BIOFIZIKA. Liliom Károly SE ÁOK Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

BIOFIZIKA Liliom Károly SE ÁOK Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet [email protected]

A biofizika előadások temaFkája 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

09-05 09-12 09-19 09-26 10-03 10-10 10-15 ! 10-17 10-24 11-07 11-14 11-21 11-28 12-05

Biofizika bevezetés, szerkezet és funkció 1 Szerkezet és funkció 2 VBK dékáni szünet Kölcsönhatások jellemzése Szerkezet és funkció 3 ZH-1 elmarad Fehérjék: szerkezet és funkció Biológiai membránok Transzport biológiai membránokban Receptorok ZH-2 Jelátvitel, pót-ZH elmarad oktatas.ch.bme.hu/Biofizika Biofizika 2016, Liliom Károly

A molekuláris biofizika módszerei Meg akarjuk érteni a biológiai rendszereket, az azokban zajló folyamatokat, elsősorban a sejt és sejtalkotó molekulák szintjén…

Hogyan épül fel – SZERKEZET

Hogyan működik – FUNKCIÓ

MAKROSZERKEZET (10-1000 nm): fénymikroszkóp (DIC)

DINAMIKA: Konformáció és annak

konfokális mikroszkóp (kontraszt javítása)

megváltozása (CD és fluoreszcencia spektr.,

STED, PALM, STORM

fluor. anizotrópia)

(feloldóképesség jav.) MIKROSZERKEZET (1-100 nm):

Kötődési vizsgálatok (fluoreszcencia spektr.,

X-ray, NMR, (atomi részletesség) Cryo-EM, szórásos technikák (alak)

fluor. anizotrópia, CD) - különböző technikák...

Biofizika 2016, Liliom Károly

Biológiai funkció = kölcsönhatás HOMOGÉN kölcsönhatás közege HETEROGÉN Fpikusan oldatban Fpikusan határfelületen ITC, fluoreszcencia spekt., FRET,... SPR, QCM, ELISA,...

DIREKT kölcsönhatás követése INDIREKT egyik partner sem jelölt min. az egyik partner jelölt SPR, QCM, ITC, ELISA FRET, fluor. spekt., bioFnilálás, His-tag

EGYENSÚLY kölcsönhatás menete FOLYAMAT vég-pont esszék kineFkai esszék (lassú, egyszerű) (gyors, komplikált) ITC, termoforézis, ELISA,... SPR, QCM, stopped flow Biofizika 2016, Liliom Károly

kölcsönhatás = reakció


GMMA = global mulF-method analysis


Szerkezetmeghatározás főbb módszerei


NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Eα kT

Eβ

és N β ≈ e Nα ≈ e mivel E α ≤ E β ezért N α ≥ N β −

−

kT

Külső mágneses térben a felesspinű magok energiafelhasadást szenvednek, a populációk eltérő betöltöxsége miax indukált mágnesezexség mérhető.

-Rádiófrekvenciás segédtérrel kibillentjük a magokat és a relaxációt a segédtér tekercsében indukált áram időfüggésével követjük, ennek a függvénynek a Fourier-transzformáltja megadja a frekvenciaeltolódásokat, amelyek a felhasadási energiával arányosak. -Makromolekulák 1D-spektrumában összeolvadnak a jelek, korelációs technikák, többdimenziós spektrumok kellenek az egyes eltolódások hozzárendelésére a magokhoz (annotálás)... Biofizika 2016, Liliom Károly

NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Az annotációs folyamat: 1) Különböző korrelációs technikákkal megmérni a spinrendszereken belüli (egyes aminosavak) és közöz csatolásokat, amelyek kényszerfeltételeket adnak az egyes atomok szomszédsági és távolsági viszonyaira 2) Szükség van az aminosavsorrend ismeretére, amely további kényszerfeltételeket jelent A térszerkezet-építési folyamat: 1) Az annotáció ismeretében a kényszerfeltételek figyelembevételével megpróbálunk összerakni egy térszerkezetet, amelyiknek aztán visszafejtve konformnak kell lennie az ismert kényszerekkel 2) A lehetséges szerkezeteket egymásra ve{tve elfogadjuk a molekula modelljének

Itera{v szerkezet-meghatározás


mindig modell-építés

X-ray vs NMR a szerkezetmeghatározásban


Röntgen-krisztallográfia a fehérjeszerkezet meghatározásában – modellépítés!

