Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret

Makalah ilmiah-3

The influences of Dexamethasone sodium phosphate to Insulin and Glucose level in young male rats body (Rattus norvegicus) Samsuri1, Rahardjo2 dan Sudjarwo3 1

Pharmacology Veteriner, Faculty of Veterinary Medicine, Udayana University, Jl. P.B. Sudirman, Denpasar Bali 80231, Phone/fax: (0361) 223791 e-mail: [email protected], 2 Pharmacology Division, Medical Faculty Airlangga University, Surabaya, 3 Pharmacology division, faculty of Veterinary Medicine Airlangga University

Abstract This study explores the effects of daily treatment of dexamethsone subcutaneously on insulin and glucose level in young male rats (Rattus norvegicus). Twenty four young male rats 3-4 months old with body weight 200-230 g approximately were divided into two groups (first control group, receiving daily subcutaneous injection of NaCl 0.9% and second group (the name of group negative or treatments group) receiving daily subcutaneous injection of dexamethasone 0.130 mg/kg. The treatment was given for 21 days. Insulin level was measured by radio immunoassay (RIA) and glucose by enzymatic methode (GOD-PAP). The result showed that the second group was significantly increased the insulin level (P<0.05) but significantly decreased the glucose level (P<0.05). The increased of insulin level was higher than the decreased of glucose level. This result indicated that Dexamethasone could decrease insulin signaling in peripheral tissue. The mechanisms may be mediated via decrease of insulin to insulin receptor affinity, phosphorylation of IRS-1, PI3-K, PKC, PKB and NO synthesis accompanied by decrease GLUT4 translocation from sitoplasma to plasma membrane. Finally, to maintenance normal glucose level was needed more insulin than normal. Key words: Dexamethasone, insulin, insulin signaling, and GLUT4.

Pendahuluan Insulin adalah hormon yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas yang berperan pada proses uptake glukosa pada jaringan perifer (otot rangka dan adiposit). Ikatan antara insulin dengan reseptor insulin merupakan pemicu serangkaian proses sinyal subseluler insulin (insulin signaling) yang akhirnya mengakibatkan perpindahan Transporter Glukosa-4 (GLUT-4) dari sitoplasma ke membran sel. Gangguan pada satu atau beberapa tahap proses sinyal subseluler insulin yang disebabkan oleh kelebihan hormon glukokortikoid endogen seperti pada kasus Chusing’s syndrome mengakibatkan hambatan perpindahan GLUT-4 dari sitoplasma ke membran plasma yang berdampak pada kadar insulin dan glukosa dalam plasma (Dimitriadis et.al., 1997). Deksametason (glukokortikoid sintetik) sebagai obat anti-inflamasi yang banyak beredar di masyarakat umumnya digunakan untuk terapi inflamasi Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 1

