BIOFIZIKA. Metodika- 4. Liliom Károly. MTA TTK Enzimológiai Intézet

BIOFIZIKA 2012 – 11 – 26 Metodika-‐4

Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet [email protected]

A biofizika előadások temaMkája •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  • 

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

09-‐03 09-‐10 09-‐17 09-‐24 10-‐01 10-‐08 10-‐15 10-‐27 10-‐29 11-‐05 11-‐12 11-‐19 11-‐26 12-‐03

Biofizika: fizikai szemlélet, modellalkotás, biometria SZÜNET Az érzékelés biofizikája Mikrostruktúrák Zárthelyi dolgozat 1 Sejtmembránok, lipid-‐fehérje kölcsönhatások Membránpotenciál, transzport biológiai membránokban Jelátvitel Zárthelyi dolgozat 2 Metodika-‐1: Hagyományos és nagyfelbontású mikroszkópia Metodika-‐2: FRET, TIRF, SPR Metodika-‐3: kölcsönhatás mérése Metodika-‐4: CD, NMR Zárthelyi dolgozat 3 Pótzárthelyi -‐ 2012. 12. 11. 10h-‐12h

Biofizika, 2012, Liliom Károly

2

Polarizált fényhullámok sajátosságai Szilágyi András hfp://www. enzim.hu/~szia/cddemo/demo0.htm

síkban polarizált fény térerősségvektora két azonos fázisú hullám szuperpozíciója

két eltérő fázisú hullám szuperpozíciója cirkulárisan polarizált fényt eredményez

két cirkulárisan polarizált fényhullám 3 szuperpozíciója síkban polarizált hullám

Cirkulárisan poláros fény kölcsönhatása anyaggal

cirkulárisan poláros fényhullám elnyelődése = intenzitás gyengülése

cirkulárisan poláros fényhullám opMkailag sűrű közegen (n>1) halad át = fáziseltolódás

4

OpMkai rotáció diszperziója (ORD) A síkban poláros fény polarizációs síkja elfordul, ha a két cirkulárisan poláros komponensre nézve az anyag törésmutatója különböző. (diszperzió = hullámhosszfüggőség)


5

Cirkuláris dikroizmus A síkban polarizált fény ellipMkusan polarizálfá válik, ha a két cirkulárisan polarizált komponensre nézve az anyag fényelnyelése (abszorpciója) különböző.


6

OpMkai akMvitás A síkban poláros fény polarizációs síkját elforgató vagy azt ellipMkusan polárossá tévő anyagokat opMkailag akpv anyagoknak nevezzük.


7

ORD és CD spektroszkópia -‐ A CD és ORD spektrumok nem függetlenek egymástól: Kronig-‐Kramers transzformáció (n*= n + ik ahol n a törésmutató és k az abszorpciós együfható) -‐ CD-‐spektrumok egyszerűbben értelmezhetőek – ez terjedt el a gyakorlatban -‐ ORD spektrum egy monoton függvény, ha nincs az anyagnak elnyelése -‐ ha kromofór van jelen annak az elnyelési sávjánál anomális ORD jel (Cofon-‐effektus) -‐ ugyanif kapjuk az anyag CD-‐jelét, vagyis λmaxCD = λoORD

λmaxCD

λoORD


8

Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia

∆A = AL – AR = (εL – εR)cl = ∆εcl OpMkai akMvitás akkor lép fel, ha az elektron a gerjesztés során helikális pályán mozdul el. Királis molekulában csak az egyik irány lehetséges. Gerjesztéskor vagy jobbmenetes pályán halad az elektron, vagy balmenetesen. Ezt a két ellentétes irányban cirkulárisan polározof fény nem azonos mértében tudja kiváltani.


A: abszorbancia, ε: moláris exMnkciós együfható, c: koncentráció, l: opMkai úthossz, L és R: balra és jobbra cirkulárisan poláros fény. Definiáljuk a [Θ]: moláris ellipMcitást és ∆ε: moláris cirkuláris dikroizmust, akkor

[Θ] = 3300*∆ε

9

Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia Királis molekula: tükörképével fedésbe nem hozható Kromofórok leggyakrabban akirálisak, a CD-‐spektrum létrejöfének feltétele a kromofór környezetében egy királis perturbáló hatás jelenléte. Indukált CD: akirális molekulák királis molekulákkal képeznek komplexet – kölcsönhatás követése! OpMkai akMvitás akkor lép fel, ha az elektron a gerjesztés során helikális pályán mozdul el. Helikális pályán való elmozdulás = lineáris elmozdulás + cirkuláris elmozdulás. Töltés lineáris elmozdulása ⇒ elektromos momentum (µ) Töltés cirkuláris elmozdulása ⇒ mágneses momentum (m) A CD-‐sávok intenzitása az un. rotátorerősséggel (R) arányos. A rotátorerősség az átmenet során létrejövő elektromos és mágneses momentumok skaláris szorzata:

