemena. V tabulce I je uvedeno srovnání frekvence výskytu jednotlivých genotypů sledovaného stáda v porovnání s literaturou (Hallén a kol., 2004). Z tabulky vyplývá nízká četnost kombinací BB a EE κ-kaseinu. Výroby nízkodohřívaných sýrů Pro výrobu nízkodohřívaných sýrů na poloprovozním zařízení na sýrařském oddělení ve VÚM Tábor byl použit standardní technologický postup pro sýry typu gouda. Byly odebrány vzorky mléka holštýnského plemene genetických variant κ-kaseinu: AA, AB, AE, BE a BB. Požadovaný objem odebíraného mléka pro použité poloprovozní zařízení byl 200 l. Frekvence výskytu varianty BB ve sledovaném souboru zvířat byla příliš nízká na požadované množství mléka, ale dobrou mikrobiologickou kvalitou mléka, možností rychlého schlazení celého objemu a vyhovujícími podmínkami pro úchovu mléka, bylo umožněno doplnit požadované množství mléka o nádoj z předchozího dne. 28
Tabulka I Varianta κ-kaseinu AA AB AE BB BE EE Σ
soubor 1 n frekvence (%) 61 48,03 31 24,41 30 23,62 4 3,15 1 0,79 127 100,00
soubor 2 n frekvence (%) 188 53,25 90 25,50 47 13,31 6 1,70 20 5,67 2 0,57 353 100,00
soubor 1 - viz literatura Hallén a kol. (2004) soubor 2 - vlastní výsledky – soubor zvířat sledovaný v letech 2003 - 2004
Obr. 1 Poloprovozní výrobní zařízení
Hodnocení syrového mléka U syrového mléka byly zjištěny hodnoty teploty (6,3 – 9,3°C), aktivní kyselosti (pH 6,74 - 6,79), titrační kyselost (6,45 – 6,80), obsah tuku (3,10 – 4,15) a syřitelnost (570 – 725 s). Hodnoty syřitelnosti byly u všech vzorků mléka vyšší než je uváděna optimální hodnota (240 - 420 s) a nejvyšší hodnoty (negativní vliv) měly varianty AA a AE. Rozdílné hodnoty syřitelnosti mléka použitého pro výrobu sýrů, byly eliminovány délkou doby sýření, jejíž změna méně ovlivní průběh zrání změna dávky syřidla. Při výrobě bylo důležité sledovat dobu sýření viz obr. 3. Dávka syřidla byla při první výrobě vzhledem k vysoké hodnotě syřitelnosti u prvního vzorku snížena.
29
Syřitelnost 750
725
čas (s)
700
692 651
650
598
600
570
550 500 AA
AB
AE
BE
BB
varianta κ -kaseinu
Obr. 2 Hodnoty syřitelnosti u syrového mléka
Obr. 3 Konec sýření Hodnocení sýrů Při hodnocení průběhu zrání byl sledován rozsah zrání a hloubka zrání. Rozsah zrání je procentický podíl ve vodě rozpustného dusíku v celkovém dusíku. Rozsah zrání vzrůstá s postupujícím stářím sýrů a nejnižších hodnot bylo dosaženo u κ-kasein AB. Hloubka zrání je podíl aminosloučenin a amoniaku v celkovém dusíku. Nejnižší hloubka zrání byla zjištěna u varianty κ-kaseinu AE. Senzorické hodnocení bylo provedeno zkušenými hodnotiteli ze sýrařského oddělení. Vyrobené sýry byly pružné a vláčné konzistence, typické sýrové chuti, čisté sýrové vůně a na řezu spojitého a světlého vzhledu bez prasklin s menšími očky. U žádné výroby nebyl zjištěn do 90ti dnů výskyt senzorických vad a jako nejlahodnější byl hodnocen sýr vyrobený z varianty BB po 60ti dnech zrání.
Obr. 4 Vzorek vyrobeného sýra (κ-kasein AA - 90 dní) 30
%
80
79,81 9,42 78,21
79,38
9,46
78,77
9,50
9,34
9,33 9,27
75
9,25
73,24
70
9,00 AA
AB
AE kaseinové číslo
BE
kg sýra /100 kg mléka
Hodnota výtěžnosti byla stanovena výpočtem dle vzorce Van Slyke a Publow. Výsledkem je výtěžnost v kg sýra / 100 kg mléka. Výsledky výtěžností jsou uvedeny na obr. 5, kde jsou také porovnány hodnoty kaseinového čísla, které charakterizuje předpokládanou výtěžnost sýra. Nejlepší kaseinové číslo a vysoká výtěžnost byly zjištěny u varianty AA. Zajímavé je porovnání u varianty BB, kde bylo dosaženo nejnižšího kaseinového čísla, přičemž výtěžnost dosahovala hodnot jako varianty s vyšším kaseinovým číslem. Naproti tomu AE měla jedno z největších kaseinových čísel, ale nejnižší výtěžnost. Nejvyšší výtěžnost byla vyhodnocena u BE.
BB
výtěžnost
Obr. 5 Kaseinové číslo a výtěžnost sýrů U vyrobených sýrů byl sledován obsah volných aminokyselin (obr. 6). Obsah všech sledovaných volných aminokyselin v sýrech se zvyšoval s dobou zrání. Esenciální AK dosahují po 90ti dnech nejvyšších hodnot u κ-kaseinu AB. U mléka varianty κ-kaseinu BE byla zjištěna při 5. odběru vysoká hodnota cysteinu, čímž vzniká riziko případných chuťových vad.
Methionin
4000
4000
3000
3000 nmol/g
nmol/g
Cystein
2000
2000 1000
1000
0
0 2
15
30
60
2
90
15
AB
AE
60
90
stáří (dny)
stáří (dny)
AA
30
BE
AA
BB
Obr. 6 Nárůst obsahu AK v průběhu zrání.
31
AB
AE
BE
BB
Závěr
U varianty κ-kaseinu AA byly zjištěny nejhorší hodnoty syřitelnosti, nejlepší kaseinové číslo a vysoká výtěžnost. Nejnižší hodnoty hloubky zrání a nízké hodnoty rozsahu zrání byly zjištěny u κ-kaseinu AE. U κ-kaseinu AB byly stanoveny nejvyšší hodnoty esenciálních aminokyselin po 90ti dnech zrání. Varianta κ-kaseinu BB byla nejchutnější při senzorickém hodnocení ve stáří 60ti dnů a i přesto, že měla nejnižší kaseinové číslo hodnota výtěžnosti tomu neodpovídala. U κ-kaseinu BE byl zjištěn vysoký obsah cysteinu na konci zrání a nejvyšší výtěžnost.
Použitá literatura: 1. Hallén E., Andrén A., Allmere T., Lundén A.: Influence of Genetic Polymorphism on Technological Properties of Cheese Milk, IDF Symposium on Cheese, Prague Czech Republic March 21 – 25, 2004, P 188. 2. Kott T. a kol.: 0176 - Produkce a kvalita mléka a jeho technologické vlastnosti v závislosti na genotypu dojnic, Závěrečná zpráva, MZe ČR 2004 Kontaktní adresa: Ing. Marie Marková, MILCOM a.s., Výzkumný ústav mlékárenský Ke Dvoru 12a, 160 00 Praha 6 – Vokovice tel.: + 420 235 354 551, fax: + 420 235 358 107, e-mail:
[email protected]
32
INDIVIDUÁLNÍ SYŘITELNOST MLÉKA HOLŠTÝNSKÝCH DOJNIC A JEJÍ VZTAH K POŘADÍ A STÁDIU LAKTACE Čejna Vladimír, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně A COAGULATION TIME OF INDIVIDUAL MILK SAMPLES AND ITS RELATIONSHIP WITH A NUMBER AND PHASE OF LACTATION IN HOLSTEIN COWS Summary: Coagulation time significantly affects the whole process of cheese making. In order to analyse fundaments of coagulation we evaluated individual milk samples. We studied relationships between coagulation time and a number and phase of lactation. We sampled daily milk yield of 12 pure-bred Holstein first-calvers and 12 second-calvers on average 25, 45, 73, 101, 133, 166 and 199 days after calving. The mean coagulation time in the first-calvers was 212 s; the mean values found on individual test days were: 161, 192, 213, 237, 241, 244 and 194 s, respectively. The mean coagulation time in the second-calvers was 227 s with the mean values of 184, 180, 197, 251, 252, 264 and 258 s on the respective test days. We found a statistically significant effect (P<0.001) of a phase of lactation and individuality of cows on coagulation time. Number of lactation had no significant effect. Úvod Pořadí a stádium laktace má vliv nejen na množství mléka a jeho obsahové složky, ale také na technologické vlastnosti mléka. Proto jsme se rozhodli sledovat vlivy těchto faktorů na mléčné parametry, které přímo souvisejí s výrobou sýrů (syřitelnost, kvalita sýřeniny, aktivní a titrační kyselost). Dále nás také zajímalo ovlivnění těchto parametrů individualitou dojnice. Jednou z nejdůležitějších vlastností mléka je jeho syřitelnost. Jedná se o schopnost mléka srážet se syřidlem a vytvořit sýřeninu požadovaných vlastností (Gajdůšek, 2003). Syřitelnost mléka bývá rozdělena mezi primární (enzymatická hydrolýza) a sekundární (agregace) fázi, ačkoliv se tyto fáze běžně překrývají. Během primární fáze je na κ-kaseinu rozštěpena syřidlem vazba Phe105 – Met106 (vzniká para-κ-kasein), výsledkem je redukce negativního nádoje a snížení prostorového odpuzování. Syřidlem změněné micely jsou citlivější k agregaci (Walstra, 1990). Nejvýznamnějšími fyzikálně-chemickými faktory ovlivňující syřitelnost jsou obsah kaseinu a zastoupení jeho frakcí, velikost a stav kaseinových micel, obsah a formy vápníku a fosforu, zejména rovnováha kalcium kaseinátového – kalcium fosfátového komplexu, případně i další minerální látky, pH a teplota. Syřitelnost je také ovlivněna výskytem metabolických poruch, nevhodnou výživou, záněty mléčné žlázy a změnami složení mléka v důsledku stádia laktace mlezivo, starodojné mléko (Gajdůšek, 2003). Na posledně jmenované faktory jsme se zaměřili v našem experimentu. Materiál a metody Analyzovali jsme vzorky mléka získané z denního nádoje 24 čistokrevných dojnic holštýnského skotu na chovaných na ŠZP v Žabčicích. Dojnic na první laktaci bylo 12 a stejný počet dojnic byl i na druhé laktaci. Dojnice se nacházely ve stejném stádiu laktace. Odběr individuálních vzorků mléka probíhal 7x po dobu 199 dnů laktace a to v průměrném 25., 45., 73., 101., 133., 166. a 199. dni laktace. Celkem bylo analyzováno 145 vzorků. Analýzy vzorků byly prováděny obvyklými postupy jednak v laboratoři LRM Brno-Chrlice (obsah tuku, bílkovin, laktózy, somatických buněk, koncentrace močoviny) a jednak v laboratoři Ústavu chovu a šlechtění zvířat MZLU v Brně (aktivní kyselost, titrační kyselost a syřitelnost). 33
Syřitelnost byla měřena pomocí „Nefelo-turbidimetrického snímače koagulace mléka“. Tento snímač pracuje na principu nefelometrie a turbidimetrie. Optický detektor přístroje převádí intenzitu dopadajícího světla na elektrický signál a velikost napětí na výstupu optického detektoru je funkcí intenzity světla, které na optický detektor dopadá. Během koagulace dochází k úbytku optického signálu (turbidimetrie), což se projeví úbytkem měřeného napětí. Tento průběh je okamžitě derivován a výsledné vysrážení parakaseinu odpovídá maximální hodnotě derivační křivky. Použili jsme syřidlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 2 ml na 100 ml mléka po zředění syřidla 1:4. Kvalita sýřeniny byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 100 ml zasýřeného mléka při 35 °C a posouzena dle známé tabulky (Gajdůšek, 1999) hodnotící vzhled sýřeniny a syrovátky (třída 1 = nejlepší, třída 5 = nejhorší). Aktivní kyselost byla měřena pH-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments). Titrační kyselost byla prováděna dle ČSN 57 0530 čl. 58. Výsledky Při hodnocení syřitelnosti a dalších ukazatelů (kvalita sýřeniny, aktivní a titrační kyselost) jsme se zaměřili na jejich změny vlivem pořadí laktace, stádia laktace a individuality dojnice. V našem experimentu byla nejlepší syřitelnost na začátku laktace. S prodlužující dobou laktace docházelo ke zhoršování syřitelnosti. Nejhorší hodnota byla dosažena uprostřed laktace (166. laktační den). Průměrné hodnoty syřitelnosti s její variabilitou ukazuje tabulka I. Prodlužování doby syřitelnosti s postupující laktací prokázal i Žižlavský et al. (1989). Zjistili jsme vysoce statisticky průkazný (P<0,001) vliv stádia laktace a také individuality dojnice. Vysoce statisticky průkazný vliv stádia laktace na syřitelnost uvádí také Tyrisevä et al. (2004). Statisticky neprůkazný byl vliv pořadí laktace. Statistickou průkaznost jednotlivých faktorů na vybrané parametry ukazuje tabulka II. Vypočítali jsme také korelační koeficienty jednotlivých vlastností mléka k syřitelnosti (tab III). Nejvyšší korelační koeficienty byly u aktivní kyselosti (0,442), titrační kyselosti (-0,317) a obsahu laktózy (-0,319). Korelační koeficient titrační kyselosti k syřitelnosti byl poněkud menší než zjistil Čejna a Chládek (2004) u plemene českého strakatého (-0,498). Změny v syřitelnosti mléka během laktace ukazuje graf 1. Zde je patrné, že rozdíly mezi dojnicemi na první i druhé laktaci nejsou veliké a syřitelnosti vykazují shodný trend. Při hodnocení kvality sýřeniny vyplynulo, že nejhorší kvalita byla na začátku laktace, jak ukazuje graf 2, kde jsou průměrné hodnoty tříd kvality. Na lineárních trendech je vidět zlepšující se trend v kvalitě sýřeniny s postupující laktací u obou skupin dojnic. Větší vypovídací schopnost má ovšem graf 3, který vyjadřuje procentuální podíl nejkvalitnější třídy sýřeniny. Také zde je vidět minimální podíl nejkvalitnější sýřeniny na začátku laktace. Zjistili jsme statisticky průkazný vliv stádia laktace (P<0,01) a individuality dojnice (P<0,05) na kvalitu sýřeniny. Statisticky neprůkazný byl vliv pořadí laktace. Syřitelnost mléka také ovlivňuje jeho kyselost. Proto jsme též zkoumali změny kyselosti mléka v průběhu laktace. Aktivní kyselost (pH) se s postupujícím stádiem laktace přibližovala k neutrálnějším hodnotám (graf 4). U obou skupin dojnic vykazovala obdobný trend, ovšem mléko dojnic na první laktaci mělo téměř vždy nižší kyselost. Zjistili jsme vysoce statisticky (P<0,001) průkazný vliv pořadí laktace, stádia laktace a individuality dojnice na aktivní kyselost. Titrační kyselost mléka vykazovala u obou skupin dojnic nejvyšší hodnoty na začátku laktace (graf 5). Statisticky průkazný byl vliv stádia laktace (P<0,01) a vysoce statisticky průkazný vliv individuality dojnice (P<0,001) na titrační kyselost. Statisticky neprůkazný byl vliv pořadí laktace.
34
Graf 1: Změny v syřitelnosti mléka v průběhu laktace
Graf 2: Průměrné hodnoty tříd kvality sýřeniny v průběhu laktace
270
(třída sýřeniny)
250
(s)
230 210 190 170 150 25
45
73
101
133
166
3,1 2,9 2,7 2,5 2,3 2,1 1,9 1,7 1,5
y = -0,0968x + 2,6457 2
R = 0,3089
y = -0,0975x + 2,5486 2
R = 0,239
25
199
45
73
133
166
199
den laktace
den laktace I. laktace
101
I. laktace Lineární (I. laktace)
II. laktace
II. laktace Lineární (II. laktace)
Graf 3: Procentuální podíl třídy sýřeniny 1 (nejkvalitnější)
(%)
50 40 30 20 10
II. laktace I. laktace
0
25
45
73
101
133
166
199
den laktace I. laktace
II. laktace
Graf 4: Změny aktivní kyselost (pH) v průběhu laktace
Graf 5: Změny titrační kyselost (SH) průběhu laktace
v
6,85
6,75
(SH)
(pH)
6,8
6,7 6,65 6,6 25
45
73
101
133
166
199
25
den laktace I. laktace
7,4 7,3 7,2 7,1 7 6,9 6,8 6,7 6,6 45
73
101
133
166
den laktace II. laktace
I. laktace
35
II. laktace
199
Tabulka I Průměrné hodnoty sledovaných ukazatelů při jednotlivých odběrech I. laktace II. laktace I. laktace syřitelnost syřitelnost tř. syř.
II. laktace tř. syř.
I. laktace AK
II. laktace AK
I. laktace TK
II. laktace TK
den laktace
(s)
(s)
(tř)
(tř)
(pH)
(pH)
(SH)
(SH)
25 45 73 101 133 166 199
161 192 213 237 241 244 194
184 180 197 251 252 264 258
2,11 2,92 2,45 1,60 2,00 2,20 1,83
2,60 2,83 1,78 2,17 2,42 1,92 2,09
6,62 6,73 6,78 6,83 6,80 6,81 6,69
6,65 6,67 6,71 6,70 6,70 6,70 6,66
7,07 7,28 6,76 6,90 6,91 6,71 7,14
7,22 7,12 6,91 6,92 6,96 7,03 6,90
212 31,13 14,71
227 37,61 16,60
2,16 0,43 19,96
2,26 0,38 16,66
6,75 0,08 1,12
6,68 0,02 0,35
6,97 0,21 2,96
7,01 0,12 1,74
průměr Sx Vx
Tabulka II Statistická průkaznost jednotlivých faktorů na vybrané parametry mléka
Tabulka III Korelační koeficienty mezi parametry a syřitelností mléka Jednotky
Korelační koeficenty k syřitelnosti
Aktivní kyselost
(pH)
0,442
Titrační kyselost
(SH)
-0,317
faktor parametr syřitelnost třída sýřeniny aktivní kyselost titrační kyselost
pořadí stádium individualita laktace laktace dojnice
0
***
***
0,2237
0,000
0,000
0
**
*
0,754
0,0027
0,0134
***
***
***
0,000
0,000
0,000
0
**
***
0,1454
0,0064
0,000
vybranými
Parametr
3
(g/cm )
0,141
Obsah tuku
(%)
-0,270
Obsah bílkovin
(%)
0,205
Obsah laktózy
(%)
-0,319
(mg/100 ml)
0,139
(tis/ml)
-0,029
Měrná hmotnost
Koncentrace močoviny Počet somatických buněk
0=stat. neprůkazné, *=P<0,05, **=P<0,01, ***=P<0,001
Závěr Laktační cyklus ovlivňuje nejen obsahové složky mléka, ale i jeho technologické vlastnosti. Jednotlivé mléčné parametry však nelze hodnotit osamoceně, neboť mezi nimi existují vzájemné vztahy. Syřitelnost mléka se s postupujícím stádiem laktace prodlužovala a nejvyšších hodnot dosahovala uprostřed laktace. Průměrná délka syřitelnosti u dojnic na první laktaci byla 212 s, u dojnic na druhé laktaci byla průměrná syřitelnost 227 s. Projevil se vysoce statisticky průkazný (P<0,001) vliv stádia laktace a individuality dojnice. Statisticky neprůkazný byl vliv pořadí laktace. Nejvyšší korelační koeficienty vztahující se k syřitelnosti jsme zaznamenali u aktivní kyselosti (0,442), titrační kyselosti (-0,317) a obsahu laktózy (-0,319).
36
S prodlužující dobou laktace se zlepšovala kvality sýřeniny a to ve shodném trendu u obou skupin dojnic. Zjistili jsme statisticky průkazný vliv stádia laktace (P<0,01) a individuality dojnice (P<0,05) na kvalitu sýřeniny. Statisticky neprůkazný byl vliv pořadí laktace. Aktivní kyselost dosáhla nejvyšších hodnot ve druhé třetině laktace. Prokázali jsme vysoce statisticky (P<0,001) průkazný vliv pořadí laktace, stádia laktace a individuality dojnice na aktivní kyselost. Titrační kyselost vykazovala nejvyšších hodnot na začátku laktace. Byl zjištěn statisticky průkazný vliv stádia laktace (P<0,01) a vysoce statisticky průkazný vliv individuality dojnice (P<0,001) na titrační kyselost. Statisticky neprůkazný byl vliv pořadí laktace. Z našeho experimentu vyplývá, že námi sledované parametry jsou podstatně více ovlivněny stádiem laktace a individualitou dojnice, než samotným pořadím laktace. Použitá literatura 1. Čejna, V., Chládek, G.: Vliv stádia laktace na titrační kyselost a syřitelnost mléka dojnic českého strakatého plemene. Sborník: Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků. 2004, s. 33 – 34 2. Gajdůšek,S.: Mlékařství II (cvičení). Brno: MZLU, 1999, 92 s. 3. Gajdůšek, S.: Laktologie. Brno: MZLU. 2003, 84 s. 4. Tyrisevä, A. M., Vahlsten, T., Ruottinen, O., Ojala, M. Noncoagulation of Milk in Finnish Ayrshire and Holstein-Friesian Cows and Effect of Herds on Milk Coagulation Ability. J. Dairy Sci. 2004, 87:3958-3966 5. Walstra, P.: On the Stability of Casein Micelles. J. Dairy Sci. 1990, 73:1965-1979 6. Žižlavský, J., Mikšík, J., Gajdůšek, S., Pospíšil, Z.: Průběh a variabilita složek a vlastností mléka krav v prvních 100 dnech laktace. Živočišná výroba, 34 (LXII), č. 8, 1989, s. 675 - 685 Kontaktní adresa:
[email protected],
[email protected]
37
VPLYV DOPLNKOVÝCH KULTÚR LAKTOBACILOV NA DYNAMIKU PREKYSÁVANIA A ZRENIA POLOTVRDÝCH SYROV Kontová Marcela1, Greifová Mária2, Hudáček Jaroslav1, Drončovský Maroš1 1 Výskumný ústav mliekarenský, Žilina 2 Katedra potravinárskej technológie, FCHPT-STU, Bratislava, Slovenská republika EFFECT OF PROTECTIVE LACTOBACILLI CULTURES ON DYNAMICS OF SOURING AND RIPENING OF SEMI-HARD CHEESES Summary: Regulation of both cheese souring during its production and proteolysis during the stage of ripening are necessary to ensure quality and health safety of cheeses. This presentation summarises data from laboratory, semi-pilot and pilot plant experiments focussed on effect of selected protective cultures of lactobacilli (Lactobacillus rhamnosus LC 705 a Lactobacillus plantarum ALC01) in mixture with several strains of lactococci commonly used in technology on the course of souring and ripening of semi-hard Edamer-type cheeses. The protective strains were selected according to our experience with their inhibition effect on pathogens and technologically undesirable microorganisms. We have observed an improving effect of these strains on cheese souring as well as on the course of proteolysis during four months of cheese ripening which together positively influenced sensoric properties of produced Edamer-type cheeses. Prioritami súčasného syrárstva vo svete i u nás je zabezpečenie vysoko zdravotne bezpečných a kvalitných syrov. I keď súčasne vyrábané syry sú zdravotne bezpečné, napriek tomu je potrebné využiť všetky preventívne opatrenia, aby nedošlo k prípadnej kontaminácii a následnému pomnoženiu patogénnych a iných nežiadúcich mikroorganizmov v syroch počas celej doby zrenia a trvanlivosti. Zistenie a potvrdenie tvorby antimikrobiálnych metabolitov produkovaných kyslomliečnymi baktériami viacerými laboratórnymi prácami (1-7) sú dobrým predpokladom pre zaistenie zvýšenej zdravotnej bezpečnosti potravín. Pri našich sledovaniach ( 8-10) sa taktiež potvrdil antimikrobiálny a antifungálny účinok u troch testovaných kmeňoch laktobacilov (L. plantarum ALC 01, L rhamnosus LC 705 a L. rhamnosus VTl) voči viacerým indikátorovým zbierkovým alebo izolovaným druhom a kmeňom mikroorganizmov a to: Listeria sp. (bolo sledovaných 22 kmeňov, z toho 12 kmeňov Listeria monocytogenes, Bacillus cereus – vyizolovaný z mlieka, Pseudomonas fluorescens CCM 2826, Staphylococcus aureus CCM 3953, Enterobacter aerogenes CCM 2531, Enterococcus faecium Milcom 106/02, kvasinka Aureobasidium pullulans-vyizolovaná zo syrov. Okrem zistenia antimikrobiálneho a antifungálneho účinku laktobacilov je pre výrobu syrov dôležité overenie ich technologickej vhodnosti a vplyvu na zmenu senzorických vlastností syrov. Cieľom práce bolo: • Stanovenie potenciálu rastu jednotlivých druhov kultúr s cieľom vytvorenia kombinácie štartovacej a doplnkovej kultúry vhodnej pre výrobu polotvrdých syrov • Overenie kysacej aktivity jednotlivých i kombinovaných druhov kultúr • Porovnanie proteolytických zmien pri vzájomnej kombinácii kultúr v modelových poloprevádzkových a prevádzkových podmienkach • Sledovanie zmien senzorického profilu syrov vyrobených s doplnkovými laktobacilovými kultúrami Materiál a metódy Kyslomliečne kultúry Štartovacie druhy kultúr, ktoré sa používajú pri výrobe eidamských druhov syrov: Lc Mix a DL Mix – výrobca Danisco cultor, Dánsko MT 53 – dodávateľ Skar, SR (kultúra z Austrálie) 38
Doplnkové druhy kultúr: L. plantarum ALC 01, L. rhamnosus LC 705 – výrobca Danisco cultor, Dánsko. Aplikácia kyslomliečnych kultúr a) laboratórne sledovanie potenciálu rastu a aktívnej kyslosti za optimálnych podmienok – kultiváciou v sterilnom plnotučnom mlieku po 2, 4, 6, 10 a 24 hodinovej kultivácie pri teplote 37°C, pri samotnej štartovacej kultúre bola vstupná koncentrácia 108KTJ.ml-1 a pri kombinácii štartovacej a doplnkovej kultúre boli počty 106 a 104 KTJ.ml-1; kultúry sa používali po druhom preočkovaní z lyofilizovanej formy b) poloprevádzkové a prevádzkové pokusné výroby – použitie lyofilizovaných kultúr po hodinovej rehydratácii v doporučených dávkach výrobcom kultúr, pričom pri kombinácii kultúr bola štartovacia kultúra nahradená 1/3 doplnkovou kultúrou. Proteolýza OPA-metóda (11) – sledovanie odbúrania bielkovín založená na reakcii s o-phthaldialdehydom; pričom ethanthiol bol nahradený sodnou soľou 2-mercaptoethansulfonovou kyselinou. Výsledky a diskusia Stanovenie potenciálu rastu jednotlivých druhov kultúr Na posúdenie rastu a výpočet rastových charakteristík bola uskutočnená stacionárna kultivácia jednotlivých druhov štartovacích a doplnkových kultúr v sterilnom mlieku počas 24 hodinovej kultivácie. Rastové charakteristiky (špecifická rastová rýchlosť, lag-fáza, generačný čas a čas, v ktorom dosiahne špecifická rastová rýchlosť maximum) boli vypočítané z nasledovnej rovnice: ln (N/N0) = A + D.exp [- exp (-B (t - M))] a ich hodnoty sú uvedené v tabuľke I-III. Tabuľka I Parametre rastu kultúry Lc Mix bez a s ochrannou kultúrou Parametre rastu
Lc Mix
µm [h-1] M [h] λ [h]
0.22 1.74 0
Kultúry Lc Mix + LC 705 Lc Mix LC 705 0.87 0.26 2.07 3.03 0.80 0.76
Lc Mix + ALC 01 Lc Mix ALC 01 0.64 0.25 4.19 5.86 2.21 2.71
Tabuľka II Parametre rastu kultúry MT – 53 bez a s ochrannou kultúrou Parametre rastu µm [h-1] M [h] λ [h]
MT 53 0.97 2.47 2.01
Kultúry MT 53+ LC 705 MT 53 LC 705 0.27 0.18 5.79 6.85 2.37 1.29
39
MT 53+ ALC 01 MT 53 ALC 01 0.48 0.19 3.04 4.14 0 0
Tabuľka III Parametre rastu kultúry DL Mix bez a s ochrannou kultúrou Parametre rastu
DL Mix
µm [h-1] M [h] λ [h]
0.18 2.17 0
Kultúry DL Mix + LC 705 DL Mix LC 705 0.83 0.62 2.78 3.41 1.13 1.42
DL Mix + ALC 01 DL Mix ALC 01 0.57 0.62 3.28 3.53 1.39 1.63
Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, že pri aplikácii štartovacej kultúry Lc Mix najvyššia špecifická rastová rýchlosť kultúry bola dosiahnutá v kombinácii s doplnkovou kultúrou Lactobacillus rhamnosus LC 705, a to 0,87 h-1, naopak najmenšiu špecifickú rastovú rýchlosť dosahovala kultúra Lc MIX samotná, bez doplnkovej ochrannej kultúry, a to 0,22 h-1. Z ďalších parametrov rastu, a to z hodnoty M (čo je čas, kedy špecifická rastová rýchlosť dosiahne maximum) a z lag fázy s prihliadnutím, že u samotnej Lc MIX bol vstupný počet KTJ bol vyšší, vyplýva, že kultúra Lc MIX dosiahla badateľne lepšie hodnoty M a lag fázy s doplnkovou ochrannou kultúrou Lactobacillus rhamnosus LC 705 ako s Lactobacillus plantarum ALC 01. Pri kombinácii štartovacej kultúry MT 53 vyplýva, že najvyššiu špecifickú rastovú rýchlosť dosiahla štartovacia kultúra samotná, a to 0,97 h-1. Naopak výrazný pokles špecifickej rastovej rýchlosti nastal prídavkom doplnkovej ochrannej kultúry LC 705 na hodnotu 0,27 h-1 a prídavkom ALC 01 na hodnotu 0,48 h-1. Taktiež porovnaním ďalších parametrov rastu a to lag fázy a hodnoty M kultúry MT – 53 s ochrannými kultúrami, je viditeľný značný rozdiel. Na základe týchto údajov sa domnievame, že kombinácia kultúry MT – 53 s doplnkovou ochrannou kultúrou Lactobacillus plantarum ALC 01 je vhodnejšia. Aplikáciou kultúry DL Mix najvyššia špecifická rastová rýchlosť kultúry bola dosiahnutá pri jej kombinácii s doplnkovou ochrannou kultúrou Lactobacillus rhamnosus LC 705, a to 0,83 h-1, naopak najmenšiu špecifickú rastovú rýchlosť dosahovala štartovacia kultúra DL Mix samotná, bez doplnkovej ochrannej kultúry, a to 0,18 h-1. Z ďalších parametrov rastu, a to z hodnoty M (t.j. času kedy špecifická rastová rýchlosť dosiahne maximum) a z lag fázy s prihliadnutím, že u samotnej DL Mix máme vstup vyšší vyplýva, že štartovacia kultúra DL Mix samotná dosiahla lepšie hodnoty M a lag fázy v porovnaní parametrov rastu kultúry DL Mix s doplnkovou kultúrou Lactobacillus rhamnosus LC 705 ako aj s Lactobacillus plantarum ALC 01. Sledovanie kysacej aktivity jednotlivých druhov kultúr Súčasne s mikrobiologickým vyšetrením rastu sa sledovala kysacia schopnosť jednotlivých druhov kultúr. Dosiahli sa zaujímavé rozdielne výsledky, ktoré sú znázornené na obrázkoch 1-3. pH 6.5
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5
MT 53 MT 53 s LC - 705 MT 53 s ALC 01
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0
0
5
10 15 20 25 (h)
pH Lc Mix Lc Mix s LC - 705 Lc Mix s ALC 01
0
Obr.1 Krivky aktívnej kyslosti (pH) v kombinácii s kultúrou MT 53
5 ]
10 15 20
25 (h)
Obr.2 Krivky aktívnej kyslosti (pH) v kombinácii s kultúrou Lc Mix 40
pH 6.4 6.2 6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4
DL Mix DL Mix + LC 705 DL Mix + ALC 01
0
5
10 15 20 25 (h)
Obr. 3 Krivka aktívnej kyslosti (pH) v kombinácii s kultúrou DL Mix Ako zo znázornenia vyplýva, priebeh prekysávania je značne odlišný pri jednotlivých kombináciách štartovacích a doplnkových kultúr. Pri kombinácii štartovacích kultúr Lc Mix i DL Mix prekysávanie s doplnkovými kultúrami bolo zo začiatku pomalšie ako pri samotnej štartovacej kultúre, ale po 24-hodinovej kultivácii boli rozdiely; kým konečné kyslosti v kombinácii s DL Mix sa vyrovnali, samotná kultúra Lc Mix dosiahla nižšiu kyslosť. Pri sledovaní kyslostí u samotnej štartovacej kultúry MT 53 sa dosiahli na začiatku hodnoty o niečo vyššie ako pri kombinácii s doplnkovými kultúrami, ale po 25 hodinách vyrovnali. Na základe týchto výsledkov môžeme predpokladať, že prídavok doplnkových kultúr môže byť i nižší, pretože eidamské typy syrov patria medzi mierne nakyslé syry, počiatočné dobré prekysávanie však môže ovplyvniť a usmerniť celkový priebeh zrenia. Porovnanie proteolytických zmien vzájomnou kombináciou kultúr Proteolýza je jednou z majoritných výsledkov biochemických reakcií, ktoré prebiehajú počas zrenia syrov, kedy dochádza k štiepeniu kazeínu. Produktom proteolýzy sú peptidy o rôznej dĺžke a aminokyseliny. Primárnou proteolýzou vznikajú dlhé vo vode nerozpustné peptidy a krátke vo vode rozpustné peptidy. V našej práci sme pre porovnávanie proteolytických zmien u syrov z modelových poloprevádzkových i prevádzkových výrob sme zvolili OPA-metódu; zistené hodnoty syrov po rôznej dobe zrenia v prepočte na kyselinu glutamínovú sú uvedené v tabuľke IV a znázornené na obrázkoch 4 a 5.
Tabuľka IV Stanovenie kyseliny glutamínovej v syroch z pokusných modelových a prevádzkových výrob po rôznej dobe zrenia syrov Obsah kyseliny glutamínove (KGA) v g.kg-1 Modelové pokusné výroby Prevádzkové pokusné výroby po 7 dňoch po 14 dňoch po 21 dňoch po 7 dňoch po 1 mesiaci po 4 mesiac. MT 53 3,160 3,401 3,696 2,968 8,875 9,508 MT 53+LC 3,213 3,621 4,283 DL Mix 3,748 4,294 4,647 4,700 10,889 12,078 DL Mix+LC 3,773 4,761 4,911 4,037 19,204 21,046 Lc Mix 3,266 4,183 4,100 3,872 9,888 10,508 Lc Mix+LC 3,480 4,258 4,217 3,871 10,983 22,083 Aplikovaná kultúra
41
25
4,8
Kyselina glutamínová (g/kg syra)
Kxselina glutamínová (g/kg syra)
5
4,6 4,4 4,2 4 3,8 3,6 3,4 3,2 3
20
15
10
5
0
7dní
14 dní
21 dní
7 dní
1 mesiac
4 mesiace
MT-53
MT-53+LC705
MT-53
Lc-Mix
DL-Mix
DL-Mix+LC705
Lc-Mix+LC705
DL-Mix
Lc-Mix
Lc-Mix+LC705
DL-Mix+LC705
Obr. 4 Priebeh zmien KGA v syroch z modelových pokusných výrob
Obr. 5 Priebeh zmien KGA v syroch z prevádzkových pokusných výrob
Zo zistených výsledkov vyplýva, že proteolytické zmeny narastajú v priebehu zrenia a to najviac v prvých týždňoch zrenia. Výraznejšie hodnoty sa zistili u syrov vyrobených s doplnkovými kultúrami laktobacilov, čo pravdepodobne môže súvisieť s vyššou tvorbou proteolytických enzýmov laktobacilov. Čím hodnota KGA bola vyššia, tým i hĺbka proteolýza bola vyššia. Ako Ginziger a kol. (12) konštatuje, pri sledovaní ementálskych typov syrov, existuje vzťah medzi hodnotou OPA a trvanlivosťou, pričom najviac trvanlivé syry boli tie, u ktorých sa zistili hodnoty do 20,0 kg-1KGA, pri vyššej hodnote KGA sa u syrov prejavovali chyby v konzistencii a tvorbou trhlín. Pri našom sledovaní sme vznik trhlín u sledovaných syrov do 4-och mesiacoch zrenia nepozorovali. Senzorický profil syrov Komisionálnym (traja hodnotitelia) bodovým (od 0 do 5 – najvyšší pridelený počet) hodnotením syrov v stanovených charakteristikách (vôňa, chuť, konzistencia) boli zistené podstatnejšie rozdiely až po dlhšej dobe zrenia. U syrov z modelových poloprevádzkových výrob po 21 dňoch zrenia boli minimálne rozdiely v chuti a konzistencii. O niečo výraznejšie rozdiely boli pozorované u syrov z prevádzkových výrob po 1 mesiaci zrenia, ale značná rozdielnosť sa prejavila u syrov po 4-och mesiacoch zrenia a to predovšetkým v konzistencii a chuti; syry vyrobené s doplnkovými kultúrami mali mäkšiu a elastickejšiu konzistenciu a plnšiu syrovú chuť. Uvedené rozdiely v organoleptických vlastnostiach neboli neprijateľné, ale naopak prispeli k celkovej lepšej kvalite eidamských druhov syrov.
42
Záver V práci sa overovalo použitie doterajších (MT 53) i nových zmesných kultúr (Lc-MIX a DL-MIX) a to v kombinácií s doplnkovými kultúrami (L. rhamnosus LC 705 a L. plantarum ALC 01), ktoré sú známe z literatúry a u nás sa zatiaľ v praxi nepoužívajú. Skúšaním vybraných kombinácií sa potvrdil ich priaznivý efekt týkajúci sa prekysávania syrov v laboratórnych i prevádzkových podmienkach. Tiež sa pozorovalo urýchlenie procesov zrenia u syrov s doplnkovými kultúrami, proteolýza sa sledovala OPA metódou. Výsledky tiež potvrdili, že prídavok doplnkových kultúr negatívne neovplyvnil senzorické vlastnosti vyrobených syrov, naopak tieto syry mali mäkšiu a elastickejšiu konzistenciu a plnšiu syrovú chuť. Práca bola podporená v rámci projektu Potraviny-kvalita a bezpečnosť 2003SP270280E010280E01.
Literatúra 1. Plocková, M., Stiles, J., Chumchalová, J., Halfarová, R. (2001). Czech J. Food Sci., 19, 46. 2. Holo Helga, Jeknic, Z. Daeschel, M., Stevanovic, S., Nes, I.F. (2001). Microbiology, 147, 643. 3. Guyonnet, D., Fremaux, Y., Cenatiempo, Y., Berjeaud, J.M. (2000). App. and Envir. Microbiology, 66, 1744. 4. Martínez, Beatrix., Suárez, J.E., Rodriguez, A. (1996). Microbiology, 142, 2393. 5. Martínez Beatrix, Rodriguez Ana, Suárez, J.E. (2000). Microbiology, 146, 946. 6. Plocková, M.,Stiles, J.,Chumchalová, J., Halfarová, R. (2001). Czech J. Food Sci., 19, 46. 7. Plocková, M. , Chumchalová, J.,,Stiles, J. (2000). Mlékařské listy, 62, 16. 8. Kontová, M., Greifová, M., Greif, G., Vollek, V. (2004). Hygiena Alimentorum XXV (Zborník prednášok a posterov), Štrbské Pleso – Vysoké Tatry, 134. 9. Kontová, M., Greifová, M., Greif, G., Kohajdová, Z .(2004). Chem. Listy, 98 (8), 689. 10. Kontová, M., Greifová, M., Kohajdová, Z., Slottová, A. (2004). Výživa a potraviny pre tretie tisícročie (Zborník prednášok a posterov), Nitra, 74. 11. Tschager, E (1990). Milchwirtschaftliche Berichte,105, 204. 12. Ginzinger, W (2000). Syrotech 2000 (Zborník prednášok), Žilina, 43.
Kontaktné adresy: Ing. Marcela Kontová, CSc., Výskumný ústav mliekarenský, Dlhá ul.95, P. O. Box C54, 010 01 Žilina, e-mail:
[email protected], tel.: 00421-41-7232618. Ing. Maria Greifová, PhD., Katedra potravinárskej technológie, FCHPT-STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, e-mail:
[email protected].
43
VÝZNAM IDENTIFIKACE LAKTOKOKŮ VE SPOJITOSTI S JEJICH AUTOLYTICKOU SCHOPNOSTÍ Kozáková Drahomíra, Kučerová Kateřina, Šviráková Eva, Holubová Jitka, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha SIGNIFICANCE OF LACTOCOCCI IDENTIFICATION IN CONNECTION WITH THEIR AUTOLYTIC ACTIVITY Summary: Autolysis of lactococci strain is an important factor in cheese ripening. This ability is defined as the lytic event which is caused by action of the cell intracellular mureinases. It was described that in general, Lactococcus lactis subsp. lactis are more autolytic than Lactococcus lactis subsp. cremoris. Lactococci strains (23 strains) isolated from different sources were identified on the base of their phenotype abilities (six strains of L. lactis subsp. cremoris were found) and by means of FISH method (no strain of L. lactis subsp. cremoris was found). Autolytic activities in citrat buffer and plasmid profiles were determined in all lactococci isolates. One strain was found as low autolytic (< 10 % cell lysis), two lactococci strains were found as medium autolytic (10 – 20 % cell lysis), two isolates were found as high autolytic (20 – 30 % cell lysis) and one isolate was found as very high autolytic strain (> 30 % cell lysis) from 6 lactococci strains identified as L. lactis subsp. cremoris by phenotype characterizations. In general, presence of L. lactis subsp. cremoris among lactococci isolates were very sporadic but the majority of them showed relatively high autolytic abilities. It is important to add that some high autolytic strains, phenotypically identified as L. lactis subsp. lactis, may belong to L. lactis subsp. cremoris. This fact is possible to be confirmed only by genotypical identification of lactococci isolates (method of restriction analysis of rRNA genes, the RAPD method). Úvod Kmeny rodu Lactococcus jsou důležitou součástí zákysových kultur využívaných pro výrobu sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou. Během zrání sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou dochází k celé řadě mikrobiologických, chemických a enzymatických reakcí, kde jedním z klíčových procesů přeměny mléka na konečný produkt – sýr, je proteolýza (Morgan a kol., 1996). Díky postupné lýzi kmenů rodu Lactococcus a následnému uvolnění intracelulárních enzymů do sýřeniny (především proteinas a peptidas) dochází k urychlení proteolytických změn v sýru a vývoji intenzivnější chutě a vůně vyráběného sýra (Morgan a kol., 1996; O´Donovan a kol., 1996; Pillidge a kol., 1998). Autolytická schopnost je definována jako hydrolýza peptidoglykanů, které jsou hlavní složkou buněčné stěny, vlastními intracelulárními enzymy, autolysiny. Byly popsány 4 typy lytických enzymů: N-acetylmuramidasa, N-acetylglukosaminidasa, N-acetylmuramyl-Lalaninamidasa a peptidasy (Garde a kol., 2002). V dnešní době se k nejprozkoumanějším enzymům řadí N-acetylmuramidasa a N-acetylglukosaminidasa (Huard a kol., 2003). Cílem výzkumu bylo stanovení závislosti mezi identifikací zkoumaných kmenů rodu Lactococcus a jejich autolytickou schopností, neboť z literatury vyplývá, že autolytická schopnost se nejintenzivněji projevuje u kmenů Lactococcus lactis subsp. cremoris (Crow a kol., 1995, Garde a kol., 2002). Materiál a metody Použité mikroorganismy - Izoláty Lactococcus sp.: • HMM - izoláty ze syrového mléka (kravín Hostomice; dojnice trpící mastitidou – neléčená) • NZS - izoláty ze stěru z vemene zdravé dojnice (Neumětely) • S12 - izoláty z francouzského sýra Tome Fermier vyrobeného ze syrového mléka • S32 - izoláty z francouzského sýra Grande Ribeaupierre vyrobeného ze syrového mléka 44
Růstová schopnost při různých kultivačních teplotách Růstová schopnost zkoumaných kmenů byla stanovena v LM17 bujónu. Byla sledována schopnost růstu zkoumaných kmenů při teplotách 30 a 45 °C. Kultivace při těchto teplotách probíhala po dobu 16 h. Tolerance zkoumaných kmenů k různým koncentracím NaCl Sledování růstu zkoumaných kmenů v přítomnosti 4 % hm. NaCl byla prováděna v LM17 bujónu za podmínek kultivace 30 °C/ 16 h. Schopnost hydrolýzy argininu a fermentace citrátu zkoumanými kmeny rodu Lactococcus Citrátová půda byla připravena dle publikace Reddy a kol. (1972). Na Petriho misku bylo nadávkováno: 1 ml příslušného ředění daného kmene a 15 ml rozehřáté citrátové půdy. Bezprostředně poté byl obsah Petriho misek promíchán, aby bylo dosaženo rovnoměrné distribuce mikroorganismů ve hmotě půdy. Kultivační médium bylo ponecháno v uzavřených Petriho miskách na chladné vodorovné ploše utuhnout, následně byly plotny obráceny dnem vzhůru a proběhla anaerobní kultivace při teplotě 32 °C. Barva kultivačního média před kultivací byla fialová. Po 40 h anaerobní kultivace při teplotě 32 °C bylo odečteno zbarvení kultivačního média (u všech laktokokových kmenů kultivační půda po 40 h anaerobní kultivace při 32 °C zabarvena do žluta) a inkubace probíhala dále anaerobně při 32 °C. Po 4 dnech inkubace byly misky vyjmuty z inkubátoru a po dobu 1 h exponovány na vzduchu. Po uplynutí 1 h bylo odečteno zbarvení kultivačního média a tvorba zón okolo jednotlivých kolonií daného kmene. Jestliže se půda po 40 h anaerobní kultivace při 32 °C zbarvila do žluta a žluté zabarvení přetrvalo po 4 dny kultivace za stejných kultivačních podmínek, byl daný kmen označen jako Lactococcus lactis subsp. cremoris. Jestliže došlo po 4 dnech kultivace za stejných kultivačních podmínek k opětnému zabarvení půdy do fialova, byl daný kmen označen jako Lactococcus lactis subsp. lactis. Jestliže došlo po 4 dnech kultivace za stejných kultivačních podmínek k opětnému zabarvení kultivační půdy do fialova a po 1 h expozice se okolo kolonií daného kmene vytvořily zóny, byl daný kmen označen jako Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (Reddy a kol., 1971). Identifikace zkoumaných kmenů za pomocí metody FISH FISH metoda byla prováděna pomocí hybridizačního kitu (MicroScreen B. V., Groningen, Nizozemí). Postup stanovení: Příprava a předehřev: pufr MCW5 a hybridizační směs se předehřejí na teplotu 45 °C až do úplného rozpuštění složek. Dále se přípraví pufr MCPX1 (0,5 ml pufru MCPX10 + 4,5 ml sterilní demineralizované vody) a pufr MCW1 (1 ml pufru MCW5 + 5 ml sterilní demineralizované vody). Čiření: 100 µl produktu se vyčeří pomocí 900 µl čiřidla v Eppendorfovo zkumavce o objemu 1,5 ml. Následuje inkubace při pokojové teplotě po dobu 10 min. Suspenze buněk se odstředí (14000 ot.min-1/ 5 min/ 4 °C) a supernatant se odlije. Permeabilizace: 140 µl roztoku enzymu (k enzymu se přidá 7,5 ml roztoku určeného k inkubaci enzymu a rozpustí se, enzym a roztok se uchovávají při teplotě -20 °C a ve tmě) se přidá k peletům buněk a probíhá resuspendace při teplotě 37 °C po dobu 10 min. Fixace: k buňkám se přidá 14 µl fixativu a následuje 1h inkubace při teplotě 4 °C. Po fixaci se ke směsi přidá 1 ml pufru MCPX1 a buňky se odstředí (11000 ot.min-1/ 10 min/ 4 °C). Supernatant se odlije a k peletům se znovu přidá 1 ml pufru MCPX1 a buňky se opět odstředí (11000 ot.min-1/ 10 min/ 4 °C). Po odlití supernatantu se k buňkám přidá 100 µl roztoku A (resuspendace) a následuje 1h inkubace při teplotě -20 °C. Hybridizace: 10 µl suspenze permeabilizovaných buněk se přenese pipetou do hybridizační směsi (100 µl) a hybridizace se nechá probíhat po dobu nejméně 16 h při teplotě 45 °C ve tmě. 45
Promytí: po hybridizaci se promývací zkumavka naplní 4 ml předehřátého pufru MCW1 a přidá se 50 µl hybridizovaných buněk. Promývání probíhá 20 min při teplotě 45 °C a ve tmě. Filtrace: filtrační aparatura se upevní a mezi nálevku a skleněnou nádobu se vloží 0,22 µm polykarbonátový filtr (lesklou stranou nahoru). Obsah promývací zkumavky se nalije do nálevky. Po filtraci se promývací zkumavka a nálevka vypláchnou 4 ml předehřátého pufru MCW1 a znovu se filtruje. Promývací zkumavka se naplní 4 ml sterilní demineralizované vody a opět se filtruje. Pro zabránění nežádoucího zbarvení prostředí se doporučuje promývací zkumavku naplnit chladným slaným fosfátovým pufrem (PBS) a znovu přefiltrovat. Vyhodnocení: na podložní sklíčko se napipetuje 6 µl fixační tekutiny (mounting fluid), na kapku se umístí filtr (vrstvou s buňkami nahoru). Dalších 6 µl fixační tekutiny se navrství na filtr (tudíž na buňky) a následně se nasadí krycí sklíčko. Před vyhodnocením se na krycí sklíčko napipetuje 25 µl nefluoreskujícího imersního oleje. Při prohlížení pomocí epifluorescenčního mikroskopu se používá 1000 násobné zvětšení a vhodná excitace a emisné filtry pro FITC (495/520 nm) a Cy3 (550/ 570 nm). Buňky se obarví zeleně díky fluorescenci FITC nebo červeně díky fluorescenci Cy3. Stanovení plazmidového profilu u zkoumaných kmenů rodu Lactococcus Plazmidový profil byl stanoven za použití specielního kitu (QIAprep Spin, Miniprep Kit (250), Bio-CONSULT s.r.o). Stanovení autolytické schopnosti v citrátovém pufru Autolytické vlastnosti laktokokových kmenů byly zjišťovány na základě změny absorbance po inkubaci buněk v citrátovém pufru dle publikace Boutrou a kol., 1998 v následující modifikaci: Kmeny byly zaočkovány (1 % obj. inokulum) do LM17 bujónu (50 ml) a kultivovány při teplotě 30 °C po dobu 6 h. Poté byly buňky odstředěny (9000 ot.min-1/ 15 min/ 4 °C). Po odstředění byl supernatant dekantován a buňky byly dvakrát promyty ve 40 ml β-glycerolfosfátovém pufru o koncentraci 0,05 mol.l-1 (pH 7). Promyté buňky byly resuspendovány ve 40 ml citrátového pufru o koncentraci citrátu sodného 0,05 mol.l-1 (pH 5) obsahujícím NaCl v množství 15 g.l-1 a kultivovány při teplotě 13 °C po dobu 12 dnů. Lýze buněk byla během této doby zjišťována měřením absorbance při 650 nm. Autolytická schopnost byla charakterizována procentem buněčné lýze: [(A0 - At)/A0] x 100, kde A0 je počáteční absorbance a At je absorbance měřená v čase t. Výsledky a diskuse Identifikace kmenů rodu Lactococcus Identifikace zkoumaných kmenů proběhla na základě jejich fenotypových vlastností a pomocí genotypové metody FISH (Fluorescence in situ hybridization). Identifikace zkoumaných kmenů dle fenotypových vlastností byla založena na stanovení: ¾ schopnosti růstu při teplotě 30 a 45 °C ¾ růstové schopnosti za přítomnosti 4 % hm. NaCl (kmeny L. lactic subsp. cremoris nejsou schopny růstu při 4 % hm. NaCl na rozdíl od L. lactic subsp. lactis (Teuber, 1995; Cogan, 1996; Harrigan, 1998), které mohou vykazovat schopnost růstu i při 6,5 % hm. NaCl (Holt et al., 1994)) ¾ schopnosti hydrolyzovat arginin (kmeny L. lactis subsp. cremoris nehydrolyzují arginin za vzniku amoniaku, zatímco kmeny L. lactis subsp. lactis arginin hydrolyzují za vzniku amoniaku (Turner a kol., 1963) ¾ schopnosti fermentovat citrát (tento jsou schopni hydrolyzovat pouze kmeny Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (Reddy a kol., 1971)) Výsledky fenotypové identifikace jsou uvedeny v tabulce I.
46
Genotypová identifikace byla provedena pomocí metody FISH. Stanovení bylo provedeno prostřednictvím komerčního hybridizačního kitu (MicroScreen B. V., Groningen, Nizozemí). Za využití tohoto kitu se měla fluorescence objevovat pouze u kmenů Lactococcus lactis subsp. lactis. Výsledky tohoto stanovení jsou uvedeny na obr. 2 a 3. U všech zkoumaných kmenů byl též stanoven jejich plazmidový profil (obr. 1).
M
M
1
18
2
19
3
20
4
21
5
22
6
23
7
24
8
M
25 M
9
26
10
27
11
28
12
29
13
30
14
31
15
32
16
33
17 M
▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬
16.210 14.174 12.138 10.102 8.066 7.045 6.030 5.012
▬
3.990
▬
2.972
▬
2.067
▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬ ▬
16.210 14.174 12.138 10.102 8.066 7.045 6.030 5.012
▬
3.990
▬
2.972
▬
2.067
34 M
Obr. 1 Plazmidový profil u souboru zkoumaných kmenů rodu Lactococcus : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
L. lactis LTM32 L. lactis 642 L. lactis 642/2 L. lactis NIZO R5 L. lactis NIZO R5/2 L. lactis LCC 416 L. lactis T LTM 32.6 L. lactis T LTM 32.7
9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
L. lactis HMM 21 L. lactis HMM 22 L. lactis HMM 31 L. lactis HMM 32 L. lactis HMM 4 L. lactis HMM 5 L. lactis HMM 51 L. lactis HMM 52 L. lactis HMM 61
18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.
L. lactis HMM 62 L. lactis HMM 72 L. lactis HMM 81 L. lactis HMM 82 L. lactis HMM 91 L. lactis HMM 92 L. lactis NZS 1 L. lactis S12A1
26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. M
L. lactis S12A2 L. lactis S12B1 L. lactis S12B2 L. lactis S12C2 L. lactis S12E1 L. lactis S32 L. lactis NIZO B643 ------------Marker
Stanovení autolytické schopnosti u zkoumaných kmenů rodu Lactococcus Autolytická schopnost u souboru zkoumaných kmenů byla stanovena metodou v citrátovém pufru a vyjádřena byla jako % buněčné lýze. Kmeny, které vykazovaly buněčnou lýzi nižší než 10 % byly označeny jako mírně autolytické (označení M); kmeny, které vykazovaly buněčnou lýzi v rozmezí 10 – 20 % byly označeny jako středně autolytické (označení S); kmeny, které vykazovaly buněčnou lýzi v rozmezí 20 – 30 % byly označeny jako vysoce autolytické (označení V) a kmeny, které vykazovaly buněčnou lýzi vyšší než 30 % byly označeny jako kmeny s velmi intenzivní autolytickou schopností (označení IN). Výsledky stanovení u souboru zkoumaných kmenů jsou uvedeny v tabulce I. Z výsledků je zřejmé, že 4 kmeny vykazovaly mírnou autolytickou schopnost, 11 kmenů vykazovalo střední autolytickou schopnost, 5 kmenů vysokou autolytickou schopnost a 3 kmeny vykazovaly velmi intenzivní autolytickou schopnost.
47
Obr. 2 Výsledky metody FISH u kmene HMM81.
Obr. 3 Výsledky metody FISH u kmene S32.
Tabulka I Výsledky identifikace a stanovení autolytické schopnosti u souboru zkoumaných kmenů rodu Lactococcus. Izolované kmeny
Zdroj
Růst za podmínek
Hydrolýza argininu
Fermentace citrátu
Zařazení laktokokových kmenů
4 % hm. NaCl
30 °C
45 °C
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM21
Syrové mléko-mastitidní
HMM22
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM31
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM32
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
-
-
Lactococcus lactis subsp. cremoris
HMM4
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM5
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM51
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM52
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM61
Syrové mléko-mastitidní
-
+
-
-
-
Lactococcus lactis subsp. cremoris
HMM62
Syrové mléko-mastitidní
-
+
-
-
-
Lactococcus lactis subsp. cremoris
HMM72
Syrové mléko-mastitidní
-
+
-
-
-
Lactococcus lactis subsp. cremoris
HMM81
Syrové mléko-mastitidní
-
+
-
-
-
Lactococcus lactis subsp. cremoris
HMM82
Syrové mléko-mastitidní
-
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
HMM91
Syrové mléko-mastitidní
-
+
-
-
-
Lactococcus lactis subsp. cremoris
HMM92
Syrové mléko-mastitidní
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
NZS1
Stěr z vemene zdravé dojnice
-
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
S12A1
Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Tome fermier) Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Tome fermier) Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Tome fermier) Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Tome fermier) Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Tome fermier) Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Tome fermier) Francouzský sýr vyrobený ze syrového mléka (Grande Ribeaupierre)
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
-
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
+
+
-
+
-
Lactococcus lactis subsp. lactis
S12A2 S12B1 S12B2 S12C2 S12E1 S32
Autolytická schopnost
S V IN V V S M S V S M IN IN S S S S S S V M S M
Legenda: M V +
kmen mírně autolytický (% buněčné lýze nižší než 10) kmen vysoce autolytický (% buněčné lýze v rozmezí 20 – 30) zkoumaný kmen vykazoval danou vlastnost
S IN -
kmen středně autolytický (% buněčné lýze v rozmezí 10 – 20) kmen s velmi intenzivní autolytickou schopností (% buněčné lýze > 30) zkoumaný kmen danou vlastnost nevykazoval
48
Dále bylo zjištěno, že ze 6 kmenů identifikovaných na základě fenotypu jako subspecie cremoris, vykazoval 1 kmen (HMM72) mírnou autolytickou schopnost, 2 kmeny (HMM62, HMM91) střední autolytickou schopnost, 2 kmeny (HMM32, HMM61) vysokou autolytickou schopnost a 1 kmen (HMM81) byl označen jako kmen s velmi vysokou autolytickou schopností. Závěr Mezi 23 kmeny izolovanými z různých zdrojů bylo na základě fenotypu nalezeno 6 kmenů řadících se k subspecii cremoris a u 5 z nich byla prokázána autolytická schopnost. Bylo zároveň zjištěno, že 13 z 18 kmenů, fenotypově identifikovaných jako subspecie lactis, vykazovalo též prokazatelnou autolytickou schopnost. Ze získaných výsledků je tedy zřejmé, že autolytická aktivita se neobjevuje pouze u kmenů subspecie cremoris, ale i u kmenů subspecie lactis. Byla též prokázána vysoká variabilita v autolýze mezi izolovanými kmeny rodu Lactococcus a nejčastěji a nejintenzivněji se projevovala autolytická schopnost u kmenů izolovaných z mastitidního mléka. V budoucnu bude ověřena autolytická aktivita u souboru zkoumaných kmenů i jinými metodami např. stanovením enzymatické aktivity v pseudosýřenině, které nám pomohou objasnit chování autolytických a neautolytických kmenů v reálných systémech. Použitá literatura: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.
Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V. (1998): Simple Tests for Predicting the Lytic Behavior and Proteolytic Activity of Lactococcal Strains in Cheese. J. Dairy Sci., 81: 2321-2328. Cogan T.M. v knize: Dairy Starter Cultures (Cogan T.M., Accolas J.-P., Eds.), str. 1-25, VCH Publishers, New York 1996. Crow V.L., Coolbear T., Gopal P.K., Martley F.G., McKay L.L., Riepe H. (1995): The Role of Autolysis of Lactic Acid Bacteria in the Ripening of Cheese. Int. Dairy Journal, 5: 855-875. Garde S., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (2002): Autolytic behaviour of Lactococcus lactis subsp. cremoris and Lactococcus lactis subsp. lactis wild isolates from ewes´ raw milk cheeses. Milchwissenschaft, 57 (3): 143-147. Harrigan W.F.: Laboratory methods in food microbiology, str. 343-345. Academic Press Limited, London 1998. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T.: Bergey´s manual of determinative bacteriology, str. 527-557. Williams & Wilkins, Haryland 1994. Huard C., Miranda G., Wessner F., Bolotin A., Hansen J., Foster S.J., Chapot-Chartier M.-P. (2003): Characterization of AcmB, an N-acetylglucosaminidase autolysin from Lactococcus lactis. Microbiology, 149: 695 – 705. Morgan S., Ross R.P., Hill C. (1997): Increasing starter cell lysis in Cheddar cheese using a bacteriocin-producing adjunct. J. Dairy Sci., 80: 1 – 10. O´Donovan C.M., Wilkinson M.G., Guinee T.P., Fox P.F. (1996): An Investigation of the Autolytic Properties of Three Lactococcal Strains During Cheese Ripening. Int. Dairy J., 6: 1149-1165. Pillidge CH.J., Govindasamy-Lucey S., Gopal P.K., Crow V.L. (1998): The major lactococcal cel wall autolysis AcmA does not determine the rate of autolysis of Lactococcus lactis subsp. cremoris 2250 in Cheddar cheese. Reddy M.S., Vedamuthu E.R., Washam C.J., Reinbold G.W. (1972): Agar Medium for Differential Enumeration of Lactic Streptococci. Appl. Microbiol., 24: 947-952. Teuber M. v knize: The Genera of Lactic Acid Bacteria (Wood B.J.B., Holzapfel W.H., Eds.), str. 173-234, Blackie Academic & Professional, London 1995. Turner N., Sandine W.E., Elliker P.R., Day E.A. (1963): Use of tetrazonium dyes in an agar medium for differentiation of Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris. J. Dairy Sci., 6: 380 – 385.
