De rol van exosomen in het tumor ecosysteem

De rol van exosomen in het tumor ecosysteem Edward Geeurickx

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Dr. Ir. An Hendrix Begeleider: Jan Van Deun Vakgroep: Laboratorium voor Experimenteel Kankeronderzoek UZGent, 1P7

Academiejaar 2014-2015

De rol van exosomen in het tumor ecosysteem Edward Geeurickx

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Dr. Ir. An Hendrix Begeleider: Jan Van Deun Vakgroep: Laboratorium voor Experimenteel Kankeronderzoek UZGent, 1P7

Academiejaar 2014-2015

De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.

08/05/2015

Naam en handtekening student:

Naam en handtekening promotor:

Voorwoord Het schrijven van deze thesis en het uitvoeren van het onderzoek was zeker geen ‘one man job’, daarom wil ik in dit voorwoord gebruik maken van de kans om iedereen die me tijdens het onderzoek en het schrijven ondersteund en geholpen heeft te bedanken. Eerst en vooral wil ik mijn promotor Dr. Ir. An Hendrix bedanken voor het uitkiezen en uitstippelen van een boeiend onderzoeksproject waar ik gedurende een heel jaar aan kon werken en door gepassioneerd ben geraakt. Ook mijn begeleider Jan Van Deun zou ik willen bedanken voor de vele uren die hij in mij heeft geïnvesteerd om mij op te leiden en mijn scriptie keer na keer na te lezen. Zonder zijn raad, hulp en opmerkingen zou deze scriptie niet half zo mooi zijn als hij nu is. Speciale dank gaat ook uit naar Prof. Dr. Olivier De Wever en Prof. Dr. Marc Bracke omwille van hun inbreng in dit onderzoeksproject. Zonder de discussies tijdens de donderdag vergaderingen zouden sommige zaken die in de scriptie staan over het hoofd gezien zijn. Graag zou ik ook alle collega’s van het Laboratorium voor Experimenteel Kankeronderzoek willen bedanken voor alle hulp die ik heb gekregen tijdens het uitvoeren van mijn experimenten, maar vooral ook voor de leuke sfeer op de werkvloer. Tot slot zou ik ook alle studenten die hun thesis deden in het Laboratorium voor Experimenteel Kankeronderzoek willen bedanken voor de onderlinge steun en hulp, en voor de leuke tijden die we samen beleefd hebben.

Inhoud Samenvatting .............................................................................................................................. 1

1.Inleiding .................................................................................................................................. 3 1.1 Intercellulaire communicatie ............................................................................................ 3 1.2 Exosomen ......................................................................................................................... 3 1.2.1 Samenstelling ............................................................................................................. 3 1.2.2. Biogenese .................................................................................................................. 5 1.2.3. Functie....................................................................................................................... 5 1.3 Exosomen en hun fysiologische functie ........................................................................... 6 1.4 Kanker .............................................................................................................................. 7 1.4.1 Translatie-gerelateerde eiwitten en kanker ................................................................ 8 1.4.2 Exosomen en kanker .................................................................................................. 9 1.5 Doelstellingen ................................................................................................................. 11

2. Materialen en methoden ....................................................................................................... 12 2.1 Algemeen ........................................................................................................................ 12 2.1.1 Buffers...................................................................................................................... 12 2.1.2 Cellijnen ................................................................................................................... 13 2.1.3 Antilichamen ............................................................................................................ 13 2.2 Celcultuur ....................................................................................................................... 14 2.3 Exosoom isolatie............................................................................................................. 15 2.4 Nanoparticle tracking analysis ........................................................................................ 16 2.5 Lysaten en eiwitconcentratiemeting ............................................................................... 17 2.6 Eiwit analyse................................................................................................................... 18 2.6.1 SDS-PAGE .............................................................................................................. 18

2.6.2 Western blot ............................................................................................................. 19 2.6.3 Immunokleuring ....................................................................................................... 20 2.7 Analyse massaspectrometrie data ................................................................................... 21

3. Resultaten ............................................................................................................................. 22 3.1Validatie van exosoom isolatie via ‘top-down’ gradiënt. ................................................ 22 3.2 Translationele eiwitten zijn aangerijkt in MCF7-Rab27B exosomen. ........................... 23 3.3 Analyse van eiwitten van interesse in exosomale fracties. ............................................. 25 3.4 Analyse van translationele eiwitten in overige fracties van ‘top-down’ gradiënt. ......... 26 3.5 Validatie via ‘bottom-up’ gradiënt ................................................................................. 28 3.6 Vergelijking van p53 activiteit in Rab27B overexpresserende cellen. ........................... 30

4. Bespreking ............................................................................................................................ 32

5. Referenties ............................................................................................................................ 38

Samenvatting Exosomen zijn nanovesikels bestaande uit een dubbele lipidenmembraan met een diameter van 30 tot 100 nm. Ze worden gesecreteerd door alle soorten cellen en vervullen een zeer belangrijke rol in intercellulaire communicatie. Ze kunnen signaalmoleculen bevatten onder de vorm van eiwitten, RNAs en lipiden en deze specifiek overbrengen van één cel naar een andere. De functie ervan wordt vooral bestudeerd in kanker omdat er geweten is dat kankercellen gebruik maken van exosomen om verschillende barrières te overwinnen. Rab27B is een eiwit dat betrokken is bij de vrijstelling van exosomen, en recent is aangetoond dat overexpressie van dit eiwit in MCF7 borstkankercellen een verhoogde graad van invasie en metastasering met zich meebrengt zowel in vivo als in vitro. In dit onderzoek gaan we na welke eiwitten, aanwezig in de exosomen, verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de verhoogde graad van invasie van deze cellijn. Uit de resultaten van tandem massaspectrometrie op exosomen van Rab27B overexpresserende cellen en controle exosomen kan men aantonen dat Rab27B exosomen sterk zijn aangereikt met translationele eiwitten die een rol spelen in eiwitmetabolisme. Eiwitten die een mogelijke rol zouden kunnen hebben in tumorigenese werden geselecteerd uit deze groep: de ribosomale subunits RPS7 en RPS20, ribonucleoproteïne hnRNPQ, translatie intiatiefactor eIF3f en translatie elongatiefactor eEF2. De aanwezigheid van deze eiwitten werd nagegaan in exosomen, geïsoleerd volgens een ‘top-down’ of ‘bottom-up’ densiteitsgradiënt, van MCF7 cellen getransfecteerd met GFP, Rab27B, Rab27A en de dominant negatieve mutant Rab27B-T23N als ook in T47D cellen getransfecteerd met GFP en Rab27B. De eiwitten van interesse werden enkel in significante mate terug gevonden in de exosomale fracties van MCF7-Rab27B cellen geïsoleerd volgens een ‘top-down’ gradiënt, maar ook in de bovenste fracties van de ‘topdown’ gradiënt en onderste fracties van de ‘bottom-up’ gradiënt van alle gebruikte cellen. Behalve voor eEF2 kan er niet geconcludeerd worden dat deze eiwitten effectief aangereikt zijn in exosomen, maar het lijkt wel aanneembaar dat deze eiwitten voorkomen in dense complexen onder de vorm van stress granules en verhoogd gesecreteerd worden door Rab27B overexpresserende cellen. Ook kan er aangetoond worden dat de tumorsuppressor P53 minder gefosforyleerd is, dus minder geactiveerd, in cellen getransfecteerd met Rab27B. Aangezien de ribosomale eiwitten RPS7 en RPS20 beiden de activiteit van P53 op een positieve wijze kunnen reguleren lijkt het aannemelijk dat een verhoogde secretie van deze eiwitten door Rab27B transfectie een verlaagde P53 activiteit met zich meebrengt. Dit zou een reden kunnen zijn voor de verhoogde invasiviteit van deze cellen.

1

Abstract Background. Exosomes are nanovesicles with a diameter of 30-150 nm that contain multiple signalling molecules in the form of proteins, RNAs and lipids. Overexpression of the small GTPase Rab27B, a protein responsible for secretion of exosomes, increases the growth and invasiveness of estrogen receptor positive breast cancer cells in vivo and in vitro. Methods. We isolated exosomes from MCF7 and T47D breast cancer cells transfected with GFP, Rab27A, Rab27B, and a dominant negative mutant Rab27B-T23N via a top-down and bottom-up discontinuous iodixanol density gradient. The presence of translational proteins previously identified to be differentially expressed in exosomes by quantitative mass spectrometry analysis (RPS7, RPS20, hnRNPQ, eIF3f and eEF2) was validated by Western blot analysis. Results. The proteins of interest were found in both exosomal and upper fractions of the topdown gradient from MCF7-Rab27B cells, while only in the lower fractions of bottom-up gradients of these cells and in the upper fractions of top-down gradients of the other cell lines. There was a slight difference in the amount of ribosomal proteins secreted by Rab27B transfected cells in contrast to GFP control cells, and it also seemed that p53 is less phosphorylated in Rab27B transfected cells in contrast to GFP control cells. Conclusions. From these experiments we cannot conclude that the proteins of interest, except eEF2, are enriched in exosomes derived from Rab27B transfected cells. But we can say that overexpression of Rab27B causes inhibition of the p53 pathway, and that this is probably caused by increased ribosomal protein secretion.

2

1.Inleiding 1.1 Intercellulaire communicatie Voor de overleving van multicellulaire organismen is het van groot belang dat cellen onderling met elkaar kunnen communiceren om bijvoorbeeld de homeostase van verschillende organen te onderhouden of reacties op gang te brengen tegen specifieke extraof intracellulaire pathogenen. Voor het onderhouden van deze communicatie hebben cellen verschillende efficiënte mechanismen ontworpen zoals interactie tussen membraaneiwitten van verschillende cellen, secretie van eiwitten in het extracellulair milieu zodanig dat ze kunnen opgenomen worden of interageren met membraaneiwitten van andere cellen, en zelfs het vormen van intercellulaire bruggen, zoals nanotubes, waardoor signaalmoleculen kunnen worden doorgegeven [1], [2]. De laatste 20-30 jaar is de interesse in een nieuwe geconserveerde

vorm

van

intercellulaire

communicatie

sterk

gestegen,

namelijk

communicatie via extracellulaire vesikels. Cellen kunnen verschillende vesikels, die eiwitten en nucleïnezuren bevatten, afscheiden in het extracellulair milieu die dan weer kunnen interageren met andere cellen. Deze vesikels kunnen sterk verschillen van elkaar op basis van inhoud, grootte en biogenese. Zo is er bijvoorbeeld sprake van apoptotische lichamen (> 800 nm), microvesikels (0.1-1 µm) en exosomen (30-150 nm) [2]. Deze laatste zijn onderwerp geworden van tal van publicaties (n=3585), en het aantal artikels met betrekking tot exosomen blijft jaar na jaar stijgen als gevolg van hun uitgebreide rol in zowel homeostase als pathogenese.

1.2 Exosomen 1.2.1 Samenstelling Bekeken via elektronenmicroscopie (EM) zijn exosomen nanovesikels met een diameter van 30-150 nanometer (nm) omgeven door een dubbele lipidemembraan. Deze membraan is aangerijkt aan karakteristieke lipiden zoals sfingomyeline, fosfatidylserine, cholesterol en verschillende verzadigde vetzuren. Onderzoek op deze nanovesikels heeft aangetoond dat ze door alle cellen worden gesecreteerd in het extracellulair milieu en dat hun lumen is gevuld met specifieke cytosolische eiwitten en RNA-species van de cel van herkomst. Ook hebben ze

3

cytoplasmatische membraan (CPM)-eiwitten van de cel van oorsprong geïntegreerd in hun membraan (Fig.1.1).

Figuur 1.1 Schematische voorstelling van exosomen. De exosomale membraan bestaat uit verschillende karakteristieke lipiden en proteïnen en hun lumen is gevuld met verschillende proteïnen en RNA-species [3].

De effectieve inhoud van exosomen is verschillend en hangt af van het celtype waardoor ze gesecreteerd worden [3]–[5]. Zo bezitten exosomen van de minder invasieve MCF-7 borstkanker cellijn minder eiwitten voor het onderhoud van de extracellulaire matrix (ECM) dan exosomen van de sterk invasieve MDA-MB 231 cellijn [6]. Een andere variabele die de exosoominhoud medebepaald is de status waarin de cel zich bevindt. Zo kan er bijvoorbeeld een stijging optreden van de concentratie proteïnen betrokken in celoverleving in exosomen van endotheelcellen die onderworpen worden aan hypoxie [7]. Exosomen kunnen onderscheiden worden van andere extracellulaire vesikels, zoals grotere microvesikels en apoptotische lichaampjes, door middel van elektronenmicroscopie waarbij ze een karakteristieke sferische tot bekervormige vorm vertonen. Ze kunnen echter ook onderscheiden worden door de aanwezigheid van bepaalde merkereiwitten zoals het tetraspanine CD63, Alix, Tsg101 en HSP70, die allen geassocieerd zijn met de specifieke pathway voor exosoom productie. Deze merkereiwitten kunnen gebruikt worden voor de validatie van exosoomisolatie via Western blot en voor de visualisatie van exosomen door EM met antilichamen gericht tegen deze eiwitten gekoppeld aan goudpartikels [3]–[5]. Er zijn reeds veel methoden beschreven over de isolatie van exosomen uit cultuurmedium, maar bij de meeste methoden is de isolatie niet zuiver door contaminatie van grote eiwitagglomeraten en andere extracellulaire vesikels. De meest zuivere isolatietechniek maakt

4

gebruik van ultracentrifugatie op een discontinue iodixanol gradiënt, waarbij de nanovesikels gescheiden worden van andere vesikels en eiwitagglomeraten op basis van hun densiteit [8]. 1.2.2. Biogenese Exosomen ontstaan uit de membraan van late endosomen. Endosomen zijn intracellulaire vesikels die ontstaan door invaginatie van de CPM en vervolgens verder matureren tot late endosomen waarvan het merendeel voornamelijk wordt afgebroken door lysosomen [9], [10]. Endosomen die niet afgebroken worden in lysosomen kunnen verder matureren en fuseren met andere endosomen. Van deze grote late endosomen kan de membraan vervolgens invagineren met de vorming van multivesikulaire endosomen (MVE). Door dit laatste fenomeen, wat gereguleerd wordt door het endosomal sorting complex required for transport (ESCRT), kunnen cytosolische moleculen opgenomen worden in de intraluminale vesikels (ILV) en kunnen CPM-eiwitten met hun extracellulair deel naar buiten gericht geïntegreerd worden in de membraan. MVE’s kunnen vervolgens afgebroken worden in lysosomen of naar de CPM gebracht worden, waar door versmelting met de CPM de ILV’s vrijgesteld worden in het extracellulair milieu als exosomen (Fig.2.2) [3]–[5]. Onderzoek heeft aangetoond dat het transport van MVE’s naar de CPM en de fusie van beide membranen gereguleerd wordt door de Rab GTPasen Rab27A en Rab27B. Inhibitie van deze twee eiwitten resulteert in grotere en minder mobiele MVE’s en kleinere en meer mobiele MVE’s respectievelijk, wat er op wijst dat Rab27A een rol speelt in het transport van deze MVE’s naar de CPM via het cytoskelet en dat Rab27B een rol speelt in de docking van deze endosomen aan de CPM. Tevens wordt er ook een significante vermindering van exosoomvrijstelling waargenomen bij de inhibitie Figuur 2.2: Exosomen ontstaan door invaginatie van de membraan van late endosomen met de vorming van MVBs en hebben een andere oorsprong dan andere extracellulaire vesikels [3].

van deze twee eiwitten [11].

