BIOFIZIKA. Metodika- 1. Liliom Károly. MTA TTK Enzimológiai Intézet

BIOFIZIKA 2012 – 11 – 05 Metodika-‐1

Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet [email protected]

A biofizika előadások temaLkája •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  • 

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

09-‐03 09-‐10 09-‐17 09-‐24 10-‐01 10-‐08 10-‐15 10-‐27 10-‐29 11-‐05 11-‐12 11-‐19 11-‐26 12-‐03

Biofizika: fizikai szemlélet, modellalkotás, biometria SZÜNET Az érzékelés biofizikája Mikrostruktúrák Zárthelyi dolgozat 1 Sejtmembránok, lipid-‐fehérje kölcsönhatások Membránpotenciál, transzport biológiai membránokban Jelátvitel Zárthelyi dolgozat 2 Metodika-‐1 Metodika-‐2 Metodika-‐3 Metodika-‐4 Zárthelyi dolgozat 3 Pótzárthelyi -‐ 2012. 12. 11. 10h-‐12h

Biofizika, 2012, Liliom Károly

2

Biofizikai módszerek – mit miért? Meg akarjuk érteni a biológiai rendszereket, az azokban zajló folyamatokat, elsősorban a sejt és sejtalkotó molekulák szintjén…

Hogyan épül fel – SZERKEZET

Hogyan működik – FUNKCIÓ

Biofizikai vizsgálaL módszeren azt értjük, hogy a biológiai rendszert valamely fizikai kölcsönhatásnak vetjük alá, vagy valamelyik fizikai paraméterét kívánjuk meghatározni, például – felhasználhatjuk a hullámok elhajlását, szóródását, elnyelését és kibocsájtását: mikroszkópia (fény, EM), röntgenkrisztallográfia, SAXS, spektroszkópia (EPR, NMR, CD is), SPR, …, illetve ezek különféle kombinációi (TIRF, FRAP, FRET) … – mérhetjük az anyag termodinamikai sajátságait: hőkapacitását (ITC, DSC), diffúzióját (termodiffúzió), vagy ezek kombinációit az előzőekkel (anizotrópia, DLS, korrelációs spektroszkópia és mikroszkópia) … – vizsgálhatjuk a mechanikai vagy elektromos tulajdonságait: sajátrezgés (QCM), felüleL minőség (AFM), zétapotenciál, vezetőképesség, vagy ezek kombinációi az előzőekkel (lézercsipesz) … Biofizika, 2012, Liliom Károly

3

Biofizikai módszerek – mit miért? Mindegyik módszer (= kölcsönhatás) más fizikai jellemzőkre, paraméterekre érzékeny – módszert választani ennek alapján kell, hogy – a mérendő biológiai rendszer lényeges sajátságát határozzuk meg (mérerartomány, dinamika) – minél érzékenyebben ( jel/zaj viszony) tudjunk mérni. Igyekezzünk legalább két (vagy több) független (más elven alapuló) módszert is alkalmazni! Mindig a vizsgálat céljához válasszunk módszereket… (könnyen észrevehető, hogy a biofizikai vizsgálómódszerek nagyrészt a hullámok és az anyag kölcsönhatására építkezik)


4

Szerkezet – mérerartományok

100 nm

? 10 nm

1 nm

A kolloid mérerartományt szeretnénk vizsgálni a sejt nagyobb alkotórészeitől (Lpikusan ≤ 1 µm) a vezikuláris rendszereken át (50-‐200 nm) a makromolekuláris komplexekig (10-‐100 nm) és az egyedi molekulákig (1-‐10 nm).

elektronmikroszkópia

1 µm

fénymikroszkópia

mit szeretnénk “látni”?

A mikroszkópos képalkotás lényege a hullámfrontok törése határfelületeken vagy a hullámok elhajlása és interferenciája – DE minden anyag részecske is és hullám is, elvileg bármivel lehet mikroszkópot csinálni, történeL és prakLkussági szempontok miar dominál a fény és az elektron…


5

Hullámok képalkotásra…

FÉNYMIKROSZKÓP: Numerikus apertúra (NA) = n*sinα

-‐ n = a törésmutató a frontlencse és a fedőlemez közör -‐ száraz objek|v: n(levegő)=1 tehát maximálisan NA ≤ 1 -‐ törésmutató növelése: víz=1.33, glicerin=1.47, immerziós olaj=1.51 Biofizika, 2012, Liliom Károly

Airy diszk

6

Fénymikroszkóp felbontóképessége

A mikroszkópban akkor és csak akkor tudunk feloldani két tárgypontot, ha a diffraktálódot fényhullámból a főmaximumon kívül legalább az első rendben elhajlor fény is részt vesz a képalkotásban. d = 0.61*λ / sinα mert az első elhajlási maximum helyzete 1.22*λ


7

Fénymikroszkóp felbontóképessége A felbontás a nagyítástól nem, csak a fény hullámhosszától és a NA-‐tól függ!


