Szedimentáció, Elektroforézis
Biofizika szeminárium 2. szemeszter
Makromolekulák analízise és elválasztása
Szedimentáció
Szedimentáció Miért van szükség centrifugálásra? A nehézségi erőtérben való ülepítés a 2-50 µm tartományban alkalmazható, az ennél kisebb részecskék ülepítéséhez a gravitációs erőtér nem elegendő, ezért centrifugális erőteret kell alkalmazni. Theodor Svedberg – 1920-as években megalkotta az első ultracentrifugát. (N>10000 min-1)
Ultracentrifuga
Preparatív Különböző méretű ill. moláris tömegű komponensek elkülönítése
Analitikai méret vagy a moláris tömeg meghatározása
Szedimentáció Koncentráció eloszlás viszonyok az UC cellájában
Milyen erők hatnak a centrifugában lévő részecskére?
Szedimentáció Centrifugális erő:
Súrlódási erő: m, ρ0
ma = mrω2
fv
Felhajtó erő: ρ0 Vg = ρ0
Meddig gyorsul a részecske?
Fs=Fc-Ff A centrifugális erő és a felhajtóerő különbsége addig mozgatja a részecskéket gyorsuló mozgással a tengelytől kifelé, amíg (a sebesség növekedésével) az ellenkező irányú súrlódási erővel egyensúlyba nem kerül.
m 2 rω ρ
Szedimentációs sebességi módszer Erőegyensúly esetén: Fc + Ff + Fs = 0
Fs = Fc − Ff
ρ0 fv = mrω − ρ0rω = mrω 1− ρ ρ 2
Ezután a sebesség állandó lesz?
m
2
2
NEM
A centrifugális erő értéke függ a sugártól(ac = rω2), a tengelytől távolodva növekszik. Ülepedés esetén a részecske sebessége tehát a tengelytől távolodva növekszik (helyfüggő).
ρ0 m1 − ρ v S= 2 = rω f Szedimentációs állandó: S 1 Svedberg=10-13 s
Mire jó? Meghatározhatom a részecske/molekula tömegét Ha meghatározzuk a sebességet (v) és a centrifugális gyorsulást (rω2), akkor a részecske tömege számolható:
Ehhez tudnom kell az f alakfaktort, de… D – diffúziós állandó k - Boltzmann állandó R - egyetemes gázállandó N - Avogadro-szám 6*1023
A tömeg meghatározásához a szedimentációs sebességi módszert kombinálni kell diffúziós mérésekkel. Meghatározhatom a részecske/molekula alakját
Szedimentációs egyensúlyi módszer Ha a részecskék elérik a cső falát, egyensúly áll be, a nettó sebesség nulla lesz;
Ha csak a centrifugális erő hatnak, a molekulák a legkisebb energiájú helyen (az edény alján) helyezkednének el. DE! A mikroszkópikus mozgások folytatódnak A cső falának közelében kialakul a részecskéknek egy eloszlása.
A tengelytől mért két különböző r1, illetve r2 távolságban az n1 és n2 molekulakoncentráció arányát a Bolztmann-eloszlásból kapjuk meg:
E-helyzeti energia
Az energiák különbsége felírható
Adott kísérletben az r1 és r2 pozíciók energiájának a különbségét a rotor szögsebessége határozza meg. A molekulák annál szűkebb r intervallumban helyezkednek el, ,minél nagyobb a rotor szögsebessége. Szedimentációs egyensúly létrejön
Vesszük a ln-t
mérhető számolható
A kapott egyenletből a tömeg kiszámolható!
A módszer előnye a szedimentációs sebességi módszerhez képest:
Az eredmények nem függenek az alaki faktortól Egy probléma lehet: sűrűség meghatározása
Sűrűség grádiens ultracentrifugálás
Sőrőség grádiens ultracentrifugálás Nagy sűrűségű, de kis molekulatömegű anyagok centrifugálásánál az egyensúly beálltakor sűrűséggradiens keletkezik. Pl.: CsCl Egy dalton molekulatömeg különbség már kimutatható a módszerrel (Pl.:Meselson-Stahl kísérlet)
Pl.:Meselson-Stahl kísérlet Az E.coli baktériumokat 15N táptalajon tenyésztették,majd átették őket 14N táptalajra. Egy generációsidő elteltével az összes DNS a hibrid sűrűséget mutatta centrifugálás során A második generációban a 14N DNS sűrűségének megfelelő sáv is megjelenik a hibrid sáv mellett. Ez a DNS szemikonzervatív replikációjának bizonyítéka.
Differenciál centrifugálás
Számolási példa Mekkora fordulatszámot kell beállítani a 10 cm-es rotorral rendelkező centrifugán, ha 15000 g-t kell alkalmaznunk két fehérje elválasztásához?
RCF= 15000g
RCF =
acp g
a= 15000x10=150000
a cp = ω 2 r = 4π 2 n 2 r 2
N acp = 4π r = 0,011N 2 r 60 2
N=
acp 0,011r
n- másodpercenkénti fordulatszám N- percenkénti fordulatszám r-sugár (m)
Elektroforézis Elektromosan töltött molekula mozgása elektromos térben.
Elektroforézis Mi történik egy töltött molekulával, ha elektromos térbe kerül? v fv
ZeE +Ze
-
+ E 1. Coulomb erő FC=ZeE E=elektromos térerő e=elemi töltés z=töltések száma
2. Surlódási erő Fsurlódási = f v v=sebesség f=alaki faktor (súrlódási állandó)
A részecskéknek, molekuláknak elektromos erőtér hatására bekövetkező transzlációs mozgását elektroforézisnek nevezik.