Kontaktní adresa: Ústav technologie mléka a tuků, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6; email:
[email protected] Poděkování: Tato práce byla vytvořena za podpory grantu MSM 6046137305. Autoři dále děkují Doc. Ing. Vojtěchu Radovi, CSc. z Katedry mikrobiologie, výživy a dietetiky, České zemědělské univerzity v Praze, za pomoc při fluorescenční mikroskopii.
49
NOVINKY TECHNOLÓGIE VÝROBY SYROV A BALENIA MLIEČNYCH VÝROBKOV Harhovský Milan ALPMA, KARL SCHNELL, BOSCH, abala.cz stroje obaly folie s.r.o., INDUSTRING NEW BY TECHNOLOGY OF CHEESE PRODUCTION AND MILK PRODUCT PACKAGING Summary: Both – big producer and small specialist need partnership with machines supplier. The market need longer shelf life, standard quality, standard weight, and the producer higher yield. In total is the problem deal with more hygiene, continuous processing, and precise dosage. Výrobné firmy sa na jednej strane koncentrujú do veľkých majetkových celkov a na druhej strane sa tvoria malí výrobcovia špecialít. Pre obidva tábory platí v dnešnom konkurenčnom prostredí jedno spoločné: každý si zabezpečuje svoj vlastný odborný vývoj s použitím progresívnejšej technológie. Preto je pri tomto vývoji častá spolupráca s výrobcom potravinárskych strojov, a tak vznikajú unikátne riešenia, často chránené mnohými opatreniami pred konkurenciou. Na našom území zabezpečuje túto odbornú spoluprácu INDUSTRING – dnes „abala.cz stroje obaly fólie s.r.o.“ u kvalifikovaných dodávateľov technológie pre proces výroby syrov a tvarohu – ALPMA a pre tavený syr a pomazánky – KARL SCHNELL a u dodávateľov pre balenie okrem iných u firmy BOSCH. Novým smerom technológie je vyhovieť tržnému prostrediu, ktoré ovládajú obchodné reťazce. Požiadavka je jasná: zabezpečiť dlhú trvanlivosť, zabezpečiť stále rovnakú kvalitu a rovnakú hmotnosť a to všetko pri minimálnom zisku. Výrobca reaguje tak, že hľadá cesty vo zvýšení výťažnosti. Výsledok sa dosiahne strojnými zariadeniami, ktoré sa zhodujú v určitých spoločných znakoch. -
-
-
Trvanlivosť sa zabezpečí vyššou hygienou, mnoho krát vylúčením ľudí z procesu a automatizovaním linky. Okrem toho pravdaže lepším výberom a prípravou suroviny, prídavných látok a náročnejšími postupmi - napríklad sterilizáciou – aseptické balenie alebo aspoň nové balenie s ochrannou atmosférou. Stále rovnaká kvalita – dosiahne sa prísnym dodržovaním postupu a úpravou surovín, aby mali rovnaké hodnoty. Napríklad mlieko sa štandardizuje na tuk ale aj na obsah bielkoviny filtračným procesom a podobne. Optimálne je proces automatizovať a kontinualizovať = zabezpečiť výrobu bez prerušovania, stále rovnakým prúdom procesu. Rovnaká hmotnosť sa zabezpečí presným dávkovaním, plnením tvarohu napríklad do foriem, tieto formy prípadne kontinuálne zalisovávať a podobne. Zvýšenie výťažnosti – ide ruka v ruke so splnením vyššie uvedených troch požiadaviek. Ak vylúčim ľudí z procesu, pripravím štandardizáciu suroviny, proces dokážem vykonávať kontinuálne a presne dávkujem výrobok napríklad do formy kde mi neunikne výrobok do straty, tak v konečnom dôsledku zvýšim výťažnosť pre svoju ekonomiku.
Niektoré technológie umožňujú garantovať zvýšenie výťažnosti až o 3%, napríklad výrobná linka v Argentíne Mastellone spracuje množstvo mlieka na výrobu syrov. Je koncipovaná tak, že polovica kapacity sa spracuje kontinuálnym koagulátorom ALPMA a druhá polovica beží synchrónne na klasických výrobníkoch syroviny. Produkty z oboch liniek sú potom porciované na rovnakých porciovaniach ALPMA do foriem, odkvapávané na dráhach, solené a odchádzajúce na zretie a balenie. Srvátka je vedľajší produkt, ktorý odnáša so sebou bielkovinu (zaujíma nás hlavne syrársky prach, nie srvátkové bielkoviny) a tuk, ktorý sa nepodarilo umiestniť vo výrobku vplyvom technológie. Preto odborníci z výzkumu pri plnení úlohy posudzovali argentínsku srvátku z oboch výrob na tuk a syrársky prach. Výsledky sú viditeľné na grafickom zobrazení obrázku č.1 a č.2.
50
Obr. 1 Porovnanie úspory tuku pri kontinuálnej výrobe na koagulátore ALPMA.oproti úniku do srvátky při výrobe na výrobníku syroviny
Obr. 2 Porovnanie úspory suroviny pri kontinuálnej výrobe na koagulátore ALPMA. 51
Tiež pri diskontinuálnych procesoch ako napríklad príprava navážky pre tavenie syru dokáže KARL SCHNELL kontinualizovať výrobu v špeciálnych riešeniach svojich zariadení tak, aby sa dosiahla dobrá kvalita, trvanlivosť a hlavne výťažnosť a rovnomernosť hodnôt. Pre presné dávky pastovitých konzistencií má KARL SCHNELL špeciálne dávkovacie systémy, ktoré sú jednoduché a presné aby pomer ceny a úspory priniesol efekt výrobcovi. Firma BOSCH vyrába okrem iného aj baliace stroje pre aseptické balenie napríklad trvanlivej smotany do kávy v kelímkoch v mliekárni Bohušovice alebo Rajo. V Rusku je napríklad niekoľko úspešných inštalácií BOSCH aseptického balenia pre jogurt. Trvanlivosť výrobku je potom veľmi vysoká a výrobca dosiahne lepšiu predajnosť oproti konkurencii. Použitá literatura: 1. Archiv ALPMA a INDUSTING Kontaktní adresa: abala.cz stroje obaly folie s.r.o., Denkova3602, 767 01 Kroměříž.. tel. 573 335 857 Ing. Harhovský, tel.603 415 962,
[email protected]
52
VÝSKYT BIOGENNÍCH AMÍNŮ V SÝRECH. Černý Vladimír1, Křížek Martin2, Kvasničková Eva1, Havlíková Šárka1 1 Výzkumný ústav mlékárenský Tábor, 2Jihočeská universita České Budějovice OCCURRENCE OF BIOGENIC AMINES IN CHEESE. Summary : Content of tyramine, putrescine, cadaverine, histamine, spermine, spermidine and tryptamine was determinated in chain : milk - milk cultures – model cheesemaking - swiss-type cheese or surface-ripened cheese - surface-ripened cheese from trade network. It was documented risk of occurrence of biogenics amines (BA) in produce of raw milk and in cheesemaking is minimalized when the conditions of GMP/GHP are kept More then 30 producents of BA were isolated, especially putrescine, cadaverine, histamine. Sum of BA generated by isolates on culture medium was in excess of 4000 mg / 1000 g. It is possible to use test culture medium for screening of occurrence of potential producents of BA. Většina biogenních amínů má vasoaktivní účinky (např. histamin, tyramin, phenyethylanin, tryptamin), některé působí primárně jako inhibitory hystamin-detoxikujících enzymů (např. putrescin a cadaverin) (Hui a Taylor 1985). Názor na účinky dalších biogenních amínů jako je spermin či spermidin se stále vyvíjí. Tailor (1986) shrnuje toxikologické a klinické aspekty toxicity histamínu, který ve vyšší koncentraci významně působí na kardiovaskulární systém, roztažení periferních krevních cév, kapilár a tepen s výsledným nízkým tlakem, bolestmi hlavy a zčervenáním pokožky, bolestmi břicha, zvracením a průjmem. Histamin je normální složkou lidského těla. Je v organismu vytvářen z histidinu prostřednictvím s pyridoxal-fosfátem spřaženou dekarboxylázou a ovlivňuje řadu důležitých tělesných funkcí a jeho koncentrace v krvi je striktně regulovaná. Ovšem pro mnoho jedinců příjem potravin s poměrně velkou koncentrací biogenních amínů jako je histamin nevyvolává symptomy otravy, protože mají schopnost biogenní amíny rychle konvertovat na aldehydy působením monoamino-oxidasy (MAO) a diamin-oxydázy (DAO) a dále na karboxylové kyseliny prostřednictvím oxidativní deaminace (Edwards a Sandine 1981). Tyto enzymatické systémy jsou přítomné v gastrointensiálním traktu a mohou působit preventivně nebo redukovat absorpci nemetabolizovaného histaminu do krevního řečiště (Taylor a Lieber 1979, Lyons et al. 1983, Hui a Tailor 1985). Účinnost detoxikační role enzymů metabolizujících histamin v zažívacího traktu je tak vysoký, že orální požití 1 mmol histaminu (cca 100 mg ) nevyvolá u normálního jedince příznaky otravy, kdežto intravenosní dávka 0,07 µmol histaminu příznaky otravy již vyvolá (Motil a Scrimshae 1979). Pokud je však aktivita MAO a DAO poškozena vlivem genetické poruchy nebo v přítomnosti potentiators (násobitel) jako jsou hnilobné amíny (např. putrescin, cadaverin) nebo farmakologická agens (např. isoanizid, antidepresiva, antihistaminika nebo antimalarika), pak se může nepříznivý účinek přijímaných biogenních amínů projevit. (Rice et al. 1976, Diamond et al. 1987, Joosten 1988). Putrescin a kadaverin byly označeny jako inhibitory dvou enzymů v řetězci detoxikace histaminu, DAO a histamin N-methyltransferase (HMT) (Hui a Taylor 1985). Pro stanovení obsahu biogenních amínů v čerstvě nadojeném mléce byla odebírány bazénové vzorky mléka ihned po jeho vychlazení pod teplotu 10 °C. Vzorky mléka byly převezeny na pracoviště VÚM v Táboře, podrobeny mikrobiologickým rozborům a do doby stanovení obsahu biogenních amínů byly tyto vzorky skladovány při teplotách pod – 25 °C.
53
Pro testování na produkci BA byly použity kultury používané pro výrobu sýrů ementálského typu a sýrů zrajících pod mazem a obsahující tyto mikroorganismy : Lactococcus lactis ssp. lactis Lactococcus lactis ssp. cremoris, Leuconostoc ssp. Str. salivarius ssp. thermophilus Lactobacillus helveticus Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis Propionibacterum ssp. Micrococcus ssp. Brevibacterum linens Modelové sýry ementálského typu i sýry zrající pod mazem byly vyrobeny na pilotním zařízení Výzkumného ústavu mlékárenského v Táboře. Sýry zrající pod mazem standardního složení a kvality byly zakoupeny v tržní síti. Pro stanovení obsahu biogenních amínů byla použita elektroforetická metoda zavedená Doc. Ing. M. Křížkem CSc. na katedře analytické chemie Jihočeské university v Českých Budějovicích (Křížek et al. 1991, 1998) a pro analýzu některých vzorků byla použita HPLC metoda. Výsledky sledování výskytu biogenních amínů v řetězci od prvovýroby po výrobky v tržní síti lze shrnout do těchto bodů : 1. mléko nakoupené amíny.
od prvovýrobce
dodržujícího zásady
GMP/GHP neobsahuje biogenní
2. dlouhodobým kultivačním testem (kultivace po dobu 7 týdnů) bylo prokázáno, že testované čisté mlékařské kultury, běžně používané pro výrobu dohřívaných sýrů a sýrů zrajících pod mazem, nebyly producenty biogenních amínů, nebo byly v ojedinělých případech schopny produkovat jen malé množství biogenních amínů, 3. na pilotních výrobách vysokodohřívaných sýrů i sýrů zrajících pod mazem byl prokázáno,že: a. dodržení zásad GMP/GHP zabrání rekontaminaci sýrů nežádoucími skupinami mikroorganismů schopných produkovat biogenní amíny, i. mikrobiálními rozbory byly isolovány kmeny mikroorganismů, které je možno označit jen za slabé producenty bigenních amínů, ii. rozbory sýrů v průběhu jejich zrání byly nalezeny jen nízké celkové obsahy BA (suma všech BA se pohybovala v desítkách mg/kg sýra) b. za těchto podmínek výroby a zrání sýrů se pak neprojeví potenciální vliv i. vysokého pH sýra ii. stupně proteolýzy bílkovin a koncentrace volných aminokyselin – prekurzorů tvorby BA iii. teploty použité při zrání a skladování sýrů, iv. nebyly nalezeny významné rozdíly v obsahu biogenních amínů v středové a krajové zóně, 4. nedodržení zásad GMP/GHP má za následek mikrobiální rekontaminaci v řetězci zpracování mléka – výroba – zrání sýrů a přítomnost producentů biogenních amínů v zrajících sýrech, a. ve zralých sýrech byly nalezeny vysoké počty mikroorganismů schopných dekarboxylovat aminokyseliny, b. byla získáno cca 130 isolátů vykazujících dekarboxylázovou aktivitu, 54
5. pro 30 vybraných isolátů byl stanoveno množství produkovaných biogenních amínů s těmito výsledky : a. prakticky všechny testované isoláty ( 28 ze 30) je nutno považovat za vysoké producenty biogenních amínů, b. celkový obsah produkovaných biogenních amínů se pohyboval v tisících mg/l kultivačního média a v některých případech celkový obsah BA překročil 4 000 mg/l. Tyto hodnoty pak odpovídají obsahu BA vyššímu než 0,4 % (w/v). c. jen několik isolátů vykazovalo schopnost produkovat histamin a produkované množství pak bylo v některých případech i vyšší než 4 000 mg/l, d. u většiny isolátů byla zjištěna produkce tyraminu, kadaverinu a putrescinu v různých poměrech a s obsahem těchto jednotlivých BA řádově v tisících mg/l media. e. Pouze dva isoláty nevykázaly dekarboxylázovou aktivitu 6. v současnosti ještě není dokončena identifikace všech isolátů ale zatím je možno konstatovat, že většina isolátů bude pravděpodobně patřit do skupiny gramnegativních fermentujících tyčinek z čeledi Enrobacteriaceae a dále o grampozitivní tzn. mléčné koky z rodu Enterococcus. Doporučení : 1. dbát na vysokou mikrobiální jakost nakupovaného mléka 2. zavedené zásady GMP/GHP i systém HACC/P modifikovat s ohledem na potenciální průnik mikroorganismů schopných produkovat biogenní amíny v celém výrobním řetězci : mléko - výroba sýrů – zrání sýrů, 3. zavést do laboratorní praxe mikrobiální metody vhodné pro preventivní sledování výskytu mikroorganismů vykazujících dekarboxylázovou aktivitu. 4. souběžně s mikrobiální kontrolou mléka a sýrů je žádoucí sledovat i další suroviny a pomocné látky používané při výrobě sýrů. 5. Výzkumný ústav mlékárenský testoval použití živné půdy resp. bujónu pro plošné sledování přítomnosti dekarboxylázo-pozitivních mikroorganismů, 6. ve Výzkumném ústavu mlékárenském je možno po předchozí dohodě a. dohodnout fázové rozbory zaměřené na výskyt dekarboxylázo-pozitivní mikroflory, b. získat živnou půdu nebo bujón, který lze použít pro tyto mikrobiální rozbory a konzultovat možnosti jejího použití.
Kontaktní adresa : Ing. Vladimír Černý, MILCOM a.s., Výzkumný ústav mlékárenský, pracoviště Tábor Soběslavská 841, 390 02 Tábor e-mail :
[email protected] Poděkování : Tato práce byla vytvořena za podpory grantu NAZV QD1056. 55
HODNOCENÍ VOLNÝCH MASTNÝCH KYSELIN V BAZÉNOVÝCH VZORCÍCH SYROVÉHO KRAVSKÉHO MLÉKA Kopunecz Pavel, Štěpánková Jitka Centrální laboratoř Pardubice EVALUATION OF FREE FATTY ACIDS IN BULK MILK SAMPLES OF RAW COW MILK Summary: Central Laboratory Pardubice [CL] has estimated free fatty acids [VMK] in bulk milk samples since November 2003. The CL did a few steps before launch of the estimation VMK. The laboratory verified the eligibility of evaluation VMK in the system of centralize laboratory processing of milk samples, which is usually the second day after the sampling. The laboratory verified the eligibility of the standard transport and the standard preservation of samples [exclusively by cold preservation up to 10°C]. The CL concentrated on evaluation of average values from the monthly data files, stability of measure results in the group of milk producers, differences among milk processors and potential connections between VMK and remaining milk quality parameters. We suppose that routine analysing and monitoring VMK in bulk milk will be able to help producers and suppliers improving milk quality. Centrální laboratoř Pardubice nabízí v rámci kontroly bazénových vzorků syrového mléka široký soubor jakostních ukazatelů, které je možno rutinně analyzovat pomocí výkonné a přesné přístrojové techniky. V minulosti jsme zavedli stanovení močoviny, které je již považováno za standardní součást výsledků rozborů obsahových složek mléka prováděných naší laboratoří. Od ledna 2003 jsme přidali plošné hodnocení kaseinu a bodu mrznutí a od listopadu 2003 jsme začali s poskytováním výsledků množství volných mastných kyselin (VMK). Tomuto dosud poslednímu rozšíření spektra jakostních parametrů mléka nutně předcházelo několik kroků v nichž jsme museli zvážit a částečně i vyhodnotit účelnost laboratorního zkoušení a provozního sledování výsledků VMK v bazénových vzorcích mléka. Ve fázi přípravy jsme spoléhali především na vlastní zkušenosti a vlastní prověřování možností hodnocení VMK. Analýzy obsahových složek mléka (včetně VMK) provádíme na přístroji MilkoScan FT 6000, který byl v laboratoři instalován v listopadu 2002. V průběhu období od instalace do vydávání výsledků jsme prověřili stabilitu vzorku od odběru až po předpokládanou dobu zpracování v laboratoři s ohledem na způsob transportu, vhodnost běžně používané konzervace a vhodnou teplotu transportu vzorků. Nejdříve jsme však museli ověřit správnost kalibrace přístroje nastavenou výrobcem a zjistit běžný rozsah měření. Hodnoty VMK v bazénových vzorcích mléka se pohybují od 0,10 až po 3,0 mmol/100g tuku. Tabulka I Frekvence výskytu VMK v jednotlivých intervalech za první pololetí 2004. Výsledky byly zpracovány ze souboru 39 605 vzorků mléka. Interval
do 0,10
0,11 až 0,40
0,41 až 0,70
0,71 až 1,00
1,01 až 1,30
1,31 až 1,60
1,61 až 1,90
1,91 až 2,20
2,21 až 2,50
2,51 až 2,80
nad 2,81
% vzorků
0,54
15,76
35,07
25,55
12,24
5,51
2,81
1,27
0,59
0,30
0,36
56
40
podíly v %
30 20 10 0 do 0,10 do 0,40 do 0,70 do 1,00 do 1,30 do 1,60 do 1,90 do 2,20 do 2,50 do 2,80
nad 2,81
Obr. 1 Rozložení hodnot VMK z výsledků bazénových vzorků v prvním pololetí 2004.
1,00 0,95
mmol / 100g tuku
0,90 0,85 0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 prosinec
listopad
říjen
září
srpen
červenec
červen
květen
duben
březen
únor
leden
0,50
Obr. 2 Průměrné hodnoty VMK z výsledků bazénových vzorků v roce 2004. Průměrný obsah VMK v bazénových vzorcích mléka byl v roce 2004 0,81 mmol/100g tuku. Za první pololetí loňského roku byl průměr 0,78 mmol/100g tuku. Při srovnání výsledků VMK podle jednotlivých mlékáren (závodů) se průměrné hodnoty pohybovaly od 0,48 mmol/100g tuku (při četnosti 73 vzorků) do 1,03 (107 vz.). Pro příklad rozdílů v množství VMK jsme vybrali dva větší soubory výsledků. Hodnoty sledovaného parametru v dodávkách mléka u mlékárny „A“ byly 0,61 mmol/100g tuku při četnosti 1504 vzorků, u mlékárny „B“ bylo množství VMK 1,01 mmol/100g tuku při 806 vzorcích mléka.
57
Tabulka II Frekvence výskytu VMK v intervalech hodnot za první pololetí 2004 v dodávkách vybraných mlékáren. 0,11 0,41 0,71 1,01 1,31 1,61 1,91 2,21 do až až až až až až až až Interval 0,10 0,40 0,70 1,00 1,30 1,60 1,90 2,20 2,50 „A“ 1,06 26,26 39,16 21,94 8,38 2,06 0,73 0,27 0,14 % vzorků „B“ 0,37 4,34 25,93 23,21 22,95 11,41 7,44 2,61 1,12 % vzorků
mléka u dvou 2,51 až 2,80
nad 2,81
0,00
0,00
0,25
0,37
Chceme-li posuzovat výše uvedené výsledky podle limitu normy na syrové kravské mléko (ČSN 570529, článek 2.4.2), který je 13,0 mmol/kg, pak u mlékárny „A“ nevyhovělo 3,2% vzorků a u mlékárny „B“ 24,2% vzorků. Hodnotu 10,0 mmol/ kg překročilo u mlékárny „A“ 11,6% vzorků a u mlékárny „B“ 47,2% vzorků. V režimu centralizovaného hodnocení bazénových vzorků mléka bylo velmi důležité zjistit stabilitu VMK ve vzorcích od odběru vzorku až po analýzu v laboratoři, tj. zpravidla následující den, přibližně do 36 hodin. Sledovali jsme změny VMK u vzorků s počáteční hodnotou v rozmezí 0,40 až 0,60 mmol/100g tuku skladovaných za různých podmínek. Skupina NV5 jsou nekonzervované vzorky uchovávané při teplotě do 5°C. Skupina NV10 jsou nekonzervované vzorky uchovávané při 10°C a skupina KV5 jsou konzervované vzory (mikrotablety DF) uchovávané při 5°C. Z uvedených skupin bylo připraveno několik identických vzorků, které byly postupně měřeny ve stáří jeden až pět dnů. 0,7
mmol/100g tuku
0,6 0,5 NV
5
NV 10
0,4
KV
5
0,3 0,2 1.den
2.den
3.den
4.den
5.den
pořadí měření
Obr. 3 Vývoj množství VMK v bazénových vzorcích mléka. Zvýšení množství VMK od odběru po předpokládanou dobu měření v CL je sice průkazné ale neznehodnocuje vypovídací schopnost výsledku. Navíc v systému kdy jsou všechny bazénové vzorky měřeny přibližně se stejnou prodlevou, je srovnání hodnot konkrétního dodavatele na hodnoty ostatních vzorků dostatečně reprezentativní. Vzorky jednou změřené a ponechané při teplotě místnosti (více než 22°C) po dobu 4 až 5 hodin vykazovaly při opakovaném měření hodnoty VMK o 0,15 až 0,35 mmol/100g tuku vyšší.
58
Zajímalo nás rovněž jaká je variabilita výsledků VMK u jednotlivých prvovýrobců mléka. Proto jsme vybrali tři skupiny dodavatelů mléka (stájí) podle průměrné hodnoty VMK za první pololetí 2004. U těchto skupin dodavatelů jsme sledovali variabilitu výsledků hodnot VMK. Tabulka III Stabilita výsledků vybraných skupin zemědělských výrobců mléka hodnocená podle variačních koeficientů Nejnižší var. Nejvyšší var. Průměrný var. Skupina podle množství VMK Četnost koef. (%) koef. (%) koef. (%) ( v mmol/100 g tuku) Nízké hodnoty ( průměr 0,22)
18
27,16
99,9
45,75
Střední hodnoty ( průměr 0,74)
15
7,20
45,3
22,50
Vysoké hodnoty ( průměr 2,25)
20
12,58
41,12
22,48
Domníváme se, že lze poměrně spolehlivě na základě předchozích výsledků rozdělit stáje podle úrovně hodnot VMK v dodávkách mléka, zaměřit pozornost na problémové stáje a případně pomoci s odhalením příčin, doporučit opatření a zlepšit tak kvalitu mléka posuzovanou podle množství VMK. CL Pardubice nedisponuje terénními pracovníky, kteří by vyjížděli k problémům s kvalitou mléka v prvovýrobě. Proto názory dále v tomto odstavci publikované jsou získány zprostředkovaně a jistě by stálo za to, je podrobněji ověřit. Můžeme potvrdit, že významným faktorem zvýšeného množství VMK v mléce jsou mechanické, biochemické a enzymaticko-mikrobiologické změny tukové složky mléka. Rovněž je velmi pravděpodobné, že množství VMK v nadojeném mléce může být ovlivněno metabolizmem samotných dojnic. Zejména v první fázi laktace se část produkčních dojnic dostává do období v němž jsou vystaveny negativní živinové bilanci. V té době mobilizují tukové zásoby na produkci mléka (dojnice hubnou). Zvýšené množství mastných kyselin obsažených v krvi dojnice přechází též do mléka. Vše pak bývá doprovázeno klinickými a subklinickými ketózami. Tyto dva zcela odlišné zdroje zvýšeného množství VMK v mléce sice na první pohled komplikují detekci příčin ale na druhé straně zvyšují význam pravidelného sledování tohoto ukazatele jak pro mlékárnu tak pro chovatele. V souvislosti s vyhodnocováním našich prvních zkušeností s analýzou VMK jsme provedli srovnání hodnot VMK s hodnotami dalších běžně sledovaných jakostních ukazatelů. K tomu jsme využili výsledků zkoušek skupin dodavatelů již uvedených v tabulce III. Tabulka IV Porovnání výsledků skupin zemědělských výrobců mléka podle množství VMK a dalších běžně hodnocených jakostních ukazatelů Tuk Bílkovina SB Urea Skupina podle množství VMK Četnost g/100g g/100g v tis. mg/100ml ( v mmol/100 g tuku) Nízké hodnoty ( průměr 0,22)
18
4,19
3,48
201
20,3
Střední hodnoty ( průměr 0,74)
15
4,20
3,39
281
23,9
Vysoké hodnoty ( průměr 2,25)
20
4,10
3,33
289
21,7
59
Vzhledem k poměrně malé četnosti vybraných skupin nelze získané výsledky zevšeobecňovat. Navíc v předchozím textu uvedené dvě zcela irelevantní příčiny obsahu VMK v syrovém mléce mohou pro nás nepostižitelným způsobem ovlivnit výběr dodavatelů mléka. Mlékárenské podniky jsou v současné době řeší požadavky zemědělců na vyrovnání nákupních cen mléka na úroveň, kterou prvovýrobcům nabízejí zahraniční mlékárny. Při zvýšení důrazu na oceňování mléka podle obsahových složek, zejména bílkovin, a poskytnutí širokého spektra výsledků zkoušek, které mohou pomoci jak mlékárnám tak zemědělcům odhalit rezervy v kvalitě dodávek mléka, lze tyto podmínky ustát. K tomu chce být svými aktivitami nápomocna i Centrální laboratoř Pardubice. Kontaktní adresa: Ing. Pavel Kopunecz, Centrální laboratoř Pardubice, MLEKOLAB s.r.o., S.K.Neumanna 1316, 530 02 Pardubice
60
TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI NEBOVINNÝCH MLIEK Boroš Vladimír, Herian Karol Výskumný ústav mliekarenský, a.s. Žilina TECHNOLOGICAL PROPERTIES OF NON-BOVINE MILKS Summary: The paper deals with problems of some technological fields of milks from small ruminants (sheep and goat). Presented are results related to observation of possibilities of using the sheep and goat milk in preparation of cream and yogurt culture as well as cheese cultures S. thermophilus and Lactobacilus helveticus. It was found that both types of milk (sheep and goat) are just as good for preparation of these cultures as cow milk. Development of microorganisms of the cultures observed as well as fermentation was good in all three types of milk. However, it is better to use cow milk for preparation of highly aromatic cream culture. The paper further deals with factors influencing the rennetability of these milks in comparison to cow milk. Goat milk is more sensible to action of rennets, namely of pepsin, which is important to take in account for technological production of cheeses. Presented are also results of the study depending up the somatic cell counts on the change of composition and technological properties of these milks. Limits of somatic cell counts for cheep milk and goat milk are suggested for the domestic and European legislation. Nebovinné mlieka v našich podmienkach nepredstavujú rozhodujúci podiel vo výrobe a spotrebe mliečnych výrobkov, no napriek tomu predstavujú a historicky vždy predstavovali pre určité skupiny obyvateľstva a regióny Slovenska významný zdroj činnosti aj výživy. Najmä spracovanie ovčieho mlieka sa u nás môže oprieť o bohatú tradíciu, kozie mlieko má však vzhľadom na možnosti väčšej koncentrácie výroby mlieka nové možnosti priemyselného využitia. Preto sme v minulých rokoch orientovali pozornosť na štúdium niektorých technologických vlastností týchto mliek s cieľom využitia poznatkov pri ich spracovaní v koncentrovaných i dekoncentrovaných podmienkach. Vzhľadom na zameranie tohoto odborného seminára v referáte stručne prezentujeme získané poznatky v nasledovných odborných okruhoch: - vhodnosť nebovinných mliek (ovčieho a kozieho) ako média pre rozvoj ušľachtilej mikroflóry - syriteľnosť týchto mliek pri použití komerčných syridlových enzýmov - vplyv počtu somatických buniek na zmenu niektorých technologických vlastností. V prvom okruhu sme sledovali rast a rozmnožovanie jogurtovej a smotanovej kultúry a syrárskych kultúr S. thermophilus a L. helveticus v ovčom, kozom a kravskom mlieku. V priebehu inkubácie sme v rôznych časových intervaloch sledovali titračnú a aktívnu kyslosť a počty zárodkov. U jogurtovej kultúry sme mikroskopicky sledovali aj pomer streptokokov a tyčiniek. U smotanovej kultúry sme sledovali množstvo aromatických látok kvalitatívne kreatínovou skúškou a rozvoj mikroorganizmov mikroskopicky. Keď porovnáme priebeh zmien v počte mikroorganizmov smotanovej kultúry vo všetkých troch druhoch mlieka, zistíme, že priebeh zmien bol podrobný, pričom rýchlejšie sa zvyšoval ich počet v kozom mlieku ako v ostatných dvoch druhoch mlieka. Maximálny počet mikroorganizmov sme zistili vo všetkých troch druhoch mlieka po 12 hodinách inkubácie. V ďalšom období dochádzalo k znižovaniu ich počtu, avšak aj po 24 hodinách inkubácie dosahoval počet rádovo hodnotu 108. ml-1. Rozdiely v rozvoji mikroorganizmov (sledované mikroskopicky) sme zistili medzi kravským mliekom a ostatnými dvoma druhmi mlieka (ovčím a kozím), v ktorých sme zistili väčšie množstvo streptokokov ako v mlieku kravskom. Titračná kyslosť sa zvyšovala rýchlejšie v ovčom a kravskom mlieku, ako v kozom mlieku, v ktorom po 24 hodinách dosahovala len 34,4o SH oproti hodnotám 40,2o SH v mlieku kravskom a 44,2o SH v mlieku ovčom. Zmeny pH boli podobné vo všetkých druhoch mlieka, čo zodpovedá zisteniu autorov Bysstad a Abrahamsen u smotanovej kultúry FD. 61
Väčšie množstvo aromatických látok sme zistili v kravskom mlieku ako v kozom a ovčom mlieku. V kozom mlieku sme okrem toho zistili aj menej kyslú chuť a menej homogénny film. Pri sledovaní aktivity jogurtovej kultúry sme zistili najvyššiu titračnú kyslosť v ovčom mlieku, titračná kyslosť v kravskom a kozom mlieku bola približne rovnaká, na rozdiel od výsledkov autorov Abrahamsen et al., ktorí zistili vyššiu titračnú kyslosť v kozom mlieku. Priebeh zmien v pH bol podobný vo všetkých druhoch mliek. Najvyšší počet zárodkov sledovaných druhov mlieka sme zistili po troch hodinách inkubácie, a to 47.107 v kozom mlieku, 55.107 v kravskom mlieku a 58.107 v ovčom mlieku. Po štyroch hodinách sme zaznamenali mierny pokles. Po 24 hodinách poklesol ich počet výrazne; v kozom a ovčom mlieku dosahoval hodnotu 10.107 a v kravskom mlieku 30.107.ml-1. Pomer streptokokov k tyčinkám sa menil v priebehu inkubácie. Kým po prvej hodine bol pomer 2 : 1 v kravskom mlieku a 2,3 : 1 v ovčom a kozom mlieku, po dvoch hodinách bol pomer 1 : 1,4 v ovčom mlieku, 1,7 : 1,1 v kravskom mlieku a 2,9 : 1 v kozom mlieku, po troch hodinách sa podiel streptokokov v kravskom mlieku znížil a dosahoval 1,35 : 1, v kozom mlieku zostal prakticky rovnaký (3,3 : 1) a v ovčom mlieku bol pomer obrátený a dosahoval 1 : 2,4. V ďalšom období sa podiel streptokokov znižoval a nastával mierny presun v prospech tyčiniek (kravské mlieko 1 : 1,3, ovčie mlieko 1 : 2,3), okrem kozieho mlieka, v ktorom aj naďalej prevládali streptokoky (2,2 : 1). Konzistenčne najlepšia kultúra bola v ovčom mlieku, v kozom mlieku sa menej uvoľňovala srvátka ako v mlieku kravskom. V kozom a ovčom mlieku bola však menej výrazná jogurtová vôňa; chuť bola kyslá, čistá, typicky jogurtová. Podobný priebeh zmien v počte mikroorganizmov sme zistili vo všetkých troch druhoch mlieka aj u syrárskych kultúr S. thermophilus a Lb. helveticus, pričom najpomalšie sa zvyšoval počet v kozom mlieku u S. thermophilus a v ovčom mlieku u kultúry Lb. helveticus. Maximálny počet mikroorganizmov sme zistili u kultúry S. thermophilus po ôsmich hodinách inkubácie vo všetkých troch druhoch mlieka; dosahovali rádovo hodnotu 108. ml-1. Po 24 hodinách poklesli na hodnotu 107. ml-1. Pomalšiemu zvyšovaniu počtu S. thermophilus v kozom mlieku zodpovedalo aj pomalšie zvyšovanie titračnej kyslosti, ktorá po 24 hodinách dosahovala v kozom mlieku len 34o SH oproti 40o SH v kravskom mlieku a 42o SH v ovčom mlieku. Naopak, u kultúry Lb. helveticus kysací proces prebiehal najrýchlejšie v mlieku kozom, v ktorom sme súčasne zistili aj najvyššiu kyslosť a najnižšie hodnoty pH. Maximálny počet zárodkov vo všetkých troch druhoch mlieka sme zistili po 12 hodinách inkubácie (108 . ml-1). Po 24 hodinách činil počet rádovo 106 . ml-1. Ak zhodnotíme dosiahnuté výsledky s ohľadom na jednotlivé kultúry, môžeme povedať, že rovnako dobrým médiom ako kravské mlieko je pre rozvoj mikroorganizmov smotanovej kultúry i jogurtovej kultúry ovčie a kozie mlieko. Obidve uvedené kultúry sa v tomto mlieku dobre rozvíjali (rozdiely v počte mikroorganizmov boli nevýznamné) a prekysávanie bolo rovnako dobré ako v kravskom mlieku. Menej vhodným médiom pre smotanovú kultúru sú obidva druhy mlieka s ohľadom na aromatičnosť kultúry, ktorá bola menšia ako v mlieku kravskom. V kozom mlieku sme okrem toho zistili nižšiu titračnú kyslosť, čo mohlo byť do istej miery spôsobené nižšou pufrovacou schopnosťou kozieho mlieka, ako uvádzajú Abrahamsen et al. U jogurtovej kultúry sme v uvedených druhoch mlieka zistili menej výraznú jogurtovú arómu. Čo sa týka vhodnosti mlieka na prípravu syrárskych kultúr S. thermophilus a Lb. helveticus , sú uvedené druhy mlieka vhodné aj na prípravu týchto kultúr. Mikroorganizmy obidvoch kultúr sa v ovčom a kozom mlieku dobre rozmnožovali, prekysávanie bolo dobré. U kultúry S. thermophilus sme zistili o niečo nižšiu titračnú kyslosť v kozom mlieku po 12 hodinách, avšak po 24 hodinách dosahovala hodnotu 34o SH. Na základe našich zistení je možné úspešne pripravovať smotanovú a jogurtovú kultúru, ako aj syrárske kultúry S. thermophilus i Lb. helveticus okrem kravského mlieka i v kozom a ovčom 62
mlieku. Jedine v prípade, že chceme získať vysoko aromatickú smotanovú kultúru, je výhodnejšie ju inkubovať v kravskom mlieku. Tieto výsledky avšak vyvracajú časté názory hovoriace o schopnostiach kozieho mlieka ako zvlášť vhodného média na prípravu mliekarenských kultúr. V druhom okruhu sme zamerali pozornosť na syriteľnosť týchto mliek, nakoľko sa väčšinou využívajú na výrobu rôznych typov syrov. Je známe, že zloženie najmä ovčieho mlieka sa mení v závislosti od plemena, laktácie, kŕmenia i hygieny. Z tohoto dôvodu je preto nevyhnutné pri priemyselnom spracovaní štandardizovať jeho vlastnosti, a to kyslosť, výťažnosť, kysaciu a sýriacu schopnosť. Už samotným chladením a záhrevom sa mení a zhoršuje schopnosť mlieka k sýreniu, no na druhej strane sa zlepšuje schopnosť prekysávania po prídavku čistých kultúr. Z našich pokusov vyplýva, že pasterizačným záhrevom sa čas zrážania ovčieho mlieka syridlom predlžoval len v prvej polovici laktácie, pričom vytužovanie syreniny prebiehalo pomalšie a tiež jej pevnosť bola nižšia. Čas zrážania pasterizovaného mlieka bol kratší ako u surového mlieka, avšak pevnosť a elastičnosť syreniny bola nižšia asi o 30%. V mesiaci septembri a októbri bola už syriteľnosť pasterizovaného mlieka až o 50% vyššia. Podobné účinky ako má záhrev na syriteľnosť, má aj nízke ochladenie na 5oC. Teploty nad 10 – 12oC spôsobovali už zlepšenú syriteľnosť. Spomínané zmeny súvisia so zložením mlieka, a to jeho beztukovej sušiny, bielkovín, kazeínu a so zmenenou rovnováhou vápenatých solí. Z uvedených dôvodov je preto v praxi žiadúce upravovať pri výrobe syrov zo surového alebo i pasterizovaného ovčieho mlieka v priebehu laktácie jeho technologické vlastnosti. Najdôležitejšie je dodržať vhodnú titračnú kyslosť – minimálne 9,0 SH na jar a maximálne 12,0 SH na jeseň. Táto sa môže na jar upravovať pridávaním prevarenej kyslej srvátky, predzrievaním mlieka v teple a po pasterizácii prídavkom vhodných mliekarenských kultúr. Pri nadmernej kyslosti je túto možné znížiť prídavkom pitnej vody. Ďalším dôležitým ukazovateľom je obsah vápnika a najmä jeho rozpustné formy v iónovom stave. Napriek tomu, že v ovčom mlieku je vyšší obsah celkového vápnika (asi 1800 mg/l), pri zvýšenom obsahu kazeínu (4,5%) je v ovčom mlieku relatívne oproti kazeínu menej ako v kravskom mlieku. Z tohoto dôvodu je v ovčom syrárstve prídavok vápenatých solí veľmi dôležitý na dosiahnutie lepšieho sýrenia, výťažnosti i kvality. Zvlášť je to potrebné pri používaní pepsínových syridiel, kde pridaním vápenatých solí (20 g CaCl2/100 l mlieka) sa zvýši syriteľnosť až o vyše 70%. Pri výrobe ovčích syrov má veľkú úlohu i druh používaného syridla vzhľadom na vyšší obsah bielkovín a vyššiu kyslosť. Porovnávaním viacerých druhov syridiel sme zistili, že chymozínové syridlá zrážali ovčie mlieko pomalšie (asi o 20%) ako kravské mlieko. Avšak mikrobiálne syridlo Renniláza a tiež pepsínové syridlá zrážali ovčie mlieko lepšie o 15, resp. až 58%. Najlepšie výsledky sa však dosahovali s jahňacím syridlom, ktoré je na ovčie mlieko veľmi citlivé a vyrobený syr mal najlepšie chuťové i konzistenčné vlastnosti. Venovali sme sa výskumne aj štúdiu technologických vlastností kozieho mlieka. Pri sledovaní syriteľnosti sa potvrdilo, že syridlom sa lepšie zráža kazeín kozieho mlieka ako kravského. Táto vlastnosť sa zachovala aj pri rôznych kombináciách sledovaných technologických faktorov. Pri porovnávaní sýriacej schopnosti pepsínového a chymozínového syridla na kozom mlieku sa zistila pri nižších teplotách vyššia účinnosť chymozínového syridla, pričom pri najvyššej sledovanej teplote sa pomer zmenil v prospech syridla pepsínového. Pepsínové syridlo sa v porovnaní so syridlom chymozínovým prejavilo priaznivejšie i na retenciu bielkovín, pričom najvyššia retencia sa dosiahla pri teplote 30oC, kyslosti 8,0 SH a prídavku 20 g CaCl2 na 100 l mlieka. Vyššia retencia bielkovín pri použití chymozínového syridla sa zistila pri sýrení kravského mlieka, pričom rozdiel bol štatisticky významný. Z uvedených výsledkov vyplýva, že účinnosť pepsínového syridla je mierne vyššia pri pôsobení na bielkovinu kozieho mlieka a pri dodržaní optimálnej teploty sýrenia je jeho použitím možné dosiahnuť optimálnu retenciu bielkovín. Pre získanie poznatkov v treťom problémovom okruhu sa v priebehu jednej dojnej sezóny (apríl až október) v pravidelných intervaloch vykonalo 10 odberov bazénových vzoriek mlieka od dvoch stád kôz (biela krátkosrstá) a dvoch stád oviec (zušľachtená valaška). U týchto vzoriek sa sledovalo základné zloženie mlieka – obsah tuku, bielkovín, laktózy a beztukovej sušiny, 63
počet somatických buniek, trieda NK-testu, merná vodivosť, titračná kyslosť, merná hmotnosť, teplota tuhnutia, obsah sodíka, obsah vápnika, obsah chloridových iónov, celkový počet mikroorganizmov, prítomnosť rezíduí inhibičných látok a technologické vlastnosti mlieka, ako syriteľnosť – doba zrážania syridlom a kysacia schopnosť. Vzorky ovčieho mlieka v priebehu dojnej sezóny prakticky spĺňali požiadavky slovenskej legislatívy (tuk min. 5,5 g/100 g, bielkoviny min. 4,8 g/100 g), len hodnota mernej hmotnosti bola až do začiatku augusta pod dolným limitom 1,033 g/cm3, v priemere sa pohybovala okolo hodnoty 1,032 g/cm3 a v jednom prípade ku koncu sezóny vystúpila titračná kyslosť nad horný prípustný limit 12oSh. Hodnoty počtu SB sa pohybovali v rozmedzí od 61 do 366 tis. Podobné hodnoty v priebehu sezóny zistili aj Jelínek a kol. a Špánik a kol. Vzhľadom k tomu, že sa počty SB pohybovali počas celej sezóny v rozmedzí hodnôt, pri ktorých možno predpokladať, že ide o mlieko štandardné, možno konštatovať, že zmeny, ktoré nastali u jednotlivých ukazovateľov sú spôsobené predovšetkým vplyvom sezóny. Na základe dosiahnutých výsledkov možno konštatovať, že pri počtoch SB do 400 tis./ml, pri neprítomnosti rezíduí inhibičných látok a celkových počtoch mikroorganizmov do 800 tis./ml, sú najdôležitejšie technologické vlastnosti ovčieho mlieka – syriteľnosť a kysacia schopnosť štandardné počas celej dojnej sezóny, t.j. od polovice apríla do začiatku októbra. Vzorky kozieho mlieka v priebehu dojnej sezóny nespĺňali požiadavky slovenskej legislatívy (tuk min. 3,0 g/100 g, bielkoviny min. 3,0 g/100 g) v parametri obsah bielkovín (80%), beztuková sušina (90%) a merná hmotnosť (70%). Nízky obsah bielkovín v kozom mlieku zaznamenali tiež Gajdůšek – priemerná hodnota 2,95%, min. hodnota 2,01%, max. hodnota 3,86%m a Hanuš – priemerná hodnota 2,77, min. hodnota 2,46%, max. hodnota 3,28%. Hodnoty počtu SB sa pohybovali v rozmedzí od 635 do približne 1000 tis./ml. Len v jednom prípade bola hodnota 2589 tis./ml. Zvýšené počty SB nemali vplyv na hodnoty mernej vodivosti, ktoré sa pohybovali v rozmedzí od 0,65 do 0,69 s priemernou hodnotou 0,66, čo zodpovedá aj hodnotám uvádzaným Hanušom pre vzorky kozieho mlieka s počtom SB do 900 tis./ml a triedou NK testu 1 až 2. Zvýšené hodnoty mernej vodivosti oproti kravskému mlieku (0,4 – 0,55 S/m) zaznamenali aj Park a Nuti. Zvýšené počty SB tiež nemali vplyv na obsah laktózy, ktorý sa pohyboval v rozmedzí od 4,53 do 4,64%. Iba vzorky v apríli a októbri mali hodnoty pod hranicou 4,50%, vtedy však boli hodnoty SB cca 800 tis./ml. Takéto premenlivé počty SB nemali podstatný vplyv na technologické vlastnosti kozieho mlieko počas celej sezóny. Pri priemernej hodnote PSB 360 tis./ml v ovčom mlieku je na Slovensku situácia o niečo lepšia a pri priemernej hodnote PSB 800 tis./ml v kozom mlieku je situácia na Slovensku približne rovnaké ako v niektorých oblastiach Francúzska, Španielska a Talianska. Získanými výsledkami sa stanovili reálne kritériá zodpovedajúce možnostiam a podmienkam na Slovensku. Pre Slovensko sú reálne hranice PSB u ovčieho mlieka 800 tis./ml a u kozieho mlieka 1500 ml./ml. Európska únia ešte tento parameter do svojej legislatívy nezaviedla, ale je len otázkou času, kedy sa tak stane. Mlieka malých prežúvavcov, najmä mlieko kozie, je citlivejšie na vonkajšie aj vnútorné faktory v chove. Potvrdzujú to časté problémy pri spracovaní týchto mliek, ktoré je potrebné riešiť. Preto je potrebné túto problematiku neustále sledovať. Citovaná literatúra je k dispozícii u autora. Kontaktná adresa: Výskumný ústav mliekarenský, a.s., Dlhá 95, 010 01 Žilina, SR
64
VÝSLEDKY SENZORICKÉHO HODNOCENÍ KOZÍCH SÝRŮ VYRÁBĚNÝCH NA FARMĚ Šustová Květoslava1, Mášová Hana1, Kuchtík Jan2 1 Ústav technologie potravin, 2Ústav chovu hospodářských zvířat Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně RESULTS OF SENSORY EVALUTED OF GOAT‘S CHEESE MANUFACTURED ON FARMHOUSE V červnu loňského roku proběhl na Mendelově zemědělské a lesnické univerzitě v Brně seminář zaměřený na problematiku farmářské výroby sýrů a kysaných mléčných výrobků. V rámci tohoto semináře se uskutečnilo senzorické hodnocení sýrů vyráběných z kozího, ovčího a kravského mléka na farmách. Vzorky 14 kozích sýrů hodnotila jedenáctičlenná odborná komise sestavená ze školených posuzovatelů. Sýry, patřících převážně do kategorie sýrů čerstvých, byli posuzovány pomocí nestrukturované 10-ti cm grafické stupnice. Hodnocena byla příjemnost vzhledu, intenzita vůně po kozím mléku, celková příjemnost vůně, intenzita slané chuti, intenzita chuti po kozím mléku, intenzita cizí chuti a celková příjemnost chuti. Výsledky senzorického hodnocení byly statisticky zpracovány. Převážně byla většina sýrů hodnocena velmi kladně. Výsledky senzorického hodnocení jsou uvedeny v tabulkách I a II. Tabulka I Výsledky vybraných ukazatelů senzorického hodnocení kozích sýrů Vzorek
Amalthea s.r.o. Hrbkovi Kozí sýr slaný tvrdý Amalthea s.r.o. Hrbkovi Kozí sýr slaný tvrdý zralejší Kozí farma Žofín Lužický přírodní sýr paprikový s česnekem Kozí farma Žofín Lužický přírodní sýr Kozí farma Žofín Lužický přírodní sýr bílý Kozí ekolog. farma Látalovi Polotvrdý zrající sýr Akát Kozí ekolog. farma Látalovi Čerstvý sýr kmínový Kozí ekolog. farma Látalovi Čerstvý sýr kořeněný p. Koňařík Slaný sýr p. Zelenská Kozí sýr s nivou Farma dojných a kašmírských koz Šošůvka Přírodní kozí sýr Farma dojných a kašmírských koz Šošůvka Přírodní sýr s gyrosem Kozí farma Štrbovi Sýr s koprem Kozí farma Štrbovi Uzený sýr Tabulka II
Celková příjemnost vzhledu
Intenzita vůně po kozím mléku
Celková příjemnost vůně
Intenzita slané chuti
72
35
53
72
59
34
55
54
67
29
48
59
60
35
55
25
68
25
56
59
66
34
64
63
71
25
62
43
75
20
80
56
70
25
60
47
40
43
42
38
67
19
62
42
75
12
78
55
77
11
69
14
84
17
85
23
65
Výsledky vybraných ukazatelů senzorického hodnocení kozích sýrů Vzorek
Amalthea s.r.o. Hrbkovi Kozí sýr slaný tvrdý Amalthea s.r.o. Hrbkovi Kozí sýr slaný tvrdý zralejší Kozí farma Žofín Lužický přírodní sýr paprikový s česnekem Kozí farma Žofín Lužický přírodní sýr Kozí farma Žofín Lužický přírodní sýr bílý Kozí ekolog. farma Látalovi Polotvrdý zrající sýr Akát Kozí ekolog. farma Látalovi Čerstvý sýr kmínový Kozí ekolog. farma Látalovi Čerstvý sýr kořeněný p. Koňařík Slaný sýr p. Zelenská Kozí sýr s nivou Farma dojných a kašmírských koz Šošůvka Přírodní kozí sýr Farma dojných a kašmírských koz Šošůvka Přírodní sýr s gyrosem Kozí farma Štrbovi Sýr s koprem Kozí farma Štrbovi Uzený sýr
Intenzita cizí chuti
Intenzita chuti po kozím mléku
Celková příjemnost chuti
Celkové hodnocení vzorku
16
36
49
54
29
46
48
44
13
24
53
55
5
36
66
63
7
36
58
56
14
43
62
63
10
21
68
64
9
27
66
72
11
29
57
47
30
46
28
20
15
40
54
59
8
24
62
63
9
11
66
66
12
17
64
57
Výsledky senzorického hodnocení Hodnocení příjemnosti vzhledu Jako vzhledové nejpřitažlivější byly hodnoceny na prvních místech sýry ochucené nebo uzené (přírodní sýr s gyrosem – Šošůvka, sýr s koprem – Štrbovi, uzený sýr – Štrbovi, čerstvý sýr kořeněný – Látalovi. Velmi vysoké ohodnocení získaly také čerstvé sýry (kozí sýr slaný tvrdý – Hrbkovi, čerstvý sýr kmínový – Látalovi). Hodnocení vůně Podle očekávání byly z hlediska intenzity kozí vůně dobře hodnoceny především ochucené sýry, u kterých byla, tato pro některé konzumenty ne příliš žádaná vůně, do jisté míry překryta právě použitou příchutí. Zde jsou nejlépe hodnoceny sýry přírodní sýr s gyrosem –Šošůvka, sýr s koprem – Štrbovi, uzený sýr – Štrbovi. Velmi podobné výsledky potom byly získány i při hodnocení celkové příjemnosti vůně, kde vysoce hodnoceny byly opět především sýry s příchutí (přírodní sýr s gyrosem –Šošůvka, čerstvý sýr kořeněný – Látalovi). Na rozdíl u hodnocení intenzity kozí vůně, kde vysoká čísla znamenají sýry méně přijatelné, u hodnocení příjemnosti vůně vysoká čísla znamenají vyšší příjemnost pro hodnotitele. Z tohoto pohledu je zřejmé, že naprostá většina sýrů byla hodnocena jako velmi příjemně vonící.
66
Hodnocení chuti Zde byly hodnoceny intenzity chuti slané, kozí a celková příjemnost chuti. Většina vzorků byla hodnocena jako přijatelně slaná. Nejvíce slanou chuť měl kozí sýr slaný tvrdý – Hrbkovi, naopak nejméně slaný byl sýr s koprem – Štrbovi. Porovnáme-li následně celkovou příjemnost chuti a chuť slanou, je zřejmé, že právě velmi výrazná slaná chuť některých sýrů snížila pak jeho hodnocení chuti celkové. Hodnocení intenzity kozí chuti je vždy velmi problematické. U kozích sýrů se dá tato chuť očekávat ve vyšší míře a není možné ji hodnotit jako chuť nevyhovující, na druhou stranu je příliš intenzivní chuť po kozině pro řadu konzumentů méně přijatelná. Toto se potvrdilo i u našich výsledků. Nejvíce intenzivní kozí příchuť měly sýry kozí sýr s nivou – Zelenská a kozí sýr slaný tvrdý zralejší – Hrbkovi. U těchto sýrů se kozí příchuť ještě zvýrazní v průběhu vlastního technologického zpracování sýrů – tedy zráním a přídavkem plísňové kultury. Nejméně intenzivní kozí chuť měly uzený sýr – Štrbovi a sýr s koprem – Štrbovi. Je samozřejmé, že u ochucených sýrů byla tato kozí chuť přehlušena použitou příchutí. Výsledky hodnocení cizí chuti se příliš neliší od hodnocení kozí chuti. Cizí příchuť byla nejvíce uváděna u vzorků kozí sýr slaný tvrdý zralejší – Hrbkovi, kozí sýr s nivou – Zelenská. Kromě těchto sýrů byly hodnoceny všechny ostatní sýry velmi dobře, tedy v naprosté většině bez nežádoucích příchutí. Nejlépe byl hodnocen z tohoto pohledu Lužický přírodní sýr – Žofín. Výsledky ukazují, že v této kategorii hodnocení byly sýry umístěné na prvních místech velmi vyrovnané. Závěrem senzorického hodnocení sýrů bylo posouzení příjemnosti celkové chuti. V tomto hodnocení byly výsledky velmi vyrovnané, jak je zřejmé hned 3 sýry se umístily na druhém místě. Výsledky hodnocení vzorků podle chuti – zde získaly 3 sýry stejné bodové ohodnocení: Čerstvý sýr kmínový - Látalovi
68 bodů - I . místo
Lužický přírodní sýr - Žofín
66 bodů – II. místo
Čerstvý sýr kořeněný - Látalovi
66 bodů - II. místo
Sýr s koprem - Štrbovi
66 bodů - II. místo
Uzený sýr - Štrbovi
64 bodů – III. místo
Výsledky hodnocení vzorků podle celkového dojmu, tedy zde bylo zahrnuto i hledisko celkové příjemnosti vzhledu a textury sýru: Čerstvý sýr kořeněný - Látalovi
72 bodů - I . místo
Sýr s koprem - Štrbovi
66 bodů - II. místo
Čerstvý sýr kmínový - Látalovi
64 bodů - III . místo
I zde jsou výsledky hodnocení velmi vyrovnané, což je zřejmé z umístění na čtvrtém místě, kde získali stejný počet bodů (63) hned 3 druhy sýrů: Lužický přírodní sýr – Žofín, polotvrdý zrající sýr Akát – Látalovi, přírodní sýr s gyrosem – Šošůvka. Uvedený výsledky senzorického hodnocení kozích sýrů dokazují, že lze i v nelehkých podmínkách České republiky vyrábět vysoce kvalitní a chutné sýry přímo na farmách. Kontaktní adresa: Ing. Květoslava Šustová, PhD., Ústav technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno. Tel.: +420 545 133 257, Fax: +420 545 133 190, e-mail:
[email protected]
67
KVANTITATÍVNA ANALÝZA POTENCIÁLNEHO ANTIMIKROBIÁLNEHO PÔSOBENIA LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 V MLIEKU Valík Ľubomír, Lauková Denisa, Polka Peter, Bajúsová Barbora Katedra výživy a hodnotenia potravín Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU Bratislava, Slovensko QUANTITATIVE STUDY OF POTENTIAL ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 IN MILK Summary: In the study the results of growth dynamics of Staphylococcus aureus B1 and Lactobacillus rhamnosus VT1 incubated in milk individually and together in dependance of storage temperature are presented. Increasing storage temperature caused the lag-phase shortening and growth rates increases of both microbial strain, Lb. rhamnosus VT1 and S. aureus B1. In both cases the increase of growth rates as a function of storage temperature were described using Ratkowsky modelling technique: √µLr = 0.013T-0.0036 (R2 = 0.9664) and √µSa = 0.0257T-0.1805 (R2 = 0.9623). Lagphase of Lb. rhamnosus VT1 in dependance of temperature was possible characterized according to the polynomic equation: λLr = 1.1237T2-48.601T+521.3 (R2 = 0.9974). Lag time shortening of S. aureus B1 as a function of the increasing incubation temperature was in secondary phase of mathematical modelling described according to the following equation: λ-1Sa = 2E-05×T2.8896 (R2 = 0.9655). The partial antimicrobial activity of Lb. rhamnosus VT1 against S. aureus B1 tested at 15, 20, 25 and 35 °C was determined only at the temperature of 15 °C. Lag-phase duration of S. aureus B1 was prolonged about 40 h in comparison with lag time of S. aureus B1 in milk without Lb. rhamnosus VT1. The effect of Lb. rhamnosus VT1 on the growth rates of S. aureus B1 at all tested temperatures was not observed. Výroba ovčieho hrudkového syra (OHS) na salaši zo surového mlieka a jeho kysnutie sa spravidla uskutočňuje bez použitia zákysov používaných v priemyselnom syrárstve. Fermentácia ovčieho hrudkového syra na salaši a zrenie pred výrobou bryndze v bryndziarni je preto vecou vzájomných ekologických vzťahov medzi mikroorganizmami natívne prítomnými v ovčom mlieku po nadojení, vnútorným prostredím v hrudke a vonkajšími podmienkami, ktoré sa v konečnom dôsledku podieľajú na vlastnostiach vyrobeného ovčieho syra. Rozhodujúcimi sú predovšetkým vlastnosti mlieka, jeho teplota, teplota spracovávaného koagulátu, teplota vonkajšieho prostredia ako aj čas. Vzhľadom na horeuvedené skutočnosti pri výrobe ovčieho hrudkového syra je možné očakávať určitú variabilitu v dosahovaní požadovanej finálnej kyslosti syrov a taktiež variabilitu v čase, kedy sa dosiahne požadovaná kyslosť (alebo hodnota pH). Tento čas by mohli využiť aj nežiadúce mikroorganizmy, ktoré, ak by sa v syre nachádzali, mohli by sa pri pomalom okyseľovaní vnútorného prostredia množiť. Do úvahy prichádzajú najčastejšie E. coli alebo Staphylococcus aureus. Grieger a kol. (1979) pozorovali po požití OHS vyrobeného na salaši počas prvých chladnejších jarných mesiacov stafylokokové intoxikácie konzumentov. Pri hľadaní príčin tohto javu terénnymi pokusmi experimentálne upozornili na vysoký výskyt stafylokokov v ovčom mlieku ako aj v samotnom OHS na začiatku jeho kysnutia. V chladnejšom mesiaci máji stanovili v mlieku 490 000 až 540 000 KTJ.g-1 stafylokokov a v mladom syre kysnúcom dva dni aktívnu kyslosť pH = 6,3 až 6,0. Teplota ovzdušia počas kysnutia tohto OHS kolísala v rozmedzí 18 až 12 °C. O situácii v súčasnosti, konkrétne z ostatnej sezóny r. 2004, referuje Štátna veterinárna a potravinová správa SR na svojej internetovej stránke. Zo zverejnených údajov vyplynulo, že v období od apríla do septembra, t.j. za 6 mesiacov, sa v rámci oficiálnych kontrol zistilo prekročenie limitných počtov E. coli alebo Staphylococcus aureus v 24 prípadoch. Bohužiaľ nebolo možné zistiť, koľko vyšetrení ovčieho hrudkového syra sa v uvedenom období uskutočnilo. 68
Lactobacillus rhamnosus patrí medzi baktérie mliečneho kysnutia, o ktorý mliekarenskí technológovia a mikrobiológovia prejavujú zvýšený záujem. Zameriavajú sa predovšetkým na probiotické vlastnosti niektorých jeho kmeňov, (napríklad Lb. rhamnosus GG), ale aj antimikrobiálnu aktivitu voči kontaminujúcim mikroorganizmom (Salmonella typhi, S. typhimurium, Shigella flexneri, Sh. dysenteriae, E. coli a Pseudomonas aeruginosa), (Gilmour a Rowe, 1990). Tieto jeho vlastnosti sa už využívajú aj komerčne vo forme tzv. ochranných kultúr aplikovaných napríklad do kyslomliečnych produktov. Kolektív Doc. Ing. Milady Plockovej (2001) zistil antifungálnu aktivitu kmeňa Lb. rhamnosus VT1 voči vláknitým mikroskopickým hubám P. expansum, P. verrucosum, F. proliferatum, F. graminearum, A. candidus C25, A. repens NRRL 13, Alternaria alternata NRRL 5255, R. stolonifer NRRL 1519 a Cladosporium cladosporioides NRRL 6421. Minulý rok sa prezentovali výsledky o inhibičnej aktivite Lb. rhamnosus VT1 na rast kvasinkového kontaminanta Candida maltosa YP1 v závislosti od teploty uchovávania. Tento kmeň vykazoval voči testovanému psychrotrófnemu, acidotolerantnému a termorezistentnému kmeňu C. maltosa YP1 pomerne intenzívnu antimikrobiálnu aktivitu, ktorá sa prejavovala predlžovaním jej lag-fázy a znižovaním rastovej rýchlosti (Lauková a kol., 2004). Na základe horeuvedených informácii bolo cieľom tejto práce zistiť, či kmeň Lb. rhamnosus VT1 má podobné vlastnosti aj voči Staphylococcus aures, ktorého kmeň označený ako B1 sme izolovali z bryndze. K tomuto účelu sme do UHT mlieka naočkovali obidva kmene a pri viacerých inkubačných teplotách sledovali ich dynamiku rastu. Získali sme ich príslušné rastové čiary počas ich spoločného rastu v tom istom substráte. Nás zaujímalo ako bolo správanie S. aureus B1 ovplyvnené rastom a metabolizmom Lb. rhamnosus VT1. Získané rastové parametre S. aureus B1 sme porovnali jeho parametrami v UHT mlieku bez súčasnej inokulácie Lb. rhamnosus VT1. Dynamika rastu Lactobacillus rhamnosus VT1 a Staphylococcus aureus v závislosti od teploty uchovávania (samostane) Dynamika rastu kultúr Lb. rhamnosus VT1 a S. aureus B1 zámerne inokulovaných do vzoriek trvanlivého mlieka v závislosti od teploty uchovávania je graficky znázornená na obr. 1 a 2. Grafické znázornenia rastových čiar Lb. rhamnosus VT1 a S. aureus B1 (obr. 1 a 2) v mliečnom rastovom substráte poukazujú na skutočnosť, že rastová rýchlosť bakteriálnych kultúr sa so zvyšujúcou sa teplotou uchovávania zvyšovala a trvanie lag-fázy sa analogicky skracovalo. 9
9
8
8
7
6 5
15°C
[log KTJ.ml -1]
[log KTJ.ml-1]
7
17°C
4
20°C 25°C
3
6 5 8°C
4
10°C
3
15°C
2
17°C 21°C
1
35°C
24°C
0
2 0
24
48
72
96
120
144
0
168
Čas [h]
Obr. 1:
72
144 216 288 360 432 504 576 648 720 Čas [h]
Obr. 2:
Rastové čiary Staphylococcus aureus B1 v UHT Rastové čiary Lactobacillus rhamnosus VT1 v UHT mlieku pri teplote 15, 17, 20, 25 a 35 °C mlieku pri teplote 8, 10, 15, 17, 21 a 24 °C
69
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
1/lag-fáza [h-1]
druhá odmocnina rastovej rýchlosti [h-1]
V mliečnom substráte sme nezaznamenali rast Lb. rhamnosus VT1 pri teplote 6 °C. Pri teplote 8 °C trvala lag-fáza laktobacila 202 h (8d) a rastová rýchlosť bola vypočítaná na 0,0106 h-1, pričom generačný čas (GT) trval 28,4 h. Už zvýšením teploty uchovávania na 10 °C sa rastová rýchlosť Lb. rhamnosus VT1 zvýšila dvojnásobne (GT = 13,9 h). Najvýraznejšia dynamika rastu čistej kultúry Lb. rhamnosus VT1 bola pozorovaná pri teplotách 21 a 24 °C, kedy sa generačný čas skrátil osemnásobne a fáza prispôsobovania trvala 4 h, resp. pri teplote 24 °C rástla kultúra laktobacilov bez lag-fázy. Dynamiku rastu S. aureus B1 zámerne inokulovaného do UHT mlieka sme študovali pri teplotách 15 až 35 °C. Toto teplotné spektrum sme si vybrali z dôvodu analýzy jeho schopnosti potenciálne sa pomnožiť v hrudkovom ovčom syre, ak by neboli nedodržané prísne kritériá jeho výroby zo surového ovčieho mlieka na salašoch. Kým pri teplote 15 °C trvala lag-fáza kmeňa S. aureus B1 57 h, zvýšením o 2 °C (17 °C) sa jej dĺžka skrátila na 10 h. Pri teplotách 20 až 35 °C bola fáza prispôsobovania sa kultúry podmienkam v novom prostredí skrátená zo 6,2 hodín na 1,5 hodiny. Podobne sa znižoval aj generačný čas, zvyšovala sa intenzita rozmnožovania S. aureus v exponenciálnej fáze. Hodnoty rastových parametrov, ako trvanie lag-fázy (λ) a rastová rýchlosť (µ) boli v druhej fáze matematického hodnotenia analyzované vo vzťahu k teplotám uchovávania trvanlivého mlieka. Závislosť rastovej rýchlosti S. aureus B1 a Lb. rhamnosus VT1 bolo možné popísať Ratkowského modelom s vysokými korelačnými koeficientami (√µSa = 0,0257T-0,1805, R2 = 0,96230; √µLr = 0,013T-0,0036, R2 = 0,9664). Analogicky bolo možné matematicky analyzovať skracovanie trvania lag-fázy oboch kmeňov v závislosti od stúpajúcej teploty uchovávania pomocou nasledovných rovníc: λ-1Sa = 2E-05×T2,8896 (R2 = 0,9655), λLr = 1,1237T248,601T+521,3 (R2 = 0,9974). Obr. 3 a 4 dokumentujú horeuvedené závislosti získané v UHT mlieku s kmeňom S. aureus B1.