8

javítani szeretnénk a kép kontraszját és felbontóképességét

a legegyszerűbb ötlet a kontraszt javítására a Tyndall-‐ jelenség: sötétlátóterű mikroszkópia (természetesen speciális kondenzorral)


9

Fáziskontraszt mikroszkópia

Használjuk ki, hogy a minta különböző opLkai vastagságú rétegei fáziseltolódást okoznak a sugármenetben, amelyek interferenciája fokozható egy félhullám eltolódással… Biofizika, 2012, Liliom Károly

10

Polarizációs mikroszkóp


11

DIC – DifferenLal Interference Contrast


12

DIC – élő sejtek megfigyelése


13



14



15



16



17



18

Fluoreszcencia mikroszkópia


19

STED (STimulated Emission DepleLon)


20

Nanoscope variációk


21

500 nm

5 µm

STORM…


23

Foton korrelációs módszerek

A molekulák mozgásáról valamint egymáshoz képesL lokalizációjáról kapunk információt Biofizika, 2012, Liliom Károly

24

A nemlineáris opLkai jelenségek alkalmazásának remek példája a ké}otonos gerjesztés – ehhez óriási fényintenzitás kell (a hagyományos képalkotáshoz szükséges milliószorosa), mert a két foton egyszerre történő elnyelésének valószínűsége nagyon kicsi, tehát csak a fókuszpontban valósul meg a folyamat. Az infralézerekkel mélyen belelátunk a mintába… Biofizika, 2012, Liliom Károly

25

Hullámok képalkotásra… ELEKTRONMIKROSZKÓP:

de Broglie: λ = h/p (Planck állandó / impulzus) = h/mv “V” gyorsítófeszültség meller eV = ½mv2 ➔ λ = h/√(2meV) = 12.12*10-‐10/√V ➔ λ (pm) = 3.9 (100keV), 2.7 (200 keV), 2.2 (300 keV) az EM-‐ben fellépő elektronsebességeknél már figyelembe kell venni a relaLviszLkus tömegnövekedést is, ezzel a korrekcióval kicsit még csökken a hullámhossz: ➔ λ (pm) = 3.7 (100keV), 2.5 (200 keV), 2 (300 keV) Az EM elméleL felbontását az elektron-‐ lencserendszer kb 0.1 nm-‐re korlátozza, de még ez is bőven elég lenne a makromolekulákat megfigyelni. Csakhogy az EM-‐ben a képalkotáshoz az elektronok az anyag elektronjain szóródnak, aminek a hatékonysága a rendszámmal nő. A makroelemek (C,H,N,O) kicsik és hasonló méretűek = gyenge kontraszt! (pl. festés kell nehézelemekkel) Biofizika, 2012, Liliom Károly

26

Elektronmikroszkóp felbontása gyorsfagyasztás magas nyomáson, különben a jégkristályok összetörnek mindent:

hagyományos fixálás gyorsfagyasztás

Víz homogén nukleációja légköri nyomáson: kb -‐40oC, DE kb 10,000oC/s fagyasztási sebesség kell a vitrifikációhoz. Folyékony nitrogénnel elérhető a -‐16,000oC/s. A víz gyenge hővezetése miar a vitrifikáció vastag szeletekre (>10 μm) nem működik. 2100 bar nyomáson a homogén nukleáció kb -‐90oC-‐nál van, DE 200oC/s fagyasztási sebesség is elegendő, ami lehetővé teszi 500 μm vastag szeletekig a jégkristályképződés megakadályozását! Biofizika, 2012, Liliom Károly

27

Digitális–elektronmikroszkópia Gyorsfagyasztás magas nyomáson + szeletek 3D rendelése spéci algoritmusokkal: Az idegszeleteket egymáshoz kell igazítani (A), intenzitásküszöböt választani és szűrni (B), majd a sejtmembránt azonosítani (C), amihez tanítóképeket (D,E) használnak… Ezután az azonosítor axonokat színezik és a szeleteket 3D-‐ben rekonstruálják:


28

Digitális–elektronmikroszkópia Fokozás: gyorsfagyasztás magas nyomáson + fókuszált germánium ionsugarak és a visszavert elektronok trajektóriáinak rögzítése gyantában = 3 nm felbontású 3D kép!

3D-‐élesztő színkódolva az endoplazmás reLkulum (ER; sárga), a nukleusz (világoskék), a ciszternák (zöld), vezikulák (világoszöld), lipid-‐cseppek (narancs), mikrotubulusok (rózsaszín), mitokondriumok (vörös) és a sej}al (szürke) 3.72 nm × 3.72 nm × 15 nm darabokból, sejtátmérő 3.2 μm Biofizika, 2012, Liliom Károly

29

Digitális–elektronmikroszkópia

Ha már megvan a 3D kép, a bemutatási lehetőségek határtalanok! Az adatgyűjtés és ada}eldolgozás sebességének növelésével, a folyamat automaLzálásával tényleg szédítő morfológia-‐kutatások jöhetnek… (de a dinamika ebből mindig hiányozni fog!) Biofizika, 2012, Liliom Károly

30

EM és nanoszkóp kombó


31

BIOFIZIKA. Metodika- 1. Liliom Károly. MTA TTK Enzimológiai Intézet

Recommend Documents