1.2.3. Functie Oorspronkelijk ging men er van uit dat exosomen enkel een rol speelden bij de excretie van cellulaire producten die niet langer een functie hadden in de cel [3]. Verder onderzoek heeft

5

ook geleid tot het erkennen van exosomen als intercellulair communicatiemiddel aangezien ze informatiedragers bevatten onder de vorm van proteïnen, lipiden en RNA-species die ze kunnen overbrengen van de ene cel naar de andere [3]–[5]. Deze vorm van communicatie heeft een groot voordeel in vergelijking met oplosbare exocytose van informatiedragers. Doordat de eiwitten en RNA-species omringd zijn door een dubbele lipidemembraan, zijn deze informatiedragers beschermd tegen afbraakmechanismen die zich voordoen in de ECM. Door dit voordeel hebben de signaalmoleculen een langere levensduur waardoor ze grotere afstanden kunnen overbruggen en dus meer cellen kunnen bereiken [2], [12]. Exosomen kunnen hun informatie op drie manieren overbrengen naar de doelwitcel. Ten eerste door interactie tussen membranaire eiwitten van exosoom en doelwitcel waardoor een intracellulaire signaaltransductie wordt gestart. Ten tweede via fusie van beide membranen waardoor de exosoominhoud in de doelwitcel terecht komt en membraaneiwitten in de CPM van de doelwitcel geïntegreerd worden. Ten derde via actieve endocytose waarbij de exosomale membraan intracellulair wordt afgebroken en de informatiedragers in de doelwitcel terecht komen [3]–[5] . De communicatie via de exosomale pathway kan zowel specifiek als aspecifiek zijn. Bij informatie-overdracht aan een specifieke doelwitcel treedt er waarschijnlijk interactie op tussen cel-specifieke membraan eiwitten van doelwitcel en exosoom [3]–[5].

1.3 Exosomen en hun fysiologische functie Zoals eerder vermeld spelen exosomen een rol in de opruiming van cellulaire eiwitten die niet langer een functie hebben in de cel. Dit hebben Barré en collega’s kunnen bewijzen door onderzoek op het maturatieproces van ratreticulocyten tot erythrocyten, waarbij de reticulocyt zijn kern verliest samen met vele andere membraan- en cytosolische eiwitten. Ze hebben kunnen aantonen dat zowel cytosolische als membranaire eiwitten selectief in het lumen van ILV’s gesorteerd worden en dat de vrijgestelde exosomen opgenomen worden door macrofagen voor degradatie en dit door een galactoside-gereguleerd proces [13]. Dit wil zeggen dat reticuloctyen gebruik maken van de exosomale pathway om zich te ontdoen van cellulaire producten en vervolgens als erythrocyt in de circulatie terecht te komen. Veel interesse gaat uit naar de rol van exosomen in de modulatie van het immuunsysteem aangezien ze gebruikt kunnen worden om antigenen (Ag) over te brengen naar immuuncellen

6

om zo een specifieke, Ag-gerichte immuunreactie uit te lokken. De exosomen van mastcellen bijvoorbeeld kunnen zowel in vitro als in vivo de secretie van Ag-specifieke antilichamen induceren. Dit doen ze door geëndocyteerde Ag selectief te incorporeren in het lumen van ILV’s met behulp van de heat shock proteïnen Hsp60 en Hsc70. Deze ILV’s worden vervolgens vrijgesteld in het extracellulair milieu waar ze opgenomen worden door natieve dendritische cellen waardoor deze laatste geactiveerd worden. De geactiveerde dendritische cellen kunnen dan uiteindelijk de Ag presenteren aan B- en T-cellen om zo een selectieve immuunreactie uit te lokken. De Ag-presentatie blijkt bijna 20 keer effectiever te zijn met behulp van exosomen in vergelijking met oplosbare antigenen [14]. Omwille van hun rol in Ag-presentatie is er veel interesse naar het gebruik van kanker exosomen voor de behandeling van tumoren. Men zou patiënten kunnen behandelen met kankerexosomen, die kanker-Ag bezitten, met het doel om een tumor-specifieke immuunrespons uit te lokken. Frühbeis en collega’s hebben kunnen aantonen dat exosomen afkomstig van oligodendrocyten selectief worden opgenomen door neuronen en dat deze exosomen bescherming bieden tegen oxidatieve stress en een tekort aan nutriënten. De vrijstelling van deze nanovesikels wordt gestimuleerd door secretie van de neurotransmitter glutamaat door de neuronen zelf, wat wijst op een gereguleerde exosoomvrijstelling. Ook hebben ze kunnen aantonen dat de inhoud van deze exosomen functioneel gerecupereerd kan worden in de doelwitcel, en dit zowel in vitro als in vivo. De internalisatie van de exosomen gebeurde hierbij volgens een clathrine- en dynamine-gerelateerde vorm van endocytose [15]. Met dit onderzoek kon de onderzoeksgroep van Frühbeis aantonen dat exosomen een rol spelen in gerichte intercellulaire communicatie. Dit zijn slechts enkele voorbeelden waarin exosomen dagdagelijks een rol spelen. Wellicht zijn er nog vele andere voorbeelden, maar omwille van hun rol in pathogene processen blijft deze kennis beperkt en spitst men zich meer en meer toe op de “slechte kant” van exosomen.

1.4 Kanker Onder normale omstandigheden wordt de homeostase van weefsels gereguleerd op celniveau door stimulatie of inhibitie van groei en migratie onder invloed van intrinsieke of extrinsieke signalen. Als deze strikte signalisatie ontregeld wordt dan kan het celaantal lager of hoger worden dan in normale omstandigheden. In het laatste geval kan het zijn dat de nieuwgevormde cellen het weefsel gaan overwoekeren. Dit noemen we neoplasie en in geval

7

van belemmering van de normale functie van het weefsel, kanker. Ontregeling van deze signalisatie is veelal het gevolg van gain of function (“winst van functie”) mutaties in genen verantwoordelijk voor celgroei (oncogenen), of door loss of function (“verlies van functie”) mutaties in genen die coderen voor apoptose-inducerende of celcyclus-vertragende eiwitten (tumor suppressors) [16]. Mutaties in deze genen alleen is niet voldoende voor het ontstaan van kanker: de ontregelde cellen moeten eerst verschillende barrières overwinnen opdat ze het weefsel kunnen koloniseren en eventueel zelfs migreren naar andere weefsels. De belangrijkste en meest bestudeerde barrières zijn onder andere het ontwijken van celgroeionderdrukkende signalen, onderhouden van celgroei-inducerende signalen, inductie van angiogenese, vermijden van celdood en ontwijken van het immuunsysteem. Hoe meer van deze barrières overwonnen zijn, hoe slechter de prognose voor de patiënt [17]. 1.4.1 Translatie-gerelateerde eiwitten en kanker Hoewel het voor de hand ligt dat eiwitten die een rol spelen in translatie een invloed zouden kunnen hebben op kanker ontwikkeling, is er pas recent een toenemende interesse in deze eiwitten en hun mogelijke rol in tumorigenese. Dit komt omdat men tot enkele jaren terug de toegenomen translationele activiteit zag als een gevolg op de toegenomen proliferatie van kankercellen, zodat de cel voldoende wordt voorzien van essentiële eiwitten. Dit kon men afleiden uit de grotere nucleoli van kankercellen waar de aanmaak van ribosomen wordt geregeld [18]. Zo blijkt dat de activiteit van verschillende initiatiefactoren waaronder eIF2,3,4,5 sterk verhoogd is in verschillende kankers waardoor in deze cellen translatie sneller van start kan gaan [19]. Dit is een logisch gevolg op overexpressie van initiatiefactoren, maar dit is niet altijd zo bij overexpressie van subunits van deze eiwitcomplexen. Elke subunit kan een aparte functie uitoefenen die proliferatie ten goede of ten slechte kan komen. Zo is de expressie van subunit eIF3f sterk verlaagd in verschillende kankers en krijgt het een tumorsupressor functie toegeschreven omwille van zijn celgroei vertragend effect, terwijl er een overexpressie is beschreven van eIF3a,c,e in andere kankers en ze daarom oncogenen worden genoemd (16,17). Ook ribosomale eiwitten blijken verschillende functies te kunnen vervullen in tumorigenese. Onder normale omstandigheden vormen deze eiwitten samen met initiatiefactoren en ribosomale RNA’s (rRNA) het 80S ribosoom dat instaat voor het gehele translatieproces. Echter, onder stress situaties, waar kankercellen vaak het slachtoffer van zijn, kunnen deze

8

ribosomale eiwitten uit elkaar vallen en interfereren met de MDM2-p53 pathway waardoor de tumorsupressor p53 geactiveerd wordt en de celcyclus gestopt wordt [21]. De meeste ribosomale eiwitten doen dit door te binden met MDM2 waardoor de ubiquitine-ligase activiteit van dit proto-oncogen wordt geïnhibeerd en dus p53 niet meer afgebroken wordt door het proteasoom [22]. Door deze extra-ribosomale functies worden sommige ribosomale eiwitten ook tumorsuppressors genoemd. 1.4.2 Exosomen en kanker Kankercellen communiceren met elkaar en met de omliggende cellen van het stroma met als doel een verhoogde graad van proliferatie te bekomen en invasie in de omringende weefsels te induceren. Ook in de intercellulaire communicatie tussen kankercellen spelen exosomen een grote rol. Ze kunnen zowel oncogene factoren overbrengen naar cellen in de directe omgeving om het aantal tumorale cellen te vergroten, maar ze kunnen ook door hun kleine afmetingen in de bloed- of lymfebaan geraken om zo cellen op distale plaatsen te bereiken en deze te stimuleren tot het vormen van een metastatische niche voor eventuele circulerende tumor cellen (CTC) [23]. Met recent onderzoek konden Webber en collega’s aantonen dat mild invasieve prostaatkankercellen communiceren met stromale fibroblasten via de exosomale pathway. Ze kunnen fibroblasten induceren tot expressie van α-smooth muscle actin (α-SMA), wat een kritische merker is voor de differentiatie tot myofibroblasten. Myofibroblasten komen vaak voor in het stroma van kankers en kunnen de groei van tumoren reguleren door middel van angiogenese. De transformatie van deze fibroblasten is het gevolg van activatie van de SMAD3-afhankelijke signaalbaan door de Transforming Growth Factor (TGF)-β. TGF-β werd inderdaad gevonden op de exosomale membraan en is in staat om myofibroblastdifferentiatie te induceren. De gevormde myofibroblasten bleken uiteindelijk in staat om in vitro angiogenese te induceren, en de kankerexosomen konden ook in vivo angiogeneseinducerende myofibroblasten induceren. Myofibroblasten die gedifferentieerd waren via oplosbaar TGF-β konden geen angiogenese induceren. Dit wijst dus op een specifieke exosomale interactie met stromale cellen via TGF-β die de groei van de tumor op een positieve wijze reguleert, en die zich niet voordoet bij oplosbaar TGF-β [24]. Zoals eerder vermeld zouden kankerexosomen gebruikt kunnen worden voor de behandeling van tumoren door het induceren van een tumor-Ag specifieke immuunrespons. Onderzoek heeft echter ook aangetoond dat exosomen, gesecreteerd door kankercellen, tumorgroei

9

zouden kunnen promoten door middel van ontwijking van het immuunsysteem. Zo kunnen exosomen van een muis borstkankercellijn zowel in vitro als in vivo de cytotoxische activiteit en de graad van proliferatie van natural killer (NK) cellen significant verminderen. NK-cellen kunnen tumorcellen niet meer afdoden na incubatie met kankerexosomen. Dit is het gevolg van een significante reductie van de expressie van het cytotoxische perforine van NK-cellen na incubatie met kankerexosomen. Deze reductie treedt niet op na incubatie met exosomen afkomstig van normale cellen en is niet aanwezig op het mRNA niveau, wat wijst op interventie in de pathway die verantwoordelijk is voor de vrijstelling van het cytotoxische eiwit [25]. Kankerexosomen kunnen op verschillende manieren andere kankercellen in de omgeving stimuleren tot een hogere graad van proliferatie. Zo kunnen ze bijvoorbeeld de graad van apoptose, teweeg gebracht door ECM-stress in het tumor ecosysteem, van andere cellen verlagen. Khan en collega’s hebben in dit verband aangetoond dat kankercellen onderworpen aan stress situaties, zoals subletale protonbestraling, verhoogde concentraties aan exosomaal survivin vrijstellen, wat niet het geval was bij normale cellen. Survivin is een inhibitor van apoptose die verantwoordelijk is voor therapieresistentie en de verhoogde proliferatiegraad van verschillende kankers. Deze inhibitor werd gevonden op het oppervlak van exosomen. Na inhibitie van exosoomvrijstelling trad er een significante daling van de extracellulaire concentratie survivin op terwijl men deze concentratiedaling niet kon waarnemen na inhibitie van traditionele exocytose. Inhibitie van exosoomvrijstelling verhoogde ook de gevoeligheid voor apoptose van de kankercellen. Met deze resultaten kon men vaststellen dat apoptose van kankercellen kan ontweken worden door exosomale intercellulaire communicatie en dit waarschijnlijk via exosomaal aangereikt survivin, waardoor er ongecontroleerde groei ontstaat [26]. Metastasevorming is de grootste doodsoorzaak bij kanker. Dit is het gevolg van verschillende cellen van de primaire tumor die in de bloed- of lymfebaan geraken en op andere plaatsen in het lichaam aanleiding geven tot secundaire tumoren die de normale fysiologie van de geïnfiltreerde organen drastisch kunnen verstoren. Ook in dit proces van tumorigenese spelen exosomen een rol. Zo kunnen melanoom exosomen, als ze in de lymfebaan geraken, het ontstaan van secundaire tumoren in de omringende lymfeknopen stimuleren. Na injectie van melanoom exosomen in een muis treedt er verandering op van genexpressie in de omliggende lymfeknopen waarbij genen die een rol spelen in cel rekrutering, aanmaak van ECM proteïnen en angiogenese een hogere graad van expressie krijgen. Hierdoor wordt de lymfeknoop

10

aangepast waardoor eventuele CTCs een hogere affiniteit verkrijgen en aanleiding kunnen geven tot secundaire tumoren in dit orgaan. Het ECM eiwit vitronectine wordt bijvoorbeeld extra aangemaakt waardoor melanoomcellen, die positief zijn voor het vitronectine-bindend eiwit integrine αvβ3, sterker kunnen binden in de lymfeknoop en secundaire tumoren kunnen vormen [12].

