Doktori értekezés. Dr. Máthé Miklós. Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola

A syndecan-1 expresszióváltozásai és a HPV-fertőzöttség: önálló és kölcsönható faktorok a laphámrákok prognózisában és progressziójában

Doktori értekezés Dr. Máthé Miklós Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető : Prof. Dr. Kovalszky Ilona PhD DSc Hivatalos bírálók: Dr. Újpál Márta PhD, egyetemi adjunktus Dr. Sápi Zoltán PhD, főorvos Bíráló Bizottság elnöke: Prof. Dr. Sótonyi Péter, az MTA tagja Bizottság tagjai: Dr. Kiss András PhD, egyetemi adjunktus Dr. Simon Károly PhD, oszt.vez. főorvos

Budapest 2006

Összefoglalás

A syndecan-1 (Sdc-1) egy transzmembrán heparánszulfát proteoglikán, mely főként hámsejtek felszínén jelenik meg. A Sdc-1 molekula képes proliferációt gátló hatásokat közvetíteni, de növekedési faktorok kötésével serkentheti is a sejtosztódást. A rosszindulatú daganatsejtekben gyakran csökken a syndecan-1 expresszió, ám az őket körülvevő kötőszöveti állomány sejtjeiben a tumorsejtek induktív hatására ektópiás termelődés jelenhet meg. Immunhisztokémiai elemzést végeztünk 40 szájüregi leukoplákia, 51 primer szájrák, 35 méhnyaki in situ karcinóma, és 56 invazív méhnyakrák formalin-fixált, paraffinba ágyazott anyagán. A normál nyálkahártya reakciójához képest a Sdc-1 szintje csökkenést mutatott már a rákmegelőző elváltozásként ismert szájüregi leukopákiákon is. A Sdc-1 termelődés csökkenését észleltük 45/51 szájrákban, és az összes invazív méhnyakrák mintán. Ugyanakkor 19/51 szájrákban megjelent a tumor-indukált reakció a stróma sejtjeiben. Szájrákoknál a sejtfelszíni reakció csökkenése összefüggést mutatott a betegség klinikai progressziójával, azonban a stromális Sdc-1 reakció megjelenése jóval markánsabban (p=0,023) bizonyult kedvezőtlen prediktív faktornak. A kóros kötőszöveti reakció megjelenését észleltük a méhnyakrákokban is 26/56 esetben, azonban a betegek eddigi követése alapján még nem dönthető el, hogy mindez mennyiben befolyásolja posztoperatív progressziót és a túlélést. Fej-nyaki laphámrákok esetében sajátos molekuláris jellemzőkkel bíró alcsoportnak tartják a humán papillómavírussal (HPV-vel) asszociált daganatokat, noha a vírus kóroki szerepe a szájüreg tumorai esetén vitatott. Szájrákban szenvedő betegek mintáit párhuzamosan elemeztük polimeráz láncreakcióval és az E6 vírusfehérjére végzett immunhisztokémiával. Eredményünk szerint ugyan a HPV valóban szerepet játszhat a szájüregi laphámrákok egy részének kialakulásában, de a PCR pozitivitása gyakran csak a környező nyálkahártya fertőzöttségét mutatja, és nem utal a vírus és a daganat oki kapcsolatára. A HPV 16 PCR/IHC kettősen pozitív tumorok Sdc-1 expressziója jóval erősebb volt, mint a vírust nem hordozóké, ami támogatja azt az elképzelést, hogy a HPV-vel összefüggő fej-nyaki karcinómák külön csoportot alkotnak.

Summary

Syndecan-1, a transmembrane proteoglycan may exert anti-proliferative effects, but may also promote cell growth by binding various growth factors. Malignant epithelial cells often down-regulate their own syndecan-1 production, whereas they are capable of inducing

an

aberrant

syndecan-1

expression

in

stromal

fibroid

cells.

Immunohistochemical analysis performed on 40 oral leukoplakias, 51 invasive oral squamous cell cancers and 35 in situ and 56 invasive carcinomas of uterine cervix revealed one or both of the above alterations concerning syndecan-1 expression. A decrease in syndecan-1 expression compared to normal epithelium could occasionally be detected as early as in leukoplakias, representing premalignant oral lesions. Syndecan-1 expression of tumor cells was decreased or even completely lost in 45/51 oral carcinomas and in all cervical carcinomas. Furthermore, tumor-induced stromal syndecan-1 immunoreaction appeared in 19/51 oral tumors. In the case of oral cancers the probability of postoperative progression showed some dependence on the degree of decrease in tumour cell syndecan-1 levels.Based on recurrence and overall survival data, stromal syndecan-1 expression in primary oral cancers appears to be a more reliable factor of adverse prognosis.(p=0.023) We also detected the tumor-induced stromal syndecan-1 expression in the case of cancers of uterine cervix; however, the question whether the presence and extent of stromal syndecan-1 expression can be considered real risk factors of postoperative progression in these malignancies requires further clinical investigation. Numerous lines of evidence indicate that head and neck squamous cell carcinomas associated with human papillomaviruses form a special molecular subgroup. However, HPVs’ role in the pathogenesis of oral cavity cancers is still a matter of debate. Our aim was to analyze the presence of HR-HPVs DNA and E6 protein in oral cancers. Fifty-one oral carcinomas were assayed for HPV by PCR, and parallelly by E6 protein immunohistochemistry. Our results are consistent with the idea that a distinct subgroup of oral cancers are HR-HPV-associated, although not all PCR positivity means a real causative relationship between virus and malignancy. The syndecan-1 expression of the HPV 16 PCR/IHC positive tumours was higher than cancers lacking the virus, which support the idea, HPV-associated head and neck cancers form a distinct entity.

TARTALOMJEGYZÉK

I. Bevezetés

1

I/1. Proteoglikánok és daganatok. A syndecan-család.

1

I/1.1. Proteoglikánok szerepe a daganatokban

1

I/1.2. A syndecan család tagjai és biológiai szerepük

4

I/1.2.1. Syndecan-család

4

I/1.2.2. A glukózaminoglikán láncok, és szerepük

5

I/1.2.3. A syndecanok expressziója, és szöveti megjelenése

6

I/1.2.4. A syndecan molekulák élettani szerepe

8

I/1.2.5. Az ektodomén lehasadása (Shedding)

8

I/1.2.6. A

9

Vázfehérje-mediált oligomerizáció

I/1.2.7. A syndecanok génjei

10

I/1.2.8. A syndecan-molekulák és fertőző mikroorganizmusok

11

I/1.3. A syndecan-1 molekula szerepe humán daganatokban

11

I/1.3.1. A syndecan-1 sejtfelszíni expresszió szerepe a daganatok klinikai viselkedésében

11

I/1.3.2. A stromális syndecan-1 expresszió és klinikai következményei

13

I/1.3.3. Syndecan-1 expresszió fokozódása daganatokban

14

I/2. A Humán Papillomavírus szerepe a szájüregi daganatokban

16

I/2.1. Bevezető

17

I/2.2. A humán papillómavírus (Papillomaviridae)

18

I/2.3. A papillómavírusok életciklusa

18

I/2.4. A fő transzformálvírusfehérjék, az E6 és E7 szerepe a malignus transzformációban

18

I/2.5. A vírus genomja, molekuláris életciklusa, fehérjéinek kifejeződése

21

I/2.6. A HPV terjedése, epidemiológiai jellemzői

21

I/2.7. A HPV szerepe Fej-Nyaki daganatokban

22

I/3. Célkitűzéseink

24

I

II. Anyag és módszer

25

II/1. Szövettani Minták

25

II/1.1. Szájüregi minták

25

II/1.2. Méhnyakrákos betegek anyagai

26

II.2. Vegyszerek, oldatok, pufferek

27

II/3. Vizsgálati módszerek

28

II/3.1. Immunohisztokémiai vizsgálatok

28

II/3.1.1. Immunhisztokémiai vizsgálatok kivitelezése

28

II/3.1.2. A syndecan-1 immunhisztokémiai reakciók kiértékelése

30

II/3.1.3. Immunohisztokémiai verifikációs módszerek, Envision-rendszer

31

II/3.2. Sejttenyésztés, és Immuncytokémiai módszerek a syndecan expresszió jellemzésére

31

II/3.3. ELISA vizsgálatok keringő syndecan-1 kimutatására

33

II/3.4. Fotódokumentáció

33

II/3.5. Polimeráz láncreakció (PCR)

34

II/3.5.1. DNS izolálás paraffinba ágyazott anyagból

34

II/3.5.2. Konvencionális PCR

34

II/3.5.3. Nested PCR

35

II/3.5.4. Agaróz gélelektroforézis

37

II/3.5.5. Southern blot

37

II/3.6. In situ Hibridizáció

38

II/3.6.1. In situ hibridizációs technika

38

II/3.6.2. ISH saját jelölésű próbával

38

II/3.6.3. Indirekt FISH biotinilált gyári próbával

39

II/3.7. Lézer Mikrodisszekció

39

II/3.8. DNS szekvenálás

40

III. Eredmények

42

III/1. Syndecan-1 eltérések szájrákokban

42

III/1.1. A syndecan-1 expresszió a szájüreg rákmegelöző állapotaiban:

II

Szájüregi Leukoplákiák syndecan-1 reakciójának vizsgálata

42

III/1.2. A vizsgált szájüregi laphámrákok sejtfelszíni expressziójának változása

42

III/1.3. Stromális syndecan-1 expresszió klinikai vonatkozásai orális karcinómákban

43

III/1.4. Statisztikai elemzés

54

III/2. Syndecan-1 változásai a méhnyak rosszindulatú daganataiban

56

III/2.1. A sejtfelszíni reakció csökkenése in situ karcinómákon és méhnyakrákokban

56

III/2.2. Syndecan-1 megjelenése méhnyakrákok kötőszöveti állományában

56

III/2.3. Syndecan-1 ELISA vizsgálatok méhnyakrákos betegek szérumából

66

III/2.4. Kísérleti szövettenyésztési modellrendszer

66

III/3. HPV-hez kapcsolódó eredmények

71

III/3.1. A HPV genom és fehérjék jelenléte szájüregi laphámrákokban

71

III/3.2. A syndecan-1 expresszió és a HPV jelenlétének viszonya

75

III/3.3. HPV-re utaló jelek nem epiteliális szövetekben

76

IV. Megbeszélés

84

V. Megállapítások

94

Rövidítésjegyzék

96

Irodalomjegyzék

99

Publikációs jegyzék

119

III

I. BEVEZETÉS

I/1. PROTEOGLIKÁNOK ÉS DAGANATOK. A SYNDECAN-CSALÁD. I/1.1. Proteoglikánok szerepe a daganatokban Tumorbiológiai kutatások hívták fel arra a tényre a figyelmet, hogy nem csak a rosszindulatú daganatok sejtei, hanem szöveti környezetük is döntő tényező a daganat és a szervezet kapcsolatában. A ráksejteknek valami módon kapcsolódniuk kell a szervezet anyagforgalmához, mozogniuk és vándorolniuk kell annak struktúrái mentén (vagy azok ellenére), továbbá el kell kerülniük a tumorellenes immunválaszt. Ez érdeklődést keltett a daganatos stróma, a benne levő mátrixfehérjék és a környező nem-tumoros sejtek szerepével kapcsolatban. A daganatban levő extracelluláris mátrix (ECM) összetétele jelentősen eltér a kiindulási normál szövetekre jellemző sejtközötti állománytól. E drámai különbség oka az, hogy a daganatban levő stróma a malignus sejtek által erősen átformált közeg (1). A klinikai tüneteket okozó rosszindulatú daganat sejtjei invázióra, illetve távoli áttétek kialakítására képesek. Mindkét folyamatban kiemelt szerepe van a daganatsejt és a mátrixfehérjék kapcsolatának. Ennek során nem csak molekuláris környezetüket alakítják át, hanem kötődhetnek olyan struktúrákhoz, amelyekhez a kiindulási szövet normál sejtjei képtelenek lennének (pl. melanómasejt a vérlemezkékre jellemző integrint fejez ki, és köti a fibrint). Citokinjeikkel a környező nem-tumoros strómasejtekre hatva serkentik egy megváltozott összetételű, az adott daganatra jellemző stróma kialakítását és az angiogenezist.(1,2,3,4,5,6,7). A proteoglikánok tipikusan a sejtfelszín és az extracelluláris mátrix fehérjéi. Jellemzőjük, hogy vázukhoz savas természetű, lineáris, szulfatált cukorláncok, az úgynevezett glukózaminoglikánok (GAG) kapcsolódnak. A poliszacharidok savas jellegét szulfát- és karboxilcsoportjaik adják. A proteoglikánok főbb csoportjaik szerint lehetnek membránfehérjék, és kis, leucinban gazdag extracelluláris proteoglikánok, mint a decorin, biglycan, illetve a más alcsoportba sorolt fibromodulin, lumican,

1

keratocan. Lehet proteoglikán intracelluláris vagy sejtfelszíni is, erre példa a serglycin (2, 4, 5). (1. táblázat) A sejtfelszíni proteoglikánok fontos képviselői a syndecan-család tagjai és a glypican-csoport proteoglikánjai. Részidős proteoglikánként a sejthártya-asszociált PGkhez sorolható a betaglycan, és a CD-44 is. (2,4,5) A proteoglikánokat sokáig főként térkitöltő molekuláknak tekintették, amelyek más mátrixelemmekkel kapcsolódva nagyobb struktúrákat építenek föl (pl. a decorin nevű proteoglikán a kollagénnel alkot komplexet). Kiderült, hogy szerepük van a szöveti ozmotikus folyamatokban, illetve az agrin nevű proteoglikán részt vesz a veseglomerulusokban zajló töltésen alapuló ionszelekcióban (2, 3). A proteoglikánok szerepét a biológiailag aktív molekulák megkötésében és tárolásában a 90-es évektől napjainkig számos eredmény tanúsítja. Kötődhet hozzájuk a bFGF, aFGF, HGF, TGF-β, TNF- α, interleukinok, GM-CSF, interferon-gamma. Részt vesznek a sebgyógyulási folyamatokban, mennyiségük dinamikus változást mutat a regeneráció során. (5, 6, 7, 8, 9, 10) Megállapították azt is, hogy a daganatokban egyes proteoglikánok az adott kiindulási szövetre jellemzőtől eltérő mennyiségben lehetnek jelen. Saját kutatásainkban a syndecan-1 nevű sejtfelszíni proteoglikán szerepét vizsgáltuk szájüregi és méhnyaki daganatokban, illetve ezek előalakjaiban, majd ehhez kapcsolódó kiegészítő vizsgálatokat folytattunk.

2

1. táblázat: A Proteoglikánok felosztása (Kovalszky I, 1999, (1))

A

GAG lánc

Intracelluláris Serglycin

B

HS/CS

Sejtfelszíni Syndecan-család HS/CS

Syndecan-1 Syndecan-2 Syndecan-3 Syndecan-4

HS HS HS

Glypican-család Glypican-1,2,3 Részidős Proteoglikánok Betaglycan CD-44 C

HS HS/CS CS

Extracelluláris Kis, leucinban gazdag Proteoglikánok Decorin Biglycan Fibromodulin

CS/DS CS/DS KS

Moduláris Proteoglikánok Versican Aggrecan Perlecan/Agrin

CS CS/KS HS/CS

HS: heparánszulfát láncok, CS: chondroitin-szulfát, DS: dermatán-szulfát, KS:keratánszulfát

3

I/1.2. A syndecan család tagjai és biológiai szerepük I/1.2.1. A syndecan-család A syndecan családba tartozó proteoglikánok az összes adherens sejtben megtalálható, evolúciósan igen konzervatív szerkezetű transzmembrán fehérjék. Felépítésük szerint egy vázfehérjéből (core protein), és ennek sejten kívüli részéhez kovalensen

kapcsolódó

savanyú

szénhidrát

polimerekből,

úgynevezett

glukózaminoglikánokból (GAG) állnak, mely poliszacharid láncok molekulatömege 10 és 100 kDa között változik (11). A syndecan család tagjai az I. típusú transzmembrán fehérjék közé tartoznak, tehát N-terminálisuk az extracelluláris térben, míg karboxil-terminusuk a sejten belül helyezkedik el (11). (1.ábra) A molekulák három szerkezeti egységre tagolhatók: 1. egy hosszabb extracelluláris domén, melyen számos GAG-kötő konszenzusszekvencia található; 2. egy transzmembrán domén, valamint 3. egy rövidebb intracelluláris domén, mely számos fehérjével lehet interakcióban. A syndecan-molekula intracelluláris és a transzmembrán doménje evolúciósan meglehetősen konzervatív szerkezetű származástanilag messze eső csoportokban is, a Caenorhabditis-tól kezdve a rovarokon (Drosophila) át az emlősökig (11, 12, 13, 14, 15). A syndecan-1 (és syndecan-3) fehérjevázán két külön glukózaminoglikán-kötő szakasz található: az egyik az N-terminus közelében, míg a másik a sejtmembrán közelében, egy prolin-treonin gazdag régióval elválasztva (11). A syndecan-1 transzmembrán doménjára jellemző a kis oldalláncú aminosavak reguláris, ismétlődő mintázata. Sajátos tulajdonsága, hogy három glicin is van transzmembrán részben, ami meglehetősen ritka ilyen lokalizációban, mert a glicin nem hidrofób aminosav. Ennek a molekula dimerizációjában lehet szerepe. (13) A sejten belüli domén membránhoz közel eső része (C1 régió) és a C-terminális rész (C3 régió) a törzsfejlődés során különösen erősen konzervált szakaszok. A

4

konstans régiót megszakító szegmensek (V régió) viszont variábilis aminosav szekvenciát mutatnak (11, 16). A syndecan család molekuláinak foszforilációja in vivo főként a citoplazmatikus domén konzervatív szakaszának szerinjén megy végbe. (17).

I/1.2.2. A glukózaminoglikán láncok, és szerepük A syndecanok funkcióiban döntő szerepük van az általuk hordozott savanyú cukorláncoknak, melyek számos biológiailag aktív molekulához kötődhetnek, így elősegítve a syndecanok ko-receptor szerepét (18, 19, 20). A syndecanok ún. „full time” proteoglikánok, tehát nem írtak még le glukózaminoglikán nélküli természetes syndecan molekulát (11). A megszintetizált vázfehérjére a Golgi-rendszerben kerülnek a cukorláncok. A syndecanok általában heparán-szulfát típusú GAG molekulák hordozói, azonban a syndecan-1 és a syndecan-4 esetében kondroitin-szulfát is kapcsolódhat a vázfehérjéhez, eltérő funkciókkal. A syndecan-1 membránproximális GAG-kötőhelyeit elsősorban kondroitin-szulfát, míg az N-terminushoz közeli glikozilációs pontokat főként heparánszulfát cukorláncok foglalják el (18, 19, 21, 22). A heparán-szulfát láncok ismétlődő egységeit glukuronsav és N-acetil-glukózamin alkotja, melyek között β 1-4 kötés alakul ki (18). A kondroitin-szulfát ismétlődő diszacharid egységet glukuronsav, és hozzá β 1-3 kötéssel kapcsolódó N-acetilgalaktózamin alkotja. A GAG-addíció konszenzus-szekvenciája a savas környezetben levő szerin-glicin motívum. A szénhidrát lánc egy minden syndecanban azonos tetraszacharid kapcsoló régióhoz csatlakozik, és felillesztését a kulcsfontosságú alfa-N-acetil-glukózaminiltranszferáz enzim katalizálja (19). Az ezt követő – nem minden diszacharid-alegységet érintő – posztpolimerizációs módosító lépések során (epimerizáció, szulfatálás) alakul ki a glukózaminoglikán lánc végleges szerkezete. Úgy tűnik, hogy a cukorláncok eltérő mintázatai különböző ligandaffinitást eredményeznek. Erre utal a tény, hogy különböző sejttípusokra eltérő GAG struktúrák jellemzők, s ezek a különbségek a sejttípusok közötti funkcionális

5

eltéréseket tükrözik. Pl. az egyrétegű hámok syndecan-1 molekulája hosszabb és erősebben módosított GAG láncokat hordoz, mint a többrétegű hámok sejtjeinek syndecan-1-e (19). I/1.2.3. A syndecanok szöveti megjelenése A syndecanok kifejeződése mind fejlődési fázis-, mind szövetspecifikus lehet. Expressziójuknak úgy a fokozódása, mint az eltűnése jelentős sejtmorfológiai változásokkal függ össze (23, 24). A 33 kDa molekulasúlyú syndecan-1 (más néven CD-138) főként az epitéliális sejtekre jellemző molekula,( 1,2 ábra) amely megjelenik a laphámsejtek teljes felszínén, de az endotél és a simaizomsejt is kifejezi. A B-lymphocyták érése során, a csontvelői naiv pre-B sejteken, de a plazmasejteken is expresszálódik. Más mesenchymalis eredetű sejtek is kifejezik az embrionális fejlődés folyamán, amelyekben vélhetően az epitélium és a mezenchima közti kölcsönhatások résztvevője. A köb-és hengerhámsejteken (pl. az emlő duktális sejtjei) megjelenése csak a bazolaterális membránra jellemző. Ha olyan syndecan-1 génkonstrukcióval transzfektáltak Madin-Darby kutyavese sejteket, amelyből hiányzott a C-terminális 12 aminosav, a molekula – a vad típussal ellentétben – nem csak a bazolaterális, hanem az apikális membránon is megjelent. A syndecan-1 expresszió Schwann-sejtekben megnövelte a sejtek szétterülését és a mikrofilamentum-képződést, ami a citoszekeletonnal való kapcsolataira utal (11, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30). A syndecan-2 (fibroglycan, 23 kDa) főként fibroblasztokra jellemző proteoglikán. (30) A syndecan-3 (N-syndecan, 43 kDa) kizárólag idegsejtekben fejeződik ki, mind a perifériás, mind a központi idegrendszerben. Emlősöknél a syndecan-3 expressziója összhangban van a központi idegrendszer oligodendrocytáinak differenciációs periódusaival, és a velőshüvely képződésével. (30, 31). A syndecan-4 (ryudocan, 22 kDa) a syndecan család legáltalánosabban előforduló tagja, a fokális adhéziók területén található meg (30, 32, 33, 34).

6

1. ábra: a syndecan-családba tartozó proteoglikánok molekuláris szerkezete. A sejten kívüli domén hordozza a glukózaminoglikán láncokat, mellyek heparinkötő növekedési faktorok forgalmát szabályozzák. A citoplazmatikus domének igen ősi strukturát őriztek meg az evolúció során.

7

I/1.2.4. A syndecan molekulák élettani szerepe A syndecan-család tagjai elsősorban más receptorok ligandkötését segítő (koreceptor)

molekulák.

Extracelluláris

doménjuk

heparán-szulfát

láncaival

hozzájárulnak növekedési faktorok (pl. bFGF, HGF) megkötéséhez, továbbá a mátrix adhéziós fehérjéihez (pl. fibronektin) kötődve növelik a sejt-extracelluláris mátrix kapcsolatok erősségét (11, 12, 35, 36, 37, 38, 39, 40). A citoplazmatikus doménnak fontos szerepe lehet az aktin-filamentális rendszer kialakításában, a citoszkeletális szerveződésben. A fehérje-kölcsönhatásokat vizsgáló „élesztő két-hibrid” módszerrel számos PDZ domén fehérjét azonosítottak mint a citoplazmatikus domén partnerét. Ilyen a syntenin, a synbindin, a synectin és a kalcium/kalmodulin-dependens szerin protein-kináz (CASK) is. Mind a négy syndecanban megvan C-terminus közeli motívum, mely a II. típusú PDZ fehérjéket köti. Így a syndecanok transzmembrán receptorokhoz és ioncsatornákhoz kötődve azokat koncentrálják és működésüket befolyásolják, részt vesznek a citoszkeletális szerveződés kialakításában, interakcióban számos sejtadhéziós komponenssel (41). A syndecanok a lipoproteinek anyagcseréjében is szerepet játszanak (42). I/1.2.5. Az ektodomén lehasadása (shedding) A membránfehérjékre jellemző, hogy eltávolításukat endocitózist követő lizoszomális lebontás biztosítja. Egy részüknél, így a syndecan család tagjai esetén egy másik jelenséget is megfigyeltek, az ún. „shedding”-et („vedlést”). Ennek pontos biológiai szerepe még nem feltárt (30, 43). A shedding során az extracelluláris domén proteáz-mediált módon levágódik a plazmamembránról; ebben főként a matrilysin nevű mátrix metalloproteáz (az MMP-7) játszik szerepet, de más proteázok (plasmin, thrombin) is fokozzák a syndecansheddinget (44, 45, 46). A lehasadt ektodomén bekerülhet a keringésbe, sejtkultúrák esetében kimutatható a tenyésztéshez használt médiumból. A lehasadás fokozását több receptorcsalád serkentése is ki tudja váltani, így egyes tirozin-kináz aktivitású receptoroké és G-fehérjéhez kapcsolt receptoroké.

8

Az EGF család tagjai fokozzák a sheddinget, egyes eredmények szerint a MAP kináz útvonalon. Fokozzák a külső domén levágódását egyes citokinek és kemotaktikus peptidek. A celluláris stressz szintén serkenti a shedding jelenségét. Ugyancsak fokozza a syndecan-vedlést számos bakteriális faktor; ez fölveti annak lehetőségét, hogy a sejten kívüli rész lehasadásának szerepe lehet a mikroorganizmus és a gazdaszervezet közti kölcsönhatásokban. A levált ektodomén nagy mennyisége mutatható ki szeptikus sokk esetén is. Egyes eredmények szerint tüdőgyulladásban kemotaktikus attraktánsként hathat a granulocytákra (47, 48). A keringő syndecan-1 szintjének emelkedését detektálták tüdőrákos betegekben (49, 50, 51, 52) és a gége és garat rákjainál is (53). Erős shedding-agonistáknak bizonyultak a forbol-észter vegyületek (pl. PMA), melyek közvetve, a protein kináz C aktivációján keresztül a syndecan intracelluláris doménjain elhelyezkedő konzervált tirozinok foszforilációját okozzák. A folyamat hidroxamát metalloproteáz-inhibitorokra érzékenynek bizonyult. Vizsgálták az összefüggést a shedding és a TIMP család tagjai között is. Úgy tűnik, a TIMP-3 képes gátolni a syndecan-1 és syndecan-4 PMA-indukálta sheddingjét, a TIMP-1 és a TIMP-2 azonban nem. (54, 55).

I/1.2.6. A vázfehérje oligomerizációja A syndecan család tagjainak core proteinjai képesek oligomerizációra. Az így alkotott komplex stabil, detergenseknek ellenáll. Mivel a receptor kinázok, az adhéziós molekulák, valamint a nem-katalitikus receptorok esetében a dimerizáció jól ismert aktivációs mechanizmus, fölmerül, hogy esetleg hasonló szerepet tölthet be a syndecanok működésében is (18, 56). A patkány syndecan-3 molekulával végzett kísérletek szerint a transzmembrán domén szükséges a dimerizációhoz, ez azonban önmagában még nem elégséges: az extracelluláris domén sejtfelszínhez közeli utolsó motívuma is szükséges hozzá. Ez a motívum nem hasad le a shedding során. Elképzelhető, hogy az oligomerizáció a sejten belüli doménok közvetítésével fejti ki hatását, akár az extracelluláris domén „vedlése” után is (56).