A szórási adatokból elektron-sűrűségi térképet kapunk. Fel kell építenünk a fehérjénk ezzel kompaFbilis modelljét. Minél nagyobb a felbontás, annál kisebb a bizonytalanság a pepFdváz és az oldalláncok koordinátáiban... Biofizika 2016, Liliom Károly

Cryo-EM – a feltörekvő technika


Cryo-EM – a feltörekvő technika


Cryo-EM – ~2Å felbontás már elérhető


A tudomány módszertana valóság → megfigyelés és kísérlet → absztrakció = modell → modell összevetése a valósággal = a modell megmagyarázza-e az ismert tényeket és megjósolhatók-e kísérleFleg ellenőrizhető, új, eddig nem ismert effektusok... → pontosítox absztrakció = új á•ogóbb érvényű modell (BIO)STATISZTIKA Biofizika 2016, Liliom Károly

Adatgyűjtés: Megfigyelés és Kísérlet •  Az adatgyűjtés mindkét esetben méréseket jelent •  A mérés a mérendő mennyiség közvetlen vagy közvetex összehasonlítása a mértékegységgel - eredménye soha nem lehet tökéletesen pontos •  A mérési eredmény szisztemaFkus és véletlen hibákat tartalmaz - a szisztemaFkus hibák egy része (hőmérsékleF dri‚, kalibrációs hiba) a mérés gondos kivitelezésével kiküszöbölhető, a véletlen hibák a mérés sajátságai •  Következmény: a mérési (a kísérleF) eredményt a véletlen matemaFkai törvényszerűségei (is) jellemzik!


A mérési eredmény staFszFkai változó •  Adox elemek összességét a bennünket érdeklő tulajdonságukat leíró numerikus adatokkal együx sta2sz2kai sokaságnak nevezzük. Általában a sokaság eloszlását, de legalább az eloszlást jellemző paramétereket akarjuk meghatározni, amihez mintát veszünk, ami a sokaság n számú elemének véletlenszerű kiválasztásából áll.

•  Egy mérés (kísérlet vagy megfigyelés) mindig mintavételezés, eredménye (a laboratóriumi gyakorlatban majdnem mindig) egy folytonos eloszlású valószínűségi változó.


A mérési eredmény staFszFkai változó •  A mérés mindig mintavételezés, eredménye egy valószínűségi változó adox értéke. •  n-szer megismételt mérés eredménye n számú egymástól független és azonos eloszlású valószínűségi változó. (DE: megismételt mérések eredményei (párhuzamosok) akkor tekinthetők független mintavételnek, ha a megismételt mérés új preparátumon történt)

•  Bármely sta8sz8kai jellemző, amelyet az adatainkból számolunk – maga is sta8sz8kai változó !!!


A mérési eredmény mint várható érték •  A mért mennyiség valódi (meghatározandó) értékének az eloszlás várható értékét tekintjük. •  Az eloszlás paramétereit is csak a mérési adatokból tudjuk becsülni – tehát azok is valószínűségi változók! valódi érték

1.4

1.3

szisztemaFkus hiba 1.2

véletlen hibák

1.1

1.0

várható érték 0.9

0.8 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

A véletlen mérési hibák többsége normális eloszlású! Biofizika 2016, Liliom Károly

Normális eloszlás a mérési eredményekből… n = 20 50 100 500

"n" a biológiai mérésekben 8pikusan 3-5 közöH van !!! Biofizika 2016, Liliom Károly

A mérési eredmény mint staFszFkai minta kis “n” esetén (Fpikusan n<10) A normális eloszlású alapsokaságból véletlenszerűen kiválasztox minta - tehát a kísérleF adatok - ~95%-a az átlagértéktől számítox ± 2σ tartományba esik. Ez kb azt jelenF, hogy 100 mérésből átlagosan 5 eredményez kiszóró pontot, feltéve, hogy a mérés szisztemaFkus hibától vagy egyéb torzítástól mentes! Következmény: 3-5 párhuzamosban valószínűtlen a kiszóró pont! Ne dobjunk el kísérleF adatot alapos elemzés nélkül, hacsak nem vagyunk teljesen biztosak abban, hogy az adox mérés hibás volt! A biológiában mérési eredményeink gyakran normális vagy lognormális eloszlást követnek. Biofizika 2016, Liliom Károly

