FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
!
Academiejaar 2013-2014
Tumor-geassocieerde fibroblasten en hun rol in de prognose van kanker
Capucine Verstraete Promotor: Prof. Dr. Olivier De Wever
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER IN DE GENEESKUNDE
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
!
Academiejaar 2013-2014
Tumor-geassocieerde fibroblasten en hun rol in de prognose van kanker
Capucine Verstraete Promotor: Prof. Dr. Olivier De Wever
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER IN DE GENEESKUNDE
Voorwoord Deze literatuurstudie was een serieuze uitdaging voor mij. Het zeer actueel onderwerp en de verschillende recente publicaties daaromtrent, maakten het onderzoek er niet gemakkelijker op. Gedurende twee jaar heb ik mij ingezet om deze masterproef tot een goed einde te brengen. Ik hoop dat ik met deze studie een mooie analyse van de recente resultaten in het onderzoek naar TAF en hun rol in de prognose van kanker heb gemaakt. Dit alles zou echter niet mogelijk geweest zijn zonder de hulp van Professor Dr. Olivier De Wever. Ik zou hem graag bedanken voor het mij op weg helpen in deze literatuurstudie, voor alle tips omtrent het opzoeken van de artikelen en het synthetiseren van de resultaten, voor het verbeteren van de voorlopige versies, de handige feedback en alle nuttige opmerkingen in de kantlijn. Dank aan hem voor alle tijd die hij aan mijn masterproef besteed heeft. Professor Dr. Alain Verstraete wil ik bedanken voor de logistieke ondersteuning, de uitleg rond het gebruik van EndNote en alle antwoorden op mijn praktische vragen. Ten slotte wil ik mijn ouders bedanken voor de aanmoedigingen en de ondersteuning tijdens mijn studies.
Inhoudsopgave A. ABSTRACT ....................................................................................................................................................... 1 B. INLEIDING ....................................................................................................................................................... 1 C. ONDERZOEKSVRAAG EN METHODOLOGIE ........................................................................................... 8 D. RESULTATEN .................................................................................................................................................. 8 1. TUMOR-‐GEASSOCIEERDE FIBROBLASTEN ...................................................................................................................... 8 1.1 Wat zijn TAF? ................................................................................................................................................................ 8 1.2 Oorsprong .................................................................................................................................................................... 12 1.2.1 TAF afgeleid van fibroblasten ......................................................................................................................................................... 12 1.2.2 TAF afgeleid van epitheliale cellen ............................................................................................................................................... 12 1.2.3 TAF afgeleid van stamcellen afkomstig van het beenmerg ................................................................................................ 13 1.2.4 TAF afgeleid van endotheelcellen ................................................................................................................................................. 14 1.2.5 TAF en myofibroblasten .................................................................................................................................................................... 14 1.2.6 TAF afgeleid van adipocyten ........................................................................................................................................................... 14
1.3 TAF en signaalmoleculen betrokken in de carcinogenese ..................................................................... 15 1.3.1 Tumor Groeifactor β ........................................................................................................................................................................... 16 1.3.2 Hepatocyt Groeifactor ........................................................................................................................................................................ 17 1.3.3 Pro-‐inflammatoire cytokines: IL-‐1β, IL6, IL33, osteopontin en COX-‐2 ......................................................................... 17 1.3.4 CCL 5 en IL-‐17B ..................................................................................................................................................................................... 18 1.3.5 Insuline growth factor -‐1 en -‐2 ....................................................................................................................................................... 18 1.3.6 Caveolin-‐1 ................................................................................................................................................................................................ 18 1.3.7 Galectin-‐1 ................................................................................................................................................................................................. 19 1.3.8 Tenascin-‐C ............................................................................................................................................................................................... 20 1.3.9 Matrixmetalloproteïnasen ................................................................................................................................................................ 