Makalah ilmiah-3 pada persendian atau arthritis rheumatoid dan alergi. Harganya yang murah dan mudah mendapatkanya mengakibatkan obat ini masih menjadi andalan untuk terapi penyakit tersebut. Pada kasus Chusing’s syndrome, kelebihan glukokortikoid telah menimbulkan banyak masalah seperti resisten insulin, diabetes, osteoporosis, sepsis dan penyakit kardiovaskuler (Katzung, 2001). Penelitian ini dilakukan berdasarkan pengalaman empiris keluarga penulis, yang menggunakan deksametason selama kurang lebih 5 tahun untuk terapi arthritis rheumatoid yang berakhir dengan kematian karena simtoma seperti sepsis, obesitas, dan nefritis interstisial kronis. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian deksametason sodium fosfat secara subkutan yang diberikan sehari satu kali terhadap kadar insulin dan glukosa serum pada tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus). Materi dan metode Bahan yang digunakan adalah deksametason sodium fosfat (Dexamethasone 5 mg/ml, Harsen), NaCl 0,9%, tikus putih jantan (Rattus norwegicus) strain Wistar berumur 3-4 bulan dengan berat badan 0,158 – 0,253 kg, makanan berasal dari COMFEED (P.T. Japfa Comfeed Indonesia) yaitu PAR-L1, kandang, minuman diberikan ad libitum, tissue, spuit, pemusing (sentrifuge) dan alkohol. Alat untuk pemeriksaan insulin terdiri : serum, insulin Ab-coated tubes, insulin yang terlabel radioaktif Iodida (*125I-Insulin), 7 kalibrator insulin (masing-masing kalibrator mengandung insulin 0, 5, 15, 50, 100, 200 dan 350 µIU/ml), human serum-based immunoassay control, aquades (deionized water, tabung polypropylene 12 x 75 mm, pipet mikro (200 µl dan 1000 µl), pipet volumetric (3 ml dan 6 ml), logit-log graph papper, Vortex mixer, Refrigerator, Gamma counter, Decanting rack. Bahan dan alat untuk pemeriksaan glukosa terdiri : standar glukosa, aquades dan reagen (phosphate buffer pH 7,5, phenol, POD (peroxidase), GOD (glucose oksidase), 4-aminoantipyrine), tabung kaca (glass tube), fortex mixer, pelat mikro (micro plate), dan mesin pembaca (automated photometric system) dengan panjang gelombang 500 nm, Hg 546 nm. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan The Posttes-Control Group Design (Zainudin, 2000). Rancangan penelitian terdiri 2 kelompok dengan replikasi 12 ; A adalah kelompok kontrol, hanya diberikan NaCl 0,9% sebanyak 0,5 ml secara subkutan dan B adalah kelompok yang diberikan deksametason sodium fosfat 0,130 mg/kg/hari dalam NaCl 0,9% sebanyak 0,4 – 0,6 ml secara subkutan sesuai dengan berat badan tikus. Perlakuan diberikan sekali dalam sehari selama 21 hari. Pemberian deksametason 0,130 mg/kg berat badan secara subkutan selama 13 hari pada tikus putih pernah dilakukan oleh Barbera et.al (2001) dan deksametason 2µg per hari secara subkutan selama 4 minggu pada tikus putih juga pernah dilakukan oleh Severino et.al., (2002). Pengambilan darah untuk pemeriksaan kadar insulin serum dilakukan pada hari ke-21 melalui intrakardial setelah tikus dianestesi dengan eter secara inhalasi. Pada penelitian ini pengukuran kadar insulin serum menggunakan Coated-ACount Insulin Radio Immuno Assay (RIA) (Fluitest Glu, GOD-PAP, 2001; Coat-ACount Insulin. 2003; Schteingart, 1985) dan kadar glukosa serum menggunakan metode enzimatik regensia GOD-PAP (Glucose GOD FS. DiaSys Diagnostic Systems, 2000; Rat Insulin RIA Kit, 250 Tubes (Cat.#RI-13K), 200; Mudjiono, 2000) yang keduanya dilakukan di RSUD Dr Soetomo Surabaya. Sampel darah yang telah diambil dari hewan coba dipusingkan (sentrifuge) untuk memisahkan serumnya.

Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011 2

Makalah ilmiah-3 Prosedur pemeriksaan kadar insulin serum: (i) Plain Tubes. Pemberian label pada 4 tabung (1-4) yang tidak dilapisi antibodi (uncoated polypropylene tubes) yaitu T (total counts) dan NSB (non-specific binding) masing-masing 2 tabung. (ii) Coated Tubes. Pemberian label pada 14 tabung (5-18) yang terlapisi antibodi terhadap insulin (insulin Ab-coated tubes) yaitu A (maximum binding), B sampai G masingmasing 2 tabung. Pemberian label juga dilakukan pada tabung yang terlapisi antibodi terhadap insulin untuk kontrol dan sampel. (iii) Ditambahkan 200 µl kalibrator nol A (zero calibrator A) pada tabung NSB dan A. Dilanjutkan dengan penambahan 200 µl masing-masing kalibrator (B-G), kontrol (19-22) dan sampel (23-n) yang akan diuji pada masing-masing tabung yang tersedia. Selanjutnya (i) tambahkan 1,0 ml 125I-Insulin dengan segera pada masing-masing tabung dan dihomogenasi dengan vortex mixer, kemudian (ii) inkubasi pada suhu 15-280C selama 18-24 jam, dan (iii) proses decanting lakukan secara hati-hati pada semua tabung (kecuali tabung T tidak dilakukan decanting) selama 2-3 menit. Jika terdapat sisa residu cairan pada ujung tabung, dibersihkan dengan kertas absorben. Diakhiri (iv) pembacaan pada gamma counter selama satu menit. Prosedur pemeriksaan glukosa diawali dengan memasukan sepuluh mikro liter sampel serum/standar/blanko pada pelat mikro dan ditambahkan 1000 µl reagen seperti pada Tabel 1. Tabel 1. Prosedur pemeriksaan glukosa. Bahan Standar/Sampel Aquades Reagen