1.5 Doelstellingen In onze onderzoeksgroep werd eerder reeds aangetoond dat oestrogeen receptor positieve (ER+) borstkankercellen getransfecteerd met een klein GTPase verantwoordelijk voor exosoomvrijstelling, Rab27B, een hogere graad van invasie hebben in vergelijking met ER+ cellen die dit eiwit niet tot overexpressie brengen. De getransfecteerde cellen zijn grilliger van vorm door de aanwezigheid van invadopodia en invaderen veel sterker in een type 1 collageen gel. Bij in vivo experimenten in de muis kan er ook waargenomen worden dat de Rab27B cellen veel sterker invaderen in omliggend spierweefsel en dat de tumor na tien weken significant groter is dan bij normale ER+ borstkankercellen. Ook bleek dat in humane ER+ borstkankers de graad van differentiatie, evenals het voorkomen van metastasen in de lymfeklieren gecorreleerd was aan de expressie van het GTPase Rab27B [27]. Aangezien al deze negatieve effecten significant afgezwakt worden na inhibitie van Rab27B zou men de hypothese kunnen stellen dat deze oncogene processen gemedieerd worden door de vrijstelling van exosomen, en meer bepaald door de verschillende eiwitten die hiermee geassocieerd zijn. Omwille hiervan werd er proteoomanalyse uitgevoerd op zowel de exosomen van de Rab27B overexpresserende cellen als op de exosomen van de normale ER+ borstkankercellen. Door het uitvoeren van dit experiment werd er een lijst verkregen van alle eiwitten die in deze exosomen aanwezig zijn en in welke mate ze meer of minder aanwezig zijn in de exosomen van de Rab27B overexpresserende cellen. Tijdens deze thesis zal er op zoek gegaan worden naar de proteïnen, geassocieerd met de exosomen van Rab27B overexpresserende ER+ borstkankercellen, die een rol zouden kunnen spelen in de verhoogde graad van invasie of proliferatie van deze cellijn.

11

2. Materialen en methoden 2.1 Algemeen 2.1.1 Buffers De samenstelling van alle gebruikte buffers in dit onderzoeksproject zijn terug te vinden in tabel 2.1. Tabel 2.1. Samenstelling van alle gebruikte buffers met SDS ‘sodiumdodeceylsulphate’ en ODG ‘OptiPrep densiteitsgradiënt.

Buffer Werkoplossingsbuffer

Homogenizatiebuffer

Laemmli (1x)

Laemmli (1,5x)

Reducerende 'sample buffer' Scheidingsbuffer

concentrerende buffer

Running buffer

Blotting buffer

Samenstelling 0,25 M sucrose 6 mM EDTA 60 mM Tris-HCl 0,25 M sucrose 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl 10% Glycerol 2,3% SDS 50% 0,125 M Tris-HCl 15% Glycerol 3,45% SDS 75% 0,125M Tris-HCl Laemmli (1,5x) 3% β-mercapto-ethanol 0,005% bromofenol blauw 0,4% SDS 18,7% Tris 6 M HCl 0,4% SDS 6% Tris 6 M HCl 0,15% glycine 0,03% Tris 0,1% SDS 0,15% glycine 0,03% Tris 0,00005% SDS 22% methanol

Gebruik ODG

ODG

Lysaten

SDS-PAGE

SDS-PAGE

SDS-PAGE

SDS-PAGE

SDS-PAGE

Western blot

12

2.1.2 Cellijnen 2.1.2.1 MCF7 MCF7 cellen (Michigan Cancer Foundation) zijn niet invasieve borstkankercellen met epitheliale kenmerken geïsoleerd uit een pleurale effusie van een borst adenocarcinoom van een 69 jarige vrouw [28]. De cellen zijn ER+ en bevatten het wild type P53 gen [29]. Deze cellijn werd eerder al getransfecteerd met een pEGFP-C1 vector met of zonder integratie van volgende eiwitten in de ‘multiple cloning site’ (MCS): Rab27B, Rab27A en Rab27B-T23N, een geïnactiveerde puntmutant van Rab27B waarvan de affiniteit groter is voor GDP dan voor GTP. Door deze transfectie komen GFP of fusie-eiwitten met dit merker eiwit tot expressie in deze cellijnen. De pEGFP-C1 vector bevat ook een G418 (geneticine) resistentie gen waardoor stabiele klonen gegenereerd kunnen worden. [27]. De cellen gegenereerd door deze transfectie worden met volgende naam benoemd in deze scriptie: MCF7-GFP, MCF7Rab27B, MCF7-Rab27A en MCF7-Rab27B-T23N 2.1.2.2 T47D T47D cellen zijn gedifferentieerde borstkankercellen met epitheliale kenmerken en geïsoleerd uit een pleurale effusie van een ductaal carcinoom van de borst uit een 54 jarige vrouw [28]. Ook deze cellen zijn ER+, maar zijn dubbel mutant voor de tumorsupressor P53 waardoor deze constitutief geactiveerd is [29]. Van deze cellen werden ook getransfecteerde klonen gegenereerd volgens hetzelfde principe als bij bovenstaande MCF7 cellen met GFP of het fusie eiwit Rab27B-GFP [27]. 2.1.3 Antilichamen De antilichamen gebruikt in dit onderzoeksproject zijn samengevat in tabel 2.2 en 2.3.

13

Tabel 2.2. Primaire antilichamen

Antilichaam Anti-Alix Anti-TSG101 Anti-HSP70 Anti-RPS20 Anti-RPS7 Anti-eEF2 Anti-eIF3f Anti-SYNCRIP Anti-P-P53 Anti-P53

Firma Product nummer Cell signaling, Danvers, USA CST2171S Santa cruz biotechnology, Danvers, sc-7964 USA System Biosciences, Mountain View, 322-EXOABUSA HSP70A Abcam, Cambridge, UK ab74700 Proteintech, Chicago, USA 14491-1-AP Cell signaling, Danvers, USA CST2332S Rockland Immunochemicals, 600-401-934 Philadelphia, USA Sigma-Aldrich, St Louis, USA HPA041275-100µL Cell signaling, Danvers, USA CST 9284S Santa cruz biotechnology, Danvers, sc-126 USA

Species muis

Verdunning 1/1000

muis

1/1000

konijn

1/1000

konijn konijn konijn

1/500 1/200 1/1000

konijn

1/1000

konijn konijn

1/200 1/1000

muis

1/1000

Species

Verdunning

Tabel 2.3. Secundaire antilichamen

Antilichaam

Firma

Product nummer

Anti- konijn HRP IgG Sigma-Aldrich, St Louis, USA

GENA934-1ML

Geit

1/4000

Anti- muis HRP IgG

GENA931-1ML

Schaap

1/3000

Sigma-Aldrich, St Louis, USA

2.2 Celcultuur Beide cellijnen worden in cultuur gehouden in ‘Dulbecco’s Modified Eagle Medium’ (DMEM) verrijkt met 10% foetaal kalfsserum, 100U/ml penicilline en 100µg/ml streptomycine bij 37°C en 10% CO2. Dit medium bevat tevens een pH-indicator, fenol rood, waardoor uitputting van de nutriënten in het medium aangetoond kan worden door een gele kleur die het gevolg is van een verhoogde concentratie CO2 in het medium. De getransfecteerde cellen worden continu geselecteerd door toevoeging van 1 mg/mL G418 antibioticum (geneticine) aan het medium en contaminatie door mycoplasma werd regelmatig nagegaan met MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Verviers, België). Bij +/- 70% confluentie worden de cellen gesubcultiveerd door een opeenvolgende behandeling met divalente ionen-chelator moscona en trypsine. Enkelvoudige cellen worden gesuspendeerd in kweekmedium waarbij serum de activiteit van trypsine inhibeert.

14

2.3 Exosoom isolatie Twintig T175 celcultuur flessen elk bezet met +/- 15 ∗ 106 cellen werden gebruikt voor één exosoom isolatie. De cellen worden 24 uur geïncubeerd met 15 mL geconditioneerd medium (CM) (DMEM gesuplementeerd met 0.5% exosoom gedepleteerd kalfsserum (exosome depleted serum, EDS)) voorafgegaan van 3 wasstappen met DMEM en DMEM + 0.5% EDS gedurende respectievelijk 30 sec, 10 min en 30 min. EDS wordt verkregen door foetaal kalfsserum gedurende 18 uur te centrifugeren aan 100 000 g bij 4°C (SW 55 Ti rotor, Beckman Coulter) en vervolgens te filtreren doorheen een 0.2 µm filter. Exosomen worden uit het CM geïsoleerd zoals beschreven door Van Deun et al. [8]. Hierbij wordt het gecollecteerd CM (300 mL) 10 min gecentrifugeerd aan 200 g om dode cellen en celdebris te verwijderen gevolgd door filtratie doorheen een 0.45 µm filter opdat grotere partikels geëxcludeerd zouden worden. Vervolgens wordt het gefiltreerde CM 300 maal geconcentreerd door centrifugatie doorheen een 10 kDa filter (Centricon® Plus-70, Millipore) aan 3200 g gedurende 35 min. Het uiteindelijke retentaat (1mL) wordt dan nogmaals gefilterd doorheen een 0.2 µm filter en aangebracht op een discontinue iodixanol gradiënt en 18 uur gecentrifugeerd aan 100 000 g bij 4°C (SW 32.1 Ti rotor, Beckman Coulter). De gradiënt bestaat uit 4 op elkaar aangebrachte lagen van 4 mL 40%, 4 mL 20%, 4 mL 10% en 3.5 mL 5% iodixanol. Deze verschillende lagen worden gemaakt door een stockoplossing van 60% (OptiPrepTM, Axis-Shield, Oslo, Noorwegen) te combineren met een werkoplossingsbuffer en te verdunnen met de gepaste hoeveelheden homogenizatie buffer. Na centrifugatie van de gradiënt worden 16 1 mL fracties afgenomen en geresuspendeerd in 15 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing vrij van calcium ionen (PBSD-) in een 16.8 mL polyallomeer tube (Beckman Coulter) en gedurende 3 uur gecentrifugeerd aan 100 000g bij 4°C (SW 32.1 Ti rotor, Beckman Coulter). Zoals eerder aangetoond bevinden de exosomen zich in fracties 8 en 9 die overeenstemmen met een densiteit van 1.094 mg/mL [8]. Van deze gepelleteerde fracties wordt het supernatans voorzichtig verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in 100 µL PBSD- en bewaard bij -80°C of direct gebruikt voor validatie. Het supernatans wordt vervolgens ook nog 70 maal geconcentreerd (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Billerica, MA, USA) om eventueel verlies van eiwitten en exosomen aan te tonen. Bovenstaande techniek wordt een ‘top-down’ gradiënt genoemd en wordt schematisch weergegeven in figuur 2.1. Bij een ‘bottom-up’ gradiënt concentreert men het gefiltreerde CM tot 0.5 mL en wordt het aangelengd met 0.3 mL homogenizatie buffer en 3.2 mL OptiPrepTM

15

gecombineerd met werkoplossingsbuffer zodanig dat men een 40% iodixanol oplossing verkrijgt. De gradiënt wordt dan vervolgens opgebouwd zoals beschreven bij de ‘top-down’ methode en bovenop wordt er 1 mL PBSD- geplaatst. Doordat de exosomen hierbij van onder naar boven migreren treedt er een shift op van de fracties waarin de exosomen zich bevinden. Ze bevinden zich nu in fracties 9 en 10. Figuur 2.1 schematisch voorstelling van exosoom isolatie via een top down gradiënt. Geconcentreerd CM wordt bovenop een discontinuë Iodixanol gradiënt aangebracht en door 18h centrifugatie aan 100000g migreren de exosomen naar hun overeenkomstige densiteit (Jan Van Deun).

2.4 Nanoparticle tracking analysis Nanoparticle tracking analysis (NTA) wordt toegepast om de grootte en het aantal partikels te bepalen. Hierbij wordt het staal in een afgesloten kamer gebracht waarin zich ook een optisch vlak met schuine zijde bevindt. Bij NTA analyse wordt er gebruik gemaakt van een 405 nm laser die invalt op de schuine zijde van de glasplaat en hierdoor door het staal wordt geleid. Partikels aanwezig in het staal kunnen dan vervolgens deze laser straal verstrooien en het verstrooide licht kan waargenomen worden door een EMCCD camera (‘Electron Multiplication Charged Coupled Device’) boven de afgesloten kamer (fig.2.2 a). Bijgeleverde software kan dan op basis van het verstrooide laserlicht het aantal partikels per frame waarnemen en dit herleiden naar aantal partikels per mL. Ook kan de grootte van de partikels worden afgeleid doordat de software de afgelegde weg van elk partikeltje, onder invloed van Brownse bewegingen, volgt. Door het toepassen van de Stokes-Einstein vergelijking en het bijhouden van de gemeten temperatuur kan vervolgens de diameter van de partikels berekend worden [30]. Praktisch wordt er van elk staal een 5 µL aliquot genomen en 100 maal verdund in PBSD-. 300 µL van deze oplossing wordt dan vervolgens in de afgesloten kamer gebracht waarna de

16

analyse gestart wordt. Aangezien het toestel slechts lineair meet tussen een concentratie van 108 en 109 partikels per mL, moet als de concentratie boven dit interval licht het staal opnieuw verdund worden totdat het tussen het lineaire concentratiegebied ligt.