20 1.3.10 Urokinase-‐type plasminogeen acitvator ................................................................................................................................. 22 1.3.11 Fibronectin ........................................................................................................................................................................................... 22 1.3.12 Fibroblast-‐activerende proteïne ................................................................................................................................................. 23 1.3.13 Podoplanin ........................................................................................................................................................................................... 23 1.3.14 Type I collageen en reactief stroma .......................................................................................................................................... 23
1.4 TAF en genetische veranderingen ..................................................................................................................... 24 2. CARCINOGENESE EN DE ROL VAN TAF ....................................................................................................................... 25 2.1 Algemeen ..................................................................................................................................................................... 25 2.2 TAF en hun invloed op de ECM ........................................................................................................................... 26 2.3 TAF en hun invloed op het metabolisme ........................................................................................................ 28 2.4 TAF en hun invloed op de tumorangiogenese .............................................................................................. 29 2.5 TAF en hun invloed op de inflammatie ........................................................................................................... 31 2.6 TAF en de krachtsafhankelijke transformatie van de matrix ............................................................... 34 3. METASTASE EN INVASIE EN DE ROL VAN TAF ........................................................................................................... 34 3.1 Algemeen ..................................................................................................................................................................... 34 3.2 TAF en de pre-‐metastatische niche .................................................................................................................. 36 3.3 TAF en de vorming van metastasen ................................................................................................................. 37 3.4 TAF en de vorming en activatie van micrometastasen ........................................................................... 38 4. TAF ALS PREDICTIEVE MERKER ................................................................................................................................... 39 4.1 Algemeen ..................................................................................................................................................................... 39 4.2 Kenmerken van TAF die respons op medicatie bepalen .......................................................................... 39 4.3 TAF en radioresistentie ......................................................................................................................................... 41 4.4 TAF en chemotherapie ........................................................................................................................................... 43 E. ALGEMEEN BESLUIT-‐DISCUSSIE ............................................................................................................ 46 F. REFERENTIES ............................................................................................................................................... 48
A. Abstract Tumor-geassocieerde fibroblasten (TAF) zijn één van de belangrijkste componenten van de tumor micro-omgeving en zijn sterk betrokken in het tumorproces. Ze beïnvloeden de groei van tumoren en metastasen en de angiogenese. Daarnaast manipuleren ze de inflammatoire reactie rond de tumor zodat deze optimaal kan groeien. De communicatie tussen de kankercellen en de micro-omgeving bepaalt in belangrijke mate de progressie ervan. Deze communicatie gebeurt door secretie van verschillende signaalmoleculen en transformatie van de extracellulaire matrix (ECM). In deze literatuurstudie werd er onderzoek verricht naar de invloed van TAF op de prognose van kanker in recente artikels. Uit dit onderzoek blijkt dat TAF de prognose van tumoren in sterke mate bepalen. Door hun invloed op de tumorigenese en angiogenese zorgen ze voor tumoren met een groter volume. Door modulatie van de ECM stimuleren ze de vorming van metastasen. Daarnaast worden ze ook als predictieve merkers beschouwd. Men kan aan de hand van deze TAF de reactie op therapie bepalen. De rol van TAF in het tumorproces is al grotendeels verhelderd maar toch zijn er nog verschillende elementen die nog verder onderzocht zouden moeten worden. Onder andere hoe TAF de evolutie van micrometastasen naar macrometastasen beïnvloeden en het effect hiervan op de mortaliteit van een tumor. Verder zou de therapie specifiek gericht op TAF en wat nu juist de rol van TAF in het tumorproces bepaalt, uitgediept moeten worden.