0,5 0,4 0,3
0,5 0,4 0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0 0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
0 0
Teplota [°C]
4
8
12
16
20
24
28
32
36
Teplota [°C]
Obr. 3:
Obr. 4:
Závislosť lag-fázy S. aureus B1 (λ-1) v UHT mlieku od teploty
Závislosť rastovej rýchlosti S. aureus B1 (√µ) v zámerne inokulovanom UHT mlieku od teploty
Dynamika spoločného rastu Staphylococcus aureus a Lactobacillus rhamnosus VT1 v UHT mlieku v závislosti od teploty V ďalšej sérii pokusov sme UHT mlieko súčasne naočkovali obidvoma kultúrami, ktorých rast sa doteraz sledoval samostatne. Počiatočné počty obidvoch mikroorganizmov po inokulácii mlieka sa pohybovali v intervale 103 až 104 KTJ.ml-1. Tri naočkované paralelné mlieka sa inkubovali pri 15, 20, 25 a 35 °C. 70
Z jednotlivých rastových čiar prezentovaných na obr. 5 a 6 je zreteľne vidieť, že rast S. aureus sa na rozdiel od rastu Lb. rhamnosus VT1 vyznačoval lag-fázou v UHT mlieku pri všetkých sledovaných teplotách. Na druhej strane však potom jeho rast v exponenciálnej fáze bol dynamický, rýchlejší ako rast laktobacila. Rast Lb. rhamnosus VT1 prebiehal bez tzv. prispôsobovacej fázy a ukázalo sa, že mliečny substrát je mu blízky. Na druhej strane jeho rast bol pomalší ako rast S. aureus B1 (v exponenciálnej fáze) a tiež okyseľovanie mlieka bolo pomalé. V dôsledku toho bol rast S. aureus B1 ovplyvnený len čiastočne, a to pri najnižšej použitej teplote inkubácie 15 °C, kedy došlo k predĺženiu lag-fázy o takmer 44 h v porovnaní so samostatným rastom tohto kmeňa. Zníženie rastovej rýchlosti v exponeciálnej fáze rastu nebolo pozorované. Pri teplotách 25 a 35 °C sa dĺžka lag-fázy S. aureus B1 zmenila len nevýznamne. Hodnoty rastových rýchlostí zostali pri všetkých paralelných pokusoch a testovaných teplotách nezmenené. 9
8
8
7
7
6
6 log
log
9
5 4
5 4
3
3
LR15_SA (15 °C)
2 0
48 log_LR pH log_SA
96
144
LR20_SA (20 °C)
2
192
0
24 log_Lr_20 log_Sa_20 pH
čas [h]
48
72
96
čas [h]
9
9
8
8
7
7
6
6 log
log
Obr. 5: Rastové čiary S. aureus B1 a Lb. rhamnosus VT1 kultivovaných spolu v UHT mlieku pri teplotách 15 a 20 °C
5 4
log_Lr_25 log_SA_25 pH
3
5 4
log_LR_Sa_35 log_SA_Lr_35 pH_Lr_Sa_35
3
2
2
0
24
48
72
0
čas [h]
24
čas [h]
48
72
Obr. 6: Rastové čiary S. aureus B1 a Lb. rhamnosus VT1 kultivovaných spolu v UHT mlieku pri teplotách 25 a 35 °C 71
ZÁVER V práci sa nepotvrdil inhibičný účinok metabolitov Lb. rhamnosus VT1 na rast S. aureus B1. Rastové parametre S. aureus počas súbežnej kultivácie v UHT mlieku s Lb. rhamnosus VT1, boli prakticky rovnaké s parametrami zistenými počas samostatných pokusov. Javí sa, že Lb. rhamnosus VT1 pri danej aplikovanej počiatočnej koncentrácii nevytvoril dostatočné množstvo metabolitov vrátane kyseliny mliečnej, ktoré by inhibovali rast S. aureus B1. Následkom pomalého okyseľovania bolo v médiu dostatočne dlho vhodné prostredie, v ktorom S. aureus dosiahol až stacionárnu fázu. Pre dosiahnutie inhibície rastu S. aureus v ďalších pokusoch je potrebné počítať prinajmenej s vyššími počiatočnými denzitami inokulácie laktobacila a výrazným urýchlením fermentačného procesu. LITERATÚRA Gilmour A., Rowe M.T.: Micro-organisms associated with milk. In: Robinson R.K.: Dairy Microbiology, The microbiology of milk. Elsevier Applied Science, London, New York, 1990, vol. 1, s. 37-77. Grieger C., Bednarčíková E., Verdon F.: Vplyv zrenia ovčieho hrudkového syra na rastovú krivku Staphylococcus aureus. Veterinářství, 29, 1979, 9, s. 407-409. Lauková D., Valík Ľ., Görner F.: Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth of yeast Candida maltosa YP1. In.: Book of Abstracts from 4th IDF Symposium on cheese ripening, characterization and technology. Praha, 2004, Česká republika, s. 113, ISBN 80-86257-35-5. Plocková M., Stiles J., Chumchalova J., Halfarová, R.: Control of mould growth by Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on milk agar plates. Czech Journal of Food Sciences, 19, 2001, s. 46-50.
Kontaktná adresa: Ing. Denisa Lauková PhD., Katedra výživy a hodnotenia potravín, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika. e-mail:
[email protected]
72
VPLYV LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 A TEPLOTY NA DYNAMIKU RASTU LISTERIA MONOCYTOGENES 272 Petríková Jana1), Lauková Denisa2), Valík Ľubomír2) 1 Oddelenie hygieny, sanitácie a potravinárskej mikrobiológie, Výskumný ústav potravinársky Modra, Slovensko 2 Katedra výživy a hodnotenia potravín, STU Bratislava, Slovensko EFFECT OF LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 AND TEMPERATURE ON GROWTH DYNAMICS OF LISTERIA MONOCYTOGENES 272 Summary: Listeria monocytogenes is a gram-positive facultative anaerobe foodborne pathogens. It is ubiquitous in nature and common in food. Outbreaks of human listeriosis have resulted from the consumption of raw milk, soft cheese, meat and vegetable products contaminated with this pathogen. It growths in wide range of temperatures, from –1,5°C to 45°C, in wide range of pH (from 4,3 to 9,4) and in salt environment. Some strains of lactic acid bacteria can produce metabolites inhibit the growth of some foodborne pathogens. In this study is presented the effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth dynamics of Listeria monocytogenes 272 isolated from goat cheese (Olomouc, Czech republic). The significant effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 was observed on the growth rate of L. monocytogenes 272. With increasing of the concentration of L. rhamnosus VT1 in milk, the growth rate was decreased at individual temperature. At law temperature, 8°C and 10°C, the growth rate of L. monocytogenes 272 was influenced by antimicrobial metabolites in lactobacilli addition. The counts of lactobacilli during the storing condition were ranged from 107 to 108 CFU.ml-1. The increasing of storing temperature caused the significant decreasing of growth rate of L. monocytogenes 272 at lower concentration of lactobacilli. The counts of lactobacilli were increased by 1 lg counts. 2,5% addition of lactobacilli was decreased the growth rate by 10% at 8°C, by 25% at 10°C, by 30% at 12°C and by 35% at 14°C. Rod Listeria je široko rozšírený v celom prostredí a možno ho nájsť v rôznych druhoch potravín. Listeria monocytogenes bola označená za dôležitý potravinársky patogénny mikroorganizmu v roku 1981, kedy prepuklo ochorenie, listerióza, v Kanade z kontaminovaného kapustového šalátu. Odvtedy záujem o tento patogénny mikroorganizmus narastá z hľadiska jeho detekcie a kontroly. Na rozdiel od najpatogénnejšieho druhu, L. monocytogenes, ostatné druhy ako sú L. ivanovii a L. seeligeri spôsobujú ochorenie u ľudí len veľmi zriedkavo. Zvlášť citliví na listérie sú imunodeficientní pacienti, malé deti a starší ľudia. Symptómy sú rôzne, od miernych prejavov chrípky až po veľmi vážne infekcie krvi a mozgu. U tehotných žien listerióza môže spôsobiť vážne poškodenie plodu s následným potratom alebo predčasný pôrod. U novorodencov, kojencov, starších ľudí, ľudí s poruchou imunitného systému sa môže rozvinúť meningitída. L. monocytogenes sa môže nachádzať v potravinách určených na priamu konzumáciu bez tepelnej úpravy, vákuovo balené potraviny, napr. mäso a ryby, pâté a mäkké syry. Vo Francúzsku sa ochorenie listeriózy spájalo s konzumáciou mäkkého syra vyrábaného z nepasterizovaného mlieka. Určité faktory zvyšujú riziko kontaminácie potravín listériami. Potraviny určené na priamu konzumáciu bez tepelnej úpravy skladované pri chladiarenských teplotách sú v prospech rastu L. monocytogenes. Keďže je schopná prežívať v širokom rozmedzí teplôt (–1,5°C do 45°C) a pH hodnôt (4,5 – 9,5), môže sa stať problémom ťažko čistiteľných miest výrobného zariadenia [1, 2 , 3]. Tým, že sa môže vyskytnúť ako kontaminant surového mlieka a tým aj mliečnych výrobkov pri ich krížovej kontaminácii, kmeň Listeria monocytogenes 272 stal predmetom nášho štúdia vo vzťahu k baktériam mliečneho kysnutia (Lactobacillus rhamnosus VT1) a k teplote skladovania.
73
Stanovenie počtu Listeria monocytogenes 272 a Lactobacillus rhamnosus VT1 Mikroorganizmy: Kmeň Listeria monocytogenes 272 bol izolovaný z kozieho syra (Olomouc, ČR) a identifikovaný na Oddelení mikrobiológie a molekulárnej biológie Výskumného ústavu potravinárskeho Bratislava a uchovávaný v lyofilizovanej forme pri –18°C. Kmeň Lactobacillus rhamnosus VT1 izolovaný z tatárskej omáčky je zaradený do Zbierky mikroorganizmov ÚTMT VŠCHT Praha pod č. DMF 30105 a bol zapožičaný Doc. Ing. M. Plockovou CSc. z ÚTMT VŠCHT Praha. Príprava suspenzií a inokulácia: Na inokuláciu L. monocytogenes sa použila 24 h kultúra na GTK kolmom agare, z ktorej sa pripravilo príslušné riedenie v sterilnej peptónovej vode. UHT mlieko bolo inokulované tak, aby koncentrácia buniek bola menej ako 103 KTJ.ml-1. Kmeň L. rhamnosus VT1 bol kultivovaný v MRS bujóne pri 37°C 18 hodín a do mlieka bol inokulovaný v množstve od 0 do 10% (v/v). Takto inokulované mlieko sa skladovalo pri teplote 8°C, 10°C, 12°C a 14°C ± 0,5°C (Lovibond, Nemecko). Počty L. monocytogenes sa stanovili na Oxford médiu (Merck, Nemecko) vyočkovaním 200 µl na povrch tuhej živnej pôdy [4]. Počty L. rhamnosus VT1 sa stanovili na MRS agare zalievaním [5]. Počas skladovania sa sledovala hodnota pH mlieka (WTW, Nemecko) a hodnota SH, ktorá sa stanovila titračne podľa Soxhlet-Henkel [6]. Matematické modelovanie: Dynamika rastu L. monocytogenes 272 v zámerne inokulovanom UHT mlieku pri teplote 8, 10, 12 a 14 ± 0,5°C sa sledovala ako závislosť počtu buniek od času pre jednotlivé prídavky L. rhamnosus VT1 použitím D-modelu [7]. Získané rastové parametre, rastová rýchlosť (µ), trvanie lag-fázy (λ) a generačný čas (GT), z primárneho modelovania sa stali vstupnými údajmi pri sekundárnom modelovaní. Výsledky a diskusia Dynamika rastu Listeria monocytogenes 272 v závislosti od rôzneho prídavku L. rhamnosus VT1 (od 0% do 10% (v/v)) a teploty skladovania (8, 10, 12 a 14°C) je znázornená na obr. 1, 2, 3 a 4. Súbežne sa sledovala aj dynamika rastu L. rhamnosus VT1. Získané rastové parametre pre L. monocytogenes 272 sú uvedené v tabuľke 1 ako i zmeny hodnoty pH inokulovaného UHT mlieka počas skladovania pri jednotlivých teplotách.
log KTJ.ml
-1
Teplota 8°C 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
0% 2,50% 5% 7% 10% 15%
0
50
100
150
200
250
čas [h]
Obr. 1 Dynamika rastu Listeria monocytogenes 272 v závislosti od prídavku Lactobacillus rhamnosus VT1 (0% - 10%) pri teplote 8°C.
74
9 8
0%
log KTJ.ml-1
7
1%
6
2.50%
5
5%
4
7%
3
10%
2 1 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
čas [h]
log KTJ.ml-1
Obr. 2 Dynamika rastu Listeria monocytogenes 272 v závislosti od prídavku Lactobacillus rhamnosus VT1 (0% - 10%) pri teplote 10°C. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
0% 1% 2.50% 5% 7% 10%
0
20
40
60
80
100
120
čas [h]
log KTJ.ml
-1
Obr. 3 Dynamika rastu Listeria monocytogenes 272 v závislosti od prídavku Lactobacillus rhamnosus VT1 (0% - 10%) pri teplote 12°C.
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
0% 1% 2.50% 5% 7% 10%
0
20
40
60
80
100
čas [h]
Obr. 4 Dynamika rastu Listeria monocytogenes 272 v závislosti od prídavku Lactobacillus rhamnosus VT1 (0% - 10%) pri teplote 14°C.
75
Tabuľka I Rastové parametre Listeria monocytogenes 272 pre jednotlivé teploty skladovania a pre rôzne prídavky Lactobacillus rhamnosus VT1 (0%-10%) ako aj hodnoty pH mlieka ihneď po inokulácii (pH0) a na konci skladovacieho pokusu (pHK). 8°C -1
% 0 1 2,5 5 7 10
µ [h ] 0,0401 0,0407 0,0361 0,0306 0,0295 0,0226
λ [h] 17,2 15,7 25,0 28,6 34,8 30,8
0 1 2,5 5 7 10
µ [h-1] 0,0775 0,0620 0,0547 0,0347 0,0085 0,0015
λ [h] 7,1 4,2 6,8 7,1 0,3 38,7
GT [h] 7,5 7,4 8,3 9,8 10,2 13,3 12°C GT [h] 3,9 4,9 5,5 8,7 27,5 19,9
-1
pH0/pHk 6,63/6,56 6,61/6,50 6,48/6,25 6,20/6,08 6,16/5,92 5,95/5,75
µ [h ] 0,0555 0,0511 0,0415 0,0347 0,0091 0,0036
λ [h] 14,4 9,2 13,9 13,2 37,4 28,6
pH0/pHk 6,54/6,49 6,62/6,14 6,32/5,28 6,11/4,82 6,02/4,74 5,84/4,65
µ [h-1] 0,0813 0,0618 0,0532 0,0492 0,0411 0,0453
λ [h] 8,8 4,4 4,1 9,2 6,3 2,9
10°C GT [h] 5,4 5,9 7,5 8,7 31,5 50,9 14°C GT [h] 3,7 4,9 5,7 6,1 7,3 6,6
pH0/pHk 6,59/6,54 6,63/6,27 6,44/5,90 6,19/5,63 5,89/4,99 5,77/4,74 pH0/pHk 6,65/6,41 6,61/5,87 6,32/5,20 6,02/5,30 5,91/5,15 5,88/4,70
Počty laktobacilov sa počas doby skladovania pri teplote 8°C nemenili, ich počty sa pohybovali v rámci nainokulovaného počtu 107 až 108 KTJ.ml-1 a rastová rýchlosť L. rhamnosus VT1 sa pohybovala od 0,0006 h-1 do 0,0084 h-1. Z tabuľky 1 vyplýva, že zvyšujúci sa prídavok L. rhamnosus VT1 znižoval rastovú rýchlosť L. monocytogenes 272. Významnejší pokles rastovej rýchlosti L. monocytogenes pri 8°C bol až pri 10% prídavku laktobacilov, kedy rastová rýchlosť klesla o 40% a zároveň sa trvanie lag-fázy predĺžilo o 15 h. Počty laktobacilov sa počas doby skladovania pri teplote 10°C mierne zvýšili, čo sa prejavilo výraznejším poklesom hodnoty pH (zvýšením hodnoty SH) ako aj zvýšenou rastovou rýchlosťou. Zatiaľ čo pri teplote 10°C významnejší pokles rastovej rýchlosti o 38% bol pozorovaný pri 5% prídavku laktobacilov, pri teplote skladovania 12°C zníženie rastovej rýchlosti o 30% bolo už pri 2,5% prídavku laktobacilov. Z uvedeného je zrejmé, že zvýšenie teploty priaznivo ovplyvnilo rast laktobacilov už pri ich nižšej inokulácii. Počty laktobacilov počas skladovania pri 12°C sa zvýšili o 1 log poriadok a prišlo k výraznej zmene hodnoty pH a SH, pre 2,5% prídavok laktobacilov sa hodnota pH znížila z 6,32 na 5,28, pre 5% prídavok z 6,11 na 4,82. Hodnota pH čistej kultúry L. monocytogenes v mliečnom prostredí sa pohybovala od 6,54 po 6,49 počas skladovania pri 12°C. Ešte výraznejší účinok L. rhamnosus VT1 na kmeň L. monocytogenes 272 pri teplote 14°C mal 2,5% prídavok laktobacilov, kedy rastová rýchlosť sa znížila o 35%. Pri teplote 14°C už 1% prídavok znížil rastovú rýchlosť o 24%. Avšak pri 10% prídavku nebol pozorovaný významný inhibičný účinok, tak ako bol pozorovaný pri nízkych teplotách skladovania. Z uvedeného nám vyplýva, že pre nás zaujímavé budú najmä nižšie prídavky laktobacilov, čím sa priblížime množstvám a teplotám používaných v reálnych podmienkach.
76
Záver Predložená práca je zameraná na sledovanie vplyvu kultúry Lactobacillus rhamnosus VT1 na rast patogénnej baktérie Listeria monocytogenes 272 v zámerne inokulovanom UHT mlieku využitím princípov prediktívnej mikrobiológie. Pri sledovaných teplotách uchovávania bola pozorovaná parciálna inhibícia rastu L. monocytogenes 272 ako výsledok kombinácie teploty a metabolitov laktobacila. V štúdiu charakteristiky L. monocytogenes 272 v modelovom systéme sa bude ďalej pokračovať, nakoľko získaná charakteristika bude slúžiť na porovnanie s charakteristikou, ktorá sa následne získa v reálnych podmienkach potraviny. Použitá literatúra: 1. 2. 3. 4.
Kmety, E. a kol.: Špeciálna epidemiológia. Osveta, Martin 1985, 152 s. Arpai, J., Bartl. V.: Potravinárska mikrobiológia. Alfa, Bratislava 1977, 280 s. Tvrdoň, M.: Školský atlas mikroorganizmov. Alfa, Bratislava 1979, 178 s. STN EN ISO 11290 - 2: Mikrobiológia potravín a krmív. Horizontálna metóda na dôkaz a stanovenie počtu baktérií Listeria monocytogenes. 5. Østlie, H. M., Helland, M. H., Narvhus, J. A.: Growth and metabolism of selected strains of probiotic bacteria in Milk. International Journal of Food Microbiology, 87, 2003, s. 17-27. 6. Palo, V.: Chémia a technológia mlieka. Návody na laboratórne a technologické cvičenia. Bratislava, SVŠT 1983, 217 s. 7. Baranyi, J., Roberts, T. A., McClure, P.: A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 10, 1993, 43-59 Kontaktná adresa: Ing. Jana Petríková, Výskumný ústav potravinársky, Štefánikova 45, 900 01 Modra, Slovensko
[email protected] Táto práca bola podporovaná štátnym podprogramom výskumu a vývoja „Potraviny - kvalita a bezpečnosť“, č. 2003SP270280E010280E01
77
VLIV pH NA ANTIMIKROBIÁLNÍ AKTIVITU MASTNÝCH KYSELIN A JEJICH DERIVÁTŮ S POLYOLY Bartošová Eva, Prekop Jiří, Janšová Jitka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha THE DEPENDENCE OF PH ON THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF FATTY ACIDS AND THEIR DERIVATIVES WITH POLYOLS
Summary: The aim of the study was to determine the dependence of pH on the antimicrobial properities of fatty acids (decanoic, undecanoic, dodecanoic, tridecanoic and tetradecanoic acid) and their derivatives with polyols (1-acylglycerols, 6-O-acylsucroses, 6-O-acylglucoses). The antimicrobial activity was tested against spore-forming Gram-positive bacteria Bacillus cereus DMF 2001, toxicogenic fungal strain Fusarium culmorum DMF 0103 and technologically important Gram-positive bacteria strain Lactobacillus rhamnosus VT1. The highest bacteria inhibition was caused by tridecanoic acid and their derivatives. The lowest pH the highest inhibition was detected. The highest inhibition of fungy was caused by 6-O-tetradecanoylsucrose. The lowest pH the highest inhibition was detected. Lactobacillus rhamnosus was less sensitive to treatment of tested substances. The lowest pH the lowest inhibition was detected. Úvod Mléko a mléčné výrobky jsou díky svému chemickému složení vhodným prostředím pro růst a množení mikroorganismů. Konzervační metody, které zamezují výskytu a množení mikroorganismů v tomto prostředí, ať již fyzikální nebo chemické mají i své omezení při použití pro určitý typ výrobku. V současné době, kdy je snahou minimalizovat množství chemických konzervantů, ale kdy požadavky konzumentů na trvanlivost potravin neustále rostou, je nutné najít takový konzervační systém, který by neovlivňoval vlastnosti mléčných výrobků a neměl nepříznivý vliv na zdraví konzumentů. Alifatické karboxylové kyseliny se střední délkou uhlovodíkového řetězce se ve formě triacylglycerolů běžně vyskytují v živočišných tucích a rostlinných olejích. Existuje řada publikací o antimikrobiálním působení kyseliny dodekanové (laurové) a jejich derivátů. Mastné kyseliny a jejich estery jsou látky netoxické (monolaurin a kyselina laurová patří mezi látky označené mezinárodní zdravotnickou organizací – WHO - GRAS „generally recognized as a safe“), jsou zcela biologicky rozložitelné, nemají žádný zápach ani negativní chuťové vlastnosti. Při vhodné volbě hydrofilní části molekuly esteru mastné kyseliny lze dosáhnout i dobré rozpustnosti ve vodné fázi potravinářského produktu, která je z mikrobiologického hlediska ohrožena nejvíce. Zároveň se jedná o látky s povrchově aktivními vlastnostmi, které nacházejí své uplatnění jako potravinářské emulgátory. Tato práce se zabývá vlivem pH na antimikrobiální aktivitu mastných kyselin se střední délkou uhlovodíkového řetězce a jejich derivátů s polyoly vůči technologicky nežádoucím mikroorganismům: Gram-pozitivnímu sporotvornému kmenu Bacillus cereus DMF 2001, toxikogenní plísni Fusarium culmorum DMF 0103. Dále byl sledován vliv těchto látek vůči technologicky významnému kmenu Lactobacillus rhamnosus VT1. Metodika Testované látky byly syntetizovány na Ústavu technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha. Jako rozpouštědlo testovaných látek byl použit ethanol, který měl výslednou koncentraci v růstovém mediu 1 %, což nemělo vliv na růst testovaných mikroorganismů. K detekci antimikrobiální aktivity byla využita spektrofotometická metoda, jejimž výstupem byly křivky závislosti optické denzity O. D. (620 nm) na čase (240 hodin). Bacillus cereus DMF 2001: 1% inokulum, nutrient bujon, pH 5,2; 6,2; 7,2. 78
Lactobacillus rhamnosus VT1: 1% inokulum, MRS bujon, pH 4,5; 6,5. Fusarium culmorum DMF 0103: inokulum 103 spor . ml-1, malt extrakt bujon, pH 5,4; 6,4. Příslušné bujony (9,7 ml) byly zaočkovány (0,1 ml) a byl k nim přidán roztok testovaných látek v etanolu (0,2 ml) tak, aby se výsledné koncentrace testovaných látek nacházely v rozmezí 0,05 - 0,8 mmol.l-1. Takto připravený bujon byl rozpipetován do mikrotitračních destiček (á 100 µl). Výsledky a diskuse Pro přehledné vyhodnocení vlivu pH na antimikrobiální aktivitu testovaných látek byly z růstových křivek vypočteny integrály pod jednotlivými křivkami. Bacillus cereus DMF 2001 Jako příklad růstové křivky je na obr.1 uveden vliv působení 6-O-dodekanoylsacharosy při pH 6,2. 0,5 0,8 mmol/l
O.D. [-]
0,4
0,4 mmol/l
0,3
0,2 mmol/l
0,2
0,1 mmol/l 0,05 mmol/l
0,1
kontrola
0,0 0
50
100
150
200
250
300
doba kultivace [hod]
Obr. 1 Růstové křivky B. cereus v přítomnosti 6-O-dodekanoylsacharosy (pH 6,4). Pro přehledné vyhodnocení antimikrobiální aktivity testovaných látek byly z růstových křivek vypočteny integrály pod jednotlivými křivkami viz Tabulka I. Jako příklad je na obr. 2 znázorněn integrál (plocha pod růstovými křivkami) v závislosti na počtu atomů uhlíku v řetězci vázané mastné kyseliny.
O.D./ 240 h
80 0,8 mmol/l
60
0,4 mmol/l
40
0,2 mmol/l
20
0,1 mmol/l
0 10
11
12
13
14
0,05 mmol/l
počet atomů C
Obr. 2 Integrály růstových křivek B. cereus v závislosti na počtu atomů uhlíku vázaných mastných kyselin v 6-O-acylsacharosach (pH 6,4). 79
Tabulka I: Souhrnná tabulka uvádějící plochu pod růstovými křivkami B. cereus (Optická densita / 240 hodin) v závislosti na testovaných látkách, počtu atomů uhlíků, pH a koncentraci. testovaná látka Mastné kyseliny
počet atomů C 10
11
12
13
14
1-acylglyceroly
10
11
12
13
14
6-O-acylsacharosy
10
11
12
13
14
6-O-acylglukosy
10
11 12
13
14
pH 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2 5,2 6,2 7,2
0,8 mmol/l 50,0 55,6 57,8 2,0 52,0 42,9 1,9 -0,4 37,0 0,5 -1,0 0,0 -1,4 -0,6 0,0 28,4 36,5 38,0 0,3 8,2 35,1 1,6 -0,9 28,7 2,1 0,0 -1,0 31,9 19,9 40,9 43,3 45,5 58,6 28,0 26,3 44,5 0,1 0,0 5,4 0,3 0,3 5,5 0,2 24,6 20,1 48,4 34,1 58,7
0,4 mmol/l 48,0 54,9 57,5 5,2 48,8 50,2 1,8 0,0 39,9 -0,6 -1,2 18,3 0,8 0,4 0,0 35,2 35,7 49,1 0,2 6,7 38,2 1,7 -0,4 29,2 0,8 0,0 1,8 35,0 27,0 46,0 44,3 52,1 63,9 47,7 52,7 62,6 0,6 2,1 28,1 0,4 0,0 21,2 0,1 32,6 47,5 57,8 42,2 49,3
0,2 mmol/l 46,3 51,4 55,1 19,3 47,2 53,9 4,7 45,7 39,6 -0,2 -1,3 32,0 0,1 42,1 35,2 43,2 50,2 48,7 0,0 4,6 39,3 0,1 0,7 38,5 0,1 9,2 9,2 41,6 38,0 41,0 47,7 56,2 72,2 51,6 65,4 70,2 30,1 48,7 53,7 0,4 0,2 63,3 0,0 43,4 52,6 57,7 37,9 33,4
0,1 mmol/l 48,4 52,0 56,3 34,3 48,2 52,3 11,2 37,4 58,5 -0,2 -1,6 56,0 16,2 33,6 33,1 44,7 49,9 54,4 0,3 47,2 49,7 1,0 41,6 39,2 1,4 35,0 40,4 39,6 40,6 44,9 58,6 61,4 76,1 53,4 70,0 77,9 46,4 56,1 63,9 12,4 48,0 81,1 0,0 47,2 58,4 54,1 45,7 51,4
0,05 mmol/l 59,0 68,1 64,4 54,5 65,4 56,2 26,3 50,5 59,0 -0,2 2,0 59,3 45,8 43,3 38,5 44,0 53,1 58,7 0,5 49,4 60,0 1,4 51,1 49,8 32,8 34,0 51,7 40,7 41,7 43,6 62,5 69,9 82,2 59,2 73,4 86,1 54,5 68,7 76,0 49,6 65,4 94,4 0,1 59,0 60,4 57,6 53,2 55,6
64,4 11,9 46,3 18,9 2,1 0,0 2,1 3,9 0,0 8,3
54,5 16,5 45,8 49,5 1,5 0,0 7,5 5,5 0,0 5,0
44,2 22,1 53,6 52,2 0,0 1,1 18,9 5,3 40,8 45,5
44,8 60,0 58,3 45,4 1,7 43,6 46,4 18,2 38,6 44,6
43,9 64,0 60,5 51,9 0,2 57,3 37,6 54,5 48,6 52,2
80
O. D./ 240 h
Na obr. 3 je znázorněn vliv pH na antimikrobiální aktivitu 6-O-acylsacharos, ze kterého je zřejmé, že se snižující hodnotou pH dochází ke zvýšení antimikrobiální aktivity (nižší hodnota O. D.) 80 70 60 50 40 30 20 10 0
pH 7,4 pH 6,4 pH 5,4
10
11
12
13
14
počet atomů C
Obr. 3 Vliv pH na antimikrobiální aktivitu 6-O-acylsacharos (koncentrace testovaných látek 0,2 mmol/l). Fusarium culmorum DMF 0103, Lactobacillus rhamnosus VT 1 Pro přehledné vyhodnocení antimikrobiální aktivity testovaných látek byly z růstových křivek vypočteny integrály pod jednotlivými křivkami viz Tabulka II (Fusarium culmorum) a Tabulka III (Lactobacillus rhamnosus). Tabulka II: Souhrnná tabulka uvádějící plochu pod růstovými křivkami F. culmorum (Optická densita / 240 hodin) v závislosti na testovaných látkách, počtu atomů uhlíků, pH a koncentraci. testovaná látka Mastné kyseliny
počet atomů C 10 11 12 13 14
1-acylglyceroly
10 11 12 13 14
6-O-acylsacharosy
10 11 12 13 14
pH 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4
0,8 mmol/l -1,4 25,1 -4,3 -0,9 1,0 -1,6 91,9 35,4 124,0 145,4 -0,9 -0,6 0,5 -0,2 -39,4 18,0 77,8 123,0 102,4 111,2 135,2 151,4 139,3 153,8 108,3 24,9 3,0 -0,7 -0,4 -0,2
81
0,4 mmol/l -0,2 162,4 -1,5 159,6 -3,8 162,1 97,2 127,8 133,3 144,7 0,2 -0,7 -2,0 -3,0 -18,9 41,0 98,2 137,2 108,8 112,8 142,4 139,8 144,5 149,1 130,6 81,2 6,0 1,7 -1,3 -0,4
0,2 mmol/l -0,4 151,2 -0,1 161,4 -2,9 161,0 131,7 133,3 138,1 138,0 0,0 96,9 -1,5 -0,9 -4,8 63,0 119,9 130,1 127,1 116,2 145,1 153,1 147,0 149,4 145,7 135,0 45,0 11,9 54,7 -2,0
0,1 mmol/l 68,9 146,3 -0,4 157,6 -0,7 156,8 142,9 129,2 137,1 136,7 139,0 155,8 -1,2 133,6 100,2 143,0 134,0 134,2 132,5 120,2 152,0 162,0 158,4 151,3 150,5 156,5 103,7 116,4 118,2 -0,6
0,05 mmol/l 135,1 154,7 140,3 153,9 106,6 164,0 146,7 142,5 137,8 143,5 175,9 163,0 131,3 161,6 132,2 151,4 130,8 128,7 139,1 127,8 165,1 168,0 162,5 160,0 156,3 161,0 114,2 145,0 150,0 0,3
Tabulka II: pokračování testovaná látka 6-O-acylglukosy
počet atomů C 10 11 12 13 14
pH 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4 5,4 6,4
0,8 mmol/l 164,0 149,2 66,8 142,8 -0,5 107,7 3,7 0,8 0,2 -14,2
0,4 mmol/l 154,9 156,5 126,9 149,9 17,8 128,3 0,3 30,3 -0,1 19,3
0,2 mmol/l 160,3 162,4 153,4 166,5 101,4 152,4 1,1 56,3 0,1 137,5
0,1 mmol/l 167,3 167,7 166,1 169,4 152,5 159,6 1,0 132,5 0,0 144,1
0,05 mmol/l 173,7 165,8 172,6 171,4 164,1 171,3 33,7 131,8 1,3 161,2
Tabulka III: Souhrnná tabulka uvádějící plochu pod růstovými křivkami Lb. rhamnosus (Optická densita / 240 hodin) v závislosti na testovaných látkách, počtu atomů uhlíků, pH a koncentraci. testovaná látka Mastné kysliny
počet atomů C 10 11 12 13 14
1-acylglyceroly
10 11 12 13 14
pH 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5 4,5 6,5
0,8 mmol/l 93,6 90,4 92,6 93,7 92,1 97,9 92,8 97,2 89,9 88,4 97,5 105,6 91,0 103,3 95,2 100,6 96,5 99,3 94,9 101,5
0,4 mmol/l 91,3 87,0 90,2 94,2 90,9 88,2 90,5 82,4 85,9 89,1 95,1 102,3 95,2 99,3 94,6 95,5 95,8 96,5 94,7 96,2
0,2 mmol/l 85,5 92,8 86,9 66,4 84,5 65,2 87,1 79,8 86,4 84,3 93,5 103,2 93,5 100,5 92,6 89,5 89,4 93,9 89,0 93,9
0,1 mmol/l 79,1 54,8 75,4 22,6 73,8 15,8 80,9 70,1 86,8 92,6 94,5 84,6 87,8 58,5 86,4 47,7 80,4 88,0 85,3 89,3
0,05 mmol/l 16,9 26,3 23,1 2,4 47,9 0,0 68,9 57,5 79,2 76,2 59,3 53,2 40,2 21,3 48,3 12,3 75,2 70,2 84,0 83,6
Závěr Testované látky vykazují antimikrobiální aktivitu. Nejvyšší antimikrobiální učinky vůči Bacillus cereus vykazuje kyselina tridekanová a její deriváty. Nejvyšší antifungální aktivitu vůči Fusarium culmorum vykazují mastné kyseliny a 1-acylglyceroly s počtem atomů uhlíku 10, 11 a 12 dále pak 6-O-acylsacharosy a 6-O-acylglukosy s počtem atomů uhlíku 13 a 14. Lactobacillus rhamnosus je vůči působení testovaných látek nejméně citlivý. Poděkování
Práce byla vykonána s finanční podporou GA 525/03/0374.
Použitá literatura: Kabara J. J.: v knize Antimicrobials in food (Branen A. R., Davidson P. M., Eds.), Marcel Dekker, New York (1993). Breeuwer P. Reu J. C., Drocourt J., Rombouts F. M., Abee T.: Nonanoic acid, a self-inhibitor, prevents Germination of Rhizopus oligosporus sporangiospores by dissipation of the pH gradient, Appl. Environ. Microbol., 63, 178-185 (1997). Kabara J. J., Vrable R., Lie Ken Jie M.: Natural and synthetic fatty acids and monoglycerides, Lipids, 9, 753 (1977). Růžička J., Velclová K., Rahula J, Krejčí J.: Antimicrobial effects of 1-monoacyglycerols prepared by catalytic reaction of glyceidol with fatty acids, Eur. Food Res. Technol., 217, 329-331, (2003). Wang Ch., Xing J., Chin Ch., Peters J. S.: Fatty acids with certain structural characteristics are potent inhibitors of germination and inducers of cell death of powdery mildew spores, Physiological and Molecular Plant Pathology, 61, 151-161, (2002).
Kontaktní adresa: Eva Bartošová, Technická 5, VŠCHT Praha 6, 166 28, e-mail:
[email protected]
82
ENZYMOVÁ AKTIVITA BAKTERIÍ POUŽÍVANÝCH PŘI VÝROBĚ JOGURTŮ S PROBIOTICKÝMI VLASTNOSTMI Trojanová Iva, Rada Vojtěch, Vlková Eva Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Česká zemědělská univerzita v Praze ENZYMATIC ACTIVITY OF BACTERIA USED IN THE PRODUCTION OF JOGURTS WITH PROBIOTIC PROPERTIES
Summary: Enzymatic activity of bacteria - Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus termophilus and Bifidobacterium animalis (isolated from Danone and ABT fermented milk products) and jogurts with probiotic cultures was tested. Enzymatic activity of pure cultures and jogurts was determined using API ZYM kit (bioMérieux, France). Three enzymatic activities were characteristic for probiotic bacteria (bifidobacteria) - α-galactosidase, α-glucosidase and β-galactosidase activities. Jogurts and jogurt cultures Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus termophilus had high β-galactosidase activity. High peptidase acitivity was detected in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Peptidolytic activity wasn´t detected in bifidobacteria, which is probably reason for their slow growth in cows´ milk. Pure cultures of B. animalis had high β-galactosidase, α-galactosidase and α-glucosidase activity. In tested jogurts there wasn´t detected the activity of these enzymes which signifies that bifidobacteria occured in commercial products aren´t fully metabolic active and probably have no probiotic effects (e.g. lowering of lactose intolerance). Úvod Kysané mléčné výrobky jsou v posledních letech hojně propagovány, protože mnoho lidí upřednostňuje zdravý životní styl. Mléčné výrobky mají blahodárný vliv na lidský organismus. Pro zlepšení příznivých účinků se začaly se do mléčných kysaných výrobků přidávat mikroorganismy, které se přirozeně vyskytují v trávicí soustavě lidí už od útlého věku, ale vlivem nesprávných stravovacích návyků se jejich množství podstatně snížilo (Scheinbach, 1998). Jsou to právě bifidobakterie, které jsou schopny adherovat na stěnu střeva a napomáhají hostiteli bojovat proti mnoha civilizačním chorobám, jako je např. rakovina tlustého střeva. Dále tyto bakterie snižují hladinu cholesterolu v krvi, stimulují imunitu a podílí se také na produkci vitaminů (Mitsuoka, 1992). Bakterie rodu Bifidobacterium jsou grampozitivní, sacharolytické, pleomorfní, striktně anaerobní nesporulující tyčinky, které se přirozeně vyskytují v trávicím traktu zvířat a lidí. Charakteristický kyjovitý tvar bifidobakterií nebo tvar připomínající písmeno „Y“ je využíván jako pomocný znak pro jejich odlišení od ostatních bakteriálních kmenů obsažených v trávicím traktu (Scardovi, 1986). Mohou být uspořádány jednotlivě i v řetízcích, ale i hvězdicovitě a do tvaru písmene „V“ nebo vedle sebe palisádovitě seskupené. Bifidobakterie jsou významnou složkou probiotických kultur používaných v potravinářském průmyslu (Langhendries et al., 1995). Druhy B. animalis, B. longum, B. bifidum a B. infantis jsou používány do probiotických startovacích kultur z důvodu jejich příznivého vlivu na rovnováhu mikroflóry trávicího traktu a celkového zdravotního stavu hostitele (Gibson a Roberfroid, 1995). Bifidobakterie produkují velké množství kyseliny mléčné a octové, čímž snižují pH ve střevě a potlačují tím rozvoj nepříznivých a patogenních bakterií. Snižují riziko vzniku nádorových onemocnění, snižují hladinu sérového cholesterolu v krvi, stimulují imunitní systém, snižují intoleranci na laktózu a produkují některé vitaminy (Mitsuoka, 1992). Hostiteli jsou bifidobakterie dodávány v podobě kysaných mléčných výrobků, jako jsou nápoje, biojogurty, měkké sýry a další potravinářské výrobky (Gibson et al., 1994). Aby splnily předpokládaný nutriční úkol, musí být ve výrobcích ve velkém počtu a maximální biochemické aktivitě, takže v tlustém střevě pak pokračují intenzivním růstem. Aplikace bifidobakterií se v poslední době provádí také sušenými kulturami bifidobakterií. Tyto preparáty v podobě tablet, 83
kapslí, ale i prášků v sáčcích můžeme označit za typická probiotika. Probiotika jsou tedy živé mikrobiální potravní doplňky, které úspěšně ovlivňují hostitele a zlepšují střevní mikrobiální rovnováhu (Fuller, 1992). Mají splňovat následující kriteria (Maxa a Rada, 2002): 1) Jsou životaschopná, připravená šetrným technologickým způsobem. 2) Vysoká deklarovaná aktivita musí být zajištěna po celou expirační dobu. 3) Obsažená ušlechtilá mikroflóra musí přežít drastické podmínky trávicího traktu a zafixovat se na sliznici tlustého střeva. 4) Podstatně stabilizují s zlepšují zdraví hostitele. Probiotika se mohou používat ke zlepšení mnoha zdravotních obtíží. Jsou vysoce účinná při průjmu i zácpě, kolitidě, nadýmání, gastroenteritidě, zvýšené žaludeční kyselosti, vysoké hladině cholesterolu, jaterní encefalopatii, kancerogenezi a snížené imunorezistenci (Silva et al., 1987). Cíl Cílem práce bylo stanovení počtu bakterií (bifidobakterií, laktobacilů a streptokoků) v mléčných kysaných výrobcích a sledování enzymové aktivity zejména peptidáz a glykosidáz (α-galaktosidasa, α-glukosidasa a β-galaktosidasa). Dalším cílem bylo porovnání enzymových aktivit čistých kultur a výrobků s těmito kulturami. Materiál a metody Enzymová aktivita bakterií - Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus termophilus a Bifidobacterium animalis bylo sledována pomocí API ZYM soupravy (bioMérieux, Francie). Byly testovány tři komerčně dostupné kysané výrobky s probiotickou kulturou: jogurt Activia (Danone), bílé jogurty (Olma a Hollandia) a kefírové mléko s ABT kulturou (Madeta). API ZYM je semikvantitativní metoda vytvořená pro stanovení enzymové aktivity. Technika je použitelná na všechny vzorky (mikroorganismy, buněčné suspenze, tkáně, biologické tekutiny atd.). To umožňuje systematickou a rychlou studii 19 enzymových reakcí velmi malých množství vzorků. Byla sledována zejména aktivita α-galaktosidasy, α-glukosidasy a β-galaktosidasy, která je charakteristická pro probiotické bakterie. Zároveň byly stanoveny počty bifidobakterií pomocí modifikovaného TPY agaru (Sharlau, Barcelona Španělsko) s přídavkem 100 mg/l mupirocinu (Rada a Koc, 2000). Po 48 hodinách kultivace byly spočítány typické kolonie bifidobakterií. Stejným způsobem byly stanoveny počty laktobacilů pomocí Rogosa agaru (Oxoid, Velká Británie) a streptokoků pomocí M17 agaru (Oxoid, Velká Británie). Z narostlých kolonií bylo izolováno několik kmenů, u kterých byla rovněž provedena API ZYM zkouška. Výsledky a diskuse Počty bakterií stanovené v komerčně dostupných mléčných kysaných výrobcích jsou uvedeny v tabulce č. 1. Chevalier et al. (1990) použil detekci α-galaktosidasy a α-glukosidasy rozlišení rodů Bifidobacteria a Lactobacillus. Ačkoliv některé střevní laktobacily vykazovaly aktivitu αgalaktosidasy a α-glukosidasy, zdají se být současné aktivity obou enzymů charakteristické pro bifidobakterie (Rada, 1997). Tabulka I Počty streptokoků, laktobacilů a bifidobakterií u čtyřech testovaných kysaných mléčných výrobků (KTJ/ml) OLMA HOLLANDIA ABT mléko DANONE streptokoky 1,4.109 6,8.108 4,9.107 2,9.109 laktobacily 6,6.106 3,5.105 5,1.105 2,2.105 bifidobakterie 1,8.105 7,4.105 9,6.105 4,2.105 Hughes a Hoover (1995) testovali u kmenů Bifidobacterium breve NCFB 2258, 84
Bifidobacterium bifidum NCFB 2715, Bifidobacterium longum ATCC 15707, Bifidobacterium angulatum ATCC 27535 a Lactobacillus acidophilus N2 životaschopnost a aktivitu β-galaktosidasy a α-galaktosidasy při skladování ve 4°C v netučném sušeném mléce. Aktivity obou enzymů byly velice variabilní. Bifidobacterium angulatum 27535 vykazovalo mnohem větší enzymovou aktivitu než ostatní kmeny. Všechny kmeny prokázaly enzymovou stabilitu za daných podmínek. Bifidobakterie byly výrazně méně tolerantní na nízkou teplotu než L. acidophilus N2. U bifidobakterií byla prokázána aktivita α-galaktosidasy v mléce, kdežto u Lactobacillus acidophilus N2 nikoliv. V jogurtech byla zaznamenána vysoká aktivita β-galaktosidasy stejně jako u čistých jogurtových kultur Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus termophilus. Lactobacilus delbrueckii subsp. bulgaricus navíc ještě vykazoval zvýšenou aktivitu peptidáz (hlavně valin-arylamidázy a cystin-arylamidázy). Peptidolytická aktivita nebyla zaznamenána u bifidobakterií, což je zřejmě jedním z důvodů, proč bifidobakterie špatně rostou v kravském mléce (tab. 2). Čisté kultury B. animalis vykazovaly kromě aktivity β-galaktosidasy vysokou aktivitu α-galaktosidasy a α-glukosidasy. V testovaných jogurtech nebyla zaznamenána aktivita těchto enzymů (obr. 1), což naznačuje, že bifidobakterie obsažené v komerčních produktech nejsou plně metabolicky aktivní a pravděpodobně nemohou vykazovat některé probiotické účinky jako je např. snižování intolerance na laktózu.
Obr. 1 Porovnání enzymové aktivity čisté kultury Bifidobacterium animalis (izolovaný z kysaného mléčného výrobku Danone)-DAN a kysaného mléčného výrobku Activia (Danone)-ACT. Šipky značí aktivitu α-galaktosidasy a α-glukosidasy, které u kysaného mléčného výrobku nejsou aktivní.
85
valinarylamidáza
cystinarylamidáza
ACTIVIA 0 4 OLMA 0 1 HOLLANDIA 0 4 KEFÍR ABT 0 1 B. animalis DANONE* 5 4 B. animalis HOLLANDIA** 3 5 L. delbrueckii subsp. bulgaricus 0 5 S. termophilus 71*** 0 0 0 4 S. termophilus * izolováno z kysaných mléčných výrobků DANONE ** izolováno z kysaného mléčného výrobku HOLLANDIA *** obdrženo ze sbírky MILCOM a.s.
α-glukosidáza
βgalaktosidáza
vzorek
αgalaktosidáza
Tabulka II Přehled enzymových aktivit glukosidáz a peptidáz u kysaných mléčných výrobků a čistých kultur
1 0 0 0 5 5 0 0 0
0 0 0 0 0 1 4 1 1
0 0 0 0 1 1 4 3 8
Závěr Počty bifidobakterií v mléčných kysaných výrobcích nesplnily doporučení Mezinárodní mlékařské federace (IDF) pro počty bifidobakterií v mléčných výrobcích 106 KTJ/ml. Jejich počty se pohybovaly v rozmezí 1,8 – 9,6.105. Pomocí API ZYM testů byla potvrzena aktivita β-galaktosidasy, která je charakteristická pro jogurtové kultury. V testovaných výrobcích nebyla prokázána aktivita α-galaktosidasy a αglukosidasy, která je charakteristická pro bifidobakterie, což nasvědčuje tomu, že bifidobakterie jsou do mléčných výrobků přidávány v metabolicky neaktivní formě (lyofilizované prášky) a nemohou být tedy enzymově aktivní. (Práce byla sponzorována grantem GAČR523/03/H076) Použitá literatura: Fuller R.: Ed. Probiotics, The Scientific Basis, Chapman and Hall, London U.K., 1992 Gibson G.R., Roberfroid M.B.: Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 125, 1995, 1410-1412 Gibson G.R., Wang X.: Selective enrichment of bifidobacteria from human gut contains by oligofructose using continuous culture. FEMS Microbiology Letters 118, 1994 b, s. 121-128 Hughes D.B., Hoover D.G.: Viability and enzymatic activity of bifidobacteria in milk. J. Dairy Sci. 78(2): 268-76, 1995 Chevalier P., Roy D., Ward P.: Detection of Bifidobacterium species by enzymatic methods. J. Appl. Bacteriol. 68, 1990, 619-624 Langhendries J.P., Detry J., van Hees J., Lamboray J.M.: Effect of fermented infant formula containing viable bifidobacteria on the fecal flora composition and pH of healthy full-term infants. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 21, 1995, 177-181 Maxa V., Rada V.: Význam probiotik a prebiotik pro výživu a zdraví, Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 2000, s. 9-12 Mitsuoka T.: The Human Gastrointestinal Tract. In: Wood, B.J.B.(Eds.)The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. Elsevier Applied Science, London, 1992, 69-114 86
Rada V.: Detection of Bifidobacterium species by enzymatic methods and antimicrobial susceptibility testing. Biotechnol. Tech. 12, 1997, 909-912 Scardovi V.: Genus Bifidobacterium. In: Bergey´s „Manual of Systematic Bacteriology“. Williams and Wilkins MD, Baltimore, 1986, 1418-1434 Scheinbach S.: Probiotics: functionality and commercial status. Biotechnol Adv. 16(3): 581-608, 1998 Silva M. et al.: Antimicrob. Agents Chemother., 31, 1987, s. 1231 Kontaktní adresa: Iva Trojanová Česká zemědělská univerzita v Praze Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol
87
VLIV AW A TEPLOTNÍHO ŠOKU NA STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS Komárková Eliška, Erban Vladimír Výzkumný ústav potravinářský Praha EFFECT OF THE AW AND THE HEAT SHOCK ON THE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS Summary: Streptococcus thermophilus is commonly used as a starter culture in hard cheeses technologies. Several strains were tested for their ability to grow with decreased water activity (Aw) caused by NaCl. We also tested the impact of a heat shock on the strain resistance to the Aw. We found, that 6 strains were sensitive to Aw and 7 strains were resistant. Heat shock supported resistance to Aw was found for 2 strains (1 resistant and 1 sensitive) but for the rest of the strains the heat shock had slight effect. This description can be used for the better specification of the starter culture. Their application in the cheese production has to be evaluated also next characteristics. Sbírka mlékařských kultur obsahuje celou řadu čistých kmenů izolovaných z různých zdrojů. Při rozhodování o tom, který kmen použít, je třeba vzít v úvahu celkovou charakteristiku kmene a jeho vlastnosti z mnoha různých úhlů pohledu. Reakce jednotlivých kmenů na změnu vodní aktivity (AW) je jednou z užitečných informací stejně tak jako vliv teplotního šoku. Streptococcus thermophilus se vyskytuje jako součást startérových kultur v tvrdých sýrech. Tato kultura má význam jakožto technologicky aktivní populace zajišťující organoleptické změny v průběhu zrání sýra. Cílem experimentů bylo charakterizovat kmeny vzhledem ke změně vodní aktivity spojené se solením sýrů. Dalším sledovaným parametrem byl vliv teplotního šoku, kterým prochází populace v průběhu dohřívání a sušení sýřeniny a vliv kombinace tohoto šoku a vodní aktivity na růstové charakteristiky těchto kmenů. Experimenty byly prováděny s populací Streptococcus thermophilus získané ze sbírky Laktoflora ve formě lyofilizátů. Jednotlivé kmeny nesly označení: 7, 33, 126, 128, 437, 438, 439, 954, 955, 956, 957, 1032, 1033, 1042. Lyofilizáty byly oživeny kultivací v 10% mléce při 42 °C a udržovány v mléce přeočkováváním každé 3 týdny. Inokulum bylo připravováno kultivací v příslušném mediu přes noc při 42 °C. Experimenty byly prováděny v zařízení Bioscreen C. Změna vodní aktivity byla simulována přídavkem 1, 2, 4, a 6% NaCl do kultivačního media (viz tab.1). Tabulka I Změna vodní aktivity media M17 při různé koncentraci NaCl. % NaCl v M17 mediu 0 1 2 4 6
Aw 0,989 0,982 0,977 0,963 0,954
Testované kmeny projevily různou schopnost růstu v přítomnosti NaCl (Obr. 1). Kmeny označené 1033, 126, 955, 954 a 128 byly shledány jako citlivé vůči změně Aw způsobené NaCl, protože nebyly schopny růstu s více než 1% NaCl. Pro kmeny 955, 954 a 128 redukoval přídavek 1% NaCl růstovou rychlost na polovinu a méně. Kmen 1042 byl schopen růstu i při 2% NaCl, ale pouze s rychlostí růstu odpovídající 0,1 násobku růstové rychlosti v mediu bez přídavku NaCl. Kmeny 1042 a 126 vykazovali pokles růstové rychlosti při 1% NaCl v mediu o cca. 40%. Kmen 1033 dosáhl v mediu s 1% NaCl téměř stejné růstové rychlosti jako v čistém M17 mediu, ale nebyl 88
schopen růstu při koncentraci 2% NaCl a vyšší. Naproti tomu kmeny 1032, 33, 437, 439, 438, 957 a 7 vykazovaly schopnost růstu i při koncentraci NaCl 6%. Se vzrůstající koncentrací NaCl se růstová rychlost snižovala ve všech případech kromě kmenů 1032 a 437 kde dosáhla lokálního maxima při 1% NaCl. Zvyšování koncentrace laktosy v mediu nevedlo ke změně Aw a zároveň se neprojevilo výraznou změnou růstové rychlosti testovaných kmenů (viz Obr. 2) M1 7 (0 % N a C l) 2% Na C l 4% Na C l 6% Na C l
1 ,2 0 1 ,0 0
1% Na C l 3% Na C l 5% Na C l
µ (1 /h )
0 ,8 0 0 ,6 0 0 ,4 0 0 ,2 0 0 ,0 0 1032
33
437
439
438
957
7
1033 1042
126
955
954
128
km e n
Obr. 1 Vliv koncentrace NaCl na růstovou rychlost
0 ,5 2% 4% 6%
1 ,4 0 1 ,2 0
% la k to s y L a k to s a L a k to s a L a k to s a
1 % L a k to s a 3 % L a k to s a 5 % L a k to s a
µ (1 /h )
1 ,0 0 0 ,8 0 0 ,6 0 0 ,4 0 0 ,2 0 0 ,0 0 1032
33
437
439
438
957
7
km e n
Obr. 2 Vliv koncentrace laktosy na růstovou rychlost 89
1033
1042
126
955
954
128
T (°C)
Teplotní šok byl simulován zahříváním alikvotního podílu inokulační suspenze podle následujícího schématu: start při 30°C; zahřívání na 53 °C v průběhu 35 minut; výdrž při 53 °C podobu 30 minut; chladnutí při laboratorní teplotě 10 minut (viz Obr. 3). 60 50 40 30 20 10 0 0
20
40
60
80
t (min)
Obr. 3 Průběh teplotního šoku. Na základě kultivace v mediu M17 s různou koncentrací NaCl bylo vybráno následujících 9 kmenů pro další testy: 1032, 33, 437, 439, 438, 957, 7, 1033 a 1042. Tyto vybrané kmeny jsme podrobili zkoumání vlivu teplotního šoku simulujícího dohřívání a sušení sýrů na jejich odolnost vůči změně Aw. Experimenty byly prováděny při třech různých teplotách: 42 °C – optimální růstová teplota, 10 °C a 20 °C jako simulace podmínek při zrání sýrů. Při všech teplotách byla sledována jak populace podrobená teplotnímu šoku, tak referenční – nešokovaná – populace. Téměř všechny kmeny zareagovaly na snížení teploty kultivace předpokládaným snížením růstové rychlosti. Kromě změny růstové rychlosti byla též sledována metabolická aktivita kmene prezentovaná změnou pH media před a po kultivaci (odpovídá produkci kyselin).
