BIOFIZIKA 2012 – 11 – 12 Metodika-‐2
Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet
[email protected]
A biofizika előadások temaKkája • • • • • • • • • • • • • •
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
09-‐03 09-‐10 09-‐17 09-‐24 10-‐01 10-‐08 10-‐15 10-‐27 10-‐29 11-‐05 11-‐12 11-‐19 11-‐26 12-‐03
Biofizika: fizikai szemlélet, modellalkotás, biometria SZÜNET Az érzékelés biofizikája Mikrostruktúrák Zárthelyi dolgozat 1 Sejtmembránok, lipid-‐fehérje kölcsönhatások Membránpotenciál, transzport biológiai membránokban Jelátvitel Zárthelyi dolgozat 2 Metodika-‐1: Hagyományos és nagyfelbontású mikroszkópia Metodika-‐2: FRET, TIRF, SPR, QC Metodika-‐3 Metodika-‐4 Zárthelyi dolgozat 3 Pótzárthelyi -‐ 2012. 12. 11. 10h-‐12h
Biofizika, 2012, Liliom Károly
2
STED mikroszkópia felbontóképessége
Synaptotagmin (balra) és synaptophysin (jobbra) fehérjék lokalizációja endoszómákon. Immunfestést követő STED mikroszkópos felvételek további felbontás-‐javítása lehetséges lineáris dekonvolúcióval (Wiener filter). Legjobb elért felbontás a vizsgált fehérjétől függően kb 20-‐25 nm! Biofizika, 2012, Liliom Károly
3
MulKkolor PALM/STORM mikroszkópia
Hat megfelelően választom fénykapcsolható festékpárral (a hosszabb hullámhosszon emimáló festék csak a rövidebb hullámhosszú párja általi gerjesztés hatására lesz fluoreszcens) streptavidint jelölve bizonyítomák, hogy a hatszoros együmes jelölés mérhető diffrakciós limit alap felbontással. Biofizika, 2012, Liliom Károly
4
Színkódolt nanorészecskék – egyedi molekulák detektálása
A karboxil-‐módosítom nanorészecskéket egy flexibilis linkeren keresztül komplementer vagy random oligo-‐nukleoKdokhoz kötömék. Biofizika, 2012, Liliom Károly
5
Színkódolt nanorészecskék – egyedi molekulák detektálása
A DAOPHOT asztrofizikai fotometriai programot (amit zsúfolt csillaghalmazok térben közeli csillagainak azonosítására fejlesztemek ki) sikeresen alkalmazták az összetartozó nanorészecskék nagysebességű automaKkus azonosítására. Biofizika, 2012, Liliom Károly
6
Fluoreszcens festékek Néhány fluoreszcens alapmolekula kémiai módosításaival lefedték a teljes UV–látható–infra spektrumot. (példa: Alexa Fluor sorozat… ) /The Molecular Probes Handbook/ Funkcionalizált (reakcióképes) és különböző hordozókhoz konjugált változatok sokasága kapható…
Biofizika, 2012, Liliom Károly
7
Fluoreszcens fehérjék GFP
GFP (Aequorea) származékok – az Aequorea victoria csendes-‐óceáni medúzából izolálták
DsRed (vörös korall, Anthozoa) származékok
Biofizika, 2012, Liliom Károly
8
Fluoreszcens fehérje palema GFP
Biofizika, 2012, Liliom Károly
9
Fluoreszcens fehérje palema
A San Diego beach scene drawn with an eight color paleme of bacterial colonies expressing fluorescent proteins derived from GFP and the red-‐fluorescent coral protein dsRed. The colors include BFP, mTFP1, Emerald, Citrine, mOrange, mApple, mCherry and mGrape. (2006) Biofizika, 2012, Liliom Károly
10
Fluoreszcens kvantumpömyök (QD)
Félvezető anyagban elektron-‐lyuk vezetőpárt hozunk létre, amelyet geometriai kényszerekkel szűk térrészbe zárunk (confinement). Az így csapdázom exciton energiaszintje a csapda méretével fordítoman arányos. A leggyakoribb a kadmium/szelenium QD mag, amelyet ZnS köpeny vesz körül, de már sokféle anyagból lehet QD-‐t készíteni, a legújabb alapanyag a grafén (a nehézfémek használata sok országban Kltom). Biofizika, 2012, Liliom Károly
11
Fluoreszcens kvantumpömyök (QD)
A gerjesztési spektrumok jól áyednek kb 400 nm-‐ig, tehát lehetséges egy hullámhosszon egy egész sorozat kvantumpömyöt gerjeszteni = színkódolt mulKplex alkalmazások! A kvantumpö,yök 1-‐2 nagyságrenddel foto-‐stabilabbak és világosabbak a hagyományos fluoreszcens festékeknél és fehérjéknél !!! Biofizika, 2012, Liliom Károly
12
Kvantumpömyök mint nano-‐eszközök
biolumineszcens gerjesztés
bio-‐kompa6bilis bevonatok (PEG) és funkciós csoportok, jelölések nem-‐ op6kai képalkotáshoz, stb...
A kvantumpömyök a fluoreszcencia spektroszkópiai és mikroszkópiai alkalmazásokon túl funkcionalizált nanorészecskék formájában szinte bármilyen jelölésre vagy célbajumatásra használhatók (komoly távlatok a rák diagnoszKkájában és gyógyításában)... Biofizika, 2012, Liliom Károly
13
FRET – Förster/Fluorescence Resonance Energy Transfer mikroszkópia
Megfelelő térközelség, orientáció és spektrális áyedés esetén a sugárzásmentes energiaátadás hatékonysága = 1/(1 + (r/Ro)6) Biofizika, 2012, Liliom Károly
14
FRET mikroszkópia
Biofizika, 2012, Liliom Károly
15
TIRF – Total Internal ReflecKon Fluorescence
Biofizika, 2012, Liliom Károly
16
TIRF mikroszkópia
Biofizika, 2012, Liliom Károly
17
TIRF mikroszkópia
Biofizika, 2012, Liliom Károly
18
TIRF mikroszkópia
Biofizika, 2012, Liliom Károly
19
TIRF mikroszkópia
Biofizika, 2012, Liliom Károly
20
Mikroszkópia
Fluoreszcens technikák (FRET, TIRF)
Kölcsönhatások követése
Biofizika, 2012, Liliom Károly
21