B. Inleiding Verschillende factoren spelen een rol in de prognose van kanker. Op de eerste plaats heb je de elementen die de TNM-classificatie en dus de graad van invasie bepalen. Dit zijn de grootte van de tumor of de lokale tumoruitbreiding, de regionale lymfeklierinvasie en de aanwezigheid van metastasen op afstand. Daarbij komt nog de reactie op therapie, het stadium waarin de tumor zich bevindt, de groeisnelheid ervan, de differentiatiegraad van de tumor, de angiogenese errond en de weefsels betrokken in het tumorproces. Daarnaast zijn er ook verschillende patiënt-afhankelijke factoren, die de prognose bepalen. Zo kunnen de leeftijd, de algemene gezondheidstoestand, comorbiditeiten, drugs- en alcoholmisbruik, bereidheid tot therapie en therapietrouw van belang zijn in de prognose en de evolutie van de patiënt. (1) Tumoren ontwikkelen zich uit normale stamcellen door een accumulatie van genetische mutaties in het groei-controlerend systeem. (2) Tumorgroei is afhankelijk van interacties tussen 1
verschillende celtypes, van signaalwegen geïnduceerd door cel-celinteracties, en van de productie van groeifactoren en cytokines, gesecreteerd door de omgevende stromale cellen. (3) Tumoren hebben over het algemeen een lange latentieperiode. Ze moeten een minimale grootte of gewicht hebben opdat ze gediagnosticeerd zouden kunnen worden. Tijdens deze latentieperiode gaat het grootste deel van de ontwikkeling van de tumor door, hij kan zich dus al in een vergevorderd stadium bevinden vooraleer hij symptomatisch wordt. (1) Tumoren kunnen de gezondheid van een patiënt op verschillende manieren beïnvloeden. Aan de ene kant veroorzaken ze lokale symptomen: lokale pijn, zwellingen, ze kunnen een verandering in of verlies van functie geven, bloedverlies uit één van de lichaamsopeningen of verandering in de samenstelling of frequentie van stoelgang. Daarbij kan metastasering dezelfde symptomen geven in de organen waar metastasen optreden. Tumoren kunnen stoffen produceren of mechanismen activeren, die een invloed hebben op afstand. Daardoor kunnen andere organen of systemen een verandering in hun functie krijgen (bv. inflammatoire reacties rond een tumor en de paraneoplastische syndromen). Bij de diagnostiek is het belangrijk om snel een onderscheid te maken tussen een goedaardige en een kwaadaardige tumor. Dit is echter niet altijd even gemakkelijk, want hoe beter de differentiatiegraad van een kwaadaardige tumor, hoe moelijker het is om de kwaadaardige cellen te onderscheiden van normale cellen in een biopt. Echter hoe vroeger de diagnose gesteld wordt, hoe beter de prognose van de patiënt is. (1) Tumoren zijn enerzijds opgebouwd uit kankercellen en anderzijds uit stroma. De belangrijkste componenten van dit stroma zijn de ECM, bloedvaten, fibroblasten en ontstekingscellen. De lokale infiltratieve tumorgroei en metastasering van een tumor spelen zich af binnen een ecosysteem. Kankercellen verwerven de mogelijkheid om zich te vermenigvuldigen, te invaderen en te metastaseren door kritische mutaties. Maar of de tumor zich kan ontwikkelen hangt af van de weerstand en de medewerking van de omringende stromale cellen. Kankercellen kunnen allerlei paracriene signalen produceren, die een invloed hebben op hun naburige cellen en waarmee ze het stroma kunnen omvormen tot een permissieve en onderhoudende omgeving voor kankerprogressie. Een tumor maakt voor de invasie gebruik van gelijkaardige mechanismen als bij de fysiologische invasie, een belangrijk element in het wondgenezingsproces. Het grote verschil met het wondgenezingsproces is echter het persisterend karakter van de kankerinvasie. (1)
2
Eén van de belangrijkste componenten van het tumorstroma zijn de tumor-geassocieerde fibroblasten (TAF). Dit zijn celtypes die sterk gelijken op myofibroblasten. (1) TAF promoten de groei en invasie van kankercellen via verschillende mechanismen. (3) Er zijn interacties tussen deze TAF en de hypoxische kankercellen. Zo spelen zij een belangrijke rol in het kankerproces en dus in de prognose van de verschillende tumoren. (4) TAF zijn grote staafvormige mesenchymale cellen met spanningsvezels en een goed ontwikkelde fibronexus. Ze brengen meestal alfa-smooth-muscle actin (α-SMA), fibroblast activerende proteïne (FAP), fibroblast specifieke proteine (FSP), neuro-gliaal antigen 2 en platelet-derived groeifactor (PDGF) α en β receptor tot expressie. α-SMA is een specifieke actine-vorm betrokken bij de contractie van cellen en speelt dus een rol in de beweeglijkheid van de cel. Het is dé merker van de myofibroblasten. De verzameling TAF is heel heterogeen. (1) Ze vertonen specifieke kenmerken en brengen bepaalde merkers tot expressie, afhankelijk van het type en het stadium van de tumor en afhankelijk van de cellen waaruit ze zich ontwikkeld hebben. (5) Ze vertonen verschillende functionele verschillen zowel in de tumor zelf als tussen verschillende tumoren. (1) Tijdens de wondheling zorgen myofibroblasten voor een fysieke contractie van de wonde en produceren ze verschillende signaalmoleculen zoals matrixproteïnen, proteasen, groeifactoren en chemokines, betrokken bij de vorming van de ECM. (1) Tumoren worden wel eens vergeleken met wonden die niet helen. Bij normale wondheling initieert coagulatie van het bloed dat uit de bloedvaten getreden is een complexe cascade van signalen, dat inflammatoire cellen rekruteert. Dit stimuleert de fibroblasten en epitheliale celproliferatie, stuurt de celmigratie en induceert de angiogenese om de weefselintegriteit te herstellen. Verschillende van deze herstelprocessen kunnen continu actief zijn in het tumormilieu en van belang zijn voor tumorinnesteling, lokale invasie en metastase naar verafgelegen organen. Inflammatoire cellen, die gerekruteerd worden door verstoring van de normale structuur van het weefsel, kunnen het wonde-antwoord versterken en bijdragen tot tumorinvasie door o.a. expressie van matrixmetalloproteïnasen (MMP). (6) Het stroma gevormd en vervormd door kankercellen wordt ‘reactief stroma’ genoemd. De micro-omgeving evolueert mee met de tumor tot een geactiveerde status via constante paracriene communicatie. Zo onstaat er een dynamisch circuit, dat uiteindelijk zal leiden tot de fatale ziekte. (2) De kankercellen secreteren voortdurend hoge hoeveelheden PDGF (AA, AB of BB) en transforming growth factor- β 1, 2 of 3 (TGF-β). PDGF en TGF-β werken in op 3