9

A transzmembrán doménok oligomerizációs képességében lényegesek lehetnek egyes korábban említett molekuláris sajátosságaik (kis oldalláncú aminosavak, és a három glicin molekula jelenléte). Ennek bizonyítására a syndecan-3 transzmembrán domén glicinjeit leucinra cserélték: ez meggátolta a dimerek kialakulását, feltehetően sztérikus okokból. Hasonlóképpen, ha a kritikus helyen levő négy extracelluláris membránproximális aminosav közül a bázikusak helyére alanint illesztettek be, az jelentősen gátolta a dimerizációt (15, 56). A jelenlegi elképzelések szerint a syndecan vázfehérjék oligomerizációja a transzmembrán doménok közti hidrofób kölcsönhatások mellett az ektodoménhoz közelebb eső aminosavak kisebb és terjedelmesebb oldalláncai közti intermolekuláris kölcsönhatások révén jön létre, amelyeket még a külső domén sejtfelszíni végére eső motívumok közti elektrosztatikus kölcsönhatások is stabilizálnak.

I/1.2.7. A syndecanok génjei A humán syndecan család minden egyes tagjának génje eltérő kromoszómán lokalizálódik. Úgy tűnik, filogenetikailag a syndecan 1 és 3, illetve a syndecan 2 és 4 állnak közelebb egymáshoz (14). Az exonok és intronok szerkezete alapján föltételezik, hogy egy ősi gén duplikációjával keletkezhettek. Génjeik öt exonból és négy intronból állnak. Az 1. exon kódolja az 5’ nem-transzlálódó régiót és a szignálpeptidet, a 2-es exon az N-terminus felé eső GAG kötőhelyeket. A 3. exon az ektodomén spacer régióját, a 4-es exon pedig a membránproximális GAG-kötő részt kódolja, és 10 bázispárnyi részt a transzmembrán doménből, végül az 5-ös exon a maradék transzmembrán részt és a sejten belüli domént, valamint a 3’ nem-átíródó régiót (14). A syndecan-1 gén lokalizációja 2p24.1. A syndecan2 géné 8q22-q23 szakasz. A syndecan-3 molekula génje az 1pter-p22.3, a syndecan-4 –é 20q12 helyen helyezkedik el.

10

I/1.2.8. A syndecan-molekulák és fertőző mikroorganizmusok A syndecan család tagjai a sejtek felületén nagy mennyiségben jelen levő, az evolúció során korán megjelent fehérjék, így baktériumok (pl. Pseudomonas, Staphylococcus, Porphyromonas) kötőhelyeként szolgálhatnak. „Vírusreceptorok” is lehetnek: a syndecanokhoz kötődhet a HIV, és a hámeredetű daganatok kialakulásában fontos szerepet betöltő Humán Papillómavirusok is (57, 58, 59, 60, 61). A baktériumok elleni védekezésben is szerepük lehet a syndecanoknak. Elképzelhető, hogy a Toll-like receptor (TLR)-defensin rendszerrel is kapcsolatban állnak. E tény figyelembe vételével különösen érdekesek lehetnek a shedding hatásai a mikróba-gazdaszervezet viszonyra, s ez további kutatások szükségességét veti fel e témában (62, 63).

I/1/3. A syndecan-1 molekula szerepe humán daganatokban A syndecan-1 molekula daganatbiológiai szerepét vizsgálták talán legtöbbet a syndecan család tagjai közül. A szakirodalom főként kétféle kifejeződési eltérés szerepével foglalkozik: a sejtfelszíni syndecan-1 reakció csökkenésével, és a syndecan-1 expresszió kóros stromális megjelenésével. Az emlő és a pankreász daganatainál az expresszió fokozódását is leírták.

I/1.3.1. A syndecan-1 sejtfelszíni expresszió szerepe a daganatok klinikai viselkedésében A sejtfelszíni syndecan-1 változásait és klinikai hatásait számos eltérő eredetű emberi daganatban vizsgálták, bár a jelenség prognosztikus jelentősége nem mindig egyértelmű (64). A sejtfelszíni syndecan-1 kifejeződésének csökkenése általában dedifferenciációs jel.

11

A syndecan-1 ektodomén csonkolt változata, mely a „minican” fantázianevet kapta, jelentősen gátolta az S 115 (egér emlőkarcinóma) sejtek osztódását, mégpedig a RAS/ERK szignálúton keresztül. A kísérletből a kutatócsoport azt a következtetést vonta le, hogy a syndecan-1 ektodomén gátló hatásokat közvetít (65, 66). Az újabb kutatások fényében azonban valószínűbb, hogy inkább kompetitív jelenségről volt szó: a médiumba nagy tömegben került ektodomén lekötötte a szolubilis növekedési faktorokat, és így vezetett gátláshoz. Ugyanis az ektodoménnak kizárólag proliferációgátlást tulajdonító szemlélet alapján nehéz megmagyarázni, hogy a kóros stromális megjelenés miért jár rosszabb prognózissal az emberi daganatokban. Továbbá emlőrákok esetén nem igazolódtak a syndecan-1 csökkenés prognózist rontó hatásai. Több daganattípusban, így laphámrákokban az expresszió csökkenése mRNS szinten következik be, mert e daganatokban nem csak a syndecan-1 fehérje, de a hírvivő RNS mennyiségében is csökkenést észleltek. Úgy tűnik, hogy hámsejtekben ez párhuzamos lehet az E-cadherin csökkenésével is (19, 64, 67, 68, 70). A tumorsejtek syndecan-1 expressziójának a kiindulási szövethez viszonyított visszaesését figyelték meg agresszív basaliomáknál (71). Leírták a jelenséget vastagbélrákokban is, ahol a kedvezőtlen klinikai lefolyás jeleként értékelték (72, 73). A bőr laphámrákjainak progressziójában az invazívvá válás fontos lépésének gondolják a sejtfelszíni syndecan-1 kifejeződésének csökkenését (74). Mesotheliomáknál viszont a syndecan-1 expressziója az epitéliális irányú differenciáció jele (75). A nem-hámeredetű daganatok közül a B-sejtes lymphomáknál, elsősorban a myeloma multiplex, de más monoklonális gammopátiák diagnosztikájában is fontos a syndecan-1 sejtfelszíni és szérum szintje (shedding!). A syndecan-1 egyéb B-sejtes folyamatokban is szerepet játszhat ( 76, 77, 78). A nem-kissejtes tüdőrákban a sejtfelszíni a syndecan-1 expresszió csökkenése kedvezőtlen prognózissal járt. (79, 80). Májrákok immunhisztokémiai vizsgálata során a sejtfelszíni reakció csökkenése, mely a nem-cirrhotikus alapon megjelenő daganatok sajátja, szintén prognosztikus tényezőnek bizonyult (81, 82). Leírták, hogy a syndecan-1 sejtfelszíni csökkenése párhuzamos a sejtek atípiájával, a magok polimorfiájával veserákban (83), valamint hogy a syndecan-1 prognosztikus tényező endometriális karcinómában (82) és nasopharyngealis karcinómában is (85).

12

Az eddigi tanulmányok szerint a sejtfelszíni syndecan-1 szint csökkenése a tumor mélyebb invazív frontján hasznos prognosztikai marker lehet a szájüregi laphámrákok esetében. Japán kutatócsoportok szerint az erős vagy közepes syndecan-1 expressziót mutató nyelvrákos betegek túlélése szignifikánsan kedvezőbb volt, mint akiknél a syndecan-1 kifejeződés gyenge volt, vagy eltűnt (86-91). A méhnyaki laphámrákoknál azonban nem sikerült hasonlóan meggyőző összefüggést találni a syndecan-1 expresszió és a kórlefolyás között. Inki et al. szerint a syndecan-1 expresszió csökken a cervikális intraepitéliális neoplázia (CIN) fokozatai között a CIN I-től a CIN III felé haladva, miközben az immunreakciót adó sejtek zónája kiszélesedik a normál méhnyaki hámhoz képest (92, 93) . Rintala és munkatársai 7 évvel ezelőtti vizsgálatukban 124 méhnyakrákban szenvedő, közöttük 102 laphámrákos beteg mintáját elemezték a syndecan-1 jelenléte szempontjából, és ezt vetették össze a túlélési paraméterekkel. A Turkui Egyetem 19701988 közti méhnyakrákos betegeit vizsgálták archivált mintákon, az extracelluláris domén elleni B-B4 antitestet használva. Eredményük szerint a syndecan-1 expresszió csökkenése

valóban

párhuzamos

a

szövettani

grade-del

(amely

faktornak

méhnyakrákokon ismert módon nincs klinikai jelentősége), de nem mutatott összefüggést a klinikai stádiummal és a betegségmentes túléléssel (94, 95). Hasonló módon egy japán tanulmány 81 méhnyakrák elemzése után nem talált összefüggést a syndecan-1 mRNS szintjének csökkenése és a betegek további sorsa között, azonban a syndecan-1 csökkenés össszefügött a nyirokcsomómetasztázisok létével. Fölvetésük szerint a csökkent syndecan-1 szint előnyt hordozhat a metasztatizálási folyamat során a daganatsejt számára (68).

I/1/3/2. A stromális syndecan-1 expresszió és klinikai következményei Emberi daganatok közül először duktális emlőrákokban írták le, hogy a syndecan-1 expressziója megjelenik a kötőszöveti sejteken. Kiderült, hogy ez emlőrákban kedvezőtlen klinikai lefolyással, a tumorspecifikus halálozás emelkedett kockázatával jár (96-103). A kötőszöveti syndecan-1 immunreakció gyomorrákoknál szintén rossz

13

prognózissal társul (85). Egy igen érdekes vizsgálat eredménye szerint a syndecan-1 molekulát kifejező stromasejtek miofibroblaszt jelleget mutatnak (104). A strómális expresszió jelenségét megfigyelték a pajzsmirigy, a petefészek és a prosztata rákjaiban is (100, 101). A hasnyálmirigy adenokarcinómáiban szintén leírták, mint a kedvezőtlen kórlefolyás jelét rezekábilis daganatok esetén (104). Kísérleti modellben vizsgálták, hogy valóban a tumor serkenti a syndecan-1 termelődését, s ez visszahat-e az adott daganatsejtekre. Kokultúrás rendszerben Maeda és társai duktális emlőrákvonalat és fibroblasztokat tenyésztettek együtt. A syndecan-1et egyébként nem kifejező fibroblaszt sejtek syndecan-1 expresszióval reagáltak a ráksejtek faktoraira, tehát abnormális helyen és nagyobb mennyiségben jelent meg a proteoglikán.

Megfigyelték,

hogy

ez

pozitív

visszacsatolást

jelentett

az

emlőráksejteknek, mert gyorsította proliferációjukat, és serkentette az angiogenezist is (105). Fölmerül ezek után a kérdés, hogy mi magyarázhatja a daganatok gyorsult növekedését, amelyre mind az in vitro kísérlet, mind számos klinikai eredmény utal. Elképzelések szerint a daganatos klón számára azért jelenthet mikroevolúciós előnyt, ha a környező strómasejteket serkenti, és azok kifejezik ezt az egyébként csak éretlen mezenchimális sejtekre jellemző proteoglikánt, mert a syndecan-1 heparán-szulfát glukózaminoglikán láncai jelentős mennyiségű növekedési faktort kötnek le a daganatsejt közvetlen szomszédságában (105). Fej-nyaki daganatoknál eddig egyetlen tanulmány foglalkozott a syndecan-1 stromális megjelenésével. A jelenséget meglehetősen gyakorinak írta le (85%-a a vizsgált daganatoknak), de nem találta prognosztikailag értékelhető faktornak (108).

14

I/1/3/3. Syndecan-1 expresszió fokozódása daganatokban Duktális emlőrákok esetén jóval összetettebb a sejtfelszíni syndecan-1 eltérések szerepe, mint a laphámrákoknál, ugyanis a fokozott syndecan-1 expresszió kedvezőtlen klinikai prediktív faktornak bizonyult (97, 107, 108). Az emlő duktális sejtjei esetében a syndecan-1 a bazolaterális membránrészen fejeződik ki, és ebben a lokalizációban fontos szerepet tölt be a sejt morfológiájának fenttartásában. (24) További magyarázat lehet, hogy duktális karcinóma vonalaknál a syndecan-1 mint heparánszulfátproteoglikán az αvβ3-integrin fontos koreceptora (36). Mivel a syndecan-1 segíti az αvβ3- integrin ligandkötését, s ez fontos túlélési jel a daganatsejtnek, a sejtfelszíni syndecan-1 elvesztése nem jelent egyértelmű előnyt a ráksejtnek, sőt ellenkezőleg: éppen a syndecan-1 megtartása vagy akár fokozott expressziója előnyös a számára (36, 109, 110) Valóban, egy vizsgálatban a magasabb syndecan-1 expressziót mutató emlődaganatok az alkalmazott kemoterápiára kevésbé mutattak regressziót (111). Valószínűleg e tényezők magyarázzák a más daganatokhoz képest fordított klinikai összefüggést az emlőrákoknál. A duktális karcinóma mellett még a pankreász daganatainál írták le, hogy a syndecan-1 magasabb expressziója rosszabb prognózist jelent, de egy másik kutatócsoport ezzel ellentétes véleményre jutott. (112, 104).

15

I/2. A HUMÁN PAPILLOMAVÍRUS SZEREPE A SZÁJÜREGI DAGANATOKBAN

I/2.1. Bevezető A fej-nyaki daganatok legfontosabb kockázati tényezői világszerte a dohányzás és az alkoholfogyasztás, továbbá szerepet tulajdonítanak a rossz szájhigiénének is. Egyes földrajzi régiókban speciális addiktológiai okok is fölmerülnek (pl. a Dél-Ázsiában, maláj nyelvű országokban elterjedt bételrágás, Jemenben a katcserje levele stb.) (113). Rous 1911-ben csirkékkel végzett kísérletsorozata vetette föl először, hogy fertőző ágensek is okozhatnak daganatot. Azóta több emberi rosszindulatú daganat, pl. a méhnyakrák, a Kaposi-szarkóma esetében igazolódott bizonyos vírusok kóroki szerepe. A hepatitisz B és C vírusokkal erősen átfertőzött trópusi övezetekben, pl. Mozambik, a primer hepatocelluláris karcinóma a leggyakoribb rosszindulatú daganatok közé tartozik, s ezzel előkelő helyet foglal el a vezető halálokok között. (Ennek persze alimentáris oka is van, az aflatoxin B1.) Becslések szerint az emberi daganatok mintegy 15%-a tulajdonítható valamilyen vírusfertőzés következményének. Az

utóbbi

két

évtizedben

egyre

nagyobb

figyelem

fordul

a

humán

papillómavírusok járványtani szerepére. Epidemiológiai vizsgálatok szerint a HPV fertőzés nagyobb kockázatot jelent a méhnyakrák kialakulásában, mint a dohányzás a tüdőrák létrejöttében (114). A fej-nyaki elváltozások egy részében is fontos kockázati tényezőnek tartják a papillómavírusokat (115).

I/2.2. A humán papillómavírus család (Papillomaviridae) A HPV az egyik legismertebb onkogén DNS víruscsalád. Ubikviter kórokozó, melynek csaknem 100 típusa különböztethető meg az E6, E7 és L1 ORF-ek szekvenciája alapján (116). Prevalenciájuk magas, egyes becslések szerint a szexuálisan

16

aktív fiatal nők fertőzöttségi aránya 20-40 %. A papillomavírusok önálló rendszertani kategóriát képeznek, mióta a vírustaxonómusok felismerték, hogy a korábbi ún. Papova (Papillóma-Polióma-Vakuolizáló

vírus)

csoporton

belül

a

papillóma-

és

a

poliómavírusok nagyobb filogenetikai távolságot mutatnak, mint korábban hitték. A különböző vírustípusok eltérő transzformáló képességgel bírnak. Azokat a HPV típusokat, amelyek jelenléte mellett magas a malignus transzformáció kialakulásának kockázata, az ún. „high risk” (HR-HPV) csoportba sorolják. A high risk csoportba 2004 óta 15 típus tartozik: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 és 82. A high risk HPV típusok olyan onkoproteineket termelnek, melyek kötődnek a p53-hoz, vagy a pRb-hoz. A fertőzött sejtek immortalizációjához elég az E6 és E7 fehérjét kódoló DNS fragment integrációja. A különböző HPV típusok elterjedése jelentős és etnikai földrajzi különbségeket mutat. A HPV típusok közül az egyik legnagyobb csoportot a főként nyálkahártyafertőzéseket okozó HPV típusok alkotják, melyek leginkább az anogenitális régióban fordulnak elő. Legismertebb közülük a HPV 16, amely a méhnyakrákok többségénél kóroki szerepet játszik (117). A HPV az eddigi szakirodalom szerint hámsejteket fertőz, epiteliotróp. A vírusfertőzés különböző jó- és rosszindulatú elváltozásokat okozhat. (117). Egyes adatok szerint további ráktípusokban lehet szerepe, pl. nyelőcsőrák, (118), és talán a húgyhólyag tranzicionális sejtes karcinómáinak (TCC) kialakulásában is (119). A vírus rákkeltő hatását, és annak pontos mechanizmusát eddig méhnyakrákokon tanulmányozták a legrészletesebben. A rákot megelőző hámelváltozásokban a HPVgenom episzómák (extrakromoszomális genetikai elemek) formájában található, invazív méhnyakrákokban viszont nagy gyakorisággal beépül a gazdasejt DNS-ébe. Minden jel szerint az integrálódás kulcsfontosságú hámsejtek malignus transzformációjában. A növekvő DNS-instabilitás további genetikai károsodásnak nyit utat. A HPV esetében mindezidáig nem sikerült kitüntetett integrációs helyet kimutatni. Méhnyaki hámon igen hosszú idő telhet el a fertőzéstől kezdve az intraepitéliális neoplázia megjelenéséig, majd az in situ karcinóma, végül az invazív tumor kifejlődéséig. Ez akár 20-30 év is lehet (117).

17

I/2.3. A papillómavírusok életciklusa

A papillómavírusok hámsejteket fertőznek, életciklusuk azokkal szinkron: termelődésük a hámsejtek differenciációjához kötődik. Úgy tűnik, a HPV sejtbe jutásáért felelős sejtfelszíni receptorok között lehet heparánszulfát proteoglikán (59, 60, 61), nagy eséllyel éppen a syndecan-molekula; továbbá valószínűleg szükséges az integrin α6/β4 (120). A klatrin-dependens endocitózist gátló klórpromazinnal a fertőzés magakadályozható, mivel a lefűződő endoszómákat klatrinburok veszi körül (121). Fertőzés után a vírusgenom episzóma formájában van jelen a sejtmagban, sejtenként mintegy 50-100 kópiában. Egy HPV-fertőzött sejt osztódása után mindkét leánysejt tartalmazza a vírus DNS-ét, ami a sejtciklus S-fázisában együtt replikálódik a gazdasejt örökítőanyagával. Ezek a sejtek tovább osztódva rezervoárként szolgálnak a vírus számára. A hámfelszín felé vándoroló, és differenciálódó hámsejtekben a HPV örökítő anyaga az újonnan összeszerelődő kapszidokba csomagolódik. A virionok a leváló hámsejtekkel válnak szabaddá, és fertőzhetnek meg újabb sejteket (122).

I/2.4. A fő transzformáló vírusfehérjék, az E6 és E7 szerepe a malignus transzformációban Az E6 és E7 fehérjék tehetők felelőssé a fertőzött sejtek malignus átalakulásáért. Bár külön-külön is képesek humán sejtek immortalizációjára, együttműködve fejtik ki funkciójukat, egymás hatását erősítve. Az E6 fehérje a G1/S, G2/M átmenet ellenőrzésééért felelős p53 fehérjéhez kötődik, így az nem tudja kifejteni proapoptotikus

hatását.

Emellett

gátolja

az

apoptózist

Bak

fehérje

hatásának

felfüggesztésével is. Miközben megakadályozza a programozott sejthalált, aktiválja a telomerázt és a Src kinázokat. Míg az E6 fehérje interferál azokkal a mechanizmusokkal,

melyek

gátolnák

a

18

sérült

genommal

rendelkező

sejtek

továbblépését a sejtciklusban, az E7 protein aktiválja a ciklin A-t és E-t, valamint ezzel párhuzamosan gátolja a p21 (Waf1) és p27 (Kip1) ciklin-dependens kináz inhibitorok működését, ezáltal S fázisba kényszeríti a gazdasejtet. A transzformáló vírushérjék együttműködése úgy vezet a fertőzött sejt gyorsult proliferációjához, hogy közben a genom épségét ellenőrző mechanizmusok is kiesnek.(2. ábra) (117).

19

2. ábra: a magas kockázatú HPV vírusok két fő transzformáló fehérjéje, az E6 és E7 közösen, egymást erősítve vesz részt a tumorok kialakulásában. Harald zur Hausen cikke nyomán, ( )

20

I/2.5. A vírus genomja, molekuláris életciklusa, és fehérjéinek kifejeződése A papillómavírus partikulumok mintegy 55 nm átmérőjűek. Az ikozaéderes szimmetriájú, 72 kapszomerből álló fehérjeburkon belül helyezkedik el a mintegy 72008000 bázispár méretű cirkuláris, kettősszálú DNS-genom, melyhez hisztonszerű fehérjék kapcsolódnak (123, 124). A DNS-molekulának csak az egyik szálán történik transzkripció, és 8-10 ORF-et tartalmaz. A HPV genomban három fő régiót különíthetünk el: a long control régiót (LCR), ami a vírus-DNS kb. 10 %-át teszi ki, valamint a korai (early-E) és a késői (late-L) gének régióját (125). Az L1 ORF kódolja az 55 kDa molekulatömegű, erősen konzervált fő kapszidfehérjét. A víruskapszid járulékos strukturális komponense a kevésbé konzervatív L2 fehérje, amely 75 kDa molekulatömegű. A korai gének termékei olyan szabályozófehérjék, amelyek a vírusgenom fennmaradásáért, replikációjáért és a litikus ciklusának aktivációjáért felelősek. A korai és a késői gének leolvasási iránya nem teszi lehetővé, hogy a replikáció és a kapszidgének átírása egyszerre történjék (125).

I/2.6. A HPV terjedése, epidemiológiai jellemzői A vírus az anogenitális régióban főként nemi érintkezés útján terjed (Sexually Transmitted Disease – STD) (126). A HPV terjedését a sérült hámfelszín segíti elő legjobban (127). Feltételezhetően orogenitális kontaktus által is juthatnak fertőző HPV típusok a szájüregi régióba. Itt a nyállal történő terjedés lehetősége sem kizárt (128). A bőr - főleg sérült hám - fertőzése papillómavírussal szennyezett anyagok, eszközök érintésével valósul meg (129). A fertőzés rendszerint szemölcs, vagy nyálkahártya-papillóma alakjában jelenhet meg (130, 131). A fertőzések többsége abortív, vagy spontán gyógyul, azonban ez igen lassú folyamat. A vírusok és a fertőzés klinikai tünetei 1-3 év alatt tűnnek el teljesen. A fertőzött személyek legfeljebb 10 %-ában perzisztál a vírus; ez az érték a magas kockázatú vírustípusok - főként a HPV 16 - esetében 30% felett is lehet (132). Az immunrendszer csak lassan tudja eliminálni a papillómavírussal fertőzött sejteket, és pont a magas rizikócsoportba tartozó vírusok ellen tud kevésbé hatékonyan

21

fellépni. Az immunrendszer defektusai elnyújtják a HPV fertőzések idejét (133, 134, 135). A papillómavírusok nem pusztítják el a vírusfertőzött sejteket, így az immunrendszer aktivációja gyenge, ráadásul a papillómavírusok serkentik gátló citokinek, pl. az IL-4, IL-10 termelődését (136). Már az 1990-es évek elején felmerült a transzverzális terjedés lehetősége is, mely szerint a papillómavírusok perinatális úton kerülnek át a vírushordozó anyáról az újszülöttre (137). Egyes eredmények szerint a per viam naturalem szülés során az újszülött a fertőzés nagy kockázatának van kitéve. Még fontosabb eredmény, mely szerint elképzelhető, hogy az újszülött fertőzött hámsejtjeiben évtizedeken át klinikai következmények nélkül jelen lehet a vírus (138). Az Országos Epidemiológiai Központ virológusai, Csire Márta és munkatársai vetették fel először, hogy az újszülöttek papillómavírussal való fertőződése a fentiektől eltérő útvonalon, a placentán keresztül is bekövetkezhet (139). A magzatvízből szintén detektálható a vírus jelenléte. Leírták továbbá, hogy a HPV képes replikálódni a trofoblasztokban (140).

I/2. 7. A Humán papillómavírus a fej-nyaki daganatokban Mikroszkópos morfológiai és immunhisztokémiai vizsgálatok alapján már 1983ban fölmerült, hogy a HR-HPV típusok etiológiai faktorok lehetnek a szájüregi laphámrákok kialakulásában (141). Azonban az eddigi eredmények ellentmondásosak, és értékelésük is vitatott. A HPV 16-ot az irodalomban fellelhető különböző tanulmányok szerint a száj- és garatüregi rákok 20-90%-ában azonosították; a jelentős szóráshoz bizonyára a különböző mintavételi technikák, illetve az eltérő érzékenységű vizsgálati módszerek is hozzájárultak. A szájrákokban a leggyakrabban előforduló HPV típusok a HPV 16 és a 18, melyek aránya messze meghaladja a többi típusét (115, 141). A HPV-asszociált daganat gyakoribbnak bizonyult nőkben, továbbá magyarázatot adott a karcinóma kialakulásáról az olyan betegek többségénél, akiknek anamnézisében sem alkohol, sem dohányzás nem szerepelt, noha a fej-nyaki daganatok gyakran összefüggnek e tényezőkkel (115, 141, 142).