1
2
0,8
1,5
µ 0,6
(1/h) 0,4
-∆ 1 pH 0,5
0,2
0 -0,5
0 0
2
cNaCl (%)
4
0
6
2
cNaCl (%)
4
6
Obr. 4 Vliv teplotního šoku, teploty kultivace a AW kmen 1032.
Teplota kultivace 42°C (), 20°C ({) a 10°C (U); prázdné symboly – populace vystavena teplotnímu šoku, plné symboly – populace referenční (nešokovaná)
Kmen 1032 zareagoval na pokles Aw při 2% NaCl poklesem růstové rychlosti, ale rychlost růstu výrazněji nepoklesla při 4 a 6% NaCl. Křivka pro šokovanou a nešokovanou populace se téměř neliší. Je zajímavé že metabolická aktivita vyjádřená změnou pH takto výrazný skok nevykazuje a nepříliš výrazně klesá rovnoměrně v průběhu testovaných koncentrací. 90
1
2
0,8
1,5
µ 0,6
(1/h) 0,4
-∆ 1 pH 0,5
0,2
0
0
-0,5 0
2
cNaCl (%)
4
6
0
2
cNaCl (%)
4
6
Obr. 5 Vliv teplotního šoku, teploty kultivace a AW kmen 33.
Teplota kultivace 42°C (), 20°C ({) a 10°C (U); prázdné symboly – populace vystavena teplotnímu šoku, plné symboly – populace referenční (nešokovaná)
1
2
0,8
1,5
0,6
(1/h) 0,4
-∆ 1 pH 0,5
0,2
0
0
-0,5
µ
0
2
4
0
6
2
4
6
cNaCl (%)
cNaCl (%)
Obr. 6 Vliv teplotního šoku, teploty kultivace a AW kmen 7.
Teplota kultivace 42°C (), 20°C ({) a 10°C (U); prázdné symboly – populace vystavena teplotnímu šoku, plné symboly – populace referenční (nešokovaná)
1
2
0,8
1,5
µ 0,6
(1/h) 0,4
-∆ 1 pH 0,5
0,2
0
0
-0,5 0
2
4
6
0
2
4
6
cNaCl (%)
cNaCl (%)
Obr. 7 Vliv teplotního šoku, teploty kultivace a AW kmen 1033.
Teplota kultivace 42°C (), 20°C ({) a 10°C (U); prázdné symboly – populace vystavena teplotnímu šoku, plné symboly – populace referenční (nešokovaná)
91
Kmen 33 (Obr. 5) vykazuje značnou rezistenci vůči Aw, pokles růstové rychlosti nastal až při koncentraci 4 a 6% NaCl. Teplotní šok se pozitivně projevil při nižších koncentracích z pohledu růstové rychlosti avšak metabolická aktivita byla v důsledku teplotního šoku vyšší v celém testovaném rozsahu. U kmene číslo 7 (Obr. 6) se projevila zvýšená rezistence vůči AW u šokované populace. Růstová rychlost šokované populace byla vyšší než u referenční. Při sledování metabolické aktivity se tento jev nezopakoval. Pro kmen 1033 (Obr. 7) byl pozorován nárůst rezistence vůči Aw v důsledku teplotního šoku, obdobně jako pro kmen číslo 7. Tento kmen byl původně vyhodnocen jako citlivý vůči Aw. Metabolická aktivita jevila podobný trend jako sledované růstové rychlosti. Jednotlivé kmeny se liší v citlivosti na změnu Aw způsobenou přídavkem NaCl do media. Jako nejodolnější se jeví kmeny 1032, 33, 7, 437, 439, 438 a 957. Jako citlivé se jeví kmeny 126, 955, 954 a 128. Teplotní šok způsobil u kmenů 7 a 1033 zvýšení jejich rezistence vůči NaCl. U ostatních kmenů nenastala vlivem teplotního šoku výrazná změna. Tyto charakteristiky mohou být využity pro detailnější hodnocení čistých kultur, avšak pro výběr nejvhodnější sýrařské kultury je nutno uvažovat i další vlastnosti kmenů v širších souvislostech. Práce vznikla za finanční podpory NAZV Mze ČR projekt GF 3284. Kontaktní adresa: Výzkumný ústav potravinářský Praha, Radiová 7, 102 31 Praha 10 – Hostivař. E-mail:
[email protected];
[email protected]
92
VLIV GALAKTOOLIGOSACHARIDŮ NA RŮST BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ. Čurda Ladislav, Holubová Jitka, Rudolfová Jana, Němečková Irena Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze THE INFLUENCE OF GALACTOOLIGOSACCHARIDES ON THE GROWTH OF LACTIC ACID BACTERIA Summary: The stability of galactooligosaccharides (GOS) during cultivation of different dairy starter cultures in buttermilk was studied. Saccharides were estimated by HPLC with ELSD, the growth of bacteria was monitored by impedance method. The lag phase in presence of GOS was in most cases longer than control. The concentration of GOS after cultivation represents from 90 to 37 % of initial GOS content. High variability in GOS utilization was found especially for yoghurt starters. The stability of bifidobacteria during storage was not influenced by presence of GOS. As the GOS partly remain in product after cultivation and storage, we can presume that they can serve as prebiotics. Úvod Galaktooligodacharidy (GOS) lze připravit transgalaktosylací účinkem β-galaktosidasy. Mnoho oligosacharidů není člověkem tráveno, a tak nalézá uplatnění v nízkokalorických potravinách a výrobcích pro diabetiky. Nestravitelnost oligosacharidům umožňuje plnit funkci vlákniny a prebiotika (Crittenden a Playne 1996). Díky β-konfiguraci jsou GOS odolné hydrolýze lidskými slinami a žaludečními šťávami, protože enzymy v nich obsažené selektivně napadají α-vazby (Sako a kol. 1999). Pokusy in vitro ukazují, že jsou GOS pomalu hydrolyzovány β-galaktosidasou lidské střevní mukosy. Některé GOS jsou hydrolyzovány pomaleji než deseti procenty rychlosti hydrolýzy laktosy, allolaktosa dokonce pomaleji než pěti procenty (Mahoney 1998). Energetická hodnota GOS je proto pouze 1,0–2,0 kcal/g, což je 30–50 % energetické hodnoty stravitelných oligosacharidů, např. sacharosy (Sako a kol. 1999). Předpokladem utilizace GOS bakteriemi mléčného kvašení je přítomnost β-galaktosidasy u daného kmene. Přítomnost či nepřítomnost β-galaktosidasy indikuje, kterou metabolickou dráhu daný kmen bakterií mléčného kvašení využívá. Laktokoky mají fosfoenolpyruvát-fosfotransferasový systém (PEP-PTS) k transportu laktosy do buňky v podobě laktosy-6-fosfátu, která je štěpena fosfo-β-galaktosidasou, a proto nemohou ani přijímat ani štěpit GOS. Transport galaktooligosacharidů do buňky může být zajištěn laktosa-permeasou (poté dochází k působení intracelulární β-galaktosidasy) nebo hydrolýzou za pomoci extracelulární β-galaktosidasy s následným uplatněním glukosa-permeasy nebo galaktosa-permeasy. Rod Bifidobacterium má galaktooligosacharidy indukovatelnou permeasu, která zajišťuje transport trisacharidů a tetrasacharidů, což vysvětluje schopnost bifidobakterií přerůst ostatní střevní mikroorganismy, jestliže jsou v potravě přijímány člověkem nestravitelné oligosacharidy. Mikroorganismy schopné utilizovat GOS se také liší preferovaným stupněm polymerace substrátu. (Gopal a kol. 2001). Podmínkou aplikace GOS do fermentovaných výrobků, ve kterých by měly plnit funkci prebiotika, je zachování dostatečné koncentrace GOS po fermentaci, příp. skladování. Pokud by docházelo k utilizaci GOS během fermentace, bylo by nutné GOS přidávat až před balením. Cílem práce proto bylo: • Ověřit schopnost různých kultur bakterií mléčného kvašení, používaných při výrobě fermentovaných mléčných výrobků, metabolizovat GOS. • Ověřit vliv obsahu GOS ve fermentovaném výrobku na růst a stabilitu probiotické kultury. • Porovnat výhody a nevýhody použití GOS místo běžně používaných fruktooligosacharidů. • Porovnat různé způsoby přídavku GOS do mléka před fermentací. Materiál a metody Pro sledování stability galaktooligosacharidů byly použity následující kultury: smetanová FD, acidofilní CCDM 92, Bifidobacterium bifidum 94, Streptococcus thermophilus 144, 93
jogurtová J 2 (Milcom a.s. Praha), dále jogurtové kultury MY 092 a MY 800 (Texel – Rhodia, Francie). ABT kultura byla připravena zaočkováním 1 % acidofilní kultury CCDM 92, 2 % kultury Bifidobacterium bifidum 94 a 0,4 % kultury Streptococcus thermophilus 144). Vlastní experimenty byly provedeny v obnoveném sušeném podmáslí (Promil, a. s., Nový Bydžov) s výslednou sušinou 17,5 %hm (varianta „bez GOS“). V experimentech označených jako varianta „s GOS“ byly galaktooligosacharidy přítomné už v sušeném podmáslí, které bylo poloprovozně vyrobeno v Promilu a.s., Nový Bydžov (Čurda a kol. 2004). Sušené podmáslí obsahovalo v 1 kg 70 g galaktooligosacharidů, 223 g laktosy, 152 g glukosy a 88 g galaktosy. Pro variantu „MAX“ galaktooligosacharidy vznikly v tepelně ošetřeném podmáslí bez galaktooligosacharidů působením β-galaktosidasy Maxilact LX 5000 (DSM Food Specialities, Holandsko). Enzymatická reakce (43 °C, 0,05 % enzymu) byla zastavena po 1 h a 45 min dvouminutovou výdrží při teplotě nad 90 °C. Koncentrace GOS byla v tomto případě kolem 6,0 g/l. Podmáslí s přídavkem Raftilinu GR inulin (Arnaud s. r. o., Praha) v množství 12 g/l, (označeno jako varianta „s FOS“) bylo použito pouze pro některé kultury. Růst kultur byl sledován prostřednictvím změn titrační a aktivní kyselosti a impedanční metodou na přístroji BacTrac 4100 (Sy-Lab GmbH, Rakousko). Bifidobakterie byly stanoveny na MRS agaru (Oxoid) o pH 6,8, do kterého bylo po rozehřátí přidáno 0,5 g/l L-cysteinhydrochloridu (Merck, Německo) a 0,002 g/l dicloxacillinu (Sigma Chemical Co, USA). Kultivace probíhala v anaerostatu 3 dny při 37 °C s adsorbentem kyslíku AnaeroGen AN0035A (Oxoid). Sacharidy byly stanoveny s pomocí HPLC (Ecom Praha) s ELSD detektorem (Eurosep Instruments, Francie). Pro analýzu sacharidů byly jako standardy použity: fruktosa (Lachema, a. s., Neratovice), galaktosa (Acros Organics, USA), glukosa monohydrát (Penta, Chrudim), laktosa monohydrát (Aldrich Chemical Company, Inc.) a maltotriosa (Fluka Chemie GmbH). Sacharidy byly separovány na koloně OSTION LG KS 0800 Ca2+ (Watrex Praha) při teplotě 80 °C a průtoku 0,5 ml/min. Mobilní fází byla demineralizovaná voda o teplotě 65 °C. Výsledky a diskuse Měřítkem využívání GOS byl rozdíl na počátku a konci kultivace, který byl vztažen k počáteční koncentraci GOS a vyjádřen v procentech. Příslušné hodnoty jsou uvedeny v tab. I. Nejméně jsou GOS využívány smetanovou kulturou a jogurtovými kulturami MY 800 a MY 092. Naopak jogurtová kultura J2 a ABT kultura patří ke kulturám s větší tendencí využívat GOS. Tabulka I Relativní změny koncentrace GOS na začátku a na konci kultivace pro sledované kultury Relativní pokles GOS během fermentace (%) Kultura varianta MAX varianta s GOS Smetanová kultura FD 25,3 11,0 Lactobacillus acidophilus CCDM 92 32,1 32,4 Streptococcus thermophilus 144 24,7 21,8 Jogurtová kultura J2 28,0 62,9 Jogurtová kultura MY 800 11,7 19,9 Jogurtová kultura MY 092 17,7 13,1 Bifidobacterium bifidum 94 33,3 16,9 ABT kultura 33,8 45,4 Streptococcus thermophilus tvoří β-galaktosidasu (Mahoney 1998, Sako a kol. 1999). Gopal a kol. (2001) zjistil, že jen bakteriální kmeny produkující β-galaktosidasu jsou schopné utilizovat galaktooligosacharidy. Tím je také vysvětlen úbytek galaktooligosacharidů během kultivace jogurtových kultur. Jednotlivé kmeny laktobacilů (i kmeny druhu Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) se liší schopností utilizovat galaktooligosacharidy (Gopal a kol. 2001). 94
Mezi sledovanými jogurtovými kulturami (J2, MY 092 a MY 800) se vliv rozdílnosti laktobacilové složky projevuje. Laktokoky nemohou využívat galaktooligosacharidy (Gopal a kol. 2001). Jestliže tedy GOS ubývají v přítomnosti smetanové kultury, je to pravděpodobně způsobeno leukonostoky. Všechny kultury s výjimkou kultury Bifidobacterium bifidum 94 vykazovaly v médiu s GOS podstatně delší lag fázi, varianta MAX se na lag fázi neprojevila nebo byla mírně prodloužena. Jednou z příčin může být vyšší obsah látek, které vznikají reakcí bílkovin a monosacharidů v médiích po enzymové hydrolýze laktosy. Průběh změn impedance je na obr. 1 pro Bifidobacterium bifidum 94 a na obr. 2 pro ABT kulturu. Křivky pro médium s FOS byly pro přehlednost z grafů vypuštěny, ale prakticky se neliší od kontrolních křivek podmáslí. 30 25
%M
20 15 10 5 0 0
5
čas10 (hod)
podmáslí
15
Maxillact
20
GOS
Obr. 1 Růst kultury Bifidobacterium bifidum 94 vyjádřený jako změna impedance media (% M) v různých typech podmáslí se sušinou 17,5 % a bez přídavku kvasničného extraktu (inokulum 4%, teplota 37 °C, anaerobní kultivace). 30 25
%M
20 15 10 5 0 0
2
podmáslí
čas (hod) 4
Maxillact
6
8
GOS
Obr. 2 Růst ABT kultury (1 % acidofilní kultury, 2 % bifidové kultury a 0,4 % kultury Str. thermophilus) vyjádřený jako změna impedance media (% M) v podmáslí různého složení (teplota 37 °C). Příklad změn obsahu sacharidů během fermentace je uveden na obr. 3. pro ABT kulturu a variantu MAX. Jen částečně je i v případě ostatních sledovaných kultur preferována glukosa, paralelně dochází k mírnému poklesu všech ostatních sacharidů. Výrobek s ABT kulturou byl skladován 6 týdnů při 6 °C. Na počátku fermentace podmáslí ABT kulturou bylo přítomno 5,8 × 105 JTK/ml. Na konci fermentace se počty bifidobakterií pohybovaly mezi 2,9 x 107 CFU/ml pro variantu podmáslí po reakci s Maxilactem a 6,8 x 107 CFU/ml pro variantu podmáslí bez GOS. Vliv GOS a FOS na nárůst bifidobakterií během fermentace je srovnatelný a vzhledem ke kontrolnímu médiu bez oligosacharidů zanedbatelný. Změny počtů bifidobakteríí během skladování (obr. 4) jsou srovnatelné s chybou stanovení a ve všech variantách lze stabilitu bifidobakterí hodnotit jako dobrou, i když celkově je počet bifidobakterií dosti blízko limitu pro výrobky s prebiotickou kulturou. 95
Závěrem lze konstatovat, že po fermentaci media s obsahem galaktooligosacharidů nejčastěji používanými bakteriemi mléčného kvašení i bifidobakteriemi zůstává v mediu při dostatečné koncentraci ostatních dostupných sacharidů také větší část galaktooligosacharidů. Při kombinování bifidové kultury s jogurtovou kulturou lze doporučit ověření využívání GOS při fermentaci, protože jednotlivé jogurtové kultury se mohou v této schopnosti značně lišit. 45 Lac
40
Glc
koncentrace (g/l)
35
Gal
30
GOS
25 20 15 10 5 0 0
2
4
6
8
doba kultivace (h)
Obr. 3 Koncentrace sacharidů v průběhu fermentace podmáslí po reakci s Maxilactem ABT kulturou (1 % acidofilní kultury, 2 % bifidové kultury a 0,4 % kultury Str. thermophilus; teplota 37 °C).
Obr. 4 Změny počtu bifidobakterií během skladování výrobku s ABT kulturou. Poděkování: Práce byla podpořena Institutem Danone a MŠMT (MSM 6046137305). Použitá literatura: 1. Crittenden, R. G. & Playne, M. J. (1996): Production, Properties and Applications of Food-grade Oligosaccharides. Trends Food Sci. & Technol., 7: 353–361. 2. Sako, T., Matsumoto, K., Tanaka, R. (1999): Recent Progress on Research and Applications of Non-digestible Galacto-oligosaccharides. Int. Dairy J., 9: 69–80. 3. Mahoney, R. R. v knize: Encyclopedia of Dairy Science (Roginski, H., Fuguay, J. W., Fox, P. F., Eds.), Vol. 2, str. 907–914, Academic Press, New York 2003. 4. Gopal, P. K., Sullivan, P. A., Smart, J. B. (2001): Utilisation of Galacto-oligosaccharides as Selective Substrates for Growth by Lactic Acid Bacteria including Bifidobacterium lactis DR10 and Lactobacillus rhamnosus DR20. Int. Dairy J., 11: 19–25. Kontaktní adresa:
[email protected] 96
Plakátová sdělení
POVRCHOVÁ MIKROFLÓRA PLESŇOVÉHO SYRA NIVA Čanigová Margita, Kusá Silvia Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre THE SUPERFICIAL MICROFLORA OF BLUE CHEESE NIVA Summary: In this work the presence of selected groups of microorganisms on the superficial smeared layer of Niva cheese was studied. There were analysed 20 samples of smear taken from the surface of Niva cheese before its expedition to retailer's chain. The average count of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms reached the value log 9.48 cfu.g-1. Stating yeasts the highest counts of specific microorganisms were found out. The average count of yeasts was log 9.37 cfu.g-1. The average coliform bacteria counts in smear of Niva cheese fluctuated from log 1.30 cfu.g-1 up to values higher than 4.18 cfu.g-1. The counts of enterococcus were higher than of coliforms and ranged the average value 7.58 cfu.g-1. Mliekarenský priemysel produkuje mnohé mliečne výrobky, pričom dôležitú časť mliekarenskej výroby predstavuje výroba syrov. Zo širokého sortimentu vyrábaných syrov majú významné postavenie plesňové syry, a to najmä syry s plesňou vo vnútri syra. Celkový objem ich výroby na Slovensku tvorí 3 – 4 % z výroby syrov (Herian, 2004). Rozhodujúcu úlohu pri výrobe a najmä zrení syrov, okrem kvalitného mlieka, zohrávajú mikroorganizmy.Pri výrobe syra Niva sa cielene vo forme kultúr používajú smotanová kultúra, plesňová a mazová kultúra. Okrem nich sa na povrchu tohto typu syra môžu vyskytovať kvasinky, enterokoky, mikrokoky, koliformné baktérie, koryneformné baktérie a ďalšie. Rod Lactococcus, ktorého dva druhy sú súčasťou smotanovej kultúry, sa zúčastňuje premeny laktózy na kyselinu mliečnu. Táto zásadným spôsobom ovplyvňuje premenu mlieka na syr. Kyselina mliečna sa priebežne laktokokmi a inými mikroorganizmami môže meniť až na kyselinu octovú a etanol (Mc Sweeney a Sousa, 2000). Okrem metabolizmu kyseliny mliečnej zástupcovia r. Lactococcus vyvolávajú tiež špecifické štiepenie mliečnych bielkovín na peptidy a aminokyseliny (Rehman, 1999), čo v rozhodujúcej miere vplýva na organoleptické vlastnosti syra. Pre tvorbu arómy syrov sú dôležití ďalší zástupcovia smotanovej kultúry – baktérie r. Leuconostoc. Okrem kyseliny mliečnej vytvárajú z laktózy etanol, oxid uhličitý, kyselinu octovú. Dôležitú úlohu zohrávajú pri odbúravaní kyseliny citrónovej na aromatické látky ako sú acetoín a diacetyl (Teplý et al., 1985; Mc Sweeney a Sousa, 2000). Plesňová kultúra tvorená Penicillium roqueforti je zaujímavá z hľadiska tvorby proteolytických a lipolytických enzýmov (Larsen et al., 1998). Ich pôsobením sa kazeín štiepi na voľné aminokyseliny, napr. kyselinu asparágovú, kyselinu glutámovú, valín, leucín, lyzín a ďalšie. Mliečny tuk sa postupne rozkladá až na ketóny. Práve tieto metabolity dávajú plesňovému syru typickú vôňu a chuť (Chrzanowska et al., 2003). Ketóny v „modrých“ syroch vznikajú najmä z nízkouhlíkatých, voľných, unikavých mastných kyselín ako napr. z kyseliny maslovej, kaprónovej, kaprylovej. Symbiózu baktérií mliečneho kysnutia a ušľachtilej vláknitej huby Penicillium roqueforti podporuje mazová kultúra, tvorená najmä kvasinkami. Kvasinky sú pri zrení plesňových a mazových syrov dôležité najmä pre schopnosť tvoriť etanol, ktorý s uvoľnenými mastnými kyselinami tvorí estery. Tieto sa spolu s ketónmi podieľajú na špecifickej chuti a aróme plesňových syrov. Okrem toho oxid uhličitý, vznikajúci činnosťou kvasiniek, tvorí v mladom syre dutinky, ktoré poskytujú lepšiu možnosť rastu Penicillium roqueforti. Okrem kvasinky Candida lipolytica sa u syrov zrejúcich pod mazom sledovala činnosť a pôsobenie kvasiniek Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Sacharomyces cerevisiae (Kronborg, et al., 1996; Jakobsen a Narvhus, 1996). Z povrchu syrov zrejúcich pod mazom, medzi ktoré patrí aj Niva, sa izolovalo okrem vyššie uvedených, široké spektrum mikroorganizmov. Povrchová mikroflóra je väčšinou zložená 99
z koryneformných baktérií, pričom najznámejší je druh Brevibacterium linens. Okrem neho sa u rôznych druhov syrov zistili napr. Arthrobacter sp., Staphylococcus sp. (Bockelmann, 2002). Z povrchu modrých plesňových syrov sa z kvasiniek najčastejšie izoloval druh Debaryomyces hansenii (Eliskases – Lechner, 1996). Súčasťou mazu sú aj enterokoky. Niektoré kmene týchto baktérií sa dajú využiť ako štartovacie kultúry na zlepšenie organoleptických vlastností syrov. Využíva sa najmä ich proteolytická aktivita, schopnosť produkovať esterázy rozkladajúce mliečny tuk, ale aj produkcia typických aromatických zložiek, ako sú acetaldehyd, acetoín, diacetyl (Finn, 2003). Z tohto pohľadu dominujú v syroch hlavne Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis. Koliformné mikroorganizmy sa môžu taktiež vyskytovať na povrchu syrov. Zväčša indikujú zlú hygienu a sanitáciu a zároveň môžu spôsobovať problémy v technologickom procese výroby syrov, prejavujúce sa chybami syrov. Cieľom práce bolo zistiť kvantitatívne zastúpenie vybraných skupín mikroorganizmov (celkový počet, počet kvasiniek, enterokokov a koliformných baktérií) na povrchu syra Niva po 6 týždňovom zrení pred expedíciou do obchodnej siete. Uvedené skupiny mikroorganizmov zásadným spôsobom mohli ovplyvniť proces zrenia syra a jeho charakteristické vlastnosti. Materiál a metódy Zastúpenie mikroorganizmov na povrchu plesňového syra Niva sa zisťovalo vo vzorkách, ktoré sa získavali oškrabávaním povrchu vyzretého syra pred jeho balením a expedovaním do obchodnej siete. Syr Niva sa expedoval väčšinou 6 týždňov po výrobe. Vzorky sa odoberali asepticky do sterilných vzorkovníc u výrobcu syra. Zo vzoriek sa pripravilo základné riedenie a následne sa pripravila sada riedení až do stupňa riedenia 10-8. V takto spracovaných vzorkách sa stanovovali celkové počty aeróbnych mezofilných mikroorganizmov (CPM), počty koliformných baktérií (KB), enterokokov (E) a kvasiniek (K). Celkové počty aeróbnych mezofilných mikroorganizmov sa stanovili po 72 + 3 h kultivácii nariedenej vzorky pri 30 + 1 oC na GTK agare (Hi Media, India) - (STN ISO 4833, 1997). Počty koliformných baktérií sa stanovovali na VRB agare (Hi Media, India) po 48 + 3 h kultivácii vzoriek príslušného riedenia pri teplote 30 + 1 oC (STN ISO 4832, 1997). Selektívny agar na izoláciu fekálnych streptokokov (Hi Media, India) sa použil pri stanovení enterokokov. Kultivácia naočkovaných vzoriek prebiehala pri teplote 37 + 1 oC po dobu 72 + 3 hodín (STN 56 0100, 1970). Počty kvasiniek sa stanovili po 3 dňovej kultivácii nariedených vzoriek pri 25 + 1 oC na GKCH agare (STN ISO 7954, 1997). Získané výsledky sa štatisticky spracovali. Výsledky a diskusia Pri výrobe syra Niva v prvých fázach výroby dochádza k intenzívnemu rozkladu laktózy na kyselinu mliečnu, čo sa prejavuje postupným poklesom pH z hodnôt 6,5 – 6,7 na menej ako 5. Pri opätovnej neutralizácii mladého plesňového syra, ktorá je potrebná pre začatie procesu proteolýzy, je veľmi dôležitý tzv. oxidatívny metabolizmus. Tento biochemický proces zabezpečujú kvasinky, ktoré postupne odbúravajú naprodukovanú kyselinu mliečnu. Z tohto pohľadu je výskyt kvasiniek na povrchu syra Niva veľmi dôležitý a nie je prekvapujúce, že počty kvasiniek dosahovali v analyzovaných vzorkách vysoké hodnoty – tab. 1. Len v 5 % vzoriek dosiahli počty kvasiniek hodnotu menšiu ako 109 cfu . g -1, inak ich počty dosiahli hodnotu nad 109 cfu . g -1. Na minimálne výkyvy počtov kvasiniek a teda ich pravidelný výskyt a dôležitú úlohu pri zrení Nivy poukazuje aj variačný koeficient. Priemerný počet kvasiniek stanovených v maze syra Niva sa približoval priemernému celkovému počtu mikroorganizmov. Ani v jednej z analyzovaných vzoriek sa nezistili celkové počty mikroorganizmov pod hodnotu 109 cfu . g -1, v 10 % vzoriek počty dokonca prekročili hranicu 109 cfu . g -1.
100
Tabuľka I Počty vybraných skupín mikroorganizmov na povrchu syra Niva po ukončení zrenia Ukazovateľ (log cfu . g -1)
CPM
KB
Kvasinky
Enterokoky
x
9,48
2,84
9,37
7,58
xMIN
9,04
1,30
8,82
5,59
xMAX
10,08
4,18
9,99
8,48
s
0,291
0,773
0,290
0,822
v[%]
3,06
27,21
3,09
10,84
Počty baktérií r. Enterococcus varírovali na povrchu syra Niva výraznejšie ako celkové počty resp. počty kvasiniek. V 60 % vzoriek počty enterokokov kolísali v rozpätí hodnôt 106 až 108 cfu . g -1. Keďže táto skupina mikroorganizmov sa nepoužíva pri výrobe syra Niva vo forme čistých mliekarenských kultúr, je možné predpokladať, že počet enterokokov vzhľadom na ich tepelnú rezistenciu kolísal už v spracovávanom mlieku. Najvýraznejšie kolísanie počtov sledovaných skupín mikroorganizmov sa zistilo v prípade koliformných mikroorganizmov. V 50 % vzoriek dosahovali počty koliformných baktérií poriadkovo 102 cfu . g -1. 15 % vzoriek obsahovalo poriadkovo 104 cfu koliformných baktérií v 1 g. Kolísanie počtov koliformných baktérií súvisí zrejme so skutočnosťou, že pri výrobe syra Niva sa uplatňuje vo veľkej miere ručná práca a počty týchto baktérií ovplyvňuje práve úroveň vykonanej sanitácie a hygieny. Percentuálne zastúpenie sledovaných skupín mikroorganizmov v maze syra Niva znázorňuje obr. 1.
kvasinky a plesne koliformné
enterokoky iné
1,14% 0,000028% 74,4% 24,46%
Obr. 1 Percentuálne zastúpenie mikroorganizmov v maze syra Niva Iné, nami nesledované skupiny mikroorganizmov, môžu predstavovať u syrov zrejúcich pod vrstvičkou mazu podľa Bockelmanna (2002) napr. korynebaktérie, enterobaktérie, stafylokoky, pseudomonády a ďalšie. Pri hodnotení zmien počtov jednotlivých sledovaných skupín mikroorganizmov – obr. 2 sa zistila negatívna závislosť medzi počtami koliformných baktérií a počtami enterokokov. 101
12
log KTJ/g
10 8
CPM kvasinky
6
enterokoky koliformné
4 2 0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
číslo vzorky
Obr. 2 Zmeny v počtoch mikroorganizmov v maze syra Niva v priebehu sledovaného obdobia Problematikou výskytu kvasiniek na povrchu syrov zrejúcich pod vrstvou mazu sa zaoberal napr. Eliskases – Lechner (1996). Zistil, že najčastejšie sa v maze vyskytuje kvasinka Debaryomyces hansenii, a počty kvasiniek v syroch s plesňou vo vnútri syra dosiahli hodnoty vyššie ako log 5 cfu . g -1. Kvasinkovú mikroflóru na povrchu Roquefortu sledovali Besacon et al. (1992), ktorí taktiež najčastejšie izolovali kvasinku Debaryomyces hansenii. Ako ďalšie kvasinky izolovali Kluyveromyces lactis, Candida sphaerica, Candida sp. Zastúpenie kvasiniek v syre Rokpol (modrý, plesňový syr vyrábaný v Poľsku) sledovali Chrzanowska et al. (2003). Títo zistili, že počty kvasiniek presiahli hodnotu log 8 cfu . g -1. Až 54 % izolovaných kvasiniek predstavoval druh Candida famata. V prípade vzoriek tohto syra počty kvasiniek prevyšovali celkové počty mezofilných mikroorganizmov. V syre Danablu (dánsky, modrý plesňový syr) sa dokázala najčastejšie prítomnosť kvasiniek Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica (Tempela a Jakobsen, 2000). Počty kvasiniek na povrchu tohto syra sa poriadkovo pohybovali na úrovni nami zistených počtov. Hansen et al. (2001) na povrchu syra Mycella, čo je ďalší plesňový syr vyrábaný v Dánsku, najčastejšie identifikovali kvasinku Saccharomyces cerevisiae. Nami zistené celkové počty aeróbnych mezofilných mikroorganizmov na povrchu syrov s mazom sú zhodné so zisteniami Bockelmanna (2002). Tento stanovil vo viacerých druhoch mazových syrov počty vyššie ako log 9 cfu . g-1. Počty baktérií na úrovni log 9 cfu . cm-2 v povrchovom maze syra Tilsit zistili aj Eliskases – Lechner a Ginzinger (1995). Viac ako 30 % z celkovej bakteriálnej flóry predstavoval Brevibacterium linens. Priemerné celkové počty mikroorganizmov v hodnote log 9,27 cfu . g-1 na povrchu syra Idiazabal zistili aj Elortondo et al. (1999). Naopak Chrzanowska et al. (2003) zaznamenali v priebehu zrenia pokles celkového počtu mikroorganizmov v maze syrov, pričom u plesňového syra Rokpol po 8 týždňoch zrenia dosiahli celkové počty mikroorganizmov hodnotu log 6,57 cfu .g-1. Výskyt a počty enterokokov kolíšu v závislosti od typu syra, sezónnej teploty, stupňa kontaminácie spracovávaného mlieka, podmienok výroby a zrenia syrov. Z výsledkov sledovania enterokokov v povrchovej mikroflóre rôznych syrov vyplýva, že ich počty kolíšu najčastejšie v rozpätí log 5 cfu . g-1 až log 7 cfu . g-1 (Arana et al., 2003; Bockelmann, 2002), čo je v súlade
102
s našimi výsledkami. Najčastejšie sa medzi izolátmi enterokokov zo syrov biochemicky potvrdzujú E. faecalis, E. faecium a E. durans (Coppola et al., 2000). Na porovnateľnej úrovni napr. s Aranom et al. (2003), Bockelmannom (2002), Elortondom et al.(1999) sa pohybovali aj nami zistené počty koliformných mikroorganizmov v syroch. Záver V povrchovej vrstve syra Niva po 6 týždňovom zrení sa dokázala prítomnosť kvasiniek, enterokokov a koliformných mikroorganizmov. Získané výsledky sú v súlade so zisteniami iných autorov. Najvyššie počty sa stanovili pri zisťovaní kvasiniek. Najviac v maze na povrchu syra Niva varírovali koliformné mikroorganizmy. Použitá literatúra ARANA, I. et al. 2003. Technical attribute – based selection of Enterococcus strains for addition to a starter culture for making a ewe´s milk cheese. In: Milchwissenschaft, vol. 58, 2003, no. 11/12, p. 627 – 630. BESACON, X. et al. 1992. Study of surface yeast flora of Roquefort cheese. In: Internat. J. Food Microb., vol. 17, 1992, no. 1, p. 9 – 18. BOCKELMANN, W. 2002. Development of defined surface starter cultures for the ripening of smear cheeses. In : Internat. Dairy J., vol. 12, 2002, no. 2-3, p. 123-131. COPPOLA, R. et al. 2000. Microbiological characteristics of Parmigiano Reggiano cheese during the cheesemaking and the first months of the ripening. In: Lait, vol. 80, 2000, no. 5, p. 479 – 490. ELISKASES-LECHNER, F. 1996. Yeasts in the dairy industry : possitive and negative aspects. Brussels : IDF, 1996, 182 p. ELISKASES-LECHNER, F. – GINZINGER, W. 1995. The bacterial flora of surface – ripened cheeses with special regard to coryneforms. In: Lait, vol. 75, 1995, no. 6, p. 571 – 584. ELORTONDO et al. 1999. Physicochemical properties and secondary microflora variability in the manufacture and ripening of Idiazabal cheese. In: Lait, vol. 79, 1999, no. 3, p. 281 – 290. FINN, H. 2003. Enterokoky v potravinách. In : Trendy v potravinárstve, roč. 10, 2003, č. 2, s. 4. HANSEN, E. et al. 2001. Saccharomyces cerevisiae as a starter culture in Mycella. In: Internat. J. Food Microb., vol. 69, 2001, no. 1 – 2, p. 101 – 111. HERIAN, K. 2004. Aktuálne úlohy slovenského syrárstva. In : Mliekarstvo, roč. 35, 2004, č. 1, s. 13-15. CHRZANOWSKA, A.-SZOLTYSIK, M.-ZAROWSKA, B. et al. 2003. Microbiological and physicochemical characteristics of Rokpol cheese during ripening. In : Milchwissenschaft, vol. 58, 2003, no. 9/10, p. 505-508. JAKOBSEN, M.-NARVHUS, J. 1996. Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the quality of dairy products. In : Internat. Dairy J., vol. 6, 1996, no. 12, p. 755-768. KRONBORG, J-HANSEN, G.-JAKOBSEN,T. 1996. Interactions between Penicillium roqueforti and yeast of importance in the production of Danish blue cheese. Brussels : IDF, 1996, 182 p. LARSEN, M. D.-KRISTIANSEN, K. R. - HANSEN, T. K. 1998. Characterization of the proteolytic activity of starter cultures of Penicilluim roqueforti for production of blue veined cheeses. In : Internat. J. Food Microbiol., vol. 43, 1998, no. 3, p. 215-221. McSWEENEY, P.-SOUSA, M. J. 2000. Biochemical pathways for the production for flavour compounds in cheeses during ripening : A review. In : Lait, vol. 80, 2000, no. 5, p. 293-324. REHMAN, S. 1999. Assessing the proteolytic and cheese ripening properties of single strains of Lactococcus in miniature cheeses. In : Lait, vol. 79, 1999, no. 4, p. 361-383. TEMPEL, T. – JAKOBSEN, M. 2000. The technological characteristics of Debaryomyces hansenii and Yarrowia lipolytica and their potential as a starter cultures for production of Danablu. In: International Dairy Journal, vol. 10, 2000, no. 4, p. 263 – 270. TEPLÝ, M. et al. 1985. Výroba sýrů, kaseinů, a kaseinatů. Praha: STNL, 1985, 185 s.
Kontaktná adresa: Ing. M. Čanigová, CSc., KHSŽP FBP SPU, ul. Tr. A. Hlinku č. 2, 949 01 Nitra, SR E-mail:
[email protected] 103
ZMĚNY V MIKROBIÁLNÍM I CHEMICKÉM SLOŽENÍ VYSOKODOHŘÍVANÝCH SÝRŮ Černý V., Erban V., Šatná Z., Šatný A., Komárková E., Ledvinka P. Výzkumný ústav mlékárenský Praha, Výzkumný ústav potravinářský Praha, Krkonošské mlékárny a.s.Jíčín CHANGES IN MICROBIOLOGICAL AND CHEMICAL COMPOSITION IN HARD CHEESES Summary: 13 Czech hard cheeses and French, German and Swiss (each in two samples) hard cheeses were compared on the base of chemical and microbiological analyses The degree of casein proteolysis was evaluated on the base of characteristic NCN, NPN and PTA-N. The casein proteolysis in the German and the Swiss hard cheeses was in a lower level in comparison to Czech and the French cheeses. The breadth of ripening was the best in the Swiss cheeses followed by the Czech ones. The depth of ripening was the lowest in the Swiss cheeses in contrast to all others. Propionic acid content was the highest in the Swiss cheeses and the lowest in the German cheeses. It was in relation to the content of lactic and acetic acids. The evaluation of microbial contamination is statistically irrelevant because of too big differences in parallel samples of the chesses of the individual countries. Only content of Clostridium tyrobutyricum is several order lower in the Swiss cheese, in comparison to other cheeses. Starter cultures are the lowest in the Swiss cheeses, mainly Propionic bacteria; nevertheless propionic acid is the highest pursuant to the best taste. Na základě mikrobiologických chemických a fyzikálních charakteristik bylo porovnáváno 13 českých vysokodohřívaných sýrů ementálského typu, dva francouzské, dva švýcarské a dva německé. Posterové sdělení prezentuje vybrané charakteristiky pro hodnocení kvality sýru. Omezení hodnocení je dáno tím, že u zahraničních sýrů získaných z tržní sítě není známé stáří sýrů . Lze předpokládat, že je jistě vyšší než 90 dní i u zahraničních sýrů. Základní porovnání vyplývá z dosaženého stupně proteolýzy kazeínu pomocí charakteristik NCN, NPN a PTA-N. Švýcarské a německé sýry mají nižší stupeň proteolýzy proti českým a francouzským. Co do šíře zrání byly nejvíce prozrálé švýcarské sýry následované českými. Ušvýcarských sýrů je ale nízká proteolýza co do hloubky zrání na rozdíl od českých je proteolýza vysoká do šíře i hloubky zrání. U francouzských sýrů byla proteolýza výrazně nižší. Proteolýza bílkovin
35 30
% z TN
25 20 PTA-N 15
NPN NCN
10 5
bílk. frakce
m ik r
D
19 92
výrobce
19 92 k
H
F
PTA-N
C
Z3 C
Z2
NCN
C
C
Z1
0
Obr.1 Proteolýza bílkovin evropských v sýrech 104
Obsah kyseliny propionové je nejvyšší u švýcarských sýrů, nižší je u českých a francouzských nejnižší je u německých. S tím korespondují i obsahy kyseliny mléčné a kys. octové. Propionové kvašení 1600 1400
mg/100 g
1200 1000 800
octová propionová
600
mléčká 400 kyselina
200
mléčká
H
F
octová
D 19 92 k
C
C Z1 C Z2 C Z3
0
výrobce
Obr. 2 Propionové kvašení v evropských sýrech U kontaminující mikroflóry jsou velké rozdíly mezi sýry jednotlivých států a z toho důvodu obtížně hodnotitelné vzhledem k nízkému počtu vzorků. Výjimku tvoří Clostridium tyrobutyricum jehož obsah je o několik řádů nižší než ve francouzských a německých sýrech. Zejména středové části sýra obsahují vysoké počty vegetativních klostridií.. Počty spor klostridií jsou u švýcarských sýrů zanedbatelné u ostatních sýrů jsou proporcionální k obsahu vegetativních forem. České sýry se řadí ve výskytu vegetativních klostridií í mezi švýcarské sýry a ostatní evropské sýry. Pokud se týká výskytu okrajových částech jsou všechny sýry srovnatelné.
7 ,0 0 6 ,0 0 log(bb/g)
5 ,0 0 4 ,0 0 3 ,0 0 2 ,0 0 1 ,0 0
ýc
,+
,+ šv
nc
f ra
,+ m
ně
,+ cz
ýc
,-
,šv
nc
,-
f ra
m
ně
cz
,-
0 ,0 0 s tře d o kra j z e m ě ; pa s te r a c e (+ /-)
Obr.3 Výskyt Clostridium tyrobutyricum ve střední a okrajové části sýrů v závislosti na pasteraci. Nepasterované vzorky představují výskyt všech forem klostrídií a pasterované vzorky obsah spor. 105
U mezofilních laktokoků a laktobacilů nejsou rozdíly významné. Termofilní streptokoky a laktokoky jsou u švýcarských sýrů až o 3 řády nižší než u ostatních ementálů, které dosahují srovnatelných hodnot. sýrařské mikroorg.
8,5 ČR min ČR max
7,5 log(počtů)
FRA min 6,5
FRA max ŠVÝC min
5,5
ŠVÝC max BAV min
4,5
BAV max 3,5 M17-42°C
M17-21°C
MRS 5,4 42°C
Lbc
GLIM(FGN)30°C
mikrooganismy
Obr.4 Sýrařsky významné mikrobiální kultury: M17-42°C M17-21°C MRS 5,4 42°C Lbc GLIM(FGN)30°C
termofilná laktokoky mesofilní laktokoky termofilní laktobacily mezofilní laktobacily propionové bakterie
Významný je nejnižší počet propionových bakterií u švýcarských sýrů, které měly i méně ok. Chuťově však byly nejlepší jak odpovídá i nejvyššímu obsahu kyseliny propionové. Kontaktní adresa: Vladimír Erban Výzkumný ústav potravinářský Praha, Radiová 7, 102 31 Praha 10 – Hostivař, Email:
[email protected]
106
STANOVENÍ OBSAHU TUKU A LAKTÓZY V MLÉCE POMOCÍ FT-NIR Dračková Michaela, Hadra Luboš, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno DETERMINATION OF FAT AND LACTOSE IN MILK BY FT-NIR Summary: Near infrared spectroscopy has been widely used for food analysis. The NIR spectra were measured in the region 800 – 2500 nm. Analysis using FT-NIR is common in the dairy industry. It has also been used to determine the total solid, fat, protein and lactose. NIR spectroscopy allows determine of sensoric and physico-chemical parameters e.g. density, melting point, pH etc. The objective of this study was to investigate the feasibility of using near infrared transflectance spectroscopy to determine the fat and lactose in raw milk. ÚVOD Spektroskopie v NIR oblasti se v potravinářství a zemědělství jako jediných oborech uplatňuje už od 60. let (stanovení vody, proteinů, olejů a tuku, sacharidů). Další uplatnění našla ve farmacii, petrochemii, medicíně a při sledování životního prostředí. NIR spektroskopie se používá zejména pro stanovení hlavních složek, tzn. sušiny, bílkovin, tuku a sacharidů. Aplikace NIR spektroskopie je však mnohem širší a zahrnuje i stanovení senzorických a fyzikálně–chemických parametrů (hustota, bod tuhnutí, pH, velikost částic). Úspěšnost při využití NIR spektroskopie závisí nejen na kvalitě přístroje a jeho konstrukci, ale také na referenční metodě, standardní přípravě vzorku, jeho homogenitě a v neposlední řadě na kalibrační metodě (Čurda et al., 2002; RodriguezOtero et al., 1997; Tsenkova et al., 1999). Jedná se o metodu, která využívá spektrální oblast vymezenou vlnovými délkami 800 nm a 2500nm, tj. vlnočty od 12500 do 4000 cm-1(Čurda et al., 2002). NIR spektroskopie nabízí řadu výhod oproti tradičním chemickým metodám. Jedná se o fyzikální, nedestruktivní metodu, kde příprava vzorků je minimalizována nebo zcela eliminována. Další výhody představují úspora práce, času a materiálu, snadná obsluha a možnost měření vzorků i přes transparentní obaly. Jedno spektrum je použitelné ke kvantitativnímu stanovení více složek i kvalitativní analýze (Büning-Pfaue, 2003; Šustová a Janovská, 2002). Cílem naší práce je sestavení kalibračního modelu pro stanovení obsahu tuku a laktózy pomocí FT-NIR. METODIKA Ke kalibraci byly použity vzorky syrového kravského mléka. Sledované parametry byly stanoveny referenčními metodami. Hodnoty laktózy a tuku byly stanoveny infračerveným absorpčním analyzátorem Bentley 2500 (Bentley Instruments, Minnesota, USA) podle normy ČSN 570536. Obsah tuku byl také stanoven acidobutyrometrickou metodou dle Gerbera podle normy ČSN 570530. Vzorky mléka byly proměřeny na spektrometru FT-NIR NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. Čas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla měřena na integrační sféře v režimu reflektance s použitím transflektanční kyvety o optické tloušťce 0.1 mm. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509. Ke statistickému vyhodnocení dat byl použit statistický a grafický software STAT Plus, VÚVeL Brno (Matoušková et al., 1992). VÝSLEDKY A DISKUZE Pro vytvoření kalibračního modelu bylo použito 38 vzorků pro laktózu a tuk, stanovené metodou dle ČSN 570536 a 42 vzorků pro tuk stanovený acidobutyrometrickou metodou. Vzorky, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila odchylka ve změřeném 107
spektru, byly vyřazeny pomocí diagnostického nástroje spektrum outlier a leverage. V kalibračním modelu bylo vyřazeno 5 vzorků pro tuk a 8 pro laktózu, které byly stanoveny medovou dle ČSN 570536 a 4 vzorky pro tuk stanovený dle ČSN 570530. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu. Byly zjištěny korelační koeficienty (R) a směrodatné odchylky kalibrace (RMSEC) pro následující parametry mléka: pro tuk (ČSN 570536) R = 0,96767 a RMSEC = 0,170 (obr. 1a), počet PLS faktorů 2, pro tuk (ČSN 570530) R = 0,96813 a RMSEC = 0,151 (obr. 2a), počet PLS faktorů 4, pro laktózu R = 0,80397, RMSEC = 0,0606 (obr. 3a), počet PSL faktorů 3. Pro vytvoření validačního modelu metodou křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako pro kalibraci. Validace ověřuje spolehlivost kalibračního modelu a je charakterizována směrodatnou odchylkou validace (RMSECV). V křížové validaci byly zjištěny následující hodnoty: pro tuk (ČSN 570536) R = 0,95657 a RMSECV = 0,197 (obr.1b), pro tuk (ČSN 570530) R = 0,93122 a RMSECV = 0,221 (obr. 2b) a pro laktózu R = 0,69280 a RMSECV = 0,0747 (obr. 3b). Byly porovnány referenční metody pro stanovení tuku a nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly.
Obr. 1 Kalibrační (a) a validační (b) modely pro tuk stanovený referenční metodou ČSN 570536.
Obr. 2 Kalibrační (a) a validační (b) modely pro tuk stanovený referenční metodou ČSN 570530 acidobutyrometricky.
Obr. 3 Kalibrační (a) a validační (b) modely pro laktózu stanovený referenční ČSN 570536. 108
Obr. 4 Funkce PRESS pro tuk (ČSN 570536) (a). Spektrum syrového mléka (b) ZÁVĚR NIR spektroskopie je v současné době stále více využívána k analýze potravin. Praktické uplatnění FT-NIT spektroskopie v mlékařství je hlavně založeno na stanovení základního složení mléka. Byla zavedena kalibrační metoda pro stanovení tuku a laktózy v syrovém kravském mléce. Použitá literatura: BÜNING-PFAUE, H. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chem., 2003, vol. 82, no. 1, p. 107-115. ČSN 570530 Metody zkoušení mléka a tekutých mléčných výrobků. Vydal Úřad pro normalizaci a měření, Praha, 1995, s. 100. ČSN 570536 Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem. Vydal Český normalizační institut, Praha, 1999. ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., NOVOTNÁ, M. NIR spektroskopie a její využití při analýze mléka a mléčných výrobků. Chem. Listy, 2002, vol. 96, no. 5, p. 305-310. MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská příručka, verse 1.01., 1992. Veterinary Research institute, Brno, CR. RODRIGUEZ-OTERO, JL. HERMIDA, M., CENTENO, J. Analysis of dairy products by near-infrared spectroscopy: A review. J. Agric. Food Chem., 1997, vol. 45, no. 8, p. 2815-2819 ŠUSTOVÁ, K., JANKOVSKÁ, R. Sledování obsahu kaseinu v mléce použitím FT NIR spektroskopie. Mlékařské listy, 2002, vol. 73, p. 24-25. TSENKOVA, R., ATANASSOVA, S., TOYODA, K., OZAKI, Y., ITOH, K., FEARN, T. Near-infrared spectroscopy for dairy management: measurement of unhomogenized milk composition. J. Dairy Sci., 1999, vol. 82, no. 11, p. 2344-2351.
Práce vznikla za podpory grantového projektu FRVŠ č. 1459 a výzkumného záměru MŠMT Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Kontaktní adresa: MVDr. Michaela Dračková Ústav hygieny a technologie mléka Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého 1/3 612 42 Brno e-mail:
[email protected]
109
PŮSOBENÍ LAKTOCIDU A OPTIFORM+PURAC NA RŮST LAKTOBACILŮ POCHÁZEJÍCÍCH Z LAHŮDKOVÝCH VÝROBKŮ Fialová Jana, Chumchalová Jana, Míková Kamila* * Ústav technologie mléka a tuků, Ústav chemie a analýzy potravin Vysoká škola chemicko-technologická v Praze EFFECT OF LAKTOCID AND OPTIFORM + PURAC ON THE GROWTH OF LACTOBACILLI INDIGENOUS FROM DELICACY PRODUCT. Summary Lactobacilli can grow in various delicacy products and they are responsible for the spoilage of these products. Although they do not represent a health risk, they alter sensorial properties of product at concentration above 103 CFU.g-1. They cause a lot of problems and losses for producers because the shelf-life of product is reduced. There is a need to improve quality of such products by suppressing the growth of lactobacilli. The resistance of 20 lactobacilli isolated from delicacy products was tested against two preservatives: Laktocid and Optiform + Purac (blend of lactic, acetic acid and their sodium salt, 28 % w/w) in agar contain mayonnaise or Tartar sauces (simulations of real conditions). Laktocid was more efficient than Optiform + Purac. Laktocid had full inhibitory effect at concentration 6 % w ̸ w for all lactobacilli on the agar with mayonnaise or Tartar sauce. The lowest concentration of Optiform + Purac at which no growth of lactobacilli occurs was 8 % w/w on the agar with mayonnaise. Same of tested lactobacilli (25 %) were able to grow in presence of Optiform + Purac at concentration 8 % w/w on the agar with Tartar sauce. Úvod Majonézy a lahůdkové výrobky patří mezi potraviny s velmi dobrou mikrobiální stabilitou díky vysoké kyselosti a nízké hodnotě aktivity vody ve výrobku. V současnosti je trend výrobců, v souvislosti ze změnami ve stravování, snižovat obsah oleje a tím zvyšovat obsah vody ve výrobku, což způsobuje nižší mikrobiální stálost výrobku. Mezi mikroorganismy, které se mohou množit ve výrobku a tím zkracovat dobu použitelnosti výrobku, patří patogenní bakterie, kvasinky a plísně. V poslední době se také uvádí rozvoj bakterií mléčného kvašení, zejména rod Lactobacillus. K potlačení růstu nežádoucích mikroorganismů ve výrobků se běžně používá kyselina sorbová, kyselina benzoová a zvýšená kyselost výrobku. Tato opatření zabraňují růst většiny bakterií a plísní, ale jsou neúčinná vůči kvasinkám a bakteriím mléčného kvašení. Třebaže laktobacily nepředstavují riziko pro konzumenty, v důsledku jejich metabolické činnosti dochází k senzorickému znehodnocení výrobku (tvorba pachutí, pachů, kysnutí výrobku a změna konzistence). Růst laktobacilů v lahůdkových výrobcích podporuje nízký obsah kyslíku, nepřítomnost kompetitivní mikroflóry (kyselé prostředí potlačující růst dalších mikroorganismů) a vyšší skladovací teplota. Maximální senzoricky přípustná koncentrace laktobacilů v lahůdkovém výrobků je 102 JTK/g (Míková 2001). Jelikož jsou laktobacily rezistentní vůči působení běžných konzervačních látek, hledají výrobci jiné způsoby konzervace. V souvislosti s rostoucím zájmem o biokonzervaci, se nabízí použití organických kyselin přírodního původu (např. kyselina mléčná, kyselina octová). Inhibiční účinek organických kyselin je způsoben převážně jejich nedisociovanou formou, přestože i disociovaná forma kyselin působí mikrobicidně, jejich antimikrobiální účinek roste s klesajícím pH. Při pH 7 jsou minimální inhibiční koncentrace kyseliny mléčné pro rod Lactobacillus udávány v rozmezí 4 – 2,5 % hm. a při pH 4 jen 0,5 % hm.. Pro octovou kyselinu jsou minimální inhibiční koncentrace stanoveny přibližně 4 % hm. pro pH 7 a 0,5 % hm. pro pH 4 (Ray a Sandine1992). Cíle práce V této práci byl sledován vliv dvou komerčních konzervačních preparátů Laktocid a Optiform + Purac na růstu laktobacilů izolovaných z tatarské a italské omáčky. Pro zjištění vlivu 110
konzervačních látek byla použita metoda simulující reálné podmínky, kdy laktobacily byly naočkovány na agaru obsahující majonézu nebo tatarskou omáčku. Materiál a metody Použité mikroorganismy Pro studium byly použity laktobacily, obnovené ze zamražených kultur sbírky Ústavu technologie mléka a tuků, VŠCHT v Praze, izolované z komerčně vyrobené majonézy (obsah tuku 50 % hm.), tatarské omáčky s feferonkami (obsah tuku 50 % hm.) laboratorně připravené tatarské omáčky (obsah tuku 50 % hm.) a italské omáčky (obsah tuku 40 % hm.). Kmeny laktobacilů byly kultivovány v MRS bujónu (Oxoid, UK) anaerobně, 17 h při teplotě 37 °C. Konzervační látky Byly použity následující konzervační látky: Laktocid (kyselina mléčné - přibližně 2,5 % hm. mléčné kyseliny v octu, L (+) forma, 2 – 8 % hm., Lactoprot Zeelandia, ČR) a Optiform + Purac (směs mléčnanu sodného, octanu sodného a kyseliny mléčné, 2 – 8 % hm., ICF Food, ČR). Majonézový a tatarkový agar Vliv konzervačních látek na růst laktobacilů izolovaných z lahůdkových výrobků byl sledován na majonézovém nebo tatarkovém agaru. Majonézový a tatarkový agar byly připraveny následovně: na Petriho misku bylo naváženo 7,5 g majonézy nebo tatarské omáčky naředěné sterilním fyziologickým roztokem s peptonem v poměru 1:1 , konzervační látka v množství odpovídající požadované koncentraci a 7,5 g 2 % agaru ve vodě. Po zatuhnutí agaru a vysušení povrchu byly laktobacily načárkovány na agar (cca 3 µl narostlé kultury). Po kultivaci při teplotě 37 °C, 72 h, anaerobně byl vyhodnocován nárůst laktobacilů na agaru. Pro přesnější vyhodnocení růstu laktobacilů bylo přidáno barvivo bromkresolový purpur (objem 75µl, 0,2 % hm. v 50 % ethanolu, Sigma-Aldrich, USA). Výsledky a diskuze Byl sledován se vliv dvou konzervačních látek Laktocid a Optiform + Purac na růst laktobacilů izolovaných z majonézy, tatarské a italské omáčky na agaru obohaceném o majonézu nebo tatarskou omáčku. Majonéza a tatarská omáčka ve směsi s agarem měly simulovat původní prostředí testovaných laktobacilů. Dále byla snaha porovnat vliv rozdílného složení obou výrobků ve spojitosti s konzervační látkou na růst laktobacilů. Laktocid je směs kyseliny mléčné a kyseliny octové, Optiform + Purac je směs mléčnanu sodného, octanu sodného a kyseliny mléčné. Pro pokus byla zvolena jednotná koncentrační řada konzervační látky a to 2 % hm., 4 % hm., 6 % hm., 8 % hm.. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v Tab.I pro majonézovy agar a v Tab.II pro tatarkový agar. Z Tab. I vyplývá, že na majonézovém agaru konzervant Laktocid resp. konzervant Optiform + Purac inhiboval růst všech testovaných laktobacilů až od koncentrace 6 % hm. resp. 8 % hm.. Nejnižší zkoumaná koncentrace (2 % hm.) neměla významnější inhibiční účinek na růst laktobacilů, Laktocid inhiboval růst 33 % sledovaných laktobacilů, zatímco u Optiform + Purac nebyla detekována inhibice růstu ani u jediného kmene. Výraznější inhibice růstu testovaných laktobacilů byla zjištěna u konzervační látky Laktocid až od koncentrace 4 % hm. (76 % kmenů) a u Optiform + Purac od koncentrace 6 % hm. (71 % kmenů). Při koncentraci 4 % hm. konzervant Optiform + Purac působí na růst dvou laktobacilů (vykazuje 9-ti % účinnost). Nejnižší zkoumaná koncentrace obou konzervačních látek (2 % hm.) testovaná na agaru obsahující tatarskou omáčku (viz tab.II) neměla žádný vliv na růst laktobacilů. Při koncentraci 4 % hm. měl Laktocid 66 % účinnost (inhiboval růst 14-ti kmenů). Preparát Laktocid inhiboval všechny testované laktobacily až od koncentrace 6 % hm.. Konzervant Optiform + Purac při koncentraci 4 % hm. vykazoval 33 % hm. (inhibice 7 kmenů), výraznější inhibice růstu laktobacilů byla zjištěna až u koncentrace 8 % hm. (76 % kmenů). Koncentrace 6 % Optiform + Purac ovlivnila růst 43 % testovaných laktobacilů. 111
Tabulka I Vliv Laktocid a Optiform + Purac na růst laktobacilů v majonézovém agaru Kmen
Lactocid
Laktocid
Laktocid
Laktocid
DEL 1 FEF B2 TAT A2 TAT C13 TAT D12 TAT D13 TAT K13 TAT K14 TAT K21 TAT K22 TAT K23 TAT K24 TAT K25 IT B14 IT D11 IT D12 IT D13 IT D14 IT 1 IT sl 1 IT sl 2
2 % hm. + + + + + + + + + + + + + +
4 % hm. + + + + + -
6 % hm. -
8% hm. -
Optiform a Purac 2 % hm. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Optiform a Purac 4 % hm. + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Optiform a Purac 6 % hm. + + + + + +
Optiform a Purac 8% hm. -
kontrola
Optiform a Purac 8% hm. + + + + + -
kontrola
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Tabulka II Vliv Laktocid a Optiform + Purac na růst laktobacilů v tatarkovém agaru Kmen
Lactocid
Laktocid
Laktocid
Laktocid
DEL 1 FEF B2 TAT A2 TAT C13 TAT D12 TAT D13 TAT K13 TAT K14 TAT K21 TAT K22 TAT K23 TAT K24 TAT K25 IT B14 IT D11 IT D12 IT D13 IT D14 IT 1 IT sl 1 IT sl 2
2 % hm. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
4 % hm. + + + + + + + -
6 % hm. -
8% hm. -
Optiform a Purac 2 % hm. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Optiform a Purac 4 % hm. + + + + + + + + + + + + + +
Optiform a Purac 6 % hm. + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Legenda k Tab. I a II: DEL TAT IT FEF
Lactobacillus pocházející z majonézy Lactobacillus pocházející z tatarské omáčky + Lactobacillus pocházející z italské omáčky Lactobacillus pocházející z tatarské omáčky s feferonkami
112
nebyl pozorován nárůst laktobacilů byl pozorován nárůst laktobacilů
Porovnáním Tab. I. a Tab.II. bylo zjištěno, že Laktocid je účinnější konzervační látkou než Optiform + Purac, jelikož inhiboval růst laktobacilů již od koncentrace 6-ti % hm. na agaru obsahujícím majonézu nebo tatarskou omáčku. Dále bylo zjištěno, že obě konzervační látky vykazovaly výší účinnost na agaru obsahujícím majonézu. Co se týče rozdílnosti složení obou lahůdkových výrobků tatarská omáčka se lišila od majonézy pouze přídavkem zeleninové směsi naložené v octu. Předpokládá se, že takto upravená zelenina by neměla být zdrojem laktobacilů, ale pouze zdrojem živin potřebných pro růst laktobacilů. Závěr Laktocid byl účinnější konzervant něž Optiform + Purac. Rozdíly v účinnosti testovaných látek lze potlačit použitím vyšší koncentrace méně účinného konzervantu, pokud to legislativní opatření připouští a také s ohledem na senzorickou hodnotu finálního výrobku. Výrobce preparátu Laktocid doporučuje používat Laktocid ve stejném množství jako ocet (4 % hm.), ale koncentrace 6 % hm je ještě senzoricky přijatelná. U konzervační látky Optiform + Purac je koncentrace 8 % hm. ještě senzoricky přijatelná. Získané výsledky poskytují předpoklady pro úspěšnou aplikaci těchto konzervačních preparátů v potravinářském průmyslu při výrobě lahůdkových výrobků. Proto by se práce měla do budoucna zaměřit na sledování vlivu těchto dvou konzervačních látek přímo ve výrobku a zjistit, jak ovlivňují tyto konzervační látky počty laktobacilů v samotném výrobku. Tato práce byla podpořena grantem MŠMT ČR, projekt CEZ: MSM 223300004. Literatura Benthin S. and Villadsen J. (1995): Different inhibition of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulbaricus by D-and L- lactic acid: effect on lag phase, grow rate and cell yield. Journal of Applied Bacteriology, 78:647-654. Brocklehurst T.F., Lund B.M., (1984): Microbiological changes in mayonnaise-based salads during storage. Food Microbiology, 1:5-12. Hsiao CH., Siebert (1999): Modeling the inhibitory effect of organic acid on bacteria. Int. Journal of Food Microbiology, 47:189-201. Ray B., Sandine W.E. v knize: Food biopreservatives of microbial origin (Ray B., Daeschel M.), str. 103 , Marcel Dekker, Inc., New York 1992. Míková K. (2001): Majonézy. Maso, příloha Lahůdka 1:5-6. Míková K., Chumchalová J., Hrůšová I. (2003): Stanovení rodu Lactobacillus v majonézách. Maso, příloha Lahůdka 1: 3-5. Kontaktní adresa
[email protected]
113
THE INFLUENCE OF PH AND HYDROLYSIS DEGREE ON FOAMING PROPERTIES OF ENZYMATIC WPC HYDROLYSATES Gallier Sophiea, Dryáková Adrienab, Čurda Ladislavb a Ecole des Mines d‘Albi-Carmaux, Campus Jarlard, France b Institute of Chemical Technology, Department of Dairy and Fat Technology, Czech republic VLIV PH A STUPNĚ HYDROLÝZY NA PĚNICÍ VLASTNOSTI ENZYMATICKÝCH HYDROLYZÁTŮ KONCENTRÁTU SYROVÁTKOVÝCH PROTEINŮ
Summary: The difference between foaming properties of hydrolysates with and without adjustment of pH after thermal inactivation of hydrolysis was studied. Spray dried whey protein concentrate was treated with three commercially available proteases: Alcalase, Flavourzyme and Protamex at optimal conditions. Foams were prepared immediately after hydrolysis and thermal inactivation of enzyme. Two foams were made from each hydrolysate: one from hydrolysate without adjustment of pH; one from hydrolysate with adjustment of pH (6,54). Foamability of all hydrolysates was almost same as foamability of unhydrolysed whey protein, no matter if with adjusted or without adjusted pH. In contrast, stability of foams was strongly influenced by hydrolysis. Adjustment of pH had either no significant effect on foam stability (Protamex, Alcalase) or even negative effect in the case of foams processed from Flavourzyme hydrolysates. In relation to the total foam quality prepared from hydrolysates, if no influence of either hydrolysis or adjustment of pH on foamability was observed, we can conclude that the Flavourzyme hydrolysate (without adjustment of pH) taken after 15 min of hydrolysis was the most suitable hydrolysate as it produced at least the same stable foam as from enzyme untreated whey protein or even more stable. Introduction Whey proteins have been established to have good foaming properties and they are an integral part of recipes that require whipping or foaming. With a present effort to utilize whey proteins as much as possible it is necessary to understand more to the functional properties of such ingredient that can be potentially used for food formulations. Molecular changes occurring during the hydrolysis may result in modified functional behaviour of the hydrolysates compared to the intact protein such as altered solubility, viscosity, sensory properties, emulsion and foam properties. Hydrolysis of whey proteins generally resulted in increased foam-forming ability of the hydrolysates, however the influence of hydrolysis on foam stability seems to depend on enzyme specifity and degree of hydrolysis. The aim of this study was to contribute to number of reports that deal with this topic and try to explain the relationship between pH and DH and their mutual influence on foaming properties of defined hydrolysates, which could be potentially used for production of functional foods. Materials Spray dried whey protein concentrate (WPC) containing 60.1 % (w/w) of pure protein (Promil, Czech Republic); Alcalase 2.4 L; Flavourzyme 500 MG; Protamex (Novo Nordisk A/S, Denmark); all other reagents or chemicals were of the highest available purity. Methods Hydrolysis: Reconstituted WPC with 4 % of intact protein in solution was hydrolysed by three enzymes: Alcalase, Flavourzyme and Protamex. All experiments were carried out at the temperature of 45 °C and at the same ratio enzyme/substrate (E/S = 1/100). The individual experiments differed only in set up of initial pH according recommendation of producer with the aim to achieve optimal conditions for each enzyme (Table I). 114
Table I Initial conditions of hydrolysis Enzyme pH Alcalase 2.4 L 8 Flavourzyme 500 MG 7 Protamex 6
t [°C] 45 45 45
The total time of reaction was 180 min. Samples were taken during hydrolysis in times 0; 15; 30; 60 and 180 min after adding the enzyme (1 ml for measuring the degree of hydrolysis (DH) by method with using of o-phtadialdehyde (Hernández et al., 2002); 150 ml for measuring foaming properties). Each sample was thermally treated by heating to 85°C for 10 min and so the inactivation of enzyme was reached. A selection of hydrolysates was adjusted to pH of 6,54 value by adding either NaOH or HCl (2 mol.l-1) after thermal inactivation of enzyme. This value has been chosen according to pH value of reconstituted unhydrolysed WPC with 4 % of intact protein in solution. Foaming properties measurement: All foams were prepared in food processor immediately after cooling down of thermally treated hydrolysate in duplicates. All samples were whipped for 3 min at 490 min-1. Foamability: The foamability was expressed as % of overrun (OR) and calculated according to the Equation 1 (Adler–Nissen, 1986). %OR =
wh − w f ⋅ 100 wh
(1)
where: wh - weight of liquid hydrolysate [g]; wf - weight of foam [g] Foam instability: The instability of foams was defined as a drainage, which was monitored during 20 min after whipping the foam and it was calculated according to the Equation 2. Drainage [%] =
w dl ⋅ 100 wf
(2)
where: wdl - weight of drained liquid [g]; wf - weight of foam that was kept draining [g] The foam instability is proportional to the area under the curve constructed from plotted dependence of drained liquid on time of drainage. The area was calculated as sum of trapezoids, obtained values were recalculated and therefore 0 is stable foam (no drainage during 20 min), value 100 means maximal instability. Results and Conclusions The significant difference of the calculated DH between Flavourzyme hydrolysates and Alcalase and Protamex hydrolysates was observed, which is caused by different nature of enzyme reaction (Flavourzyme is carboxypeptidase; Alcalase and Protamex are endopeptidases). This is well obvious from the Fig. 1. No significant difference between foamability of hydrolysates with or without pH adjustment was observed. However, even the foamability of hydrolysates was almost comparable to the foamability of unhydrolysed WPC, we observed a trend of increasing foamability during the course of hydrolysis until a certain DH depending on enzyme action. That would support the theory that considers the relationship with molecular distribution of hydrolysates and foamability. But the foamability is particularly determined by nature of peptides (hydrophilic/hydrophobic) presented in solution; or by relative amounts of substances (various peptide fractions/protein), which can interact and thus can be responsible for making up the foam and on the other hand for its breakage and stability, respectively. This trend, even observed, was not proved to be significant. 115
An example of plotting the overrun values of foams made from Alcalase hydrolysates shows the Figure 2. Similar behaviour was observed also for Flavourzyme and Protamex.