stromale cellen, gladde spiercellen, fibroblasten en macrofagen en zorgen zo voor de ontwikkeling van TAF. PDGF is een glycoproteïne bestaande uit 2 strengen en zo kunnen er verschillende soorten gevormd worden: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB. Het speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van bloedvaten. PDGF stimuleert de chemoattractie en de proliferatie van fibroblasten. TGF-β1 werkt als chemoattractant en als differentiatiefactor. De chemotactische factor zorgt voor aantrekking van lokale fibroblasten en van mesenchymale stamcellen afkomstig van het beenmerg die de tumor dan invaderen en in TAF differentiëren en prolifereren. (1) Tumor-geassocieerde fibroblasten worden gezien als cellen die tumor-stimulerende signalen ontvangen maar zelf ook produceren. (7) Ze secreteren heel wat paracriene factoren, die noodzakelijk zijn voor kankercelproliferatie, overleving op een andere plaats, migratie en invasie van de tumor. Ze stimuleren de angiogenese. De TAF gesitueerd ter hoogte van invasieve rand brengen pro-invasieve factoren tot expressie zoals scatter factor/ hepatocyt groeifactor (SF/HGF) en de glycoproteïne tenascin-C (TNC). (3) Daarbij hebben TAF een bufferende capaciteit, ze zijn namelijk in staat toxische metabolieten te verwijderen en het zuur geproduceerd door kankercellen te neutraliseren. (7) Tumoren overleven en groeien omdat ze de fibroblasten en endotheliale cellen kunnen organiseren in een sterk samenwerkend metabolisch domein. TAF brengen bepaalde patronen van eiwitten en enzymen betrokken in het aeroob en anaeroob metabolisme tot expressie, zoals bijvoorbeeld monocarboxylaat transporter-1 en lactaat dehydrogenase-5/pyruvaat dehydrogenase kinase-1. De eiwitten die geactiveerd of geïnactiveerd worden, zijn betrokken in het aerobe metabolisme, lactaatabsorptie en lactaatoxidatie. Ze brengen enzymen of transportmoleculen, betrokken in het aerobe metabolisme met een hoge capaciteit voor lactaat -oxidatie, goede glucoseopname en resistentie tegen lactaat-invloei in de cel tot expressie. (8) Met behulp van deze moleculen zorgen zij voor een optimale metabolische omgeving en voor een tumor-bevorderende omgeving. (7) Ze kunnen de groei van kankercellen stimuleren door hun invloed op de metabolische signaalwegen. Tijdens hun proliferatie maken kankercellen gebruik van de glycolyse, zelfs in aanwezigheid van voldoende zuurstof, dit noemt men ook wel de aerobe glycolyse of het Warburg effect. (3) Kankercellen zijn ‘verslaafd’ aan glucose. Normale cellen kunnen vetzuren en aminozuren verbranden. Maar in kankercellen vormt glucose de belangrijkste energiebron en de belangrijkste bron van cellulaire bouwstenen voor celproliferatie. De hoge glycolyse laat kankercellen toe om te genieten van een selectief 4
groeivoordeel op vlak van bio-energie en biosynthese. (9) TAF zijn in staat inflammatie te induceren in de verschillende zones in het lichaam met kanker, zowel ter hoogte van de primaire tumor, als ter hoogte van metastasen. Chronische inflammatie induceert celproliferatie. TAF bepalen niet alleen de aard van de immuunrespons maar ook de sterkte. Ze trekken allerlei cellen die een rol spelen in het immmuunproces aan door vrijstelling van verschillende chemotactische moleculen. Met behulp van pro-inflammatoire factoren houden ze de kankerzone in een chronische inflammatoire status, dat de metastase van kankercellen vergemakkelijkt. (3) Inflammatoire cellen produceren MMP die de invasie en angiogenese bevorderen. (1) Ze zijn een bron van groeifactoren die een belangrijke tumorpromotor rol kunnen hebben. Het inflammatoir proces activeert tumorinitiatie, -groei en progressie. En dit al in het eerste stadium van de tumorvorming. TAF beschikken over een proinflammatoir vermogen dat macrofaaginfiltratie, de angiogenese en de tumorgroei promoot. Ze nemen deel aan het inflammatoir proces door het aantrekken van verschillende immuuncellen en door de activiteit van verschillende immuuncellen te moduleren. Zo bevorderen ze de angiogenese en immuun-invasie. (2) TAF kunnen tumorinitiatie en -progressie reguleren door modulatie van de stijfheid van de matrix. De stijfheid van de matrix wordt bepaald door de overvloed aan en de mate van verweving van type I collageen. (4) Een minder flexibele micro-omgeving veroorzaakt een grotere fysische stress op het cellichaam. Dit wordt omgezet in intracellulaire signalen, die het gedrag van de cel beïnvloeden. Zo beïnvloedt de micro-omgeving de celgroei, de genexpressie en de differentiatiegraad van de cellen. Daarnaast induceert de ECM blootgesteld aan een hogere fysieke spanning, structurele veranderingen in ECM-geassocieerde moleculen. Dit kan de bio-activiteit van deze cellen moduleren en zo bijvoorbeeld de vrijstelling van TGF-β induceren. TGF-β kan dan de differentiatie van myofibroblasten stimuleren. Dat kan op zijn beurt aanleiding geven tot een toegenomen stijfheid van de ECM wat de tumorvorming verder promoot. Een soepele matrix vergemakkelijkt de TGF-β-geïnduceerde apoptose en een stijve matrix promoot TGF-β geïnduceerde endotheliale-mesenchymale-transitie (EndMT). (10) TAF produceren ECM-componenten waaronder verschillende types collageen, fibronectin, laminine,.. (4) Ook zorgen ze ervoor dat de tumorale cellen aan apoptose kunnen ontsnappen door de productie van insuline-like growth factor 1 en 2 (IGF-1 en -2). (2) Genetische instabiliteit in de primaire tumor zorgt ervoor dat kankercellen kunnen 5