R = µ·∙m =⏐µ⏐·∙⏐m⏐cos α(µ,m) Biofizika, 2012, Liliom Károly

10

Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia A rotátorerősség félempirikus kvantumkémiai módszerekkel számítható (analiMkai célokra gyakran elegendő az előjelét meghatározni):

R = 2,297*10-‐39o∫∞∆ε/λdλ

R ≈2,297*10-‐39∆εmax∆λ/λmax •  α=0° •  cos α =1 •  R = (+)

α=180° cos α = -‐1 R = (-‐)

CD spektroszkópiával meghatározható a molekulák abszolút konfigurációja vagy az enanMomerek Msztasága:

ahol ∆εmax a maximális CD intenzitást, λmax a CD-‐csúcs helyét, ∆λ pedig a csúcs félérték-‐szélességét jelöli.

11

Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia alkalmazása fehérjék szerkezetvizsgálatára

Az amid-‐kromofór CD spektroszkópiai viselkedése: n→π* átmenet: a karbonil oxigén nemkötő pályája és az amid csoport π* lazító pályája közöf, elnyelés maximuma 230 nm, π→π* átmenet: az amid-‐csoport legmagasabb energiájú kötő π pályájáról a lazító π* pályára történik, az elnyelés maximuma 190 nm. (tehát a pepMdkötés tartománya 190-‐230 nm) Aromás oldalláncok elnyelése (triptofán és Mrozin) a 250-‐300 nm-‐es sávban. Biofizika, 2012, Liliom Károly

12

Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia alkalmazása fehérjék szerkezetvizsgálatára Az 1 aminosavra eső moláris ellipMcitást adjuk meg (mean residue molar ellipMcity: MRE) [Θ]MRE = (Θ x M) / (c x I x NA) M: molekulasúly c: koncentráció I: opMkai úthossz NA: aminosavak száma [Θ]MRE mértékegysége hagyományosan: deg cm2 dmol-‐1


13

Fehérjék másodlagos szerkezeM elemei

14

Másodlagos szerkezetek CD spektrumai

tyúk-‐tojás eset

A 190-‐240 nm-‐es pepMdkötés tartományában a másodlagos szerkezeM elemeket “Msztán” tartalmazó fehérjék CD spektruma jellegzetes hullámhosszfüggést mutat. Biofizika, 2012, Liliom Károly

15

Másodlagos szerkezeM elemek becslése A 190-‐240 nm tartományban adof fehérje CD spektruma a „Mszta” másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineáris kombinációjaként írható fel. Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja

β-redő

rendezetlen szerkezet

α-hélix 16 Biofizika, 2012, Liliom Károly

16

Másodlagos szerkezeM elemek becslése

Illesztés: Referencia spektrumként: Mszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szinteMkus polipepMdek). Vagy valós fehérjék. A programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak. Pl. Dicroprot programcsomag (hfp://dicroprot-‐pbil.ibcp.fr) Biofizika, 2012, Liliom Károly

17 17

Mivel a három alap konformáció CD spektruma igen különbözik egymástól, ezért kisebb, lokális konformációs változások is szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban – folding-‐ unfolding, misfolding, vagy ligandkötés követésére jó!

α-hélix

β-redő

rendezetlen szerkezet

α-hélix

rendezetlen szerkezet β-redő


18

Pl. β2-‐microglobulin amiloid-‐képzése lizofoszfaMdsav hatásra inert vegyület

a szerkezet fellazul: molten globula LPA


19

Indukált CD-‐sáv alkalmazása

ligandkötésre megjelenő CD-‐sávok

kiválasztof sáv Mtrálása a liganddal

illesztés: KD és sztöchiometria

összevetés szerkezeM információkkal


20

Fehérjék CD-‐mérésének szempontjai • Alacsony elnyelésű puffer, lehetőleg só nélkül, legjobb a foszfát puffer, ideálisan 5-‐10 mM. • Fehérjekoncentráció: távoli-‐UV: 0,05-‐0,3 mg/ml, jellemzően 0,1 mg/ml. • Fiziológiás sókoncentráció mellef 1 mm-‐es küvefában nem lehet 200 nm alá menni. Megoldás lehet 0,1 mm-‐es küvefa, és nagyobb fehérjekoncentráció. • Közeli-‐UV: 0,5-‐néhány mg/ml, 1 cm-‐es küvefa, a puffer általában nem jelent problémát. • 200 nm alaf a mérőteret nitrogénnel kell öblíteni, nagy fényerejű lámpa használatakor a lámpateret a hullámhossztól függetlenül, mert az ózon károsítja az opMkai elemeket. • A puffernek és adalékanyagoknak lehetőleg ne legyen CD jele! • Minél szélesebb tartományban mérjünk a másodlagos szerkezet-‐becsléshez.