Blanko 10 µl 1000 µl

Standar/Sampel 10 µl 1000 µl

Setelah dilakukan pencampuran sesuai prosedur, diinkubasikan pada suhu 370C selama 10 menit. Pembacaan absorbansi (A) standar dan sampel dilakukan dengan menggunakan pembaca (automated photometric system) dengan panjang gelombang 500 nm. Batas bawah pembacaan (sensitifitas) kadar glukosa plasma dengan metode Glucose GOD FS /GOD-PAP adalah 1 mg/dl. Data dianalisis secara statistik (Steel, Torrie, 1991) menggunakan Uji T dengan tingkat kepercayaan 5% (α = 0,05). Analisis Uji T ini menggunakan software Statistical Package for The Social Sciences (SPSS) version 10.0 for Windows. Diskusi Pengaruh pemberian deksametason sodium fosfat 0,130 mg/kg secara subkutan selama 21 hari pada tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus) terhadap kadar insulin dan glukosa serum dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Pengaruh deksametason sodium fosfat terhadap kadar insulin dan glukosa serum pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus). No 1 2

Kelompok Jumlah Kadar Glukosa (mg/dl) Kadar Insulin (µIU/ml) a A 12 16.93 ± 05.04 177.08 ± 17.69c b B 12 34.87 ± 13.09 172.33 ± 45.32c Total 24 Superscript : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05) antara kelompok perlakuan.


Makalah ilmiah-3

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian deksametason sodium fosfat 0,130 mg/kg secara subkutan sekali per hari selama 21 hari pada tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus) umur 3-4 bulan meningkatkan kadar insulin serum secara signifikan (P<0,05) yaitu lebih dua kali lipat dibandingkan kontrol dan diikuti dengan penurunan kadar glukosa serum secara signifikan pula (P<0,05) meskipun tidak sebesar perubahan insulin. Hiperinsulinemia ini mengindikasikan telah terjadi penurunan sinyalisasi insulin pada proses uptake glukosa pada jaringan perifer. Hiperinsulinemia yang terjadi merupakan akibat dari kompensasi hiperfungsi sel β terhadap penurunan sinyalisasi insulin pada jaringan perifer seperti pada penelitian yang dilakukan oleh Barbera et.al., (2001) dan Severino, et.al (2002). Penurunan sinyalisasi insulin ini bisa berawal dari penurunan afinitas antara insulin dengan bagian ekstraseluler reseptor insulin yaitu subunit α. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Buren et al., (2002) pada kultur adiposit, deksametason mampu menurunkan afinitas insulin dengan reseptor insulin sampai 40% dari normal. Secara normal hantaran sinyal insulin dimulai dengan terikatnya insulin pada reseptor insulin ekstraseluler subunit α yang menyebabkan autofosforilasi pada subunit β secara berurutan dan peningkatan aktivitas tirosin kinase intrinsik yang merupakan langkah awal reaksi enzimatik yang kompleks. Perubahan konformasi pada daerah subunit β akibat autofosforilasi merupakan dasar penyediaan tempat ikatan bagi protein efektor seperti insulin receptor substrate-1 (IRS-1) (Davani, 2003; Ducluzeau, et.al., 2002; Ebeling, et.al., 1998; Katzung, 2001; Sedaghat, et.al., 2002; Zang, 2002). Kedua, deksametason menghambat fosforilasi tirosin pada IRS-1 yang merupakan mediator penting pada penghantaran sinyal insulin. IRS-1 merupakan bagian terbesar IRS terfosforilasi tirosin yang diinduksi oleh stimulasi insulin pada otot rangka dan adiposit manusia (Anne, et.al., 2003; Ducluzeau, et.al., 2002). Fosforilasi tirosin pada IRS-1 yang terhambat mengakibatkan penurunan afinitas IRS-1 dengan phosphotidylinositol-3-OH kinase (PI3K) yang lebih selanjutnya dapat menyebabkan keadaan resisten insulin (Buren, 2002). Ketiga penurunan sinyalisasi insulin disebabkan oleh penurunan aktivitas PI3K. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Buren, et.a.l (2002) pada kultur adiposit, deksametason mampu menurunkan aktivasi PI3K sampai 20% dan PKB 40%. PI3K adalah enzim heterodimer yang terdiri dari subunit regulator p85 dan subunit katalitik p110. IRS yang terfosforilasi pada bagian tirosin, menyediakan tempat ikatan untuk subunit regulator (p85) yang kemudian mengaktivasi subunit katalitik (p110) dari PI3K. PI3K yang teraktivasi secara khusus memfosforilasi PI(3,4)P2 untuk membentukan PI(3,4,5)P3 yang diperlukan untuk aktivasi PKC atipikal dan protein kinase B (PKB) secara langsung maupun melalui peningkatan aktivitas 3phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK-1) yang berperan penting untuk translokasi GLUT4 (Davani, 2003; Farese, 2002; Letiges, et.al., 2002; Mendez, et.al., 1997). Aktivasi PI3K yang terhambat dapat menurunkan pembentukan PI(3,45)P3 dari PI(3,4)PI2 sebagai mediator penting untuk aktivasi PKC dan PKB. Berdasarkan proses aktivasinya, PKC dapat digolongkan menjadi tiga kelompok; atypical PKCs (λ, ζ, ι) membutuhkan PIP3, sedangkan conventional PKCs (α, β1, β2, dan γ) dan novel PKCs (δ, ε, η, dan θ) membutuhkan DAG untuk proses aktivasinya. Aktivasi PKC atipikal (tidak membutuhkan DAG tetapi PIP3 ) sangat diperlukan sebagai terminal molecular switches on perpindahan GLUT4 dari sitoplasma ke membran plasma, karena GLUT-4 bertanggung jawab pada proses uptake glukosa pada sebagian besar jaringan terutama pada jaringan otot dan