metastaseren. Invasieve celklonen kunnen op hun beurt in de bloed- en lymfevaten invaderen en zo migreren naar andere organen in het lichaam. (1) Buiten hun mogelijkheid tot het secreteren van groeifactoren kunnen TAF epigenetische veranderingen induceren, die de tumorale kracht van kankercellen verhoogt. Dit kan bijvoorbeeld met behulp van reactieve zuurstof radicalen (ROS). Deze ROS worden gevormd door TAF, bij een lage PH en hypoxie en veroorzaken epigenetische modificaties in omgevende cellen. (3) . De belangrijke organen naar waar tumoren metastaseren zijn long, lever, skelet, hersenen en huid. Deze secundaire tumoren kunnen dan opnieuw aanleiding geven tot het ontstaan van nieuwe metastasen. Bepaalde experimenten hebben aangetoond dat metastatische cellen van secundaire tumoren een groter potentieel tot metastasering bezitten dan de oorspronkelijke kankercellen. Dit geeft aanleiding tot de metastatische cascade en kan zorgen voor een snelle fatale afloop van de ziekte. Invasieve tumoren gaan via bepaalde patronen metastaseren. Een aantal patronen kunnen verklaard worden door de anatomie van het verloop van de efferente vaten en de filterende functie van de lever en de longen op dit verloop. Metastasevorming is gebaseerd op de ‘seed and soil theory’. (1) Deze theorie gaat ervan uit dat kankercellen zaadjes zijn, die systematisch verdeeld worden maar enkel groeien in een specifieke omgeving, de 'soil', dat de daaropvolgende groei stimuleert. (11) Bepaalde genen kunnen bepalen of een persoon metastasen gaat vormen of niet. (1) Kankercellen communiceren met hun omgeving via verschillende moleculaire interacties. Via deze interacties kunnen de kankercellen veranderingen in hun cytoskelet induceren zodat ze kunnen metastaseren. Zo kunnen ze bepalen of ze zich via lymfogene of hematogene weg gaan verspreiden en kunnen ze de metastatische niches op afstand voorbereiden. Metastatische niches zijn de plaatsen waar circulerende kankercellen zich bij voorkeur nestelen en mogelijks aanleiding geven tot metastasen. De metastatische niche wordt voorbereid doordat ofwel de tumor zelf oplosbare moleculen en exosomen vrijstelt en naar een bepaald orgaan stuur ofwel door het beenmerg te stimuleren om mesenchymale stamcellen vrij te stellen. Deze stamcellen worden door de tumor aangetrokken en promoten er de invasie en metastasering. (1) Deze stamcellen stimuleren de bloedvatvorming en daarmee trekken ze migrerende kankercellen aan naar andere organen. Ze activeren de pre-metastatische niche en inhiberen de immuunreactie aldaar. (12) Verder zorgen ze door vrijstelling van allerlei signaalmoleculen ook voor transformatie van de ECM en van de micro-omgeving. (13) Activatie van TAF speelt een essentiële rol in de vorming van een pre-metastatische niche. Door toegenomen fibronectin6
depositie beïnvloeden ze de vorming ervan. Een belangrijke factor daarbij is lysyl oxidase (LOX). De metastase-bevorderende effecten van LOX zijn secundair aan de activatie van fibroblasten aangezien LOX-depositie en enzymatische activiteit geconcentreerd zijn in zones met fibronectin-depositie. (4) De vorming van metastasen wordt beïnvloed door de aanwezigheid van TAF. Via cel-cel interacties en verschillende pro-invasieve moleculen (cytokines, chemokines en verschillende inflammatoire mediatoren) kunnen ze de metastaseringsgraad van de tumor verhogen. De eerste stap voor het ontwikkelen van metastasen is het afbreken van de basale membraan en de ECM zodat de maligne cellen in het lymfe- en bloedvatensysteem kunnen invaderen. Opdat invasie zou kunnen optreden moet celproliferatie plaatsvinden. Verschillende studies hebben aangetoond dat TAF in staat zijn tumoren te invaderen. Ze secreten matrix-degraderende proteasen en hun activatoren, ze verbreken dan de cel-celcontacten gemedieerd door Ecadherine en induceren zo de invasieve groei. (3) Ze kunnen ook dienen als leidende structuur voor de migrerende kankercellen en kunnen de kankercellen ondersteunen tijdens hun migratieproces. Ze beïnvloeden het actinecytoskelet zodat deze kankercellen zich naar de diepte kunnen verplaatsen. Ze ondersteunen de continue groei van kankercellen ter hoogte van metastasen en stimuleren de tumoren zo tot het vormen van metastasen. Een laatste rol voor TAF in het metastaseringsproces is weggelegd door de inductie van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) o.a. door de secretie van TGF-β en HGF. (2, 3) TAF kunnen een tumor voorzien van pro-invasieve informatie, kunnen aanleiding geven tot stroma-geïnduceerde drugsresistentie en kunnen een doelwit zijn bij kankertherapie. (1) Deze rol kan gespeeld worden door de fibroblasten zelf maar ook door de receptoren die ze tot expressie brengen of de stoffen die ze uitscheiden. Zo kan activatie van de stromale PDGF receptoren (PDGFR) tumorgroei promoten. Deze receptoren als doelwit gebruiken voor therapie heeft een enorm effect op de groei van tumoren. (4) Via de PDGFR kunnen TAF het transcapillaire transport van medicijnen beïnvloeden door de regulatie van de interstitiële druk in de kankercellen. Ze kunnen ook weerstand bieden tegen anti-angiogene therapie en doelwittherapie met behulp van tyrosinekinase-inhibitoren. Zo reguleren TAF de opname van medicatie en dus de respons op chemotherapie. (2) Aangezien uit onderzoek blijkt dat de rol van TAF steeds belangrijker wordt in het tumorproces, wordt er nu volop onderzoek verricht naar het vinden van prognostische gen-handtekeningen om de evolutie van tumor, de reactie op chemotherapie, de groei en invasie ervan te voorspellen. Zo onderzoekt men ook nieuwe 7
therapiemogelijkheden, specifiek gericht tegen TAF.
C. Onderzoeksvraag en methodologie In de literatuur werd onderzoek gedaan naar de rol van tumor-geassocieerde fibroblasten in de prognose van de kanker. Dit zowel op het vlak van tumorinvasie, metastasering, predictieve merkers, als op vlak van groei en differentiatie. Er werd gezocht op pubmed. Artikels waarin er specifiek sprake was van TAF of de moleculen die ze secreteren en van de prognose van kankers, werden geselecteerd. Artikels, daterend van 2009 tot februari 2014, werden in de referentielijst opgenomen.