22

A vírus integrációját a gazdasejtek genomjába a szájüregi rákok esetében is a vizsgált minták közel felében bizonyítani tudták. A vírusintegrációt a szájüregi karcinogenezisben korai eseménynek tartják, és a rákmegelőző állapotok malignussá alakulásában tartják kulcsfontosságúnak (115, 143). Egy másik kutatócsoport viszont ezt cáfolva az integrációt igen ritka eseménynek találta (144). Klinikai vizsgálatok azt az eredményt hozták, hogy a HPV jelenléte a fej-nyaki rákokban kifejezetten jó prognosztikai faktor a más eredetű karcinómákhoz képest, ami a HPV-asszociált karcinogenezisnek a más etiológiájú rákokétól eltérő molekuláris mechanizmusára utalhat (115, 145). Széleskörű, kiterjedt vizsgálatok szerint a HPVasszociált fej-nyaki daganatok egy sajátos, külön entitást alkotnak, melyet kedvezőbb prognózis jellemez, és a tumorok gyakran bazaloid morfológiájúak. Mindazonáltal jelenleg is kétes, hogy a szájüreg rosszindulatú laphámdaganataiban a papillómavírusok valóban kóroki tényezők-e; és ha azok, a HPV-asszociált fej-nyaki daganatok valószínűleg akkor is más mechanizmusok útján alakulnak ki, mint azt a HPV-kapcsolt anogenitális karcinómák, például a méhnyakrák esetében megismertük. A legtöbb eddigi vizsgálat szerint a HPV kópiaszáma szájüregi laphámrákokban alacsony. A HPV DNS jelenlétét különálló fókuszokban lokalizálták különböző in situ vizsgálómódszerekkel. Ebből a daganat nem-klonális jellegére lehetne következtetni, amely azonban további kérdéseket vet fel. A HPV replikációja általában csak néhány fertőzött sejtre korlátozódik (145, 147). Számos olyan adat merült föl, amely szerint a szájüregben tranziens ágensként is megjelenhetnek a humán papillómavírusok magas rizikójú változatai. Egy tanulmány egyenesen az alkalmazott PCR technikák túlérzékenységét okolja azért, amiért a HPV-t összefüggésbe hozták a szájrákkal (146). Néhány kutatócsoport szerint a vírus inkább „bystander”, mint patogén tényező a szájüregi daganatokban (147). Összefoglalva: A méhnyaki daganatok mellett még a fej-nyaki laphámrákok az a tumoros csoport, ahol összefüggést találtak a vírus jelenléte és a daganatok kialakulása között. Azonban a HPV etiológiai szerepe korántsem olyan meggyőző, mint a cervixtumorok esetében.

23

I/3. CÉLKITŰZÉSEINK Vizsgálataink során tisztázni akartuk a sejtfelszíni syndecan-1 csökkenésének klinikai szerepét az általunk követett betegek szájüregi és méhnyaki laphámrákjaiban. Kísérleteink során mi is találkoztunk a kötőszöveti syndecan-1 expresszió jelenségével, e szempontot is bevontuk klinikopatológiai tanulmányunkba, és – más tényezőkkel együtt – vizsgáltuk hatását a betegek későbbi sorsára. Ugyancsak terveztük a HPV-fertőzés és a syndecan-1 expresszió esetleges összefüggésének elemzését fej-nyaki daganatokon. A HPV vírusreceptoraiként heparánszulfát proteoglikánok is szerepelnek, ezért feltételeztük, hogy a syndecan is betölthet ilyen szerepet (ez azóta igazolódni látszik). Továbbá, miután mind a megtartott sejtfelszíni syndecan-1 reakciót, mind a HPV genom jelenlétét kedvezőbb prognózis jeleként írták le, azt feltételeztük, hogy a HPV-asszociált tumorok, melyek amúgy is eltérő molekuláris jellemzőkkel bírnak a vírus DNS-t nem-hordozó fej-nyaki daganatoktól, syndecan-1 expressziójuk szerint is elkülönülő csoportot alkotnak. Mindeközben azonban egy jóval alapvetőbb problémával szembesültünk: kiderült, hogy a HPV-asszociált szájrák fogalma – ha egyáltalán létezik ilyen entitás – koránt sem egyértelmű. Világossá vált a PCR technikák elégtelensége a szájrák és a papillómavírus kapcsolatának elemzésében. Ezért vírusfehérjék kimutatásán alapuló módszereket, és in situ hibridizációs technikákat alkalmaztunk, melyek során új eredményekre jutottunk.

24

II. ANYAG, MÓDSZER

II/1. SZÖVETTANI MINTÁK II/1.1. Szájüregi minták A Szájsebészeti és Fogászati Klinika 91 betegének műtéti anyagából származó formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövettani mintáját dolgoztuk fel. A szövettani kiértékelést a Klinika saját szövettani laboratóriuma végezte, melyet Prof. Dr. Suba Zsuzsanna vezet. A betegek közül 40 szájüregi leukoplákiában, a további 51 pedig szájüregi laphámrákban szenvedett. A szájrákos páciensek daganatai mind primer tumorok voltak, a recidív vagy áttéti daganatokat kizártuk a vizsgálatból. Az elemzett primer szájrákok anatómiai lokalizációjuk szerint az alábbi módon oszlottak meg: 41 volt nyelv- vagy nyelvgyöki rák; öt betegnek volt gingivakarcinómája; 1-1 betegnek volt retromolaris, bucca-, vagy tonsillatumora; 2 betegnél pedig maxillakarcinóma volt az alapbetegség. Arra törekedtünk, hogy a lehető leginkább homogén betegcsoporton végezzük el a klinikai paraméterek statisztikai értékelését. Ezért az 51 esetből csak a (T2) méretű nyelv-/nyelvgyöki rákban szenvedő pácienseket vettük figyelembe; további kiválasztási szempont volt, hogy a malignóma ne lépje át a középvonalat. A betegek a Szájsebészeti és Fogászati Klinika kezelése alatt álltak, műtét előtti keringési paramétereik, respiratorikus és vesefunkcióik kielégítőek voltak, vérképzési paramétereik normális értékeket mutattak. A vizsgált esetek II-IV. stádiumúak voltak (T2N0M0 - T2N2M0 ). .

Amelyik páciens nem felelt meg a megadott patológiai vagy belgyógyászati

feltételeknek, kizártuk a statisztikai elemzésből. Bár mind az 51 primer szájüregi laphámrákban szenvedő beteg mintáját fölhasználtuk a syndecan-1 expressziós eltérések jellemzéséhez, azonban klinikai összefüggéseket csak az e körültekintő szempontok alapján kiválasztott, 39 fős csoporton írtunk le.

A betegek közül 29 férfi és 10 nőbeteg volt, átlagéletkoruk 53,1 év (39-68 év ). A kiválasztott betegek terápiás protokollja homogénnak volt tekinthető. A neoadjuváns

25

kemoterápiás kezelés során a betegek 60 mg/m² Cisplatint kaptak, melyet intravénásan 600 mg/m² 5-fluorouracil (5-FU) követett, melyet további 5-FU adagok követtek a 2, 3, 4, és 5. napon. A kezelés indítása után a 8-10. napon került sor a kuratív műtétre, melyet supraomohyoidális nyaki disszekcióval is kiegészítettek. Ezt követően a betegek összesen 60 Gray posztoperatív irradiációban részesültek, napi 2 Gy dózisban. A

39

beteg

formalin-fixált,

paraffinba

ágyazott

anyagát

vizsgáltuk

immunohisztokémiai módszerrel. Fontos megjegyezni, hogy a próbakimetszésből származó szövetmintát használtuk fel a vizsgálatban, melynek vétele a kemo- és radioterápiás kezelést megelőzően történt. A kezelt és műtött betegek havonta ellenőrzésen vettek részt a Szájsebészeti és Fogászati Klinikán, az átlagos követési idő a vizsgálat lezártáig 37 (26-63) hónap volt. Szájrákok esetén a 2 éves eseménymentes túlélés már 90%-os biztonsággal jelent tumor-mentességet (148), ezért választottunk legalább 26 hónapos minimális követési időt. A humán papillómavírus szerepét érintő kutatásunk során szájrákos betegeinknek ugyanabból a daganatból származó két mintáját is felhasználtuk polimeráz láncreakcióval végzett vizsgálatokban: a kezelést megelőző próbaexcíziót, és a kuratív műtét anyagát.

II/1.2. Méhnyakrákos betegek anyagai Vizsgálataink során a Semmelweis Egyetem I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika anyagából 95 beteg formalin-fixált, paraffinba ágyazott méhnyaki mintáját dolgoztuk fel immunhisztokémiai vizsgálattal. A szövettani elemzést a Klinika saját patológiai laboratóriuma végezte. A minták közül 35 volt in situ karcinóma konizátuma, a vizsgálatokat megelőzően ezek a betegek kolposzkópos és/vagy citológiai elváltozások miatt estek át a konizációs műtéten. Hatvan Wertheim-műtéten (hiszterektómia és parametriális és parailiacalis nyirokcsomó eltávolítás) átesett invazív méhnyakrákos beteg formalin-fixált, paraffinba ágyazott mintáját vizsgáltuk, ebből 55 volt laphámrák, további 5 méhnyaki adenokarcinóma. A műtét során a daganat kimetszésével párhuzamosan a nyirokutak által meghatározott hat

26

anatómiai területről az arteria iliaca communis környéki, az arteria hypogastrica (iliaca interna) környéki, valamint a fossa obturatoriában elhelyezkedő nyirokcsomók kerültek eltávolításra bal és jobb oldalról. Így összesen 60 invazív tumor és 360 nyirokcsomó minta (6 minta/beteg) állt rendelkezésre. Kutatásaink etikai vonatkozásait tekintve a hatályos jogszabályok szerint jártunk el, a TUKEB 95/1999. sz. engedélyének birtokában.

II/2. VEGYSZEREK, OLDATOK, PUFFEREK A különböző laboratóriumi vegyszereket (pl.: Tris, EDTA, NaCl stb.) a Merck Kft., Magyarország-tól szereztük be. Minden a vizsgálatokban használt reagens molekuláris biológiai tisztaságú volt. A vizsgálatok során használt oldatok, pufferek elkészítéséhez és azok hígításaihoz háromszor desztillált tisztaságnak megfelelő (Millipore Co.), autoklávozott vizet használtam. A szövegben részletesen nem specifikált oldatok és pufferek összetétele: BigDye Terminator Mix: Az Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) jogvédett összetételű előkevert reakcióelegye szekvenáláshoz, amely tartalmazza a fluorokrómmal jelzett négyféle dideoxi-nukleotidot, valamint a szintézishez szükséges DNS polimerázt (AmpliTaq Gold®). BigDye Puffer: Az Applied Biosystems jogvédett összetételű puffere a BigDye Terminátor Mix hígításához. Blokkoló törzsoldat: Amersham Life Science RNA Color Kit (RPN3300) Color Development 1x-es (pH=9,5): 100mM Tris HCl, 100mM NaCl,5mM MgCl2 Color Stop 10x-es (pH=2,9): 20mM Tris HCl, 1mM EDTA Lízis puffer: 0,01M Tris HCl, 0,1M EDTA, 0,02M NaCl, 0,5% SDS PBS

10x-es

(pH=7,4):

100g/l

NaCl,

Na2HPO4.2H2O

27

2,5g/l

KCl,

2,5g/l

KH2PO4,10,57g/l

Prehibridizáló oldat (pH=7,0): 25% formamid, 4x-es SSC, 1mM EDTA, 50mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1mg/ml Yeast RNA, 5x-ös Denhardt’s, DEPC víz Puffer 1 oldat 10x-es (pH=7,5): 1M Maleinsav, 1,5M NaCl 2×REDTaq™ReadyMix™ PCR Reaction Mix (Sigma): 1.5 U Taq DNS-polimeráz, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl, 0.001% zselatin, 0.2 mM dNTP SSC 20x-os (pH=7,0): 3M NaCl, 0,3M Na-acetát TAE 10x-es (pH=8,0): 0,4M Tris HCl, 0,02M EDTA, 11,4ml/l Ecetsav TBS 10x-es (pH=7,5): 24,2g/l Tris HCl, 88,5g/l NaCl TE 1x-es (pH=8,0): 10mM Tris, 1mM EDTA TSR reagens: Az Applied Biosystems jogvédett összetételű formamid alapú denaturáló puffere szekvenáláshoz. II/3. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK II/3.1. Immunohisztokémiai vizsgálatok II/3.1.1. Immunohisztokémiai vizsgálatok kivitelezése A tárgylemezre rögzített szövet deparaffinálása (kétszer váltott xylol, majd kétszer váltott absz. etanol, mindegyik 10-10 percig), majd 1x-es PBS-sel való mosás után a metszeteken mikrohullámú antigénfeltárást végeztünk citrát pufferben (0.01M pH=4.0) 600W-tal 103°C-on 18 percig. Miután a minták kihűltek, 3 percig emésztettük őket 0.01%-os tripszinnel szobahőmérsékleten. A szájüregi mintákon a syndecan-1 elleni BB4 klón vagy a HPV E6 fehérje elleni antitest fluoreszcens másodlagos antitesstel történő detektálásalakor lehetséges volt a 38 perces mikrohullámú feltárás, és az enzimatikus emésztés elhagyása. Ezt a módszert belső kontrollként használtuk. Az endogén peroxidáz aktivitást syndecan-1 vizsgálatakor 1%-os, HPV fehérjék vizsgálatakor 3%-os H2O2 -dal blokkoltuk (20’, RT). Az aspecifikus antitestkötődéseket 3%-os BSA (PBS), 2% lószérum (v/v%) oldattal való inkubálással előztük meg (30 percig 37oC-on). Annak magakadályozására, hogy a szövetben található biotin álpozitivitást eredményezzen, a Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) biotin blokkoló kitjét alkalmaztuk. Az eljárás során először 5% -os BSA-val inkubáltuk a metszeteket, majd

28

az endogén biotinhoz avidint kötöttünk, végül az avidin szabad kötőhelyeit biotinnal fedtük el. Mosás után nem maradt szabad biotin a metszetben. Ezután az elsődleges antitest oldatával 90 percig 37oC-on (vagy egy éjszakán át 4 o

C-on) inkubáltunk. A vizsgálatok során használt antitestek: •

monoklonális egér anti-HPV16/18 E6 (Clontech, clone: C1P5) 1:50 hígítású (1%-os BSA/PBS)

•

monoklonális egér anti-HPV16 E7 (Zymed, clone: 8C9) 1:20 hígítású (1%-os BSA/PBS)

•

monoklonális egér anti humán syndecan-1 B-B4 extracelluláris epitóp (Serotec Co, Oxford, UK) 1:500, fluoreszcensen 1:100.

•

poliklonális kecske syndecan-1 intracelluláris domén antitest (Santa Cruz Inc., CA, USA) 1:50

•

monoklonális egér anti-HPV16 E7 (Lab Vision, clone: TVG701Y) 1:100 hígítású (1%-os BSA/PBS)

•

monoklonális egér anti-HPV16 L1 (DAKO, clone: K1H8) 1:100 hígítású (1%-os BSA/PBS)

•

monoklonális egér anti-humán citokeratin (DAKO, clone: AE1/AE3) 1:100 hígítású (1%-os BSA/PBS)

•

poliklonális nyúl anti-S100 (DAKO) 1:100 hígítású (1%-os BSA/PBS)

Az immunreakciók vizualizálása egyes esetekben nagy érzékenységű jelamplifikációs immuntechnikák alkalmazásával történt: ABC –BT módszerrel - PBS mosás után a másodlagos antitest (biotinilált anti-nyúl antiegér IgG - ABC KIT (VECTASTAIN, pk-6200)) 1:50 hígítású (PBS-ben) oldatával 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltunk. Ezt ABC inkubálás követte 30 percig szobahőmérsékleten. Az immunreakció érzékenységét biotinilált tiraminnal fokoztuk a Merz és munkatársai által leírt módszer szerint. (7mM-os biotinilált tiramin törzsoldatból 1:125+0,033% H2O2, 10 perc szobahőm.) Ismételt ABC hozzátétele után az immunreakciót 0,05 mg/ml DAB-bal hívtuk elő. A háttérfestés hematoxilinnal történt (149).

29

Jelamplifikálás után fluoreszcens immuntechnikákat is alkalmaztunk az immunreakciók láthatóvá tételéhez, ebben az esetben a reakciót Streptavidin-AlexaFluor® 488-cal tettük láthatóvá (Molecular Probes), amit 1:150 arányban hígítottunk PBS-ben. A sejtmagokat DAPI-val (Boehringer Mannheim), vagy propídium-jodiddal (Qbiogene) festettük meg. II/3.1.2. A syndecan-1 immunhisztokémiai reakciók kiértékelése Az összehasonlító klinikopatológiai vizsgálatokban a fenti módszer diaminobenzidinnel előhívott változatát használtuk. Lényeges volt, hogy belső standardként mindig keressünk ép hámterületet, melyet három kereszt értékű alapreakciónak tekintettünk. Ha az adott mintában nem volt ilyen, a vele egyszerre előhívott minták hámjához mértük a reakciókat, kiküszöbölendő a szubjektivitásnak a módszerben rejlő lehetőségét. Minden egyes metszetet három különböző észlelő értékelt. A reakciókat az inváziós fronton figyeltük meg. A normál hámmal összevethető erősségű, a tumorsejteket körülrajzoló reakciót tekintettük erősnek (+++) . Ha a normál hámhoz képest már érezhető csökkenést észleltünk, de a tumorsejtek többségét még körülrajzolta a reakció, tekintettük közepes erősségű reakciónak (++).Az erősen csökkent expressziós mintázatot, ahol azonban a syndecan-1 még kimutatható volt, tekintettük gyenge reakciónak (+). Ahol az inváziós fronton levő tumorsejtek többsége – vagy egésze – már semmilyen immunhisztokémiai pozitivitást sem mutatott, (0) besorolást adtunk. A daganatok heterogenitása miatt a reakciók intenzitását a tumor inváziós frontján ítéltük meg. Ugyanígy jártunk el az expresszió eltűnésének (0) értékelésénél is. A heterogenitás egyébként nemigen vetett föl kiértékelési problémákat:az értékelést egymástól függetlenül végző, különböző személyek által adott értékeket ritkán kellett az összevetés után megvitatnunk. Ez a skála természetesen nem tekinthető tökéletesnek, és a szubjektív elemek miatt kellő óvatossággal kezelendő, de a klinikopatológai vizsgálatokban használtnak megfelel.

30

II/3.1.3. Immunohisztokémiai verifikációs módszerek, EnVision-rendszer Az EnVision (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark) rendszer egy biotin-független előhívási mód, amely jól használható immunohisztokémiai reakciók során, mivel kevés műtermékkel jár. A módszer egy konjugált biopolimer alkalmazásán alapul: az immunreakciót a Dako Cytomation EnVision System/HRP-vel erősítjük fel, amely egy másodlagos antitestekkel és HRP enzimekkel konjugált dextrán szál, majd DAB-bal hívjuk elő. A módszer menete az elsődleges antitestig megegyezik az előző protokollal, kivéve, hogy célszerűnek találtuk az elsődleges ellenanyag kétszer magasabb koncentrációjának használatát. Újabb mosás után PBS oldószerben 1:2 hígított EnVision reagenssel (eltérve a gyári protokolltól, mely töményen javasolja a reagens használatát) szobahőmérsékleten két és fél órát inkubáltuk a mintát. Ezután az előhívás menete megegyezik az korábban ismertetett módszerrel. A módszert kérdéses esetekben használtuk verifikációs célokra, a stromális syndecan-1 reakció létének igazolására, illetve a humán papillómavírus fehérjék kimutatásakor fölmerült kérdések tisztázására.

II/3.2. Sejttenyésztés és immuncitokémiai módszerek Sejttenyésztés Négy sejtvonalat használtunk kísérleteink során: két laphámrák-sejtkultúrát, az A431-et és a HeLa-t, valamint két mezenchimális eredetű sejtvonalat: patkánymájból izolált miofibroblasztokat és emberi méhnyakrákból származó fibroblasztokat. A-431 laphámrákkultúra tenyésztése Az A-431 jól differenciált vulváris karcinóma eredetű sejtvonal, jellemzője a magas EGF-receptorszint. Nem hordoz humán papillómavírusokat. Tenyésztése 4500 mg/l glükózt tartalmazó, L-glutaminnal, Penicillin-Streptomycinnel (Gibco) és Ciprobay (Bayer) formájában ciprofloxacinnal kiegészített DMEM (Sigma-Aldrich) médiumban történt.

31

A HeLa sejtvonal méhnyaki laphámrák, mely nagy kópiaszámban hordozza a HPV 18 ORF-et. A sejtvonal igen agresszív. Tenyésztése az A431-vonallal megegyező médiumban történt. A-431 és miofibroblaszt kokultúra. A-431 és humán fibroblaszt kokultúra. Patkánymájból izolált miofibroblaszt tenyészetet, és a méhnyakrákból izolált fibroblaszt vonalat kétféle módón tenyészettünk együtt A-431 laphámrák vonallal. 1. Hatlyukú tenyésztőedényben vegyesen tenyészettünk üveglemezre növesztett A431 és myofibroblaszt sejteket. A két sejtvonal jól tenyészett egymás szomszédságában. 2. Membránszűrős betétekkel ellátott hatlyukú tenyésztőedényben (Transwell microplate insert, Corning, Corning, NY, US) egymástól térben szaparálva növesztettük a két sejttípust, amelyek így közvetlenül nem érintkezhettek, így a módszer a médiumba kerülő szolubilis faktorok hatásának vizsgálatára volt alkalmas. HeLa és Myofibroblaszt kokultúrák. HeLa és humán Fibroblaszt kokultúra. Az A-431 sejtvonalnál bemutatott technikákkal megegyezően jártunk el.

Immuncitokémia A sejteket mikroszkópi üveg-fedőlemezre növesztettük, majd megfelelő, 30-50%os

konfluencia

elérésekor

a

tenyésztőmédiumot

eltávolítottuk,

a

lemezeket

szobahőmérsékletű PBS-sel kétszer alaposan leöblítettük, végül a sejteket jéghideg metanollal (-20°C, 10 perc) és jéghideg acetonnal (-20°C, 2 perc) fixáltuk. Felhasználásig a lemezeket mélyhűtőben tároltuk -20°C hőmérsékleten. PBS mosás után fél óráig 5 %-os BSA oldattal blokkoltuk a mintát 37°C hőmérsékleten. Ezután az 1%-os BSA oldatban oldott primer antitesttel 1 órát inkubáltuk 37 °C-on. Gondos mosást követően (3x5 min PBS) a fluoreszcens festékkel jelzett megfelelő specifitású (anti-egér, anti-kecske) másodlagos antitestekkel fél órát sötétben, fénytől védve inkubáltunk. Végezetül a sejtmagfestés következett (20 min

32

propidium-jodid 1:200 hígitásban, vagy DAPI 1:100 a fluoreszcens fedőanyagban oldva). A fluoreszcens fedőanyaggal való fedés után megfelelő mikroszkópos módszerrel értékeltük ki az eredményt. Az általunk alkalmazott elsődleges antitest hígítások immuncitokémiai célokra: Syndecan-1 BB4 egér monoklonális Serotec 1 :50 Syndecan C2 domén poliklonális (Santa Cruz) 1:50 Agrin kecske poliklonális ( Santa Cruz) 1:20

II/3.3. ELISA vizsgálatok keringő syndecan-1 kimutatására A Sewmmelweis Egyetem I. Női Klinikáján gondozott, preoperatív irradiáción még át nem esett méhnyakrákos betegektől származó szérummintákat használtunk föl a keringő syndecan-1 detektálására. A szérummintákat -80°C-on tároltunk a vizsgálatig. Tizenkét ilyen beteg szérumával rendelkeztünk, ezt vetettük össze 11 egészséges önkéntes szérummintájával. Vizsgálatunk során a sCD-138 (syndecan-1) ELISA KIT-et alkalmaztuk (Diaclone Research, 25020 Besançon, France), a gyártó által adott protokoll szerint, minden mintánál duplikátumban.

II/3.4. Fotódokumentáció A fénymikroszkóppal megfigyelhető festési eljárásokkal készült preparátumokról Olympus VANOX-T mikroszkóppal, Olympus DT50 típusú színes digitális kamerával és Viewfinder Lite 1.0 (Pixera Corp.) szoftver segítségével készítettünk felvételeket. Az indirekt FISH preparátumok és az immunfluoreszcens készítmények vizsgálatát és a fotók készítését Nikon Eclipse E600 epifluoreszcens mikroszkóppal, VDS Vosskühler CCD-1300 monokróm kamerával és LUCIA™ FISH szoftverrel (Laboratory Imaging); illetve Olympus BH-2 mikroszkóp, BioRad MRC 1024 konfokális laser scanning apparátussal és hozzá tartozó szoftverrel végeztük

33

II/3.5. Polimeráz láncreakció (PCR) II/3.5.1. DNS izolálás paraffinba ágyazott anyagból Az izoláláshoz általában 3 db 4 µm vastagságú, paraffinba ágyazott

szövettani

anyagból készített metszeteket használtunk . a) Deparaffinálás kétszer váltott xylolban, kétszer váltott etanolban (10-10 percig szobahőmérsékleten), minden lépés után centrifugálás 13000g-vel 10 percig szobahőmérsékleten. Az üledéket 20-30 perces szárítás után TE-ben vettük fel. b) Emésztés 0,5 mg/ml koncentrációjú proteináz K-val (Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, USA) 50oC-on egy éjszakán át. A preparátumokat 13000g-vel 10 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk, majd a felülúszót használtuk föl. c) Enziminaktiválás 94oC-on 5 percig, majd jégen 5 percig. A mintát felhasználásig -20oC-on tároltuk.

II/3.5.2.Konvencionális PCR Az emberi béta-globin gén – mint kontroll – detektálását, továbbá a HPV L1 kapszidfehérjét kódoló génszakaszt kimutató GP és MY primerekkel végzett polimeráz láncreakciót végeztük így. Primer

Orientáció

Szekvencia (5'-3')

Lokalizáció

Amplikon

72-91

267 bp

β-Globin GH20

forward

GAAGAGCCAAGGACAGGTAC

PCO4

reverse

CAACTTCATCCACGTTCACC

310-339

HPV L1 fő kapszidfehérjét kódoló gén kimutatására alkalmazott primerek (GP és MY) szekvenciája:

34

Primer

Orientáció

Szekvencia (5'-3')

Lokalizáció

MY112 forward GCMCAGGGWCATAAYAATGG MY092 reverse CGTCCMARRGGAWACTGATC

Amplikon

6582-6601 452 bp 7014-7033

GP5+1 forward TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC

6624-6646 142 bp

GP6+1 reverse GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC

6741-6765

(A MY primerek degeneráltak , M= A vagy C ; R= A vagy G ; W = A vagy T ; Y= C vagy T).