Regresszióanalízis Ha két változó közöx függvénykapcsolat van, annak {pusát és paramétereit akarjuk meghatározni. Általában az egyik mennyiség általunk determinált (vagy manipulált) és ezt tekintjük független változónak (például koncentráció, idő, stb). Természetesen a valóságban ez is staFszFkai változó (pipexázási hiba, időmérés pontatlansága), de ezt a regresszióanalízisnél nem tudjuk staFszFkailag megfelelően kezelni, ezért a független változó értékeit hibamentesnek tekintjük! 6

Általában azt a függvényt keressük, amire teljesül, hogy a mért és számítox értékek négyzetes eltérésösszege minimális (legkisebb négyzetek módszere):

5

4

3

2

Y = a + b*X a =!0.3458 b =!1.0013 R =!0.9561

1

n

S = ∑ (y i − f (x i )) 2 ⇒ min i=1

0 0

1

2

3

4

5

6


Nemlineáris regresszió n

S = ∑ (y i − f (x i )) 2 ⇒ min i=1

€

Amennyiben a két változónk közöx nem lineáris a kapcsolat úgy két dolgot tehetünk: - megpróbáljuk a fügvénykapcsolatot visszavezetni a lineáris esetre, vagyis linearizálunk (ennek lényege az, hogy a regresszióanalízissel becsülni kívánt függvény-paraméterekre nézve elsőfokú összefüggést kapjunk) - a feltételezex nemlineáris függvénykapcsolaxal felírt eltérés-négyzetösszeget minimalizáljuk, tehát a legkisebb négyzetek elve marad, csak a paraméterekre általában nemlineáris egyenletrendszert kapunk, amiből valamilyen iterációs eljárással igyekszünk megbecsülni a legkisebb eltérés-négyzetösszeget adó paramétereket (Newtonmódszer, gradiens módszer, Levenberg-Marquard módszer) Biofizika 2016, Liliom Károly

Modellek közöz választás M1 ⊂ M2

M1

M1

egymásba ágyazox modellek (nested) - likelihood-raFo teszt (LRT) D = -2*ln(likelihood-M1 / likelihood-M2) ∼ χ2-eloszlású, df = df2-df1 M2 M1 ⊄ M2 független modellek (non-nested) - AIC, AICc AIC = 2*k – 2*ln(L) M2 χ2-eloszlású, df = df2-df1 Biofizika 2016, Liliom Károly

Modellek jóságának összehasonlítása: “nested” modellek Az összetexebb modell az egyszerűbb kibővítése ugyanolyan taggal (például monoexponenciális vs bi-exponenciális) – általánosabban: az összetexebb modell magában foglalja az egyszerűbb modellt F-teszt – extra négyzetösszeg alapján (SS: sum-of-squares) - ha az egyszerűbb modell (1) korrekt, akkor (ss1-ss2)/ss2 ~ (df1-df2)/df2 - ha az összetexebb modell (2) korrekt, akkor (ss1-ss2)/ss2 > (df1-df2)/df2 F-próba: F = [(SS1-SS2)/(df1-df2)]/(SS2/df2) Fα, df1-df2, df2 Biofizika 2016, Liliom Károly

Modellek jóságának összehasonlítása: “non-nested” modellek Információs elv (entrópiaelv) alkalmazása a staFszFkában (eredeFleg Hirotugu Akaike fejlesztexe ki a maximum likelihood elv használatával): Tetszőleges modell esetén definiál egy mennyiséget (AIC), amelynek csak a különbségét kell venni két modell összehasonlításakor. Ha a maradéktagok normális eloszlásúak, akkor : ∆AIC = N* ln (SS2 / SS1) + 2*∆df Ha ∆AIC nega{v, akkor az egyszerűbb modellt (1, kevesebb paraméteres) favorizáljuk, ha ∆AIC pozi{v, akkor az összetexebbet (2).


BIOFIZIKA. Liliom Károly SE ÁOK Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

Recommend Documents