Figuur 2.2 Het principe van nanoparticle tracking analysis en de Stokes-Einstein vergelijking. A) Een laser straal valt in op de schuine zijde van een glazen plaat waardoor deze door het staal wordt geleid. Partikels in het staal verstrooien vervolgens deze laser straal waardoor er verstrooid licht invalt in de microscoop waarboven zich een EMCCD camera bevindt. B) Stokes-Einstein vergelijking met ‘Dt’ de diffusie coëfficiënt van de partikels gemeten in het staal, ‘T’ de temperatuur van het staal, ‘K B’ de constante van Boltzmann, ‘η’ de viscositeit en ‘d’ de hydrodynamische diameter van de partikels.

2.5 Lysaten en eiwitconcentratiemeting Om lysaten te maken worden cellen bij +/- 70% confluentie 3 maal gewassen met PBSD+ dat calciumzouten bevat zodanig dat de cellen niet loskomen van elkaar. Na de laatste wasstap voegt men Laemmli (1x) buffer toe waardoor de membranen uit elkaar vallen. Er wordt op ijs gewerkt om de proteolytische activiteit van degraderende enzymen tegen te gaan. Door middel van sonicatie (20 Hz) worden membraan gebonden eiwitten vrijgemaakt. Het lysaat wordt 10 min gecentrifugeerd aan 20000g bij 4°C waardoor membranen worden gepelleteerd. Om toegang te krijgen tot de exosomale eiwit inhoud moeten ook deze membranen gelyseerd worden. Dit kan heel eenvoudig door een 1:1 oplossing te maken van exosomen en Laemmli (1x) buffer. Ook de pellets van overige, niet exosoom bevattende ODG fracties worden op deze manier gelyseerd. De eiwitconcentratiemeting is gebaseerd op het Lowry principe. Het lysaat wordt gedurende 20 minuten geïncubeerd met Lowry reagens (Bio-Rad, Hercules, USA) waardoor er een blauwe kleur ontstaat die het gevolg is van een reactie tussen koper en peptide-stikstof gevolgd door een reductie van foline reagens door de koper-behandelde eiwitten [31]. Deze

17

blauwkleuring is evenredig met de eiwitconcentratie en kan gemeten worden met Biodrop, een spectrofotometrisch toestel (Biodrop, Cambridge, UK).

2.6 Eiwit analyse Om na te gaan of een eiwit van interesse aanwezig is in cel- of exosomale lysaten wordt er SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gelelectroforese) toegepast gevolgd door Western blot en immunokleuring. Hierbij worden de eiwitten eerst van elkaar gescheiden op basis van hun moleculair gewicht (MW) door middel van een elektrisch veld. Vervolgens worden de gescheiden eiwitten overgebracht op een nitrocellulose membraan eveneens door middel van een elektrisch veld en kunnen de eiwitten van interesse aangetoond worden door het aanbrengen van antilichamen specifiek tegen deze eiwitten. 2.6.1 SDS-PAGE Alvorens gelelectroforese toe te passen wordt het staal vermengd met een bepaald volume reducerende ‘sample buffer’ zodanig dat mogelijke eiwitcomplexen uit elkaar vallen en ontvouwen en de eiwitten volledig bedekt worden met negatieve ladingen afkomstig van SDS (voor exosomale stalen wordt Laemmli (4x) gebruikt omwille van zeer lage opbrengst). Dit is nodig opdat de scheiding van de eiwitten enkel afhankelijk zou zijn van het MW en niet van eigen negatieve ladingen en tertiaire structuren. Als laatste stap wordt het mengsel al mixend opgekookt om volledige denaturatie te verzekeren. 10% PA gels werden gemaakt door het gieten van een mengsel (34% Acrylamide (30%), 24% scheidingsbuffer, 42% gedestilleerd water, 0.05% ammoniumperoxidesulfaat (APS), 0.05% tetramethylethyleendiamine (TEMED)) tussen twee elektroforese glasplaatjes en het geheel te laten polymeriseren waarna er nog een concentrerende gel (15% Acrylamide (30%), 25% concentrerende buffer, 60% gedestilleerd water, 0.1% APS, 0.1% TEMED) wordt op aan gebracht met als doel alle eiwitten zo dicht mogelijk bij elkaar te brengen. Om zo veel mogelijk staal te kunnen laden wordt er gewerkt met 10 ladingslaantjes waarin elk 30 µL staal kan geladen worden. De gel wordt in een buffertank gemonteerd gevuld met running buffer en de kam die de ladingslaantjes vormt wordt verwijderd. In deze laantjes wordt dan van de totale cellysaten 10

18

tot 20 µg eiwit geladen en van de exosomale lysaten, evenals van de overige ODG fracties, wordt een zo hoog mogelijke eiwit concentratie geladen. Exosomale lysaten worden echter ook geladen zodanig dat alle stalen op dezelfde gel evenveel partikels bevatten zoals afgeleid van de NTA analyse. Tot slot wordt er ook telkens een standaard eiwit oplossing met MWmerkers mee geladen om het MW van de gescheiden eiwitten af te kunnen leiden (PageRuler™, Thermo Scientific, Rockford, USA). Op de buffertank wordt dan een deksel geplaatst en het geheel wordt dan vervolgens onderworpen aan een elektrisch veld van 150 V gedurende +/- 50 min zodanig dat de eiwitten van interesse voldoende van elkaar gescheiden worden. 2.6.2 Western blot Na SDS-PAGE bevinden de eiwitten van interesse zich gescheiden van elkaar met de grootste eiwitten bovenaan en de kleinste onderaan in de gel. Om deze eiwitten eenvoudig aan te kunnen tonen moeten ze eerst van de gel naar een nitrocellulose membraan overgebracht worden. Dit gebeurt op dezelfde wijze als bij SDS-PAGE waarbij de sterk negatief geladen eiwitten via een uniform elektrisch veld van de gel naar het membraan overgebracht worden en dit alles wordt gefaciliteerd door het toevoegen van methanol, voor een betere membraan binding, en extra SDS, voor een betere migratie, aan de blotting buffer. Het nitrocellulose membraan wordt gebruikt omwille van zijn sterk hydrofobe bindingsplaatsen die ideaal zijn voor eiwitbinding (Amersham Bioscience, Uppsala, Zweden). Praktisch wordt dit gedaan door het maken van een ‘blot sandwich’ die bestaat uit een sponsje en 3 Whatman papiertjes aan elke kant met in het midden de eiwit bevattende PA gel met daar op aangebracht het nitrocellulose membraan. De hele sandwich mag zeker geen luchtbellen bevatten omdat deze de migratie van eiwitten belemmeren. Daarom wordt de sandwich goed plat gerold zodanig dat alle luchtbellen tussen de Whatman papiertjes, de gel en het membraan verwijderd worden. Het geheel wordt vervolgens in een cassette gestoken en in een blot-tank geplaatst gevuld met blottingbuffer met de gel aan de negatieve zijde (kathode) en het membraan aan de positieve zijde (anode) van de tank. Omwille van de warmte die vrijkomt tijdens dit proces door de grote weerstand wordt er ook een koelelement in de blot tank geplaatst om oververhitting en verlies van eiwitten te vermijden. Het geheel wordt dan vervolgens onderworpen aan een elektrisch veld met een spanning van 100 V gedurende +/45 minuten waardoor de eiwitten migreren van gel naar membraan.

19

Om na te gaan of de overdracht van de eiwitten geslaagd is wordt het membraan behandeld met ponceau S (Sigma-Aldrich, Bornem, België), een rode kleurstof die reversibel kan binden met alle eiwitten aanwezig op de membraan. Met deze kleuring kunnen geen individuele eiwitten aangetoond worden, maar krijgt men wel een beeld van hoeveel eiwitten er zijn overgebracht en door onregelmatigheden in de kleuring kan men ook al reeds vaststellen of er luchtbellen aanwezig waren in de sandwich of niet. De gevoeligheid van deze kleuring ligt zeer laag waardoor men meestal geen kleuring ziet bij exosomale lysaten, maar wel bij totale cellysaten. 2.6.3 Immunokleuring Om uit alle overgebrachte eiwitten op het membraan enkel de eiwitten van interesse aan te tonen wordt er gebruik gemaakt van indirecte immunokleuring. Hierbij gebruikt men eerst primaire antilichamen die binden aan specifieke epitopen op de eiwitten van interesse en voegt men vervolgens secundaire antilichamen, gericht tegen het constante deel van de primaire antilichamen en gekoppeld aan het enzym ‘Horse Radish Peroxidase’ (HRP) toe. Dit enzym is dan vervolgens in staat een redox reactie uit te voeren met H2O2 en luminol. Hierbij wordt H2O2 gereduceerd terwijl luminol een oxidatie ondergaat. Het geoxideerde luminol bevindt zich door deze reactie in een aangeslagen toestand en kan vervolgens terugkeren naar de grondtoestand vergezeld door een vrijstelling van energie onder de vorm van licht met een golflengte van 428 nm. Dit licht kan dan uiteindelijk gedetecteerd worden door een CCD camera of een autoradiografische film. Na ponceau kleuring wordt het membraan, op basis van de standaard eiwit oplossing, in horizontale reepjes gesneden zodanig dat elk reepje één eiwit van interesse bevat. Vooraleer de membraanstukjes met de antilichamen te behandelen worden ze eerst 30 minuten geïncubeerd met blokkeringsbuffer (PBSD-, 5% melkpoeder, 0.5% Tween-20) om aspecifieke binding van de antilichamen op de vrije hydrofobe plaatsten van het membraan te vermijden. Na het blokkeren worden de membraantjes overnacht geïncubeerd met de gewenste verdunning van specifieke primaire antilichamen in blokkeringsbuffer (sommige antilichamen vereisen een ‘Bovine serum albumine’ (BSA) buffer voor optimale werking). Hierna worden de membraantjes drie maal gewassen met blokkeringsbuffer en 60 minuten geïncubeerd met secundaire antilichamen gericht tegen de primaire. Deze secundaire antilichamen zijn speciesspecifiek waardoor het gebruik ervan afhangt van het dier waarin de primaire antilichamen geproduceerd zijn. Hierna worden ongebonden antilichamen verwijderd door nogmaals drie

20

maal te wassen met blokkeringsbuffer en drie maal met wasbuffer (PBSD-, 0.5% Tween-20). Na de laatste wasstap worden de membraan reepjes netjes geschikt op een plastikfolie en behandeld met ‘enhanced chemoluminescence’ reagens (ECL) (Advansta, California, USA). Licht, vrijgesteld door de reactie tussen HRP en ECL reagens, kan vervolgens worden waargenomen met ProximaTM, een toestel met een gevoelige CCD camera geschikt voor chemoluminescente Western blot (Isogen life science, De Meern, Nederland).

2.7 Analyse massaspectrometrie data Exosoomstalen van de MCF7-GFP en MCF7-Rab27B-GFP cellijn werden, in samenwerking met Wendy Westbroek (Medical Genetics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Verenigde Staten), onderworpen aan tandem massaspectrometrie volgens het iTRAQ principe (‘isobaric tag for relative and absolute quantitation’). Bij deze techniek worden de peptiden van beide stalen gekoppeld aan een specifieke isobare isotoop tag met het doel de eiwitten in beide stalen te kwantificeren ten opzichte van elkaar. Hierbij worden in de eerste massaspectrometrie stap de eiwitten geïdentificeerd en door fractionering van de isobare isotoop tag voor de tweede massaspectrometrie stap kunnen de eiwitten van beide stalen gekwantificeerd worden door het ontstaan van twee tags met een verschillend moleculair gewicht [32]. Uit dit iTRAQ experiment werd een lijst verkregen van alle eiwitten gedetecteerd in beide stalen vergezeld met de ‘fold change’ die de verhouding weergeeft van voorkomen van de eiwitten in exosomen van de Rab27B cellijn ten opzicht van de GFP cellijn. Eiwitten met een fold change van 1 komen in gelijke mate voor in beide stalen en eiwitten met een fold change groter of kleiner dan 1 komen respectievelijk meer voor in de exosomen van de Rab27B en GFP cellijn. Om significante verschillen waar te nemen werd er vooral gezocht naar eiwitten met een fold change van twee of groter en 0.5 of lager. Deze eiwitten werden vervolgens geanalyseerd met FunRich, een gratis software programma voor het uitvoeren van functionele aanrijkingsstudies [33].

21

3. Resultaten 3.1Validatie van exosoom isolatie via ‘top-down’ gradiënt. Om zeker te zijn dat de exosoom isolatie geslaagd was werden van de MCF7-Rab27B cellijn fracties 7, 8, 9, en 10, die het densiteitsgebied van 1.094 mg/mL omsluiten, gecontroleerd op aanwezigheid van de exosomale merkers Alix, TSG101 en HSP70 door middel van Western blot. Hieruit kan men afleiden dat exosomen enkel aanwezig zijn in fracties 8 en 9 (fig. 3.1a). Na deze validatie werden van alle ‘top-down’ gradiënten fracties 8 en 9 samen gepoold. Van de ER+, niet invasieve cellijnen MCF7 en T47D en de getransfecteerde klonen ervan werden vervolgens exosomen geïsoleerd en gevalideerd via Western blot op de merkers Alix en TSG101 (fig.3.1b) en NTA analyse waarbij men kijkt naar de juiste grootte distributie (fig. 3.2). Hieruit kan worden afgeleid dat de isolatie van exosomen uit elke cellijn geslaagd is.

Figuur 3.1. Validatie exosoom isolatie door ‘top-down’ gradiënt. A) Western blot op fracties die densiteitsgebied van 1.094mg/mL omsluiten tegen exosomale merkers Alix, HSP70 en TSG101. Exosomen bevinden zich in fracties 8 en 9. B) Western blot op gepoolde fracties 8 en 9 van MCF7-GFP, -Rab27B, -Rab27A en -Rab27B-T23N en van T47D-GFP en –Rab27B tegen exosomale merkers Alix en TSG101. Dit is een samengestelde afbeelding van Western blot resultaten van verschillende gels, hierdoor kon er dus niet genormaliseerd worden naar gelijke eiwitconcentratie of naar partikels.