II/3.5.3. Nested PCR Ez a módszer két egymást követő PCR lépésből áll, melyeknek során az első amplifikálás alatt felszaporított nagyobb DNS fragmentről a második lépésben egy kisebb bennfoglalt szakaszt amplifikálunk (150). A HPV esetében ez azt jelenti, hogy első lépésben felszaporítunk egy olyan általánosabb - DNS szakaszt, amely a vírus több típusában megtalálható. Ehhez ún. konszenzus primerpárt használunk, amelyet a HPV 16-ra, 18-ra és 33-ra terveztek. Ezek a külső primerek. A második lépésben a felszaporított fragmentről amplifikáljuk a belső, specifikus primerpárok segítségével a valamelyik adott HPV típusra (esetünkben a 16-ra, 18-ra vagy 33-ra) egyedien jellemző DNS szakaszt. A templát DNS különböző arányú hígításait használtam (leggyakrabban 1x, 10x és 100x). A) Az első amplifikációs kör. Az első amplifikálás során külső primerekként olyan konszenzus primereket használtunk, melyek egyaránt alkalmasak a három leggyakorobb típusnak, a HPV 16, 18 és 33 vírusok E6 ORF-jének vizsgálatára. Az első körben alkalmazott primerek az O (outer ) nevet kapták (O1 és O2 primerek.) Outer 1

forward

ACCGAAAACGGTTGAACCGAAAACGGT

Outer 2

reverse

AATAATGTCTATATTCACTAATT

35

35-61 319-341

307 bp

Az első amplifikáláshoz használt reakcióelegy, és paraméterek: Az első (általános) PCR reakcióelegyének

A második (típus-specifikus) PCR

összetétele

reakcióelegyének összetétele Térfogat (µl)

Komponensek

Komponensek

Térfogat (µl)

2×REDTaq™ReadyMix™ PCR Reaction Mix (Sigma)

12.5

HPV O1 (10 pmol/µl)

2

2×REDTaq Ready Mix

12.5

belső primerek: pl. HPV 16/1 vagy HPV 16/2 (10

HPV O2 (10 pmol/µl)

2

Víz

pmol/µl)

7.5

Víz

2 7.5

Templát DNS

1

PCR 1. terméke

1

Összesen

25

Összesen

25

Ciklus paraméterek: kezdeti denaturálás

98oC

9’

denaturálás

94oC

1,5’

o

primer hibridizálás

42 C

1,5’

szintézis

60oC

2’

o

5’

végső szálszintézis

60 C

leállítás

25oC

} 40x

B) A második amplifikációs kör A második körben használt primerszekvenciák, a primerek lokalizációja a célgéneken és az amplikonok várt mérete, és a második amplifikációs körben alkalmazott ciklusparaméterek: Ciklus paraméterek denaturálás

94oC

0,5’

o

primer hibridizálás

54 C

0,5’

szintézis

70oC

2’

o

5’

végső szálszintézis leállítás

70 C

}

o

25 C

36

40x

Primer

Orientáció

Lokalizáció3 Amplikon*

Szekvencia (5'-3')

HPV HPV16-spec. HPV18-spec. HPV33-spec.

forward

ATGTTTCAGGACCCACAGGA

104-123

reverse

CCTCACGTCGCAGTAACTGT

208-227

forward

ATGGCGCGCTTTGAGGATCC

106-125

reverse

GCATGCGGTATACTGTCTCT

274-293

forward

GCAGTAAGGTACTGCACCAC

88-107

reverse

CCTCAGATCGTTGCAAAGGT

213-232

124 bp 188 bp 145 bp

1

: konszenzus primerek

*

: : lokalizáció és termékméret a HPV16 genom alapján, ha konszenzus primer

II/3.5.4. Agaróz gélelektroforézis A keletkezett PCR termékek elválasztását 1µg/ml etidium-bromidot tartalmazó agaróz gélen végeztük. A gél koncentrációja az amplifikálás után várt termék méretének megfelelően 2%-os volt (vegyes%). A gélöntéshez, és futtatópufferként is 1x-es TAE-t használtunk. A mintapuffer: 50% (v/v) glicerin (5ml), 10x-es TAE (1ml), telített brómfenolkék (1ml), desztillált víz (3ml). Egy minta futtatásához a mintapuffer 2 µl-e szükséges. A használt molekulasúly marker (1 kilobázisos), és az agaróz az Invitrogentől származott. A gélek láthatóvá tétele és analízise UV fényben Stratagene Eagleeye videodenzitométer segítségével történt.

II/3.5.5. Southern blot A PCR reakciók HPV típus-specifitásának ellenőrzése céljából a termékeket ethidium-bromid tartalmú 2%-os agaróz gélen futtattuk, majd a mintákat nitrocellulóz membránra blottoltuk 0.4M NaOH-ban. A filtert neutralizálás után 2 órán át prehibridizáltuk, majd éjszakán át hibridizáltuk a biotin-jelölt oligonukleotiddal. A reakció láthatóvá tételét az in situ hibridizációnál leírt módon végeztük. A biotinhoz streptavidin-peroxidázt kötöttünk, majd az enzimreakciót DAB-bal tettük láthatóvá.

37

II/3.6. In situ hibridizáció II/3.6.1. In situ hibridizációs technika Az in situ hibridizáció adott nukleinsav-szekvenciák kimutatására használt molekuláris biológiai módszer. Alapja az, hogy az ismert szekvenciájú egyszálú DNS esetünkben a HPV16 E6 ORF-jének egy szakasza - és a hozzá tervezett komplementer, jelzett próba adott körülmények között hibridizálni képesek egymással.

II/3.6.2. ISH saját készítésű, fluoreszceinnel jelölt HPV 16 próbával A formalin-fixált, paraffinba ágyazott metszetek deparaffinálása 2×10 percig xilolban, majd 2×10 percig etanolban történt. Mosás után a feltárást a Qbiogene 15%-os előkezelő oldatával végeztük 45°C-on 15 percig. Ezután 0,2 mg/ml proteináz Kemésztés következett 10 percig, 45°C-on. A metszetekre prehibridizáló oldatot tettünk, és hibridizálás előtt denaturáltuk (95oC-on 6 perc, majd 1 perc jégen). A prehibridizáló oldatot kicseréltük az ugyanilyen összetételű, csak a jelzett próbát is tartalmazó hibridizáló elegyre, melyet előtte szintén denaturáltunk (95 oC 10 perc), majd ezzel egy éjszakán át 37oC-on inkubáltuk a metszeteket. Az endogén alkalikus foszfatáz enzimaktivitást 1 perces, 20%-os ecetsavval történő kezeléssel blokkoltuk. TBS-es mosást követően TBS-ben oldott 3%-os BSA oldatával blokkoltuk az aspecifikus kötőhelyeket 1 órán át 37oC-on. Ezután alkalikus foszfatázzal konjugált, fluoreszcein ellen termeltetett antitest (Amersham, RPN 3311) 1:1000-szeres hígítású (3%-os BSA/TBS-ben) oldatával 1 órát 37oC-on inkubáltunk, majd alapos TBS-ben való mosás után előhívtuk a reakciót. Az előhívó elegy összetétele: 1ml Color Development oldat, 10µl NBT törzsoldat (Nitro blue tetrazolium 30mg/ml), 10µl BCIP törzsoldat (Bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát 15mg/ml), 1.17µl levamisol (1M). A lila (várhatóan magi) színreakció kifejlődését mikroszkóp alatt követtük, majd 1x-es Color Stop oldattal állítottuk le. A háttérfestéshez 20 másodpercre eosin oldatába mártottuk a lemezeket, majd csapvizes mosás után glicerin-zselatinnal fedtünk. A lefedett mintákat fénymikroszkópban vizsgáltuk.

38

II/3.6.3. Indirekt FISH biotinilált gyári próbával A korábban leírt deparaffinálás és feltárás után az endogén peroxidáz-aktivitás blokkolására a lemezeket 0,3%-os H2O2/metanol oldatba merítettük (20 perc, RT). Annak

megakadályozására,

hogy

a

szövetben

található

biotin

álpozitivitást

eredményezzen, a Vector Laboratories biotin blokkoló kitjét alkalmaztuk. Rövid száradás után a DakoCytomation által gyártott HPV 16-specifikus biotinilált próbát (Y1407) a mintákra tettük. Ennek target-szekvenciái a vírus E1, E2, E4, E5, E6 és E7 ORF-jein, valamint az LCR-en találhatóak. A metszeteket légmentesen lefedtük, majd hőtartó hotplate-en együtt denaturáltuk a próba és a target DNS-t 87°C-on 8 percig. Ezt követően a próbát egy éjszakán keresztül hibridizáltattuk 37°C-on. A poszthibridizációs mosást 0,05% SDS/0,2×SSC-ben végeztük 58°C-on 15 percig, majd ugyanilyen összetételű oldatban szobahőmérsékleten 5 percig, végül a lemezeket PBS-ben mostuk 2×5 percig. DAKO StreptABComplex/HRP-t használva jelamplifikációt végeztünk nedves kamrában (30’, RT). További 3×5 perc PBS-es mosás után újabb jelerősítés történt biotinilált tiramin oldatával.(7mM biotinilált tiramin törzsoldat 1:125+0,033% H2O2 PBS-ben, 10’, RT). Mosás után a reakciót StraptavidinAlexaFluor® 488-cal tettük láthatóvá (Molecular Probes), amit 1:150 arányban hígítottunk PBS-ben. A sejtmagokat DAPI-val (Boehringer Mannheim), vagy propídium-jodiddal (Qbiogene) festettük meg. II/3.7. Lézer mikrodisszekció A kiválasztott területeket lézer katapult technikával vágtuk ki a metszetekből DNS izolálás és PCR vizsgálat, majd nukleinsav szekvenálás céljából. A mikrodisszekciót P.A.L.M. lézer mikrodisszekciós rendszer (P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bernried,

Németország)

segítségével

végeztük

a

II.

Belgyógyászati

Klinika

kutatólaboratórimában. A kivágott sejteket Eppendorf csövek kupakjában gyűjtöttük, a DNS izolálást pedig a High Pure PCR template Preparatiopn Kit-tel végeztük,(Roche, Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany), a gyártó utasítása szerint. A mikrodisszekciót pozitív kontrollszövetből (HPV 16 asszociált tumor metszete), és negativ kontroll szövetből (HPV mentes struktúrák, pl. hasnyálmirigy, izomszövet

39

stb.) is elvégeztük. A célterületek kivágásánál pedig nagyfokú óvatossággal jártunk el a kontamináció elkerülése céljából. II/3.8. DNS szekvenálás A PCR termékek tisztítására a Montage PCR Filter Device (Millipore, Billerica, USA) kitet használtuk a gyártó utasításainak megfelelően. A tisztítási lépés után a PCR termékek meglétét agaróz-gélektroforézissel ellenőriztük. A szekvenciák meghatározását a tisztított PCR termékek direkt, mindkét irányból történő szekvenálásával végeztük el, Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems) kitet használva. A PTC 200 (MJ Research, USA) PCR készülékben 25 ciklus hosszan zajlott. A szekvenáláshoz a HPV 16 típusra specifikus primereket használtuk, melyek az E6 ORF célszekvenciára specifikusak (lásd nested PCR második köre). A cycle sequencing termékek tiszítását a DyeEx 2.0 kittel (Qiagen, USA) végeztük el a gyártó utasításai szerint. A tisztított termékeket 20 µl TSR reagensben vettük fel. A szekvenáló reakció ciklusparaméterei : Lépés

Hőmérséklet / Idő

Kezdeti denaturáció

94 °C

2 perc

Denaturáció

94 °C

30 sec

Anelláció

54 °C

15 sec

Extenzió

60 °C

4 perc

}

25 ciklus

A szekvenciák leolvasása kapilláris elektroforézis módszerével történt, az ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) genetikai analizátor segítségével. A nyers adatok értékeléséhez a Sequencing Analysis 3.7 illetve a BioEdit programokat használtuk. Az általunk nyert szekvenciákat a National Center for Biotechnology Information

(NCBI)

GenBank

adatbázisban

hasonlítottuk.

40

található

vírusszekvenciákhoz

III/1.4. Statisztikai elemzés

Ha egyetlen, általunk kiemelt tényező hatását vizsgáltuk, adatainkat Pearson khinégyzet (χ2) tesztnek vetettük alá, ami egy 2x2-es kontingencia táblázatban a sor és oszlopváltozók függetlenségének meghatározására szolgáló elemzés. Mind a szimpla χ2 tesztet, mind a Yates-féle korrekcióval kiegészített khi-négyzet elemzést elvégeztük, továbbá az alacsonyabb esetszámoknál ajánlott a Fisher-féle exakt tesztet is. E három statisztikai analízist a GraphPad PRISM 4 szoftver segítségével végeztük. [GraphPad Software Inc. San Diego, California, USA] Bár figyelmünket gyakran felhívta a lehetséges összefüggésre, önmagában a khinégyzet teszt mégsem tekinthető statisztikai értelemben teljesen meggyőzőnek, mert nem veszi figyelembe a tényezők közti kölcsönhatásokat. Ezért a sejtfelszíni és stromális syndecan-1 klinikai hatásának értékeléséhez jóval precízebb, minden változó hatását és esetleges kölcsönhatásait figyelembe vevő Cox-féle regressziós analíziseket végeztünk el. Az összes vizsgált tényezőre külön-külön is elvégeztük a Cox-féle elemzést, majd az így nyert eredményeket alapul véve, az interakciók figyelembe vételével többváltozós rendszereket alakítottunk ki. Az igen bonyolult modellben, melyben az összes tényező szerepelt, fokozatosan leépítettük az egyes faktorokat, hogy kiderüljön, melyik az, amelyek a valósághoz legjobban illeszkedő görbét adja. Az elemzett időszak kiindulási pontjának a műtét idejét vettük, a metasztázis, vagy recidív tumor feltűntéig hónapokban számoltuk a betegségmentes túlélést. A KaplanMeier görbe által kirajzolt csökkenés mintegy tükörképeként meg lehet rajzolni egy halálozási görbét (proporcionális hazárd). A vizsgált faktor szerint különböző ilyen hazárdgörbék rajzolhatóak föl (pl. stromális syndecan-1 expressziót mutató betegek, és stromális syndecan-1 negatív betegek görbéi.) A két halálozási görbe aránya utal arra, hogy egy vizsgált tényező befolyásolja-e a halálozást. Ugyenez az elemzés természetesen a betegségmentes túlélésre is elvégezhető.

41

III. EREDMÉNYEK

III/1. SYNDECAN-1 ELTÉRÉSEK SZÁJRÁKOKBAN III/1.1. A syndecan-1 expresszió a szájüreg rákmegelőző állapotaiban: Szájüregi Leukoplákiák syndecan-1 reakciójának vizsgálata Az általunk vizsgált 40 szájüregi leukoplákián a syndecan-1 elleni monoklonális ellenanyaggal (B-B4 klón) végeztünk immunhisztokémiai vizsgálatot. A kiértékelt mintákból 18/40 leukoplákia adta a magas szintű (+++) reakciót. A további 22/40 eset csökkent reakciót (++) adó volt. Miközben a Sdc-1 reakció erőssége csökkent, kiszélesedett a reakciót adó sejtek zónája a diszplasztikus-kórosan parakeratotikus hámban. ( 3-6. ábra) . III/1.2. A vizsgált szájüregi laphámrákok sejtfelszíni expressziójának változása Eredmények A szájüregi laphámrákok syndecan-1 expressziós abnormalitásait az ismertetett immunhisztokémiai módszerrel tanulmányoztuk. Hat betegnél a syndecan-1 expresszió az inváziós front sejtjein is magas expressziót mutatott. Az 51 betegből 45-ben volt megfigyelhető a sejtfelszíni syndecan-1 reakció csökkenése, 33 betegben (++) erősségünek értékeltük a reakciót (mérsékelt csökkenés), míg 10 esetben erősen csökkentnek, (+) erősségűnek ítéltük. Két betegnél a sejtfelszíni syndecan-1 nem volt kimutatható (8.-17. ábra). A daganatok töb mint felében (31/51) a sejtfelszíni reakció csökkenése mellett megfigyelhető volt a syndecan-1 reakció megjelenése a ráksejtek citoplazmájában. ( Ábra 10, 13,16, 17 ) A kutatócsoportunk által statisztikai analízissel kimutatott klinikai összefüggéseket, a sejtfelszíni reakció prognosztikai hatásait a stromális reakció hatásával együtt értékeltük, így ott ismertetem.

42

III/1.3. Stromális syndecan-1 expresszió klinikai vonatkozásai orális karcinómákban

Az 51 primer szájrákból 19 esetben mutattuk ki a kötőszöveti reakció megjelenését. Akkor fogadtuk el a reakciót stromálisnak, ha az jól láthatóan a kötőszöveti sejtek citoplazmájára lokalizálódott, és több fészek körül is kimutatható volt. A B-B4 ABCBT reakciót néhány esetben fluoreszcensen is kiviteleztük. (14-17. ábra) Hogy ellenőrizzük az ABC-BT technikával született eredményt, a biotin-független EnVision technikával is elvégeztük a syndecan-1 B-B4 immunhisztokémiát, amely szintén alátámasztotta a kötőszöveti reakció létét (14.ábra). Annak igazolására, hogy a syndecan-1 forrásai maguk a kötőszöveti sejtek, e metszeteken fluoreszcens immunhisztokémiát végeztünk a molekula citoplazmatikus doménjának kimutatására, melyet vimentin mezenchimális markerrel kettős reakcióvá egészítettünk ki. Belső kontrollként olyan daganaton is elvégeztük a kettős immunhisztokémiát, mely nem adott korábban kötőszöveti reakciót a B-B4 reakcióval (17.ábra). Ez megerősítette, hogy a strómában elhelyezkedő, morfológiailag fibroblaszt jellegűnek tűnő, vimentin-pozitív sejtek expresszálják a syndecan-1 molekulát (16. ábra). Mivel a citoplazmatikus domén a shedding során nem vágódik le, a syndecan-1 megjelenése a stromában nem magyarázható a „vedlés” során más sejtekről levágódó ektodomének felgyülemlésével, hanem az maguknak a stróma sejtjeinek a terméke. A kórlefolyással való összefüggést csak az 51 beteg közül kiválasztott, nyelvnyelvgyöki rákban szenvedő, igen homogén 39 fős betegcsoporton vizsgáltuk. A 39 betegből 13 adott a stromális reakciót a syndecan-1 elleni B-B4 antitest-klónnal. A klinikai adatokkal összevetve, azt találtuk, hogy a 13 stromális reakciót mutató betegből a 2 éves követési időszak alatt 8 /13 esetben újult ki a nyelvrák (61,5%), és 7 beteg halt meg (54%). Ezzel szemben az ektópiás reakciót nem mutató betegcsoportban a rekurrencia-arány jóval kisebb volt, 5/26 (19%). Az öt rekurrenciát mutató betegből kettő hunyt el (2/26, tehát: 7,7%) (7. ábra).

43

Tehát a követés során a betegek harmadán (13 fő, 8 stromális pozitív, 5 stromális negatív) jelentkezett távoli metasztázis vagy lokális recidíva az 5-15 hónap között (átlag 10 hónapon belül). Az alkalmazott másodlagos kezelés ellenére sajnos csak 4 ilyen beteg lépte túl a kétéves túlélést (28-41 hónap követés), míg 9 beteg elhunyt. Ezzel szemben a 26-63 hónap követési idő alatt eseményt nem mutató betegek több mint 90%-ban tumor-mentesnek tekinthetők (2.táblázat).

44

2. táblázat. A syndecan-1 és a kórlefolyás összefüggése strómális reakciót nem mutató (A) és mutató (B) szájrákokban.

A)

CS

Grade

St

1

+++

1

II

2

+++

1

IV

3

+++

2

IV

4

+++

3

III

64

64

5

+++

4

IV

63

63

6

++

1

III

47

47

7

++

1

IV

8

++

1

IV

klin

R

R

EFS

OS

26

26

48

48

10

52

13

26

26

26

9

++

2

II

26

26

10

++

2

II

26

26

11

++

2

III

64

64

12

++

2

IV

26

26

13

++

2

IV

42

42

14

++

2

IV

64

64

15

++

2

IV

28

28

16

++

2

IV

75

75

17

++

2

IV

39

39

18

++

2

IV

15

65

19

++

4

IV

72

72

20

++

4

IV

28

28

21

++

4

IV

26

26

22

+

2

IV

23

+

2

III

24

+

3

II

63

63

25

+

4

IV

59

59

26

0

3

II

RD

10

13

B)

CS

Grade

St

klin

EFS

OS

1

+++

2

IV

60

60

2

++

1

III

RD

12

13

3

++

3

III

RMD

5

5

4

++

2

IV

M

12

41

5

++

3

IV

RMD

6

9

6

++

3

IV

RD

9

11

R

RD

9

11

26

26

7

++

3

IV

RD

13

16

8

++

4

IV

RD

6

7

9

+

1

IV

41

41

10

+

2

IV

27

27

11

+

2

IV

26

26

12

+

4

III

41

41

13

0

3

II

9

11

RD

CS: sejtfelszíni syndecan-1 reakció. St. Stádium, Klin: klinikai lefolyás. R: rekurrencia, M: áttét, D: halál. EFS: eseménymentes posztoperatív túlélés. OS: teljes túlélés

45

3. ábra: normál syndecan-1 IHC hámon. ABC BT-DAB. Az alsó rétegek sejtjeit utcakövezetszerűen körülrajzolja. N:100x.

4. ábra: ua. normál syndecan-1 IHC hámon fluoreszcens IHC, piros: sdc-1, kék: magfestés.N:100X.

46

5. ábra: syndecan-1 IHC szájüregi leukoplákiában, a reakció zónája kiszélesedett. (B-B4, ABC, DAB) N:100X.

6.Ábra. Szájüregi leukoplákia. A syndecan-1 kifejeződés a felsőbb rétegek felé tolódott és gyengült. N:200X.

47

a

7. ábra: Kaplan-Meier görbe. A stromális syndecan-1 expressziót mutató betegek több mint fele (7/13) meghalt a műtét utáni 15 hónapon belül,(alul futó görbe) míg az ektópiás reakciót nem mutató betegcsoportból a halálozás jóval kisebb (2/26) volt (felül futó görbe). Ez fölhívta figyelmünket a stromális expresszió klinikai szerepére.

48

a

8 ábra: kifejezett syndecan-1 expresszió (+++) szájüregi laphámrákon.N:100X

9. ábra: a syndecan-1 reakció már nem egyformán rajzol körül minden ráksejtet (++). BB4, DAB.N:100X. 49

a

10. ábra: a syndecan-1 expressziója kifejezett laphámrákon , ABC-BT, DAB, B-B4. N:100X.

csökkenése(+) szájüregi

11. ábra: a syndecan-1 expressziója már eltűnt a ráksejtekről (0). BB4, DAB.N:100X.

50

12.ábra: syndecan-1 reakció szájüregi laphámrákban. Fluoreszcens IHC. Piros:SDC-1, kék:magfestés.N:200X.

13. . ábra: a szájrákban a syndecan-1 expresszió erősen csökkent. (SDC-1 B-B4, ABC, DAB). N:100X.

51

a

14. ábra: a syndecan-1 stromális expressziója szájrákban SDC-1 B-B4 IHC, Envision-DAB, N:400X.

15. ábra: ektópiás syndecan-1 B-B4 reakció, fuoreszcens felvétel. Piros: syndecan-1, kék: magfestés. N100X.

52

a

16. ábra: a syndecan-1 stromális expressziója szájrákban. Kettős immunhisztokémia vimentinnel (zöld) és syndecan-1 intracelluláris domén ellenes antitesttel( piros). A ráksejtek csökkent reakciója mellett megfigyelhető a strómában megjelenő syndecan-1 pozitivitás.N:600X.

17. Ábra: a szájüregi rák sejtjei adják a syndecan-1 reakciót (piros) míg a vimentin-pozitív (zöld ) kötőszöveti sejtek nem.N:600X. 53

III/1.4. Statisztikai elemzés

A követési idő – már említett módon – legkevesebb 26 hónap volt a műtétet követően (26-63 hónap); kivételt csak a páciens időközbeni elhunyta jelentett. Adatainkat Cox-féle regressziós elemzésnek vetettük alá. Ennek során figyelembe vettük a sejtfelszíni és stromális syndecan-1 változásait, a betegekre jellemző grade-et és a betegség stádiumát, és lehetséges kölcsönhatásaikat egyaránt. Eredményünk szerint a betegség stádiuma (stage) nem gyakorolt szignifikáns hatást a klinikai lefolyásra. A grade és a syndecan-expresszió abnormalitásai (mint csökkent sejtfelszíni syndecan-1 szint, vagy stromális aberráns megjelenés) nem korreláltak szignifikáns mértékben egymással. A csökkent sejtfelszíni syndecan-1 szint gyenge mértékben korrelált a betegség kiújulásával (RMD: rekurrencia, metasztázis, tumorspecifkus halálozás), (p=0,097). A stromalis syndecan-1 expresszió viszont jóval erősebben függött össze a kedvezőtlen prognózissal, önmagában is 5,13-szoros proporcionális kockázatot jelentett rekurrens daganat, vagy távoli áttét két éven belüli jelentkezése szempontjából (p=0,03). A stromális expresszió megléte döntőbbnek bizonyult, mint a sejtfelszíni reakció megtartott volta: a megtartott syndecan-1 nem jelentett jobb prognózist, ha a betegben kötőszöveti syndecan-1 expresszió is jelen volt. A grade önmagában nem bizonyult szignifikáns hatásúnak adaganat kiújulására, azonban a magasabb (3-4) grade kombinálódva a stromális syndecan-1 megjelenésével, annak prognózist rontó hatását tovább erősítve, kedvezőtlenebb túlélési kilátások jele (p=0,035). A

sejtfelszíni

syndecan-1

elvesztése

mérsékelt

összefüggést

mutatott

a

tumorspecifikus halálozással (p=0,0659). A grade jóval erősebben fügött össze a daganat okozta halálesetekkel (p=0,044). A stromális syndecan-1 jelenléte a sejtfelszíni syndecantól és a grade-től független, kedvezőtlen prognosztikai markernek bizonyult. A tumorspecifikus halálozással való összefüggése erős (p=0,023). A halálozásra is igaz, ami a daganatos relapszusra: a stromális reakció megjelenése kioltja a megtartott sejtfelszíni expresszió kedvező prognosztikai hatását. A

54

betegcsoportok túlélésében – kellő előzetes standardizálás elvégzése után – a stromális expressziós

mintázat

megjelenése

36,7–szer

nagyobb

halálozási

kockázatot

(proporcionális hazárdgörbe aránya) jelent a műtétet követő két éven belül, mint ha nem jelenik meg az aberráns kifejeződés. ( 3. táblázat) Bár a vizsgált beteganyag kevésnek tűnhet, a megállapított összefüggés elég biztosnak látszik. Annak az esélye, hogy a modell keretein belül a statisztikai véletlen adjon ugyanilyen eloszlást: definíciójából következően maga a p érték, azaz 2,3%. Tehát eddigi vizsgálataink alapján 97,7% eséllyel mondhatjuk ki, hogy a stromális syndecan-1 expresszió szájüregi laphámrákokban a prognózist jelentősen rontja. A stromális reakció megléte magasabb grade értékekkel kombinálva a daganatos relapszus és a tumorspecifikus halálozás magasabb kockázatát vetíti előre. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a stromális syndecan-1 expresszió megjelenése szignifikáns, független prognosztikai faktor, amely kedvezőtlen klinikai lefolyásra utal.

55

III/2. A syndecan-1 változásai a méhnyak rosszindulatú daganataiban

III/2.1. A sejtfelszíni reakció csökkenése in situ karcinómákon és méhnyakrákokban A sejtfelszíni reakciót harmincöt méhnyaki in situ karcinómán vizsgáltuk. A syndecan-1 B-B4 reakciót ABC-BT erősítéssel végeztük. Az in situ karcinómák közül 27/35 mutatta a syndecan-1 sejtfelszíni immunreakció csökkenését (++), míg 8 esetben a reakciót erősnek ítéltük. A syndecan-1 festődés zónája kiszélesedett a normál méhnyaki hámhoz képest. A

vizsgált

55

invazív

méhnyaki

laphámrák

közül

syndecan-1

B-B4

immunhisztokémiával 13/55 daganat adott közepes (++) reakciót. Gyenge (+) erősségűnek értékeltük 20/56 daganat immunreakcióját. A syndecan-1 sejtfelszíni reakció hiányzott 22/55 laphámrákban. Az általunk vizsgált invazív méhnyakrákok mindegyikének csökkent volt a syndecan-1 sejtfelszíni reakciója, egyik sem kapott magas (+++) értéket ( 18-26.ábra) (3. táblázat).