Fig.1 Plot of DH in the dependence on time of hydrolysis for used enzymes
Overrun [%]
100
without adjusting pH
50
with adjusting pH at 6,54
0 0
15
30
60
180
Time of hydrolysis [min]
Fig. 2 Example of plotting the Alcalase overrun values in the dependence on time of hydrolysis The stability of foams whipped from hydrolysed samples differed significantly during the course of hydrolysis by individual enzymes. The stability of foams whipped from unhydrolysed WPC was different, which is caused by adjustment of pH of the solution at the beginning of hydrolysis. The most stable foam at all was prepared from unhydrolysed WPC solution adjusted to pH 6,0 prior adding Protamex (Fig. 5). This means that the adjustment of pH protein solution has influence on a quality of foam, which is not surprising as pH influences the charge of reactive groups of aminoacids and thus the charge density of protein/peptide molecule. Also the thermal treatment should be taken in account as it influences the protein structure and folding and thus the ability of creating protein/protein interactions or molecule mobility which is responsible for faster/slower diffusion to the phase interface. A moderate decrease in drainage was observed in foams made from 60 min Alcalase hydrolysates with adjusted pH after inactivating the enzyme (Fig. 3). Significant difference between foam instability of 15 min Flavourzyme hydrolysates with and without adjusted pH was observed (Fig. 4). As was mentioned above, the most stable foam was formed from unhydrolysed WPC at pH 6 that was used for Protamex. Hydrolysis by this enzyme disrupts the foam stability – even after 15 min of hydrolysis. The adjustment of pH after hydrolysis had no influence on stability of Protamex foams (Fig. 5). 116
Foam instability [-]
100
75
50
25
0 0
15
30
60
180
T im e of hydrolys is [m in]
Fig. 3 The influence of time of hydrolysis and adjustment of pH on the Alcalase foam instability with ad jus ting p H
witho ut ad jus ting p H
Foam instability [-]
100
75
50
25
0 0
15
30
60
180
T im e of hydrolysis [m in] with adjusting pH
without adjusting pH
Fig. 4 The influence of time of hydrolysis and adjustment of pH on the Flavourzyme foam instability
Foam instability [-]
100
75
50
25
0 0
15
30
60
180
Time of hydrolysis [m in] with adjusting pH
without adjusting pH
Fig. 5 The influence of time of hydrolysis and adjustment of pH on the Protamex foam instability 117
Our study confirms that adjustment of pH can not improve observed worse foam stability of foams from hydrolysates processed under these conditions and used in our study or at least it can not improve it significantly. Nevertheless, this also shows that right choice of enzyme and conditions of hydrolysis are essential with respect to the potential use of such hydrolysate. Finally, if such hydrolysate would be used as a foaming agent, the likely behaviour of such additive could not be predicted without studying of its foaming potential in real foods. References: 1. Adler–Nissen J.: Enzymatic hydrolysis of food proteins. Elsevier, London 1986. 2. Hernández et al.: Use of the o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine reagent in the evaluation of milk proteins. J. Dairy Sci. 74 (6), 1779-1785 (1991). 3. Smyth M., Fitzgerald R. J.: Relationship between some characteristics of WPC hydrolysates and the enzyme complement in commercially available proteinase preparations. Int. Dairy J. 8, 819–827 (1998). 4. Raymundo A., Empis J., Sousa I: Method to evaluate foaming performance. J. Food Eng. 36, 445-452 (1998). 5. Lieske B., Konrad G.: Physico-chemical and functional properties of WP as affected by limited papain proteolysis and selective ultrafiltration. Int. Dairy J. 6, 13-31 (1996). 6. van der Ven C., Gruppen H., de Bont D. B. A., Voragen A. G. J.: Correlations between biochemical characteristics and foam-forming and stabilizing ability of whey and casein hydrolysates. J. Agric. Food Chem. 50, 2938–2946 (2002). Acknowledgments: This study was supported by Erasmus – Socrates programme and by the Czech Ministry of Education, Youth and Sport (MSM6046137305). Kontaktní adresa:
[email protected]
118
POSÚDENIE RASTU LISTERIA MONOCYTOGENES V LEB BUJÓNE VPLYVOM RÔZNYCH PODMIENOK Greifová Mária, Greif Gabriel, Šovčíková Andrea, Gažová Zdenka, Horáková Katarína STU Bratislava, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie EVALUATION OF GROWTH OF LISTERIA MONOCYTOGENES IN LEB BROTH UNDER VARIOUS CONDITIONS Summary: Total elimination of Listeria monocytogenes from foods is not possible. It is however possible to reduce the probability of its occurence either in the raw stock or in the food product itself. This work describes model growth of Listeria monocytogenes at 37 °C in LEB broth with varying levels of NaCl (0,5 – 12%), pH (4,8 – 9) and potassium sorbate (0,1 – 1%). Growth of Listeria monocytogenes was monitored by measuring turbidity of medium at 630 nm; the growth curves were used for calculation of growth characteristics: µm – specific growth rate, λ -lag phase and time (M) at which (µm = max). NaCl and potassium sorbate had inhibition effect on the growth, their increasing concentrations resulted in decrease of specific growth rate and prolongation of lag phase. Under controlled pH of the incubation broth, we have observed the highest growth rate at pH 7 – 9, the shortest lag phase was recorded in the pH interval from 6,3 to 8. Listeria monocytogenes sa bežne nachádza v životnom prostredí, na človeka sa prenáša najmä prostredníctvom potravín. Je všeobecne prítomná v mäse, hydine, rybách a surových poľnohospodárských produktoch (Rodriques a kol., 1994). Bolo zistené, že prežíva rozličné technologické spracovanie potravín vrátané výroby syrov a klobás. Je to environmentálny kontaminant surových aj tepelne opracovaných produktov (Bruncic a kol, 1991). U senzitívnych jedincov môže L. monocytogenes spôsobiť ochorenie listeriózu, ktorá pri neliečení môže byť až smrteľná – obzvlášť je nebezpečná pre dojčatá, tehotné ženy a starších ľudí (Francois a kol., 2004). Hoci oficiálne deklarovaná úmrtnosť v SR aj ČR nie je vysoká, vo svete sú známe viaceré prípady epidémií listeriózy s tragickými následkami. V tejto súvislosti práca je zameraná na modelovanie rastu L. monocytogenes pri teplote 37 °C v LEB bujóne s prídavkom NaCl (od 0,5 do 12 %), pH hodnotou (od 4,8 do 9) a s obsahom sorbanu draselného (od 0,1 do 1 %). Materiál a metódy Použitý mikroorganizmus: 88/049 Listeria monocytogenes NCTC 4886, sérotyp 1/2a. Bol získaný z národnej zbierky UK v rámci riešenia medzinárodného projektu INCO Copernicus. Kultúra bola uchovávaná na BHI agare (Merck, Germany) pri teplote 4 °C. Pre vlastné pokusy bola dva krát preočkovaná do 10 ml BHI bujónu (Merck, Germany) a inkubovaná 18 h pri 37 °C. Po centrifugácii bol supernatant odstránený a bunkový pelet 2 krát prepraný v sterilnom fyziologickom roztoku, potom umiestnený do testovaného LEB bujónu. Vstupná koncentrácia bola cca 107 KTJ.ml-1. Suspenzia buniek bola pripravená vždy čerstvá pred novým pokusom. Príprava LEB bujónu s prídavkom NaCl LEB bujón sa rozpustí v predpísanom množstve deionizovanej vody, pridá sa vypočítane množstvo NaCl podľa požadovanej koncentrácie. Po úprave pH sa rozpipetuje do vhodných skúmaviek a sterilizuje 15 min pri 121 °C. Príprava LEB bujónu s prídavkom konzervačnej látky LEB bujón sa rozpustí v predpísanom množstve deionizovanej vody, pridá sa vypočítane množstvo sorbanu draselného podľa požadovanej koncentrácie. Po úprave pH sa rozpipetuje do vhodných skúmaviek a sterilizuje 15 min pri 121 °C. 119
Príprava LEB bujónu s rôznymi hodnotami pH LEB bujón sa rozpustí v predpísanom množstve deionizovanej vody. Po vysterilizovaní sa asepticky upraví pH (s 5% NaOH a 99% kyselinou octovou) a asepticky rozpipetuje do sterilných skúmaviek. Tabuľka I Podmienky experimentu Prídavok NaCl (%) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 12,0
LEB bujón, t: 37 °C pH upravené s NaOH s ľadovou kys. octovou 9,0 6,6 8,0 6,2 7,3 5,8 5,3 4,8
Obsah sorbanu draselného (%) 0,1 0,2 0,3 0,5 0,8 1,0
Mikrotitračná metóda Do pripraveného LEB bujónu sa pridála suspenzia baktérií tak, aby koncentrácia buniek bola cca 107 KTJ.ml-1. Z každého takto naočkovaného LEB bujónu sa pipetovalo 3x200µl do jamiek v mikrotitračnej platni. Platňa sa inkubovala pri teplote 37 °C. Vo zvolenom časovom intervale (každé 2 h) sa odčítavali hodnoty absorbancii pri 630 nm vo vhodnom čitači - readri (Humareader, Hungary). Zo získaných výsledkov sa zostrojila rastová krivka A630=f(t). Výpočet rastových charakteristík Rastové charakteristiky boli vypočítane z rovnice (Gibson a kol., 1988)
µm =
A = C.exp[exp(-B(t-M))];
B.C e
λ=M −
1 B
A – denzita populácie v čase t M – čas, v ktorom je µm maximálna, B – smernica krivky v bode M C – horná asymptota – maximálna hustota buniek v stacionárnej fáze rastu
Výsledky a diskusia Rast Listeria monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym prídavkom NaCl L. monocytogenes je schopná rásť aj pri vysokých koncentráciách soli. Skutočnosť, že bola izolovaná zo soľných kúpeľov pri výrobe syrov zvyšuje významnosť sledovania vplyvu NaCl na tento patogén. Najlepšie rastové podmienky boli v LEB bujóne bez prídavku NaCl, rýchlosť rastu 0,185 h-1 sa dosiahla už za 4,8 h. Pri prídavku 0,5 až 4 % NaCl rýchlosť rastu postupne klesala a doba dosiahnutia max. rýchlosti sa predĺžila o 2,6 h. Od 6 % prídavku NaCl sa rast výraznejšie spomaľoval až po 9 % prídavok NaCl, kedy sa max. rýchlosť dosiahla až za 25,8 h. V LEB bujóne s 10 a 12 % prídavkom NaCl sa rast nezaznamenal ani po 160 h kultivácie. Rast L. monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym prídavkom NaCl je znázornený na obr. 1 S rastúcim prídavkom NaCl v LEB bujóne sa predlžovala lag fáza (λ) ako aj doba dosiahnutia maximálnej rastovej rýchlosti (M) a klesala špecifická rastová rýchlosť (µm), čo je graficky znázornené na obr. 2
120
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,3
OD
OD
0,4 bez prídavku NaCl 0,5% NaCl 1% NaCl 2% NaCl 3% NaCl 4% NaCl
0,2 0,1 0,0 0
5
10
15
20
25
0,3 0,2 6% NaCl 7% NaCl 8% NaCl 9% NaCl
0,1 0,0
30
0
20
40
60
čas [h]
80 100 120 140 160
čas [h]
0,20 0,18 0,16
µm λ
M
-1
µm [OD.h ]
0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0
2
4
6
8
28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 10
λ , M [h]
Obr. 1 Rast L. monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym prídavkom NaCl
NaCl [%]
Obr. 2 Závislosť špecifickej rastovej rýchlosti (µm), lag fázy (λ)a času (M), v ktorom je špecifická rastová rýchlosť maximálna od prídavku NaCl v LEB bujóne Razavilar a Genigeorgis (1998) sledovali vplyv NaCl na L. monocytogenes pri rôznych teplotách. Pri 30 °C koncentrácia NaCl nad 8 % výrazne potláčala rast L. monocytogenes. Obsah 10 a 12 % soli predlžoval lag fázu na 6 a 21 dní. Pri 20 °C pozorovali zvýšenie inhibičného účinku NaCl so zvyšovaním koncentrácie z 0,5 na 12,5 %. Predĺženie lag fázy pozorovali pri 10 a 12 % NaCl pri tejto teplote menej výrazne ako pri 30 °C. Zníženie teploty na 4 a 8 °C predĺžilo lag fázu pri všetkých koncentráciách soli. V prítomnosti 12,5 % soli nezaznamenali rast pri žiadnej sledovanej teplote. Jičinská a Havlová (1995) tiež uvádzajú, že L. monocytogenes sa pri optimálnej teplote rozmnožuje ešte pri 10 % soli v prostredí. My sme dosiahli podobné výsledky, L. monocytogenes pri optimálnej teplote a pri 12 % obsahu soli nerástla ani po 7,5 dňoch. Robinson a kol. (1998) sledovali vplyv koncentrácie NaCl na lag fázu a zistili jej veľké predĺženie pri koncentrácii NaCl nad 3 %. My sme pozorovali predĺženie lag fázy od obsahu 6 % NaCl. Rast Listeria monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym pH L. monocytogenes dobré rastie v mierne kyslom, neutrálnom až mierne zásaditom prostredí. Takéto pH má mnoho potravinárskych výrobkov a preto je dôležité bližšie sledovať jeho vplyv na tento patogén. Najlepšie podmienky pre rast boli v LEB bujóne s pH hodnotou 8,0, kedy bola rýchlosť rastu najvyššia (0,187 OD.h-1). Postupným znižovaním pH hodnoty bujónu rastová rýchlosť klesala. Pri pH 5,3 mala hodnotu 10-krát nižšiu (0,019 OD.h-1) ako pri pH 8,0. 121
Lag fáza bola najkratšia pri pH hodnote bujónu 7,3 (3,2 h). Zvyšovaním alebo znižovaním pH nad resp. pod uvedenú hodnotu sa lag fáza postupne predlžovala; pri pH 9 a 5,3 bola 5,5 resp. 5,2 h. Podobne ako lag fáza sa so zmenou pH hodnoty bujónu menil aj čas potrebný na dosiahnutie maximálnej rýchlosti rastu. Pri pH hodnote bujónu 4,8 sa rast nezaznamenal ani po 80 h kultivácie. Rast L. monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznou pH hodnotou ako aj závislosť vypočítaných rastových charakteristík je znázornený na obr. 3 12
0,20
µm λ
M
0,10 0,08
9
0,6
8
0,5
7 6
OD
0,14 0,12
5
0,06 0,04
pH=5,8 pH=5,3 pH=6,2 pH=6,6 pH=7,3 pH=8,0 pH=9,0
0,7
10
λ , M [h]
-1
µ m [O D.h ]
0,8
11
0,18 0,16
0,4 0,3 0,2
4
0,1
3 0,02 0,00 2 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
0,0 0
5
10
pH
15
20
25
30
čas [h]
Obr. 3 Charakteristika rastu L. monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym pH V literatúre sa uvádzajú pre rast limitujúce hodnoty pH 4,5 a 9,0, s optimom v neutrálnej oblasti. V našom experimente sme rast pri pH 4,8 do 80 h nezaznamenali. Robinson a kol. (1998) zistili zanedbateľný vplyv pH na lag fázu okrem hodnoty blízkej nižšiemu limitu pre rast, kde zaznamenali výrazne predĺženie lag fázy. Podobné výsledky sme dosiahli aj v našej práci s rozdielom, že výrazné predĺženie lag fázy sme zaznamenali pri pH blízkych obom limitným hodnotám. Rast Listeria monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym obsahom sorbanu draselného Konzervačné látky (KL) (napr. sorban draselný, benzoán sodný, propionán sodný) sa pridávajú do rady potravín za účelom inhibície nežiaducich baktérií, však používanie chemických KL môžu vyvolať u jedincov rôzne alergické reakcie. Konzumenti teda preferujú aplikáciu skôr prírodných ingrediencii s antioxidačným a antibakteriálnym účinkom. Na obr. 4 je znázornený rast L. monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym obsahom sorbanu draselného. 0,8
0,8
bez prídavku sorbanu draselného 0,1% 0,2% 0,3%
0,7 0,6
0,5% 0,8% 1,0%
0,6 0,4
0,4
OD
OD
0,5 0,3
0,2
0,2 0,1
0,0
0,0 0
2
4
6
8
10
0
12
čas [h]
5
10
15
20
čas [h]
Obr. 4 Rast L. monocytogenes (88/049) v LEB bujóne s rôznym obsahom sorbanu draselného 122
25
30
Pri 1%-nom prídavku sorbanu draselného do LEB bujónu sa zaznamenala najmenšia rastová rýchlosť a bola takmer o polovicu menšia ako v bujóne bez sorbanu draselného. So zvýšovaním sorbanu draselného v bujóne sa rastová rýchlosť znižovala, lag fáza ako aj čas dosiahnutia maximálnej rýchlosti sa predlžovali a pri jeho 1 % prídavku mali hodnotu 5,2 h resp. 7,4 h (obr. 5). El-Shenawy a Mart (1988) sledovali vplyv sorbanu draselného na rast L. monocytogenes v tryptozovom bujóne s pH 5 a 5,6 pri teplote 4 a 35 °C. Zistili, že účinnosť sorbanu draselného sa zvyšovala so znižovaním pH. Pri pH 5 a teplote 13 °C jeho koncentrácia 0,2, 0,25 a 0,3 % zapričinila inhibíciu rastu a inaktiváciu buniek. Vyššie koncentrácie zapričinili komletnú inaktiváciu patogénu počas 117 h pri 21 °C alebo 78 h pri 35 °C. Eklund (1983) uvádza, že inhibičný účinnok nedisociovanej kyseliny sorbovej bol 10-600 krát väčší ako disociovanej, predsa disociovaná forma zapríčinila viac ako 50% inhibíciu rastu pri pH>6 pre väčšinu študovaných mikroorganizmov. 9
0,20 µm λ
8
M
7 6
-1
µm [OD.h ]
0,16 0,14
5
0,12
4
λ, M [h]
0,18
3
0,10 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
2
sorban draselný [%]
Obr. 5 Závislosť špecifickej rastovejrýchlosti (µm), lag fázy (λ) a času (M), v ktorom je špecifická rastová rýchlosť maximálna od prídavku konzervačnej látky v LEB bujóne Záver Listerie sú schopné prežívať a rásť za pomerne náročných podmienok, vrátane nízkeho pH, zvýšeného obsahu soli v prostredí, ako aj v prítomnosti konzervačných látok. Znamená to, že aj malé pôvodné množstvo baktérií sa môže ľahko v potravine pomnožiť, hoci pri jej správnom skladovaní. Sú preto potrebné informácie týkajúce sa vplyvu rôznych vnútorných (pH, konzervačné látky..) a vonkajších (teplota, aw… ) potravinových a environmentálnych parametrov na rast alebo inhibíciu listerií v kontaminovaných potravinách. Práca bola podporená v rámci projektov VEGA 1/0102/03 a Potraviny-kvalita a bezpečnosť 2003SP270280E010280E01 Literatúra: Bruncic, S., Paunovic, L., Radisic, D. (1991) J. Food Prot. 54, 413-417. Eklund, T. (1983) J. Appl. Bacteriol. 54, 384-389. El-Shenawy, M.A., Marth, E.H. (1988) J. Food Prot. 51, 842-847. Francois, K., Devlieghere, F., et al, (2004) Int. J. Food Microbiol. In press. Gibson, A.M., Bratchell, N., Roberts, T.A. (1988) Int. J. Food Microbiol. 6, 155-178. Jičinská, E., Havlová, J. (1995) ÚZPI, Praha, 106s. Razavilar, V., Genigeorgis, C. (1998) Int. J. Food Microbiol. 40, 149-157. Rodriques, J.L., Margarita Medina P.G., Nunez, M. (1994) J. Food Prot. 57, 571-575. Robinson, T.P., Ocio, M.J., Kaloti, A., Mackey, B.M.. (1998) Int. J. Food Microbiol. 44, 83-92. Kontaktná adresa: Ing. Mária Greifová, PhD., STU, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Katedra potravinárskej technológie,Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika.
[email protected]; 00421-2-59325683
123
VYUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE K ANALÝZE MLÉKA Hadra Luboš, Dračková Michaela, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno USE OF NEAR-INFRARED SPECTROSCOPY TO MILK ANALYSIS Summary: The application of near infrared spectroscopy to the analysis of foodstuffs is a relatively recent technique whose use started in the 1960s. This method is used to qualitative and quantitative analysis. Routine analytical methods used for milk composition measurement are destructive, expensive time and labor consuming. NIR has been demonstrated as a successful tool in agriculture and food industry for rapid and accurate compositional analysis. Aim of this study was determination of the total solid and protein in raw milk.
ÚVOD Kvalita mléka závisí na obsahu hlavních nutrientů jako jsou bílkoviny, tuk a laktóza. Rutinní analytické metody používané pro měření složení mléka jsou destruktivní, drahé, pracné a časově náročné. NIR spektroskopie nabízí řadu důležitých výhod před tradičními chemickými metodami. Jedná se o fyzikální, nedestruktivní metodu, vyžadující minimální nebo žádnou přípravu vzorku. V porovnání s tradičními chemickými analýzami, nejsou potřeba žádná činidla a není produkován žádný odpad. Metoda nabízí možnost měřit fyzikální i chemické vlastnosti a několik stanovení může být provedeno najednou. Hlavní nevýhodou je závislost na časově náročných a pracných kalibračních metodách i náročnost ve výběru zpracování dat. Avšak jednou nakalibrovaný NIR spektrometr je jednoduchý na obsluhu. NIR spektroskopie využívá spektrální oblast vymezenou vlnovými délkami 800 – 2500 nm.1,4,5,6 Cílem naší práce je sestavení kalibračního modelu pro stanovení obsahu sušiny a bílkoviny pomocí FT-NIR. METODIKA Byl sledován obsah sušiny a bílkovin v syrovém kravském mléce. Hodnoty pro kalibraci FT-NIR byly stanoveny pro sušinu podle normy ČSN ISO 6731 a bílkovina podle normy ČSN 570536 stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem na přístroji Bentley 2500 (Bentley Instruments, Minnesota, USA). Vzorky mléka byly proměřeny na spektrometru FT-NIR NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. Čas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla měřena na integrační sféře v režimu reflektance s použitím transflektanční kyvety o optické tloušťce 0.1 mm. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509. VÝSLEDKY A DISKUZE Pro vytvoření kalibračního modelu bylo použito 39 vzorků pro bílkovinu, stanovenou metodou dle ČSN 570536 a 42 vzorků pro sušinu stanovenou metodou dle ČSN ISO 6731. Vzorky, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila odchylka ve změřeném spektru, byly vyřazeny pomocí diagnostického nástroje spektrum outlier a leverage. V kalibračním modelu bylo vyřazeno 10 vzorků pro bílkovinu a 6 pro sušinu. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu. 124
Byly zjištěny korelační koeficienty (R) a směrodatné odchylky kalibrace (RMSEC) pro následující parametry mléka: pro bílkovinu R = 0,80937 a RMSEC = 0,197 (obr. 1a), počet PLS faktorů 3, pro sušinu R = 0,87191 a RMSEC = 0,328 (obr. 2a), počet PLS faktorů 3. Pro vytvoření validačního modelu metodou křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako pro kalibraci. Validace ověřuje spolehlivost kalibračního modelu a je charakterizována směrodatnou odchylkou validace (RMSECV). V křížové validaci byly zjištěny následující hodnoty: pro bílkovinu R = 0,72966 a RMSECV = 0,231 (obr.1b), pro sušinu R = 0,82614 a RMSECV = 0,378 (obr. 2b).
Obr. 1 Kalibrační (a) a validační (b) modely pro bílkovinu.
Obr. 2 Kalibrační (a) a validační (b) modely pro sušinu.
Obr. 3 Funkce PRESS pro sušinu (a). Spektrum syrového mléka (b) 125
ZÁVĚR NIR spektroskopie je adekvátní technika k analýze potravin bez preanalytické úpravy vzorků. Úspěšnost při využití NIR spektroskopie závisí nejen na kvalitě přístroje, ale také na referenční metodě, standardní přípravě vzorku, jeho homogenitě a v neposlední řadě na kalibrační metodě. Byla zavedena kalibrační metoda pro stanovení bílkovin a sušiny v syrovém kravském mléce. Použitá literatura: 1. BÜNING-PFAUE, H. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chem., 2003, vol. 82, no. 1, p. 107-115. 2. ČSN 570536 Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem. Vydal Český normalizační institut, Praha, 1999. 3. ČSN ISO 6731 Mléko, smetana a zahuštěné neslazené mléko – Stanovení obsahu celkové sušiny (referenční metoda). Vydal Český normalizační institut, 1997, s.6. 4. ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., NOVOTNÁ, M. NIR spektroskopie a její využití při analýze mléka a mléčných výrobků. Chem. Listy, 2002, vol. 96, no. 5, p. 305-310. 5. TSENKOVA, R., ATANASSOVA, S., ITOH, K., OZAKI, Y., TOYODA, K. Near infrared spectroscopy for biomonitoring: Cow milk composition measurement in a spectral region from 1100 to 2400 nanometers. J. Anim. Sci., 2000, vol. 78, no. 3, p. 515-522. 6. PRAVDOVA, V., WALCZAK, B., MASSART, D. L., KAWANO, S., TOYODA, K., TSENKOVA, R. Calibration of somatic cell count in milk based on near-infrared spectroscopy. Anal. Chim. Acta, 2001, vol. 450, no. 1-2, p.131-141. Práce vznikla za podpory grantového projektu FRVŠ č. 1459 a výzkumného záměru MŠMT Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Kontaktní adresa: Ing. Luboš Hadra Ústav hygieny a technologie mléka Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého 1/3 612 42 Brno e-mail:
[email protected]
126
MĚŘENÍ SYŘITELNOSTI MLÉKA POMOCÍ NEFELO-TURBIDIMETRICKÉHO SNÍMAČE Chládek Gustav, Čejna Vladimír Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně DETERMINATION OF COAGUALTION TIME WITH THE AID OF NEPHELO-TURBIDIMETER Summary: The process of cheese-making is significantly affected not only by milk composition but also by milk processing quality. A coagulation time is the most important milk processing indicator. Good coagulation is essential for the firmness of gel and the final quality of cheese. In order to objectively evaluate milk coagulation time, Ing. Lubomír Přibyla from the Institute of Analytical Chemistry of ASCR developed “Nephelo-turbidimeter of milk coagulation“. The coagulation takes place in cuvettes (volume 4.5 ml). We applied two different methods to test the meter for repeatability of results; they differed in sample preparation and a volume of rennet. The milk was identical in all samples for both methods. We found the following values for A method (50 ml of milk + rennet, mix, pour into cuvette): n = 20, mean = 209 s, min = 204 s, max = 216 s, st. deviation = 3.76, coefficient of var. = 1.80 %. B method (3 ml of milk + rennet into cuvette, mix) gave the following values: n = 20, mean = 122 s, min = 114 s, max = 126 s, st. deviation = 3.88, coefficient of var. = 3.18 %. Our results suggest that “Nephelo-turbidimeter of milk coagulation“ provides reliable values of coagulation time and is fully competent to substitute a present visual method based on the observation of the first para-casein flakes. Úvod Syřitelnost mléka představuje jednu z nejvýznamnějších technologických vlastností mléka. Dobrá syřitelnost podmiňuje efektivní výrobu sýrů jak po stránce kvantitativní (výtěžnost), tak kvalitativní (jakost). Syřitelnost mléka je ovlivněna fyzikálně-chemickými vlastnostmi mléka (např. obsah a genetické varianty kaseinu, poměry minerálních látek, kyselost), které jsou významnou mírou ovlivněny prvovýrobou mléka (plemeno skotu, stádium a pořadí laktace, management chovatelského prostředí, kvalita krmiv, metabolické poruchy, zdravotní stav dojnic). Syřitelnost je vyjadřována jako časový interval od přidání syřidla do mléka do objevení se prvních vloček para-κ-kaseinu. Objevení vloček se často hodnotí tzv. vizuální metodou (visual coagulation-Berridge metod, Berridge, 1952). Tato metoda je ovlivněna subjektivním hodnocením a zkušenostmi pozorovatele a též samotným mlékem. Pro objektivní hodnocení syřitelnosti mléka vyvinul Ing. Lubomír Přibyla z Ústavu analytické chemie AV ČR „Nefelo-turbidimetrický snímač koagulace mléka“. Přednosti tohoto přístroje je objektivizace času syřitelnosti, malý objem vzorku, nízká pořizovací cena, nenáročnost obsluhy a též křivka zaznamenávající celý průběh srážení. Pro zjištění přesnosti tohoto přístroje jsme provedli v laboratoři Ústavu chovu a šlechtění zvířat MZLU v Brně zkoušku opakovatelnosti. Cílem bylo také zjistit rozdíly v opakovatelnosti přístroje při přelívání vzorku se syřidlem do kyvety (metoda A) v porovnání s měřením přímo v kyvetě (metoda B) při různých dávkách syřidla. Materiál a metody, výsledky „Nefelo-turbidimetrický snímač koagulace mléka“ pracuje na principu nefelometrie a turbidimetrie. Optický detektor přístroje převádí intenzitu dopadajícího světla na elektrický signál a velikost napětí na výstupu optického detektoru je funkcí intenzity světla, které na optický detektor dopadá. Během koagulace dochází k úbytku optického signálu (turbidimetrie), 127
což se projeví úbytkem měřeného napětí (Černý et al., 2003). Tento průběh je okamžitě derivován a výsledné vysrážení parakaseinu odpovídá maximální hodnotě derivační křivky. Srážení mléka probíhá ve spektroskopických kyvetách (objem 4,5 ml). Na všechny vzorky bylo použito stejné mléko. Provedli jsme hodnocení dvou metod lišícími se přípravou vzorku a množstvím syřidla. Při metodě A jsme napipetovali do Erlenmayerovy baňky 50 ml mléka, vytemperovali na 35°C a po přídavku 1 ml syřidla (Laktochym 1:5000, MILCOM Tábor, ředění 1:4) jsme začali měřit čas. Po přídavku syřidla je velmi důležité mléko dobře promíchat (nejméně 10 sekund), aby se po následném odlití do kyvety dostalo mléka s konstantním množstvím syřidla. Po přelití mléka do kyvety jsme ji umístili do přístroje a v době, kdy od přídavku syřidla uběhlo 30 sekund, jsme zapnuli přístroj. K výsledném času syřitelnosti jsme připočetli zmíněných 30 sekund. Změřili jsme 20 vzorků. Tato metoda vykázala tyto hodnoty: n = 20, průměr = 209 s, min = 204, max = 216, sm. odchylka = 3,76, var. koeficient = 1,80 %. Naměřené hodnoty ukazuje graf 1. Při metodě B jsme přímo do kyvety napipetovali 3 ml mléka (35 °C), přidali 0,4 ml syřidla (Laktochym, MILCOM Tábor, ředění 1:8), kyvetu uzavřeli, promíchali a ve 30 sekundách od přídavku syřidla jsme zapnuli přístroj. K výslednému času syřitelnosti jsme opět připočetli zmíněných 30 sekund. Změřili jsme 20 vzorků. Metoda B vykázala tyto hodnoty: n = 20, průměr = 122 s, min = 114, max = 126, sm. odchylka = 3,88, var. koeficient = 3,18 % . Srovnání s metodou A je v tabulce I. Naměřené hodnoty ukazuje graf 2.
Graf 1: Zkouška opakovatelnosti m etoda A
160
240
140
220
120
200
100
180
(s)
(s)
Graf 2: Zkouška opakovatelnosti metoda B
80
140
40
120 100
20
metoda
A B
160
60
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
pokus
pokus
ČS (s)
ČS (s)
n 20 20
průměr 209 122
min 204 114
max 216 126
Sx 3,76 3,88
Vx (%) 1,80 3,18
Tabulka I Statistické hodnoty metody A a B V průběhu měření přístroj zaznamenává derivační křivkou průběh srážení. Křivky vybraných vzorků metody A jsou znázorněny na grafu 3. Derivační křivka vykazuje při srážení různých mlék jisté odlišnosti, a proto bude možná zajímavé její další analyzování. Na grafu 4 jsou prezentovány některé typy derivační (srážecí) křivky individuálních vzorků mléka získané z jiného projektu měření. 128
Graf 3: Křivky vybraných vzorků mléka - metoda A 1600 1400 1200
(∆mV/∆t)
1000 800 600 400 200
270
264
258
252
246
240
234
228
222
216
210
204
198
192
186
180
174
168
162
156
150
144
138
132
0 (s)
Graf 4: Křivky srážení individuálních vzorků mléka, získané z jiného projektu měření (křivka A = dojnice plemene montbeliarde, křivka B = dojnice plemene holštýnského, křivka C = mléko, které obsahovalo 5 258 000 somatických buněk) 3500 3000
2000
A B C
1500 1000 500 0 -500
12 30 48 66 84 102 120 138 156 174 192 210 228 246 264 282 300 318 336 354 372 390 408 426 444 462
(∆mV/∆t)
2500
(s)
129
Závěr Na základě našeho sledování se domníváme, že „Nefelo-turbidimetrický snímač koagulace mléka“ poskytuje spolehlivé hodnoty času syřitelnosti a může nahradit vizuální metodu odečítání prvních vloček syřitelnosti. Předností je také vytvořená křivka srážení, která umožní hlubší studium syřitelnosti mléka. Použitá literatura 1. Berridge, N., J.: An improved Metod of observing the clotting of milk containing rennin. J. Dairy Res. 1952, 19:328-329 2. Černý, V., Klepetář, J., Přibyla, L.: Měření koagulace mléka působením syřidla. Sborník: Mléko a sýry 2003. s 42 - 48 Kontaktní adresa:
[email protected],
[email protected],
[email protected]
130
OBSAH VÁPNIKA V SUROVOM MLIEKU A MLIEČNYCH VÝROBKOCH MLIEKARNE VYRÁBAJÚCEJ TVRDÉ, DLHOZREJÚCE SYRY Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Výskumný ústav živočíšnej výroby, Nitra THE CALCIUM CONTENT IN RAW MILK AND MILK PRODUCTS OF MILK FACTORY PRODUCING HARD, LONG TIME RIPENING CHEESES Summary: Directive 92/46 EC laying down the health rules for the production and placing on the market of milk and milk based products, prescribes requirements that must be met by raw milk used for the human food production. Slovak national standard STN 57 0529 is fully approximated. Raw milk according to this rules used for the cheese production contains 0,93g of Calcium per liter in average. The content of Clacium in milk based products depends on technology of milk processing. V práci sa zaoberáme štúdiom vzťahov a porovnaním výsledkov stanovenia základných a niektorých doplnkových ukazovateľov kvality mlieka s požiadavkami na jeho kvalitu podľa STN 57 0529 „Surové kravské mlieko na mliekárenské ošetrenie a spracovanie“. Táto norma bola aproximovaná so Smernicou EU 92/46 vyhlasujúcou hygienické predpisy pre výrobu a predaj mlieka a mliečnych výrobkov. Uvádzame obsah vápnika v nakupovanom mlieku a vo výrobkoch mliekarne vyrábajúcej tvrdé, dlhozrejúce syry Materiál a metódy Počas 11 mesiacov roka sme 1 krát mesačne sledovali bazénové vzorky mlieka 12 poľnohospodárskych podnikov, ktoré sú vytypované mliekarňou spracujúcou mlieko na tvrdé, dlhozrejúce syry ako podniky so stabilnou výberovou kvalitou suroviny, a ktorých mlieko sa na tento účel zváža samostatne. Týmto sú intenzívne motivované k sústavnej starostlivosti o kvalitu svojej produkcie. Vzorky tak boli odoberané z chovov, ktoré produkujú mlieko zodpovedajúce najmenej 1. triede kvality určenej podľa počtu somatických buniek, celkového počtu mikroorganizmov a s negatívnym výskytom inhibičných látok. To znamená, že v práci je vyhodnotené kvalitné mlieko zodpovedajúce záväzným požiadavkám STN 57 0529. Prevládajúce chované plemeno v týchto podnikoch je holsteinské a slovenské strakaté. Vyšetrili sme 132 bazénových vzoriek surového kravského mlieka pripraveného na dodávku do mliekárne a ošetreného podľa STN 46 6104, odobratých podľa Metodických pokynov MP SR. Obsah vápnika v mlieku a v mliečnych výrobkoch bol stanovený pomocou Atómového absorpčného spektrometra UNICAM 939 Solar. Výsledky a diskusia V tabuľke I sú uvedené výsledky a základné štatistické údaje zloženia a vlastností sledovaných vzoriek mlieka. V tejto tabuľke uvádzame i minimálne hodnoty pre jednotlivé zložky predpísané normou pre surové kravské mlieko, označené ako limity STN. Minimálny obsah sušiny, laktózy a minerálnych látok je odvodený výpočtom z hodnôt beztukovej sušiny (BTS), tuku a základnej hodnoty bielkovín pre účely speňažovania.
131
Tabuľka I Základné štatistické údaje výsledkov sledovaných bazénových vzoriek mlieka n=132 priemer min max Št. odch. var. Koef. limit STN 57 0529
tuk
bielk. lakt. BTS popol
pH
°SH
TTM
4.08 3.20 5.06 0.30 7.34
g/100g mlieka 3.23 4.78 8.84 2.94 4.22 7.71 3.63 5.04 9.65 0.13 0.11 0.31 3.90 2.22 3.55
0.72 0.55 0.88 0.05 6.71
kyslosť 6.52 6.57 6.10 5.70 7.30 7.50 0.25 0.33 3.85 5.05
m°C -513 -533 -496 7.32 1.43
3.30
2.80
0.70
6.5-6.8* 6.2-7.8
-515
4.60 8.50
*
CPM
PSB
tis/ml mlieka 31 175 4 44 329 617 46.12 87.36 147.04 49.86 100
400
Ca g/l 0.93 0.59 1.36 0.09 9.90 1.20
optimálne hodnoty
Ako vidno z výsledkov uvedených v tab.1, obsah sušiny vyšetrovaných vzoriek mlieka bol priemerne 12.92 g/100g. Podľa normy na surové kravské mlieko STN 57 0529, by sčítaním minimálneho obsahu tuku a BTS sušina mala byť minimálne 11.8 g/100g. Obsah bielkovín bol v priemere 3.23 g/100g, norma uvádza min. obsah bielkovín 2.8 g/100g, avšak základný obsah bielkovín na speňažovanie mlieka je 3.2 g/100g. Pretože zo živočíšnych bielkovín sa z metabolického hľadiska vďaka zloženému žalúdku prežúvavcov a ich schopnosti tráviť pomocou mikrobiologickej fermentácie v bachore vlákninu a zbudovávať aminoskupiny amoniaku do aminokyselín, najracionálnejšie vyrábajú práve bielkoviny mlieka prežúvavcov, je výhodné podporovať spotrebu mlieka a mliečnych výrobkov na báze bielkovín. Mliečne bielkoviny zaujímajú významné postavenie medzi živočíšnymi bielkovinami i z nutričného hľadiska, pretože majú priaznivé zloženie aminokyselín. V porovnaní s vaječným bielkom majú vyšší obsah lyzínu a tryptofanu. Bielkoviny mlieka tvoria viacero frakcií, z ktorých najdôležitejšie sú kazeín (pribl. 80%), a srvátkové bielkoviny, albumíny a globulíny. Z technologického hľadiska má najväčší význam obsah kazeínu v mlieku, ktorý sa využíva na výrobu syrov. Obsah laktózy bol v priemere 4.78 g/100g. Z hodnôt uvádzaných v norme pre BTS (8,5 g/100g) a základný obsah bielkovín pre speňažovanie mlieka (3.2 g/100g) vychádza, že minimálny obsah laktózy by mal byť 4.6 g/100g. Mliečny cukor – laktóza má význam pre technológiu kyslomliečnych produktov, ktorých výroba spočíva v mikrobiálnej fermentácii laktózy na kyselinu mliečnu. Vznikom kyslého prostredia sa mliečne bielkoviny zrážajú a vytvárajú gélovitú konzistenciu. Priemerný obsah tuku bol 3.88 g/100g. Norma uvádza min. obsah tuku 3.2 g/100g. Na speňažovanie sa ako základná hodnota udáva 3.6 g/100g. Nutričná hodnota mliečneho tuku spočíva v širokom spektre mastných kyselín, čo mu dodáva charakteristickú chuť, v obsahu esenciálnych mastných kyselín s vyšším počtom konjugovaných násobných väzieb a v tom, že je nositeľom vitamínov rozpustných v tuku, najmä vitamínu A, ktorý pochádza zo zelených krmív. Obsah popolovín bol v priemere 0.72 g/100g, pričom podľa normou predpísanej BTS je potrebné aby dosahoval minimálne 0.7 g/100g. Hodnota BTS bola v priemere 8.84 g/100g, čo je taktiež nad minimálnym obsahom BTS 8.5 g/100g uvádzaným normou. Priemerná hodnota teploty tuhnutia mlieka bola -513 m°C, norma predpisuje max. -515 m°C, čo by mohlo naznačovať určité zriedenie mlieka počas získavania v prvovýrobe. Keď porovnáme priemerné hodnoty jednotlivých sledovaných ukazovateľov s predpísanými hodnotami vidíme, že v mlieku ktoré sme v práci sledovali, boli podmienky normy splnené. Zistený obsah tuku a bielkovín vyhovuje i základným hodnotám pre účely speňažovania mlieka. V priebehu pokusu sa však vyskytli hodnoty nedosahujúce požadovanú úroveň, čo odzrkadľujú zistené minimá v obsahu tuku, laktózy, sušiny, BTS, popolovín, maximum v TTM, ako aj hodnoty presahujúce povolený rozsah pri pH, a°SH. Tieto výsledky potvrdzujú určité problémy s dosahovaním štandardného zloženia mlieka i v chovoch s dobrou hygienickou kvalitou mlieka, ale vzhľadom k tomu, 132
že sa vyskytli vždy u inej vzorky, a nie súčasne, nepoukazujú na podozrenie z pridanej vody, a ich výskyt je iba sporadický. Z hygienického hľadiska môžeme hodnotiť sledovaný súbor ako výberovej kvality, keď priemerný celkový počet mikroorganizmov bol 31tis./ml mlieka a počet somatických buniek 175tis./ml mlieka. Mikroorganizmy prechádzajú do mlieka z dojacích zariadení, z podstielky, výkalov a krmiva. Kyslosť mlieka je základnou vlastnosťou, ktorá charakterizuje čerstvosť mlieka a ochranu pred pôsobením mikroorganizmov. Pretože mlieko má pufrovacie schopnosti, aktívna kyslosť pH sa mení pomalšie, ako titračná, °SH. Vylúčenie mlieka od nemocných a liečených dojníc, a podmienka stanovujúca prípustný počet somatických buniek, ktoré sa zvyšujú pri zápaloch vemena, ako aj testovanie mlieka na obsah inhibičných látok a schopnosť kysnutia jogurtovou kultúrou sú opatrenia zamerané na ochranu spotrebiteľa pred nežiadúcou konzumáciou antibiotík a bakteriálnych toxínov, ako aj na zabezpečenie nevyhnutných technologických vlastností mlieka pre jeho ďalšie spracovanie. Niektoré ustanovenia STN sú zamerané na ochranu mlieka pred porušením vodou – obsah beztukovej sušiny (BTS) a teplota tuhnutia mlieka (TTM), ktorá je závislá od obsahu minerálnych látok. Obsah minerálnych látok vyjadrený množstvom popola po zotlení je geneticky determinovaný, čo znamená, že v prípade ich nedostatku dojnica mobilizuje hlavne rezervy vápnika v kostre a znižuje produkciu mlieka. Obsah vápnika v sledovaných vzorkách bol priemerne 0,93g/liter mlieka, nižší ako uvádza doplnkový ukazovateľ normy. Treba však poznamenať, že tento ukazovateľ patrí k najstarším, od roku 1988 nebol revidovaný, je nepovinný, žiadna mliekareň ho nemá zavedený v kontrole dodávaného mlieka, a jeho znížená hodnota je zrejme daňou za čoraz vyššiu úžitkovosť dojníc. Tabuľka II Obsah sledovaných zložiek v mliečnych výrobkoch Mliečny výrobok Maslo Moravský blok Primátor Eidam blok 40% Eidam blok 25% Smotana 33% Tvaroh mäkký Mlieko plnotučné Mlieko materské
Tuk
Bielkoviny
g/100g pôv. hmoty 80.4-82.6 0.70-1.40 46.6-47.0 24.1-25.8 46.7-46.9 28.2-29.0 41.0-41.2 28.9-30.2 26.1-26.5 27.1-35.2 31.9-33.1 2.23-2.43 2.93-3.09 19.4-20.1 3.30-3.50 3.10-3.40 4.30-4.70 0.99-1.10
Vápnik Ca g/1kg pôv. hmoty 0.21-0.22 7.26-7.49 7.61-7.65 7.66-7.81 9.65-10.20 0.74-0.79 1.04-1.05 0.85-1.03 0.30-0.38
Mlieko je stabilným zdrojom vápnika v ľudskej výžive. Vápnik sa v mlieku nachádza v dvojsýtnych a trojsýtnych fosforečnanoch, ktoré spájajú kazeínové komplexy vo forme kazeínanu vápanatého, čo podmieňuje jeho schopnosť vytvárať pôsobením syridla (proteolytický enzým) pevnú zrazeninu bez zmeny kyslosti. Vápnik teda pri výrobe syrov prechádza do syreniny a spôsobuje, že syry získavané pomocou sýrenia sú taktiež bohatým zdrojom vápnika (7-10g/kg tvrdého syra v našich vzorkách), čo dokumentuje tabuľka II, v ktorej sú výsledky mliečnych výrobkov tej istej mliekárne, ktorej zvozný rajón sme sledovali. Naopak, pri skysnutí mlieka pomocou mliečnych kultúr sa v momente zrážania kazeínu vápenaté soli z kazeínu odštiepia, čo spôsobuje, že výrobky vyrábané z tvarohu získavaného kyslomliečnym zrážaním a odhrievaním srvátky majú podstatne nižší obsah vápnika (1-1.05g/kg tvarohu v našich vzorkách), i keď sú hodnotným zdrojom bielkovín. 133
Obsah vápnika (Ca) [g/100g pôvodnej hmoty]
1,2 1 0,8
Eidam blok 25% y = 0,0282x R2 = 0,9863
Moravský blok
Primátor
Eidam blok 40%
0,6 0,4 0,2
Mlieko plnotučné, Tvaroh mäkký Smotana 33% Mlieko materské 0 Maslo 0 5 10 15 20 25 Obsah bielkovín [g/100g pôvodnej hmoty]
30
35
Obr. 1 Obsah vápnika vo vzťahu k obsahu bielkovín v sledovaných mliečnych výrobkoch. Na obrázku 1 je znázornený vzťah obsahu bielkovín a vápnika v sledovaných mliečnych výrobkoch. Pomer vápnika k bielkovinám je v mlieku a vo výrobkoch takmer stabilý a s 98%-nou pravdepodobnosťou tvorí 2.82%. Taktiež materské mlieko, ktoré uvádzame pre ilustráciu zodpovedá tomuto vzťahu. Obsah vápnika v tvarohu v pomere k bielkovinám je od regresnej čiary výrazne vzdialený. Záver Mlieko je významná potravina podporujúca zdravie so širokými možnosťami spracovania na pestrý sortiment výrobkov. V oblasti so zvýšenou starostlivosťou o mlieko je možné produkovať mlieko výberovej kvality, čo je pozitívny poznatok pri našon vstupe do EU. Vzhľadom k tomu, že mlieko je živnou pôdou pre mikroorganizmy, je to surovina ktorú je potrebné čo najrýchlejšie spracovať na čo najtrvanlivejšie výrobky. Výsledky kvalitatívnych skúšok sú k dispozícii až keď je mlieko spracované. Celý systém kontroly musí teda pracovať ako prevencia. Iba sústavná systematická starostlivosť a kontrola kvality mlieka môže zabezpečiť, aby bola čo najmenšia pravdepodobnosť nekvalitnej dodávky a jej spracovania. Použitá literatúra: 1. STN 57 0529 Surové kravské mlieko na mliekárenské ošetrenie a spracovanie 2. STN 57 0530 Metódy skúšania mlieka a tekutých mliečnych výrobkov. 3. STN 57 0538 Stanovenie teploty tuhnutia mlieka pomocou mliečnych kryoskopov. Kontaktná adresa: Ing. Katarína Kirchnerová, PhD, Ing. Vladimír Foltys, PhD, Ústav kvality živočíšnych produktov VÚŽV, 949 92 Nitra, Hlohovská 2.
[email protected]
134
VPLYV LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 A TEPLOTY NA DYNAMIKU RASTU BACILLUS CEREUS Koreňová Janka1), Lauková Denisa2), Valík Ľubomír2), Petríková Jana1) 1 Oddelenie hygieny, sanitácie a potravinárskej mikrobiológie, Výskumný ústav potravinársky Modra, Slovensko 2 Katedra výživy a hodnotenia potravín, STU Bratislava, Slovensko EFFECT LACTOBACILLUS RHAMNOSUS VT1 AND TEMPERATURE ON GROWTH DYNAMICS OF BACILLUS CEREUS Summary: The growth dynamics of psychrotrophic strain Bacillus cereus PM1 was observed in artificial inoculated UHT milk under the condition of 8°C, 11°C and 12°C temperature and the addition of 18 hours culture of Lactobacillus rhamnosus VT1 in the amount of 0 – 10% (v/v). The growth rate of B. cereus in milk with 5% L. rhamnosus VT1 at 8°C was 7 times lower and generation time was 3 times shorter than the growth rate of B. cereus in milk without L. rhamnosus VT1. The increasing of volume of inoculated culture L. rhamnosus VT1 was caused more inhibited growth of B. cereus PM1 with the longer lag phase (6 days) and the death cells. The growth rate of B. cereus PM1 was decreased with decreased cultivation temperature and increased inoculum concentration of L. rhamnosus VT1. This relation was described in the secondary mathematical modelling by this equation: µ = -0,0826+0,01409c+0,01399T-0,0022Tc. The metabolites of L. rhamnosus VT1 had a significant influence on the growth rate of B. cerus PM1 at lowest inoculum concentration. It was not observed insignificant influence on the duration of lag phase of B. cereus PM1. Úvod Bacillus cereus je grampozitívna aeróbna spórotvorná tyčinka je potvrdená ako prirodzený kontaminant mlieka a následne aj mliečnych produktov ošetrených pasterizáciou [1,2,3].Táto problematika nadobúda na význame z dôvodov termorezistencie jeho spór, psychrotrófnych vlastností niektorých kmeňov [1,3,5,6] a produkcie dvoch enterotoxínov [1,3,6]. Technologicky nežiadúce sú aj jeho proteolytické enzýmy, ktoré môžu vyvolať sladké zrážanie mlieka, smotany a miešaných jogurtov [3].Sú prezentované štúdie inhibície rastu kmeňov B. cereus v mlieku vplyvom bakteriocínov [1,6], a tiež vplyvom baktérií mliečneho kysnutia vrátane Lactobacillus rhamnosus [3]. Pre naše pokusy sme použili kmeň L. rhamnosus VT1, u ktorého bola zatiaľ študovaná a dokázaná antifungálna aktivita [7,8].
Obr. 1 Bacillus cereus a Lactobacillus rhamnosus. (Dr. M. Kaláb, Agriculture and Agri-food, Canada). 135
Materiál a metódy Mikroorganizmy: Kmeň Bacillus cereus PM1 bol vyizolovaný z pasterizovaného mlieka s obsahom tuku 15 g/l vyočkovaním na povrch tuhej selektívno-diagnostickej pôdy podľa Mossela. Vyrastené kolónie boli mikrobiologicky posúdené a potvrdené biochemickými testami podľa STN ISO 7932 [9]. Kmeň Lactobacillus rhamnosus VT1 izolovaný z tatárskej omáčky je zaradený do Zbierky mikroorganizmov ÚTMT VŠCHT Praha pod č. DMF 30105 a bol zapožičaný Doc. Ing. M. Plockovou CSc. Z ÚTMT VŠCHT Praha. Príprava suspenzií a inokulácia: Na prípravu suspenzií buniek B. cereus PM1 bola použitá sterilná peptónová voda. Kmeň L. rhamnosus VT1 bol kultivovaný v MRS bujóne pri 37°C 18 hodín. Obe štandardne pripravené suspenzie boli použité na inokuláciu UHT mlieka s počiatočnou denzitou B. cereuis PM1 ≤103 KTJ/ml a koncentráciou inokula L. rhamnosus VT1 od 1 do10% (v/v). Matematické modelovanie: Dynamika rastu B.cereus PM1 v zámerne inokulovanom UHT mlieku pri teplote 8, 10 a 12±0,5°C bola sledovaná ako závislosť počtu buniek od času pre jednotlivé počiatočné koncentrácie L. rhamnosus VT1 použitím D-modelu [10]. Závislosť rastových parametrov B. cereus PM1 od teploty a koncentrácie pridaného inokula L. rhamnosus VT1 bola modelovaná použitím Essential Regression Software.
Výsledky a diskusia Rastová rýchlosť B. cereus PM1 pri teplote 8°C (obr. 2) sa so zvyšujúcou sa koncentráciou inokula 18 h kultúry L. rhamnosus VT1 znižovala a trvanie lag fázy sa pozvoľna predlžovalo. Maximálna priemerná hodnota rastovej rýchlosti B. cereus PM1 pri 8°C bola pozorovaná v UHT mlieku bez prídavku laktobacila µ=0,031 h-1, generačný čas bol vypočítaný na 9,7 h. S prídavkom 5% (v/v) laktobacila sa rastová rýchlosť B. cereus PM1 znížila 7 krát a generačný čas sa predĺžil 3 krát. Dvoj- až trojnásobné zníženie rastovej rýchlosti a trojnásobné predĺženie generačného času B. cereus PM1 bolo zaznamenané v kultivácii pri teplote 10°C s prídavkom 5% (v/v) laktobacila, resp. pri teplote 12°C a prídavku L. rhamnosus VT1 v množstve 4% (v/v). Získané rastové parametre sa stali vstupnými údajmi pre sekundárne matematické modelovanie, výsledkom ktorého je rovnica závislosti rastovej rýchlosti B. cereus PM1 od koncentrácie inokula kultúry L. rhamnosus VT1 pre tri sledované teploty (8, 10, 12°C): µ = -0,0826+0,01409c+0,01399T-0,0022Tc a následne jej trojrozmerné zobrazenie (obr.3).