22

Figuur 3.2 Validatie via NTA analyse. Gepoolde exosomale fracties (8-9) van MCF7-Rab27B cellen worden vergeleken met omliggende fracties 5-7 en 10-11. A) In de exosomale fracties (8-9) ziet men een homogene grootte distributie van partikels met een gemiddelde grootte van 105 nm, wat overeen stemt met de grootte van exosomen. In facties 5-7 (B) en 10-11 (C) Is er geen homogene grootte distribute maar te nemen, hier zijn partikels met verschillende groottes aanwezig. In deze figuur worden de drie metingen van één NTA analyse, in één grafiek weergegeven.

3.2 Translationele eiwitten zijn aangerijkt in MCF7-Rab27B exosomen. De iTRAQ tandem massaspectrometrie, eerder uitgevoerd door An Hendrix, leverde een lijst op met 879 eiwitten aanwezig in exosomen van MCF7-GFP en –Rab27B cellen. Deze eiwitten werden geanalyseerd en speciale aandacht werd gegeven aan eiwitten die potentieel biologisch significant verschillend voorkomen in exosomen afkomstig van de MCF7RAB27B cellijn ten opzichte van de MCF7-GFP cellijn en omgekeerd. Hiervoor werd respectievelijk gezocht naar eiwitten met een ‘fold change’ (FC) van 2 of hoger (n=79) en 0.5 of lager (n=58) (Tabel S1). De eiwitten aangerijkt in MCF7-Rab27B en -GFP exosomen werden vervolgens met elkaar vergeleken op basis van cellulair compartiment waartoe ze behoren, moleculaire functie en biologische processen waarin ze een rol spelen (fig. 3.3 a,b,c) met behulp van FunRich, een programma gebruikt voor annotatie en analyse van proteoomdatasets [33].

23

Voor cellulair compartiment valt op dat een groot deel (26.4%) van de aangerijkte eiwitten in de Rab27B exosomen (geïsoleerd uit het CM van MCF7-Rab27B cellen) geassocieerd is met het ribosoom, meer bepaald de kleine subunit ervan, en dat er geen enkel eiwit in de GFP exosomen tot deze klasse behoort (fig. 3.3a). Dit vertaalt zich dan ook verder in de moleculaire functies en biologische processen waarmee deze eiwitten geassocieerd zijn, nl.: structuurelementen van het ribosoom, translationele regulatie en ligase activiteit enerzijds, en eiwit metabolisme, tRNA-aminoacylatie en celproliferatie anderzijds (fig. 3.3b, c). Ook valt het op dat de Rab27B exosomen sterk zijn aangerijkt met eiwitten die voornamelijk in het cytosol voorkomen, waaronder ook de eiwitten die behoren tot het ribosoom en het translatie systeem, ten opzichte van de GFP exosomen (fig. 3.3a). Daartegenover bevatten de GFP exosomen procentueel meer eiwitten die toebehoren tot het exosomale en lysosomale compartiment.

Figuur 3.3. Vergelijking van eiwitten aangerijkt in Rab27B en GFP exosomen op basis van cellulair compartiment (a), moleculaire functie (b) en biologische processen (c). Van elk staal werden de drie klassen geselecteerd die het sterkst zijn aangerijkt, bepaald door de p-waarden, en vergeleken met dezelfde klassen van het andere staal [33].

24

Het is aangetoond dat ribosomale eiwitten en eiwitten die een functie vervullen bij het translatieproces een rol kunnen spelen in de ontwikkeling van verschillende kankers [18], [19], [21]. Door te zoeken naar eiwitten die tot deze klassen behoren en te zoeken naar literatuur die mogelijke rollen in kankerontwikkeling zou kunnen aantonen werden een aantal relevante eiwitten geselecteerd. De ribosomale subunits RPS7 en RPS20 (FC=2.76 en 2.57) kunnen MDM2 binden en degradatie van de tumorsupressor p53 verhinderen [22], [34]. De subunit eIF3f (FC=2.43) van het complexe multisubunit ‘eukaryotic initiation factor 3’ (eIF3) kan, indien niet gebonden aan het complex, degradatie van rRNA induceren. Bovendien is verminderde expressie van deze subunit geassocieerd met een slechte prognose in kankerpatiënten [20], [35]. ‘Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q’ (hnRNPQ) (FC=2.95) is betrokkin in de stabilisatie van p53 mRNA en kan translatie van dit gen starten in stresssituaties [36]. Tot slot werd ook de ‘eukaryotic elongation factor 2’ (eEF2) (FC=1.73) geselecteerd omdat dit eiwit een zeer belangrijke rol vervult in het normale translatie proces, en ook omdat het frequent in hogere concentraties wordt terug gevonden in verschillende kankers [37].

3.3 Analyse van eiwitten van interesse in exosomale fracties. De identificatie van RPS7, RPS20, eIF3f, hnRNPQ en eEF2 met iTRAQ massa spectrometrie werd gevalideerd met Western blot in de exosomale fracties van MCF7-GFP en -Rab27B CM (fig.3.4). Om na te gaan of de differentiële expressie van deze eiwitten het gevolg is van een hogere Rab27B expressie, werden ook exosomale fracties van de MCF7-Rab27A en – Rab27B-T23N cellijn gebruikt, als ook van de T47D-GFP en –Rab27B cellijn. Hieruit kan men vervolgens afleiden dat alle eiwitten van interesse terug te vinden zijn in de exosomen van de MCF7-Rab27B cellen en, behalve eEF2, niet in de MCF7-GFP cellijn (fig. 3.4). In de MCF7-Rab27A exosomen zijn ook voor alle eiwitten, behalve voor hnRNPQ, bandjes waar te nemen maar de intensiteit ervan is veel lager dan bij de MCF7-Rab27B exosomen, wat er op wijst dat de concentratie ervan hoger is in de laatste exosomen (fig.3.4 zwarte pijlen). Ook voor eIF3f zijn er twee zeer lichte bandjes te zien in de exosomen van MCF7-GFP en T47DGFP cellen (fig.3.4 rode pijlen). Enkel de elongatiefactor eEF2 kon waargenomen worden in de exosomen van elke cellijn, maar slechts zeer zwak in de MCF7-RAB27B-T23N en T47DRab27B cellijn (fig.3.4).

25

Figuur 3.4. Western blot analyse voor eEF2, hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 op exosomen van MCF7-GFP, Rab27B, -Rab27A en -Rab27B-T23N en T47D-GFP en –Rab27B, met “C” een lysaat van MCF7-Rab27B cellen als positieve controle. Hier werden van elk staal 8.34 E09 partikels geladen ter normalisatie.

3.4 Analyse van translationele eiwitten in overige fracties van ‘top-down’ gradiënt. Aangezien er in de exosomale fracties van alle cellijnen behalve MCF7-Rab27B weinig of geen eiwitten van interesse werden terug gevonden werd er ook Western blot uitgevoerd op alle overige gepelleteerde fracties van de top down gradiënten van elke cellijn (de laatste fracties konden niet meegenomen worden door plaatsgebrek in de gel) (fig.3.5 a-f). Hierdoor kan er nagegaan worden of secretie van deze eiwitten enkel gebeurt via de exosomale pathway, of door andere secretie mechanismen. In dit experiment werden zo hoog mogelijke eiwit concentraties van gepoolde fracties geladen op een gel zodanig dat ook een zeer zwakke aanwezigheid van eiwitten aangetoond zou kunnen worden. Uit dit experiment kan men afleiden dat de elongatiefactor eEF2, die eerder werd terug gevonden in de exosomale fracties van elke cellijn (fig. 3.4), niet enkel exosomaal is aangerijkt maar ook aanwezig is in hoger en soms lager gelegen fracties (fig. 3.5a-f). Bij elke cellijn neemt de concentratie af van de bovenste fracties naar de onderste, maar bij de MCF7GFP, -Rab27B en T47D-GFP cellen ziet men een sterker bandje in de exosomale fracties 8-9 ten opzichte van de omliggende fracties dat zou kunnen wijzen op een exosomale aanrijking ervan (fig.3.5a,b,e). Na het laden van hogere concentraties in vergelijking met fig.3.4 kan hnRNPQ wel terug gevonden worden in de exosomale fracties, maar ook in hoger en lager gelegen fracties van MCF7-GFP cellen (fig.3.5a). In de MCF7-Rab27A en –T23N cellijnen kon dit eiwit echter alleen maar terug gevonden worden in hoger gelegen fracties (fig.3.5c,d) terwijl het in beide T47D cellijnen zelfs nergens teruggevonden kon worden (fig.3.5e,f). De inititiatiefactor-subunit eIF3f is ook bij elke cellijn aanwezig in de hoger gelegen fracties en dit in afnemende hoeveelheden van boven naar onder. Nieuw hierbij is wel dat de subunit nu

26

ook waar te nemen is in de exosomale fracties van de T47D-Rab27B cellijn terwijl dit in fig. 3.4 enkel in de MCF7-GFP, -Rab27B, -Rab27A en T47D-GFP cellen was (fig.3.5f). Het ribosomale eiwit RPS7 is ook in elke cellijn weer te vinden in de hoger gelegen fracties (in de T47D cellijnen slechts een zeer zwak bandje), maar het blijkt alleen maar exosomaal aangerijkt te zijn in de MCF7-Rab27A cellijn aangezien het bandje van facties 8-9 een hogere intensiteit heeft dan de omliggende fracties (fig.3.5c). Tot slot is ook het eiwit RPS20 terug te vinden in de bovenste fracties van de ‘top-down’ gradiënt van elke cellijn, maar nu ook in de exosomale fracties van beide T47D cellijnen (fig.3.5e,f). Een zeer vreemd resultaat hierbij echter is wel dat het signaal in de exosomale fracties van MCF7-Rab27A cellen verdwenen is terwijl er wel meer staal is geladen (fig.3.5c).

Figuur 3.5. Western blot tegen eiwitten van interesse eEF2, hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 op gepoolde ‘top-down’ fracties van elke cellijn, met “C” een positieve controle, “1” de bovenste fractie en “13” de onderste fractie. A) MCF7GFP. B) MCF7-Rab27B. C) MCF7-Rab27A. D) MCF7-RAB27B-T23N. E) T47D-GFP. F) T47D-Rab27B. Hier werd telkens de hoogst mogelijke eiwitconcentratie van elke fractie geladen.

27

3.5 Validatie via ‘bottom-up’ gradiënt Aangezien elk eiwit dat aanwezig was in de exosomale fracties van de ‘top-down’ gradiënt ook aanwezig bleek te zijn in de hoger gelegen fracties van dezelfde gradiënt (fig. 3.5) werden nieuwe exosomen geïsoleerd van dezelfde cellijnen via een ‘bottom-up’ gradiënt. Het idee hierachter is dat tijdens ultracentrifugatie alle vrije eiwitten in het geconcentreerde CM onderaan de gradiënt zouden blijven doordat ze algemeen gesproken een hogere densiteit hebben dan vesikels en dus niet opwaarts zullen migreren naar lagere densiteiten [38]. Hierdoor zou er een duidelijker onderscheid moeten zijn tussen eiwitten die effectief exosomaal zijn aangerijkt en vrije eiwitten, daar er bij de ‘top-down’ gradiënt vaak een smeer waar te nemen is van eiwitten van de eerste fracties tot de exosomale fracties (fig. 3.5). In plaats van fracties 8 en 9 bevinden exosomen zich nu voornamelijk in fracties 9 en 10. Dit werd nagegaan door middel van Western blot op individuele fracties tegen de exosomale merkers Alix en TSG101 (fig.3.6a). Daarom werden, om zo veel mogelijk exosomen te isoleren, fracties 9 en 10 van de ‘bottom-up’ gradiënten van alle cellijnen samen gepelleteerd en gevalideerd via Western blot op exosomale merkers (fig.3.6b) en NTA (figuur niet getoond). Hieruit kan men afleiden dat de exosoom isolatie geslaagd was voor alle cellijnen behalve bij MCF7-Rab27A cellen, dewelke verder buiten beschouwing werden gelaten.

Figuur 3.6. Validatie exosoom isolatie via ‘bottom-up’ gradiënt. A) Western blot tegen exosomale merkers Alix en TSG101 op individuele ‘bottom-up’ fracties die de oude fracties van interesse 8 en 9 omsluiten. B) Western blot op gepoolde exosomale ‘bottom-up’ fracties 9 en 10 van MCF7-GFP, -Rab27B, -Rab27A en -Rab27B-T23N en T47DGFP en –Rab27B cellen tegen merkers Alix en TSG101.

Vervolgens werd er Western blot uitgevoerd tegen de eiwitten van interesse eEF2, hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 op de exosomale fracties van alle cellijnen behalve de MCF7-Rab27A cellijn (fig.3.7). Hiervoor werden per cellijn 1.78 E10 partikels geladen op de gel zodanig dat er een verschil tussen de verschillende stalen waargenomen zou kunnen worden. Uit figuur 3.7 kan men afleiden dat, behalve eEF2, alle eiwitten van interesse niet meer aanwezig zijn in de exosomale fracties van zowel de MCF7-Rab27B cellen als alle andere cellijnen. Bandjes voor RPS7 zijn wel nog waar te nemen voor elke cellijn, maar dit met een zeer lichte intensiteit.

28

Figuur 3.7. Western blot gericht tegen de eiwitten van interesse eEF2, hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 op de exosomale ‘bottom-up’ fracties van MCF7-GFP, Rab27B en -Rab27B-T23N en T47D-GFP en –Rab27B cellen, met “C” een positieve controle. Van elk staal werden er 1.78 E10 partikels geladen.

Figuur 3.8. Western blot op gepoolde ‘bottom-up’ fracties van alle cellijnen tegen de eiwitten van interesse eEF2, hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 met “C” een positieve controle. A) MCF7-GFP. B) MCF7-Rab27B. C) MCF7RAB27B-T23N. D) T47D-GFP. E) T47D-Rab27B. Hier werd er steeds een zo hoog mogelijke eiwitconcentratie geladen.