III/2.2 A syndecan-1 megjelenése méhnyakrákok kötőszöveti állományában

Immunhisztokémiai vizsgálatsorozataink során a vizsgált méhnyakrákok jelentős részében (26/55) ki tudtuk mutatni, hogy a kóros kötőszöveti syndecan-1 termelés megjelenik a strómasejtekben. (Ábra 22-26.) Annak bizonyítására, hogy valóban maguk a strómális sejtek adják a syndecan-1 expressziót, és hogy a teljes syndecan-1 molekula az ő termékük, Sdc-1 C-terminus elleni antitesttel és vimentinnel kettős immunhisztokémiát végeztünk, a szájüregi daganatoknál már ismertetett módon. Sikerült igazolni, hogy a teljes syndecan molekula megjelenik ezekben az elnyúlt, fibroblaszt morfológiájú, vimentin-pozitív sejtekben (24.ábra ). A vizsgált öt adenokarcinómából háromban szintén kimutatható volt a stromális reakció. Érdemes megemlíteni, hogy nem csak laphámrákok daganatos strómáiban észleltük a syndecan-1 kötőszöveti kifejeződését. Tizenöt olyan nyirokcsomókban, ahol

56

kimutatható

volt

mikrometasztázisnál

nagyobb

méretű

áttét,

szintén

immunohisztokémiai vizsgálatot végeztünk a syndecan-1 B-B4 ellenanyaggal (a kisebb méretű nyirokcsomóáttéteknél ez nemigen lett volna értékelhető vizsgálat.) Természetesen figyelembe vettük a lymphoid elemek pozitív immunhisztokémiai reakcióját, és megkülönböztettük az áttéti daganattól, és annak strómájától. Megfigyeltük, hogy a ráksejtek syndecan-1 termelést serkentő képességüket megőrzik az áttétképzés során is, mert a nyirokcsomókban kimutatható volt a stromális syndecan1 expresszió megjelenése, ha a primer tumor is mutatta a jelenséget.

Statisztikai értékelés A klinikai utánkövetés során nyert adatok statisztikai értékelése jóval bonyolultabb volt, mint a nyelvrákos eseteké, mivel a vizsgált beteganyag heterogénebb volt (3. táblázat). A betegek közül 13/56 hunyt el, a posztoperatív követési idő 16-60 hónap között volt, átlag 3,5 év. Kezelésükben sem voltak olyan homogének, eltértek a posztoperatív ellátás formái (kemoterápia, kemoirradiáció). Ezért igyekeztünk Cox-analízis során a matematikai modellbe, annak instabillá válása nélkül, körültekintően a legtöbb szempontot beépíteni, hogy a sejtfelszíni és a stromális syndecan-1 expresszió megközelítőleg valós klinikai relevanciáját kapjuk. Figyelembe vettük a strómális és a sejtfelszíni syndecannal kapcsolatban a gradeet, a stage-et, a betegek életkorát, az eltérő posztoperatív ellátást, a követési időt, a tumorspecifikus haláleset idejét, beépítettük a modellbe a mikroszkóposan kimutatott nyirokcsomómetasztázisok létét, sőt még azt is, hogy többféle papillómavírus volt jelen a betegben, vagy nem. Méhnyaki rákok esetén nem csak egy a szempontokat fokozatosan leépítő, hanem egy fordított (beépítéssel dolgozó) modellt is kialakítottunk. Az előbb említettek közül mindig egy szempontot újként beépítve vizsgáltuk, javul-e a kirajzolódó görbe illeszkedése a valósághoz. Ismert jelenség, hogy a kétféle megközelítés – a redukciós, és az additív változószelekciós számítás – időnként eltérhet egymástól, még akkor is, ha ezt a tényt az alkalmazott statisztika általában elhanyagolhatónak tekinti. Az eltérés matematikai magyarázata jelenleg még nem ismert.

57

Ez a ritka matematikai jelenség fellépett saját kísérletes eredményeink értékelése során is. A változószelekciós modell szerint a stromális syndecan 3,8-szorosra növelte a tumorspecifikus halálozást, és ez szignifikáns volt. (p=0,04). Ezzel ellentétes eredményt adott a változóbeépítéses modell: e szerint a stromális reakció nem volt szignifikáns faktor (p=0,07), bár mintegy háromszorosra növelte a tumorspecifikus proporcionális kockázatot. Statisztikai és klinikai megfontolásokból az óvatosabb modellt fogadtuk el valósághűbbnek, tehát eddigi kutatásaink szerint a stromális syndecan-1 expressziót feltehetően nem tekinthetjük szignifikáns értékű önálló kockázati tényezőnek méhnyaki laphámrákokban. A sejtfelszíni syndecan-1 csökkenés eddigi vizsgálatunkban összefüggést mutatott a tumorspecifikus halálozással, és egy kereszt csökkenés 7-szeresére növeli a proporcionális kockázatot, viszont nem függött össze szignifikánsan a grade-del.

58

3. táblázat méhnyakrákok syndecan-1 expressziója. Női minta

CS

S

grade

kor

St.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0

1 1 1 2 2 1 1 2 1 2 2 2 2 3 2 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 2 2 1 1 1 2 1 2 1 2 2 2 1 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 3 3 3 3

31 54 39 37 52 42 34 39 38 45 48 36 52 42 63 45 55 30 63 74 52 38 77 29 47 41 38 37 38 47 52 63 34 57 51 41 32 48 72 43 38 56 52 45 48 55 26 37 41 52 40 65 39 55 68

I/B II/A II/A II/A I/B I/B I/B II/B II/B III/B II/A I/B I/B II/B II/B II/A I/B II/B II/B II/B II/A II/B II/B I/A II/B II/B II/B I/B II/B II/B II/B II/B II/B I/B II/B III/B I/A2 II/A II/B III/B I/B I/B II/B I/B II/B II/B II/B II/A II/A II/A II/A I/B I/B I/B II/A

MET multi 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0

m m m m m m m m m m m m m m m m -

RDM

exit

Hó

él D él él él él él él él él él él él RD él él él él RD él MD él él él él él él él él él él él él él él él D D él él él D RD RD D él él él D D D él él él él

él 2003.04.03. él él él él él él él él él él él 2004.11. él él él él 2002.02.18. él 2003.07.12. él él él él él él él él él él él él él él él 2000.06.29. 2001.09.30. él él él 2003.10.06. 2002.05.31. 2002.08.10. 2001.11.17. él él él 2003.06.24. 2002.08.22. 2002.08.01. él él él él

52 29 51 48 44 44 32 32 32 c29 32 32 32 30 36 51 30 16 22 44 23 30 44 38 38 37 36 34 34 c33 34 48 37 60 60 58 3 13 55 36 52 36 17 20 19 44 44 c30 21 8 7 33 c29 32 30

CS: sejtfelszíni sdc-1, S: stromális sdc-1, kor: életkor, St:stage, MET: nyirokcsomómetasztázisok, multi. többféle HR-HPV jelenléte, exit: halálozás időpontja, Hó: követés halálig/vizsgálat lezártáig

59

18. ábra: Méhnyakrák , syndecan-1 BB4 rekció, DAB.A reakció mérsékelt csökkenést mutat az ép hámhoz képest. N:400X.

19. ábra: Cervix karcinóma syndecan-1 IHC. sejtmagok. N.600X.

60

Zöld: SDC-1, piros:

20. ábra: Syndecan-1 immunhisztokémia méhnyakrákon. ABC-BTDAB.N: 400X.

21. ábra : Fluoreszcens syndecan-1 IHC méhnyakrákon. Zöld: syndecan-1, piros: propidium-jodidos magfestés.N:100X. 61

22. ábra: tumor-indukált stromális syndecan-1 reakció méhnyaki laphámrákban. Ezt a jelenséget az irodalomban még nem írták le. (ABC, BT, DAB). N:100.

62

a

23.ábra : Méhnyakrák. kötőszöveti syndecan-1 expresszió BB4 reakció , ABC, DAB,

24. ábra: vimentin (zöld) és syndecan-1 intracelluláris domén (piros) IHC. A syndecan-1 a mezenchimális sejtek terméke a strómában. 63

25. ábra: méhnyakrák nyirokcsomóba adott áttétében is megjelenik a kötőszöveti reakció, B-B4 epitóp, ABC-DAB.

26. ábra nyirokcsomóáttét .: B-B4 fluoreszcensen, zöld: syndecan-1, piros: propidium-jodidos magfestés. Nem csak a rák, de a stróma is syndecan reakciót mutat. 64

4. táblázat: keringő syndecan-1 (CD-138) szintje méhnyakrákos betegekben (A) és egészséges önkéntesekben. (B). Az átlag koncentráció egészségesekben 37-123 ng/ml. A) Szérum 1 2 4 5 6 7 8 12 15 16 18 19

1 0,152 0,092 0,058 0,428 0,097 0,139 0,093 0,142 0,107 0,056 0,075 2,553

2 0,196 0,077 0,068 0,388 0,110 0,138 0,091 0,201 0,102 0,047 0,072 2,607

átlag 0,174 0,0845 0,0630 0,4080 0,1035 0,1385 0,0920 0,1715 0,1045 0,0515 0,0735 2,5800

kalibrált Fehérje(ng/ml) 0,1255 34,68 0,0360 22,58 0,0145 19,68 0,3595 66,30 0,0550 25,15 0,0900 29,88 0,0435 23,59 0,1230 34,34 0,0560 25,28 0,0030 18,12 0,0250 21,09 2,5315 359,81

CD138-Elisa standa rd

y = 0,0074x - 0,1311 R2 = 0,97

2

Abs.

1,5 1 0,5 0 0,00 - 0,5

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

s CD138 (ng/ml)

B) Minta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 0,200 0,259 0,767 0,289 1,831 0,268 0,438 0,273 0,938 0,270 0,469

2 0,230 0,206 0,694 0,697 1,576 0,393 0,494 0,328 1,093 0,264 0,536

átlag 0,215 0,2325 0,7305 0,4903 1,7035 0,3305 0,4660 0,3005 1,0155 0,2670 0,5025

kalibrált Fehérje(ng/ml) 0,1650 31,4024 0,1825 33,5366 0,6805 94,2683 0,4430 65,3049 1,6535 212,9268 0,2805 45,4878 0,4160 62,0122 0,2505 41,8293 0,9655 129,0244 0,2170 37,7439 0,4525 66,4634

1: első mérés abszorbanciája. 2-második mérés. Fehérje: keringő syndecan-1 koncentráció ng/ml-ben.

65

III/2.3. Syndecan-1 ELISA vizsgálatok méhnyakrákos betegek szérumából A

vonatkozó

szakirodalom

szerint

a

keringő

syndecan-1

mennyisége

megnövekszik rosszindulatú daganatokban. Méhnyakrákos betegeinknél ezt a szempontot is bevontuk vizsgálatainkba. Sajnos retrospektív vizsgálatban csak 12 olyan betegtől levett szérummal rendelkeztünk, aki még nem esett át a preopreratív irradiációs kezelésen a mintavételkor. Ezt vetettük össze 11 egészséges önkéntes (orvostanhallgató TDK-sok) szérummintájával. Az egészséges önkéntesek közül egynél enyhén emelkedett syndecan-1 szintet dektektáltunk. A méhnyakrákos betegek közül szintén csak

egynél

észleltünk

határérték

feletti

eredményt

a

keringő

syndecan-1

szérumszintjében. A többi beteg esetén a syndecan-1 értéke nem volt magasabb az ELISA-kit gyártója által normálisnak tekintett értéknél, illetve az általunk vizsgált, egészséges önkéntesekből álló csoport eredményénél. (4.táblázat) Természetesen a vizsgált minták elégtelen száma miatt a továbbiakban prospektív vizsgálatban kell Wertheim-műtétes beteganyagunkat ez irányban bővíteni. Nem mondhatjuk ki azt, hogy a szérum syndecan-1 szint emelkedése nem jellemző a méhnyakrákok többségére (bár ez a lehetőség tényleg nem valószínű). Azt azonban állíthatjuk: vizsgálatunk alapján kizártnak tűnik, hogy a syndecan-1 szint emelkedése a méhnyakrákok általános jellemzője lenne. III/2.4 .Kísérleti szövettenyésztési modellrendszer Maeda és muntatársai kísérlete alapján, mely duktális karcinómasejtekkel történt, megpróbáltunk kialakítani egy laphámrák alapú kokultúrás kísérleti rendszert a daganatindukált stromális syndecan-1 képzés modelljeként. Ilyen modell még nem szerepelt a szakirodalomban. Két laphámrák eredetű sejtvonalat vontunk be e kísérletünkbe, a viszonylag magasan differenciált vulva eredetű A-431 jelzésű rákot, s az agresszív, jóval anaplasztikusabb HeLa sejtvonalat. A tumoros stróma modellezésére két mezenchimális sejtvonal szolgált: patkánymájból izolált miofibroblaszt tenyészet, és méhnyakrákból izolált humán fibroblasztok.

66

A vegyes lemezeken tenyésztett miofibroblasztokon nem láttunk igazán Sdc-1 reakció növekedést a kontrollként használt miofibroblaszt vagy fibroblaszt kultúrához képest. Az A-431 sejteket direkt FITC jelölt citokeratin immunrekcióal különítettük el, a miofibroblasztok markereként vimentint használtunk. Ugyancsak minimális expressziófokozódás volt a filteres kokultúra használatában is. (Ábra 27.) Mivel nem minden tumor serkenti jelentősen a kötőszöveti sejtek syndecan-1 termelését, számunkra szerencsétlen módon az általunk vizsgált két karcinómavonalra sem jellemző e tulajdonság. Párhuzamosan egy másik proteoglikánt, az agrint is bevontuk e vizsgálatunkba. Érdekes módon, az agrin esetén rendkívül erős különbség mutatkozott a mezenchimális sejtekben: egyértelműen fokozódott a máj eredetű miofibroblasztok agrintermelése a tumorsejtek hatására Ez a jelenség esetleg utalhat az agrin szerepére, a metasztatikus folyamat során. Mivel az agrinnal molekuláris rokonságban levő perlecan esetén ismert, hogy szerepet játszik az angiogenezisben, ez új kutatások kiindulópontja lehet (28-29. ábra). (151, 152, 153) Tervezzük, hogy a továbbiakban a kísérletet kiegészítjük az mRNS mennyiségének vizsgálatával. Inkább az agrin esetében tűnik valószínűnek, hogy a további kiegészítő vizsgálatok különbséget adnak majd a kontroll fibroblaszt-tenyészet és a laphámrákkal együtt filteres kokultúrában tenyésztett mezenchimális sejtek között.

67

A

B 27. ábra: A: Kontroll humán fibroblaszt-tenyészet, vimentin: zöld, syndecan-1: piros (nem látszik) B: kokultúrában A431 laphámrákkal együtt tenyésztett, attól filterrel elválasztott humán fibroblasztok, vimentin: zöld, syndecan-1: piros. Gyenge SDC-1 expresszió.N: 1000X.

68

A

B 28 ábra: Az agrin expressziója kontroll miofibroblaszt kultúrán (A). Piros: Agrin, és A431 laphámrák-vonallal vegyesen tenyésztett (B) miofibroblasztokon. Az agrin produkciója tumor-indukáltan megnő. Zöld: Citokeratin a tumorsejtekben.N:100X. 69

A

B 29. ábra: Az agrin termelődése kontroll miofibroblasztokon (A), összevetve a filteres kokultúrában HeLa sejtekkel együtt tenyésztettekkel (B).N:100.

70

III/3. HPV-HEZ KAPCSOLÓDÓ EREDMÉNYEK III/3.1. A HPV genom és fehérjék jelenléte szájüregi laphámrákokban Miután egy adott betegből két eltérő időpontban vett mintával rendelkeztünk – a próbaexcíziós mintával, és az effektív műtétnél eltávolított preparátummal –, a primer szájrákos betegek mindkét mintáját megvizsgáltuk PCR technikával. Az így kapott HPV 16, 18, és 33 PCR eredményeket még összevetettük a HPV 16 /18 E6 fehérje elleni immunohisztokémiai vizsgálat során nyert adatokkal. A HPV 16 minden pozitív mintában kimutatható vírus volt, három esetben találtunk mellette HPV 18-at, egy daganatban HPV 18 és 33-at is, de olyan tumor, amelyikben csak 18/33 prezentálódott, nem volt. (Az általunk alkalmazott immunhisztokémia pedig nem tudja megkülönböztetni a HPV 16 –ot a HPV 18-tól.) Gyakorlati megközelítésben a „HRHPV” a HPV 16-ot jelentette betegeinkben. Egy adott beteg ugyanazon tumorából származó két mintán (próbaexcizió, majd a kemoterápia után eltávolított teljes műtéti preparátum) elvégzett PCR nyolc esetben is eltérést mutatott párjához képest, vagy az első, próbaexciziós minta (5 eset), vagy a második, a műtéti preparátum (3 eset) bizonyult pozitívnak. A kérdéses esetekben kétszer-háromszor is elvégeztük a polimeráz láncreakciót, de a különbség nem tűnt el. Tisztázandó a vírus esetleges oki szerepét a fej-nyaki daganatokban, a PCR mellett E6 immunohisztokémiát is végeztük az összes pozitívnak bizonyult mintán. A PCR és az immunhisztokémiai eredmények között is különbség állt fönn: több minta bizonyult PCR pozitívnak, mint amelyikben ki lehetett mutatni az E6 fehérjét (30-33, 35. ábra). Az immunohisztokémiai reakció a PCR eredmény alapján pozitívnak bizonyult a vírushordozónak vélt daganatok többségénél (20/31), és két esetben az indirekt FISH is pozitív eredményt hozott (34. ábra). A PCR pozitív minták azonban 8 esetben teljesen immunonegatívak voltak, három esetben pedig a környező ép mukóza mutatta a reakciót, a tumor maga nem (30., 32. ábra). Húsz daganat teljesen negatív volt mindkét vizsgálattal.

71

30. ábra: HPV E6 vírusfehérje kimutatható a diszplasztikus hámban. Piros: E6 fehérje, kék: magfestés. N:100X.

31. ábra: HPV E6 IHC szájrák sejteken. Zöld: E6 IHC, kék: magfestés N:200X.2 72

32. ábra: HPV 16 E6 immunhisztokémia orális mukózán, fluoreszcens. Zöld: E6 fehérje, kék: magfestés. N:200X.

33. ábra: HPV E6 fehérje gingivakarcinómában, fluoreszcens. Zöld: E6 fehérje, kék: magfestés. N:20X.

73

34. ábra: Indirekt HPV 16 E6 ORF DNS in situ hibridizáció szájrákon,(formalin-fixált anyag), a pozitív reakció zöld.

35. ábra: HPV 16 E6 IHC orális karcinóma sejtjeiben. ABC, DAB. N:200X. 74

III/3.2. A syndecan-1 expresszió és a HPV jelenlétének viszonya Mivel nem sikerült teljes bizonyossággal körülírni, hogy az általunk vizsgált szájrákok közül melyek tekinthetők HPV 16/18 pozitívnak és melyek negatívnak, ezért egy kritériumrendszert vezettünk be. A mind PCR, mind immunhisztokémia által vírushordozónak mutatott csoportot állítottuk szembe egy, a polimeráz láncreakcióval következetesen negatívnak mutatott csoporttal, és e két szétválasztott csoport syndecan1 expressziós mintázatát vetettük össze. Klinikai lefolyásban nem találtunk különbséget: HPV E6 ORF PCR negatív szájrákos csoportban 20-ból 6 betegnél újult ki a daganat, és öt halt meg. (5/20 beteg). A PCR+/IHC+ betegek közül 6/20 mutatott visszaesést , 4/20 nyelvrákos halt meg. A syndecan-1 immunhisztokémiai eredmények alapján különbség mutatkozott a HPV PCR/IHC kettős + tumorok és a többi között. Az összes szájráknál a PCR/IHC + betegek közül 4/20 tartozott a legmagasabb (+++) reakciójúcsoportba, 12 beteg a közepes (++) csoportba, négy pedig a gyenge reakciót adó (+) csoportba, míg olyan beteg, akinél eltűnt volna a sejtfelszíni syndecan-1 reakció, e betegcsoportban nem volt. Átlag 2,00 kereszt jön ki a populáció egy adott tagjára. Összevontuk magasabb (+++ - ++) és alacsonyabb mértékű ( + - 0) expressziós csoportokat, és így osztottuk ketté a betegeket. A HPV / IHC + betegeknél 16/20 tartozott az összevont magasabb expressziójú csoportba (80%) míg 4 az összevont gyengébb kifejeződésűbe ( 20%). A stromális reakciók száma 8/21 volt. Szintén 20 beteg maradt a HPV PCR negatív csoportban. (Bár valószínűleg a „HPV-bizonytalan” betegek tumorai nem állnak oki összefüggésben a vírussal, tehát valójában negatívak). A HPV E6 ORF negatív szájrákok syndecan-1 reakciói közül 2/20 volt erős (+++), és 6/20 volt közepes (++) erősségű, 9/20 beteg tumora volt gyenge reakciót mutató (+), három beteg esetén a reakció teljesen eltűnt (0). Átlagosan 1,3 kereszt jött ki egy betegre. A csoportok összevonása után a magasabb expreszziójú betegek(+++-++) aránya 8/20 volt (40%), míg az alacsonyabbak (+-0) aránya 12/20 (60%). A stromális reakciók száma 6/20 volt. Ha az összes „HPV-bizonytalan” esetet is ide soroltuk, akkor a megoszlás a következő: 2/28 (+++), 15/28 (++), 11/ 28 (+), és 3/28 (0 reakció), átlagosan 1,56 kereszt/fő.

75

A magas expressziójú daganatok aránya 17/31 volt, az alacsonyaké 14/31. A stromális reakciók száma 8/28 volt a „HPV negatív és -bizonytalan” csoportban. A khi-négyzet próba szerint a vírust hordozó, HPV PCR/IHC + csoport syndecan-1 expressziója szignifikánsan magasabb, mint a negatívoké (p=0,0098). Az összefüggés markánsan kirajzolódott az alacsonyabb esetszámoknál ajánlott Fisher-féle exaktteszttel is (p=0,0225). Ha a HPV PCR/IHC kettős + csoportot vetettük össze az összes többi esettel (HPV-negatív és bizonytalan), a vírust hordozó csoport syndecan-1 expressziója khi-négyzet teszttel közel szignifikáns mértékben volt magasabb (p=0,0664), és az óvatosabb Fisher-féle exakt teszttel is 91,9 % -nál nagyobb valószínűségű tendencia rajzolódik ki (p=0,08). Összefoglalva: A sejtfelszíni syndecan-1 szint csökkenése valóban kifejezettebb volt a HPV-negatív tumoroknál. Ez a különbség az egyváltozós statisztikai módszerekkel relevánsnak mutatkozott. Várakozásainkkal ellentétben viszont a stromális syndecan-1 reakció nem bizonyult gyakoribbnak a HPV negatív daganatoknál. III/3.3. HPV-re utaló jelek nem epiteliális szövetekben Füle Tibor munkatársammal közös kutatásaink során az in situ módszerek alkalmazásakor (immunhisztokémia, in situ hibridizáció) néhány beteg esetében nemhámeredetű szövetben is találtunk pozitív jeleket mutató sejteket. Ilyenek voltak nem csak bizonyos mononukleáris sejtek, hanem az erek falának endotélsejtjei, és az idegrostok Schwann-sejtjei. Ezek a szokatlan lokalizációjú immunreakciók és hibridizációs szignálok mind HPV asszociált méhnyakrák mintákban, mind pedig HPV asszociált fej-nyaki laphámrák metszetekben megfigyelhetők voltak. Kezdetben műterméknek tekintettük a jelenséget, mert nem egyezett meg a vonatkozó szakirodalommal. Azonban a koherensen megjelenő kép már elgondolkoztató volt számunkra, hiszen két teljesen különböző módszerrel is ugyanazt láttuk (36.-40 ábra).

76

Immunhisztokémiai vizsgálatok Ötven HPV 16-asszociált laphámkarcinómát – 15 előrehaladottabb stádiumú méhnyakrákot és 35 fej-nyak daganatot – vizsgáltunk immunhisztokémiával. Nyolc mintában találtunk a tumorsejtek pozitív festődése mellett HPV E6 fehérjére utaló reakciót a tumor melletti perifériás idegrostokban, ezek közül 6 mintában a tumorkörnyéki erek endotéliuma is erős pozitivitást mutatott. Az erekben a reakció az endotélsejtekben

volt

látható,

a

szignálok

pontos

lokalizációját

konfokális

lézermikroszkóppal vizualizáltuk. Az endotélsejtek citoplazmájára lokalizálódott a HPV 16,18 E6 fehérje elleni immunreakció. (37.ábra) Ez egyes idegrostokban kifejezettebb volt,

s

ez

az

erős

festődés

független

volt

a

használt

technikától,

enzimatikus/fluoreszcens vizualizációs módszertől. A pozitivitás ezekben a szöveti struktúrákban avidin/biotin-független immuntechnika alkalmazásával (EnVision) is detektálható volt. (38.ábra) Egy adott metszetben nem minden egyes idegrost volt pozitív, továbbá voltak olyan idegátmetszetek is, melyek nem festődtek, olykor közvetlenül egy pozitív reakciót mutató idegrost mellett (36.ábra). Felmerült, hogy az immunreakciók e különös szöveti elhelyezkedése valamilyen módon tumoros beszűrődéshez kötődne, még ha ez a látott mikroszkópos morfológia alapján nemigen tűnt is valószínűnek. A daganatos invázió kizárására citokeratin immunreakciót végeztünk, mely azonosítja a laphámrák-sejteket. Míg a környező daganat erős citokeratin reakciót mutatott, addig a vizsgált idegrostok mindegyike negatívnak bizonyult. Tehát ezt a feltevést el kellett vetnünk. Hogy megállapítsuk az idegi elemeken belüli pontos elhelyezkedést, kettős immunreakcióval vizsgáltuk a metszeteket. Az anti-S100 immunreakcióval – melyet piros színnel hívtunk elő – főleg a Schwann-sejtek festődnek, a HPV 16 E6 fehérje elleni reakció – amely zöld színű – pedig egy adott metszetben nem minden idegrostban volt pozitív. Ez arra utal, hogy a jelenség oka feltehetően mégsem valamely, az idegrostokban jelenlévő epitóp és az E6 vírusfehérje hasonlósága miatt fennálló keresztreakció. Az adott mintákon HPV 16 E7 fehérje elleni immunhisztokémiai reakciót is végeztünk.