D. Resultaten De wederzijdse interactie tussen de kanker en zijn omgeving is een belangrijk proces in de vorming en de ontwikkeling van tumoren. De tumor micro-omgeving is een complex netwerk van verschillende celtypes, oplosbare factoren, signaalmoleculen en ECM-componenten. (14) Een normale micro-omgeving speelt een inhiberende rol in de kankerinitiatie. Kankercellen beschikken over de mogelijkheid om een tumor-inhiberende micro-omgeving om te zetten naar een omgeving dat de groei en metastase van een tumor bevordert. (15) Eén van de belangrijkste cellen in de omgeving van de tumor zijn TAF.
1. Tumor-geassocieerde fibroblasten 1.1 Wat zijn TAF? Het kankerproces wordt niet langer herkend als een onafhankelijk event dat het gevolg is van genetische mutaties en ongecontroleerde groei van kankercellen. (3) Tumorinitiatie, -groei, invasie en metastasevorming zijn het gevolg van een complexe interactie tussen de gastheer en kankercellen. (4) Verschillende groeifactoren en cytokines gesecreteerd door de omgevende stromale cellen en signaalwegen geïnduceerd door cel-cel interacties spelen een essentiële rol in de tumorvorming en metastase. Door de hechte relatie tussen TAF en kankercellen wordt het steeds duidelijker dat kankerontwikkeling niet losgekoppeld kan worden van zijn omgeving. (3) Fibroblasten beïnvloeden de verschillende stappen van de kankerontwikkeling. Ze zijn belangrijke componenten van tumorinitiatie, vroege progressie en vorming van metastasen. (4) Fibroblasten spelen normaal gezien een rol in het wondhelingsproces. Ze invaderen de wonde en vormen de ECM, die als basis dient voor weefselregeneratie. (3) De wondheling wordt 8
gekenmerkt door een hyperproliferatieve status van zowel de epitheliale als de stromale cellen. Dit is het gevolg van een tijdelijke stroom van verschillende mitogene signalen ten gevolge van de verstoring van de homeostase in een bepaald weefsel. (10) Tijdens de wondheling, worden fibroblasten geactiveerd. Ze vormen dan de myofibroblast, een gespecialiseerd fibroblasttype, dat beter in staat is tot synthese van de ECM en verhoogde depositie van type I en type IV collageen. Ze doen het stroma samentrekken en brengen zo de epitheliale randen van de wonde bij elkaar. Daarnaast zijn myofibroblasten essentieel voor mucosale immuniteit, weefsel- en stamcelnichevorming. In de kankerregio vindt men TAF die een gelijkaardige morfologie hebben aan de myofibroblasten, die men tijdens het wondhelingsproces terugvindt. (3) In tegenstelling tot fibroblasten in het wondhelingsproces en myofibroblasten vertonen TAF een continue activatie. TAF gaan niet in apoptose of trekken zich niet terug om in rust te gaan wanneer het herstelproces afgerond is. (16) Tijdens het wondhelingsproces worden deze cellen normaal gezien verwijderd via p53- of integrine-gereguleerde apoptose en/of door celopruiming via natural killercellen (NK) en/of interferon-γ (INF-γ) secretie. Dit gebeurt echter niet met TAF. (10) De geactiveerde fibroblasten zorgen voor een toegenomen secretie van normale ECM-componenten en een toegenomen proliferatiegraad. Om de ECMcomponenten in groot aantal te kunnen secreteren, vertonen geactiveerde fibroblasten een grote ovale euchromatische kern met één of twee nucleolen, een ruw endoplasmatisch reticulum en een prominent golgi-apparaat. Tumoren worden gezien als wonden die niet helen. Cellen betrokken in de angiogenese en de reactie op een wonde, zoals endotheliale cellen en fibroblasten hebben een belangrijke rol in de progressie, groei en verspreiding van tumoren. Het is echter nog onduidelijk of de TAF-invasie gestimuleerd wordt door TGF-β vrijgesteld door kankercellen of TAF-invasie een wondhelingbeschermingsmechanisme is dat de kankerlaesie herstelt en verhindert dat er zich een invasief carcinoom vormt. (16) Tumoren zijn heel complexe weefsels opgebouwd uit kankercellen en omgevend stroma. (17) Tumorstroma
bestaat
uit
verschillende
types
mesenchymale
cellen;
fibroblasten,
myofibroblasten, van het beenmerg afgeleide cellen, een ECM, leukocyten en endotheliale cellen. Deze cellen zorgen voor de complexiteit van de tumoromgeving. (3, 17) TAF zijn een subpopulatie van cellen, die gelegen zijn in de tumor micro-omgeving. Ze bevinden zich aan de rand van de tumor of infiltreren de tumor en bevorderen zo het transformatieproces. (18) Tijdens de progressie van kanker, kunnen kankercellen de karakteristieken van het omgevende stroma beïnvloeden zodat ze een ondersteunende omgeving vormen. (3) Het niet-neoplastisch 9
stroma in de meeste vaste tumoren speelt een actieve rol in tumorproliferatie, -invasie en de vorming van metastasen. (19) De aanwezigheid van TAF in groot aantal is vaak geassocieerd met de ontwikkeling van hooggradige maligniteiten en slechte prognose. TAF gewonnen uit de tumor zijn beter in staat tot het promoten van tumorgroei door hun interacties met kankercellen dan de fibroblasten gewonnen uit fenotypisch normaal stroma. (17) TAF zijn continu geactiveerd, vertonen een verhoogde proliferatiegraad, keren nooit terug naar hun normaal fenotype en gaan niet in apoptose. (3) Fenotypisch normaal stroma bestaat uit bindweefsel dat zich gedraagt als een ondersteunend kader voor weefsels en organen. Fibroblasten zijn in dit stroma essentieel en vormen de ECM door de productie van verschillende soorten collageen, laminin, proteoglycanen en fibronectin. Zo vormen ze een structureel kader. Daarnaast zijn ze een belangrijk onderdeel betrokken bij de vorming van de basale membraan, die het epitheel van het stroma scheidt door secretie van laminin en type IV collageen. Ze zijn een bron van verschillende oplosbare paracriene en autocriene groeifactoren, die de groei van de omgevende cellen en van de fibroblasten zelf reguleren. (3, 20) Fibroblasten afkomstig uit dit fenotypisch normaal stroma zijn langwerpige cellen, die zich in het bindweefsel bevinden in een inactieve rustende toestand en zorgen voor de synthese van de ECM. (18) In sommige gevallen dragen ze bij tot de transformatie van de ECM door secretie van MMP, die de ECM afbreken. (20) Ze controleren en ondersteunen de normale weefselhomeostase en spelen een rol in verschillende biologische processen zoals celdood en wondheling. (18, 20) Rustende fibroblasten worden geactiveerd gedurende weefseltransformatie en worden omgevormd tot myofibroblasten. (21). Tabel 1: verschillen tussen fibroblasten en TAF.