21

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában z

y

x

külső mágneses térben a feles-‐spinű magok energiafelhasadást szenvednek, a populációk kismértékben eltérő betöltöfsége miaf indukált mágnesezefség mérhető Biofizika, 2012, Liliom Károly

22

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Rádiófrekvenciás segédtérrel kibillentjük a magokat, a két új precessziós kúp közötti betöltöttség-különbség megbontja a főkúpokon az eloszlást és a betöltöttséget. A két legfontosabb impulzus szemléltetése: z

z

y

y

x

x

π/2x

πx Biofizika, 2012, Liliom Károly

23

€

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Relaxáció egy π/2 impulzus után

e

2,00

t T2

2,00

1,80

Mz

1,60 1,40 Mz

forgó koordinátarendszer

1,60 1,40

1,20

1,20

1,00

1,00

0,80

0,80

0,60

0,60

0,40

0,40

0,20

0,00 0,0

1,80

Mxy

M xy (t) = M

max . xy

−

Mxy

2,0

4,0

6,0

8,0 t/s

0,20

0,00 10,0 12,0 14,0 16,0

Relaxációs folyamatok: Egy π/2-impulzus után a kialakult Mxy komponens megszűnik, míg a megszűnt Mz komponens visszaépül. Biofizika, 2012, Liliom Károly

24

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Free InducMon Decay (FID)


25

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában FID időfüggvény Fourier-‐transzformáltja:

-0,1Hz 0,1Hz

0,1Hz

-0,1Hz

A segédimpulzusokkal kibillentef magspinek relaxációját a segédtér tekercsében indukált áram időfüggésével követjük, ennek a függvénynek a Fourier-‐transzformáltja megadja a frekvenciaeltolódásokat, amelyek a felhasadási energiával arányosak Biofizika, 2012, Liliom Károly

26

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában

A kiindulási állapot beállítása, tartalmazhat pulzusokat és folyamatos besugárzást is. Fix hosszúságú.

τ A vizsgálandó folyamat érvényesülése, kifejlődése. Tartalmazhat pulzusokat, folyamatos besugárzásokat. Hossza változhat, amiből a t1–tengely származik a 2DNMR-alkalmazásokban.

π/2

Mixing/Keverés

Kifejlesztés

πx

Evolution

Előkészítés

Preparation

Pulzus-‐sorozatok általában:

t2 Detection Detektálás A FID mérése

A vizsgálni kívánt mágnesezettségi komponennek az xy-síkba történő beforgatására szolgáló impulzusok. Fix hosszúságú, de hiányozhat is! Biofizika, 2012, Liliom Károly

27

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Példa pulzus-‐szekvenciára: Chemical Shi‡ COrrelaMon SpectroscopY Homonukleáris spinkorrelációs spektroszkópia – a magok közti J-csatolások kimutatására

t1

π/2xz

z

t2

π/2x

z

FFT vL

z

vL

y x

x

y

y

y

x

2,00

x

Intenzitás

1,50 1,00

FFT

0,50 0,00 -‐0,50

0

2

4

6

8

10

12

14

t1/s

-‐1,00


28

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Codein spektruma (kismolekula)


29

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Makromolekulák 1D-‐spektrumában összeolvadnak a jelek, többdimenziós spektrumok kellenek az egyes eltolódások hozzárendelésére (annotálására) a magokhoz...


30

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Az annotációs folyamat: 1) Különböző korrelációs technikákkal megmérni a spinrendszereken belüli (egyes aminosavak) és közö‰ csatolásokat, amelyek kényszerfeltételeket adnak az egyes atomok szomszédsági és távolsági viszonyaira 2) Szükség van az aminosavsorrend ismeretére, amely további kényszerfeltételeket jelent A térszerkezet-‐építési folyamat: 1) Az annotáció ismeretében a kényszerfeltételek figyelembevételével megpróbálunk összerakni egy térszerkezetet, amelyiknek aztán visszafejtve konformnak kell lennie az ismert kényszerekkel 2) A lehetséges szerkezeteket egymásra veptve elfogadjuk a molekula modelljének

31

BIOFIZIKA. Metodika- 4. Liliom Károly. MTA TTK Enzimológiai Intézet

Recommend Documents