29

Aangezien er bij geen enkele cellijn eiwitten van interesse werden terug gevonden in de exosomale ‘bottom-up’ fracties, behalve eEF2, werden ook de overige gepelleteerde ‘bottomup’ fracties van alle cellijnen behalve MCF7-Rab27A onderworpen aan Western blot tegen dezelfde eiwitten (fig.3.8). Hiervoor werd er van gepoolde fracties een zo hoog mogelijke eiwitconcentratie geladen zodanig dat ook zeer kleine hoeveelheden eiwit opgepikt zouden kunnen worden. Hieruit blijkt net zoals in figuur 3.7 dat er, behalve eEF2, geen enkel eiwit van interesse aanwezig is in de exosomale fracties 9 en 10. Alle eiwitten die werden gevonden bevinden zich in de onderste fracties, behalve eEF2 dat in elke cellijn behalve T47D-GFP ook terug gevonden kon worden in hoger gelegen fracties (fig.3.8.a,b,c,e). Dit is een groot verschil vergeleken met de ‘top-down’ gradiënt waarbij de meeste eiwitten terug te vinden zijn in de hoger gelegen fracties (fig.3.5). Dit zelfde verschil kan ook waargenomen worden door de ponceau kleuring van ‘top-down’ en ‘bottom-up’ fracties met elkaar te vergelijken. Zo ziet men na ponceau S kleuring gevolgd na Western blot ook duidelijk een aanrijking van eiwitten in de bovenste fracties bij een ‘top-down’ gradiënt en in de onderste fracties bij een ‘bottomup’ gradiënt (fig.S1).

3.6 Vergelijking van p53 activiteit in Rab27B overexpresserende cellen. Omwille van het feit dat de eiwitten hnRNPQ, RPS7 en RPS20 de stabiliteit en activiteit van de tumorsuppressor P53 kunnen beïnvloeden [22], [34], [36] werd de activiteit ervan nagegaan door middel van Western blot tegen de gefosforyleerde vorm van p53 (P-P53) op lysaten van elke cellijn die gedurende 24 uur geïncubeerd werden met CM (fig. 3.9). De gefosforyleerde vorm van dit eiwit werd gebruikt omdat fosforylatie van het eiwit telkens optreedt bij activatie [39]. Ook werd de aanwezigheid van niet-gemodificeerd p53 aangetoond in de MCF7-GFP en –Rab27B cellen (fig. 3.10). Hiervoor werd er van elke cellijn 20 µg eiwit geladen en alfa-tubuline werd gebruikt als ladingscontrole aangezien dit een huishoud eiwit is dat in elke cellijn met dezelfde confluentie in gelijke mate aanwezig is [40]. In figuur 3.9 is het duidelijk dat P-P53 sterker aanwezig is in de MCF7-GFP cellijn in vergelijking met de MCF7-Rab27B cellijn. Dit zelfde verschil valt ook waar te nemen tussen de T47D-GFP en – Rab27B cellijn, maar in mindere mate. Voor de MCF7-Rab27A en –T23N cellijn is de intensiteit van de bandjes ongeveer even sterk. De niet-gemodificeerde vorm van p53 is echter in gelijke mate aanwezig in de lysaten van MCF7-GFP en –Rab27B cellen (fig. 3.10).

30

Figuur 3.9. Western blot tegen de geactiveerde vorm van p53 op MCF7-GFP, -Rab27B, -Rab27A en –Rab27B-T23N (onderaan) met ladingscontrole alfa-tubuline (bovenaan). Geactiveerd p53 is minder aanwezig in Rab27B getransfecteerde cellijnen in vergelijking met controle GFP cellijnen en in gelijke mate aanwezig in de MCF7-Rab27A en –T23N cellijn. Hier werd voor elke cellijn 20µg eiwit geladen.

Figuur 3.10. Western blot tegen de tumorsupressor p53 op een MCF7-Rab27B lysaat en een controle lysaat van MCF7-GFP. Hier werd er van elk lysaat 20µg eiwit geladen. Er is geen duidelijk verschil waar te nemen tussen beide cellijnen.

31

4. Bespreking In dit onderzoeksproject werd gezocht naar eiwitten die aangerijkt zouden zijn in de exosomen van MCF7 borstkankercellen getransfecteerd met het eiwit Rab27B en die mogelijk verband zouden houden met de eerder beschreven verhoogde invasiviteit van deze cellijn [27]. Hiervoor werd er kwantitatieve tandem massaspectrometrie uitgevoerd op exosomen van de Rab27B getransfecteerde cellijn en een GFP controle cellijn die opgezuiverd werden via iodixanol densiteitsgradiënt centrifugatie. Er werd gezocht naar eiwitten die 2 maal zo veel voorkomen in de MCF7-Rab27B exosomen in vergelijking met de MCF7-GFP exosomen. Uit dit experiment kon waargenomen worden dat de Rab27B exosomen sterk aangerijkt zijn met ribosomale eiwitten en eiwitten die een rol spelen in eiwitmetabolisme (fig.3.3). De aanwezigheid van deze eiwitten in exosomen is al verschillende malen aangetoond via massaspectrometrie, maar er is nog nooit verder op ingegaan [41]–[43]. Dit is dan ook de eerste keer dat er actief gezocht wordt naar de aanwezigheid van eiwitten betrokken in eiwitmetabolisme in exosomen. In de exosomale fracties van de ‘top-down’ gradiënt werden de eiwitten van interesse eEF2, hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 door middel van Western blot enkel terug gevonden bij MCF7-Rab27B en –Rab27A cellen. Een uitzondering hierop was hnRNPQ dat niet in MCF7Rab27A exosomen werd terug gevonden (fig.3.4). Als men echter naar de overige fracties van deze cellijnen kijkt ziet men een smeer van deze eiwitten tot in de exosomale fracties met een iets sterker bandje in de exosomale fracties van de MCF7-Rab27B cellijn (fig.3.5). De eiwitten behalve eEF2 zijn niet waar te nemen in de exosomale fracties van de overige cellijnen, maar wel in de hoger gelegen fracties van de ‘top-down’ gradiënt. Er kan dus niet met zekerheid gezegd worden dat deze eiwitten enkel aangereikt zijn in MCF7-Rab27B exosomen aangezien er een spoor waar te nemen is van de bovenste tot de exosomale fracties (en soms lager), wat niet waar te nemen is voor de exosomale merkers Alix en TSG101. Dit wijst erop dat deze eiwitten kunnen migreren in de gradiënt, zij het in dense complexen of aan de binnen- of buitenkant van vesikeltypes met verschillende densiteit, waaronder exosomen. Het feit dat de eiwitten zich meestal in fracties 1 tot 7 bevinden wijst er ook op dat er nog geen equilibrium is na 18 uur centrifugatie van de gradiënt. Ook Mathivanan et al. melden dat bij exosoom isolaties vaak dense eiwitcomplexen mee geïsoleerd worden [41]. In hun artikel beschrijven ze het verschil in eiwitinhoud van exosomen geïsoleerd door ultracentrifugatie en immunoaffiniteits binding op beads. Zij zien dat exosomen na immunoaffiniteitsscheiding

32

minder eiwitten bevatten die hoge MW complexen vormen dan exosomen geïsoleerd door ultracentrifugatie en geven hieraan de reden dat deze complexen samen met onder andere ribonucleoproteïnen mee zouden kunnen pelleteren in de ultracentrifugatiestap. Ook melden ze dat er een reductie van ribosomale eiwitten optreedt na immunoaffiniteitsscheiding, en in de addenda van het artikel toont men eveneens aan dat eIF3f verloren gaat na binding op beads. Aangezien in dit onderzoek geen densiteitsgradiënt wordt gebruikt zijn de resultaten niet volledig te vergelijken met dit onderzoek, maar het maakt wel duidelijk dat het voorkomen van ribosomale eiwitten in exosomale fracties ook waar te nemen is bij andere isolatie technieken. Uit de massaspectrometrie data kan men ook afleiden dat Rab27B exosomen meer cytosolische eiwitten bevatten dan GFP exosomen (fig. 3.3). Men zou dus kunnen denken dat door Rab27B overexpressie ook de conventionele secretie activiteit stijgt en er hierdoor meer hoge MW complexen waar te nemen zijn in de gradiënt. Deze hypothese kan worden versterkt door het artikel van Tolmachova et al. waarin ze vermelden dat Rab27B ook de vrijstelling van dense granules door bloedplaatjes reguleert [44]. Verder onderzoek in de literatuur wijst aan dat ribosomale eiwitten vaak voorkomen in hoge MW complexen als ‘stressgranules’ [45], [46]. Dit zijn partikels bestaande uit ribosomale eiwitten, translatie initiatiefactoren, RNA-bindende eiwitten en verschillende mRNAs die gevormd worden als gevolg op verschillende stress stimuli. Deze partikels zijn waar te nemen als densere structuren bij conventionele lichtmicroscopie, maar kunnen ook aangetoond worden door fluorescentiemicroscopie gebruikmakend van de typische merker eiwitten TIA1/R en G3BP-1/2 [47]. Er wordt waargenomen dat deze partikels meer voorkomen in kankercellen en dat ze celdood van deze cellen verhinderen door onder andere verschillende signaalbanen te activeren en selectieve mRNAs af te schrijven. Dit zou dus een verklaring kunnen zijn voor de aanwezigheid van hnRNPQ, eIF3f, RPS7 en RPS20 in meerdere fracties van de ‘top-down’ gradiënt (fig.3.5). Stressgranules met verschillende dichtheden (afhangend van de grootte en dus de betrokken eiwitten) zouden zich op verschillende plaatsen van de gradiënt kunnen bevinden na ultracentrifugatie. Dit wordt ook ondersteund door de resultaten van Kedersha et al. die kleine ribosomale subunits terug vonden in een 10%-47% sucrose gradiënt na ultracentrifugatie in dezelfde fracties waar de merkers voor stress granules aanwezig waren [48]. Afgezien van het feit dat er een reductie van ribosomale eiwitten optreedt in het experiment van Mathivanan et al. worden er ook nieuwe ribosomale eiwitten geïdentificeerd na immunoaffiniteitsscheiding, die eerst niet werden opgepikt na enkel ultracentrifugatie (2,

33

supplementaire data). Dit werd echter niet vermeld in het artikel zelf. Ook in het artikel van Tauro et al. rapporteert men een aanrijking van ribosomale eiwitten in exosomen geïsoleerd via ultracentrifugatie, maar ook via densiteitsscheiding op een iodixanol gradiënt en via immunoaffiniteitsscheiding [43]. In de addenda van dit artikel kan men waarnemen dat alle eiwitten van interesse behalve hnRNPQ aanwezig zijn in de exosomen geïsoleerd volgens de drie technieken. Het feit dat deze eiwitten voorkomen in exosomen geïsoleerd volgens ultracentrifugatie en densiteitsscheiding zou verklaard kunnen worden door de aanwezigheid van stressgranules, maar dit kan niet verklaren waarom deze eiwitten zich ook bevinden in exosomen geïsoleerd door immunoaffiniteitsscheiding aangezien er hier geselecteerd wordt op exosomale merkers. Om zeker te zijn of deze eiwitten nu echt exosomaal aangerijkt zijn of dat ze als hoge MW complexen pelleteren of in de gradiënt geraken is het nodig Western blot uit te voeren tegen deze eiwitten en de merkers voor stress granules TIA-1/R en G3BP-1/2 op alle fracties van een densiteitsgradiënt. Om na te gaan of de smeer van eiwitten in de hoger gelegen fracties van ‘top-down’ gradiënten een artefact is van de techniek of het gevolg is van eiwitpartikels die in de gradiënt geraken werd het zelfde experiment herhaald met fracties van ‘bottom-up’ gradiënten. Doordat bij de ‘bottom-up’ gradiënt exosomen van onder naar boven migreren en er zich na 18 uur centrifugatie waarschijnlijk nog geen perfect equilibrium heeft gevormd treedt er een shift op van de fracties waarin de exosomen zich voornamelijk bevinden. Ze bevinden zich in fracties 9 en 10 in plaats van 8 en 9. Na Western blot tegen de eiwitten van interesse op exosomale fracties kon echter geen enkel eiwit, behalve eEF2, terug gevonden worden (fig.3.7). Dezelfde eiwitten konden wel terug gevonden worden in de onderste fracties van de ‘bottom-up’ gradiënten van elke cellijn (fig.3.8). Het principe van deze techniek van exosoomisolatie is dat alle vrije eiwitten aanwezig in het CM onderaan de gradiënt zouden blijven doordat ze niet opwaarts kunnen migreren doorheen de densiteitsgradiënt [38]. Men zou geneigd zijn om te concluderen dat de eiwitten van interesse behalve eEF2 niet exosomaal zijn aangerijkt aangezien ze in de onderste fracties van de ‘bottom-up’ gradiënt blijven zitten, maar zonder validatie van al eerder gevonden exosomaal aangerijkte eiwitten kan men hieruit geen conclusie trekken. Een reden om de ‘bottom-up’ gradiënt niet als standaard te nemen is het fenomeen dat na ponceau kleuring in de exosomale fracties telkens een bandje waar te nemen is net onder 70kDa, wat niet het geval is bij de exosomale fracties van een ‘top-down’ gradiënt (fig. S2). Het is niet geweten waarvan dit bandje afkomstig is, maar men kan hieruit wel stellen dat de exosomale fracties hierbij minder zuiver zijn dan bij