136
1%
8
1%
log KTJ.ml
-1
7
2%
6
2%
5
3% 3%
4
4%
3
4%
2
5% 5%
1
10%
8 °C
0
10% 0
48
96
144
192 č a s [h ]
240
288
336
0%
8
0%
log KTJ.ml
-1
7
2%
6
2%
5
3% 3%
4
4%
3
4%
2
5% 5%
1
7%
1 0 °C
0 0
48
96
č as [h ]
144
192
240
8
0%
7
0% 1%
6 log KTJ.ml-1
7%
1%
5
2%
4
2%
3
3%
2
3% 4%
1
12 °C
0 0
4% 30
60
č as [h]
90
120
150
7% 7%
Obr. 2 Rastové krivky B. cereus PMI1 v závislosti od počiatočnej koncentrácie pridaného inokula L. rhamnosus VT1 pri teplote 8°C, 10°C a 12°C v UHT mlieku.
137
-0 ,0 4 --0 ,0 2 7
-0 ,0 2 7 --0 ,0 1 4
-0 ,0 1 4 --0 ,0 0 1
-0 ,0 0 1 -0 ,0 1 2
0 ,0 1 2 - 0 , 0 2 5
0 ,0 2 5 - 0 , 0 3 8
0 ,0 3 8 - 0 , 0 5 1
0 ,0 5 1 - 0 , 0 6 4
0 ,0 6 4 - 0 , 0 7 7
0 ,0 7 7 - 0 , 0 9
0 ,0 9 0
0 2
-1
12.0
11.6
10.7
10.2
9.8
8.9
8.4
8.0
9
9.3
7
11.1
4 konc. L .rh .[% v /v ]
B.c. [h ]
0 ,0 6 4 0 ,0 5 1 0 ,0 3 8 0 ,0 2 5 0 ,0 1 2 - 0 ,0 0 1 - 0 ,0 1 4 - 0 ,0 2 7 -0 ,0 4 0
rast.rýchlosť
0 ,0 7 7
T e p lo ta [°C ]
Obr. 3 Grafické znázornenie závislosti rastovej rýchlosti B. cereus PM1 od teploty inkubácie a počiatočnej koncentrácie L. rhamnosus VT1 v UHT mlieku.
Záver Predložená práca sa zameriava na sledovanie vplyvu kultúry Lactobacillus rhamnosus VT1 na rast kontaminanta Bacillus cereus PM1 v zámerne inokulovanom UHT mlieku využitím princípov prediktívnej mikrobiológie. Pri sledovaných teplotách uchovávania bola pozorovaná parciálna inhibícia dynamiky rastu B. cereus PM1 ako výsledok kombinácie účinku nízkej teploty a metabolitov laktobacila.V štúdiu vlastností B. cereus PM1 sa bude pokračovať v ďalších experimentoch zameraných na účinok vyšších kultivačných teplôt na oba mikroorganizmy a ich metabolizmus.
Použitá literatúra: 1. Dufrenne, J., Bijward, M., Giffel, M., Beumer, R., Notermans, S.: Characteristics of some psychrotrophic B. cereus isolates. International Journal of Food Microbiology, 27, 1995, 175183 2. Petríková, J., Lauková, D., Koreňová, J., Valík, Ľ.: Dynamika rastu B. cereus a CPM v pasterizovanom mlieku so 7-dňovou dobou trvanlivosti. Sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2004, Česká společnost chemická, Praha, 2004,163-166 3. Røssland, E., Borge, G. I. A., Langsrud, T., Sørhaug, T.: Inhibition of B. cereus by strains of Lactobacillus and Lactoccocus in milk. International Journal of Food Microbiology, 89, 2003, 205-212 138
4. Simmonds, P., Mossel, B. L., Intaraphan, T., Deeth, H. C.: Heat resistance of Bacillus spores when adhered to stainless steel and its relationship to spore hydrophobicity. Journal of Food Protection, 66 (1), 2003, 2070-2073 5. Guinebretiere, M. H., Girardin, H., Dargaignaratz, C., Carlin, F., Nguyen-The, C.: Contamination flows of Bacillus cereus and spore-forming aerobic bacteria in cooked, pasteurised and chilled zucchini purée processing line. International Journal of Food Microbiology, 82, 2003, 223-232 6. Faille, Ch., Membre, J. M., Kubaczka, M., Gavini, F.: Altered ability of Bacillus cereus spores to grow under unfavourable condition following heat treatment during sporulation. Journal of Food Protection 65 (12), 2002, 1930-1936 7. Plocková, M., Chumchalová, J., Giesová, M., Boušková, O.: Antifungal effectiveness of Lactobacillus rhamnosus VT1 at different temperatures. Advances in Food Science, 26 (2), 2004, 64-68 8. Lauková, D., Valík, Ľ., Görner, F., Petríková, J.: Effect of Lactobacillus rhamnosus VT1 and temperature on growth dynamics of Candida maltosa YP1. Book of Abstracts 2ndCentral European Congress on Food, Budapest, April 2004, 218 9. STN ISO7932 (5600830) Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na stanovenie počtu baktérií B. cereus. Metóda počítania kolónií kultivovaných pri 30°C, 1998 10. Baranyi, J., Roberts, T. A., McClure, P.: A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 10, 1993, 43-59
Kontaktná adresa: Ing. Janka Koreňová, Výskumný ústav potravinársky, Štefánikova 45, 900 01 Modra, Slovensko
[email protected] Táto práca bola podporovaná štátnym podprogramom výskumu a vývoja „Potraviny - kvalita a bezpečnosť“, č. 2003SP270280E010280E01
139
FENOTYPICKÉ ROZLIŠENÍ PODDRUHŮ LACTOCOCCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS A LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. CREMORIS Kučerová Kateřina, Kozáková Drahomíra, Šviráková Eva, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze PHENOTYPICAL SUBSPECIES DIFFERENTIATION OF LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS AND LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. CREMORIS Summary: Only the strain NIZO B33 was characterized on the basis of phenotypical properties as Lactococcus lactis subsp. cremoris out of the collection of 20 lactococcal strains. Remaining 19 strains were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis. Phenotypical differentiation of L. lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris on the basis of hydrolysis of arginine, fermenation of citrate, tolerance to NaCl, pH and methylene blue was obvious. Phenotypical differentiation of lactis and cremoris subspecies on the basis of their tolerance to temperatures and fermentation of carbohydrates was less obvious. Úvod Pro zajištění konstantní kvality vyráběných fermentovaných mléčných výrobků (sýrů, jogurtů, másla atd.) je nutné přesně charakterizovat složení a vlastnosti použité zákysové kultury, jejíž velmi významnou součást tvoří laktokoky. Za tímto účelem se provádí fenotypická charakterizace dané kultury. Vzhledem k tomu, že u laktokoků může docházet ke ztrátě či naopak získání některých nových fenotypických vlastností (např. schopnosti fermentace ribosy nebo využívání argininu u kmenů L. lactis subsp. cremoris), které mohou sloužit k rozlišení poddruhů L. lactis subsp. lactis a L. lactis subsp. cremoris, je fenotypizace ne zcela dostačujícím faktorem k rozdělení těchto dvou poddruhů [1]. Z tohoto důvodu byly vyvinuty genotypické metody (polymerasová řetězová reakce (PCR), ribotypizace [2], fluorescenční in situ hybridizace (FISH) [3], které umožňují přesnější rozlišení těchto mlékařsky významných poddruhů laktokoků. Cíl práce Cílem práce bylo provést fenotypickou charakterizaci 20 vybraných kmenů L. lactis. Z fenotypických vlastností byla zjišťována růstová aktivita laktokoků v bujónu GM17 a odstředěném mléce, fermentace vybraných sacharidů, tolerance k vybraným teplotám, pH, NaCl a methylenové modři. Dále byla sledována schopnost kmenů L. lactis hydrolyzovat arginin a fermentovat citrát. Materiál a metody Použité bakteriální kmeny Bezplasmidové kmeny: L. lactis subsp. cremoris MG 1614, L. lactis subsp. lactis IL 1403 Multiplasmidové kmeny: L. lactis subsp. lactis NIZO R5, L. lactis subsp. lactis NCDO 2054, L. lactis FI 5876, L. lactis subsp. lactis LCC 416, L. lactis subsp. lactis LCC 731, L. lactis subsp. lactis LTM 32 Transkonjugované kmeny: L. lactis T LTM 32.6 a T LTM 32.7, L. lactis T LCC 416.7 a T LCC 416.8, L. lactis T LCC 731.4 a T LCC 731.9 Izolované kmeny Lactococcus sp.: izoláty ze syrového mléka (neléčená dojnice trpící mastitidou, kravín Hostomice, Česká republika) L. lactis HMM 32, L. lactis HMM 61, L. lactis HMM 62, L. lactis HMM 81 Jiné bakteriální kmeny: L. lactis subsp. lactis NIZO B643, L. lactis subsp. cremoris NIZO B33. Kultivace použitých kmenů L. lactis Kmeny L. lactis se kultivovaly v M17 bujónu [4] s glukosou (0,5 % hm.) (GM17 bujón) na místo laktosy při teplotě 30 °C po dobu 16 h za aerobních podmínek. 140
Růstová aktivita kmenů L. lactis Počet laktokoků se stanovil plotnovou metodou [5] (technikou přelivu). Kultivace probíhala na M17 agaru s glukosou (0,5 % hm.) (GM17 agaru) při teplotě 30 °C po dobu 72 h. Stanovení fermentace uhlíkatých substrátů kmeny L. lactis Fermentace vybraných uhlíkatých substrátů u jednotlivých kmenů byla stanovena na McKayově agaru s indikátorem BCP (0,4 % hm.) [6]. Sledování tolerance kmenů L. lactis k teplotě Kmeny L. lactis se rozočkovaly na povrchy Petriho misek s GM17 agarem a kultivovaly při dané teplotě (10, 30, 40 a 45 °C) po dobu 16 h. Sledování tolerance kmenů L. lactis k pH Kmeny L. lactis se rozočkovaly na povrchy Petriho misek s GM17 agarem s upraveným pH (9,2 a 9,6) a kultivovaly se při teplotě 30 °C po dobu 16 h. Sledování tolerance kmenů L. lactis k NaCl Kmeny L. lactis se rozočkovaly na povrchy Petriho misek s GM17 agarem a s experimentálně zvolenými koncentracemi NaCl (2, 4, a 6,5 % hm.) a kultivovaly se při teplotě 30 °C po dobu 16 h. Sledování růstu kmenů L. lactis k přítomnosti methylenové modři Kmeny L. lactis se rozočkovaly do zkumavek s roztokem obnoveného sušeného odstředěného mléka (11 % hm.) s přídavkem methylenové modři (0,1 % hm.) a kultivovaly při teplotě 30 °C po dobu 1 až 5 dnů. Hydrolýza argininu kmeny L. lactis Detekce pomocí Nesslerova činidla Zkumavky s bujónem s argininem se zaočkovaly kmeny L. lactis a následně se kultivovaly při teplotě 30 °C po dobu 1 až 5 dnů. V případě nárůstu kmenů se kapka kultury přenesla do jamky mikrotitrační destičky a přidala se k ní jedna kapka Nesslerova činidla a sledoval se vznik žlutého zbarvení. Detekce pomocí TTC (2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid) Stanovení produkce amoniaku z argininu se provedlo podle [7]. Fermentace citrátů u kmenů L. lactis Stanovení fermentace citrátů se provedlo podle [8, 9]. Výsledky U kmenů L. lactis se počet laktokoků v GM17 bujónu po jednorázových kultivacích při teplotě 30 °C po dobu 16 h pohyboval v rozmezí řádů 108 až 109 JTK.ml-1, a po jednorázových kultivacích v odstředěném mléce při teplotě 30 °C po dobu 16 h pohyboval v řádu 108 JTK.ml-1. Všechny kmeny L. lactis fermentovaly glukosu, fruktosu, mannosu a maltosu (0,5 % hm.). Laktosu (0,5 % hm.) fermentovaly všechny kmeny kromě kmenů L. lactis MG 1614, IL 1403, FI 5876 a kromě všech transkonjugovaných kmenů L. lactis (T LTM 32.6, T LTM 32.7, T LCC 416.7, T LCC 416.8, T LCC 731.4 a T LCC 731.9). Sacharosu (0,5 % hm.) fermentovaly všechny kmeny kromě kmenů L. lactis MG 1614, IL 1403, HMM 32, HMM 61, HMM 62, HMM 81 a kromě kmene L. lactis NIZO B643. Ribosu (0,5 % hm.) fermentovaly všechny kmeny kromě kmenů L. lactis MG 1614, FI 5876, kromě všech transkonjugovaných kmenů L. lactis a kromě kmene L. lactis subsp. cremoris NIZO B33 (výsledky pro vybrané kmeny L. lactis fotograficky znázorněny na obrázku 1). Galaktosu (0,5 % hm.) fermentovaly všechny kmeny kromě kmene L. lactis subsp. cremoris NIZO B33. Salicin fermentovaly pouze kmeny L. lactis IL 1403 a L. lactis subsp. cremoris NIZO B33. Xylosu a rafinosu fermentoval pouze kmen L. lactis IL 1403. 141
Obr. 1 Fermentace ribosy (0,5 % hm.) vybranými kmeny L. lactis kultivovanými na McKayově agaru s indikátorem BCP (0,4 % hm.) při teplotě 30 °C po dobu 16 h. Výsledky tolerance kmenů L. lactis k teplotě, pH, NaCl a methylenové modři jsou uvedeny v tab. I . Všechny kmeny L. lactis hydrolyzovaly arginin, pouze kmen L. lactis subsp. cremoris NIZO B33 nebyl schopen arginin hydrolyzovat. Výsledky získané pomocí obou metod byly shodné. Žádný z 20 kmenů L. lactis nebyl schopný fermentovat citrát, a tudíž se ve sbírce laktokoků nevyskytoval ani jeden kmen L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Tabulka I Tolerance kmenů L. lactis k teplotě, pH, NaCl a k přítomnosti methylenové modři Teplota NaCl Methylenová Kmen pH [°C] [% hm.] modř L. lactis [0,1 % hm.] 10 30 40 45 9,2 9,6 2,0 4,0 6,5 + + + + + + k LTM 32 + + + + + + k LCC 416 + + + + + + k LCC 731 + + + + + + + k NIZO R5 + + + + + + + k NCDO 2054 T LTM 32.6 + + + + + + + + + + + + + + + T LTM 32.7 + + + + + + T LCC 416.7 + + + + + + T LCC 416.8 + + + + + + + T LCC 731.4 + + + + + + + T LCC 731.9 + + + + + + + + MG 1614 + + + + + + + FI 5876 + + + + + + + IL 1403 + + + + + + k HMM 32 + + + + + + k HMM 61 HMM 62 + + + + + + k + + + + + + k HMM 81 + + + + + NIZO B33 + + + + + + k NIZO B643 + … pozitivní nárůst, - … negativní nárůst, k … pozitivní nárůst a koagulace mléka 142
Závěr Z kolekce 20 laktokokových kmenů byl pouze kmen NIZO B33 charakterizován jako poddruh L. lactis subsp. cremoris. Zbylých 19 kmenů bylo určeno jako poddruh L. lactis subsp. lactis. Kmen L. lactis subsp. cremoris MG 1614 se fenotypicky jevil jako poddruh lactis. Toto zjištění odpovídá skutečnosti, že kmen L. lactis subsp. cremoris NCDO 712, z něhož byl kmen L. lactis subsp. cremoris MG 1614 jako jeho bezplasmidový derivát odvozen, se také jevil fenotypicky jako poddruh lactis. Ovšem pomocí genotypických metod se tento kmen jevil jako poddruh cremoris [10]. Fenotypické rozlišení poddruhů L. lactis subsp. lactis a L. lactis subsp. cremoris na základě hydrolýzy argininu, fermentace citrátů, tolerance k NaCl, pH a methylenové modři bylo průkazné, zatímco rozlišení na základě tolerance k teplotě a fermentace sacharidů bylo méně průkazné. Z dosažených výsledků je patrné, že rozlišení kmenů L. lactis pouze na základě fenotypických vlastností je nedostatečné. Proto by bylo vhodné v budoucnu provést genotypické rozlišení těchto kmenů, např. pomocí metody restrikční analýzy genů rRNA nebo metody RAPD (Randomly Amlified Polymorphic DNA). Tato práce byla podpořena Národní agenturou pro Zemědělský Výzkum ( NAZV QF 3163). Literatura: 1. SALAMA, M.S., MUSAFIJA- JEKNIC, T., SANDINE, W.E., GIOVANNONI, S. An ecological study of lactic acid bacteria: Isolation of new strains of Lactococcus including Lactococcus lactis subspecies cremoris. J. Dairy Sci., 1995, vol. 78, pp.1004 – 1017. 2. MANGIN, I., CORROLER, D., REINHARDT, A., GUEGUEN, M. Genetic diversity among dairy lactococcal strains investigated by polymerase chain reaction with three arbitrary primers. J. Appl. Microbiol., 1999, vol. 86, pp. 514 – 520. 3. MOTER, A., GÖBEL, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods, 2000, vol. 41, pp. 85 – 112. 4. TERZAGHI, B.E., SANDINE, W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophage. Appl. Microbiol., 1975, vol. 29, pp. 807-813. 5. ČSN ISO 7218 (56 0103) : 1998. Mikrobiologie potravin a krmiv. Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. Praha: Český normalizační institut, 1998. 17 – 31 str. 6. MCKAY, L.L., BALDWIN, K.A., ZOTTOLA, E.A. Loss of lactose metabolism in lactic streptococci. Appl. Environ. Microbiol., 1972, vol. 23, pp. 1090-1096. 7. REDDY, M.S., VEDAMUTHU, E.R., REINBOLD, G.W. A differential broth for separating the lactic streptococci. J. Milk Food Technolog., 1971, vol. 34, no. 1, pp. 43-45. 8. REDDY, M.S., VEDAMUTHU, E.R., WASHAM, C.J., REINBOLD, G.W. Agar medium for differential enumeration of lactic streptococci. Appl. Microbiol., 1972, vol. 24, pp. 947-952. 9. TURNER, N., SANDINE, W.E., ELLIKER, P.R., DAY, E.A. Use of tetrazolium dyes in an agar medium for differentation of Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris. J. Dairy Sci., 1963, vol. 46, pp. 380 – 385. 10. LE BOURGEOIS, P., LAUTIER, M., VAN DEN BERGHE, L., GASSON, M.J., RITZENTHALER, P. Physical and genetic map of the Lactococcus lactis subsp. cremoris MG 1363 chromosome: Comparison with that of Lactococcus lactis subsp. lactis IL 1403 reveals a large genome inversion. J. Bacteriol., 1995, vol. 177, no. 10, pp. 2840-2850. Kontaktní adresa: Kateřina Kučerová, Ústav technologie mléka a tuků, FPBT, VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika, e-mail:
[email protected]
143
VLIV RŮZNÝCH PŘÍSAD NA SENZORICKOU JAKOST OCHUCENÝCH TVAROHŮ Lachová Hana, Vítová Eva, Tykvart Jan*, Loupancová Blanka Fakulta chemická,Vysoké učení technické v Brně, * KROMILK spol. s r.o. THE INFLUENCE OF VARIOUS ADDITIVES ON SENSORY QUALITY OF FLAVOURED CREAM CHEESE Summary: Organoleptic properties of cream cheeses made in dairy KROMILK, Kroměříž were evaluated and some aroma components that influence these properties were identified. In order to observe the influence of various additives on sensory quality of flavoured cream cheese, the cream cheeses with different flavours were sensory evaluated. Profile methods, total evaluation of all signs and order of preference test were used for sensory evaluation of cheese. Impo cheese was evaluated as the most delicious one, which resulted from the total evaluation. The least preferred cheese was Žervé. Analyzing particular sensory tests we concluded that samples of all flavours were in accordance with PN 57 11 32 minimally for fifteen days. Therefore it is possible to extend the durability of these cheeses from ten to fifteen days. SPME method („Solid Phase MicroExtraction“) followed by an analysis by gas chromatography was chosen to identify typical compounds influencing the taste and smell of cream cheese. Volatile aroma compounds of cream cheese were identified on the basis of standards. All evaluated samples contained the same volatile aroma compounds and their content was changing only slightly during guarantee period. ÚVOD Tato práce byla vypracována ve spolupráci s mlékárnou Kroměříž - KROMILK spol s r.o. Zabývá se hodnocením senzorické jakosti krémových tvarohových sýrů s různými příchutěmi. Krémové sýry patří do skupiny tzv. čerstvých sýrů, u nichž neprobíhá proces zrání. Vyrábí se z tučného tvarohu s přídavkem různých ochucujících přísad, jsou určeny ke konzumaci v čerstvém stavu a jejich trvanlivost je tedy ve srovnání se sýry zrajícími poměrně nízká. Výrobce garantuje trvanlivost 10 dní. Cílem této práce bylo sledovat změny v senzorické jakosti krémových sýrů během 10denní záruční doby a potvrdit, že v této době nedochází ke zhoršení organoleptických vlastností. Dalším cílem bylo stanovit hlavní těkavé sloučeniny, které tyto vlastnosti ovlivňují. Pro identifikaci charakteristických sloučenin ovlivňujících chuť a vůni krémových sýrů byla zvolena metoda SPME („Solid Phase MicroExtraction“) s následnou analýzou plynovou chromatografií. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Vzorky sýrů Vzorky sýrů poskytla mlékárna Kroměříž – KROMILK s.r.o. Krémové sýry jsou vyrobeny z tvarohu s přídavkem ochucujících přísad, jsou určeny ke konzumaci v čerstvém stavu. Při výrobě se používá tučný tvaroh s možností přídavku smetany pro úpravu požadovaného obsahu mléčného tuku. Senzorická jakost krémových sýrů musí odpovídat podnikové normě PN 57 11 321. Byly hodnoceny tyto tržní druhy: ŽERVÉ – pouze dokonale prohnětený tvaroh bez dalších přísad IMPO – přídavek jemné soli KAPIOVÝ – přídavek kapie, sušené cibule, jedlé soli a kari koření BYLINKOVÝ – přídavek bylinkové směsi a jedlé soli Byly odebrány celkem tři šarže všech příchutí. Vzorky byly skladovány během celé záruční doby při 6 °C. Senzorické hodnocení Senzorické hodnocení probíhalo vždy čtyřikrát u každé šarže. Před vlastním senzorickým hodnocením bylo zhodnoceno skupinové balení a vlastní obal vzorku, zda odpovídá požadavkům PN 57 11 321. Vzorky byly připraveny (v množství cca 50 g) do zdravotně nezávadných 144
porcelánových misek. Zkušební místnost byla dle možností zařízena podle požadavků normy ČSN ISO 85892. Hodnotící komise byla tvořena studenty 5. ročníku Fakulty chemické VUT v Brně. Dotazník pro hodnocení byl sestaven podle požadavků PN 57 11 321 a obsahoval následující části: CELKOVÉ HODNOCENÍ VŠECH ZNAKŮ3 – hodnocení vzhledu, barvy, chuti, vůně a konzistence pomocí 5ti bodové kategorové ordinální stupnice. HODNOCENÍ INTENZITY VYBRANÝCH VŮNÍ pomocí profilového testu3 s použitím 5ti bodové intenzitní stupnice. HODNOCENÍ INTENZITY VYBRANÝCH CHUTÍ pomocí profilového testu3 s použitím 5ti bodové intenzitní stupnice. POŘADOVÝ TEST3, 4 (hodnotitelé seřadili vzorky od nejchutnějšího k nejméně přijatelnému). Stanovení aromatických látek SPME - GC technikou5 Těkavé látky byly extrahovány metodou HS-SPME, bylo použito CARTM /PDMS vlákno o tloušťce 85 µm. Pro jejich analýzu byl použit plynový chromatograf TRACE GC (ThermoQuest Italia S.p.A., Itálie) s plamenově ionizačním detektorem, opatřený split/splitless injektorem a kapilární kolonou DB-WAX (30 m × 0,32 mm, tloušťka filmu imobilizované fáze 0,5 µm) Teplotní program: 1 minutu na 40°C, zahřívání rychlostí 5°C/min do 200°C, výdrž 7 minut. Detekce: FID detektorem při 220°C VÝSLEDKY Celkové hodnocení všech znaků Výsledky byly zpracovány ve formě sloupcových grafů (obr. 1.) a ukazují, že sledované organoleptické vlastnosti sýrů se během záruční doby mírně mění. Použitá stupnice: 1 – výborná → 5 – nevyhovující. VZHLED krémových sýrů se během trvanlivosti nemění s výjimkou krémového sýru s příchutí kapie, který byl několikrát hodnocen stupněm 2. Vzhled ostatních sýrů byl pokaždé hodnocen stupněm 1. CHUŤ A VŮNĚ krémových sýrů byla nejčastěji hodnocena stupněm 1 až 2. KONZISTENCE krémových sýrů byla většinou hodnocena stupněm 1 a v některých případech stupněm 2. Žádný ze sledovaných znaků nebyl hodnocen stupněm 5 jako nevyhovující. 5
1. den hodnocení
4 2
vzhled a barva chuť a vůně konzistence
1
celkový dojem
3
0
5 4 3 2 1 0
impo
žervé
kapie
bylinka
10. den hodnocení
impo
žervé
kapie
5 4 3 2 1 0
vzhled a barva chuť a vůně konzistence celkový dojem bylinka
5 4 3 2 1 0
4. den hodnocení
impo
kapie
15. den hodnocení
impo
žervé
kapie bylinka
Obr. 1. Organoleptické vlastnosti krémových sýrů (šarže I) Ze statistického vyhodnocení výsledků Kruskal – Wallisovým testem vyplývá, že s 95% 145
pravděpodobností dochází k významným změnám pouze v těchto vlastnostech: Žervé – chuť, Impo – chuť, Kapie – vzhled. Do této změny vzhledu u krémového sýru s příchutí kapie se mohla odrazit určitá nezvyklost zbarvení (žlutá barva sýra s červenými kousky kapie). Tento sýr obsahuje kari koření, které ke konci trvanlivosti sýra tvořilo oranžové tečky se žlutými okraji ve hmotě sýra. Výraznější změna chuti sýra Impo a Žervé mohla být způsobena mírným rozvojem hořké chuti ke konci trvanlivosti sýrů. U ostatních sledovaných sýrů nebyly prokázány statisticky významné změny během trvanlivosti. Intenzitní profil vybraných chutí a vůní Hodnotitelé měli posoudit, do jaké míry se čtyři vybrané deskriptory vůně (mléčně smetanová, kyselá, po přísadě, zatuchlá) a sedm charakteristických deskriptorů chuti (mléčně smetanová, kyselá, slaná, po přísadě, kvasničná, zatuchlá, hořká) podílejí na vytváření celkového dojmu chuti a vůně sýrů. Použitá stupnice 1–›5: neznatelná, velmi slabá, silnější, dosti silná, velmi silná. Během celé záruční doby se chuť a vůně výrazně neměnila. U sýrů Žervé a Impo se jako nejvýraznější složka vůně uplatňuje mléčně smetanová a kyselá, u sýrů s příchutí se nejvíce uplatňovala vůně „po přísadě“, mléčně smetanová a kyselá. Nejvýraznější složkou chuti sýrů Žervé a Impo je mléčně smetanová a kyselá, u sýra Impo také slaná. U sýrů s příchutí byla nejvýraznější složkou chuť „po přísadě“, mléčně smetanová, kyselá a slaná. Ostatní deskriptory chuti (kvasničná, zatuchlá) se během celé trvanlivosti neprojevily, což je v pořádku, jelikož tyto chutě jsou známkou mikrobiální kontaminace a nežádoucích senzorických změn.
Zatuchlá
mléčně smetanová 5 4 3 2 1 0
Impo Žervé Kapie
hořká
Bylinky kyselá
mléčně smetanová 5 4 3 2 1 0
zatuchlá
Po přísadě
kvasničná
kyselá
slaná
Po přísadě
Obr. 2. Intenzitní profil vybraných vůní a chutí krémových sýrů (šarže I) Pořadový test Vzhledem k použitým přísadám se čtyři testované druhy krémových sýrů ze senzorického hlediska poměrně výrazně liší. Pořadový test byl vyhodnocen graficky a statisticky pomocí statistického programu Unistat. Z celkového vyhodnocení všech tří šarží vyplývá, že jako nejchutnější (1) hodnotitelé označili sýr Impo, protože má vyváženou, příjemně slanou chuť. Jako nejméně chutný (4) sýr hodnotitelé označili sýr Žervé, jeho chuť definovali jako jemnou, tvarohovou, ale moc jednoduchou (tento sýr je bez jakýchkoliv příchutí). Hodnocení jednotlivých sýrů nebylo významně závislé na stáří vzorků, spíše na složení hodnotitelské komise a preferencích jednotlivých hodnotitelů. Jelikož hodnotitelé byly jen krátce školeni, je možno považovat jejich preference za velmi blízké preferencím běžných spotřebitelů.
146
4 Den 1 Den 4 Den 10 Den 15
3 2 1 0
žervé
impo
kapie
bylinky
Obr. 3. Vyhodnocení pořadového testu (šarže I) Výsledky stanovení aromatických látek Těkavé látky krémových sýrů byly identifikovány pomocí standardů. U všech analyzovaných vzorků byly identifikovány stejné sloučeniny (Tab.1) a nebyly nalezeny žádné sloučeniny, které by byly charakteristické pro jednotlivé příchutě. Obsah příchutí se na chromatogramu výrazně neprojevil. Pouze u kapiové příchutě byl nejvyšší obsah propan-2-olu, který se s rostoucím stářím sýru ještě zvyšoval. V průběhu patnácti sledovaných dnů se obsah jednotlivých sloučenin jen mírně mění. Tyto mírné změny však neměly zásadní vliv na organoleptickou jakost hodnocených sýrů. Tabulka I Těkavé látky identifikované v krémových sýrech. Identifikovaná sloučenina octová kyselina aceton propan -2 on ethyl-acetát propan-2-ol ethanol pentan-2-on propan-1-ol acetaldehyd pentan-2-ol butanol 3-methylbutanol acetoin heptan-2-ol nonan-2-on oktan-1-ol benzaldehyd undekan-2-on máselná kyselina
Retenční čas [min] 3,98 4,00 4,46 6,09 6,19 6,95 8,30 9,80 10,17 11,80 12,19 14,50 17,29 17,39 19,00 22,39 24,00 24,70 25,00 147
ZÁVĚR Tato práce se týkala především hodnocení organoleptických vlastností krémových sýrů s různými příchutěmi vyráběných mlékárnou KROMILK spol. s r.o., Kroměříž. Hlavním cílem bylo zjistit, jak se liší organoleptické vlastnosti jednotlivých typů sýrů a zda se významným způsobem mění jejich senzorická jakost v průběhu záruční doby, případně ještě po uplynutí záruční doby. Byly odebrány tři šarže sýrů Impo, Žervé, krémového sýru s příchutí bylinek a krémového sýru s příchutí kapie ihned po ukončení výroby. Pro senzorické hodnocení byla zvolena metoda senzorického profilu, neboť je schopna popsat celkovou chutnost výrobků se všemi složkami, které lze vnímat při konzumaci. Sýry byly dále hodnoceny stupnicovou metodou a pořadovým testem. Obecně lze říci, že u sýrů neochucených byla nejvýrazněji vnímána chuť a vůně mléčně smetanová a kyselá, zatímco u sýrů ochucených se podle očekávání nejvíce uplatnila chuť a vůně „po přísadě“, která v podstatě překryla mléčně nakyslou chuť a vůni tvarohu. Během záruční doby všech sýrů se jednotlivé deskriptory významným způsobem neměnily. Jako nejchutnější byl hodnotiteli označen sýr Impo, což je tučný tvaroh s přídavkem jemné soli bez dalších přísad. Hodnocení chutnosti ostatních druhů sýrů bylo více proměnlivé, příchuť různých přísad je pochopitelně hodnocena velmi subjektivně v závislosti na zvyklostech a požadavcích jednotlivých spotřebitelů. Z uvedených výsledků vyplývá, že organoleptické vlastnosti tvarohových krémových sýrů se během doby trvanlivosti významně nemění. Vzorky všech příchutí odpovídaly podnikové normě PN 57 11 321, a to minimálně po dobu patnácti dnů. Bylo by tedy možné prodloužit trvanlivost těchto sýrů z deseti na patnáct dnů, aniž by docházelo ke snížení jakosti výrobků. U ochucených sýrů nebyla pomocí SPME-GC nalezena žádná sloučenina, která by byla charakteristická pouze pro tuto příchuť. Použitá literatura: 1. PN 57 11 32: Příručka HACCP. KROMILK spol. s r.o., platné od 1.8.2002 2. ČSN ISO 8589 : 1993. Senzorická analýza – Obecná směrnice pro uspořádání senzorického pracoviště. Praha: Vydavatelství norem, 1993. 3. POKORNÝ, J.: Metody senzorické analýzy potravin a stanovení senzorické jakosti. 2. vydání. Praha: ÚZPI, 1997. ISBN 80-85120-60-7. 4. HRABĚ, J., KŘÍŽ, O., BUŇKA, F.: Statistické metody v senzorické analýze potravin. Vyškov: VVŠ PV, 2001. ISBN 80-7231-086-0. 5. Pawliszyn, J.: Solid Phase Microextraction – Theory and Practice. New York: WILEY–VCH, 1997. ISBN 0-471-19034-9. Kontaktní adresa: Hana Lachová, Fakulta chemická VUT v Brně, Purkyňova 118, 612 00 Brno, ČR;
[email protected]
148
ZMĚNY OBSAHŮ MASTNÝCH KYSELIN A DALŠÍCH AROMATICKÝCH LÁTEK SÝRA NIVA Loupancová Blanka, Vítová Eva, Zemanová Jana, Lachová Hana Fakulta chemická VUT v Brně CONTENT CHANGES OF FATTY ACIDS AND THE OTHER AROMATIC SUBSTANCES IN NIVA CHEESE Summary: The aim of this work was to isolate, identify and quantify fatty acids and other aroma compounds of Niva cheese, to monitor their changes during ripening of cheese and to find possible relations between them. Fatty acids were determined as methyl esters by gas chromatography. Methanol esterification method with potassium hydroxide catalysis was used for sample preparation. There were total of 30 fatty acids identified in the Niva cheese. Capric, myristic, palmitic, stearic and oleic acids represented the largest proportion of acids content and the most significant changes during ripening. The SMPE method (solid phase microextraction) followed by gas chromatography analysis was used to analyse other aromatic substances. Total of 20 aromatic compounds were identified consisting of 2 acids, 6 ketones, 2 sulphides, 4 aldehydes, 5 alcohols and 1 ester. Because of the largest proportion are the most significant acetic acid, acetone and Benzaldehyde. The results of these chemical analyses were statistically compared to determine the relation between contents of fatty acids as precursors and other aromatic substances. ÚVOD Sýry s modrou plísní v těstě jsou v současné době pod různými názvy rozšířeny po celém světě. U nás se tento druh sýra vyrábí z pasterovaného kravského mléka pod názvem Niva. Jednotlivé druhy se liší původem a druhem mléka, jeho zpracováním, klimatickými podmínkami, zvyklostmi obyvatel a dobou zrání. Společným znakem je modrozelený porost různých kmenů rodu Penicillium roqueforti. Tato plíseň je významná vysokou proteolytickou a lipolytickou aktivitou, které můžeme považovat za hlavní činitele vzniku široké škály chuťových a vonných látek. Zrání je jednou z nejdůležitějších fází výroby, protože při ní dochází k tvorbě charakteristické chuti, vůně, ale také struktury a konzistence sýra. Aby bylo možno vyrábět stále stejně kvalitní a chutný sýr, je nutné znát podmínky a zákonitosti vzniku aromatických látek. Právě vztahy mezi změnami aromatických látek a mastných kyselin jako jejich prekursorů v sýrech s modrou plísní v těstě se zabývala naše práce. Cílem práce bylo izolovat, identifikovat a kvantifikovat mastné kyseliny a další aromatické látky v závislosti na délce zrání sýra Niva. Statistickým porovnáním výsledků chemických analýz byly určeny vzájemné souvislosti mezi aromatickými látkami a mastnými kyselinami jako jejich prekursory. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Stanovení methylesterů mastných kyselin Příprava vzorků4,5 Zmýdelnění vzorku methanolovým roztokem KOH Vytřepání methylesterů heptanem Analýza plynovou chromatografií Podmínky GC analýzy Plynový chromatograf TRACE GC (ThermoQuest Italia S. p. A., Itálie) Nosný plyn: Dusík; optimální průtok 1,2 ml.min-1. Dávkování: Auto sampler – 1 µl; Splitless injection – ventil je uzavřen po dobu 5 minut. Teplota injektoru: 250 °C Teplotní program: 60 °C, 2 minuty; vzestupný gradient 10 °C za minutu do 220 °C s výdrží 149
20 minut. Kolona: Kapilární; SP 2560 o rozměrech: 100 m x 0,25 mm x 0,2 µm. Detektor: Plamenově ionizační (FID), 220 °C; průtok vodíku 35 ml.min-1, vzduchu 350 ml.min-1, make – up dusíku 30 ml.min-1. Celková doba analýzy: 38 minut.
Stanovení aromatických látek SPME technikou Příprava vzorků4,5 Navážka vzorku: 1,0 g Extrakční teplota: 35 °C Rovnovážná doba: 30 minut Extrakční doba: 20 minut Podmínky GC analýzy Plynový chromatograf TRACE GC (ThermoQuest Italia S. p. A., Itálie) SPME vlákno s polární stacionární fází CARTM/PDMS o tloušťce filmu 85 µm Nosný plyn: Dusík; optimální průtok 0,9 ml.min-1. Dávkování: Splitless injection – ventil je uzavřen po dobu 5 minut. Teplota injektoru: 250 °C Teplotní program: 40 °C, 1 minuta; vzestupný gradient 5 °C za minutu do 200 °C s výdrží 7 minut. Kolona: Kapilární DB – WAX o rozměrech 30 m x 0,32 mm x 0,5 µm Detektor: Plamenově ionizační (FID), 220 °C; průtok vodíku 35 ml.min-1, vzduchu 350 ml.min-1, make – up dusíku 30 ml.min-1. Celková doba analýzy: 38 minut.
Obr. 4. Chromatogram methylesterů mastných kyselin, Niva zralá 62. dní
Obr. 5. Chromatogram směsi standardů methylesterů mastných kyselin 150
Obr. 6. Chromatogram standardů aromatických látek
Obr. 7. Chromatogram aromatických látek, Niva zralá 62. dní
VÝSLEDKY Výsledky stanovení methylesterů mastných kyselin Na obrázcích 4 – 7 jsou pro ukázku zobrazeny chromatogramy. Je patrné, že rozdíly v kvantitativním zastoupení mastných kyselin u různě zralých vzorků nejsou příliš výrazné. Nejvíce se mění obsahy kyseliny kaprinové, myristové, palmitové, stearové a olejové. Pro názornost je závislost změny na době zrání vynesena do grafu (Obr. 8). Obsah kyselin palmitové a olejové v první třetině zrání klesal, ve druhé stoupal a ve třetí prudce klesal. Podobný průběh byl zaznamenán i u kyseliny stearové, ale s méně výraznými výkyvy. Změny kyselin kaprinové a myristové nejsou příliš patrné. Lze tedy předpokládat, že tyto kyseliny vznikají jako produkt neúplné β–oxidace jak kyseliny palmitové, tak i olejové. Z výsledků analýz všech vzorků vyplývá, že v průběhu zrání pravděpodobně nedochází k výrazným změnám obsahů mastných kyselin. Mastné kyseliny se v sýru nacházejí zejména ve formě esterů glycerolu. Z této vazby se uvolňují podle potřeby působením mikrobiálních lipas. Proto jsou také štěpeny zvolna a postupně. Při přípravě vzorků zmýdelněním, jsou však na methylestery převedeny všechny mastné kyseliny nacházející se v sýru, tedy volné i vázané. V mastných kyselinách je uchováno velké množství energie, avšak na jejich úplnou oxidaci je potřeba také odpovídající množství kyslíku. Vzhledem k tomu, že plíseň roste uvnitř kaveren s nízkou koncentrací kyslíku a zvýšenou koncentrací oxidu uhličitého, využívají se často méně energetické zdroje, ze kterých vznikají další aromatické látky.
151
Kaprinová
Myristová
Palmitová
Stearová
Olejová
100
Obsah (µg na g sýra)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Doba zrání (dny)
Obr. 8. Změny obsahů methylesterů mastných kyselin v závislosti na době zrání Výsledky stanovení aromatických látek V sýru Niva jsou nejvíce zastoupeny kyseliny octová a isopentanová, aceton, dimethylsulfid a benzaldehyd. Ostatní sloučeniny byly zaznamenány v množství menším než 1 µg.g-1 sýra. Na Obr. 9 jsou zobrazeny změny nejvíce zastoupených aromatických látek. Koncentrace kyseliny isopentanové a dimethylsulfidu v průběhu zrání klesá. Od počátku druhé třetiny zrání stoupá koncentrace acetonu. Kyselina octová vzniká činností mléčných bakterií a úpravou pH napomáhá rozvoji plísně. V první triádě je plísní metabolizována, poté je vytvářena jako produkt degradace aminokyselin a mastných kyselin. Velmi významná je kyselina kaprinová, ze které kromě kyseliny octové a 1-okten-3-olu vzniká boční drahou β–oxidace nonan-2-on. Negativně se ovlivňují dvojice aceton – acetoin a aceton – butan-2,3-dion, protože aceton pravděpodobně vzniká jejich rozkladem. Octová kyselina
Aceton
Dimethylsulfid
Benzaldehyd
Isopentanová kyselina
40
Obsah (µg na g sýra)
35 30 25 20 15 10 5 0 20
25
30
35
40
45
Doba zrání (dny)
Obr. 9. Změny obsahů aromatických látek v závislosti na době zrání
152
50
55
60
65
STATISTICKÉ POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ6,7,8 Pearsonovy korelační koeficienty se používají ke stanovení vzájemné závislosti mezi vlastnostmi nebo výsledky dvou měření. Pro 0 ≤ R ≤ +1 platí, že závislost mezi vlastnostmi je přímo úměrná. Pro –1 ≤ R ≤ 0 platí, že závislost mezi vlastnostmi je nepřímo úměrná. Tabulka I zobrazuje korelační koeficienty methylesterů mastných kyselin a aromatických látek. Zvýrazněné hodnoty jsou velmi blízké krajní hodnotě, a proto vyjadřují vysokou míru vzájemné závislosti vlastností. Souvislosti mezi aromatickými látkami a mastnými kyselinami jako jejich prekursory jsou přirozeně velice složité. Korelační koeficient pro kyseliny kaprinovou a octovou poukazuje na jejich vzájemný vztah. Při vyšších množstvích kyseliny kaprinové je zastoupení kyseliny octové nižší, z čehož lze odvodit, že kyselina octová vzniká štěpením kyseliny kaprinové. Tabulka I Korelační koeficienty vybraných methylesterů a aromatických látek Kaprinová k.
Myristová k.
Palmitová k.
Stearová k.
Olejová k.
Octová k.
-0,9759
-0,1700
-0,1401
-0,4690
-0,8886
Aceton
-0,6717
0,3179
0,3240
-0,6419
-0,7919
Dimethylsulfid
0,2475
-0,4251
-0,4116
0,4841
0,4944
Propionaldehyd
0,9477
-0,4903
-0,5288
0,9320
0,9317
Butan-2,3-dion
0,8695
-0,2394
-0,2585
0,7058
0,9217
Acetoin
0,7421
-0,6236
-0,6352
0,8706
0,8293
Nonan-2-on
0,9930
-0,2850
-0,3178
0,8211
0,9987
1-okten-3-ol
0,9727
-0,2552
-0,2972
0,8173
0,9693
Benzaldehyd
0,4834
-0,8484
-0,8544
0,9028
0,6628
Isopentanová k.
0,0523
-0,8665
-0,8635
0,8136
0,5311
Boční drahou β–oxidace vzniká z kyseliny kaprinové nonan-2-on. Čím vyšší je množství kyseliny kaprinové, tím je vyšší i zastoupení nonan-2-onu a 1-okten-3-olu. Díky korelačním koeficientům nacházíme přímo úměrnou souvislost také mezi kyselinou olejovou, nonan-2-onem a 1-okten-3-olem. Zajímavé jsou také souvislosti mezi samotnými aromatickými látkami. Tabulka II vyzdvihuje ty dvojice látek, které mají korelační koeficienty nejbližší mezním hodnotám. Tabulka II Porovnání dalších aromatických sloučenin Dvojice sloučenin
Korelační koeficienty
Aceton a Butan-2,3-dion
-0,9618
Aceton a Acetoin
-0,9265
Propionaldehyd a 1-okten-3-ol
0,9666
Nonan-2-on a 1-okten-3-ol
0,9558
Benzaldehyd a Isopentanová kyselina
0,9833
153
ZÁVĚR Tato práce se zabývala problematikou těkavých aromatických sloučenin sýra Niva. Naším hlavním úkolem byla identifikace a kvantifikace mastných kyselin sýra Niva a to v závislosti na délce zrání sýra. Celkem bylo identifikováno 30 mastných kyselin, z nich byly v hojném množství zastoupeny a změnám v průběhu zrání nejvíce podléhaly kyseliny kaprinová, myristová, palmitová, stearová a olejová. Z výsledků analýz všech sérií vzorků vyplývá, že v průběhu zrání nedochází k výrazným změnám obsahů mastných kyselin. Na základě dosažených výsledků lze soudit, že na začátku zrání se štěpí hlavně kyseliny se středně dlouhým řetězcem, které slouží jako zdroj uhlíku a energie potřebných pro rozvoj plísně. V souvislosti s tím také narůstá koncentrace nižších mastných kyselin, které již v první třetině zrání ovlivňují chuť a vůni sýra. Kyseliny se v pozdějších fázích zrání štěpí za vzniku různorodých aromatických látek. Další sledované aromatické látky byly extrahovány metodou HS–SPME a analyzovány plynovou chromatografií. K identifikaci a zároveň kvantifikaci byly použity dostupné standardy. Celkem bylo identifikováno 20 aromatických sloučenin, z toho 2 kyseliny, 6 ketonů, 2 sulfidy, 4 aldehydy, 5 alkoholů a 1 ester. Vzhledem k vysokému obsahu jsou nejdůležitější kyseliny octová a isopentanová, aceton, dimethylsulfid a benzaldehyd. Tyto sloučeniny mají velmi nízké prahy vnímání a proto mohou při vyšších hladinách způsobovat chuťové vady sýrů. Na základě statistického zpracování výsledků pomocí Pearsonových korelačních koeficientů byly určeny některé souvislosti mezi mastnými kyselinami na jedné a dalšími aromatickými látkami na druhé straně. Studium aromatických sloučenin různých sýrů je dnes v centru pozornosti řady odborníků z celého světa. I tato práce přispívá k lepšímu pochopení procesů, vedoucích ke vzniku těchto sloučenin a také k odhalení vztahů mezi jejich obsahem a organoleptickými vlastnostmi sýrů. Tyto poznatky nám v praxi umožní standardizovat senzorickou jakost výrobků. Použitá literatura: 1. Šimek, Z., Mašek, I., Voznica, P., Fišera, M., Dočekalová, H.: Kvantitativní analýza. Praktikum z analytické chemie I, II. Vybrané postupy optických, elektrochemických a separačních metod.Skripta FCH VUT. Brno: VUT, 1999. ISBN 80-214-1297-6 2. Pawliszyn, J.: Solid Phase Microextraction – Tudory and Practise. New York: WILEY–VCH, 1997. ISBN 0-471-19034-9 3. Churáček, J., a kol.: Analytická separace látek. Praha: SNTL, 1990. ISBN 80-03-00589-8 4. Norma ČSN 570107: Metody zkoušení přírodních a tavených sýrů. Stanovení obsahu tuku. Praha: 1984. 5. Norma ČSN 571211: Sýry s plísní uvnitř hmoty. Praha: 1983. 6. Doerffel, K., Eckschlager, K.: Optimální postup chemické analýzy. 2. vydání. Praha: SNTL, 1988. 7. Hrabě, J., Kříž, O., Buňka, F.: Statistické metody v senzorické analýze potravin. Vyškov: Vysoká škola pozemního vojska, 2001. 8. Cyhelský, L., Kalounová, J., Hindls, R.: Elementární statistická analýza. 2.vydání. Praha: Management Press, 1999. ISBN 80-7261-003-1 Kontaktní adresa: Blanka Loupancová, Fakulta chemická VUT v Brně, Purkyňova 118, 612 00 Brno, ČR;
[email protected]
154
APLIKACE METODY PCR PRO DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI KRAVSKÉHO MLÉKA V KOZÍCH SÝRECH Mašková Eva, Paulíčková Ivana Výzkumný ústav potravinářský Praha APPLICATION
OF PCR METHOD FOR THE DETECTION OF COW MILK IN GOATS’ CHEESES
Summary The article deals with a method based upon the polymerase chain reaction (PCR) for the detection of cow milk in goats’ cheeses. The method involves DNA isolation using the Invisorb Spin Food Kit for the animal samples and PCR oriented to a sequence of the mitochondrial gene encoding cytochrome b. Using model samples containing defined portions of cow and goat cheese, a detection limit of 1 % was determined. The optimised method was applied to 17 samples of goats’ cheeses from the retail trade in order to verify the label statements. The cow milk components were detected in 3 samples. The method proved to be suitable for the specific and sensitive detection of cow milk in goat cheese. Úvod Kozí sýry jsou považovány za speciality s charakteristickými senzorickými vlastnostmi, především chutí a vůní, a jejich nabídka je vzhledem k rozmnožovacímu cyklu koz omezena sezónně. Kozí mléko je výrazně dražší než kravské, a proto je častá tendence nahradit alespoň část mléka v kozích sýrech nedeklarovanou kravskou složkou. Spotřebitel chce z důvodu zdravotního či náboženského znát původ jednotlivých živočišných druhů v sýrech. Pro důkaz přítomnosti kravského mléka v mléčných výrobcích je platná referenční metoda založená na izoelektrické fokusaci mléčných kaseinů a rovněž byly pro tento účel odzkoušeny některé ELISA metody popisující složení proteinů. Tyto metody jsou často nevhodné pro analýzu komplexní potravinové matrice a méně citlivé pro tepelně opracované materiály, a proto se stále více uplatňují metody na principu polymerázové řetězové reakce. Některé využívají po amplifikaci restrikční štěpení fragmentu DNA (1,4,7,13), jiné se s úspěchem orientují na mitochondriální gen kódující cytochrom b (2,10,12 ). Cílem předkládané práce byla optimalizace a ověření PCR metody pro stanovení nedeklarovaného množství kravské mléčné složky v kozích sýrech a její aplikování na sýry z obchodní sítě. Materiál a metoda Sýry použité k analýzám byly nakupovány v síti obchodních řetězců a prodejnách eko a biopotravin. DNA v sýrech je původem ze somatických buněk a jejich počet je silně závislý na ročním období, stavu laktace a především na klinickém stavu dojnice (7). DNA byla ze sýrů izolována použitím izolačního kitu Invisorb Spin Food I firmy Invitek, Německo, který je určen pro potravinové vzorky živočišného původu a využívá nechaotropické extrakce na tuhé fázi. V rámci komerčně doporučeného izolačního protokolu byly upraveny podmínky eluce DNA tak, aby odpovídaly použitému potravinovému materiálu. DNA byla z kolonky eluována 2 x 50 µl předehřátého elučního pufru a přechovávána před následnou amplifikací v chladničce při 4oC. K odstranění nežádoucí RNA ze vzorku byla v průběhu extrakce přidávána RNAsa A (10 mg/ml), Top-Bio s.r.o. Kvalita a koncentrace izolované DNA byla zjišťována spektrofotometricky stanovením absorbance při 260 a 280 nm. Polymerázová řetězová reakce byla prováděna v cycleru Touchgene Gradient Techne (England). Byl použit forward primer SIM společný pro kravskou i kozí DNA a reverse primer specifický pro daný druh (10). 155
• SIM primer : 5´GAC CTC CCA GCT CCA TCA AAC ATC TCA TCT TGA TGA AA 3´ • Kráva (Cattle B) : 5´CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT ATA AG 3´ • Koza ( Goat G) : 5´CTC GAC AAA TGT GAG TTA CAG AGG GA 3´ Reakční směs o objemu 50 µl obsahovala : • 2,5 U Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen England • 1 x koncentrovaný PCR buffer bez Mg (obsahuje 20 mM Tris-HCl, pH 8,4 a 50 mM KCl) • 1,5 mM MgCl2 Invitrogen • 0,2 mM dNTP mix Eppendorf • 25 pmol každého primeru • roztok izolátu DNA, do 50 µl doplněno sterilní vodou Molecular Biology Grade, bez DNas Optimalizovaný teplotní a časový profil PCR reakce byl následující: • Initial denaturation – 94oC, 1 min • 40 cyklů s následujícím průběhem : o Denaturation – 94oC, 30 s o Annealing – 60oC, 30 s o Extension – 72oC, 30 s • Final extension – 72oC, 5 min Jako standard kravské DNA sloužil v PCR reakcích izolát z hovězího masa, pro kozu byla použita DNA z Capra hircus o koncentraci 20 ng/µl Biotools, Španělsko. Produkty PCR reakce byly analyzovány elektroforeticky na 3 % agarózovém gelu v TBE pufru 1x koncentrovaném a obarveném ethidium bromidem. Agarózová gelová horizontální elektroforéza probíhala při napětí 110 V po dobu 1 hod. 30 minut současně s použitím 50 bp DNA standardu molekulových hmotností Invitrogen, England. Vizualizace byla provedena na transiluminátoru v UV světle s následnou fotodokumentací pomocí digitálního fotografického přístroje Kodak s napojením na software Kodak 1D. Výsledky a diskuse Popsanou PCR metodou bylo možné detekovat amplifikovaný fragment kravské DNA o velikosti 274 bp a kozí DNA o velikosti 157 bp. To názorně charakterizuje obr.1. Obr.1 Detekce kravské a kozí DNA Dráha č.1 – 50 bp DNA Ladder Invitrogen (pásy po 50 bp, se zvýrazněním 350 bp) Dráha č.2 – PCR produkt z izolátu kozího sýra (detekce kozí složky – 157 bp) Dráha č.3 – PCR produkt z jiného izolátu kozího sýra (detekce kozí složky – 157 bp) Dráha č.4 – PCR produkt z kozího standardu Biotools Dráha č.5 – PCR produkt z izolátu kozího sýra (detekce kravské složky – 274 bp) Dráha č.6 – slepý pokus PCR reakce Dráha č.7 – PCR produkt z hovězího masa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aby bylo možné spolehlivě říci, že je metoda použitelná k detekci nedeklarovaného množství kravského mléka v kozích sýrech, bylo třeba stanovit její mez detekce. Pro zjištění detekčního limitu byla připravena série modelových vzorků čistého kozího sýra se žervé z kravského mléka. Vzorky byly podrobeny izolaci DNA, amplifikaci se zaměřením na detekci kravské DNA a po elektroforéze byla zjištěna 1 % mez detekce uvedené PCR reakce (Obr 2). 156
Obr.2 Výsledky stanovení detekčního limitu PCR reakce Dráha č. 2 – 50 bp DNA Ladder Invitrogen (pásy po 50 bp, se zvýrazněním 350 bp) Dráha č. 3 – 1 % kravského sýra v kozím sýru Dráha č. 4 – 5 % kravského sýra v kozím sýru Dráha č. 5 – 10 % kravského sýra v kozím sýru Dráha č. 6 – 25 % kravského sýra v kozím sýru Dráha č. 7 – 50 % kravského sýra v kozím sýru Dráha č. 8 – 100 % kravského sýra Dráha č. 9 - slepý pokus PCR reakce Dráha č. 10 – PCR produkt z hovězího masa
1
2 3 4 5
6 7 8
9
10
V tabulce I jsou uvedeny zjištěné výsledky PCR analýz 17 kozích sýrů z tržní sítě. Ve třech případech, tj.v 18 %, byla detekována nedeklarovaná přítomnost kravského mléka. Příkladem je obr 3. Tabulka I Výsledky analýzy kozích sýrů z tržní sítě na přítomnost kravské mléčné složky
Balkánský kozí sýr Kaprinus
ČR
Deklarace přítomnosti kravského mléka ne
Čerstvý nezrající kozí sýr přírodní
ČR
ne
ne
Dezertní kozí sýr Doral
ČR
ne
ne
Přírodní kozí sýr
ČR
ne
ne
Přírodní polotvrdý plátkovaný kozí sýr Pikant
ČR
ne
ano
Sedlákova přírodní kozí brynza
ČR
ne
ne
Sládečkův pravý polotvrdý zrající kozí sýr
ČR
ne
ne
Tylžský kozí sýr
ČR
ne
ne
Nakládaný přírodní sýr z kozího mléka
SR
ne
ano
Přírodní sýr z kozího mléka s kapií
SR
ne
ano
Gouda kozí Polder
NL
ne
ne
Čerstvý kozí sýr přírodní Chavroux
F
ne
ne
Čerstvý kozí sýr přírodní Soignon Mini Buche Blanche Kozí sýr přírodní s plísní na povrchu Soignon Buchette Saint Maure Čerstvý kozí sýr Cabridoux
F
ne
ne
F
ne
ne
F
ne
ne
Kozí sýr s plísní na povrchu Chevre du Poitou
F
ne
ne
Kozí sýr Tomme
F
ne
ne
Země původu
157
Skutečnost nalezeno kravské mléko ne
Obr.3 Příklad výsledků PCR analýzy kozích sýrů na přítomnost kravské mléčné složky Dráha č. 1 – 50 bp DNA Ladder Invitrogen Dráha č. 2 – PCR produkt z kozího standardu Biotools Dráha č. 3 – PCR produkt izolátu z přírodního kozího sýra s kapií (Slovensko) – detekce kozí DNA Dráha č. 4 – PCR produkt izolátu Sedlákovy kozí brynzy (detekce kozí DNA) Dráha č.5 a 6 – PCR produkty izolátů z přírodního kozího sýra s kapií (detekce kravské DNA) Dráha č.7 a 8 – PCR produkty izolátů ze Sedlákovy kozí brynzy (detekce kravské DNA) Dráha č. 9 – slepý pokus PCR reakce Dráha č. 10 – PCR produkt z hovězího masa
1
2 3 4 5
6 7 8 9
10
Jak je vidět z obr.3, slovenský přírodní kozí sýr s kapií byl jednoznačně falšován kravským mlékem, přestože byl deklarován jako čistě kozí. Stanovený 1 % detekční limit popsané PCR reakce byl v dobré shodě s výsledky jiných autorů. Většina původních prací používajících k detekci nedeklarovaného přídavku kravského mléka techniku PCR uvádí stanovenou mez detekce v rozmezí 0,1 – 1 %. Tak byl metodou PCR detekován přídavek 1 % kravského mléka v buvolím (15) nebo 5 % přídavek kravské DNA do kozího, ovčího nebo buvolího mléka a 2 % přídavek v kozích sýrech (6). Jiní autoři (13) identifikovali 0,5 % kravského mléka v kozích a ovčích sýrech nebo různé druhy mlék v mléčných výrobcích metodou multiplex PCR (3). Ještě nižší mez detekce (0,1 %) byla nalezena při identifikaci kravského mléka v kozím mléku a sýrech (2,11). Metoda, která je založena na mitochondriálním 12S a 16 S rRNA genu detekovala 0,1 % přídavek kravského mléka v ovčím a kozím (8,9). Pouze v jediné práci (12) se uvádí 0,01 % mez detekce pro přídavek kravského mléka do ovčích sýrů. Evropská referenční metoda izoelektrické fokusace mléčných kaseinů má stanovenou mez detekce rovněž na 1 %. Výtěžek DNA ze sýrů závisí na množství somatických buněk ve vzorku a účinnosti techniky použité k izolaci DNA (15). Vzhledem k složité potravinové matrici je limitujícím faktorem popsané metody i užívaná termostabilní polymeráza. Někteří autoři (9,11,14,15) s úspěchem aplikují pro takovýto potravinový materiál velmi drahé, zato vysoce specifické a citlivé polymerázy, jako např. AmpliTaq Gold DNA polymerase a Tth DNA polymerase Toyobo. Stejně jako v této práci prováděli někteří autoři průzkum přídavku nedeklarovaného množství kravského mléka do sýrů jiných druhů v tržní síti. V jedné práci (9) zjistili, že z 10ti zakoupených a analyzovaných ovčích sýrů jen 8 obsahovalo druhové složky, které byly uvedené na obalu. Zbylé dva sýry byly pouze z kravského mléka, přestože na obalu byla deklarována přítomnost kravského i ovčího mléka. Autoři usuzují, že z důvodu nebezpečí falšování by bylo velmi žádoucí vyvinout metodu pro kvantifikaci ovčího mléka ve směsných sýrech. Na jiném pracovišti (16) analyzovali 13 kravských, kozích a ovčích sýrů, které byly deklarovány jako čisté a ve čtyřech případech prokázali přítomnost nedeklarované složky, kterou nebylo pouze kravské mléko, ve dvou případech v „čistě ovčím“ sýru bylo zastoupeno rovněž kozí mléko. Pro identifikaci jednotlivých druhů vycházeli ze zkušeností stejných autorů (10) jako tato práce. I v další práci (12) konstatovali, že z 10 analyzovaných ovčích a kozích sýrů 90 % obsahovalo nedeklarovanou kravskou složku. Ne každý ovčí nebo kozí sýr je vyroben z deklarované suroviny (17). Dokazují to výsledky rutinní kontroly Bavorského zemského úřadu pro kontrolu zdraví a bezpečnost potravin (LGL) v průběhu roku 2003. Celkově bylo analyzováno 40 druhů ovčích sýrů a 80 druhů kozích sýrů na 158
obsah mastných kyselin metodou plynové chromatografie a na přítomnost genetického materiálu krav metodou PCR. Přítomnost nedovoleného kravského mléka byla prokázána v osmi ovčích a sedmi kozích sýrech., tj. ve 20 % ovčích a v 9 % kozích. Závěr Byla ověřena optimalizovaná PCR metoda pro stanovení nedeklarovaného množství kravské mléčné složky v kozích sýrech. Na modelových vzorcích byl stanoven 1 % detekční limit PCR reakce. PCR metodou bylo analyzováno 17 druhů kozích sýrů z tržní sítě. Bylo zjištěno, že 3 obsahovaly nedeklarovanou složku kravského mléka, tj. 18 %. Jednalo se o 1 sýr českého původu a oba analyzované slovenské sýry. Práce vznikla za finanční podpory výzkumného projektu NAZV č.QC 1111. Použitá literatura 1. Amills M., Francino O., Jansa M., Sanches A.: Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin. J. Dairy Res.64, 231 – 238 (1997). 2. Bania J., Ugorski M., Polanowski A., Adamczyk E.: Application of polymerase chain reaction for detection of goats′milk adulteration by milk of cow. J. Dairy Res. 68, 333-336 (2001). 3. Bottero M.T., Civera T., Nucera D., Rosati S., Sacchi P., Turi R.M.: A multiplex polymerase chain reaction for the identification of cows‘, goats‘ and sheep’s milk in dairy products. Int.Dairy J. 13, 277 – 282 (2003). 4. Branciari R., Nijman I.J., Plas M. E., Di Antonio E., Lenstra J.A.: Species origin of milk in italian mozzarella and greek feta cheese. J. Food Prot.63, 408-411 (2000). 5. Commission Regulation (EC) 213/2001 of 9 January 2001. Off. J. Eur. Communities L37/1, 51 – 59 (2001). 6. Klotz A., Einspanier R.: Development of a DNA-based screening method to detect cow milk in ewe, goat and buffalo milk and dairy products using PCR-LCR-EIA-technique. Milchwissenschaft 56, 67-70 (2001). 7. Lipkin E., Shalom A., Khatib H., Soller M., Friedmann A.: Milk as a source of deoxyribonucleic acid and as a substrate for the polymerase chain reaction. J. Dairy Sci. 76 (7), 2025-2032 (1993). 8. López-Calleja I., González I., Fajardo V., Rodriguez M.A., Hernández P.E., Garcia T., Martin R.: Rapid Detection of Cows‘ Milk in Sheeps‘ and Goats‘ Milk by a Species-Specific Polymerase Chain reaction Technique. J. Dairy Sci. 87, 2839 – 2845 (2003). 9. Mafra I., Ferreira I.M.P.L.V.O., Faria M.A., Oliveira B.P.P.: A Novel Approach to the Quantification of Bovine Milk in Ovine Cheeses Using a Duplex Polymerase Chain Reaction Method. J.Agric. Food Chem. 52, 4943 – 4947 (2004). 10. Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K., Yamada J., Shinmura Y.: A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Science 51, 143 – 148 (1999). 11. Maudet C., Taberlet P.: Detection of cows´milk in goats´cheeses interred from mitochondrial DNA polymorphism. J. Dairy Res. 68, 229 – 235 (2001). 12. Piknová L., Krahulcová J., Kuchta T.: Dôkaz kravskej mliečnej zložky v ovčích a kozích syroch polymerázovou reťazovou reakciou. Bulletin potravinárskeho výskumu 41 (3),163-167 (2002). 13. Plath A., Krause I., Einspanier R.: Species identification in dairy products by three different DNA-based techniques. Z. Lebensm. Unters. Forsch. A 205, 437-441 (1997). 14. Poms R.E., Glössl J., Foissy H.: Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat. Eur. Food Res. Technol. 213, 361 – 365 (2001). 15. Rea S., Chikuni K., Branciari R., Sangamayya R.S., Ranucci D., Avellini P.: Use of duplex polymerase chain reaction (duplex-PCR) technique to identify bovine and water buffalo milk used in making mozzarella cheese. J. Dairy Res. 68, 689 – 698 (2001). 16. Santos J., Fernandes P., Bardsley R.: Portuguese “PDO“ cheese and species origin of milk. Electron J. Environ.Agric.Food Chem. 2 (4), (2003). 17. Schweizerische Milchzeitung 130 (16), 3 (2004).