Makalah ilmiah-3 lemak (Anne, et.al., 2003; Dimitriadis, et.al., 1997; Ducluzeau, et.al., 2002; Ebeling, et.al., 1998; Zang, 2002). PKC atipikal merupakan bagian penting pada patogenesis dan terapi diabetes melitus tipe 2 dan sindrom resisten insulin (Farese 2002; Gaster et.al., 2001; Letiges et.al., 2002; Sedaghat et.al., 2002; Wang et.al., 2000). Faktor lain yang telah diketahui yang mempunyai peran pada proses uptake glukosa adalah NO (nitric oxide). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Brett et.al. (2003) dan Wallerath et.al. (1999), deksametason menurunkan kemampuan GTP cyclohydrolase-1 untuk menghasilkan tetrahydrobiopterin (BH4). BH4 berfungsi sebagai stabilisator endothelial nitric oxide synthase (eNOS) dimmer dan meningkatkan afinitas eNOS terhadap arginin untuk menghasilkan NO. Berdasarkan penelitian ini diperkirakan bahwa akibat dari kompensasi hiperfungsi sel β pakreas untuk mensintesis insulin, dengan jumlah yang lebih besar dari normal terhadap penurunan sinyalisasi insulin proses uptake glukosa pada jaringan perifer dan penurunan produksi NO. Kesimpulan Pemberian deksametason 0,130 mg/kg secara subkutan selama 21 hari pada tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus) mengakibatkan peningkatan kadar insulin serum secara signifikan (P<0,05) dan penurunan kadar glukosa serum secara signifikan pula(P<0,05). Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui (i) pengaruh pemberian deksametason secara subkutan pada tikus putih jantan muda terhadap kadar insulin dan glukosa serum dengan waktu yang lebih lama untuk mengetahui efek diabetogeniknya, (ii) intervensi yang tepat untuk mencegah atau menghambat efek deksametason yang meningkatkan kadar insulin serum. Daftar pustaka Anne MJ, Luciano P, Emmanuel VO, 2003. Molecular Mechanisms of Insulin Receptor Substrate Protein-Mediated Modulation of Insulin Signaling. FEBS Letters 546: 32-36. Barbera M, Fierabracci V, Novelli M, Bombara M, Masiello P, Bergamini P, De Tata V, 2001. Dexamethasone Induced Insulin Resistance and Pancreatic Adaptive Response in Aging Rat Are Not Modified by Oral Vanadyl Sulfate Treatment. Europ J Endocrinol 145:799-806. Brett MM, Anne MD, Clinton RW, 2003. GTP Cyclohydrolase-1 Downregulation Contributes to Glucocorticoid Hypertension in Rats. Hypertens 41(2):669-674. Buren J, 2002. Glucose and Lipid Metabolism in Insulin Resistance. An Experimental Study in Fat Cells. Dissertations, Umea University, Sweden. Buren J, Liu HX, Jensen J, Eriksson JW, 2002. Dexamethasone Impairs Insulin Signalling and Glucose Transport by Depletion of Insulin Receptor Subtrate-1, Phosphatidylinositol 3-Kinase and Protein Kinase B in Primary Cultured Rat Adipocytes. Eur J Endocrinol 146:419-429. Coat-A-Count Insulin. 2003. DPC. Diagnostic Product Corporation. Los Angeles, USA.