Erőegyensúly esetén állandó vándorlási sebesség:
ZeE = fv Elektroforetikus mozgékonyság (egységnyi elektromos mozgási térre vonatkoztatott sebesség):
E=
U d
v=
l – t idő alatt megtett út t – idő U – feszültségkülönbség d – elektródok közötti távolság
l t
ld uel = Ut
Elektroforézis fajtái I. Szabad elektroforézis II. Kapilláris elektroforézis III. Gélelektroforézis
1. Agaróz gélelektroforézis 2. Poliakrilamid gélelektroforézis 3. Grádiens gélelektroforézis 4. Izoelektromos fókuszálás 5. Kétdimenziós elektroforézis
IV. Blotting technikák 1. Southern Blot 2. NorthernBlot 3. Western Blot
II. Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különböző sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelően: • kis méret, nagy töltés –nagy mozgékonyság/gyors • nagy méret, kis töltés –kis mozgékonyság/ lassú
detektor
kapilláris
Az elektroforézis egy vékony 25-75 µm belső átmérőjű, pufferoldattal töltött kapillárisban történik. Detektálás: OD, λ = 200 nm
puffer puffer
minta
elektród
elektród nagyfeszültségű tápegység Dr. Gáspár Attila: Kapilláris elektroforézis
A módszer alapja Elektroozmotikus áramlás (EOF)
a
b c
Kapilláris falán kialakuló kettősréteg
Az elektroozmotikus áramlás kialakulása negatív töltésű kvarc kapilláris belső felülete (Si-O-) hidratált kationok gyűlnek össze a felület közelében tömegáramlás alakul ki az elektromos tér létrehozása miatt
Vándorlás: 1. Kationok 2. Töltés nélküli részecskék 3. Anionok
Az EOF egy másik fontos előnye, hogy gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétől, azonos irányú mozgásban tartja. Kapilláris Elektroforézis előnyei: Csekély hőfejlődés Rövid mérési idő Nagy elválasztási hatékonyság Minimális mintatérfogat (1-10 nl) Könnyen automatizálható
Gyakorlati alkalmazás albumin
α-1
Két komponensből álló albumin frakció, ami az igen ritkán megfigyelhető bisalbuminaemiának felel meg.
α-2 béta gamma
Jelentősen emelkedett α-1 és α-2 frakciók, amely aktív gyulladásos folyamatot jelez. Poliklonális gammopathia jelentősen emelkedett gamma frakciót eredményez, mely autoimmun kórképre utal.
III./1. Agaróz gélelektroforézis Alapelv: a nukleinsavak megfelelő puffer oldatban negatív töltésűek, ezért egyenáram hatására a pozitív pólus felé vándorolnak Agaróz: -térhálós szerkezetű poliszacharidláncokat tartalmaz -a kisebb méretűek gyorsabban vándorolnak („futnak”) Gélfestés: a minta láthatóvá tételét szolgálja a futtatás során
Etídium-bromid: kovalensen kötődik a nukleinsavakhoz Bekötődve fluoreszkál UV hatására UV alatt a nukleinsavak láthatóak
III/2. SDS- Poliakrilamid gélelektroforézis • gél pórusnagysága a monomerek koncentrációjától függ; • leghatékonyabb, rutinszerűen alkalmazott fehérje elválasztási módszer.
Összetevők: APS- elindítja a polimerizációt Temed- szabadgyök, katalizálja a polimerizációt Bisz-akrilamid-crosslinker SDS- anionos detergens A fehérje apoláros részéhez kapcsolódik Lefedi a pozitív régiókat Minden fehérjét anionossá tesz
Akrilamid + biszakrilamid + perszulfát → poliakrilamid
III/4. Izoelektromos fókuszálás Bizonyos makromolekulák, melyekben savas és bázikus csoportok is találhatóak, ha változik a közeg pH-ja össztöltésüket megváltoztatják. Pl.: fehérjék Magas pH – negatív Alacsony pH – pozitív nettó töltés De egy bizonyos pH-n az össztöltés nulla – izoelektromos pont
Az elektroforézis pH gradiensben végezzük A fehérjék az izoelektromos pontjuknak megfelelő pH-ig vándorolnak
III./5. Kétdimenziós elektroforézis
Csökkenő méret
Csökkenő pH
IV. A Southern, Northern és Western technikák Elektroforézissel a DNS, RNS vagy fehérje molekulák méret szerint elválaszthatók. A gélben elválasztott molekulák filterre blottolhatók. A filteren hibridizációval azonosíthatók a próbával homológ fragmentek, ellenanyag festéssel pedig a kérdéses fehérje. Southern-nel a gén DNS-e, Northern-nel a gén RNS-szinten történő kifejeződése, Western-nel a fehérje kifejeződése vizsgálható.
IV./1. Southern Blot festett gél
autoradiogram
1. A vizsgálandó DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük. 2. Gélelektroforézis során a méret szerinti elválasztás nem lesz tökéletes, mivel sok hasonló méretű, de eltérő szekvenciájú DNS fragmentumot kapunk az emésztés során 3. DNS fragmentumok denaturálása 4. Átvitel nitrocellulóz membránra 5. Jelölés (hibridizálás) komplementer DNS próbával 6. Az azonos hosszúságú, de eltérő szerkezetű fragmentumokat a jelölés után autoradiográfiával tesszük láthatóvá.
IV./3. Western Blot 1. SDS-gél 2. Átblottolás nitrocellulóz membránra 3. Jelölés elsődleges monoklonális antitesttel – ez specifikusan köt 4. Másodlagos antitest, ehhez színváltozással járó reakciót katalizáló enzim kapcsolódik. 5. Enzimszubsztrát hozzáadása 6. Jel detektálása
Köszönöm a figyelmet!