77

36. ábra. HPV 16 E6 (zöld) és S 100 Schwann-sejt marker (piros) perifériás idegben. Kék: magfestés.N: 400X.

37. ábra: E6 vírusfehérje endotélsejtben. Fázis-kontraszt kép igazolja, hogy érfalról van szó (nyíl), lumenben vörösvérsejtek.N:1000X.

78

38. ábra: HPV E6 IHC. Pozitivitás a perifériás idegben (A), Negatív kontroll (B). (DAB). N: 200X.

39. ábra: HPV 16 nukleinsav in situ hibridizáció saját készítésű próbával. Lila színreakció a perifériás idegben jelzi a virális nukleinsavat. N:200X.

79

40. ábra: HPV E7 immunhisztokémia szájüregi laphámrák mintákban és a peri-tumorális területeken. A: Diszpláziás hám a (B) ábrán látható HPV 16 PCR/ E6IHC pozitív tumor mellett. Az immunfestés magi elhelyezkedésű (nyílhegyek). B: HPV 16-asszociált laphámrák. A tumorsejtekben a festődés a sejtmagban, a magmembrán mellett gyűrűszerűen (nyílhegy), és a citoplazmában (nyíl) egyaránt látható. C: A HPV-mentes laphámrákban – biológiai negatív kontroll – immunfestődés nem látható. D: Perifériás ideg a (B) ábrán látható tumor környezetében. Néhány Schwann-sejt magja E7immunpozitív (nyílhegyek), míg mások negatívak (nyilak). Az E6 immunfestéssel ellentétben az E7 reakció a sejtmagokra korlátozódik. E: A (B) ábrán látható tumor környezetében E7-pozitív ideg (fekete nyílhegy), E7-negatív ideg (fehér nyílhegy) és vérerek E7-pozitív endotélsejtekkel (nyíl) egyaránt megfigyelhető volt. F: A (C) ábrán látható HPV-mentes tumor melletti idegekben (nyíl), és vérerek endotéliumában (nyílhegyek) immunreakció nem látható. (N=100x (A), 200x (E), 400x (B, C, D, F)).

80

Hasonlóan az E6 elleni reakciókhoz, az E7 esetében is 3 szájüregi laphámrák, és 1 méhnyakrák minta esetében a daganatsejtek mellett a tumor környékén lévő erek endotéliuma, és a perifériás idegek pozitívan festődtek. Azonban a festődés az érintett perifériás idegekben túlnyomórészt a Schwann-sejtek magjában volt megfigyelhető (36. ábra). (Természetesen nem zárható ki hasonló a neuronok esetében sem, azonban a neuronok magjai nem a periférián, hanem a megfelelő ganglionban helyezkednek el.) Ugyanezeken a metszeteken a HPV fő kapszidfehérjéje (L1) elleni antitesttel is végeztünk immunhisztokémiai vizsgálatot, de reakciót nem észleltünk. Mint említést nyert, a korai és késői fehérjék génjei nem íródnak át szimultán, ezért ez megegyezett várakozásainkkal. Vizsgálatok in situ hibridizációval Indirekt in situ hibridizációval vizsgálva az említett mintákat, hasonló eredményeket kaptunk. A HPV nukleinsav szekvenciák kimutatását célzó saját készítésű fluoreszcein jelzett próbák, valamint a gyári biotinilált DNS-próbák a fenti metszeteken végzett vizsgálatok során pozitív reakciót adtak endotélsejtekben és az idegátmetszetekben (33. -34. ábra). Látható, hogy a pozitivitás döntően citoplazmatikus, ez valószínűleg mRNS jelenlétére utal a Schwann-sejtekben (lásd technikai leírás); emellett azonban néhány Schwann-sejt magja is pozitívnak bizonyult. Bár egyes esetekben a szignálok sokkal kevesebb sejtben voltak megfigyelhetők a vizsgált struktúrákban, a reakciók intenzitása összemérhető volt a tumorsejtekben látottakkal.

A HPV DNS jelenlétének bizonyítása: Lézer mikrodisszekció, PCR, szekvenálás Hogy bizonyítsuk a HPV 16 E6 ORF jelenlétét, lézer mikrodisszekcióval kivágtuk a HPV 16 E6 immunreakcióra pozitív ereket és idegrostokat mintegy 2-5 mm-es távolságban a tumorfészkektől. (41. ábra). Kontrollként a tumor melletti izomszövetből

81

(biológiai negatív kontroll), a daganat területéről, és a rák melletti hámból (pozitív biológiai kontroll) is vettünk ki sejteket. A DNS izolálást követően ezeket a mintákat PCR-rel vizsgáltuk. A HPV 16 E6 ORF PCR vizsgálat során mind az idegrostok, mind pedig a kivágott érstruktúrák pozitív eredményt hoztak (41. ábra). A kapott PCR termékeket megszekvenáltuk, a szekvencia-analízis szerint az amplikon teljesen megegyezik a HPV 16 E6 fehérjét kódoló szekvencia megfelelő fragmentjével (GenBank accession no. AF404702). A vírusgenom fő kapszidfehérjéjét kódoló regió PCR vizsgálata a fenti mintákban szintén pozitív eredményt hozott, ami a papillomavírus teljes genomjának jelenlétét valószínűsíti a vizsgált sejtekben. (41.ábra)

82

. C

41 ábra: Lézer mikrodisszekcióval eltávolított ideg. (A: előtte, B: utána) C: HPV 16 E6 ORF kimutatása nested PCR-rel a lézer mikrodisszekcióval kivágott szövetekben. (1-3: izomsejtek a tumor környezetében, 4-6: érendotélium, 7-9: immunpozitív idegrostok, 10-12: negatív idegrostok 13-14: tumorsejtek, 15-16: tumor melletti hámszövet, 17-18 templát nélküli kontrollok,19: pozitív kontroll, plazmidba inszertált HPV 16 genom.)

83

IV. MEGBESZÉLÉS A syndecan-1 molekula fontos sejtfelszíni proteoglikán, mely mind a proliferációt gátló, mind azt serkentő hatásokat képes közvetíteni. Számos daganattípusban írták már le szintjének csökkenését, amely párhuzamos a daganat dedifferenciációjával. Bár még nem ismert a jelenség pontos molekuláris magyarázata, a syndecan-1 szintjének csökkenése a daganatsejteken kedvezőtlen kórlefolyás jele lehet. Korábbi publikációk leírják, hogy a rákmegelőző elváltozásként ismert szájüregi leukoplákiákban csökken a syndecan-1 sejtfelszíni reakciója (86,87,88). Eredményünk megegyezik e korábbi adatokkal, és arra utal, hogy már az invazív laphámrák kialakulását megelőzően jelentkeznek e fontos membránfehérje expressziós zavarai. A syndecan-1 reakció zónája kiszélesedik a leukoplákiákban, jelezve, hogy éretlen sejtek jelennek meg felsőbb rétegekben, azonban a diszplasztikus hámban a kiszélesedett reakció erőssége csökken a normál háméhoz képest. Saját vizsgálatunk szerint a szájüregi laphámrákok esetében a syndecan-1 immunhisztokémiai reakció csökkenése korrelál a daganat kiújulásával, és erős összefüggést mutat a tumorspecifikus halálozással. Eredményünk csatlakozik azokhoz a korábbi vizsgálatokhoz, melyek eredménye szerint a syndecan-1 kifejeződés csökkenése jellegzetes és gyakori jelenség a szájüregi laphámrákoknál, és összefügg a betegség kedvezőtlen klinikai lefolyásával. Elemzésünk eredménye a sejtfelszíni reakció szerepéről

különösen

megállapításaival,

jól

akik

egybecseng szintén

annak

nyelvrákos

a

japán

páciensek

kutatócsoportnak mintáin

a

végeztek

immunhisztokémiát (86, 90, 91). Több kutatócsoport is beszámol arról, hogy míg sejtfelszíni mennyisége csökken, a syndecan-1

felhalmozódik

a

sejten

belül,

hasonlóan

számos

más

fontos

membránfehérjéhez. ( 154, 155 ) Mukunyadzi et al. fej-nyaki laphámrákok esetén is leírja a fokozott citoplazmatikus reakció jelentkezését(108). Saját megfigyelésünk, mely szerint a syndecan-1 molekula fokozott citoplazmatikus reakciót ad a szájüregi daganatok több mint felében, csatlakozik ezekhez a megállapításokhoz. Már több mint tíz évvel ezelőtt fölmerült, hogy a kötőszöveti sejtekben kifejeződő syndecan-1 jelentős szerepet játszhat az embrionális fejlődés során, mivel részt vesz

84

hámsejtek és a mezenchima kölcsönhatásában (29). Számos tanulmány igazolta, hogy a kötőszöveti syndecan-1 expresszió megjelenik hámeredetű rosszindulatú daganatok – úgymint emlőrák, gyomorrák, pajzsmirigydaganat – strómájában. Fej-nyaki daganatoknál Mukunyadzi et al. tanulmánya foglalkozott a kérdéssel (108), egyben az első leírását adva e jelenségnek laphámrákban. Eredményünktől eltérően, Mukunyadzi és társai nem találtak összefüggést a kötőszöveti reakció és a prognózis között, azonban az általuk vizsgált daganatos betegcsoport igen vegyes volt: előfordult larynx-, hangszalag-, gingiva-, szájfenék-, lágyszájpad- és tonsillakarcinómás eset egyaránt. A valós prognosztikai jelentőség megítélését nagyban nehezíti a számos ún. „fejnyaki tumorral” foglalkozó tanulmányban, hogy a kutatócsoportok rendkívül heterogén klinikai anyaggal dolgoznak, és eltérő lokalizációjú daganattal bíró betegeket vesznek be a vizsgáltak közé – noha közismert, hogy az ajakrák és a hypopharynx daganatainak kórjóslata teljesen eltérő. ( 113 ) Eredményeink alapján igazolhatónak tűnik az a fölvetés, mely szerint a syndecan-1 stromális megjelenése rossz prognózist jelent a fej-nyaki laphámrákok esetében. A különbség, hogy Mukunyadzi et al. a daganatok 85 %-ában kimutatta a kötőszöveti syndecan-1 expressziót, míg saját vizsgálatunkban ez csak a daganatok harmadára volt jellemző, feltehetően a két kutatócsoport által használt eltérő metodikából és más kiértékelési módszerből adódhatott. Vélhetően mi csak az általuk három-öt kereszt erősségű, kifejezett stromális reakciókat mutattuk ki, vagy tekintettük a strómasejt valódi reakciójának – mindazonáltal úgy tűnik, hogy csak ezeknek van kifejezett klinikai jelentősége. Fölmerül még az is, hogy az általuk vizsgálatba bevont tumorok eltérő lokalizációja okozná a különbséget (larynx, garat stb.), de ez nem valószínű. Nem zárható ki teljesen, hogy több esetben az előhívási műtermékeket nézték pozitív reakciónak, és ez adta az általuk „gyenge stromális reakciónak” tekintett esetek egy részét. Mindenesetre saját vizsgálatunk szerint a 85% -os gyakoriság irreálisan soknak tűnik. Kétséges továbbá, hogy

helyes-e

egy

immunhisztokémiai pozitivitásának

ötfokozatú

elemzés

jellemzése

során, jóval

skála

felállítása

mivel nehezebb

85

a

egy

strómasejtek feladat,

mint

alacsony

esetszámú

immunhisztokémiai a

daganatsejteké.

Kutatócsoportunk

syndecan-1

intracelluláris

domén/vimentin

kettős

immunhisztokémiát, illetve az extracelluláris domén kimutatásának igazolására biotinfüggetlen EnVision előhívási technikát is alkalmazott a syndecan-1 B-B4 ABC-BT módszerrel strómális pozitívnak bizonyult tumorok mintáin, ezért vélhetően saját eredményünk áll közelebb a valósághoz. Vizsgálatunk szerint a stromális syndecan-1 expresszió a daganatos relapszus kockázatát több mint ötszörösére, a daganatos halálozás proporcionális kockázatát 36,7 szeresére emeli az első két évben, és ez az összefüggés szignifikáns (p=0,023). Úgy tűnik, a tumor-indukált kötőszöveti syndecan-1 expresszió megjelenése elég általános jelenség a legkülönfélébb hámeredetű rosszindulatú daganatban. Fölmerül, milyen molekuláris esemény idézi elő a syndecan-1 kifejeződés változásait, és ez milyen módon befolyásolja a prognózist? Maeda és tsai elmélete szerint a nagyobb klinikai agresszivitásért a ráksejt környezetét képező strómasejtek felszínén elhelyezkedő, abnormálisan expresszálódó heparánszulfát-proteoglikánok felelősek oly módon, hogy a „proteoglikánerdő” kötötte növekedési faktor-készletet a tumorsejt képes saját igényeinek megfelelően mobilizálni, és így az serkenti a daganat növekedését és az angiogenezist egyaránt. Kísérleti eredmény is alátámasztja, hogy a syndecan-1 proteoglikán heparánszulfát glükózaminoglikán láncai igen intenzíven szabályozzák az adott környezetbe kerülő növekedési faktorok, citokinek mennyiségét s elhelyezkedését, befolyásolva tumoros proliferációt és az angiogenezist.(105, 156 ), Mivel a mezenchimális sejtek syndecan-1 expressziója szerepet játszik az embrionális fejlődésben, elképzelhető, hogy a hám eredetű daganatok strómájában való megjelenése onkofötális jelenség. (29) . Maeda et al. megfigyelése szerint a syndecan-1-et kifejező fibroblasztok csak közvetlen kontaktusban gyakoroltak serkentő hatást a tumorsejtek osztódására, filteres kokultúrában nem. Azonban , ha a tumorsejt számára ilyen előnyös a közvetlen környezetében elhelyezkedő nagy tömegű syndecan-1 ectodomén, akkor miért előnyös számára sejtfelszíni kifejeződés csökkenése, sőt eltűnése? Erre több lehetéges magyarázat is elképzelhető.

86

Az első fölvetés szerint a tumorsejt felszínén levő syndecan-1 által lekötött szolubilis faktorok inkább a differenciáció irányában hatnak, tehát az ektodomén jelentős gátló hatást közvetít. E modellben fölmerül, hogy a stromális syndecan-1 éppen azzal fejt ki hatást, hogy lekötné ezeket a differenciáló hatású faktorokat- ennek azonban ellentmond az a tény, hogy kokultúrás kísérletben csak abban az esetben növekedtek gyorsabban a tumorsejtek, ha a mezenchimális sejtekkel közvetlenül érintkeztek, holott ha kompeticióról lenne szó, akkor annak vélhetően a filteres kokultúrában is ki kellene fejteni hatását, ahol a tenyésztőmédium közös. Második lehetőség, hogy ugyan a hámsejtekre valóban jelentős differenciáló hatást fejtenek ki a syndecan-1 külső domén által megkötött növekedési faktorok, azonban a fibroblasztokon kifejeződő syndecan-1 a GAG láncaival szintén növekedési faktorokat köt, és ennek hatására maga a syndecant hordozó fibroblaszt bocsát ki valamely , parakrin módon ható , a daganat növekedését serkentő citokint. Még fontosabb tényező lehet , hogy angiogenezist serkentő faktorokat is fokozottan termelhet a syndecanhordozó mezenchimális sejt, így a tumor vérellátásnak növelésével a daganat távolabbi részeinek növekedését is fokozza. (156). Érdemes ehhez csatlakozva megemlíteni, a lágyrésztumorok egy részében is megjelenik a syndecan-1 expresszió, a synoviális szarkómák epitéliális elemeiben és az epitéliális irányú differenciációt mutató tumorokban a sejt felszínén, érdekes módon azonban a gasztointesztinális stromális tumorok, fibromatózisok és a malignus schwannomák esetében a reakció citoplazmatikus (157). Az angiogenezisre gyakorolt hatás is logikusan magyarázhatná, miért előnyös a stromális syndecan-1 megjelenése a daganat növekedése szempontjából . Újabb lehetőség, hogy nem az extracelluláris domén, hanem a shedding után visszamaradt transzmembrán és citoplazmatikus domén idéz elő gátló hatást. Erre a korábbi felvetésektől jelentősen eltérő mechanizmusra utalhat kutatócsoportunk egy kísérleti megfigyelése (Hollósi Péter, Tátrai Enikő, Kovalszky Ilona 2003). A syndecan1 molekula csonkolt változatával-mely a shedding utáni állapotot modellezte transzfektáltunk máj eredetű daganatos sejtvonalakat (Hep3B, HepG2). A kifejeződő trunkált syndecan-1 molekula hatására a stabilan transzfektált sejtvonalak hepatocyta

87

irányú differenciációt mutattak, albumint és aszialoglikoproteint kezdtek termelni, és növekedésük jelentősen lelassult a csak medúzafehérjével (EGFP) transzfektált kontroll ráksejtekhez képest. A sejtekben csökkent az Ets-1 transzkripciós faktor mennyisége, mely mind az EGF jelpálya receptorának, mind pedig a syndecan-1 vedlésében kulcsfontosságú matrilysin metaloproteáz átírásáért felelős. Bár ez csak egy hipotézis, mégis föl kell vetnünk annak a lehetőségét, hogy a shedding után a syndecan-1 molekulák dimerizálódnak, és ismeretlen módon olyan szignálutat aktíválnak, mely gátlóan interferálhat a növekedési faktorok mitogén hatású jelpályájával. Az eredmények alapján elképzelhető , hogy dimerizáció után a syndecan-1 molekula transzlokálódik a sejtmagba. Mivel -többek között -az EGF jelpálya serkenti a sheddinget, fölmerül hogy a syndecan-1 shedding gátló visszacsatolást jelentene. Azaz a syndecan-1 extracelluláris doménje kevert , serkentő és differenciáló hatásokat egyaránt közvetít, míg a sejten belüli domén hordozná a gátló hatások fő részét. Természetesen az ismertetett elképzelésekben számos részigazság lehet, melyek bármilyen kombinációja elképzelhető. Mindenesetre tény, hogy a stromális expresszió megjelenése kedvezőtlen prognózissal jár a gyomor adenokarciómáiban, továbbá emlőrák esetében (96, 97,100). Úgy tűnik, hogy a stromális reakció hasnyálmirigyráknál is a rossz prognózis jele. (104) Saját,

szájrákra

vonatkozó

eredményünk

további

alátámasztást

nyújthat

e

klinikopatológiai megállapításokhoz. A szájüregi mintákhoz hasonló elemzést végeztünk méhnyaki mintákon is. A sejtfelszíni reakció csökkenését számos más daganathoz hasonlóan a méhnyakrákokban is leírták. Már az invazív rákokat megelőző diszplasztikus elváltozások is a syndecan-1 reakció csökkenését mutatják a normális, egészséges cervixhámhoz képest. Ezzel párhuzamosan a syndecan-1 reakciót adó sejtek zónája kiszélesedik, ahogy a normális rétegezettség aránya fölbomlik. A syndecan-1 reakció eltérései a méhnyak hámjában párhuzamosak a diszplázia előrehaladásával. Saját vizsgálatunk eredménye, mely méhnyaki in situ karcinómákon végzett syndecan-1 immunhisztokémiai reakciók kiértékelésből adódott, megegyezik ezekkel az irodalmi adatokkal. ( 92,93 )

88

Japán kutatók eredményei szerint az invazív méhnyakrákokban a syndecan-1 reakció csökkenése mRNS szinten is megjelenik. Finn és japán kutatócsoportok leírták, hogy a Sdc-1 immunhisztokémiai reakció és az mRNS szint csökkenése párhuzamosan halad a szövettani dedifferenciáció mértékével, tehát a grading-gel, de nincsen valós klinikai relevanciája, mert a betegség lefolyásában nem mutatkozott különbség a különböző expressziót muató páciensek között (68, 94). Érdekes ezzel összevetve, hogy a nyirokcsomó-metasztázisok meglétét gyakoribbnak találták a csökkent syndecan-1 expressziójú esetekben (68). A sejtfelszíni syndecan-1 reakció csökkenése vizsgálatunk szerint összefüggést mutatott a tumorspecifikus halálozással, viszont nem függött össze szignifikánsan a grade-del. Ez a két adat nem egyezik a vonatkozó szakirodalommal. Mivel azonban betegeink posztoperatív követési ideje átlagosan 3,5 év körül van, jelenleg még nem dönthető el, hogy ez valódi különbséget rajzol-e majd ki a korábban leírt eredményekkel szemben, vagy csak statisztikai látszat, mely abból adódik, hogy még nem elégséges az utánkövetés időtartama. Új eredményünk, hogy az általunk vizsgált méhnyaki laphámrákban szenvedő betegek mintáinak közel felében (26/55) ki tudtuk mutatni a syndecan-1 kötőszöveti megjelenését a daganat strómájában. Az eddigi követés szerint méhnyakrákos betegekben

a

kötőszöveti

kifejeződés

megjelenése

háromszorosra

emeli

a

tumorspecifikus halálozás proporcionális kockázatát. Ennek ellenére nem állíthatjuk a stromális reakcióról, hogy szignifikáns mértékben kedvezőtlen túlélési faktor lenne; annyit azonban mindenképpen, hogy ilyen tendencia mutatkozik. A

stromális

reakció

megjelent

a

primer

tumorokhoz

kapcsolódó

nyirokcsomóáttétekben is. A tény, hogy a tumorsejtek megőrzik e képességüket az áttétképzés során, arra utal, hogy előnyt jelenthet a daganatos klón terjedése szempontjából, ha képes a környező strómasejteket syndecan-1 termelésére serkenteni. Nem csak laphámrákoknál, de a méhnyaki adenokarcinómáknál is megfigyeltük a kötőszöveti syndecan-1 reakció jelenségét. Ez további vizsgálatok kiindulási pontja lehet, hiszen e kóros reakció szerepe és klinikai következményei a méhnyaki adenokarcinómáknál is ismeretlenek.

89

Eredményeink értékelésében óvatosságra int, hogy a megfigyelt méhnyakrákos betegeink követési ideje viszonylag rövid. Elképzelhető, hogy további megfigyelésük során pontosabb eredményt kapunk, és hogy a későbbiekben, ha az összes beteg posztoperatív követési ideje eléri majd a minimum öt évet, megmutatkozik a sejtfelszíni és a stromális reakció tényleges prediktív értéke. A HPV meghatározásokat eredetileg csak mint egy újabb szempontot akartuk figyelembe

venni

az

általunk

vizsgált

laphámrákok

syndecan-1

expressziós

anomáliáinak vizsgálatakor. Feltételeztük, hogy a kedvezőbb prognózisúnak tekintett HPV-pozitív daganatok magasabb sejtfelszíni syndecan-1 expresszióval rendelkeznek. Később, amikor a daganat stromális syndecan-1 expressziója is látókörünkbe került, újabb munkahipotézisünk szerint kevesebb kötőszöveti reakciót vártunk a HPVasszociált tumorokban. Eredményeink szerint valóban jelentős különbség rajzolódik ki, mivel a HPV PCR/IHC kettős pozitív szájüregi daganatok syndecan-1 expressziója magasabb a HPV negatívokénál. Ez a különbség szignifikánsnak bizonyult az alkalmazott egyváltozós statisztikai módszerekkel (mint Fisher- és khinégyzet-teszt). Természetesen figyelembe kell venni, hogy egy ilyen értékelés nem vetekedhet egy klinikai és szövettani paramétereket tartalmazó többváltozós modell értékével, azonban bizonyos irányt mutathat. Ez az új eredmény beleillik abba az elképzelésbe, hogy a vírust hordozó daganatok egy sajátos alcsoportot alkotnak, mely molekuláris jellemzőiben eltér a többi fej-nyaki laphámráktól. (142, 145) A humán papillomavírusok szerepe a szájüreg laphámrákjaiban vitatott. Az eddigi vizsgálatok

többsége

megelégedett

a

vírus

high-risk

típusainak

DNS-alapú

diagnosztikájával, (PCR, hybrid capture teszt) azonban az egyre halmozódó bizonyítékok a szájnyálkahártya – gyakran tranziens – fertőzéséről némileg összezavarták a képet. ( 144, 146 ) Munkacsoportunk az E6 ORF PCR mellett a PCR-rel pozitívnak bizonyult mintákon elvégezte az E6 fehérje kimutatását, sőt néhány esetben az E7 fehérjéét is. Saját eredményeink jól rámutatnak arra, hogy valóban indokolt az óvatosság a HPV és a szájrák összefüggéseinek magyarázatában. A PCR-eredmények ugyanis némelyik minta

90

esetében „csúszkáltak” két, azonos tumorból, de más mintavételből származó, nem azonos síkban metszett minta között: ha az egyik pozitív volt, a másik még nem okvetlenül volt az. Mivel duplikátumban, sőt ellentmondásos eredmények esetén háromszor is elvégeztük a PCR-t ugyanazon a tumoron, és mégis eltérő eredményeket kaptunk, arra következtethetünk, hogy a pozitív lelet hátterében ilyenkor nem a tumor HPV-pozitivitása, inkább a környező nem-tumoros, de fertőzött mukóza részleteivel való kontamináció áll. Ez annál is inkább lehetséges, mivel a PCR önmagában nem képes lokalizáció szerinti elkülönítésre: az emésztett minta teljes tartalmát prezentálja. Ennek a hibának a lehetőségét támasztja alá az is, hogy némelyik PCR pozitív tumornál az immunhisztokémiai reakció kizárólag a környező nyálkahártyát jelölte, a daganatsejteket nem.

Ellentmondásosnak tűnő eredményeink interpretálása nehéz feladatnak bizonyult. Nem kétséges, hogy az IHC érzékenysége nem mérhető a PCR-hoz, és ez akár a vírus szerepének túlzott alábecsüléséhez is vezethet. Azonban a szájrákok egy kisebb csoportját mégis elkülöníthettük, mint PCR pozitív, és a HPV transzformáló E6 fehérjéjét expresszáló csoportot. Álláspontunk szerint ez arra utal, hogy a HR-HPV típusok a szájüregi rákok egy részénél valóban kóroki szerepet játszhatnak. Erre utalnak a fej-nyaki tumorokkal foglalkozó kiterjedt nemzetközi vizsgálatok eredményei a HPV esetenkénti integrációjáról, nagyobb kópiaszámú episzómális jelenlétéről, továbbá e mellett szólnak a vírust hordozó daganatoknál leírt a sajátos szövettani és prognosztikai jellemzők. ( 142) Saját vizsgálatunkban a HPV és a daganat esetleges összefüggésére utal: 1. A lézer-mikrodisszekcióval eltávolított tumorsejtekben is kimutatható a HPV genom, 2. A vírus DNS-e kimutatható volt in situ hibridizációs technikával is. 3. A HPV PCR pozitív minták jelentős részénél kimutatható volt az E6 vírusfehérje kifejeződése a tumorsejtekben. Szintén detektálható a másik transzformáló fehérjének, az E7-nek az expressziója.