34

de ‘top-down’ gradiënt. Artikels van Zonneveld et al. en Bobrie et al. melden ook dat ‘topdown’ gradiënten efficiënter zijn in het isoleren van extracellulaire vesikels dan ‘bottom-up’ gradiënten. Ze nemen namelijk beiden waar dat exosomale merkers, zij het in lichtere mate, ook aanwezig zijn in fracties met hogere densiteit bij de ‘bottom-up’ gradiënt [49], [50]. Een hypothese hieromtrent wordt gesteld door Zonneveld et al., namelijk dat extracellulaire vesikels aan de bodem van een ultracentrifuge tube moeilijk naar boven zouden kunnen migreren door de vorming van een net van vrije eiwitten aanwezig in het staal [49]. De twee bovenvermelde studies zijn echter wel uitgevoerd met sucrose densiteitsgradiënten, wat een vergelijking met dit onderzoek moeilijk maakt. De antilichamen die gebruikt werden voor Western blot in dit onderzoek bleken niet optimaal te werken. Dit kan afgeleid worden uit het feit dat de exosomale fracties van de MCF7Rab27A cellen eerst positief bleken voor het eiwit RPS20 (fig.3.4), maar in een tweede experiment waar er zelfs meer staal geladen werd waren de exosomale fracties niet meer positief voor het eiwit (fig.3.5c). Dit is ook de reden waarom sommige resultaten voor de eiwitten RPS20, RPS7, hnRNPQ en eIF3f ontbreken. Hierdoor kunnen er bijgevolg geen conclusies gevormd worden of de eiwitten exosomaal aangerijkt zijn of niet. De studie van Choi et al. waarin massaspectrometrie wordt uitgevoerd op exosomale stalen geïsoleerd volgens een sucrose ‘bottom-up’ gradiënt tonen echter ook de aanwezigheid van RPS7 en RPS20 aan (3,supplementaire data). Dit zou ook een bewijs kunnen zijn dat deze ribosomale eiwitten toch aangerijkt zou zijn in exosomen, maar aangezien Western blot veel gevoeliger is dan massaspectrometrie zou dit ook op deze manier gevalideerd moeten worden. Om duidelijke conclusies te kunnen trekken of de eiwitten van interesse in dit onderzoek effectief aangerijkt zijn in exosomen zouden er dus andere, meer betrouwbare antilichamen gebruikt moeten worden. Ook zou het in de toekomst aangeraden zijn om meerdere merkers te gebruiken voor verschillende extracellulaire vesikels. Dit omdat Bobrie et al. melden dat bij ‘bottom-up’ gradiënten niet alle merkers even sterk aanwezig zijn in elke fracties. Zo melden ze voor de exosomale merkers CD9, CD63 en Mfge8 een aanrijking in de 1.14 g/mL fractie, maar Mfge8 is ook sterk aanwezig in hoger gelegen fracties terwijl CD9 ook sterk aanwezig is in lager gelegen fracties [50]. Door meerdere merkers te gebruiken zou men kunnen vaststellen of er in de fracties waarin de eiwitten van interesse zich vooral bevinden ook andere merkers aanwezig zijn. Dit zou dan kunnen wijzen op aanrijking van de eiwitten in specifieke subpopulaties van vesikels.

35

Doordat de eiwitten RPS20, RPS7 en hnRNPQ een invloed zouden kunnen hebben op de activatie van de tumorsuppressor p53 werd de activiteit hiervan nagegaan in elke cellijn via Western blot. Hieruit bleek dat p53 in gelijke mate aanwezig was in het lysaat van MCF7Rab27B en MCF7-GFP cellen (fig. 3.10), maar de gefosforyleerde, geactiveerde vorm ervan bleek sterker aanwezig in de GFP cellijn. Ook in de T47D cellijnen werd het zelfde verschil, maar iets zwakker, waargenomen voor P-P53 (fig. 3.9). Dit zwakkere verschil is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de T47D cellijn dubbel mutant is voor p53 waardoor het constitutief geactiveerd wordt [29]. Dit is tevens de reden waarom de bandjes voor P-P53 sterker zijn in de T47D cellijn in vergelijking met de MCF7 cellijn. Aangezien hnRNPQ in geen enkele fractie van beide T47D cellen waargenomen kon worden, maar wel in de MCF7 cellen kan dit eiwit niet de oorzaak zijn van de lagere p53 activiteit in Rab27B getransfecteerde cellen. Voor RPS20 en RPS7 werden wel relatief sterkere bandjes waargenomen in de fracties van de Rab27B getransfecteerde cellijnen in vergelijking met de GFP getransfecteerde cellijnen (fig.3.5a,b,e,f en fig.3.8a,b,d,e). Hieruit kan men echter geen conclusies trekken omdat er van elke cellijn verschillende concentraties werden geladen op andere tijdstippen en op andere gels. Om kwantitatief een verschil waar te nemen tussen beide cellijnen zouden beide stalen met gelijke concentraties naast elkaar geladen moeten worden in de gel. Het valt echter wel aan te nemen dat een verhoogde vrijstelling van deze ribosomale subunits een verminderde activiteit van p53 als gevolg zou kunnen hebben. Het is aangetoond dat beide ribosomale eiwitten het oncogen MDM2 binden waardoor de ubiquitine ligase activiteit van dit laatste eiwit geïnhibeerd wordt en p53 vrij kan komen en gefosforyleerd kan worden. Ook is er bij overexpressie van beide eiwitten een verhoogde transcriptionele activiteit van p53 waar te nemen [22], [34]. Als de Rab27B getransfecteerde cellijnen effectief meer ribosomale eiwitten secreteren dan zou men kunnen denken dat de MDM2-p53 signaalbaan minder onderbroken wordt en dus p53 minder geactiveerd wordt. Door een verminderde p53 activiteit zouden de kankercellen sneller kunnen prolifereren waardoor er weer meer mutaties opgelopen kunnen worden en uiteindelijk invasief worden. Of overexpressie van Rab27B ook echt een verhoogde secretie van ribosomale eiwitten, verpakt in exosomen of onder de vorm van stress partikels, als gevolg heeft zou in de toekomst aangetoond kunnen worden door Western blot uit te voeren op deze eiwitten aanwezig in CM van beide cellijnen. Op deze manier krijgt men een totaal beeld van hoeveel van deze eiwitten er daadwerkelijk gesecreteerd worden. Verder zou er ook nagegaan kunnen worden of overexpressie van deze eiwitten de activatiegraad van p53 verandert of niet.

36

Uit dit onderzoek kan men dus afleiden dat de elongatiefactor eEF2 exosomaal is aangerijkt in elke cellijn aangezien de aanwezigheid ervan is aangetoond in exosomale fracties van ‘topdown’ en ‘bottom-up’ gradiënten. De reden hiervoor is niet duidelijk, maar door de aanwezigheid ervan in exosomen van cellen van andere weefsels te testen zou men dit eiwit als standaard exosomaal aangerijkt kunnen zien. Aangezien dit eiwit ook aanwezig is in de overige ODG fracties lijkt het er op dat dit eiwit ook gecomplexeerd gesecreteerd wordt. Ook werd er voor het eerst gerapporteerd over de aanwezigheid van hnRNPQ in exosomen, maar verder onderzoek met betere antilichamen zou dit met meer zekerheid moeten kunnen aantonen. Het verschil tussen een ‘top-down’ en een ‘bottom-up’ gradiënt werd ook nagegaan, en men kon duidelijk waarnemen dat vrije eiwitten bij een ‘top-down’ gradiënt in de bovenste fracties blijven en bij een ‘bottom-up’ gradiënt in de onderste fracties. Welke techniek er nu beter is voor het isoleren van exosomen kan niet gezegd worden aangezien er maar getest werd met twee exosomale merkers. Om een beeld te krijgen over de isolatie van een homogene exosoom populatie zouden er meer exosomale merkers moeten gebruikt worden en de aanwezigheid ervan getest worden in alle fracties van de gradiënt. Tot slot kan men ook concluderen dat een verhoogde expressie van het secretoire eiwit Rab27B een verlaagde p53 activiteit met zich mee brengt in MCF7 en T47D borstkankercellen. Dit zou de verhoogde graad van invasie van MCF7-Rab27B cellen kunnen verklaren. Of dit fenomeen te wijten is aan een verhoogde secretie van de ribosomale eiwitten RPS7 en RPS20, verpakt in exosomen of onder de vorm van stress granules, dient in de toekomst nog duidelijk gemaakt te worden.

37

5. Referenties [1]

N. M. Sherer and W. Mothes, “cytonemes and tunneling nanotubules in cell-cell communication and viral pathogenesis,” Cell, vol. 18, no. 9, pp. 414–420, 2009.

[2]

C. Campanella, C. C. Bavisotto, A. M. Gammazza, D. Nikolic, F. Rappa, S. David, F. Cappello, F. Bucchieri, and S. Fais, “Exosomal Heat Shock Proteins as New Players in Tumour Cell-to-cell Communication,” J. Circ. Biomarkers, p. 1, 2014.

[3]

M. Colombo, G. Raposo, and C. Théry, “Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles,” Annu. Rev. Cell Dev. Biol., vol. 30, no. 1, 2014.

[4]

H. G. Zhang and W. E. Grizzle, “Exosomes: A novel pathway of local and distant intercellular communication that facilitates the growth and metastasis of neoplastic lesions,” Am. J. Pathol., vol. 184, no. 1, pp. 28–41, 2014.

[5]

C. Théry, L. Zitvogel, and S. Amigorena, “Exosomes: composition, biogenesis and function.,” Nat. Rev. Immunol., vol. 2, no. 8, pp. 569–579, 2002.

[6]

S. Kruger, Z. Y. Abd Elmageed, D. H. Hawke, P. M. Wörner, D. a Jansen, A. B. Abdel-Mageed, E. U. Alt, and R. Izadpanah, “Molecular characterization of exosome-like vesicles from breast cancer cells.,” BMC Cancer, vol. 14, p. 44, 2014.

[7]

O. G. de Jong, M. C. Verhaar, Y. Chen, P. Vader, H. Gremmels, G. Posthuma, R. M. Schiffelers, M. Gucek, and B. W. M. van Balkom, “Cellular stress conditions are reflected in the protein and RNA content of endothelial cell-derived exosomes,” J. Extracell. Vesicles, vol. 1, no. 0, pp. 1–12, 2012.

[8]

J. Van Deun, P. Mestdagh, R. Sormunen, V. Cocquyt, K. Vermaelen, J. Vandesompele, M. Bracke, O. De Wever, and A. Hendrix, “The Impact of Disparate Isolation Methods for Extracellular Vesicles on Downstream RNA Profiling,” PLoS One, 2014.

[9]

J. P. Luzio, V. Poupon, M. R. Lindsay, B. M. Mullock, R. C. Piper, and P. R. Pryor, “Membrane dynamics and the biogenesis of lysosomes (Review),” Mol. Membr. Biol., vol. 20, no. 2, pp. 141–154, Jan. 2003.

[10]

W. Stoorvogel, G. J. Strous, H. J. Geuze, V. Oorschot, and A. L. Schwartzt, “Late endosomes derive from early endosomes by maturation,” Cell, vol. 65, no. 3, pp. 417–427, May 1991.

[11]

M. Ostrowski, N. B. Carmo, S. Krumeich, I. Fanget, G. Raposo, A. Savina, C. F. Moita, K. Schauer, A. N. Hume, R. P. Freitas, B. Goud, P. Benaroch, N. Hacohen, M. Fukuda, C. Desnos, M. C. Seabra, F. Darchen, S. Amigorena, L. F. Moita, and C. Thery, “Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway.,” Nat. Cell Biol., vol. 12, no. 1, pp. 19–30; sup pp 1–13, 2010.

[12]

J. L. Hood, S. San Roman, and S. a. Wickline, “Exosomes released by melanoma cells prepare sentinel lymph nodes for tumor metastasis,” Cancer Res., vol. 71, no. 11, pp. 3792–3801, 2011.

[13]

C. Barrès, L. Blanc, P. Bette-Bobillo, S. André, R. Mamoun, H. J. Gabius, and M. Vidal, “Galectin-5 is bound onto the surface of rat reticulocyte exosomes and modulates vesicle uptake by macrophages,” Blood, vol. 115, no. 3, pp. 696–705, 2010.

[14]

D. Skokos, H. G. Botros, C. Demeure, J. Morin, R. Peronet, G. Birkenmeier, S. Boudaly, and S. Mécheri, “Mast cell-derived exosomes induce phenotypic and functional maturation of dendritic cells and elicit specific immune responses in vivo.,” J. Immunol., vol. 170, no. 6, pp. 3037–3045, 2003.

38

[15]

C. Frühbeis, D. Fröhlich, W. P. Kuo, J. Amphornrat, S. Thilemann, A. S. Saab, F. Kirchhoff, W. Möbius, S. Goebbels, K. A. Nave, A. Schneider, M. Simons, M. Klugmann, J. Trotter, and E. M. Krämer-Albers, “Neurotransmitter-Triggered Transfer of Exosomes Mediates Oligodendrocyte-Neuron Communication,” PLoS Biol., vol. 11, no. 7, 2013.

[16]

J. S. Bertram, “The molecular biology of cancer,” Mol. Aspects Med., vol. 21, no. 6, pp. 167–223, Dec. 2000.

[17]

D. Hanahan and R. a. Weinberg, “Hallmarks of cancer: The next generation,” Cell, vol. 144, no. 5, pp. 646–674, 2011.

[18]

D. Silvera, S. C. Formenti, and R. J. Schneider, “Translational control in cancer.,” Nat. Rev. Cancer, vol. 10, no. 4, pp. 254–66, Apr. 2010.

[19]

D. Silvera, S. C. Formenti, and R. J. Schneider, “Translational control in cancer etiology.,” Nat. Rev. Cancer, vol. 10, no. 4, pp. 254–266, 2010.

[20]

F. Wen, R. Zhou, A. Shen, A. Choi, D. Uribe, and J. Shi, “The tumor suppressive role of eIF3f and its function in translation inhibition and rRNA degradation,” PLoS One, vol. 7, no. 3, 2012.

[21]

N. Shenoy, R. Kessel, T. Bhagat, S. Bhattacharya, Y. Yu, C. Mcmahon, and A. Verma, “Alterations in the ribosomal machinery in cancer and hematologic disorders,” J. Hematol. Oncol., vol. 5, no. 1, p. 32, 2012.

[22]

L. Daftuar, Y. Zhu, X. Jacq, and C. Prives, “Ribosomal Proteins RPL37, RPS15 and RPS20 Regulate the Mdm2-p53-MdmX Network,” PLoS One, vol. 8, no. 7, 2013.

[23]

A. Hendrix and A. N. Hume, “exosome signaling in mammary gland development and cancer,” Int J Dev Biol, vol. 55, no. 7–9, pp. 719–729, 2011.

[24]

J. P. Webber, L. K. Spary, a J. Sanders, R. Chowdhury, W. G. Jiang, R. Steadman, J. Wymant, a T. Jones, H. Kynaston, M. D. Mason, Z. Tabi, and a Clayton, “Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes,” Oncogene, no. August 2013, pp. 1–13, 2014.