Kontaktní adresa: Ing. Eva Mašková, Výzkumný ústav potravinářský Praha, Radiová 7, 102 31 Praha 10 – Hostivař
[email protected] 159
VLIV JAHODOVÉHO AROMA NA SENZORICKÉ HODNOCENÍ MLÉKA Panovská Zdeňka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila, Košulič Pavel Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha THE EFFECT OF STRAWBERRY AROMA ON PERCEPTION OF FAT AND TASTE IN MILK Summary: Dietary choices are influenced by the taste and texture of food. Fats are responsible for the sensory properties of many foods and contribute to eating pleasure. Due to nutritional requirements is fat often replaced or decreased. In liquid dairy products where fat is contained in emulsified micro globules, the perception of fat is possible to describe by sensory cues as smoothness, thickness and viscosity. Although the impact of fat concentration on the appearance and texture is well known, its influence on flavour release and perception is still not well understood. The objective of the study was to determine the effects of strawberry aroma on perception of taste and fat amount in milk, using sensory analysis. The samples were scored for odour, flavour, appearance a texture using 100 mm line scales, anchored at the ends with extremes for each descriptive term. The results showed that the strawberry aroma influenced the perception of sweet taste and the amount of fat. Při výběru potraviny hraje jednu z hlavních rolí chuť. Vnímání chuti je kromě jiných příspěvků ovlivněno také množstvím tuku v potravině. Tuk neslouží jenom jako zdroj energie, ale je zodpovědný i za charakteristické aroma produktu a jeho texturu. V mlékárenských výrobcích je tuk ve formě emulsifikovaných mikroglobulí a vnímání tuku z pohledy textury je popisováno pojmy jako hladkost, hustota a viskozita. Vzhledem k tendenci snižovat obsah tuku je nutné studovat vlivy, které se při snížení tuku projeví na senzorických vlastnostech mléka. Byly zkoušeny různé aditivní látky, které by nahradily tuk a mohly tak ovlivnit senzorickou kvalitu. Např. přidáním 2% netučného sušeného mléka do smetany je dosaženo stejné fyzikální viskozity jako při přídavku 2% tuku. Přídavek sušeného mléka neměl podstatný vliv na texturu, ale spíše na barvu. Také další autoři se zabývali touto problematikou. Např. Phillips a kol. testovali za pomoci senzorického panelu vliv různých potravinářských aditiv na vlastnosti mléka. Zjistili, že přídavkem kaseinátu sodného a oxidu titaničitého do smetany se výrazně zlepšily vzhledové vlastnosti. Přídavek bílkovin má za následek bělejší vzhled a zlepšení texturních vlastností. Rozdíly mezi mlékem s nízkým a vyšším obsahem bílkovin byly nápadnější u nízkotučných mlék. Tepper a Kuang zkoušeli vliv přídavku aroma do mléka. Zjistili, že výrobek s vyšším obsahem přidaného aroma byl vnímán podobně jako výrobek s vyšším obsahem tuku, což indikuje vliv aroma na vnímanou tučnost. Ve své práci však použili poměrně vysoké obsahy aromat (0,5 a 1% práškového smetanového aroma) a poměrně velké koncentrace tuku ( až 10%). Autoři Frost a kol. studovali vliv různých faktorů (vliv smetanového aroma, bělidla, zahušťovadla a homogenizace) na vnímáni tučnosti. Jejich pokusy ukázaly, že aroma, bělidlo i zahušťovadlo statisticky významně ovlivňily vnímání tučnosti a že množství tuku neovlivnilo senzorické vlastnosti lineárně. Větší senzorické rozdíly byly pozorovány mezi mléky s 0,1% a 1,5% tuku než 1,5% a 3,5% . Tuk působí jako prekursor, nosič a modifikátor mnoha aromatických sloučenin. Reaguje s aromatickými sloučeninami a podílí se také na uvolňování vůně v ústní dutině. Interakce mezi těkavými a netěkavými látkami závisí na fyzikálně chemických vlastnostech a vazbách, které se mohou tvořit. Vazba aromatických sloučenin na netěkavé sloučeniny (např.bílkoviny) má za následek, že lze těžko předvídat odpovídající množství aroma, které by mělo být k potravině přidáno. Je nutné studovat faktory, které ovlivňují vazbu mezi látkami a aromatem a povahu interakcí. Zatím byl hodně studován vliv koncentrace tuku na vzhled a texturu, ale dosud neni jasný jeho vliv na uvolňování aroma. 160
Laboratoř senzorické analýzy při VŠCHT Praha se v rámci mezinárodního projektu COST zaměřila na sledování vlivu jahodového aroma na vnímání chuťových parametrů u mlék s různým obsahem tuku 0,5%, 1,5% a 3,5%. Experimentální podmínky: Senzorické hodnocení: Hodnocení probíhalo v senzorické laboratoři vybavené podle mezinárodní normy ČSN ISO 8589 (1988) Senzorická analýza - obecná směrnice pro uspořádání senzorického pracoviště. Hodnotitelé byli vybráni z řad pracovníků a studentů Ústavu chemie a analýzy potravin, kteří měli základní znalosti se senzorickým hodnocením. Hodnotitelé byli vybráni, vyškoleni a monitorováni dle mezinárodní normy ČSN ISO 8586 - 1 (2002) Obecná směrnice pro výběr, výcvik a sledování posuzovatelů – Část 1: Vybraní posuzovatelé Vzorky: Mléka s obsahem tuku 0,5 %, 1,5% a 3,5% tuku, množství podávaného vzorku 20 ml, teplota vzorků 15oC a 22oC. Jahodové aroma: Flavour Strawberry, Givaudan. Stejný přídavek aroma do všech vzorků 0,1 g/l. Neutralizátor chuti voda, bílé pečivo. Profilová zkouška: Hodnocené deskriptory - celková příjemnost vůně, intenzita vůně, celková příjemnost chuti, intenzita sladké chuti, příjemnost sladké chuti, intenzita přidaného aroma, příjemnost přidaného aroma, tučnost Výsledky: Nejprve bylo zjišťováno jak jsou hodnotitelé schopni rozeznávat od sebe tučné a netučné mléko. 97 hodnotitelům byly předkládány vzorky 1,5 % tučného mléka a hodnotitelé měli na pětibodové stupnici tučnosti zaškrtnout jeho tučnost. Pouze 22 % hodnotitelů posoudila tučnost mléka správně, většina z nich mléko hodnotila jako více tučné. Viz obr. 1. Pomocí profilové zkoušky byly porovnány vzorky mléka s přidaným aroma a bez aroma. Výsledky hodnocení jsou uvedeny na obr. 2-4
obsah tuku nižší než 1,5 % 6%
obsah tuku vyšší než 1,5% 72%
Obr.1 Výsledky senzorického hodnocení tučnosti mléka 161
obsah tuku 1,5% 22%
80 60
7
deskriptory: 1 - příjemnost vůně 2 - celková příjemnost chuti 3 - intenzita sladké chuti 4 - příjemnost sladké chuti 5 - intenzita přidaného aroma 6 - příjemnost aroma 7 - tučnost
1
2
40 20 0 6
3 mléko 0,5% tuku
5
mléko 0,5% tuku+0,1 g/l aroma
4
Obr. 2 Srovnání rozdílů mezi mlékem s přídavkem aroma a bez přídavku aroma (mléko s 0,5% tuku) deskriptory: 1 - celková příjemnost vůně 2 - celková příjemnost chuti 3 - intenzita sladké chuti 4 - příjemnost sladké chuti 5 - intenzita přidaného aroma 6 - příjemnost aroma 7 - tučnost
1 80 60
7
2
40 20 0
6
3
mléko 1,5 % tuku mléko 1,5 % tuku + aroma 0,1 g/l
5
4
Obr. 3 Srovnání rozdílů mezi mlékem s přídavkem aroma a bez přídavku aroma (mléko s 1,5% tuku) 80 8
1
60
2
40 20 7
3
0
6
deskriptory: 1 - celková příjemnost vůně 2 - intenzita vůně 3 - celková příjemnost chuti 4 - intenzita sladké chuti 5 - příjemnost sladké chuti 6 - intenzita přidaného aroma 7 - příjemnost přidaného aroma 8 - tučnost
4 mléko 3,5 % tuku mléko 3, 5 % tuku + aroma 0,1 g/l
5
Obr. 4 Srovnání rozdílů mezi mlékem s přídavkem aroma a bez přídavku aroma (mléko s 3.5% tuku) Jak vyplývá z grafů, přídavek aroma nejvíce ovlivnil parametry u nízkotučného mléka, což je v souladu s ostatními studiemi. 162
Závěr: 1. Rozpoznat tučnost mléka je pro neškolené hodnotitele obtížné. Pouze 22 % z testovaných lidí bylo schopno správně určit tučnost předložených vzorků mléka. Většina testovaných osob udávala vyšší obsah tuku, než vzorek opravdu obsahoval. 2. U mléka s obsahem tuku 0,5 % zvyšuje aroma intenzitu sladké chuti a částečně ovlivnilo i vnímanou tučnost 3. U mléka s obsahem tuku 1,5 % i mléka s obsahem tuku 3,5 % neměl přídavek aroma výrazný vliv na intenzitu sladké chuti a vnímanou tučnost.
Použitá literatura: Frost M.B., Dijksterhuis G., Martens M. Sensory perception of fat milk. Food Quality and Preference 12 (2001), 327-336 Phillips , L. G, Mc Giff, M.L., Barbano, D., Lawless, H. T. (1995) The influence of fat on sensory properties, viscosity and colour of Iowfat milk. Journal of Dairy Science 78 (10), 2113-2118 Tepper, B.J., Kuang T,. (1996). Perception of fat in a milk model system using multidimensional scaling. Journal of Sensory Studies 11(3), 175-190 Kontaktní adresa: VŠCHT FPBT, Technická 3, 166 28 Praha 6 Poděkování: Práce byla vytvořena za podpory MŠMT (Action COST 921)
163
MOŽNOSTI VYUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE PŘI ANALÝZE SÝRŮ Růžičková Jana, Mlček Jiří, Šustová Květoslava Ústav Technologie potravin, MZLU v Brně THE POSSIBILITY OF APPLICATION OF THE FT NIR SPECTROSCOPY IN THE ANALYSIS OF CHEESE Summary: In this work the possibility of application of near-infrared spectroscopy to analysis of cheese was determined with special regard to changes during the maturing. For this analysis the samples of Edam with 30% and 45% content of fat in solids were tested. The samples were analysed six months (one analysis each month). The cheese maturing was reviewed in relation of content of soluble nitrogen, tryptophan and tyrozine. These indicators were measured by UV spectroscope and by by FT NIR spectroscope at integrating sphere within reflectance mode in wavelengths ranging 12 500 – 4 000 cm-1 with 80 scans. The suitability of usage of two different methods of measurements within FT NIR spectroscopy were compared: the optic probe (for slice of cheese) and measuring on integration sphere in cuvette (for grated cheese). To develop calibration model for examined components the partial least squares (PLS) was used and this model was validated by full cross validation. The results of this study showed the availability of NIR spectroscopy for quick and non-destructive analysis of cheese. ÚVOD NIR spektroskopie využívá blízké infračervené oblasti spektra a poskytuje široké uplatnění v kontrole jakosti potravinářských surovin, meziproduktů i finálních výrobků. Využívá oblasti v rozsahu vlnočtů 12 500 – 4 000 cm-1, což odpovídá vlnovým délkám elektromagnetického záření v rozpětí 780 až 3000 nm. V této části spektra lze sledovat nízkoenergetické elektronické přechody (overtony) i různé kombinace vodíkových vibrací (C-H, N-H, O-H), jenž mají vysokou frekvenci a lze je využít pro kvantitativní analýzu (Jankovská et al., 2004; Šikola, 2002). Jedná se o rychlou metodu, s možností stanovení velkého množství vzorků s minimální spotřebou chemikálií. Cílem naší práce bylo posouzení využití této metody při analýze sýrů, především při změnách v průběhu zrání. Ukazateli zrání byli obsah rozpustného dusíku, rozpustného tryptofanu a tyrozinu. METODIKA K analýze byly použity vzorky eidamu s různou tučností a odlišnou startovací kulturou. Konkrétně se jednalo o vzorky s obsahem 45% TVS (kultura WIESBY PROBAT 505 – L. casei a L. lactis). Dále byly sledovány eidamy s obsahem 30% TVS (kultura FD a CHN – 11 – Lactobac. casei). Rozbory byly prováděny vždy po měsíci až do stáří sýrů 6 měsíců. Zralost sýrů byla posuzována podle obsahu rozpustného dusíku, rozpustného tryptofanu a tyrozinu. Tyto ukazatele byly stanoveny spektrofotometricky při vlnových délkách 270 a 290 nm dle Valkarise a Priceho (1959). Obsah jednotlivých látek byl dopočítán pomocí převáděcích rovnic. Obsah rozpustného dusíku je udáván v jednotkách % z celkového N, obsah rozpustného tryptofanu a tyrozinu v mg/100g sýra. Současně byly vzorky sýrů měřeny na přístroji FT NIR Antaris firmy ThermoNicolet ve spektrálním rozsahu 12 500 – 4 000 cm-1. Srovnávaly se dva způsoby měření v režimu reflektance, pomocí sondy (S) a měření na integrační sféře (IS). Spektra se proměřovaly při 80 scanech a rozlišení 4 s dobou snímání cca 1 min. Prvním způsobem, tzn. sondou, byl analýze podroben plátek sýra, který byl měřen 5krát, na integrační sféře se použil sýr nastrouhaný umístěný v kyvetě změřený 3krát. K tvorbě kalibračních modelů byla použita průměrná spektra.
164
VÝSLEDKY Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu (metoda částečných minimálních čtverců). PLS faktory použité v kalibračních modelech zahrnují spektrální a zároveň koncentrační informaci. Spolehlivost jednotlivých kalibračních modelů byla následně ověřena křížovou validací. Základní statistické údaje jsou uvedeny v tabulce I. Tabulka I Základní statistické údaje Integrační sféra N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
n 29 29 29
xp 16,12 0,034 0,123
sx 3,65 0,007 0,033
min 8,22 0,021 0,052
max 22,30 0,048 0,180
PLS 2 4 4
Sonda N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
n 29 27 28
xp 16,12 0,034 0,123
sx 3,65 0,007 0,034
min 8,22 0,022 0,052
max 22,30 0,048 0,180
PLS 3 5 10
n – počet vzorků; xp – průměr;sx – směrodatná odchylka; min – minimální hodnota; max – maximální hodnota; PLS – počet faktorů
Zhodnocení výsledků bylo provedeno na základě korelace mezi referenčními hodnotami a hodnotami vypočtenými ze získaných kalibračních rovnic a na základě velikosti směrodatných odchylek kalibrace (SEC) a validace (SEP). Vhodnost výsledného modelu se posuzuje rovněž dle korelačních koeficientů (R). Čím více se hodnota R blíží 1, tím lze považovat model za použitelnější. Dalším ukazatelem spolehlivosti modelu je hodnota kalibračního variačního koeficientu CCV, která by neměla přesáhnout 5 %, a hodnota predikčního koeficientu PCV (do 10 %). Kalibrační a validační výsledky pro všechny stanovované složky uvádí tabulky II a III. U modelů pro rozpustný dusík jsme dosáhli u obou způsobů měření vysokých korelačních koeficientů (IS 0,988; S 0,995), hodnoty SEC a SEP byly nízké pro oba způsoby měření. Kalibrační variační koeficient (CCV) pro IS je 3,47%, pro sondu 2,35%, čímž oba modely splňují podmínku spolehlivosti (do 5%). Limitní hodnota validačního variačního koeficientu (PCV, do 10%) je však v obou případech překročena (IS 11,60%, sonda 13,34%). Tabulka II Kalibrační výsledky pro rozpustný dusík, rozpustný tryptofan a tyrozin Integrační sféra N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
a ± bx 0,381 + 0,976x 0,012 + 0,631x 0,033 + 0,735x
R 0,988 0,789 0,857
SEC 0,560 0,0042 0,0169
CCV [%] 3,47 12,27 13,74
Sonda N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
a ± bx 0,173 + 0,989x 0,003 + 0,913x 0,004 + 0,968x
R 0,995 0,953 0,985
SEC 0,379 0,0021 0,0059
CCV[%] 2,35 6,03 4,76
a ± bx – regresní rovnice; R – korelační koeficient; SEC – směrodatná odchylka kalibrace; CCV – kalibrační variační koeficient
165
Tabulka III Validační výsledky pro rozpustný dusík, rozpustný tryptofan a tyrozin Integrační sféra N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
a ± bx 7,023 + 0,567x 0,016 + 0,536x 0,038 + 0,685x
R 0,901 0,681 0,785
SEP 1,87 0,0051 0,0204
PCV [%] 11,60 14,94 16,59
Sonda N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
a ± bx 8,196 + 0,498x 0,0097 + 0,726x 0,0343 + 0,714x
R 0,850 0,815 0,839
SEP 2,15 0,0039 0,0183
PCV [%] 13,34 11,74 14,88
a ± bx – regresní rovnice; R – korelační koeficient; SEP – směrodatná odchylka predikce; PCV – predikční variační koeficient
Predikované hodnoty [%]
Modely získané ze spekter na integrační sféře pro rozpustný tryptofan vykazují horší výsledky než hodnoty kalibračního modelu pro sondu. Korelační koeficient pro IS je 0,789, kdežto pro sondu je 0,953. Tento fakt je také ověřen ukazateli spolehlivosti CCV a PCV, které jsou v případě intergrační sféry vyšší než uvedené limity (CCV 12,27% a PCV 14,94%). U sondy došlo pouze k mírnému překročení kalibračního variačního koeficientu (6,03%) i predikčního koeficientu (11,74%), avšak tyto hodnoty lze považovat za uspokojivé. Rozpustný tyrozin prokazuje podobné výsledky jako modely pro rozpustný tryptofan. Sondou byly získány korelační koeficienty 0,985 pro kalibraci a 0,839 pro validaci. Naproti tomu modely pro integrační sféru vykazují nižší R jak pro kalibraci (0,857) tak pro validaci (0,785). Větší vhodnost použití modelu sondy potvrzují i ukazatele spolehlivosti (CCV 4,76 a PCV 14,88), i když také mírně překračují daný limit u predikčního korelačního koeficientu. Na obrázku č.1 můžeme vizuálně posoudit kalibrační a validační výsledky pro rozpustný dusík měřený na integrační sféře.. 25
y = 0.9764x + 0.3806 R = 0.9881
20
15
y = 0.5666x + 7.0226 R = 0.9008
10
5 5
10
15
20
25
Laboratorní hodnoty [%] Kalibrace
Validace
Lineární (Kalibrace)
Lineární (Validace)
OBR. 1 Graf kalibračních a validačních výsledků pro obsah rozpustného dusíku v eidamu měřený na integrační sféře. V tabulce IV jsou zaznamenány výsledky statistického vyhodnocení predikovaných NIR hodnot a referenčních hodnot pro oba způsoby měření (IS, S), jež byly testovány párovým T-testem. Nebyl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl mezi referenčními a predikovanými hodnotami. 166
Tabulka IV Statistické vyhodnocení T-testem Integrační sféra N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
n 29 29 29
xREF 16,12 0,034 0,123
xNIR 16,12 0,034 0,123
d 0,00000 -0,00003 -0,00003
SD 0,561 0,004 0,0168
P
Sonda N (% z celk. N) TRP (mg/100g) TYR (mg/100g)
n 29 27 28
xREF 16,12 0,034 0,123
xNIR 16,12 0,034 0,123
d 0,00034 -0,00004 -0,00011
SD 0,379 0,002 0,0058
P
* – P < 0,05 n – počet vzorků; xREF – referenční hodnoty; xNIR – predikované hodnoty; d – diference mezi referenčními a predikovanými hodnotami; SD – směrodatná odchylka z diference
ZÁVĚR Ze dosažených výsledků je možné konstatovat, že NIR spektroskopií lze poměrně přesně zjišťovat na základě přesných referenčních hodnot obsah rozpustného dusíku v sýrech a rovněž také obsah rozpustného tryptofanu a tyrozinu, jako ukazatele jeho zralosti. Při konfrontaci dvou způsobů měření (integrační sféra a sonda) bychom doporučili pro stanovení obsahu rozpustného dusíku použití obou modelů, protože vykazují poměrně shodné výsledky. Pro určení obsahu rozpustného tryptofanu a tyrozinu by byl vhodnější kalibrační model získaný měřením plátku sýra optickou sondou. Použitá literatura: 1. Jankovská R., Šustová K., Kuchtík J. (2004): Využití FT NIR spektroskopie v analýze ovčího mléka 2. Šikola J. (2002): NIR SPEKTROSKOPIE – Perspektivní metoda pro kvalitativní a kvantitativní analýzu v potravinách. Kvalita potravin, ročník 2, číslo 4, str. 18 – 19. 3. Vakaleris, D.G., Price, W.V. (1959): A rapid spektrophotometric method for measuring cheese ripening. Journal of Dairy Science, 42, p. 264-276 Kontaktní adresa: Ing. JANA RŮŽIČKOVÁ, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Ústav technologie potravin, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Tel.: + 420 545 133 095, e-mail:
[email protected] Příspěvek vznikl za podpory MSM 432100001.
167
POUŽITÍ KYSELINY MLÉČNÉ A JEJÍCH DERIVÁTŮ V MLÉKÁRENSKÉM PRŮMYSLU. Straková Markéta IFC FOOD spol. s r.o. USAGE OF LACTIC ACID AND THEIR DERIVATES IN DAIRY INDUSTRY. Summary: Milk and milk products including cheese are significant part of our food and accompany people from babyhood till the old age. Their popularity increase steadily therefore usage of suitable raw materials by manufacture and the quality of end-products is very important. Most occurred defects of cheeses and milk products generally is the growth of undesirable microorganisms and going rancid. Hard cheese with low water activity can be attacked by moulds, in reverse products with higher water activity like soft cheese inclined to fermentation and going rancid. For self life prolongation of food can be use some operations - addition of preservative agents, vacuum packaging, protecting atmosphere packaging etc. The lowering the pH value or water activity of food is next of this preservative techniques. By adjusted pH value can be stabilized for example the covering brine of Mozzarella, Ricotta, Feta cheese etc. The salted brine can be acidified with lactic acid to maintain the freshness of the cheese throughout its self life. Another preservative technique - lowering the water activity is possible to reach by lactates addition which can be combined with alginates to substitute of fat in low-fat products. Moulds occurrences on the surface of hard or semi-hard cheese is one of the frequent problems in cheese making industry. That's why there was tested surface treatment with lactic acidbased preparation. Je zřejmé, že údržnost potravin lze zvýšit 1) vylučováním mikroorganismů z prostředí (včetně zabránění druhotné kontaminaci) nebo jejich 2) přímou či 3) nepřímou inaktivací. V souladu s teorií „překážkového efektu“ tedy na jedné straně omezujeme počet mikroorganismů, a to jak těch, kteří se do potraviny dostanou ze surovin, tak těch, kteří se záludně přidávají k ostatním až po určité době, a na straně druhé se snažíme při výrobním procesu umístit co nejvíce překážek, a pokud možno, dostatečně vysokých. V případě produkce sýrů lze během výroby využít účinku běžných organických kyselin zejména kyseliny mléčné. Přídavek organické kyseliny do potravinářského výrobku zpravidla sníží hodnotu jeho pH a tak dochází k inhibici nebo k potlačení růstu určitých skupin mikroorganismů, přičemž se uplatňuje specifický účinek nedisociované formy organické kyseliny. K zajištění dostatečně vysokého podílu mezi nedisociovanou, a tedy antimikrobiálně účinnou formou (nenese elektrický náboj, a může tak pronikat buněčnou membránou) a disociovanou formou (schopnost snižovat pH) bez ohledu na disociační konstantu té které kyseliny, je ale opět nutná dostatečně nízká hodnota pH. Účinnost kyseliny L(+) mléčné byla již mnohokrát ověřena na různých druzích potravin. Je tedy prokázáno, že je v boji proti většině bakterií účinná a působí bakteriostaticky také proti některým kvasinkám a plísním. Bakterie, které jsou limitující z hlediska kvality většiny potravin, se dělí na ty, které svým působením znehodnocují potraviny (změna organoleptických vlastností – zkáza potravin) a na ty, které jsou patogenní nebo podmíněně patogenní, a to buď vlastním působením v lidském organismu nebo tvorbou toxinů v prostředí potravin. Kyselina mléčná působí např. proti: a) bakterie způsobující zkázu potraviny Brochothrix, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus b) bakterie patogenní a podmíněně patogenní Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Clostridium botulinum, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis 168
Je však důležité si uvědomit, že i přes dokonalost jakéhokoli použitého konzervačního zákroku nedojde nikdy k naprostému odstranění přítomné mikroflóry, nýbrž pouze ke snížení mikrobiálních počtů o určitý počet řádů (v závislosti na účinnosti zvoleného zákroku a počáteční četnosti, složení a odolnosti mikroflóry). Jak rychle, a zda-li se zbylé přežívající mikroorganismy začnou opět množit závisí na zacházení s ošetřenou potravinou a na dalších konzervačních zákrocích, jejichž účinek se vzájemně zesiluje. Výsledný konzervační efekt se pak znázorňuje jako kombinace „překážek“ a mluví se o tzv. překážkovém efektu. A protože spotřebitel si žádá výrobek s dostatečně dlouhou dobou trvanlivostí, se zachovanými organoleptickými a nutričními vlastnostmi, využívá se v současné době při výrobě sýrů taktéž kyseliny mléčné a jejích solí. Předností jejího použití je charakteristická mléčná sýrová“ chuť a vůně (výhoda pro finální produkt oproti ostatním kyselinám), zvýšení kvality produkce a samozřejmě prodloužení údržnosti mléka a mléčných výrobků díky stabilizaci pH. Dále je možné v mlékárenském průmyslu využívat přípravků na bázi kyseliny mléčné také k sanitaci výrobních a skladovacích prostor (ošetření palet, regálů, polic ve zracích sklepích), fortifikaci sýrů (mléčnany - vápenatý, hořečnatý, zinečnatý, železnatý atd.), přímému přídavku do syrovátky (při výrobě bílých a pařených sýrů) a povrchové dekontaminaci (k zabránění růstu plísní na povrchu zrajících sýrů). Ověření poslední zmíněné možnosti – vhodnosti použití přípravků na bázi kyseliny mléčné proběhlo na pokusu s cílem zabránit výskytu plísní na povrchu zrajících sýrů. Za zástupce těchto typů sýru byla vybrána známá Eidamská cihla (polotvrdý sýr, 45 % tuku v sušině, doba minimální trvanlivosti 2 měsíce). Testován byl přípravek PURAC FRESH, výrobek holandské firmy PURAC BIOCHEM. Jedná se o 65 % roztok, ve kterém je kyselina mléčná a octová zastoupena přibližně ve stejném množství. Pro vytvoření pufrovacího roztoku obsahuje preparát ještě malé množství mléčnanu sodného. Vzorky Eidamské cihly byly povrchově ošetřeny ručním tlakovým postřikovačem roztokem PURAC FRESH o koncentraci 2, 4 a 6 %. Vzorky byly skladovány v chladničce při teplotě 6 ºC. Účinky postřiku se posuzovaly na základě rozborů jednotlivých vzorků. Mikrobiologický rozbor zahrnoval: stanovení počtu plísní (podle ČSN ISO 6611); stanovení počtu bakterií Escherichia coli (ČSN ISO 7251); stanovení počtu bakterií Staphylococcus aureus (ČSN ISO 6888). Vliv přídavku PURAC FRESH na nárůst plísní u vzorků během skladování zobrazuje tabulka I, obrázek I. Četnost plísní u vzorků ošetřených přípravkem PURAC FRESH byla ve srovnání s kontrolním vzorkem nižší o jeden řád. Bakterie E. coli byly prokázány pouze u kontrolního vzorku a vzorku ošetřeného 2 % PURAC FRESH. Bakterie Staphylococcus aureus nebyly prokázány v průběhu skladování v žádném vzorku. Ke změně organoleptických vlastností Eidamské cihly v důsledku povrchového ošetření preparátem PURAC FRESH nedošlo. Tabulka I Vliv přípravku Purac Fresh na nárůst plísní na povrchu Eidamské cihly. Doba skladování [týdny] 1 4 6 9 12
Kontrola
Purac 2%
Purac 4%
Purac 6%
2,80x102 2,00x101 1,50x103 5,60 x102 1,25 x103
1,00 x102 1,32 x101 2,06 x102 3,00 x102 5,50 x102
1,60 x102 6,6 1,70 x102 3,08 x102 4,83 x102
6,00 x101 6,6 1,50 x102 2,50 x102 3,92 x102
169
1,00E+04
počet plísní [g-1]
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00 1
4
6
9
12
doba skladování [týdny]
Kontrola
Purac 2%
Purac 4%
Purac 6%
Obr. č. 1 Vliv přípravku Purac Fresh na nárůst plísní na povrchu Eidamské cihly. Aplikace přípravku PURAC FRESH na povrch Eidamské cihly tedy přispěla ke zlepšení mikrobiální stability výrobku. Je zde předpoklad možnosti prodloužení doby minimální trvanlivosti až na dvojnásobek. Literatura: 1. FORMAN, L. et al. Mlékárenská technologie II. 2. vyd. Praha: VŠCHT Praha, 1996. 228 s. ISBN 807080-250-2. 2. Nabídka přípravků firmy IFC FOOD Praha, s.r.o., 1999. 3. Vyhláška MZ č. 91 / 1999 Sb., O mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. Praha, 1999. 4. ONDREJKA, J. Hygienické a zdravotné riziká mlieka ako suroviny. Mliekarstvo. 1999, roč. 30, č. 4, s. 34 - 37. 5. PIPEK, P., BRYCHTA, J., LAMERS, P.P., BŘEZINA, P. Milchsäure und Laktat für die Haltbarkeit von Geflügelfleischerzeugnissen. Fleischerei Technik, 1998, roč. 14, č. 7 - 8, s. 20 - 23. 6. VELICHOVÁ, H., BŘEZINA, P. Využití přídavku aditiv k prodloužení údržnosti vybraných masných výrobků. In Sborník teoreticko-praktické konference FEOS VVŠ PV. Vyškov: VVŠ PV, 1998, s. 103 110. ISBN 80-7231-003-8.
170
GENOTYPICKÁ CHARAKTERIZACE VYBRANÝCH KMENŮ LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS A LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. CREMORIS Šviráková Eva, Kučerová Kateřina, Kozáková Drahomíra, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha GENOTYPICAL CHARACTERIZATION OF SELECTED STRAINS OF LACTOCOCCUS LACTIS SUSBS. LACTIS AND LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. CREMORIS Summary: This work was focused on the phenotypical and genotypical characterization of 20 selected Lactococcus lactis strains. Regarding to the genotypical properties of the L. lactis strains the two important genes (nisA and nisB) of the nisin gene cluster were localized by Polymerase Chain Reaction (PCR). All L. lactis strains were also submitted to the Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). Only the strain NIZO B33 was characterized as L. lactis subsp. cremoris out of the collection of 20 lactococcal strains. Remaining 19 strains were identified as L. lactis subsp. lactis. For genotypical differentiation of subspecies lactis and cremoris the FISH method was not suitable. PCR was the method suitable only for genotypical differentiation of L. lactis strains producing or no-producing nisin. L. lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris can be successfully distinguished by the method of restriction analysis of rRNA genes or the RAPD method (Randomly Amplified Polymorphic DNA). These two methods can be adopted by our laboratory in the future. Úvod Pro zajištění konstantní kvality vyráběných mlékárenských výrobků (fermentovaných mlék, sýrů aj.) je nutné určit složení použité zákysové kultury a charakterizovat její vlastnosti. Za tímto účelem se často provádí fenotypická charakterizace dané kultury. Vzhledem k tomu, že u kmenů Lactococcus lactis může docházet ke ztrátě či naopak získání některých nových fenotypických vlastností, je fenotypizace nedostačujícím faktorem k charakterizaci a rozlišení poddruhů L. lactis subsp. lactis a L. lactis subsp. cremoris. Z tohoto důvodu byly vyvinuty různé genotypické metody, např. polymerasová řetězová reakce (PCR) (Garde et al., 1999), ribotypizace (Garde et al., 1999), fluorescenční in situ hybridizace (FISH) (Schleifer et al., 1995), které umožňují přesněji charakterizovat a rozlišit tyto mlékařsky významné poddruhy laktokoků. Cíl práce Cílem práce byla částečná genotypická charakterizace 20 vybraných kmenů L. lactis a ověření vhodnosti použitých metod ke genotypickému rozlišení jejich poddruhů lactis a cremoris. Práce úzce navazuje na přecházející fenotypickou charakterizaci těchto kmenů (Kučerová, 2004). Materiál a metody Použité kmeny • Kmeny L. lactis (rodičovské): a) bezplasmidové: L. lactis subsp. cremoris MG 1614 (IFR Norwich, VB) (Gasson, 1983, 1984; Le Bourgeois et al., 1995), L. lactis subsp. lactis IL 1403 (VŠCHT Praha, ČR) (Chopin et al., 1984), b) multiplasmidové: L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (NIZO, Ede, Nizozemí), L. lactis subsp. lactis NCDO 2054 (NIZO, Ede, Nizozemí), L. lactis subsp. lactis FI 5876 (IFR Norwich, VB) L. lactis subsp. lactis LCC 416 (Laktoflora, Milcom a.s., Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis LCC 731 (Laktoflora, Milcom a.s., Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis LTM 32 (VŠCHT Praha, ČR) (Do et al., 2001).
171
•
Transkonjugované kmeny L. lactis: L. lactis subsp. lactis T LTM 32.6 a T LTM 32.7 (VŠCHT Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis T LCC 416.7 a T LCC 416.8 (VŠCHT Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis T LCC 731.4 a T LCC 731.9 (VŠCHT Praha, ČR). • Izolované kmeny L. lactis z různých zdrojů: L. lactis subsp. lactis HMM 32 (VŠCHT Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis HMM 61 (VŠCHT Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis HMM 62 (VŠCHT Praha, ČR), L. lactis subsp. lactis HMM 81 (VŠCHT Praha, ČR). • Jiné laktokokové kmeny: L. lactis subsp. lactis NIZO B643 (NCDO, Reading, VB), L. lactis subsp. cremoris NIZO B33 (NIZO, Ede, Nizozemí), Lactobacillus helveticus CH-1 (Chr. Hansen Laboratories A/S, Kodaň, Dánsko). Laktokokové kmeny byly kultivovány v M17 bujónu (Terzaghi and Sandine, 1975) s glukosou (0,5 % hm.) (GM17 bujón) na místo laktosy při teplotě 30 °C po dobu 16 h za aerobních podmínek. Kmen Lb. helveticus CH-1 byl kultivován v MRS bujónu při teplotě 42 °C po dobu 16 h za aerobních podmínek. Pro přeočkování všech kmenů bylo použito 1% (obj.) inokulum. Použité metody a postupy Stanovení produkce nisinu. Pro stanovení produkce nisinu u kmenů L. lactis byla použita agarová difúzní metoda (Tramer and Fowler, 1964) ve formě modifikované agarové difúzní biozkoušky (Dodd et al., 1996). Fluorescenční hybridizace in situ (FISH). Pro charakterizaci (poddruhů) kmenů L. lactis byla použita metoda FISH ve formě komerčního hybridizačního kitu (MicroScreen B. V., Groningen, Nizozemí). Polymerasová řetězová reakce (PCR). K mapování dvou významných genů nisA a nisB nisinového úseku genů byla použita metoda PCR (Maniatis et al., 1982) ve formě modifikace (Dodd et al., 1990, Horn et al., 1991). Výsledky a diskuse
Fenotypická charakteristika kmenů L. lactis Produkce nisinu Výsledky produkce nisinu u kmenů L. lactis jsou uvedeny v tabulce I a fotograficky znázorněny na obrázku 1. Tabulka I: Produkce nisinu kmeny L. lactis v GM17 bujónu (testovací kmen Lb. helveticus CH-1, difúze nisinu v MRS agaru, předinkubace při 4 °C během 6 h, inkubace při 42 °C během 20 h) Kmen Koncentrace nisinu Kmen Koncentrace nisinu L. lactis L. lactis [IU.ml-1] [mg.l-1] [IU.ml-1] [mg.l-1] 200 5,0 380 9,5 LTM 32 T LCC 731.9 380 9,5 0 0 LCC 416 MG 1614 380 9,5 105 2,6 LCC 731 FI 5876 530 13,3 0 0 NIZO R5 IL 1403 250 6,3 0 0 NCDO 2054 HMM 32 140 3,5 0 0 T LTM 32.6 HMM 61 140 3,5 0 0 T LTM 32.7 HMM 62 380 9,5 0 0 T LCC 416.7 HMM 81 270 6,8 0 0 T LCC 416.8 NIZO B33 200 5,0 0 0 T LCC 731.4 NIZO B643 172
Obr. 1 Agarová difúzní zkouška (testovací kmen Lb. helveticus CH-1, MRS agar, předinkubace při teplotě 4 °C po dobu 6 h, inkubace při teplotě 42 °C po dobu 20 h). Kalibrační křivka pro Nisaplin: pozice 0,1 - 1000 (0,1 - 1000 IU nisinu.ml-1). Žádný vzorek: pozice x). Kmen L. lactis NCDO 2054: pozice a), b), c). Transkonjugované kmeny L. lactis T LTM 32.6 a T LTM 32.7: pozice: 32.6 a 32.7. Transkonjugované kmeny L. lactis T LCC 416.7 a T LCC 416.8: pozice: 416.7 a 416.8. Transkonjugované kmeny L. lactis T LCC 731.4 a T LCC 731.9: pozice: 731.4 a 731.9. Negativní, kontrolní kmeny L. lactis (neprodukující nisin): pozice: MG 1614 a IL 1403. Pozitivní, kontrolní kmen L. lactis (produkující nisin): pozice: FI 5876. Izolované kmeny L. lactis: pozice: HMM 32, HMM 61, HMM 62, HMM 81. Jiné kmeny L. lactis: pozice: NIZO B33, NIZO B643. Jiné izolované kmeny L. lactis: pozice: 8 a 31. Z kolekce kmenů L. lactis vykazoval nejvyšší produkci nisinu kmen L. lactis NIZO R5 (530 IU nisinu.ml-1 = 13,3 mg nisinu.l-1) a nejnižší produkci nisinu kmen L. lactis FI 5876 (105 IU nisinu.ml-1 = 2,6 mg nisinu.l-1). Bezplasmidové kmeny L. lactis MG 1614 a L. lactis IL 1403 nisin neprodukovaly (Nip-), protože neobsahovaly geny zodpovědné za produkci nisinu. Nisin také neprodukovaly kmeny L. lactis HMM 32, HMM 61, HMM 62, HMM 81, NIZO B33 a NIZO B643. U všech kmenů byl pozorován pokles produkce nisinu ve srovnání s výsledky získanými během experimentů v minulých letech (Semerádová, 2002; Kozáková, 2003; Petříková, 2003). Výrazný pokles byl pozorován zejména u kmene L. lactis FI 5876, který mohl být způsoben nespecifickými mutacemi během uskladnění kmene při nízkých teplotách (-20 °C nebo –80 °C). Ztráta schopnosti produkovat nisin patří mezi vratné změny a narušený biosyntesní cyklus lze obnovit indukční dávkou nisinu (Kuipers et al., 1995). U všech kmenů L. lactis produkujících nisin (Nip+) byla současně zaznamenána i schopnost fermentovat sacharosu. Tímto bylo prokázáno, že biosyntéza nisinu a schopnost fermentace sacharosy jsou u kmene L. lactis subsp. lactis geneticky propojeny a kódovány geny konjugativního transposonu (Horn et al., 1991; Rauch and de Vos, 1992). Genotypická charakteristika kmenů L. lactis Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Pro genotypickou charakterizaci a rozlišení poddruhů lactis a cremoris testovaných kmenů L. lactis byla použita metoda FISH, prostřednictvím které byla detekována specifická část 16S rRNA těchto kmenů. Vybrané pozitivní výsledky z experimentů FISH jsou uvedeny na obrázku 2. 173
a) b) Obr. 2 Fluorescenční hybridizace in situ (FISH): L. lactis subsp. lactis LCC 416 (a), L. lactis subsp. cremoris NIZO B33 (b). Pozitivní reakce FISH (navázaní oligonukleotidové proby s fluorescenčním barvivem na úsek 16S rRNA) se při rodové a druhové charakterizaci kmenů L. lactis projeví intenzivní žlutozelenou fluorescencí (údržnou až 30 min při uchování vzorků v temnu) těchto kmenů pod fluorescenčním mikroskopem. FISH je relativně rychlá a dostupná metoda, je však relativně drahá a náročná na použité zařízení (speciální filtrační zařízení, fluorescenční mikroskop). Její nevýhodou je, že při experimentech dochází k relativně intenzivnímu obarvení nečistot pocházejících z růstového média, čímž se mikroskopické vyhodnocení stává obtížnější. Při našich experimentech (použití komerčního kitu) se metoda FISH zdála být vhodná a citlivá pouze pro rodové a druhové genotypické určení kmenů L. lactis. Pro určení poddruhů lactis a cremoris byla metoda méně citlivá, jak bylo pozorováno u kmenů L. lactis subsp. lactis (např. LCC 416) a L. lactis subsp. cremoris (NIZO B33). Tuto metodu by bylo dobré nahradit jinou genetickou metodou, např. PCR (Garde et al., 1999; Mangin et al., 1999). Příčinou falešně pozitivních výsledků může být autofluorescence materiálu nebo nedostatek specifity. Auotofluorescence mikroorganismů samotných je závažný problém, který byl pozorován u různých plísní, kvasinek i bakterií (např. r. Pseudomonas, Legionella). Autofluorescenci může v okolí bakterií také způsobovat organický i anorganický materiál (např. rostliny, bahno, pitná voda) pocházející z přírodních zdrojů. Dramatický vliv na intenzitu fluorescenčního signálu má také růstové médium, metoda fixace a fixační tekutina (Moter and Göbel, 2000). Přesnost a spolehlivost metody FISH vysoce závisí na specifitě oligonukleotidové proby. Nově vzniklé proby by proto měly být důkladně připravovány a kriticky hodnoceny. Je nutné mít na paměti, že specifita oligonukleotidu závisí na databázi, z které byl tento odvozen. Vzhledem k nepřesnostem některých uváděných sekvencí a rapidní expanzi existujících databází by se měly sekvence prob pravidelně kontrolovat pomocí nejnovějších verzí sekvenovaných dat (Moter and Göbel, 2000). Mapování části nisinového úseku genů zodpovědných za produkci nisinu U kolekce kmenů L. lactis byly mapovány dva významné geny nisinového úseku genů (geny nisA a nisB) lokalizované na chromosomu buňky. Detekce sledovaných sekvencí genů byly uskutečněny pomocí PCR (Dodd et al., 1990). K lokalizaci základního strukturního genu nisA nisinového úseku genů u kmenů L. lactis byly použity primery p54 (22 mer) a p55 (22 mer). Konečné produkty PCR (400 bp) byly následně detekovány na agarosovém gelu (1 % hm.). Vybrané výsledky lokalizace genu nisA u kmenů L. lactis jsou presentovány na obr. 3a a 3b. K lokalizaci společného úseku genů nisA + nisB u kmenů L. lactis byly použity primery p39 (25 mer) a p40 (23 mer). Výsledné produkty PCR (2 kb) byly následně detekovány na agarosovém gelu (0,7 % hm.). Výsledky detekce úseku genů nisA + nisB u kmenů L. lactis jsou uvedeny na obr. 4a a 4b. 174
a) b) Obr. 3 Detekce genu nisA (400 bp výsledného produktu PCR) u kmenů L. lactis: a) pozice: 2) MG 1614, 3) FI 5876, 4) LTM 32, 5) LCC 416, 6) LCC 731, 7) NIZO R5, 8) NCDO 2054, 9) T LTM 32.6, 10) T LTM 32.7, 11) T LCC 416.7, 12) T LCC 416.8, b) pozice: 2) MG 1614, 3) FI 5876, 4) T LCC 731.4, 5) T LCC 731.9, 6) IL 1403, 7) HMM 32, 8) HMM 61, 9) HMM 62, 10) HMM 81, 11) NIZO B33, 12) NIZO B643, a) i b) 13) volná pozice. Pozice standardu DNA: 1) a 14) širokospektrální standard DNA LoadDirectTM (Sigma - Aldrich, St. Louis, USA).
Jak je patrné z obr. 3a) a 3b), multiplasmidové kmeny L. lactis (FI 5876, NIZO R5, NCDO 2054, LTM 32, LCC 416, LCC 731) a transkonjugované kmeny L. lactis (T LTM 32.6, T LTM 32.7, T LCC 416.7, T LCC 416.8, T LCC 731.4, T LCC 731.9) obsahovaly základní strukturní nisinový gen nisA. U bezplasmidových kmenů L. lactis (MG 1614, IL 1403), a dále u izolovaných kmenů L. lactis (HMM 32, HMM 61, HMM 62, HMM 81) a jiných kmenů L. lactis (NIZO B33, NIZO B643), se tento gen nenacházel. Z literatury je známo, že strukturní gen nisA kóduje nisinové prepeptidy (Engelke et al., 1992) a spolu s ostatními geny nisinového úseku genů je zodpovědný za biosyntesu nisinu (Kuipers et al., 1995).
a) b) Obr. 4 Detekce úseku genů nisA + nisB (2 kb výsledného produktu PCR) u kmenů L. lactis: a) pozice: 2) MG 1614, 3) FI 5876, 4) LTM 32, 5) LCC 416, 6) LCC 731, 7) NIZO R5, 8) NCDO 2054, 9) T LTM 32.6, 10) T LTM 32.7, 11) T LCC 416.7, 12) T LCC 416.8, 13) volná pozice. Pozice standardu DNA: 1) a 14) širokospektrální standard DNA LoadDirectTM(Sigma – Aldrich, St. Louis, USA). b) pozice: 2) MG 1614, 3) FI 5876, 4) T LCC 731.4, 5) T LCC 731.9, 6) IL 1403, 7) HMM 32, 8) HMM 61, 9) HMM 62, 10) HMM 81, 11) NIZO B33, 12) NIZO B643, a) i b) 13) volná pozice. Pozice standardu DNA: 1) a 14) širokospektrální standard DNA LoadDirectTM (Sigma – Aldrich, St. Louis, USA).
175
Jak je patrné z obr. 4a a 4b, multiplasmidové kmeny L. lactis (FI 5876, NIZO R5, NCDO 2054, LTM 32, LCC 416, LCC 731) a transkonjugované kmeny L. lactis (T LTM 32.6, T LTM 32.7, T LCC 416.7, T LCC 416.8, T LCC 731.4, T LCC 731.9) obsahovaly společný úsek genů nisA + nisB. U bezplasmidových kmenů L. lactis (MG 1614, IL 1403), a dále u izolovaných kmenů L. lactis (HMM 32, HMM 61, HMM 62, HMM 81) a jiných kmenů L. lactis (NIZO B33, NIZO B643), se tento úsek genů nenacházel. Z literatury je známo, že nisinový gen nisB se pravděpodobně účastní v molekule nisinu dehydratace a tvorby thioetherových můstků (Van der Meer et al., 1987) a nachází se na společném úseku genů zodpovědných za produkci nisinu a resistenci k nisinu (Davies and Delves-Broughton, 1999). Identifikací genů nisA a nisB nisinového úseku genů pomocí PCR nelze odlišit poddruhy lactis a cremoris. Touto metodou lze rozlišit laktokokové kmeny produkující nisin od kmenů neprodukujících nisin. Závěr Všech 20 kmenů L. lactis bylo podrobeno lokalizaci dvou významných genů (nisA a nisB) nisinového úseku genů pomocí PCR a metodě FISH. Z kolekce laktokokových kmenů byl pouze jeden kmen s označením NIZO B33 charakterizován jako poddruh cremoris, zbylých 19 kmenů bylo charakterizováno jako poddruh lactis. Pro genotypické rozdělení poddruhů lactis a cremoris nebyla metoda FISH vhodná. PCR byla vhodná pouze pro genotypické rozdělení kmenů L. lactis, které produkovaly, a nebo neprodukovaly nisin. Pro genotypické rozdělení poddruhů lactis a cremoris se nabízí např. metoda restrikční analýzy genů rRNA, metoda RAPD (Randomly Amlified Polymorphic DNA) nebo jiné metody, které by bylo dobré do budoucna případně experimentálně zavést. Tato práce byla podpořena Národní Agenturou pro Zemědělský Výzkum (NAZV QF 3163). Autoři děkují doc. Ing. Vojtěchu Radovi, CSc. (Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, Agronomická fakulta, Česká zemědělská univerzita v Praze) za možnost pracovat na fluorescenčním mikroskopu. Použitá literatura: CHOPIN, A., CHOPIN, M.C., MOILLO-BATT, A., LANGELLA, P. Two plasmid-determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid, 1984, vol. 11, pp. 260-263. DAVIES, E., DELVES-BROUGHTON, J. Nisin. In Encyclopedia of Food Mikrobiology (Robinson, R.C. and Pate, P., Eds.). London: Academic Press, 1999. 191-198 pp. DO, T.M., PLOCKOVÁ, M., CHUMCHALOVÁ, J. L. lactis subsp. lactis LTM 32, a new bacteriocin-producing strain isolated from Vietnamese fermented milk. Czech J. Food Sci., 2001, roč. 19, str. 171-176. DOOD, H.M., HORN, N., GASSON, M.J. Analysis of the genetic determinant for production of the peptide antibiotic nisin. J. Gen. Microbiol., 1990, vol. 136, pp. 555-566. DOOD, H.M., HORN, N., GIFFARD, C.J., GASSON, M.J. A gene replacement strategy for engineering nisin. Microbiology, 1996, vol. 142, pp. 47-55. ENGELKE, G., GUTOWSKI-ECKEL, Z., HAMMELMANN, M., ENTIAN, K.D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl. Environ. Microbiol., 1992, vol. 58, pp. 3730-3743. GARDE, S., BABIN, M., GAZA, P., NUÑEZ, M., MEDINA, M. PCR amplification of the gene acmA differentiates Lactococcus lactic subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol. 65, pp. 5151 – 5153. GASSON, M.J. Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast induced curing. J. Bacteriol., 1983, vol. 154, pp. 1-9. GASSON, M.J. Transfer of sucrose fermenting ability, nisin resistance and nisin production in Streptococcus lactis 712. FEMS Microbiol. Rev., 1984, vol. 21, pp. 7-10. 176
HORN, N., SWINDELL, S., DODD, H., GASSON, M.J. Nisin biosynthesis genes are encoded by a novel conjugative transposon. Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 228, pp. 129-135. KOZÁKOVÁ, D. Variabilita vlastností u laktokoků izolovaných z různých zdrojů. Diplomová práce. Praha: VŠCHT, ÚTMT, 2003. 20, 72 str. KUČEROVÁ, K. Fenotypické a genotypické rozlišení poddruhů L. lactis subsp. lactis a L. lactis subsp. cremoris. Diplomová práce. Praha: VŠCHT, ÚTMT, 2004. 53-68 str. KUIPERS, O.P., BEERTHUYZEN, M.M., DE RUYTE, P.G.G.A., LUESINK, E.J., DE VOS, W.M. Protein engineering and biosynthesis of nisin and regulation of transcription of the structural NisA gene. Int. Dairy J., 1995, vol. 5, pp. 785-795. LE BOURGEOIS, P., LAUTIER, M., VAN DEN BERGHE, L., GASSON, M.J., RITZENTHALER, P. Physical and genetic map of the Lactococcus lactis subsp. cremoris MG 1363 chromosome: Comparison with that of Lactococcus lactis subsp. lactis IL 1403 reveals a large genome inversion. J. Bacteriol., 1995, vol. 177, no. 10, pp. 2840-2850. MANIATIS, T., FRITCH, E.F., SAMBROOK, J. In Molecular Cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. 54 p. MANGIN, I., CORROLER, D., REINHARDT, A., GUEGUEN, M. Genetic diversity among dairy lactococcal strains investigated by polymerase chain reaction with three arbitrary primers. J. Appl. Microbiol., 1999, vol. 86, pp. 514 – 520. MOTER, A., GÖBEL, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods, 2000, vol. 41, pp. 85 – 112. PETŘÍKOVÁ, L. Přenos genů zodpovědných za produkci nisinu mezi kmeny Lactococcus lactis. Diplomová práce. Praha: VŠCHT, ÚTMT, 2003. 46, 62 str. RAUCH, P.J.G., DE VOS, W.M. Characterization of the novel nisin-sucrose conjugative transposon Tn5276 and its insertion in Lactococcus lactis. J. Bacteriol., 1992, vol. 174, pp. 1280 1287. SEMERÁDOVÁ, I. Základní charakteristika fenotypu a genotypu kmenů Lactococcus lactis produkujících nisin. Diplomová práce.Praha: VŠCHT, ÚTMT, 2002. 68 – 72 str. SCHLEIFER, K.H., HERMANN, M., BEIMFOHR, E., LUDWIG, W., AMANN, R. Application of molecular methods for classification and identification of lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 1995, vol. 5, pp. 1081 – 1094. TERZAGHI, B.E., SANDINE, W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophage. Appl. Microbiol., 1975, vol. 29, pp. 807-813. TRAMER, J., FOWLER, G.G. Estimation of nisin in foods. J. Sci. Food Agriculture, 1964, vol. 15, pp. 522-528. VAN DER MEER, J.R., POLMAN, J., BEERTHUYZEN, M.M., SIEZEN, R.J., KUIPERS, O.P., VAN DER VOSSEN, J., VAN DER LELIE, D., VANEMA, G. Isolation and characterization of Streptococcus cremoris Wg2 specific promoters. Appl. Environ. Microbiol., 1987, vol. 50, pp. 540-542. Kontaktní adresa: Eva Šviráková, Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika, tel: +420-220443271, fax: +420-220443285, e-mail:
[email protected]
177
MOŽNOSTI VZNIKU KONTAMINANTŮ INTERAKCÍ AROMATICKÝCH SLOŽEK S CHLOROVOU VODOU Uvíra Roman1, Pudil František1, Janda Václav2 1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav technologie vody a prostředí VŠCHT Praha POSSIBLE CONTAMINANTS PRODUCED BY INTERACTION OF AROMA COMPOUNDS WITH CHLORINATED WATER
Summary: Chlorination of model systems with aroma compounds was studied. Two mixtures were investigated, one with benzaldehyde, the other with 3-phenyl-1-propanol. Model systems were prepared by mixing sodium hypochlorite water solution with these aroma compounds. Reaction mixtures were analyzed by solid phase micro extraction (SPME) and analyzed by GC-MS. Changes of concentrations of volatile flavor components were observed. Oxidation was found to be the main chemical reaction. Chlorination process was also involved. In model mixture with benzaldehyde, chloro- derivatives such as chlorobenzaldehyde or trichlorophenol were identified. In model mixture with 3-phenyl-1-propanol, chloro- derivatives of methylbenzene, vinylbenzene and ethylbenzene were detected. These chlorinated derivatives were all detected at trace levels. A real risk of contamination of natural or flavored drinks by these components is discussed. ÚVOD Je známo, že při chloraci pitné vody vznikají reakcí chloru s přírodními organickými složkami trihalogenmethany, které jsou považovány za karcinogeny [1-3]. Zbytkový chlor přítomný v pitné vodě může reagovat i s dalšími složkami poživatin za vzniku chlorovaných kontaminantů. Přestože v tomto případě vzhledem k povoleným koncentracím zbytkového chloru (max. 0,3 mg/l) [4] nehrozí bezprostřední riziko, může se touto cestou zvyšovat zátěž lidského organismu nežádoucími kontaminanty. Cílem práce bylo prozkoumat na modelových pokusech s chlorovou vodou změny některých organických složek aromat. Byly vybrány komponenty, které se běžně vyskytují v přírodních aromatech nebo které se běžně používají do synthetických aromatických kompozic. Zvláštní pozornost byla věnována nenasyceným a karbonylovým látkám. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Příprava vzorku Pro modelové směsi byly použity standardy benzaldehydu (Loba Chemie, Rakousko) a 3fenyl-1-propanolu (Sigma-Aldrich, Německo). Modelová směs byla připravena rozpuštěním 10 µl standardu v 1ml Sava (max. 5% chlornanu sodného; Biochemie, ČR). Směs byla inkubována při 40 °C po dobu 5 hodin. Těkavé látky byly následně extrahovány po dobu 15 min metodou SPME za použití 65 µm vlákna Carbowax/Divinylbenzen (Supelco, USA). Instrumentace Pro separaci a identifikaci látek bylo použito plynového chromatografu GC 8000 s hmotnostním detektorem MSD 800 (oba Fisons Instruments). Analyty byly separovány na koloně DB-5 (Supelco, USA) o rozměrech 25 m × 0,2 mm a tloušťce filmu 0,33 µm. Nosným plynem bylo helium, průtok byl nastaven na 2 ml/min. Teplota injektoru a detektoru byla 220 °C, resp. 230 °C. Parametry teplotního programu: počáteční teplota byla 50 °C, dvě minuty po nástřiku začala teplota růst rychlostí 5 °C/min, po dosažení 220 °C byla tato teplota ponechána po dobu 20 min. Naměřená spektra byla porovnána s knihovnou spekter NIST (National Institute of Standards and Technology, USA).