91

E tumorokban néhány esetben indirekt fluoreszcens in situ hibridizációval a HPV 16 DNS nukleáris jelenlétét is sikerült kimutatni. Mivel paraffinba ágyazott, formalinfixált archív anyagokon a DNS alapú in situ hibridizációs technika szenzitivitása alacsony, az ISH technika kudarca önmagában még nem szól a vírus szerepe ellen a többi daganatban, amelyek a hibridizációval negatívaknak tűntek. Természetesen, még ha ki sikerült is mutatnunk a vírus transzformáló fehérjéit a daganatsejtből, kérdéses, hogy valóban ez lett volna-e az iniciáló faktor. Megfordítva: szintúgy kérdéses, hogy olyan daganatok esetében, amelyekben negatív volt az immunhisztokémia, de pozitív a PCR, valóban kimondhatjuk-e, hogy a daganatnak semmi összefüggése a papillomavírusokkal. E kérdések további kutatásokat igényelnek, melyekben tisztázni kellene, hogy valóban fontos szerepet játszanak-e a szájüreg laphámsejtjeinek transzformálásában a high risk papillomavírusok. Egyes vizsgálatok szerint az integráció jelensége igen ritka a fej-nyaki daganatok esetén, eltérően a méhnyaki rákoktól. Fölvethető, hogy azokban a daganatokban, ahol a PCR pozitivitáson kívül kimutatható az E6 transzformáló vírusfehérje expressziója, a vírus mégis betölthet valamiféle szerepet a malignizálódás folyamatában. Feltehető, hogy ez a szerep jelentősen eltér a méhnyakrákoknál feltárt mechanizmusoktól, és hogy a fej-nyaki régiók rosszindulatú daganataiban inkább promóciós,

mint

iniciáló

tényezőként

vannak

jelen

a

magas

kockázatú

papillómavírusok.

A vírus pontos pathogenetikai szerepének további jellemzéséhez elsősorban olyan vizsgálatok lennének szükségesek, melyek magukra a tumorsejtekre koncentrálnak, mivel a környező fertőzött nyálkahártya bekerülése a metszetbe könnyen hamis pozitivitást adhat. Célszerű lenne a lézer-mikrodisszekció kiterjedtebb alkalmazása, és további DNS és RNS in situ hibridizációs kimutatások elvégzése. A vírusgenom elhelyezkedésének: integrációjának és/vagy episzómális jelenlétének kérdése is további elemzések szükségességét veti föl. Hasznos lenne a vírus fehérjéinek kimutatása további immunhisztokémiai vizsgálatokkal, hisz főként ezek a transzformáló hatás hordozói.

92

A HPV genomjának és fehérjéinek kimutatása idegi szövetekben újabb bizonyítékkal szolgálhat a már korábbi kutatások alapján is sejtett transzverzális terjedés létére és patológiai jelentőségére vonatkozóan. (138,139 ) Kifejlett idegszövetben a vírus nem replikálódhat, mivel életciklusa szorosan kötődik a proliferáló sejtekéhez. E föltevés mellett szól az is, hogy míg a korai vírusfehérjék (E6, E7) jelenlétére utaló immunhisztokémiai reakciók megszólaltak, a késői kapszidfehérjét nem sikerült kimutatni. Az endotélsejtekben való jelenlét azonban minden bizonnyal e sejtek ismert antigén-prezentáló funkciójával lehet kapcsolatban, tehát a külvilágból való fölvételről, nem pedig bennük folyó replikációról vagy fehérjeszintézisről lehet szó.

93

V. MEGÁLLAPÍTÁSOK A disszertáció tézisei a következők: 1. Jellemeztük a sejtfelszíni syndecan-1 reakció csökkenését szájüregi leukoplákiákon, illetve szájüregi invazív laphámrákokon. E csökkenés laphámrákok esetén összefügg a kedvezőtlen prognózissal, noha ez az eredmény vizsgálatunkban nem volt szignifikáns. 2. Elsőként írtuk le, hogy a stromális syndecan-1 expresszió a szájüreg daganataiban önálló prediktív faktor, amely kedvezőtlen kórjóslat jele. Ez az összefüggés Cox-féle regressziós analízissel szignifikáns (p=0,023). 3. Méhnyaki laphámrákok esetében a sejtfelszíni syndecan-1 megjelenésének csökkenését tapasztaltuk. A sejtfelszíni syndecan-1 csökkenése vizsgálatunk eredménye szerint szignifikánsan növelte a tumorspecifikus halálozás kockázatát, viszont a gradedel nem mutatott összefüggést. 4. Elsőként jellemeztük a tumor-indukált stromális syndecan-1 expresszió meglétét méhnyaki

laphámrákokon

és

azok

nyirokcsomóáttéteiben,

továbbá

méhnyaki

adenokarcinómákon. 5. Elsőként foglalkoztunk a stromális syndecan prognosztikai szerepével méhnyaki laphámrákokon. Eredményeink szerint a stromális syndecan-1 reakció megjelenése önmagában háromszorosra növeli a tumorspecifikus halálozás kockázatát. Ez az eredmény azonban nem szignifikáns: az adott betegcsoport további követésére van szükség, hogy az ötéves túlélés adatai alapján mondhassunk véleményt. 6. Kimutattuk a HPV magas rizikójú változatainak, legfőképpen a HPV 16-genomjának jelenlétét az általunk vizsgált szájüregi laphámrákok jelentős hányadában, polimeráz láncreakcióval. 7. Jellemeztük az általunk vizsgált PCR pozitív szájüregi laphámrákok E6 fehérje expresszióját. Eredményünk szerint a PCR pozitív szájüregi laphámrákok többsége kifejezte az E6 vírusfehérjét. A másik jelentős korai fehérjének, az E7-nek megjelenése szintén kimutatható volt. 8. Eredményeink szerint a vizsgált szájüregi laphámrákoknál a HPV PCR pozitivitás gyakran nem a vírus valós kóroki szerepére utal, hanem a környező, nem daganatos jellegű hámstruktúrák érintettségét mutatja.

94

9. Elsőként jellemeztük a HPV-asszociált szájüregi daganatok syndecan-1 expresszióját, összevetve a vírust nem hordozó rákokkal. Eredményünk szerint a HPV 16 E6 ORF nested polimeráz láncreakció/E6 fehérje immunreakció kettősen pozitív daganatok magasabb sejtfelszíni syndecan-1 reakciót mutattak, mint a PCR negatívak, ami utalhat a HPV-asszociált tumorok eltérő molekuláris jellemzőire. A két, kedvezőbb prognózist jósló tényező között átfedés van. A stromális reakció megléte viszont – eddigi vizsgálataink során – semmilyen összefüggést nem mutatott a HPV-vel.

95

Rövidítések jegyzéke

A

adenin

ABC

avidin-biotin-peroxidáz komplex

AP

alkalikus foszfatáz

BCIP

bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát

bp

bázispár

BSA

marha szérumalbumin

BT

biotinilált tiramin

CD-138

a syndecan-1 molekula

C

citozin

CIN

cervikális intraepitélialis neoplázia

CSF

kolónia stimuláló faktor

DAB

diamino-benzidin

DAPI

4',6-diamidino-2-fenilindol

DEPC

dietil-pirokarbonát

DNS

dezoxiribonukleinsav

dNTP's

dezoxiribonukleotid-trifoszfátok

E1, E2, E6, E7

HPV korai fehérjék

EDTA

etilén-diamin-tetraecetsav

FGF

fibrobaszt növekedési faktor

EGF

epidermális növekedési faktor

FISH

fluoreszcens in situ hibridizáció

FITC

fluoreszcein izotiocianát

G

guanin

GAG

glukózaminoglikán

g

nehézségi gyorsulás

96

HGF

hepatocyta növekedési faktor

HPV

humán papillómavírus

HR-HPV

high risk HPV

HRP

torma peroxidáz enzim

IgG

immunglobulin G

IHC

immunhisztokémia

IS

in situ

ISH

in situ hibridizáció

Kb

kilobázis

kDa

kilodalton

L1, L2

HPV késői fehérjék

LCR

long control region

mRNS

messenger RNS

N

nagyítás

NBT

nitro-blue-tetrazólium

ORF

open reading frame

p107

107 kDa fehérje

p130

130 kDa fehérje

p33cdk2

33 kDa ciklin dependens kináz 2

p53

53 kDa fehérje

PBS

foszfát-pufferelt sóoldat

PCR

polimeráz láncreakció

PDGFβ

vérlemezke eredetű növekedési faktor béta

pRb

retinoblasztóma fehérje

RNáz

ribonukleáz

RNS

ribonukleinsav

RT

szobahőmérséklet (23ºC)

Sdc-1

Syndecan-1

97

SSC

NaCl-nátrium-acetát

T

timin

TAE

Tris-ecetsav-EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TBS

Tris-pufferelt sóoldat

TGF-β

transzformáló növekedési faktor béta

TNF

tumor-nekrózis faktor

TE

Tris-EDTA

U

egység (unit)

UV

ultraibolya fény

VZV

Varicella Zoster vírus

98

IRODALOMJEGYZÉK 1) Kovalszky Ilona: Proteoglikánok az ép májban, cirrhosisban, májrákban. Értekezés az MTA doktora cím elnyeréséhez, 1999. 2) Fransson LA: Stucture and function of cell-associated proteoglycans. TIBS 1987.12:406-411. 3) Yanagishita M: Function of Proteoglycans in the extracellular matrix. Acta Pathol. Jpn, 1993. 43:283-293. 4) Bernfield M, Gotte M, Park PW, Reizes O, Fitzgerald ML, Lincecum J, Zako M. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Annu Rev Biochem. (Review) 1999. 68:729-77. 5) Timar J, Lapis K, Dudas J, Sebestyen A, Kopper L, Kovalszky I. Proteoglycans and tumor progression: Janus-faced molecules with contradictory functions in cancer. Semin Cancer Biol 2002.12:173-86. 6) Iozzo RV: Biology of Disease: Proteoglycans: Structure, function, and role in neoplasia. Lab.invest, 1985. 53: 373-96. 7) Kovalszky I, Nagy JO, Gallai M, Sebestyen A, Schaff Z, Paku S, Jeney A, Iozzo RV. Altered Proteoglycan Gene Expression in Human Biliary Cirrhosis. Pathol Oncol Res. 1997.3:51-58. 8) Gallai M, Sebestyen A, Nagy P, Kovalszky I, Onody T, Thorgeirsson SS.Proteoglycan gene expression in rat liver after partial hepatectomy. Biochem Biophys Res Commun. 1996. 228:690-4.

99

9) Resch MD, Nagy ZZ, Szentmáry N, Máthé M, Kovalszky I, Süveges I. Spatial distribution of keratan sulfate in the rabbit cornea following photorefractive keratectomy. J Refract Surg. 2005. 21:485-93 10) Borset M, Hjorth-Hansen H, Seidel C, Sundan A, Waage A. Hepatocyte growth factor and its receptor c-met in multiple myeloma. Blood. 1996. 88:3998-4004 11) David

J.

Carey:

Syndecans:

multifunctional

cell-surface

co-receptors

Biochemistry J. 1997. 327:1-16 12) Beauvais DM, Rapraeger AC. : Syndecans in tumor cell adhesion and signaling. Reprod Biol Endocrinol.( Review) 2004. 2:3. 13) Atsuko Yoneda, John R. Couchman: Regulation of cytoskeletal organization by syndecan transmembrane proteglycans Matrix Biology 2003. 22: 25-33 14) Okayama Minoru, Munesue Seiichi, Komaki Massato, Kusano Yuri and Oguri Kayoko: Functional specifity of syndecans Trends in Glycoscience and Glycotechnology 1998. 211-221 15) Asundi VK, Carey DJ. : Self-association of N-syndecan (syndecan-3) core protein is mediated by a novel structural motif in the transmembrane domain and ectodomain flanking region. J Biol Chem. 1995.270:26404-10. 16) Bernfield M, Kokenyesi R, Kato M, Hinkes MT, Spring J, Gallo RL, Lose EJ. Biology of the syndecans: a family of transmembrane heparan sulfate proteoglycans. Annu Rev Cell Biol.(Review) 1992.8:365-93. 17) Oh ES, Couchman JR, Woods A. Serine phosphorylation of syndecan-2 proteoglycan cytoplasmic domain. Arch Biochem Biophys. 1997. 344:67-74.

100

18) Erik Forsberg and Lena Kjellén: Heparan sulfate: lessons from knockout mice J.Clin.Invest. 2001.108:175-180 19) Benjamin L. Allen, Mark S.Filla, and Alan C.Rapraeger: Role of heparan sulfate as a tissue-specific regulator of FGF-4 and FGF receptor recognition The Journal of Cell Biology, 2001.155:845-857 20) Kokenyesi R, Bernfield M. :Core protein structure and sequence determine the site and presence of heparan sulfate and chondroitin sulfate on syndecan-1. J Biol Chem. 1994. 269:12304-9 21) Rapraeger A, Jalkanen M, Endo E, Koda J, Bernfield M.: The cell surface proteoglycan from mouse mammary epithelial cells bears chondroitin sulfate and heparan sulfate glycosaminoglycans. J Biol Chem. 1985. 260:11046-52. 22) Shworak NW, Shirakawa M, Mulligan RC, Rosenberg RD. Characterization of ryudocan glycosaminoglycan acceptor sites. J Biol Chem. 1994.269:21204-14. 23) Shimazu A, Nah HD, Kirsch T, Koyama E, Leatherman JL, Golden EB, Kosher RA, Pacifici M. Syndecan-3 and the control of chondrocyte proliferation during endochondral ossification. Exp Cell Res. 1996.229:126-36. 24) Rapraeger A, Jalkanen M, Bernfield M.: Cell surface proteoglycan associates with the cytoskeleton at the basolateral cell surface of mouse mammary epithelial cells.J Cell Biol. 1986.103:2683-96. 25) Miettinen HM, Edwards SN, Jalkanen M.: Analysis of transport and targeting of syndecan-1: effect of cytoplasmic tail deletions. Mol Biol Cell. 1994.5:1325-39. 26) Kopper L, Sebestyen A. Syndecans and the lymphoid system. Leuk Lymphoma 2000.38:271-81.

101

27) Dhodapkar M.V., and R.D. Sanderson:Syndecan-1 (CD138) in myeloma and lymphoid malignancies: a multifunctional regulator of cell behavior within the tumor microenviroment. Leuk.Lymphoma, 1999.34:.35-43 28) Larrain J, Cizmeci-Smith G, Troncoso V, Stahl RC, Carey DJ, Brandan E. Syndecan-1

expression

is

down-regulated

during

myoblast

terminal

differentiation. Modulation by growth factors and retinoic acid. J Biol Chem 1997.272:18418-24. 29) Boutin EL, Sanderson RD, Bernfield M, Cunha GR. Epithelial-mesenchymal interactions in uterus and vagina alter the expression of the cell surface proteoglycan, syndecan. Dev Biol 1991.148:63-74. 30) Kim CW, Golldberger OA, Gallo RL, Bernfield M Members of the syndecan family of heparan sulfate proteoglycans are expressed in distinct cell-, tissue-, and development-specific patterns. Mol. Biol. Cell. 1994. 5:797-805 31) Carey DJ, Conner K, Asundi VK, O'Mahony DJ, Stahl RC, Showalter L, Cizmeci-Smith G, Hartman J, Rothblum LI. : cDNA cloning, genomic organization, and in vivo expression of rat N-syndecan. J Biol Chem. 1997.272:2873-9. 32) Rapraeger AC.: The coordinated regulation of heparan sulfate, syndecans and cell behavior. Curr Opin Cell Biol. (Review) 1993. 5:844-53. 33) Woods A, Couchman JR. Syndecans: synergistic activators of cell adhesion. Trends Cell Biol. (Review) 1998.8:189-92. 34) Rapraeger

AC.

Syndecan-regulated

2000.149:995-8.

102

receptor

signaling.

J

Cell

Biol

35) Worapamorn W, Xiao Y, Li H, Young WG, Bartold PM. Differential expression and distribution of syndecan-1 and -2 in periodontal wound healing of the rat. J Periodontal Res 2002.37:293-9. 36) Beauvais DM, Rapraeger AC. Syndecan-1-mediated cell spreading requires signaling by alphavbeta3 integrins in human breast carcinoma cells. Exp Cell Res 2003.286:219-32. 37) Richardson TP, Trinkaus-Randall V, Nugent MA. Regulation of basic fibroblast growth factor binding and activity by cell density and heparan sulfate. J Biol Chem 1999.274:13534-40. 38) Dobra K, Nurminen M, Hjerpe A. Growth factors regulate the expression profile of their syndecan co-receptors and the differentiation of mesothelioma cells. Anticancer Res 2003.23:2435-44. 39) Mundhenke C, Meyer K, Drew S, Friedl A. Heparan sulfate proteoglycans as regulators of fibroblast growth factor-2 receptor binding in breast carcinomas. Am J Pathol 2002.160:185-94. 40) Hozumi K, Suzuki N, Nielsen PK, Nomizu M, Yamada Y. Laminin alpha 1 chain LG4 module promotes cell attachment through syndecans and cell spreading through integrin alpha 2beta 1.J Biol Chem. 2006 Aug 30 41) Hsueh YP, Yang FC, Kharazia V, Naisbitt S, Cohen AR, Weinberg RJ, Sheng M. Direct interaction of CASK/LIN-2 and syndecan heparan sulfate proteoglycan and their overlapping distribution in neuronal synapses.J Cell Biol. 1998.142:139-51. 42) Wilsie LC, Gonzales AM, Orlando RA. Syndecan-1 mediates internalization of apoE-VLDL through a low density lipoprotein receptor-related protein (LRP)independent, non-clathrin-mediated pathway.Lipids Health Dis. 2006.5:23

103

43) Ihrcke NS, Platt JL. Shedding of heparan sulfate proteoglycan by stimulated endothelial cells: evidence for proteolysis of cell-surface molecules. J Cell Physiol. 1996.168:625-37. 44) Jones SA, Novick D, Horiuchi S, Yamamoto N, Szalai AJ, Fuller GM. Creactive protein: a physiological activator of interleukin 6 receptor shedding. J Exp Med. 1999.189:599-604. 45) Li Q, Park PW, Wilson CL, Parks WC.: Matrilysin shedding of syndecan-1 regulates chemokine mobilization and transepithelial efflux of neutrophils in acute lung injury.Cell. 2002.111:635-46. 46) Sukanya V. Subramanian, Marilyn L. Fitzgerald and Merton Bernfields: Regulated shedding of syndecan-1 and-4 ectodomains by thrombin and growth factor receptor activation The Journal of Biological Chemistry 1997.272:1471314720 47) Sanderson RD, Bernfield M. Molecular polymorphism of a cell surface proteoglycan: distinct structures on simple and stratified epithelia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988.85:9562-6. 48) Pyong Woo Park, Gerald B.Pier, Michael J.Preston, Olga Goldberger, Marilyn L.Fitzgerald, and Merton Bernfield: Syndecan-1 shedding is enhanced by LasA, a secreted virulence factor of Pseudomonas aeruginosa J.Biol.Chem, 2000.275:.3057-3064 49) Ehlers MR, Riordan JF. Membrane proteins with soluble counterparts: role of proteolysis in the release of transmembrane proteins. Biochemistry. (Review) 1991.30:10065-74. .

104

50) Gearing AJ, Newman W. Circulating adhesion molecules in disease. Immunol Today (Review) 1993.14:506-12. 51) Anttonen A, Leppa S, Ruotsalainen T, Alfthan H, Mattson K, Joensuu H. Pretreatment serum syndecan-1 levels and outcome in small cell lung cancer patients treated with platinum-based chemotherapy.Lung Cancer. 2003.41:1717. 52) Joensuu H, Anttonen A, Eriksson M, Makitaro R, Alfthan H, Kinnula V, Leppa S. Soluble syndecan-1 and serum basic fibroblast growth factor are new prognostic factors in lung cancer. Cancer Res. 2002.62:5210-7. 53) Anttonen A, Leppa S, Heikkila P, Grenman R, Joensuu H. Effect of treatment of larynx and hypopharynx carcinomas on serum syndecan-1 concentrations.J Cancer Res Clin Oncol. 2006.132:451-7 54) Turner AJ, Hooper NM. Role for ADAM-family proteinases as membrane protein secretases. Biochem Soc Trans. (Review) 1999.27:255-9. 55) L. Fitzgerald, Zihua Wang, Pyong Woo Park, Gillian Murphy, and Merton Bernfield: Shedding of Syndecan-1 and -4 Ectodomains Is Regulated by Multiple

Signaling

Pathways

and

Mediated

by

a

TIMP-3–Sensitive

Metalloproteinase: Marilyn The Journal of Cell Biology, , 2000. 148:811-824 56) Heldin CH. Dimerization of cell surface receptors in signal transduction. Cell.( Review) 1995.80:213-23. 57) Bobardt MD, Saphire AC, Hung HC, Yu X, Van der Schueren B, Zhang Z, David G, Gallay PA. Syndecan captures, protects, and transmits HIV to T lymphocytes. Immunity. 2003.18:27-39.

105

58) Saphire AC, Bobardt MD, Zhang Z, David G, Gallay PA. Syndecans serve as attachment receptors for human immunodeficiency virus type 1 on macrophages. J Virol. 2001.75:9187-200. 59) Shafti-Keramat S, Handisurya A, Kriehuber E, Meneguzzi G, Slupetzky K, Kirnbauer R. Different heparan sulfate proteoglycans serve as cellular receptors for human papillomaviruses. J Virol. 2003.77:13125-35. 60) Joyce JG, Tung JS, Przysiecki CT, Cook JC, Lehman ED, Sands JA, Jansen KU, Keller PM. The L1 major capsid protein of human papillomavirus type 11 recombinant virus-like particles interacts with heparin and cell-surface glycosaminoglycans on human keratinocytes. J Biol Chem. 1999.274:5810-22. 61) Giroglou T, Florin L, Schafer F, Streeck RE, Sapp M. Human papillomavirus infection requires cell surface heparan sulfate. J Virol. 2001.75:1565-70. 62) Gallo RL, Ono M, Povsic T, Page C, Eriksson E, Klagsbrun M, Bernfield M. Syndecans, cell surface heparan sulfate proteoglycans, are induced by a prolinerich antimicrobial peptide from wounds.Proc Natl Acad Sci U S A. 1994.91:11035-9 63) Smith MF Jr, Novotny J, Carl VS, Comeau LD. Helicobacter pylori and toll-like receptor agonists induce syndecan-4 expression in an NF-kappaB-dependent manner. Glycobiology. 2006.16:221-9. 64) Inki P, Jalkanen M. The role of syndecan-1 in malignancies. Ann Med 1996.28:63-7. 65) Mali M, Andtfolk H, Miettinen HM, Jalkanen M.: Suppression of tumor cell growth by syndecan-1 ectodomain.J Biol Chem. 1994.269:27795-8.

106

66) Viklund L, Loo BM, Hermonen J, El-Darwish K, Jalkanen M, Salmivirta M. Expression and characterization of minican, a recombinant syndecan-1 with extensively truncated core protein. Biochem Biophys Res Commun. 2002.290:146-52. 67) Alexander CM, Reichsman F, Hinkes MT, Lincecum J, Becker KA, Cumberledge S, Bernfield M. : Syndecan-1 is required for Wnt-1-induced mammary tumorigenesis in mice. Nat Genet. 2000.25:329-32. 68) Numa F, Hirabayashi K, Kawasaki K, Sakaguchi Y, Sugino N, Suehiro Y, Suminami Y, Hirakawa H, Umayahara K, Nawata S, Ogata H, Kato H. :Syndecan-1 expression in cancer of the uterine cervix: association with lymph node metastasis.Int J Oncol. 2002.20:39-43. 69) Nakanishi K, Yoshioka N, Oka K, Hakura A. Reduction of syndecan-1 mRNA in cervical-carcinoma cells is involved with the 3' untranslated region. Int J Cancer. 1999.80:527-32. 70) Mikami S., Ohashi K., Usui Y., Nemoto T., Katsube Ki K., Yanagishita M., Nakajima M., Nakamura K., Koike M. Loss of syndecan-1 and increased expression of heparanase in invasive esophageal carcinomas. Jpn J Cancer Res 2001.92:1062-73 71) Mukunyadzi P, Sanderson RD, Fan CY, Smoller BR. The level of syndecan-1 expression is a distinguishing feature in behavior between keratoacanthoma and invasive cutaneous squamous cell carcinoma. Mod Pathol. 2002.15:45-9. 72) Fujiya M., Watari J., Ashida T., Honda M., Tanabe H., Fujiki T., Saitoh Y., Kohgo Y. Reduced -expression of syndecan-1 affects metastatic potential and clinical outcome in patients with colorectal cancer. Jpn J Cancer Res. 2001. 92:1078-81.

107

73) Lundin M, Nordling S, Lundin J, Isola J, Wiksten JP, Haglund C. Epithelial syndecan-1 expression is associated with stage and grade in colorectal cancer. Oncology 2005.68:306-13. 74) Bayer-Garner I.B., Dilday B., Sanderson R.D., Smoller B.R.: Syndecan-1 _expression is decreased with increasing aggressiveness of basal cell carcinoma Am.J Dermatopathol. 2000.22:119-22. 75) Gulyas M, Hjerpe A. Proteoglycans and WT1 as markers for distinguishing adenocarcinoma, epithelioid mesothelioma, and benign mesothelium. J Pathol 2003.199:479-87. 76) Sebestyen A, Kovalszky I, Mihalik R, Gallai M, Bocsi J, Laszlo E, Benedek S, Sreter L, Kopper L. Expression of syndecan-1 in human B cell chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Cancer. 1997.33:2273-7 77) Mahtouk K, Cremer FW, Reme T, Jourdan M, Baudard M, Moreaux J, Requirand G, Fiol G, De Vos J, Moos M, Quittet P, Goldschmidt H, Rossi JF, Hose D, Klein B.Heparan sulphate proteoglycans are essential for the myeloma cell growth activity of EGF-family ligands in multiple myeloma.Oncogene. 2006 May 29; 78) Maisnar V, Touskova M, Tichy M, Krejsek J, Chrobak L, Voglova J, Maly J. The

significance

of

soluble

CD138

in

diagnosis

of

monoclonal

gammopathies.Neoplasma. 2006.53:26-9. 79) Shah L, Walter KL, Borczuk AC, Kawut SM, Sonett JR, Gorenstein LA, Ginsburg ME, Steinglass KM, Powell CA. : Expression of syndecan-1 and expression of epidermal growth factor receptor are associated with survival in patients with nonsmall cell lung carcinoma.Cancer. 2004.101:1632-8.