Fibroblasten geassocieerd met fenotypisch normaal stroma
Tumor-geassocieerde fibroblasten
Proliferatiesnelheid aangepast aan ECM
Geactiveerde status met toegenomen
turnover
proliferatiesnelheid en mitose-activiteit.
Collageenproductie aangepast aan de vorming van de ECM Secretie van groeifactoren en ECMmodulatoren aangepast aan de groei van ECM
Toegenomen collageenproductie Toegenomen secretie van groeifactoren en andere ECM-modulatoren Toegenomen concentratie aan MMP Toegenomen migratie 10
Grote heterogeniteit in voorkomen, gedrag
Grote heterogeniteit in voorkomen, gedrag en
en genexpressie
genexpressie Heterogeniteit in expressie van celmerkers.
Heterogeniteit in expressie van merkers
Verminderde expressie van caveolin-1 en laminin. Toegenomen expressie van α-SMA, vimentin en FSP-1.
Belangrijke functies: depositie van ECM, regulatie van epitheliale differentiatie, regulatie van inflammatie, betrokken bij wondheling TAF zijn fibroblasten, die zich in de tumoromgeving bevinden. (21) Ze promoten het transformatieproces door de tumorgroei, de angiogenese, de metastasevorming en inflammatie te bevorderen. (18) Wanneer myofibroblasten gerekruteerd, geactiveerd, en geaccumuleerd worden in de tumorzone worden ze TAF. (20) TAF bevinden zich aan de rand van tumor of dringen in het tumorweefsel en vergemakkelijken zo het transformatieproces. (18) Ze zijn betrokken in het onderdrukken van de immuunrespons en in de secretie van groeifactoren en cytokines. Deze groeifactoren en cytokines mediëren de signaalwegen, die de angiogenese, tumorgroei, -invasie, en –differentiatie en een chronisch inflammatoir milieu beïnvloeden. (20) TAF bepalen in belangrijke mate de prognose van een tumor. (18) TAF vormen een heterogene populatie en hun relatieve samenstelling verschilt sterk tussen de verschillende tumoren. (21) TAF zijn grote spoelvormige mensenchymale cellen met stressvezels en een goed ontwikkelde fibronexus. (3) Ze beschikken over typische morfologische kenmerken, waaronder een spoelvormige, grote euchromatische kern, cytoplasmatische myofilamenten, golgi-apparaat en gapjuncties. (20) Er zijn verschillende merkers voor TAF waaronder α-SMA, FAP, PDGF, FSP-1, Thy, desmin, vimentin, paladin 4Ig, podoplanin en S100A4-eiwit. (1, 3, 19) In TAF is het expressieniveau van laminin sterk gedaald. Laminin is een eiwit dat helpt bij het behouden van de integriteit van de basale membraan. (3) TAF worden ook gekenmerkt door de afwezigheid van epitheliale (cytokeratin, E-cadherin), endotheliale (CD31) en volledig gedifferentieerde gladde spiercelmerkers. (19) Er is een groot assortiment aan merkers waarmee we TAF kunnen identificeren. Maar niet alle TAF kunnen hiermee geïdentificeerd worden en zelfs in dezelfde tumor brengen de TAF niet alle merkers tot expressie. (22) Door de grote heterogeniteit aan merkers, afkomst en functie, 11
zouden TAF beter gedefinieerd worden als een ‘TAF status’. Dit is de dynamische status van fibroblastachtige cellen die zich in de buurt van een tumor bevinden en de progressie ervan promoten. (18)
1.2 Oorsprong De verzameling TAF is heel heterogeen omwille van hun verschillende origine.(3) TAF ontstaan ten gevolge van celplasticiteit. Ze kunnen zich ontwikkelen uit normale fibroblasten door continue blootstelling aan kankercellen. Maar er zijn ook verschillende andere bronnen van TAF. Ze kunnen gevormd worden uit mesenchymale stamcellen (MSC), gladde spiercellen, myofibroblasten, circulerende fibrocyten, cellen van epitheliale oorsprong, endotheliale cellen, perivasculaire cellen, uit het beenmerg afgeleide cellen en stamcellen afgeleid van het vetweefsel. (7, 18) Onder invloed van de juiste stimuli kunnen al deze cellen een TAF fenotype verwerven. (18) 202
J. Zhang, J. Liu / Pharmacology & Therapeutics 137 (2013) 200–215
Figuur 1: Acht mogelijke precursoren van TAF in de tumor micro-omgeving. (23)
Fig. 2. Eight possible origins of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: locally resident quiescent fibroblasts via fibroblast to myofibroblast transdifferentiation (FMT), cancer epithelial cells via epithelial to mesenchymal transition (EMT), endothelial cells via endothelial to mesenchymal transition (EndMT), mesenchymal stem cells from the bone marrow, pericytes, smooth muscle cells, adipocytes, and inflammatory cells.