178
VÝSLEDKY Interakcemi aromatických komponent s chlorovou vodou byl potvrzen vznik chlorovaných derivátů. Mechanismus vzniku těchto komponent a jejich přesná struktura (hlavně poloha atomů chloru) nejsou dosud známy. Současně byl pozorován vznik řady oxidačních produktů. Na obr.1 je znázorněna část analýzy reakční směsi obsahující benzaldehyd. Vedle chlorovaného benzaldehydu byly v reakční směsi identifikovány také izomery dichlormethylbenzenu, trichlormethylbenzen a trichlorfenol. Hmotnostní spektra těchto produktů jsou zobrazena na obr.2-5. Z oxidačních produktů benzaldehydu je ve významném množství zastoupena kyselina benzoová. Vybrané komponenty jsou uvedeny v tab.I. Sa mple ID : benz aldehyd + sav o
A cquired on 1 2- Ja n- 20 05 at 1 3: 31 :2 Scan E I+ TIC 6.41e7 RT
AL-ASH S2 100
20.661
10.912
16.488 17.479
%
11.123
22.926 20.771
11.728
12.361
23.788 21.542 16.644
13.792 16.387 15.259
0 10.000
22.605
24.770
15.507
rt 11.000
12.000
13.000
14.000
15.000
16.000
17.000
18.000
19.000
20.000
21.000
22.000
23.000
24.000
25.000
Obr. 1 Část GC-MS analýzy reakční směsi obsahující benzaldehyd. Identifikace viz. tab.I. Tab. I Seznam identifikovaných látek z reakční směsi obsahující benzaldehyd Retenční čas Látka Poznámka 10,912 benzaldehyd původní komponenta 16,387 chlorovaný benzaldehyd produkt chlorace 16,488 chlorovaný methylbenzen produkt chlorace 16,644 chlorovaný methylbenzen produkt chlorace 17,479 chlorovaný methylbenzen produkt chlorace 20,074 benzoová kyselina produkt oxidace 23,788 chlorovaný fenol produkt chlorace Sample ID: D200 chlorovana splitless spme 45min 25c Reverse fit factor [REV]: 933 140 D200CLA 1665 (15.297) C m (1665-1656) 8.11e4
139
43
100
140 %
27
29 39
41
75
50 49
74
51
69
0 R :933
141
111 76 101 83 84 99
142
112
143
128
WILEY 9990: BENZ ALDEHYDE, 4-CH LOROHit 1
139
100
140 111 141
% 50 0
27 20
29
37 38 49
30
40
50
75
51 55 61
74
60
70
77
113 85
110
142 143
114
m/z 80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
Obr. 2 Spektrum chlorbenzaldehydu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. 179
Sample ID: benzaldehyd + savo
Acquired on 12-Jan-2005 at 13:31:28 Reverse fit factor [REV]: 826 160
AL-ASHS2 1799 (16.525) Cm (1799-1765) 7.10e6
125
100
160
127
%
61 37
0
39
50
89
73
64
51
R:826
63
86
162
89 98 99 109
163
133 135
WILEY 17504: 3,5-DICHLOR OT OLU EN E Hit 1
125
100
160
%
127 38 39 44 50
0 20
30
40
89
62 63
50
60
70
123
99 101
73 75 80
90
162 159
128
133
164 m/z
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
Obr. 3 Spektrum dichlormethylbenzenu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. Sample ID: benzaldehyd + savo
Acquired on 12-Jan-2005 at 13:31:28 Reverse fit factor [REV]: 694 194
AL-ASHS2 2305 (21.166) Cm (2305-(2297+ 2312)) 3.00e5
158
100
160 % 28 31
50 60 61
73 70
0 R:694
122 75 84 123 96 134 79 107 117
161
194 195
162
196
157
199
WILEY 32366: 2,4,5-T RICHLOR TOLUENE Hit 1
159
100
161 194 196
% 39 0 20
123 61 63 73 79 89 97 158 125 50 51 99 109 135
40
60
80
100
120
140
163
160
193 180
198 200 200
m/z 220
240
Obr. 4 Spektrum trichlormethylbenzenu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. Sample ID: benzaldehyd + savo
Acquired on 12-Jan-2005 at 13:31:28 Reverse fit factor [REV]: 827 196
AL-ASHS2 2595 (23.825) Cm (2595-2584) 1.19e6
196
100
198 %
96
61 37 29 36
0
62 73
48 53
R:827
199
131 133
97
85 89
135
106 109
160 161
200
WILEY 130251: PHENOL, 2,4,5-T RIC HLOROH it 1
196 198
100 97
% 36 37
48 61
62 66
73
99 74
96
200
132
134
107
136
0 20
40
60
80
100
120
140
202
160 162 160
180
200
220
m/z 240
Obr. 5 Spektrum trichlorfenolu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. Na obr.6 je znázorněna část chromatogramu analýzy reakční směsi obsahující 3-fenyl-1propanol. Byly detekovány chlorované produkty methylbenzenu, vinylbenzenu a ethylbenzenu. Hmotnostní spektra těchto produktů jsou zobrazena na obr.7-9. Z oxidačních produktů byly zastoupeny 3-fenyl-1-propanal, a také benzaldehyd, který vznikl pravděpodobně z původně přítomného benzylalkoholu. Vybrané látky jsou uvedeny v tab.II. 180
Sa mple ID : fe nylpropanol + sav o
A cquired on 1 2- Ja n- 20 05 at 0 9: 29 :0
AD -AS HS1 20.102
100
Scan E I+ TIC 8.86e7 RT
21.515
18.644
17.846 13.517
10.912
%
16.149 14.434
17.085
16.470
19.515 22.157 0 10.000
11.000
12.000
13.000
14.000
15.000
16.000
17.000
18.000
19.000
20.000
21.000
22.000
23.000
24.000
rt 25.000
Obr. 6 Část GC-MS analýzy reakční směsi obsahující 3-fenyl-1-propanol. Identifikace viz. tab.II. Tab. II Seznam identifikovaných látek z reakční směsi obsahující 3-fenyl-1-propanol Retenční čas Látka Poznámka 10,912 benzaldehyd produkt oxidace 13,517 benzylalkohol původní komponenta 16,149 chlorovaný ethylbenzen produkt chlorace 16,47 chlorovaný vinylbenzen produkt chlorace 17,085 chlorovaný methylbenzen produkt chlorace 17,846 3-fenyl-1-propanal produkt oxidace 20,102 3-fenyl-1-propanol původní komponenta
Sample ID: fenylpropanol + savo
Acquired on 12-Jan-2005 at 09:29:07 Reverse fit factor [REV]: 858 160
AD-ASHS1 1858 (17.066) Cm (1858-1838) 2.99e6
125
100
127
% 62 39 44 50 51 28 38
0 R:858
63
73
89
77
122
99 107
79
160 162
WILEY 17510: BENZ ENE, (DICHLOROMETHYL)Hit 7
125
100
%
127 63 38 39 44 51 62
0 20
30
40
50
60
73 70
89
77 80
90
100
110
160 162
128
90 99 105 106 122
m/z
120
130
140
150
160
170
180
Obr. 7 Spektrum chlormethylbenzenu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. Sample ID: fenylpropanol + savo
Acquired on 12-Jan-2005 at 09:29:07 Reverse fit factor [REV]: 791 138
AD-ASHS1 1791 (16.452) Cm (1791-1811) 2.19e6
103
100
138 %
77
51 28 38 39
0 R:791
61
63
69
75
78
140 87 91 92
WILEY 9385: BENZ ENE, (1-CHLOROETHENYL)Hit 1
103
100
%
0
112
26 27 20
30
38 39 40
51 50 52 50
77 62 63
74
76 78
60
70
80
138 140
102 104 90
100
110
120
130
140
150
m/z 160
Obr. 8 Spektrum chlorvinylbenzenu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. 181
Sample ID: fenylpropanol + savo
Acquired on 12-Jan-2005 at 09:29:07 Reverse fit factor [REV]: 885 140
AD-ASHS1 1766 (16.223) Cm (1766-1742) 4.56e5
91
100
% 32
0
50
39
R:885
51
63
65
76 77 79 89
92
140
102 103
142
WILEY 10068: BENZ ENE, (2-CHLOROETH YL)H it 1
91
100
%
0
26 27 20
30
38 39 40
50
51 50
63 65 60
74 77 78 89 70
80
92
90
140
103 104 100
110
120
130
140
142 150
m/z 160
Obr. 9 Spektrum chlorethylbenzenu, nahoře naměřené spektrum, dole spektrum z knihovny NIST. DISKUSE Pro „chloraci“ pitné vody se v praxi používá plynný chlor nebo chlornan sodný. Chlor reaguje za běžných podmínek s vodou prakticky kvantitativně na kyselinu chlornou a chlorovodíkovou. Stupeň disociace kyseliny chlorné (a tedy koncentrace chlornanu) závisí už jen na pH vody (pK kyseliny chlorné činí přibližně 7,4). Ve vodě se tedy prakticky nikdy téměř nevyskytuje rozpuštěný plyn Cl2 (ze všech forem výskytu chloru začne převládat až pod pH 2). Přesto se v praktickém jazyce technologů slovo „chlorace“ běžně používá. Z hydrochemického hlediska je tedy lhostejné, jestli pro „chloraci“ použijeme plynný chlor nebo chlornan. V našem případě modelových chlorací bylo vhodnější použít roztok chlornanu sodného (Savo), než si pracně připravovat koncentrovanou chlorovou vodu. Se Savem byly samozřejmě provedeny slepé pokusy. Při GC-MS analýzách byly komponenty obsahující chlor identifikovány na základě izotopových příspěvků chloru. Je známo, že přírodní chlor se skládá ze dvou izotopů o atomové hmotnosti 35 a 37 (32,5%). Proto se v hmotnostních spektrech látek s atomem chloru vyskytují jednak ionty s izotopem chloru o m/e = 35, ale i ionty s izotopem chloru o m/e = 37 (tj. o dvě jednotky m/e vyšší) v uvedeném zastoupení. Pokud se v molekule (případně iontu) vyskytuje více atomů chloru, dochází analogicky k rozštěpení této molekuly nebo iontu ve spektru na více hmotnostních fragmentů. Toto charakteristické chování chlorovaných látek při MS analýzách je vidět na všech výše uvedených spektrech. Ve spektru chlorovaného benzaldehydu (obr. 2) jsou kromě molekulového (M) a M-1 iontu o hmotnostech 140, resp. 139 vidět i ionty s m/e 142, resp. 141. První dvojice obsahuje izotop chloru 35, druhá izotop chloru 37 v odpovídajícím poměru. Ještě složitější štěpení molekulového iontu M=196 je vidět v hmotnostním spektru nalezeného trichlorfenolu (obr. 5). Naposled zmíněný trichlorfenol, který za podmínek modelového pokusu vznikl z benzaldehydu, je nebezpečný kontaminant hlavně jako možný prekurzor vysoce toxických chlorovaných dioxinů [5]. Přestože byl identifikován v modelové směsi obsahující mnohonásobně větší množství chloru než je běžné, nelze toto riziko podceňovat, protože benzaldehyd je široce se vyskytující složkou mnoha potravin a poživatin. Vznik chlorovaných izomerů methylbenzenu z benzaldehydu není pravděpodobný. Mnohem pravděpodobnější je jejich vznik chlorací methylbenzenu, který se do reakční směsi mohl dostat jako nežádoucí artefakt, nicméně případný zdroj zatím nebyl nalezen. Chlorované sloučeniny nebyly v modelových pokusech hlavními produkty, vždy převažovaly oxidační a degradační produkty. Z toho lze usuzovat, že při použití chlorované pitné vody pro potravinářské účely nehrozí z hlediska vzniku chlorovaných kontaminantů bezprostřední riziko. Může se však jednat o jeden z minoritních zdrojů. 182
ZÁVĚRY Na modelových pokusech s vodným roztokem chlornanu sodného byl opakovaně prokázán vznik chlorovaných derivátů z benzaldehydu a 3-fenyl-1-propanolu. Současně byl pozorován vznik významného množství oxidačních produktů z benzaldehydu (kyselina benzoová) a 3-fenyl-1-propanolu (3-fenyl-1-propanal). V modelových směsích, kde koncentrace chloru řádově překračovala povolený limit, byly chlorované produkty nalezeny v nízkých koncentracích. Lze předpokládat, že při dodržení hygienického limitu obsahu chloru v pitné vodě nehrozí bezprostřední nebezpečí. Vznik nalezených chlorovaných derivátů v reálných systémech bude dále studován. Použitá literatura: 1. Rook, J.J. Formation of haloforms during chlorination of natural waters. J. Wtr. Treat. Exam. 1974, 23, 234. 2. Bellar, T.A.; Lichtenberg, J.J.; Kroner, R.C. The occurrence of organohalides in chlorinated drinking waters. J. Amer. Water Works Ass. 66, 1974, 739. 3. Xiangru, Z.; Minear, R. A. Decomposition of trihaloacetic acid and formation of the corresponding trihalomethanes in drinking water. Water Res. 2002, 36, 3665. 4. Vyhláška, kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody, 252/2004 Sb. 5. Dickson, L. C.; Karasek, L. W. Mechanism of formation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins produced on municipal incinerator flyash from reactions of chlorinated phenols. J. Chromatogr. 1987, 389, 127. Kontaktní adresa: Roman Uvíra, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, Praha 6, 16628,
[email protected]
183
ZHODNOCENÍ VLIVU POČTU SOMATICKÝCH BUNĚK NA SYŘITELNOST A JAKOST SÝŘENINY OVČÍHO MLÉKA Zajícová Pavlína, Kuchtík Jan Ústav chovu a šlechtění zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně EVALUATION OF THE EFFECT OF SOMATIC CELL COUNTS ON RENNETABILITY AND QUALITY OF RENNET CURDLING OF SHEEP MILK Summary: Evaluation of the effect of somatic cell counts on rennetability and quality of rennet curdling was realised on the basis of analyses of milk samples from 10 sheep (East Friesian x Improved Valachian). All ewes under study were on the 2nd lactation. The sampling was carried on 74th, 102 nd , 130 th, 160 th, 190 th and 222 nd day of lactation. Average values of somatic cell counts, rennetability and quality of rennet curdling varied between 147,2 – 2419,9 thousands./1 ml.; 183 – 282 s and 1,2 – 2,6. Significant positive correlations (P ≤ 0,01) between somatic cell counts and quality of rennet curdling were registered only on 130 th and on 190 th day of lactation. On the other hand between somatic cell counts and rennetability there were registered any significant correlations. Úvod Obecně je možno konstatovat, že jakost mléka je z pohledu jeho dalšího zpracování velmi důležitým kritériem. Na kvalitě mléka závisí jeho syřitelnost a následně pak jakost vzniklé sýřeniny. Jakost mléka je dána, kromě jiného, i počtem somatických buněk (PSB), který je ovlivněn řadou faktorů, mezi něž řadíme především výživu, zdravotní stav, fázi laktace a věk sledovaného jedince. Problematikou somatických buněk v ovčím mléce se ve svých pracech zabývali například Margetin et al. (1996), a to u bahnic Cigájské ovce a Zušlechtěné Valašky, a Gonzalo et al. (2000) u malých přežvýkavců. Vzhledem k tomu, že tato problematika nebyla ještě sledována u kříženek Východofríské ovce a Zušlechtěné Valašky, stalo se cílem naší práce zjištění PSB v mléce těchto kříženek a následně pak i zhodnocení vlivu PSB, zjištěných v mléce, na syřitelnost mléka a jakost vzniklé sýřeniny. Materiál a metodika Zhodnocení vlivu PSB ovčího mléka na jeho syřitelnost a jakost sýřeniny bylo realizováno na základě analýz vzorků mléka odebraných od bahnic, kříženek plemen Východofríská ovce x Zušlechtěná valaška, chovaných na ekologické farmě ve Valašské Bystřici. Do sledování bylo zařazeno mléko od 10 kusů bahnic na druhé laktaci. Odběry vzorků byly prováděny z ranního dojení, jež bylo prováděno strojně. Vzorky mléka byly odebírány v šesti časových intervalech, a to v průměrném 74., 102., 130., 160., 190. a 222. dni laktace. Celkově bylo zpracováno 60 vzorků mléka, do nichž nebyl ani v jednom případě přidán konzervační přípravek. Všechny vzorky mléka byly ihned po odběru vychlazeny na teplotu 5 – 8 °C a posléze, v termoboxu, převezeny do rozborové laboratoře mléka na MZLU v Brně a do rozborové laboratoře mléka v Brně – Chrlicích. Všechny bahnice byly v průběhu celého sledování chovány v identických podmínkách a po celou dobu sledování byly v dobrém zdravotním a výživném stavu. Celkový počet somatických buněk (tis./ml) byl stanovován v rozborové laboratoři mléka v Brně – Chrlicích, metodou průtokové cytometrie na přístroji BENTLEY 2 500. Syřitelnost byla stanovena jako okamžik prvního srážení mléka v sekundách (sec) po přídavku tekutého chymosinového syřidla. Srážení bylo prováděno při teplotě mléka 35°C takovou dávkou syřidla, aby se doba srážení mléka pohybovala v průměru mezi 120 – 240 s. V rámci celého hodnocení bylo používáno stabilizované syřidlo, uchované v koncentrovaném stavu. Stanovení jakosti sýřeniny bylo založeno na hodnocení kvality vzniklé sýřeniny po inkubaci zasýřeného mléka (Gajdůšek, 1999). Inkubace zasýřeného mléka byla prováděna v termostatu po dobu 1 hodiny při teplotě 35°C. Hodnocení jakosti sýřeniny bylo prováděno dle následujícího klíče: tř. 1: velmi 184
dobrá sýřenina, tř. 2: dobrá sýřenina, tř. 3: špatná sýřenina, tř. 4: velmi špatná sýřenina, tř. 5: nezřetelné nebo žádné vyvločkování kaseinu (Gajdůšek, 1999). Na základě výsledků laboratorních analýz bylo provedeno matematicko – statistické vyhodnocení formou výpočtu základních statistických hodnot. Poté byla pro vyhodnocení dynamiky změn mezi jednotlivými odběry aplikována jednofaktorová analýza variance s následnou aplikací mnohonásobného porovnávání. Pro výpočet korelačních koeficientů byla aplikována metoda dle Pearsona. Pro statistické zpracování bylo použito programu UNISTAT verze 5.1. Výsledky a diskuse PSB dosahoval v průběhu sledovaného období hodnot od 147,2 – 2419,9 tis./1ml, přičemž jejich nejvyšší naměřená hodnota byla zjištěna na konci laktace, což je v souladu s údaji, jež uvádějí Fruganti et al. (1985) a Konig et al. (1985). Průměrný PSB za sledovanou laktaci činil 656,2 tis./1ml. Nejnižší PSB byl stanoven ve 160. dni laktace a nejvyšší ve 130. dni laktace. Zde je však nutno dodat, že i když byl PSB na konci laktace, v rámci našeho sledování poměrně vysoký, všechny sledované bahnice byly v dobrém zdravotním stavu a bez jakéhokoliv klinického projevu mastitidního onemocnění. Syřitelnost ovčího mléka se pohybovala v rozmezí 183 – 282 sec. Průměrná doba syřitelnosti činila za celé sledované období 238 sec. Nejkratší, respektive nejdelší doba syřitelnosti byla zjištěna ve 102., respektive ve 190. dni laktace. Lze tedy konstatovat, že s výjimkou 4. a 5. odběru se ve všech případech pohybovala doba syřitelnosti v doporučeném rozmezí a to konkrétně v rozmezí od 120 do 240 sec. Jakost sýřeniny se pohybovala v průběhu laktace od 1,2 – 2,6. Nejlepší jakost sýřeniny (1,2) byla zjištěna při 2. odběru, kdy byl zaznamenán rovněž i nejnižší PSB a nejkratší doba syřitelnosti. Oproti tomu vysoce průkazně (P ≤ 0,01) nejhorší jakost sýřeniny (2,6) byla zjištěna v rámci posledního odběru. Dle našeho názoru toto zjištění korespondovalo se skutečností, že v rámci tohoto odběru byl zjištěn enormně vysoký PSB. Tab. 1: Zjištěné hodnoty sledovaných ukazatelů kvality ovčího mléka v průběhu laktace
PSB (tis/ml)
x
sx x
Syřitelnost (s.)
sx
Jakost sýřeniny
sx
x
74. (A) n = 10 230,7 f 384,2
102. (B) n = 10 147,2 f 313,1
229 59,17
183 39,7
1,4 0,51
F
1,2 0,42
Průměrný den laktace Ø 130. (C) 160.(D) 190. (E) 222. (F) n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 490,3 F 201,2 f 439,4 f 2479,9 abC 656,2 986,0 356,6 591,7 3465,6 de 1016,2 240 64,11
F
1,6 0,70
274 81,9 F
1,7 0,67
282 115,4 F
1,8 0,63
223 89,8 F
2,6
ABCDE
0,84
F -test 3,36*
239 75,01
2,12
1,7 0,63
5,61**
a, b, c, d, e, f - * - P ≤ 0,05, A, B, C, D, E, F - ** - P ≤ 0,01
Z hodnocení vlivu PSB na syřitelnost (tab. 2) především vyplývá, že ani v jednom případě nebyl zaznamenán průkazný vliv PSB na dobu syřitelnosti. Tato námi zjištěná skutečnost však nekoresponduje s údaji, jež uvádějí Pirisi et al. (1996), kteří zaznamenali vysoce statisticky průkaznou korelační závislost (P ≤ 0,01) mezi PSB a syřitelností. Na druhou stranu je však nutno konstatovat, že v 74., 102., 160. a 190. dni laktace byly zjištěny pozitivní korelace mezi PSB a dobou syřitelnosti, když opačný trend, tedy negativní korelace mezi těmito ukazateli byly zaznamenány ve 130. a 222. dni laktace. Z hodnocení vlivu PSB na jakost sýřeniny, oproti výše uvedenému hodnocení závislostí především vyplývá, že jakost sýřeniny byla ve 130., 190. a 222. dni laktace vysoce průkazně (P ≤ 0,01) ovlivňována PSB. Na druhou stranu je však nutno konstatovat, že v rámci ostatních odběrů nebyl ani v jednom případě tento trend zaznamenán, když například v rámci druhého odběru byla zjištěna negativní korelace mezi těmito ukazateli. 185
Tab. 2: Tabulka korelací
Syřitelnost Jakost sýřeniny
74. den PSB 0,34 0,59
102. den PSB 0,57 - 0,10
130. den PSB - 0,10 0,79 **
160. den PSB 0,43 0,29
190. den PSB 0,27 0,74 **
222. den PSB - 0,30 0,72**
* - ≤ 0,05; ** - ≤ 0,01 Závěr Z hodnocení změn PSB a jakosti sýřeniny v intervalu od 74. do 190. dne laktace vyplývá, že PSB ani v jednom případě nepřekročil hranici do 500 000 SB v 1 ml mléka, tedy doporučeného požadavku na kvalitní ovčí mléko, což se následně příznivě projevilo i na poměrně velmi dobré a vyrovnané jakosti sýřeniny. Co se však týká posledního odběru, na konci laktace, zde byl zaznamenán výrazný nárůst PSB, což se v konečném důsledku, dle našeho názoru, projevilo i na výrazném zhoršení jakosti sýřeniny. Co se týká doby syřitelnosti mléka, tato se do 130. dne laktace pohybovala v doporučeném rozmezí (120 – 240 s). Posléze však v následných dvou odběrech došlo k mírnému prodloužení doby syřitelnosti, přičemž však tato skutečnost neměla, dle našeho názoru, výrazný vliv na jakost sýřeniny, respektive nebyla ovlivněna PSB. Z hodnocení vlivu PSB na syřitelnost vyplývá, že ani v jednom případě nebyl zaznamenán průkazný vliv PSB na dobu sýřitelnosti. Naproti tomu však v případě jakosti sýřeniny byl zjištěn vysoce průkazný vliv PSB na tento ukazatel a to v rámci 3. 5. a 6. odběru. Použitá literatura: FRUGANTI G., RANUCCI S., TESEI B., VALENTE C. (1985): Valutazione dello stato sanitario della mammela di pecore durante un intero ciclo di lattazione. Clin. Vet., 108, 286 GAJDŮŠEK, S. (1999): Mlékařství II. – cvičení. MZLU v Brně, 59 –60 GONZALO C., TARDÁGUILA A., ARIZNABARRETA A., ROMEO M., MONITORO V., PÉREZ-GUZMÁN M.D., MARCO Y.J.C. (2000): Recuentos de células somáticas en el ganado ovino lechero y estrategias de control. Situacion en Espana. Ovis, 66, 21 - 27 KONIG C.D.W., FIETEN J.H.E., GELLING G. W. (1985): Le mastiti della pecora in Olanda. Sel. Vet., XXVI, 2, 216 MARGETIN M., ČAPISTRÁK A., ŠPÁNIK J. (1996): Somatic cells in sheep milk in relation to milk production and composition during suckling and milking. Živočišná výroba 41(12): 543 - 550 PIRISI A., PIREDDA G., PODDA F., PINTUS S. (1996): Effect of somatic cells count on sheep milk composition and cheesemaking properties. In: International symposium somatic cells and milk of small ruminants, Bella Italy, 25-27 Kontaktní adresa: Ing. Pavlína Zajícová, MZLU v Brně, ÚCHŠZ, Zemědělská 1, 613 00 Brno, email:
[email protected], tel.: 5 45 13 32 39
186
SPRÁVNA VÝROBNÁ PRAX (HACCP) A HYGIENICKÝ REŽIM V PRVOVÝROBE MLIEKA PRE ZABEZPEČENIE KVALITNEJ SUROVINY NA VÝROBU ZDRAVOTNE NEZÁVADNÝCH MLIEČNYCH PRODUKTOV Foltys Vladimír1, Lehutová Soňa2, Kirchnerová Katarína1 1 Výskumný ústav živočíšnej výroby, Nitra, 2 S.L. Konzult, Nové Mesto nad Váhom PROPER PRODUCTION PRACTICE (HACCP) AND HYGIENIC REGIME IN PRIMARY MILK PRODUCTION TO PRODUCE GOOD QUALITY RAW MATERIAL FOR PRODUCTION OF MILK PRODUCTS OF HEALTH SUSTAINING QUALITY Summary: The objective of this system is to provide safe products that will not damage the consumer’s health. A new system was elaborated that performs detailed analysis of risks, on their bases are settled control points that enable to avoid risks. For each point a critical limit is determined. There must be introduced a way to monitor the control point and to keep its critical limit. Corrective measures will be determined and methods of verification will be introduced. The result is introduction of well-arranged documentation after the decision tree of technological milk production scheme. Elaboration of the hygienic regime creates a part of the system; sanitation processes are elaborated in it, it contains recommended chemical preparations and working aids, and delegates workers who will exercise them. Elaborated documentation creates a part of it, and it is an annex to the hygienic regime.
Cieľ systému HACCP Cieľom systému HACCP je zabezpečiť, aby potraviny pre konzumenta boli bezpečné a nepoškodili jeho zdravie. Prvým krokom k tomuto cieľu je určenie rizík zdravotnej škodlivosti. Prevádzkovateľ musí identifikovať predvídateľné riziká, ku ktorým môže dôjsť v potravinovom reťazci v dôsledky výroby, skladovania, prepravy, predaja a prípravy pokrmov. Musí zhodnotiť závažnosť identifikovaných rizík z hľadiska pravdepodobnosti výskytu, závažnosti ich dôsledkov a pravdepodobnosti, že nebudú včas odhalené. Definícia HACCP Codex Alimentarius a Komisia pre mikrobiologickú špecifikáciu potravín definujú HACCP ako systém, ktorým sa určujú, hodnotia a kontrolujú riziká významné pre zdravotnú bezpečnosť potravín. Z predpisu Európskej komisie možno odvodiť definíciu, podľa ktorej je HACCP systém opatrení na zabezpečenie a preukázanie zdravotnej neškodnosti potravín.Je to nástroj, pomocou ktorého podnikový manažment organizačne a technicky zabezpečuje zdravotnú neškodnosť svojej produkcie od prvovýroby až po tanier konzumenta. HACCP je skrátené označenie utvorené zo začiatočných hlások anglického Hazard Analysis Critical Control Point. Je to pomenovanie systémového prístupu k zabezpečovaniu zdravotnej neškodnosti poživatín založeného na preventívnych opatreniach na rozdiel od samej kontroly hotového výrobku. Slovo “hazard” označuje agens, ktorý vyvolá ochorenie, poranenie alebo inú ujmu na zdraví u ľudí. Do slovenčiny to prekladáme ako “riziko”. Prenesenie anglického názvu významovo správne a terminologicky presne do iného jazyka je pomerne ťažké. Do slovenského jazyka je správny preklad “Analýza rizík a rozhodujúce kontrolné body”.
187
Metóda HACCP Vychádza zo skúseností a z poznatkov o výrobku a o procese jeho výroby a umožňuje predpovedať, k akej chybe môže dôjsť (=riziko), ako a v ktorom bode procesu môže nastať chyba. Na základe tejto úvahy (=analýza) sa zvolia body, v ktorých možno vykonať merania alebo pozorovania a pomocou nich možno preukázať, či bol proces pod kontrolou. Tieto body nazvali autori systému HACCP “rozhodujúce kontrolné body”. 7 všeobecných zásad pri vytvorení systému HACCP: Vykonanie podrobnej analýzy rizík, ktoré spôsobujú zdravotnú škodlivosť požívatiny, (vychádza sa pri tom zo surovín na výrobu, technologického procesu výroby a z vlastností výrobku). Podľa záverov analýzy rizík pre každé zdravotné riziko určiť rozhodujúci kontrolný bod, ktorým možno riziku predchádzať, ktorým možno riziko odstrániť alebo znížiť mieru rizika na prípustnú úroveň. Pre každý rozhodujúci kontrolný bod určiť aspoň jeden kritický limit veličiny, pomocou ktorého možno odlíšiť stav, v ktorom je riziko pod kontrolou a stav, v ktorom je riziko mimo kontroly. Zaviesť spôsob monitorovania rozhodujúceho kontrolného bodu a dodržanie jeho kritického limitu tak, aby sa zaručilo, že riziko zdravotnej škodlivosti je nepretržite pod kontrolou. Určiť nápravné opatrenie, ktoré sa musí vykonať vždy, keď sa monitorovaním zistí neprípustná odchýlka od kritického limitu. Určiť a zaviesť postupy preverovania účinnosti zvolených opatrení na zabezpečenie zdravotnej neškodnosti požívatiny. Zaviesť prehľadnú dokumentáciu plánovaných opatrení a zistených skutočností v priebehu uskutočňovania programu HACCP. Schéma č.1: Potravinový reťazec pre výrobu surového mlieka určeného na ďalšie spracovanie na finálny výrobok HACCP Surové kravské mlieko
VODA KRMIVO
CHOV
SKLADOVANIE
VÝROBA
188
EXPEDÍCIA
Správna výrobná prax výroby surového kravského mlieka obsahuje : I. Personálne zabezpečenie II. A Popis chovu B Popis výrobku III. Technológiu výroby 1. Technologická schéma výroby kravského mlieka (Schéma č. 2) 2. Technologický postup výroby kravského mlieka - krok 1. DOJNICA - zdravotný stav - výživa - napájacia voda - ustajnenie - krok 2. PRÍPRAVA - dojáreň, technologické zariadenie - dojnice - dojiči - krok 3. DOJENIE - mliečna žľaza - kvalita mlieka - krok 4. FILTRÁCIA MLIEKA - kvalita filtra - krok 5. CHLADENIE MLIEKA - teplota a čas schladenia - krok 6. SKLADOVANIE MLIEKA - teplota a čas skladovania - krok 7. PREBERANIE MLIEKA - teplota - zmyslové posúdenie - spôsob prečerpávania mlieka IV. Analýza nebezpečenstva (Schéma č. 3) V. Plán sledovania kritických kontrolných bodov a kontrolných bodov VI. Označenie kritických kontrolných bodov v teréne VII. Verifikácia systému HACCP VIII. Revízia systému HACCP Súčasťou správnej výrobnej praxe výroby surového kravského mlieka je HYGIENICKÝ REŽIM. Hygienický režim je vypracovaný ako samostatná časť systému a obsahuje : I. Organizačné, materiálové, personálne, technické a ekonomické zabezpečenie udržiavania sanitácie technologických zariadení, priestorov a objektov organizácie - organizačné a personálne zabezpečenie, - materiálové a technické zabezpečenie, používané chemické príspevky, - ekonomické zabezpečenie. II. Členenie priestorov výrobných a nevýrobných, čistej a nečistej zóny (schémy) III. Metodika sanitácie a systém sanitačných postupov - analýza nebezpečenstva, - postupy sanitácie, - verifikácia sanitačných postupov. IV. Zásobovanie pitnou vodou - popis zdroja, - plán kontroly. V. Odpadové hospodárstvo - postupy sanitácie, - zber a zvoz odpadu. VI. Dezinfekcia a deratizácia - systém a plán kontroly škodcov. VII. Opatrenia proti prenosným chorobám a zásady dodržiavania osobnej hygieny. VIII. Školenia. IX. Verifikácia hygienického režimu. X. Revízia 189
Schéma č. 2 Technologická schéma výroby kravského mlieka Celkový zdravotný stav
CCP
DOJNICA krok 1.
PRÍPRAVA dojárne, technologického zariadenia, dojnice a mliečnej žľazy a dojiča
Výživa
CP
Napájacia voda
CP
Ustajnenie
CP CP
krok 2.
Meranie nadojeného mlieka
HYGIENICKÝ REŽIM
CCP2
Mlieko:
DOJENIE
oddojenie prvých strekov a zmyslové posúdenie
krok 3.
FILTRÁCIA MLIEKA
Kvalita filtra
krok 4.
CHLADENIE MLIEKA krok 5.
SKLADOVANIE MLIEKA krok 6.
CCP
CP
Čas a teplota schladenia mlieka po nadojení
CCP
Čas a teplota skladovania mlieka
CCP
Teplota chladenia
CCP
Zmyslové posúdenie
CCP
PREBERANIE MLIEKA krok 7.
190
Schéma č. 3 Analýza nebezpečenstva HYGIENICKÝ REŽIM TEPLOTA A KONCENTRÁCIE ROZTOKOV, ČAS OKRUH.ČISTENIA A DEZINFEKCIE, CCP2 PH PREPLACH.VODY
STOP
nie
KL
Záznam
KL
Záznam
vyhovuje
áno
krok 1
DOJNICA - zdravotný stav CCP1 mliečna žľaza
CP
Záznam
Napájacia voda CP
Záznam
Ustajnenie
Záznam
Výživa STOP
nie
vyhovuje
áno
CP
PRÍPRAVA dojárne, technolog.zariadenia, dojnice, dojiča CP
krok 2
DOJENIE mliečna žľaza CCP1 kvalita mlieka
krok 3
STOP
nie
Záznam
KL
Záznam
vyhovuje
áno
krok 4
FILTRÁCIA MLIEKA kvalita filtra CP
krok 5
CHLADENIE MLIEKA CCP1 teplota, čas STOP
nie
Záznam
KL
Záznam
KL
Záznam
KL
Záznam
vyhovuje
áno
krok 6
SKLADOVANIE MLIEKA
CCP1 teplota, čas STOP
nie
vyhovuje
áno
krok 7
PREBERANIE MLIEKA CCP1 STOP
nie
teplota, zmyslovo vyhovuje
áno
191
APLIKACE AFM PRO STUDIUM VLASTNOSTÍ KASEINU Trčková Jana1, Helstad Kristina2, Dejmek Petr2, Štětina Jiří1 1 Ústav technologie mléka a tuků, VŠCHT Praha 2 Department of Food Engineering, Lund University, Sweden APPLICATION OF AFM FOR STUDY OF CASEIN Summary: Atomic Force Microscopy (AFM) was used for imaging casein micelles and determination of their rheological properties. Casein micelles (0.02 % w/w) in imidazole buffer have been adsorbed on a hydrophobic graphite surface in a liquid cell of AFM. Rheological properties were measured on spherical casein micelle as its elasticity. Penetrations in the same measuring point showed no differences (curves of deflection vs Tip position had the same shape). Also change of tip velocity did not influence stiffness of micelle. Casein micelles behaved elastically during all measurement. Obviously a thin layer of casein was found on graphite and micelle surface. AFM is also possible to use for imagine of change after rennet addition and interactions of casein with hydrocolloids. Úvod Mikroskopie atomárních sil (AFM – Atomic Force Microscopy) začala být velmi používaná pro zobrazení biomateriálu v malém měřítku (nanometry) a měření jejich mechanických vlastností v přirozeném prostředí (v hlavici zaplněné kapalinou). Například pro zobrazení struktury DNA, jednotlivých buněk, bakterií, bílkovin, fosfolipidů atd. (Morris a kol., 2001). V kontaktním módu AFM (kontakt hrotu se vzorkem) je také možné určit nanoreologické vlastnosti vzorku. Příkladem může být měření elasticity gelu želatiny (Uricanu a kol., 2003). Kasein je hlavní bílkovinou kravského mléka. Jeho složky αS1-, αS2-, β- a κ- kasein se shlukují do kulovitých agregátů (micel) a vážou se k sobě pomocí vápenatých můstků, fosforečnanu vápenatého a malého množství citrátu. Velikost micel je od 40 do 300 nm (průměrně 150 nm). κ-Kasein vytváří na povrchu micely vrstvu řetězců, která stabilizuje micelu ve vodném prostředí. Pomocí AFM byly studovány jednotlivé bílkoviny mléka (β-casein, β -laktoglobulin, α-laktalbumin) a jejich povrchové vlastnosti (Mackie a kol., 1998; Gunning a kol., 1996). Lokální strukturu syrovátkových bílkovin popsal také Ikeda a Morris (2002). Princip AFM při měření v kontaktním módu je znázorněn na obr.1. Přitažlivé síly působící mezi vzorkem a hrotem, který je upevněn na raménku, způsobují ohyb raménka. Velikost ohybu je snímána laserovým paprskem, který je v počítači zpracován v obraz povrchu vzorku. V předložené práci se kaseinové micely naadsorbovaly na hydrofobní povrch grafitu. Byly měřeny reologické vlastnosti na sférické micele kaseinu vyjádřené jako její elasticita. Dioda laseru
detektor
Raménko
Nástavec s kapalinou
kapalina vzorek piezoskener
Obr.1 Princip AFM (www.mih.unibas.ch). 192
Materiály a metody Vzorek kaseinu pro měření byl získán rozmícháním zamrazeného kaseinového koncentrátu v pufru imidazolu na výslednou koncentraci 0,02 % hm. kaseinu. Kaseinový koncentrát byl připraven mikrofiltrací, diafiltrací a ultrafiltrafiltrací pasterovaného a odstředěného kravského mléka (22 % hm. kasein, 0,1 % hm. tuk, 2,6 % hm. laktosa, 0,85 % hm. vápník, 0,51 % hm. fosfor; ArlaFoods, Švédsko). Pufr imidazolu obsahoval 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2 . 6 H2O, 20 mM imidazolu (C3H4N2) v MilliQ-vodě. U pufru bylo upraveno pH na hodnotu 7 pomocí zředěné HCl. Vzorek kaseinu byl připraven 2 dny před měřením a uchováván při 10 °C. Nově upravený povrch grafitu (po odstranění předcházející vrstvy) byl vložen do AFM do hlavice na kapalinu (grafit – HOPG Advanced Ceramics Brand Grade ZYPTM/SPI Supplies, West Chester, PA 19380 USA). Do hlavice byla vstříknut pufr imidazolu a přístroj byl nakalibrován. Dále byl vstříknut vzorek kaseinu a takto byl ponechán 2 hodiny k naadsorbování kaseinu na povrch grafitu. Poté byl přebytečný roztok kaseinu odstraněn dalším pufrem imidazolu. Měření probíhalo při 25 °C. Pro měření byl použit AFM přístroj NanoScope III software (Veeco Instruments Inc. Santa Barbara, CA, USA) vybavený skenerem (typ J, max. velikost skenování 120 µm) a hlavicí pro výměnu kapaliny. Raménko použité pro měření bylo vyrobeno z nitridu křemíku, tvaru V, s konstantou pružiny 0,06 N/m. Hrot na raménku měl tvar čtvercové pyramidy s úhlem 35°, koncový průměr 20 nm (Model # MSCT-AUNM, P/N 00-103-090, wafer#170-71#199 10/01, Veeco Inc. Santa Barbara, CA, USA). Zobrazení povrchu vzorku a následné vyhodnocení měření bylo provedeno pomocí NanoScope software verze 5.12r3. Výsledky Ukázka zobrazení povrchu grafitu a měřených kaseinových micel je na obr. 2 (velikost měřené oblasti – 3 x 3 µm, průměrná výška kaseinových micel – 130 nm). 2a
2c
2b
2d
Obr. 2 2a. Povrch grafitu. 2b, c, d. Kaseinové micely. 2d. Měření elasticity kaseinové micely v daném bodě.
193
Elasticita gelu byla měřena jako závislost velikosti výchylky hrotu d (deflection) na vzdálenosti hrotu ke vzorku z (z-position). Princip měření elasticity na kaseinové micele je zobrazen na obr. 2d a obr. 3. Výsledná závislost je ukázána na obr. 4. Průběh měřených křivek se v zásadě nelišil. d výchylka hrotu (nm) z vzdálenost hrotu ke vzorku (nm) h výška micely
Obr. 3 Měření elasticity kaseinové micely v závislosti výchylky hrotu d na vzdálenosti hrotu ke vzorku z.
výchylka hrotu d (nm)
1. měření 2. měření
vzdálenost hrotu ke vzorku z (nm)
Obr. 4 Vyjádření elasticity kaseinové micely. Penetrace do kaseinové micely ve stejném bodě měření. Pevnost kaseinové micely byla měřena při různých rychlostech penetrace hrotu do stejného místa kaseinové micely (rychlost penetrace 120 – 6700 nm/s). Pevnost kaseinové micely byla vyjádřena jako směrnice křivky závislosti d na z od bodu dotyku hrotu s kaseinovou micelou. Pevnost kaseinové micely zůstávala po celou dobu měření bez větších změn viz obr. 5. Rychlost deformace ((∆h/∆t)/h0, ∆h/∆t – rychlost penetrace (nm/s), h0 – výška micely (nm)) se pro pohybovala v rozmezí 0,8 – 42 s-1. 0.1
Rychlost penetrace (nm/s) 1200 120 6700 1200
0.09
6700
6700
pevnost
0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0
1
2
3 4 počet měření
5
6
7
Obr. 5 Pevnost kaseinové micely při různé rychlosti penetrace. 194
Závěr Měření penetrace v jednom bodě micely byly stále stejné (průběh měřených závislostí výchylky hrotu na jeho pozici se neměnil). Také změna rychlosti hrotu neovlivnila pevnost micely. Kaseinové micely se chovaly elasticky po celou dobu měření. Z průběhu měření bylo zřejmé, že na povrchu grafitu a kaseinové micely byla naadsorbována tenká vrstva kaseinu. Měřením v AFM je dále možné ukázat účinky syřidla na kaseinové micely a interakce kaseinu s hydrokoloidy (obr. 6).
Obr. 6 Zobrazení gelu karagenanu (2 % hm. karagenanu v 0,1 M KCl) pomocí AFM. Literatura: Gunning, A.P., Wilde, P.J., Clark, D.C., Morris, V.J., Parker, M.L. and Gunning, P.A. (1996). Atomic force microscopy of interfacial protein films. Journal of Colloid and Interface Science, 183, 600-602. Ikeda,S. and Morris, V.J. (2002). Fine-stranded and particulate aggregates of heat-denatured whey proteins visualized by atomic force microscopy. Biomacromolecules, 3, 382-389. Uricanu, V.I., Duits, M.H.G., Nelissen, R.M.F., Bennink, M.L. and Mellema, J. (2003). Local structure and elasticity of soft gelatin gels studied with atomic force microscopy. Langmuir, 19(20), 8182-8194. Mackie, A.R., Gunning, A.P., Wilde, P.J. and Morfia, V.J. (1999). Orogenic displacement of protein from the air/water interface by competitive adsorption. Journal of Colloid and Interface Science, 210, 157–166. Morris, V.J., Kirby, A.R. and Gunning, A.P. (2001). Atomic force microscopy for biologists. London: Imperial College Press.
195
DODÁVKY SUROVIN DO POTRAVINÁŘSKÉHO PRŮMYSLU SUROVINY PRO MLÉKÁRENSTVÍ STABILIZÁTORY A ZAHUŠŤOVADLA ◦ Modifikované a předželované škroby ◦ Pektiny ◦ Mléčné proteinové koncentráty ◦ Maltodextriny ◦ Karagenany ◦ CMC
◦ Xantanová guma ◦ Svatojánský chléb ◦ Guarová guma, guma tara ◦ Agar agar, arabská guma ◦ Želatina…. atd.
OSTATNÍ SUROVINY ◦ Sušená zelenina ◦ Zeleninové koncentráty a protlaky ◦ Ovocné koncentráty a protlaky ◦ Sušené ovoce ◦ Sorbitol ◦ Fruktóza
◦ Aromata prášková a tekutá ◦ Obalovací systémy (strouhanky, panády) ◦ Vitamíny a minerální látky ◦ Tekuté kouře ◦ Dekorační posypy (oříšky, mandle..) ◦ Karob, laktoza
ZASTOUPENÍ ZAHRANIČNÍCH VÝROBCŮ – NAPŘ:
ZAJIŠŤUJEME TECHNOLOGICKÝ SERVIS A PORADENSTVÍ BARENTZ, spol. s.r.o., Za Tratí 752, 339 01 Klatovy tel + 420 376 32 16 12 fax +420 376 32 15 10 http://www.barentz.cz
[email protected]
NAVŠTIVTE NAŠI NOVOU WWW STRÁNKU PRO VÍCE INFORMACÍ
FOSS
První v analýze potravin, v nové organizaci ještě silnější.
Co nabízíme:
CombiFoss FC
¾ Špičkové zabezpečení Vašich laboratorních potřeb ¾ Centrální testování jakosti mléka a automatizací prací laboratorním robotem ILAS 3000 ¾ Kontrolu surovin, výrobních procesů a finální jakosti ¾ Nejmodernější technologie a laboratorní přístroje ¾ FOSS průtokovou cytometrii ¾ FTIR /Fourier IR spektrofotometrii/ ¾ NIR, NIT /blízká IR oblast/ ¾ Moderní jednoduchá a jednotná softwarová řešení ¾ In-line, on-line, at-line systémy a přístroje ¾ Identifikaci vzorků a automatizované zpracování dat ¾ Kontakty se zahraničními pracovišti, možnost konzultací a zapracování pracovníků
ILAS 3000
Parametry : Kontrola hygienických limitů /CPM, PSB/, obsahových složek mléka-tuku, bílkovin, laktózy, sušiny, tukuprosté sušiny,kaseinu, indikátorů změn mléka-podílu volných mastných kyselin, bodu mrznutí, močoviny, kyseliny citrónové, mléčné, vlhkosti, popelovin, NaCl, cukrů, pH, kvasinek, plísní, E.coli, koliformních mikroorganismů.
Naše přístroje Vám pomohou řešit kontrolu plnění požadavků vyhlášek 77/2003 Sb. a 203/2003 Sb.
FoodScan
Kontakty:
Fossomatic Minor
Milcom servis a.s., Hostivařská 56, 102 00 PRAHA 10 Tel.: +420 274 867 459, fax: 274 868 236 E-mail:
[email protected] [email protected] WWW.MILCOM.CZ WWW.FOSS.DK
MilkoScan Minor
Spoleãnost Fisher Scientific spol. s r.o. Pardubice je dodavatelem ‰irokého sortimentu laboratorních pomÛcek, chemikálií, pfiístrojÛ a nábytku. ZákazníkÛm z laboratofií ve ‰kolách, zdravotnictví, lékárnách, univerzitách a v˘zkumn˘ch ústavech, laboratofií úpraven vod, z laboratofií v prÛmyslov˘ch podnicích, jako napfi. potravináfisk˘ prÛmysl, prÛmysl chemie, v˘roby a zpracování plastÛ, skláfisk˘ a keramick˘ prÛmysl, dodáváme ve‰keré bûÏné zboÏí nutné pro denní chod laboratofie, aÏ po vybavení nov˘ch nebo rekonstruovan˘ch laboratofií na klíã. Základem nabídky jsou tyto skupiny zboÏí:
POMÒCKY ZE SKLA A PORCELÁNU
P¤ÍSTROJE PRO MECHANICKÉ ÚPRAVY BûÏné varné nádoby z borosilikátové- VZORKÒ ho skla, jako kádinky, baÀky, zábrusové díly a aparatury, odmûrné sklo jako válce, odmûrné baÀky, pipety a byrety, lahve na vzorky, exikátory, misky, tavné kelímky a dal‰í.
POMÒCKY Z PLASTÒ, PRYÎE, KOVU Nezbytné stojany a klemy, kahany, pinzety, skalpely, ‰pachtle, lÏiãky, misky z kovu. Nádoby z plastÛ, jako kádinky, odmûrné válce a baÀky, misky, podloÏky. V˘bûr hadic z bûÏn˘ch i speciálních materiálÛ, spojky a rozboãky hadic. Sortiment lahví z PE a PP, kanystry. PomÛcky k pfieãerpávání kapalin, k odebírání vzorkÛ kapalin i pevn˘ch látek v terénu i v provozech.
DROBNÉ P¤ÍSTROJE PRO PRÁCI S KAPALINAMI Dávkovaãe na zásobní lahve, mikropipety, digitální byrety, mikrostfiíkaãky, mechanické i elektrické nástavce pro práci se sklenûn˘mi pipetami.
FILTRY ·irok˘ sortiment filtraãních papírÛ a membránov˘ch filtrÛ z bûÏn˘ch i speciálních materiálÛ. Nerezové i sklenûné filtraãní sestavy.
P¤ÍSTROJE PRO TEMPERACI A CHLAZENÍ Su‰árny, klimatické komory, inkubátory, sterilizátory, obûhové termostaty, vodní láznû, mrazicí boxy, muflové ãi trubicové pece.
Magnetická i hfiídelová míchadla, tfiepaãky, dispergátory, ml˘nky, síta, ultrazvukové pfiístroje, odstfiedivky.
DAL·Í POMOCNÉ P¤ÍSTROJE V˘vûvy membránové i olejové, zubová ãi peristaltická ãerpadla, dávkovací ãerpadla. Destilaãní pfiístroje, rotaãní odparky. Aparatury pro úpravu vody. Studentské i vûdecké mikroskopy.
Mù¤ICÍ P¤ÍSTROJE Sklenûné i elektronické teplomûry, vlhkomûry, pfiístroje pro záznam teploty a vlhkosti, tlakomûry, prÛtokomûry. Technické i analytické elektronické váhy, závaÏí. Elektrochemické pfiístroje pro mûfiení pH, vodivosti, rozpu‰tûného kyslíku,elektrody, kombinované pfiístroje, titrátory. Spektrofotometry, pfiístroje pro vyhodnocování barevnosti pevn˘ch látek. Refraktometry, polarimetry.
LABORATORNÍ A KANCELÁ¤SK¯ NÁBYTEK BûÏné i speciální sestavy nábytku s díly z u‰lechtil˘ch, odoln˘ch materiálÛ. Digestofie, bezpeãnostní skfiínû, vahové stoly. Sestavy kanceláfiského nábytku s návazností na design nábytku laboratorního. Îidle a kfiesla do kanceláfií i do provozÛ.
CHEMIKÁLIE Velmi ‰irok˘ sortiment chemikálií v ãistotû p.a., v mal˘ch baleních. Normanaly.
Fisher Scientific spol. s r.o. KosmonautÛ 324, 530 09 Pardubice, fax 466 435 008, e-mail:
[email protected]
Specialisté v oboru molekulové spektroskopie FT-NIR analyzátory potravinářských výrobků Stanovení běžných parametrů potravinářských výrobků za několik minut, bez destrukce vzorku a potřeby chemikálií. Zakázkový vývoj metod, včetně automatizace stanovení, bezplatné předvedení přístrojů s možností měření vlastních vzorků.
Aplikační, servisní a obchodní středisko: Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem 11 106 00 Praha 10 T/F: 272 760 432, 272 768 569 Mobil: 602/325829, 603/554788, 603/725812
ThermoNicolet
FTIR, FTNIR, Raman, Microscopy
Kvalita spektrometrů Nicolet ověřena více než 200 uživateli v ČR a SR.
&
EuroMilk
milk makes you happy
STARTOVACÍ KULTURY A MEDIA DANISCO bylo založeno v Grinstedu, v Dánsku v roce 1924. Od této doby společnost stále rostla a dnes je jedním z největších světových výrobců potravinářských ingrediencí na světě. Připojením dánsko-německé firmy WISBY se sortiment firmy DANISCO rozšířil o širokou nabídku startovacích kultur a medií. Prostřednictvím celosvětové obchodní sítě zásobuje svými výrobky mlékárenský, masný, pekařský a farmaceutický průmysl ve více než 100 zemích světa. V květnu roku 2004 byla realizována akvizice společnosti Rhodia Food. Společnost Danisco tímto významně posílila svoji pozici v celosvětovém měřítku. DANISCO obchoduje s více než stovkou druhů startovacích kultur v různých formách – -
-
-
mezofilní a thermofilní startovací kultury od vícekmenových směsných kultur po jednokmenové kultury pro výrobu jogurtů a jiných fermentovaných mléčných výrobků dále čerstvých, měkkých, polotvrdých a tvrdých sýrů a másla. media a bioaktivátory zlepšují růst a aktivitu mezofilních a thermofilních provozních zákysů a zvyšují stabilitu a bezpečnost výroby plísňové kultury především pro sýry nebo fermentaci uzenin kultury pro povrchové zrání a kvasinky pro různé typy sýrů včetně sýrů zrajících pod červeným mazem a pro sýry s bílou plísní propionové bakterie pro zrání sýrů ementálského typu kefírové kultury pro fermentaci mléčných výrobků ochranné kultury k potlačení růstu patogenních bakterií, plísní, kvasinek a jiných nežádoucích bakterií při výrobě jogurtů, tvarohů, sýrů a dalších zakysaných výrobků. Tyto ochranné kultury nemají vliv na senzorické vlastnosti finálního produktu probiotické kultury - jedno i více kmenové kultury pro použití v mléčné i nemléčné oblasti potravinářství
Kultury i media jsou dostupné v několika tržních druzích navržených tak,aby vyhovovaly speciálním požadavkům zákazníků v mlékárenství i dalších průmyslových odvětvích.Jedná se zejména o hlubocezmrazené nebo lyofilizované kultury pro přímé zaočkování nebo k výrobě provozních zákysů. Společnost DANISCO je držitelem certifikátů kvality jakosti ISO 14001, ISO 9001, HACCP . Společnost Euromilk zajišťuje odborné poradenství a provozní zkoušky ve spolupráci s panem Ing. Michaelem Uhlem, technologickým manažerem DANISCO ve Vídni. Na provozní zkoušky poskytujeme vzorky kultur v přiměřeném množství. Pravidelně 1x měsíčně dodáváme objednané kultury přímo do mlékáren, případně dle specifických požadavků zákazníka.
Pravidelná linka DANISCO 2005 měsíc leden únor březen duben květen červen červenec srpen září říjen listopad prosinec
dny dodání po-pá 10.-14. po-pá 14.-18. po-pá 14.-18. po-pá 11.-15. po-pá 16.-20. po-pá 13.-17. po-pá 11.-15. po-pá 15.-19. po-pá 12.-16. po-pá 10.-14. po-pá 14.-18. po-pá 12.-16.
objednávka do 5.ledna 9.února 9.března 6.dubna 11.května 8.června 6. července 10. srpna 7.září. 5.října 9.listopadu 7.prosince
Expresní dodávka - mimo termín pravidelné linky Vám doručíme zboží do 5 pracovních dnů, v tomto případě mohou být účtovány vyšší náklady za individuelní dopravu Doba použitelnosti - je dána konkrétní specifikací kultury,nejméně 3 měsíce od data dodání Výhody dlouhodobé spolupráce při uzavření smlouvy - od 1,- mil.Kč/rok pro Vás připravíme individuelní podmínky - na 2500 ks hlubocezmrazených kultur - získáte mrazicí truhlu - na 1200 ks lyofilizovaných kultur - doprava zdarma
Euromilk s.r.o. , Na Svobodném 160, 280 02, Kolín 6, tel+fax 321 724 744, 321 724 749 e-mail:
[email protected] , www.euromilk.cz , mobil 602 743 775 – Jiří Brzobohatý Pro více informací můžete navštívit – www.danisco.com
Čistící a Sanitační desinfekční zařízení prostředky
Hygienický audit
Sanitační plány
Česká republika MERAK, spol. s r.o. Šimáčkova 190 628 00 Brno Tel.: 548 210 777 Fax: 548 210 666 e-mail:
[email protected] www.merak.cz
GHP + HACCP
Školení personálu
Ekonomika sanitace
Servis sanitač. zařízení
CIP stanice
Dávkovací a měřící technika
Nakládání s chemic. přípravky
Slovensko MERAK, spol. s r.o. Báč 126 930 30 Báč Tel.: 031/5501171 Fax: 031/5501172 e-mail:
[email protected] www.merak.sk
Aplikace impedanční metody detekce mikroorganismů BacTrac 4300 nebo µ-Trac 4200 Redukce provozních nákladů a časové náročnosti Délka testu Aplikace
Citlivost
Celkový počet
1 CFU/g
1)
BacTrac >106: 6-10 hod >104: 10-15 hod >102: 15-20 hod >100: 20-24 hod
Počítání kolonií 3 dny
Kvasinky a plísně
1 CFU/g
1)
max 72 hodin
5-14 dní
Koliformní
1 CFU/g
1)
<16 hodin
1-2 dny
Enterobacteriaceae Salmonella
1 CFU/g
1)
<16 hodin 30-40 hodin včetně předinkubace 66 hodin včetně předinkubace 48 hodin C.perfringens 24hod. 48 hodin
1-2 dny 4-5 dní
1 CFU/25g 2) 1 CFU/25g 2)
Listeria Clostridia Staphylococcus aureus
1 CFU/g 1 CFU/g
1) 2)
5-7 dní 3-5 dní 2-4 dny
Poznámky, výhody Není potřeba žádné ředění vzorku, Automatické stanovení CFU Není potřeba ředění, Aut. stanovení CFU Snadná kontrola a vyhodnocení Není potřeba ředění, snadné vyhodnocení Rychlá předinkubace 6-7 hod Potvrzení možné přímo v měřicích ampulích, Jsou k dispozici anaerobní měřicí ampule,
Není nutné ředění Redukce doby karantény produktu a pracovní náročnosti Metoda minimalizuje manipulaci se vzorky a s ní spojená rizika Automatická registrace výsledků, exaktní dokumentace a protokoly Kontrola a přenositelnost výsledků, analýza trendů a statistitiky
výroba
SY-LAB Geräte GmbH, Tullnerbachstrasse 61-65, A-3011 Neupurkersdorf Tel. +43 223162252-0, http://www.sylab.com prodej v ČR a SR
E-Lab Services, spol. s r. o. , U Václava 73, 184 00 Praha 8 Tel/Fax 284689168, 602286410,
[email protected], Ing. Karel Hořínek
dodává diagnostické soupravy a testy pro rychlou a nenáročnou kontrolu kvality a hygienické nezávadnosti potravin, přístroje pro přesné analýzy složení mléka a mléčných produktů
Mikrobiologie
Z nabídky vybíráme:
♦ UNI-LITEa UNI-LITE NG Představujeme luminometry pro kontrolu hygieny: • Velmi přesné luminometry používající BIOTRACE reagencie • Vhodné ke zjišťování čistoty povrchu v mlékárnách • Monitoruje efektivitu používaných desinfekčních a čistících prostředků • Detekuje kontaminaci v oplachových vodách
♦ SUŠENÉ ŽIVNÉ PŮDY BIOKAR Ucelené spektrum sušených živných půd, aditiv a supplementů pro klasickou potravinářskou mikrobiologii
Chemie potravin
♦ PETRIFILM Destičky pro přesnou kontrolu mikrobiologické kvality potravin nebo prostředí potravinářských provozů. Médium je přímo připravené k inokulaci vzorků. K dispozici pro stanovení: CPM, koliformních (detekce již za 6-8 hodin), E. coli, enterobacteriaceae, stafylokoků, kvasinek a plísní Výhody: - významně šetří práci a čas - snadné zavedení v podnicích, které dosud nemají mikrobiologickou laboratoř ani personál s mikrobiologickým vzděláním - exspirace - min. 1 rok - vysoká kvalita - certifikát ISO 9002
♦ Inhibiční látky -
jednoduchý stripový test na kontrolu tetracyklinových reziduí výsledek testu při pokojové teplotě za 10 minut doplňuje chybějící spektrum analýz antibiotik
Kontrola hygieny
♦ Přesné analyzátory mléka a mléčných produktů -
Fluorophos – velmi přesné stanovení alkalické fosfatázy Kryoskopy 4D3 a 4C3 v manuální a automatické verzi Lactoscope C3 a C3+ - tuk, bílkoviny, TPS Lactoscope C4 a C4+ - tuk, bílkoviny, laktóza, TPS, bod mrznutí Lactoscope FTIR - tuk, bílkoviny, laktóza, TPS, bod mrznutí, kasein, nebílkovinný dusík, volné mastné kyseliny, pH, hustota, kyselina citrónová, aj. Somascope – somatické buňky Combiscope a Combiscope FTIR – kombinace přístrojů
NOACK ČR, s.r.o. Květnového vítězství 160/68 149 00 Praha
www.noack.cz
Přístrojová technika
tel.: 267 913 415, 267 913 417 fax: 272 910 092
[email protected]
CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2005 Výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2005“ Vydavatel:
Česká společnost chemická, Odborná skupina pro potravinářskou a agrikulturní chemii Novotného lávka 5 116 68 Praha 1
Editor:
Štětina J., Čurda L.
Tisk:
Firma JK
Rok vydání:
2005
Počet stran:
214
Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah příspěvků odpovídají autoři.
ISBN 80-86238-48-2