Makalah ilmiah-3 Davani B, 2003. Increased Glucocorticoid Sensitivity in Pancreatic β-cells: Effects on Glucose Metabolism and Insulin Release. Thesis, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. Dimitriadis G, Leighton B, Parry-Billings M, Sasson S, Young M, Krause U, Bevan S, Piva T, Wegener G, Newsholme EA, 1997. Effects of Glucocorticoid Excess on The Sensitifity of Glucose Transport and Metabolism to Insulin in Rat Skeletal Muscle. Biochem J 321:707-712. Ducluzeau PH, Fletzher LM, Vidal H, Laville M, Tavare JM, 2002. Molecular Mechanisms of Insulin-Stimulated Glucose Uptake in Adipocytes. Diabetes Metab (Paris) 28:85-92. Ebeling P, Koistinen HA, Koivisto VA, 1998. Insulin-Independent Glucose Transport Regulates Insulin Sensitifity. FEBS Letters 436:301-303. Farese RV, 2002. Function and Dysfunctionof aPKC Isoforms for Glucose Transport in Insulin-Sensitive and Insulin-Resistant State. Am J Physiol Endocrinol Metab 283:E1-E11. Fluitest Glu, GOD-PAP, 2001. Biocon Diagnostik, Germany. Gaster M, Staehr P, Beck-Nielsen H, Schroder HD, Handberg A, 2001. GLUT4 is Reduced in Slow Muscle Fibers of Type 2 Diabetic Patients: Is Insulin Resistance in Type 2 Diabetes a Slow, Type 1 Fiber Disease? (Statistical Data Included). Diabetes 50:1324-1329. Glucose GOD FS. DiaSys Diagnostic Systems, 2000. Gmbh, Holzheim, Germany. Katzung BG, 2001. Basic and Clinical Pharmacology. 8th Ed. Lange Medical Book/McGraw-Hill, Medical Publishing Devision, USA. Letiges M, Plomann M, Standaert ML, Bandyopadhyay G, Sajan MP, Kanoh Y, Farese RV, 2002. Knockout of PKCα Enhances Insulin Signaling Through PI3K. Mol Endocrinol 16(4):847-858. Mendez R, Kollmorgen G, White MF, Rhoads RE, 1997. Requirement of Protein Kinase Cζ for Stimulation of Protein Synthesis by Insulin. Mol and Cell Biol 9:5184-5192. Mudjiono T, 2000. Efek Oksigen Tekanan Tinggi Terhadap Kadar Insulin Darah dan Glukosa Darah Pada Penderita Diabetes Melitus. Tesis, Universitas Airlangga, Surabaya. Rat Insulin RIA Kit, 250 Tubes (Cat.#RI-13K), 2001. The Linco Research Inc. Schteingart DE, 1985. Patofisiologi Konsep Klinik Proses-Proses Penyakit. Edisi 2, Alih Bahasa: Adji Dharma, EGC, Jakarta. Hal 300-310. Sedaghat AR, Sherman A, Quon MJ, 2002. A Mathematical Model of Metabolic Insulin Signaling Pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab 283:E1084-E1101.


Makalah ilmiah-3 Severino C, Brizzi P, Solinas A, Secchi G, Maioli M, Tonolo G, 2002. Low-dose Dexamethasone in The Rat: A Model Study Insulin Resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab 283:E367-E373. Steel RGD, Torrie JH, 1991. Prinsip dan Prosedur Statistik. Suatu Pendekatan Biometrik. Ed 1, Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Wallerath T, Witte K, Schafer SC, Schwarz PM, Prellwitz W, Wohlfart P, Kleinert H, Lehr HA, Lemmer B, Fostermann U, 1999. Downregulation of The Expression of Endothelial NO Synthase is Likely to Contribute to Glucocorticoid Mediated Hypertension. PNAS 96(23):13357-13362. Wang L, Hayashi H, Kishi K, Huang L, Hagi A, Tamaoka K, Hawkins PT, Ebina Y, 2000. Gi-Mediated Translocation of GLUT4 is independent of p85/p110α and p110γ Phosphoinositide 3-Kinase But Might Involve The Activation of Akt Kinase. Biochem J 345:543-555. Zainudin, 2000. Metodologi Penelitian. Universitas Airlangga, Surabaya. hal.53-54. Zang BB, 2002. Insulin Signaling and Action: Glucose, Lipids and Protein. Diabetes and Carbohydrate Metabolism, Editors; Goldfine, I.D. dan Rushakoff, R.J. Endotex.com.


Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret

Recommend Documents