108

80) Anttonen A, Heikkila P, Kajanti M, Jalkanen M, Joensuu H.: High syndecan-1 expression is associated with favourable outcome in squamous cell lung carcinoma treated with radical surgery. Lung Cancer. 2001.32:297-305. 81) Matsumoto A, Ono M, Fujimoto Y, Gallo RL, Bernfield M, Kohgo Y.:Reduced -expression of syndecan-1 in human hepatocellular carcinoma with high metastatic potential Journal Cancer, 1997.74:482-491 82) Sebestyen A, Gallai M, Knittel T, Ambrust T, Ramadori G, Kovalszky I.: Cytokine regulation of syndecan expression in cells of liver origin. Cytokine. 2000. 12:1557-60. 83) Gokden N, Greene GF, Bayer-Garner IB, Spencer HJ, Sanderson RD, Gokden M. Expression of CD138 (Syndecan-1) in renal cell carcinoma is reduced with increasing nuclear grade.Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2006.14:173-7. 84) Hasengaowa, Kodama J, Kusumoto T, Shinyo Y, Seki N, Hiramatsu Y. Prognostic significance of syndecan-1 expression in human endometrial cancer. Ann Oncol. 2005.16:1109-15. 85) Chen CL, Ou DL. Expression of syndecan-1 (CD138) in nasopharyngeal carcinoma is correlated with advanced stage and poor prognosis.Hum Pathol. 2006 Jul 18; 86) Kurokawa H, Zhang M, Matsumoto S, Yamashita Y, Tanaka T, Takamori K, Igawa K, Yoshida M, Fukuyama H, Takahashi T, Sakoda S.: Reduced syndecan1 expression is correlated with the histological grade of malignancy at the deep invasive front in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med. 2006.35:3016. 87) Kurokawa H, Matsumoto S, Murata T, Yamashita Y, Tomoyose T, Zhang M, et al. Immunohistochemical study of syndecan-1 down-regulation and the

109

expression of p53 protein or Ki-67 antigen in oral leukoplakia with or without epithelial dysplasia. J Oral Pathol Med 2003.32:513-21 88) Soukka T, Pohjola J, Inki P, Happonen RP. Reduction of syndecan-1 expression is associated with dysplastic oral epithelium. J Oral Pathol Med. 2000.29:30813. 89) Pulkkinen JO, Penttinen M, Jalkanen M, Klemi P, Grenman R. Syndecan-1: a new prognostic marker in laryngeal cancer. Acta Otolaryngol. 1997.117:312-5. 90) Inki P, Joensuu H, Grenman R, Klemi P, Jalkanen M. Association between syndecan-1 expression and clinical outcome in squamous cell carcinoma of the head and neck. Br J Cancer. 1994.70:319-23. 91) Anttonen A, Kajanti M, Heikkila P, Jalkanen M, Joensuu H. Syndecan-1 expression has prognostic significance in head and neck carcinoma. Br J Cancer 1999.79:558-64 92) Shinyo Y, Kodama J, Hasengaowa, Kusumoto T, Hiramatsu Y. Loss of cellsurface heparan sulfate expression in both cervical intraepithelial neoplasm and invasive cervical cancer.Gynecol Oncol. 2005.96:776-83. 93) Sobel G, Szabo I, Paska C, Kiss A, Kovalszky I, Kadar A, Paulin F, Schaff Z. Changes of cell adhesion and extracellular matrix (ECM) components in cervical intraepithelial neoplasia. Pathol Oncol Res. 2005.11:26-31. 94) Rintala M, Inki P, Klemi P, Jalkanen M, Grenman S.: Association of syndecan-1 with tumor grade and histology in primary invasive cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 1999.75:372-8.

110

95) Inki P, Stenback F, Grenman S, Jalkanen M. Immunohistochemical localization of syndecan-1 in normal and pathological human uterine cervix. J Pathol. 1994.172:349-55. 96) Wiksten JP, Lundin J, Nordling S, Lundin M, Kokkola A, von Boguslawski K, et al. Epithelial and stromal syndecan-1 expression as predictor of outcome in patients with gastric cancer. Int J Cancer 2001.95:1-6. 97) Leivonen M, Lundin J, Nordling S, von Boguslawski K, Haglund C. Prognostic value of syndecan-1 expression in breast cancer. Oncology 2004.67:11-8. 98) Tanabe H, Yokota K, Kohgo Y. Localisation of syndecan-1 in human gastric mucosa assiciated with alceration. J. Pathol.1999.187:338-44 99) Lundstrom E, Sahlin L, Skoog L, Hagerstrom I, Svane G, Azavedo E, Sandelin K, von Schoultz B.: Expression of syndecan-1 in histologically normal breast from postmenopausal womwn with breast cancer according to mammographic density. Climacteric, 2006.9:227 -82. 100) Stanley MJ, Stanley MW, Sanderson RD, Zera R. Syndecan-1 expression is induced in the stroma of infiltrating breast carcinoma. Am J Clin Pathol 1999.112:377-83. 101) Ito Y, Yoshida H, Nakano K, Takamura Y, Miya A, Kobayashi K, et al. Syndecan-1 expression in thyroid carcinoma: stromal expression followed by epithelial

expression

is

significantly

correlated

with

dedifferentiation.

Histopathology 2003.43:157-64. 102) Davies EJ, Blackhall FH, Shanks JH, David G, McGown AT, Swindell R, et al. Distribution and clinical significance of heparan sulfate proteoglycans in ovarian cancer. Clin Cancer Res 2004.10:5178-86.

111

103) Mennerich D, Vogel A, Klaman I, Dahl E, Lichtner RB, Rosenthal A, et al. Shift of syndecan-1 expression from epithelial to stromal cells during progression of solid tumours. Eur J Cancer 2004.40:1373-82. 104) Juuti A, Nordling S, Lundin J, Louhimo J, Haglund C. Syndecan-1 expression-a novel prognostic marker in pancreatic cancer. Oncology. 2005.68:97-106. 105) Maeda T, Alexander CM, Friedl A. Induction of syndecan-1 expression in stromal fibroblasts promotes proliferation of human breast cancer cells. Cancer Res 2004.64:612-21. 106) McDermott SP, Ranheim EA, Leatherberry VS, Khwaja SS, Klos KS, Alexander CM. Juvenile syndecan-1 null mice are protected from carcinogeninduced tumor development. Oncogene, 2006 Sept. 04 107) Baba F, Swartz K, van Buren R, Eickhoff J, Zhang Y, Wolberg W, Friedl A. Syndecan-1 and syndecan-4 are overexpressed in an estrogen receptor-negative, highly proliferative breast carcinoma subtype. Breast Cancer Res Treat. 2006.98:91-8. 108) Mukunyadzi P, Liu K, Hanna EY, Suen JY, Fan CY. Induced expression of syndecan-1 in the stroma of head and neck squamous cell carcinoma. Mod Pathol 2003.16:796-801. 109) Burbach BJ, Ji Y, Rapraeger AC. Syndecan-1 ectodomain regulates matrixdependent signaling in human breast carcinoma cells. Exp. Cell Res. 2004.300:234-47. 110) Döme B, Rásó E, Dobos J, Mészáros L, Varga N, Puskás LG, Fehér LZ, Lőrincz T, Ladányi A, Trikha M, Honn KV, Timár J.: Parallel expression of alpha IIbbeta3 and alphavbeta3 integrins in human melanoma cells upregulates

112

bFGF expression and promotes their angiogenic phenotype.Int J Cancer. 2005.116:27-35. 111) Gotte M, Kersting C, Ruggiero M, Tio J, Tulusan AH, Kiesel L, Wulfing P. Predictive value of syndecan-1 expression for the response to neoadjuvant chemotherapy of primary breast cancer.Anticancer Res. 2006.26:621-7. 112) Conejo J.R., Kleef J., Koliopanos A., Matsuda K., Zhu ZW., Goecke H., Bicheng N., Zimmerman A., Korc M., Friess H., Buchler M.W.:Syndecan-1 expression is up-regulated in pancreatic but not in other gastrointestinal cancers. Int J Cancer 2000.88:12-20 113) Suba Zs. A szájüreg klinikai pathológiája. Medicina Kiadó, Budapest, 1999 114) IARC Monograph on the Evaluation of the Carcinogenic Risk Chemicals to Humans (1986) Tobacco smoking, IARC Lyon. Vol 38 115) Stina Syrjanen: Human papillomavirus (HPV) in head and neck cancer Journal of Clinical Virology 32S 2005. S59–S66 116) B.N.Fields et al. Fields Virology, Volume 2. 3rd Ed.(Philadelphia,1996) 117) zur Hausen H.: Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis. J Natl Cancer Inst. 2000.92:690-8. 118) Syrjanen KJ.: HPV infections and oesophageal cancer. J Clin Pathol. (Review) 2002.55:721-8. 119) Barghi MR, Hajimohammadmehdiarbab A, Moghaddam SM, Kazemi B.: Correlation between human papillomavirus infection and bladder transitional cell carcinoma. BMC Infect Dis. 2005.5:102

113

120) Evander M, Frazer IH, Payne E, Qi YM, Hengst K, McMillan NA.: Identification of the alpha6 integrin as a candidate receptor for papillomaviruses. J Virol. 1997.71:2449-56. 121) Day PM, Lowy DR, Schiller JT.: Papillomaviruses infect cells via a clathrindependent pathway. Virology. 2003.307:1-11. 122) Stubenrauch F, Laimins LA.: Human papillomavirus life cycle: active and latent phases. Semin Cancer Biol. 1999.9:379-86. 123) Favre M, Breitburd F, Croissant O, Orth G.: Chromatin-like structures obtained after alkaline disruption of bovine and human papillomaviruses. J Virol. 1977.21:1205-9. 124) Pfister H, zur Hausen H.: Characterization of proteins of human papilloma viruses (HPV) and antibody response to HPV 1. Med Microbiol Immunol (Berl). 1978.166:13-9. 125) Harald zur Hausen: Papillomavirus infections - a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta 1288 (1996) F55-F78 126) H.Frazer, Medley G. Crapper RM. Brown TC. Mackay IR.: Association between

anorectal

dysplasia,

human

papillomavirus,

and

human

immunodeficiency virus infection in homosexual men. Lancet 1986 ii.657-660 127) H.K.Kashima, Shah F. Lyles A. Glackin R. Muhammad N. Turner L. Van Zandt S. Whitt S. Shah K.: A comparison of risk factors in juvenile-onset and adult-onset recurrent respiratory papillomatosis. Laringoscope 1992.1029-13 128) Palefsky J.M., Gonzales J, Greenblatt RM, Ahn DK, Hollander H.: Anal intraepithelial neoplasia and anal papillomavirus infection among homosexual males with group IV HIV disease. J.Am.Med.Assoc. 1990.263:2911-2916I.

114

129) W.Melchers, de Mare S. Kuitert E. Galama J. Walboomers J. van den Brule AJ.: Human papillomavirus and cutaneous warts in meat handlers. J.Clin.Microbiol. 1993.31:2547-2549 130) R.F.Murray,J.Hobbs and B.Payne: Possible clonal origin of common warts (Verruca vulgaris). Nature 1971.232:51-52 131) P.J.Fialkow: Human tumors studied with genetic markers. Birth Defects 1976.12:123-132 132) Winer RL, Kiviat NB, Hughes JP, Adam DE, Lee SK, Kuypers JM, Koutsky LA.: Development and duration of human papillomavirus lesions, after initial infection. J. Infect. Dis. 2005.191: 731-738. 133) N.B.Kiviat, Critchlow CW. Holmes KK. Kuypers J. Sayer J. Dunphy C. Surawicz C. Kirby P. Wood R. Daling JR.: Association of anal dysplasia and human papillomavirus with immunosuppression and HIV infection among homosexual men. AIDS 1993.7:43-49 134) A.C.Seck, Faye MA. Critchlow CW. Mbaye AD. Kuypers J. Woto-Gaye G. Langley C. De EB. Holmes KK Kiviat NB.: Cervical intraepithelial neoplasia and human papillomavirus infection among Senegalese women seropositive for HIV-1 or HIV-2 or seronegative for HIV Int.J.STD.AIDS 1994.5:189-193 135) L.Gissmann, H.Pfister and H.zur Hausen: Human papilloma viruses (HPV): characterization of four different isolates. Virology 1977.76:569-580 136) Franco EL, Villa LL, Sobrinho JP, Prado JM, Rousseau MC, Desy M, Rohan TE:

Epidemiology

of

acquisition

and

clearence

of

cervical

human

papillomavirus infection in women in a high risk area for cervical cancer. J. Infect. Dis. 1999.180: 1415-1423.

115

137) Fletcher JL Jr.: Perinatal transmission of human papillomavirus. Am Fam Physician. 1991.43:143-8. 138) Medeiros LR, Ethur AB, Hilgert JB, Zanini RR, Berwanger O, Bozzetti MC, Mylius LC.: Vertical transmission of the human papillomavirus: a systematic quantitative review. Cad Saude Publica. 2005.21:1006-15. 139) Csire M, Vályi-Nagy I, M, Fülöp V, Berencsi Gy, Visi M. (kézírat közlés alatt) 140) You H, Liu Y, Agrawal N, Prasad CK, Chiriva-Internati M, Lowery CL, Kay HH, Hermonat PL. Infection, replication, and cytopathology of human papillomavirus type 31 in trophoblasts. Virology. 2003.316:281-9 141) Snijders PJ, Scholes AG, Hart CA, et al.: Prevalence of mucosotropic human papillomaviruses in squamous-cell carcinoma of the head and neck. Int J Cancer 1996.66:464–9. 142) Gillison ML, Koch WM, Capone RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, Zahurak ML, Daniel RW, Viglione M, Symer DE, Shah KV, Sidransky D. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers.J Natl Cancer Inst. 2000.92:709-20. 143) Koskinen WJ, Chen RW, Leivo I, Makitie A, Back L, Kontio R, et al.: Prevalence and physical status of human papillomavirus in squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer 2003.107: 401–6. 144) Ha PK, Pai SI, Westra WH, Gillison ML, Tong BC, Sidransky D, Califano JA. Real-time

quantitative

PCR

demonstrates

low

prevalence

of

human

papillomavirus type 16 in premalignant and malignant lesions of the oral cavity. Clin Cancer Res. 2002.8:1203-9.

116

145) Mellin H, Dahlgren L, Munck-Wikland E, et al.: Human papillomavirus type 16 is episomal and a high viral load may be correlated to better prognosis in tonsillar cancer. Int J Cancer 2002.102:152–8. 146) Boy S, Van Rensburg EJ, Engelbrecht S, Dreyer L, van Heerden M, van Heerden W. HPV detection in primary intra-oral squamous cell carcinomas-commensal, aetiological agent or contamination? J Oral Pathol Med. 2006.35:86-90 147) Ha PK, Califano JA. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit Rev Oral Biol Med. 2004.15:188-96. Review 148) Hall SF, Groome PA, Rothwell D. Time to first relapse as an outcome and a predictor of survival in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Laryngoscope 2000.110:2041-6. 149) Adams JC. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. J Histochem Cytochem 1992.40:1457-1463. 150) Nawa A, Nishiyama Y, Kikkawa F, Kawai M, Mano H, Goto S, Suganuma N, Tomoda Y, Nakashima N. Detection of human papillomaviruses from histologically normal lymph nodes of Japanese cervical cancer patients by nested polymerase chain-reaction assay. Int J Cancer. 1993.53:932-7. 151) Tatrai P, Dudas J, Batmunkh E, Mathe M, Zalatnai A, Schaff Z, Ramadori G, Kovalszky I.: Agrin, a novel basement membrane component in human and rat liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma.Lab Invest. 2006 Sep 18;

117

152) Jiang X, Multhaupt H, Chan E, Schaefer L, Schaefer RM, Couchman JR. Essential contribution of tumor-derived perlecan to epidermal tumor growth and angiogenesis.J Histochem Cytochem. 2004 Dec;52(12):1575-90.

153) Knox SM, Whitelock JM. Perlecan: how does one molecule do so many things? Cell Mol Life Sci. 2006 Sep 4; 154) Burbach BJ, Friedl A, Mundhenke C, Rapraeger AC. Syndecan-1 accumulates in lysosomes of poorly differentiated breast carcinoma cells.Matrix Biol. 2003 Apr;22(2):163-77. 155) Roskams T, De Vos R, David G, Van Damme B, Desmet V. Heparan sulphate proteoglycan expression in human primary liver tumours.J Pathol. 1998 Jul;185(3):2907. 156) Maeda T, Desouky J, Friedl A. Syndecan-1 expression by stromal fibroblasts promotes breast carcinoma growth in vivo and stimulates tumor angiogenesis.Oncogene. 2006 Mar 2;25(9):1408-12. 157) Orosz Z, Kopper L. Syndecan-1 expression in different soft tissue tumours. Anticancer Res. 2001 Jan-Feb;21(1B):733-7.

118

Publikációs Jegyzék A disszertáció témájához kapcsolódó publikációk: Első szerzőként (beleértve megosztott szerzőséget): Mathe M, Suba Z, Nemeth Z, Tatrai P, Fule T, Borgulya G, Barabas J, Kovalszky I. Stromal syndecan-1 expression is an adverse prognostic factor in oral carcinomas.Oral Oncol. 2006 May;42(5):493-500. Impakt faktor: 2,266 Fule T,* Mathe M* , Suba Z, Csapo Z, Szarvas T, Tatrai P, Paku S, Kovalszky I. The presence of human papillomavirus 16 in neural structures and vascular endothelial cells.Virology. 2006 May 10;348(2):289-96. *-equal contributors Impakt faktor: 3, 08 Társszerzőként: Nemeth Z, Szigeti K, Mathe M, Szabo G, Velich N, Suba Z. Effect of induction chemotherapy on changes of laminin and syndecan expression in oral squamous cell carcinomas: a prospective, randomized, clinicopathologic and immunohistochemical study.J Craniofac Surg. 2005 Mar;16(2):205-12. Impakt faktor: 0,827

A disszertáció témájához szorosan nem kapcsolódó publikációk: Tatrai P, Dudas J, Batmunkh E, Mathe M, Zalatnai A, Schaff Z, Ramadori G, Kovalszky I. Agrin, a novel basement membrane component in human and rat liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Lab Invest. 2006 Sep 18; [Epub ahead of print] Impakt faktor: 3,859

119

Fule T, Csapo Z, Mathe M, Tatrai P, Laszlo V, Papp Z, Kovalszky I. Prognostic significance of high-risk HPV status in advanced cervical cancers and pelvic lymph nodes.Gynecol Oncol. 2006 Mar;100(3):570-8. Impakt faktor: 2,251 Tokes AM, Kulka J, Paku S, Mathe M, Paska C, Lodi C, Kiss A, Schaff Z. The expression of five different claudins in invasive breast carcinomas: comparison of pT1pN1 and pT1pN0 tumors.Pathol Res Pract. 2005;201(89):537-44. Impakt faktor: 0,88 Resch MD, Nagy ZZ, Szentmary N, Mathe M, Kovalszky I, Suveges I. Spatial distribution of keratan sulfate in the rabbit cornea following photorefractive keratectomy.J Refract Surg. 2005 Sep-Oct;21(5):485-93. Impakt faktor: 2,399

2. Resch Miklós*, Nagy Zoltán Zsolt*, Szentmáry Nóra*, Máthé Miklós**, Kovalszky Ilona**, Süveges Ildikó*:A glükózaminoglikánok és a keratánszulfát eloszlása és szerepe a nyúlcornea sebgyógyulásában fotoreaktív keratectómia után. *Semmelweis Egytem I. Szemészeti Klinika ** Semmelweis Egytem ÁOK I. Patológiai és Kísértleti Rákkutató Intézet Szemészet (Ophtalmologica Hungarica) 2004./2.(Őszi) száma.

120

Előadások

Füle Tibor, Dr.Máthé Miklós, Dr.Paku Sándor, Dr.Csapó Zsolt(1), Dr.Papp Zoltán(1), Dr.Suba Zsuzsanna(2), Dr.Kovalszky Ilona: A Humán Papillomavírus 16 jelenléte nem epitheliális szövetekben Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, (1)Semmelweis Egyetem I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, (2)Semmelweis Egyetem Szájsebészeti és Fogászati Klinika, Budapest előadás- I.díj 35 éven aluli előadók szabad előadása kategoria. Patológus kongresszus Budapest 2003.09.25-27.

Dr.Máthé Miklós, Füle Tibor, Dr.Suba Zsuzsanna(1), Dr.Kovalszky Ilona: High risk HPV típusok és sejtfelszíni syndecan összefüggései szájüregi laphámrákokban Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, (1)SE Szájsebészeti és Fogászati Klinika, Budapest előadás- II.díj 35 éven aluli előadók szabad előadása kategoria. Patológus kongresszus Budapest 2003.09.25-27.

Füle T. (1), Máthé M.(1), Paku S.(1), Csapó Zs.(2), Szirmai K.(2), Suba Zs.(3), Kovalszky I.: A Humán Papillomavírus 16 jelenléte nem epitheliális szövetekben Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, (2)Semmelweis Egyetem I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, (3)Semmelweis Egyetem Szájsebészeti és Fogászati Klinika, Budapest előadás MOT kongresszus Szeged 2003.11.11. Máthé M., Füle T., Suba Zs.(1 ), Kovalszky I.: High risk HPV típusok és sejtfelszíni syndecan összefüggései szájüregi laphámrákokban

121

Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, (1)Semmelweis Egyetem Szájsebészeti és Fogászati Klinika, Budapest előadás MOT kongresszus Szeged 2003.11.11.

Máthé Miklós *, Füle Tibor*, Papp Zoltán **, Kovalszky Ilona* Stromális syndecan-1 expresszió megjelenése invzív méhnyakrákokban 63. Patológus Kongresszus, 2004 szeptember 23-25, Siófok. * Semmelweis Egytem ÁOK I. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet **Semmelweis Egyetem I. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika II. helyezés, “35 év alatti előadő szabad előadás”

Nemzetközi előadásban társszerzőként: Miklós Resch 1, Zoltán Zsolt Nagy 1, Nóra Szentmáry 1, Miklós Máthé 2, Ilona Kovalszky 2, Ildikó Süveges 1. Der Zusammenhang von Post-PRK Entzündung und Keratansulfat Verteilung in der Hornhaut von Kaeninchen.(Correlation of post-PRK inflammation and Keratan-sulphate distribution in the rabbit cornea) 1-Ist Dep. of Ophtalmology , Semmelweis University, Budapest. 2-Ist Dep. of Pathology and Experimental Cancer Research, Semmelweis university, Budapest. 102nd Annual meeting of DOG (Deutsche Ophtalmologische Geselschaft) 23-27. 09. 2004, Berlin, Germany.

122

Poszter : Abnormalities of syndecan-1 expression in precancerous and malignant lesions of the oral cavity and uterine cervix Miklós Máthé (1), Zsuzsanna Suba (2), Tibor Füle (1), Péter Tátrai (1), Zsolt Németh (2), Zoltán Papp (3) and Ilona Kovalszky (1) (1) 1st Institute of Pathology and Experimental Cancer Research, Semmelweis University, Budapest, Hungary, (2) Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Semmelweis University, Budapest, Hungary, (3) 1st Department of Obstetrics and Gynaecology, Semmelweis University, Budapest FEBS-IUMB Congress, 2-7. Jul.2005, Budapest

123

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki mindazoknak, akik munkámhoz türelmes segítségükkel és szakmai tanácsaikkal hozzájárultak. Külön köszönet illeti témavezetőmet, Prof. Dr. Kovalszky Ilona DSc, egyetemi tanárt, aki vezette és óvta szakmai lépéseimet az elmúlt években. Köszönet Kovács Anitának, aki az utóbbi években nagy segítségemre volt. Külön köszönet, és mély hála illeti illeti volt kollégámat, Dr. Füle Tibort, aki a legtöbb segítséget nyújtotta az indulásnál, és akivel közösen harcoltuk meg ezeket az éveket – és persze, akinek munkája és segítsége nélkül ez a munka nem jött volna létre. Hasonlóképpen Tátrai Péternek, aki emberileg és szakmailag is oly sokszor támaszom volt, és akinek hatalmas érdemei voltak a megjelent cikkeinkben. Hálás vagyok Prof. Dr. Kopper László egyetemi tanárnak, az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet vezetőjének, amiért lehetőséget biztosított, hogy az intézetben

rendelkezésre

álló

sokféle

műszert

és

módszert

használhattam,

elsajátíthattam és alkalmazhattam. Köszönet illeti Dr. Paku Sándort, aki jelentős szakmai és technikai támogatást nyújtott. Külön köszönet Tamási Annának, aki valóságos kincsesháza volt az immunhisztokémiai fogásoknak, és Dr. Krenács Tibornak. Köszönöm a Molekuláris Diagnosztika és Molekuláris Onkofarmakológia Laboratórium minden volt és jelenlegi munkatársának, közvetlen munkatársaimnak, név szerint: Baghy Kornéliának és Bedi Katalinnak a számos kicsinek tűnő, de nélkülözhetetlen segítségért, Egedi Krisztinának, Felletár Györgynének, Hollósi Péternek közös munkánkért. Dr. Jeney András professzornak irányt mutató gondolataiért. László Viktóriának, és külön Dr. Németh Attilának az igen jó tanácsokért. Továbbá Péterfia Bálintnak, Szarvas Tibornak, Tátrai Enikőnek, akikben jóval többet látok, mint egykori kollégát. Oláhné Nagy Júliának külön köszönet , elképesztő mennyiségű technikai tanácsáért és szakmai segítségéért. Diczházi Csabának a szövettanok értékelésében nyújtott segítségéért..

124

Csorba Gézáné Maricának és Dr. Timár Ferencnek a sejttenyésztésben nyújtott segítségükért. Dr. Schönléber Júliannának a grading elkészítéséért. Köszönöm az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet minden munkatársának, hogy munkámat maximális segítőkészségüket élvezve végezhettem. Külön köszönet Dr. Zalatnai Attila DSc, és Prof. Dr. Nagy Péter Tanár Uraknak, emberi példájukért és szakmai útmutatásukért, amit mindig magammal viszek a továbbiakban. Külön köszönöm Dr. Sebestyén Annának, hogy vállalta a házi opponens szerepét, és az ezzel járó hálátlan és fárasztó munkát. Köszönöm az összes kollaboráló klinikusnak a segítséget. Köszönöm Dr. Papp Zoltán Professzor Úrnak, a Semmelweis Egyetem I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika vezetőjének, és Dr. Csapó Zsolt docensnek, a Klinika nőgyógyász-patológusának az együttműködésükért . Külön köszönöm Prof. Dr. Suba Zsuzsanna Egyetemi tanárnak, és kedves munkatársainak a rengeteg segítséget. Köszönöm Neki, és Dr. Németh Zsolt Főorvos Úrnak, hogy a Semmelweis Egyetem Szájsebészeti és Fogászati Klinikájának műtéti anyagaiból a szükséges preparátumokat rendelkezésünkre bocsátották. Köszönöm Dr. Resch Miklósnak, az I. Szemészeti Klinika orvosának az eredményes kollaborációt, - és a barátságát. Köszönetemet fejezem ki Dr. Berencsi Györgynek, aki munkánkat támogatva óriási buzdítást adott nekem és Tibinek. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Sejtanalitikai

munkacsoportjának,

kiváló

volt

évfolyamtársamnak,

Dr.

Sipos

Ferencnek, továbbá Spisák Sándornak, és különösen Dr. Molnár Béla Főorvos Úrnak, hogy lehetővé tették számunkra, és segítették a Mikrolézer berendezés – „mikrodisszektor” – használatát. És végül hálás vagyok szüleimnek, különösen Anyukámnak, Dr. Gáspár Gabriella biológusnak, rengeteg fáradozásáért és türelméért.

125