[25]

C. Liu, S. Yu, K. Zinn, J. Wang, L. Zhang, Y. Jia, J. C. Kappes, S. Barnes, R. P. Kimberly, W. E. Grizzle, and H.-G. Zhang, “Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function,” J. Immunol., vol. 176, no. 3, pp. 1375–1385, 2006.

[26]

S. Khan, J. M. S. Jutzy, J. R. Aspe, D. W. McGregor, J. W. Neidigh, and N. R. Wall, “Survivin is released from cancer cells via exosomes,” Apoptosis, vol. 16, no. 1, pp. 1–12, 2011.

[27]

A. Hendrix, D. Maynard, P. Pauwels, G. Braems, H. Denys, R. Van Den Broecke, J. Lambert, S. Van Belle, V. Cocquyt, C. Gespach, M. Bracke, M. C. Seabra, W. a. Gahl, O. De Wever, and W. Westbroek, “Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis,” J. Natl. Cancer Inst., vol. 102, no. 12, pp. 866–880, 2010.

[28]

“American Type Culture Collection,” 2015. [Online]. Available: http://www.lgcstandards-atcc.org.

[29]

R. M. Neve, K. Chin, J. Fridlyand, J. Yeh, L. Frederick, T. Fevr, L. Clark, N. Bayani, J. Coppe, F. Tong, T. Speed, P. T. Spellman, S. Devries, A. Lapuk, N. J. Wang, J. L. Stilwell, D. Pinkel, D. G. Albertson, F. M. Waldman, R. B. Dickson, M. D. Johnson, M. Lippman, S. Ethier, A. Gazdar, J. W. Gray, L. S. Division, and L. Berkeley, “A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally,” Cancer Cell, vol. 10, no. 6, pp. 515–527, 2006.

[30]

B. Carr and M. Wright, “Nanoparticle Tracking Analysis A Review of Appliations and Usage 20102012,” vol. 44, no. 0, pp. 1–193, 2012.

39

[31]

O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, a. L. Farr, and R. J. Randall, “Protein measurement with the Folin phenol reagent.,” J. Biol. Chem., vol. 193, no. 1, pp. 265–275, 1951.

[32]

N. Rauniyar and J. R. Yates, “Isobaric Labeling-Based Relative Quanti fi cation in Shotgun Proteomics.”

[33]

Pathan, “FunRich enables biologists to perform bioinformatics analysis.”

[34]

D. Chen, Z. Zhang, M. Li, W. Wang, Y. Li, E. R. Rayburn, D. L. Hill, H. Wang, and R. Zhang, “Ribosomal protein S7 as a novel modulator of p53-MDM2 interaction: binding to MDM2, stabilization of p53 protein, and activation of p53 function.,” Oncogene, vol. 26, no. 35, pp. 5029–5037, 2007.

[35]

J. W. B. Hershey, “The role of eIF3 and its individual subunits in cancer,” Biochim. Biophys. Acta Gene Regul. Mech., 2014.

[36]

D.-Y. Kim, W. Kim, K.-H. Lee, S.-H. Kim, H.-R. Lee, H.-J. Kim, Y. Jung, J.-H. Choi, and K.-T. Kim, “hnRNP Q regulates translation of p53 in normal and stress conditions,” Cell Death Differ., vol. 20, no. 2, pp. 226–234, 2012.

[37]

Y. Oji, N. Tatsumi, M. Fukuda, S. I. Nakatsuka, S. Aoyagi, E. Hirata, I. Nanchi, F. Fujiki, H. Nakajima, Y. Yamamoto, S. Shibata, M. Nakamura, K. Hasegawa, S. Takagi, I. Fukuda, T. Hoshikawa, Y. Murakami, M. Mori, M. Inoue, T. Naka, T. Tomonaga, Y. Shimizu, M. Nakagawa, J. Hasegawa, R. Nezu, H. Inohara, S. Izumoto, N. Nonomura, T. Yoshimine, M. Okumura, E. Morii, H. Maeda, S. Nishida, N. Hosen, A. Tsuboi, Y. Oka, and H. Sugiyama, “The translation elongation factor eEF2 is a novel tumor-associated antigen overexpressed in various types of cancers,” Int. J. Oncol., vol. 44, no. 5, pp. 1461–1469, 2014.

[38]

H. Fischer, I. Polikarpov, and A. F. Craievich, “Average protein density is a molecular-weight-dependent function.,” Protein Sci., vol. 13, no. 10, pp. 2825–8, Oct. 2004.

[39]

a J. Levine, W. Hu, and Z. Feng, “The P53 pathway: what questions remain to be explored?,” Cell Death Differ., vol. 13, no. 6, pp. 1027–1036, 2006.

[40]

S. Greer, R. Honeywell, M. Geletu, R. Arulanandam, and L. Raptis, “Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.,” J. Immunol. Methods, vol. 355, no. 1–2, pp. 76–9, Apr. 2010.

[41]

S. Mathivanan, J. W. E. Lim, B. J. Tauro, H. Ji, R. L. Moritz, and R. J. Simpson, “Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature.,” Mol. Cell. Proteomics, vol. 9, no. 2, pp. 197–208, Feb. 2010.

[42]

D.-S. Choi, J.-M. Lee, G. W. Park, H.-W. Lim, J. Y. Bang, Y.-K. Kim, K.-H. Kwon, H. J. Kwon, K. P. Kim, and Y. S. Gho, “Proteomic analysis of microvesicles derived from human colorectal cancer cells.,” J. Proteome Res., vol. 6, no. 12, pp. 4646–55, Dec. 2007.

[43]

B. J. Tauro, D. W. Greening, R. A. Mathias, H. Ji, S. Mathivanan, A. M. Scott, and R. J. Simpson, “Comparison of ultracentrifugation, density gradient separation, and immunoaffinity capture methods for isolating human colon cancer cell line LIM1863-derived exosomes.,” Methods, vol. 56, no. 2, pp. 293– 304, Feb. 2012.

[44]

T. Tolmachova, M. Abrink, C. E. Futter, K. S. Authi, and M. C. Seabra, “Rab27b regulates number and secretion of platelet dense granules.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 104, no. 14, pp. 5872–7, Apr. 2007.

[45]

P. Anderson, N. Kedersha, and P. Ivanov, “Stress granules, P-bodies and cancer,” Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech., 2014.

40

[46]

N. Kedersha, P. Ivanov, and P. Anderson, “Stress granules and cell signaling: More than just a passing phase?,” Trends Biochem. Sci., vol. 38, no. 10, pp. 494–506, 2013.

[47]

M. D. Panas, N. Kedersha, and G. M. McInerney, “Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.,” Methods, Apr. 2015.

[48]

N. Kedersha, S. Chen, N. Gilks, W. Li, I. J. Miller, J. Stahl, and P. Anderson, “Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.,” Mol. Biol. Cell, vol. 13, no. 1, pp. 195–210, Jan. 2002.

[49]

M. I. Zonneveld, A. R. Brisson, M. J. C. van Herwijnen, S. Tan, C. H. A. van de Lest, F. A. Redegeld, J. Garssen, M. H. M. Wauben, and E. N. M. Nolte-’t Hoen, “Recovery of extracellular vesicles from human breast milk is influenced by sample collection and vesicle isolation procedures.,” J. Extracell. vesicles, vol. 3, Jan. 2014.

[50]

A. Bobrie, M. Colombo, S. Krumeich, G. Raposo, and C. Théry, “Diverse subpopulations of vesicles secreted by different intracellular mechanisms are present in exosome preparations obtained by differential ultracentrifugation.,” J. Extracell. vesicles, vol. 1, Jan. 2012.

41

Bijlage Tabel S1. Eiwitten aangereikt in Rab27B exosomen en GFP exosomen. Rab 27B

GFP Uniprot accession number

Eiwit

Uniprot accession number

Eiwit

40S ribosomal protein S20

P60866

Folate transporter 1

P41440

DNA damage-binding protein 1

Q16531

14-3-3 protein eta

Q04917

Leucyl-tRNA synthetase

Q9P2J5

PDZ domain-containing protein GIPC1

O14908

Ras-related protein Rab-27B

O00194

G-protein coupled receptor family C group 5 Q9NQ84 member C

Tubulin alpha-1C chain

Q9BQE3

14-3-3 protein theta

P27348

Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit L (eIF3l)

Q9Y262

14-3-3 protein gamma

P61981

Semaphorin-3C

Q99985

40S ribosomal protein S14

P62263

14-3-3 protein zeta/delta P63104 D-dopachrome P30046 decarboxylase

Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15

P53999

D-dopachrome tautomerase

Q53Y51

40S ribosomal protein S13

P62277

Neurogenic locus notch homolog protein 1

P46531

40S ribosomal protein S3a

P61247

Integrin beta-1

P05556

60S ribosomal protein L10a

P62906

Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)

P05362

Growth/differentiation factor 15 Q99988 (GDF-15)

Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor

Q86X29

4F2 cell-surface antigen heavy chain

P08195

Metal transporter CNNM3

Q8NE01

Glucose-6-phosphate 1dehydrogenase (G6PD) (EC 1.1.1.49)

P11413

Choline transporter-like protein 1

Q8WWI5

FACT complex subunit SPT16

Q9Y5B9

Syndecan-1

P18827

Mitogen-activated protein kinase 3

P27361

Thrombospondin-1

P07996

Paired amphipathic helix protein Q96ST3 Sin3a

GammaP19440 glutamyltranspeptidase 1

Amidophosphoribosyltransferase Q06203 (ATase)

Transmembrane protein 51

Q9NW97

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q (hnRNP Q)

O60506

Breast cancer antiestrogen resistance protein 1

P56945

Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit A (eIF3a)

Q14152

Tetraspanin-15

O95858

AP-3 complex subunit beta-1

O00203

EH domain-containing protein 4

Q9H223

Ubiquitin-like modifier-activating A0AVT1 enzyme 6

Disco-interacting protein 2 homolog B

Q9P265

40S ribosomal protein S7

P62081

N(G),N(G)dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (DDAH-2)

O95865

Interleukin enhancer-binding factor 3

Q12906

Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2

V9HW53

Nucleolin

P19338

Ras-related protein Rap2a

P10114

Annexin A1 Annexin

P04083 Q5TZZ9

Integrin beta-5 Protein FAM102A

P18084 Q5T9C2

Large neutral amino acids transporter small subunit 1

Q01650

Prominin 2

A0A024RE18

40S ribosomal protein S12

P25398

Vinculin

P18206

Heat shock protein beta-1 (HspB1)

P04792

Epididymis secretory protein Li 102

V9HW43

Integrin alpha-2

P17301

26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14

O00487

Alpha-2-HS-glycoprotein

P02765

40S ribosomal protein S25

P62851

Peroxidasin homolog

Q92626

40S ribosomal protein S24

P62847

MARCKS-related protein

P49006

40S ribosomal protein S4

P62701

SLIT-ROBO Rho GTPaseactivating protein 2

O75044

HCG26477

B2R4R9

Ras-related protein Rap2c

Q9Y3L5

40S ribosomal protein S28

P62857

Guanine nucleotidebinding protein subunit gamma

A0A024R156

Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit F (eIF3f)

O00303

Guanine nucleotidebinding protein

P50151

Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C (eIF3c)

Q99613

Peroxiredoxin-2

P32119

ATP-dependent 6phosphofructokinase, platelet type

Q01813

Scavenger receptor class B member 1

Q8WTV0

Serine/arginine-rich splicing factor 1

Q07955

Cytoplasmic FMR1interacting protein 2

Q96F07

40S ribosomal protein S9

P46781

Keratin, type I cytoskeletal 16

P08779

Tubulin beta-1 chain

Q9H4B7

Sushi domain-containing protein 2

Q9UGT4

Tubulin beta-3 chain

Q13509

CD82 antigen

P27701

40S ribosomal protein S16

P62249

Integrin alpha-V

P06756

Tubulin beta-4B chain Tubulin beta-6 chain Carboxypeptidase D Isoleucine--tRNA ligase Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2

P68371 Q9BUF5 O75976 P41252

Protein S100-A16 Kit ligand Mucin-5B MUC1 isoform J14 Golgin subfamily A member 7B

Q96FQ6 P21583 Q9HC84 B6ECA3

P62316

Q2TAP0

Cation-independent mannose-6P11717 phosphate receptor

Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5

P06731

40S ribosomal protein S3

P23396

Protein shisa-2 homolog

Q6UWI4

40S ribosomal protein SA

P08865

Tetraspanin-14

Q8NG11

Epsilon-COP

Q7Z4Z1

Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal

P35908

Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2

P07910

ATP-binding cassette subQ86UK0 family A member 12

UDP-glucose 6-dehydrogenase

O60701

Keratin, type II cytoskeletal 1

P04264

40S ribosomal protein S8

P62241

Galectin-3-binding protein

Q08380

Grancalcin Tubulin--tyrosine ligase-like protein 12

P28676

Lysine--tRNA ligase Coatomer subunit beta

Q15046 P53618

Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M

Q7L2H7

T-complex protein 1 subunit theta

P50990

ATP-dependent 6phosphofructokinase, liver type

P17858

Q14166

Aspartate--tRNA ligase Cell cycle and apoptosis regulator protein 2

P14868

E-cadherin

Q9UII7

Q8N163

DNA topoisomerase 2-beta

Q02880

Leucine-rich repeat-containing protein 59

Q96AG4

Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR2

Q01974

Vang-like protein 1 Protein YIPF6

Q8TAA9 Q96EC8

Coatomer subunit gamma-1

Q9Y678

Copine-3 Arginine--tRNA ligase Coatomer subunit alpha Spermidine synthase

O75131 P54136 P53621 P19623

Figuur S1. Ponceau kleuring van nitrocellulose membranen na Western Blot op ‘top-down’ fracties (a) en ‘bottom-up’ fracties (b). Bij de ‘top-down’ gradiënt is er een grote hoeveelheid eiwitten aanwezig in de bovenste fracties (a) en bij de ‘bottom-up’ gradiënt zijn er meer eiwitten aanwezig in de onderste fracties (b).

Figuur S2. Ponceau S kleuring na Western Blot op exosomale fracties van (a) ‘top-down’ gradiënt en (b) ‘bottom-up’ gradiënt. Bij de ‘bottom-up’ gradiënt ziet men in elke exosomale fractie een bandje net onder de 70kDa merker, wat niet te zien is in de exosomale fracties van een ‘top-down’ gradiënt.