1.2.1 TAF afgeleid van fibroblasten another unique process of transdifferentiation, endothelial to mesenchy-
Analogously, stromal p53 mutational status is associated with regional
2007). CAFs also originate from other cell types including smooth muscle
The inactivation of Pten gene in stromal fibroblasts from mouse mam-
Christian, 2010).
formation of mammary epithelial tumors (Trimboli et al., 2009).
spindle shape, large euchromatic nuclei, prominent nucleoli, rough en-
mas samples (Qiu et al., 2008; Walter et al., 2008). Some researchers
gap junctions (Worthley et al., 2010). They usually show positive ex-
imens, the accuracy of microdissected cells, inherent difference, and detection techniques (Qiu et al., 2008; Worthley et al., 2010). On the contrary, there is a common view on CAFs' epigenetic alterations. The specific patterns of epigenetic modifications through DNA methylation are identified in the CAFs adjacent to breast or prostate cancer (Hu et al., 2005; Richardson et al., 2007). Gene expression of CAFs can be silenced through the methylation of specific sites in the promoter region, such as the promoters of glutathione S-transferase 1 and retinoic acid receptor b2 (Hanson et al., 2006; Rodriguez-Canales et al., 2007). Global loss of methylation has long been recognized as a feature of human cancer epithelial cells. Some data highlight the fact that DNA hypomethylation is also present in CAFs and may enhance genetic instability resembling its role in cancer cells (Jiang et al., 2008). The epigenetic alterations in tumor stroma and cancer cells may be associated with specific biological characteristics of HER-2/neu+ breast cancers, such as high aggressiveness and resistance to anti-hormonal therapy (Fiegl et al., 2006).
lymph node metastases in human sporadic cancer (Patocs et al., mal transition. A transgenic mouse model showed that up to 40% ofgestimuleerd CAFs Lokale fibroblasten of fibroblastprecursoren, door leden van debreast PDGFR of TGF-β 2007), and resistance to cytotoxic chemotherapy (Lafkas et al., 2008). arose from endothelial cells at the invasive front of tumors (Zeisberg et al.,
familie cells, worden als de voornaamste van TGF-β is de and enige gekende mary glandsTAF. promoted the initiation, progression, malignant transpericytes, gezien adipocytes, or inflammatory cells (Fig. 2) (Xouri bron & To die date, CAF on their morphology severalin studies published the controversial results that genetgroeifactor inrecognition staat depends is omprimarily fibroblasten om teHowever, zetten TAF. TGF-β is een krachtige and specific biomarkers. CAFs possess typical morphological features: ic alterations are extremely rare in breast, ovarian and pancreas carcino-
chemoattractant voorcytoplasmic dermale fibroblasten, zodatpropose ook fibroblasten buiten de tumorregio doplasmic reticulum, myofilaments, Golgi apparatus, and that the reasons for the differences may due to sources of specpression of alpha-smooth muscle actin aangetrokken kunnen worden. (7)(α-SMA), vimentin, fibroblast activation protein (FAP), S100A4 protein/fibroblast specific
protein-1, PDGF receptor (PDGFR)α/β, and paladin 4Ig (Ronty et al., 2006; Sugimoto et al., 2006; Paulsson et al., 2009; Hua et al., 2011), and negative expression of epithelial (e.g., cytokeratin), endothelial (e.g., CD31 and CD34) and fully differentiated smooth muscle (e.g., smoothelin) markers (Gonda et al., 2010). Among them, α-SMA is the most widely used CAF marker, although none of these markers were unique to CAFs. Hence, it may be is necessary to use a combination of markers to recognize CAFs.
1.2.2 TAF afgeleid van epitheliale cellen
TAF afkomstig van epitheliale cellen worden gevormd door EMT. (3) Deze TAF vindt men vooral terug aan de invasieve rand van de tumor. (19) Bij EMT worden cellen van het 2.2. Genetic and epigenetic alterations
CAFs cultured in vitro partially retain their biological properties, even when lacking coexisting malignant epithelial cells (Olumi et al., 1999). Despite relatively little is known about the mechanism, some studies propose that the answer might lie in the genetic or epigenetic alterations of CAFs (Ostman & Augsten, 2009). In analyses of laser-captured-microdissected stroma adjacent to car-
2.3. Future challenges
12
epitheliale fenotype met stevige juncties naar mesenchymale cellen met een losse cel-cel adhesie omgezet. EMT is een mechanisme dat mogelijks epitheliale kankermetastasen kan induceren. TAF die ontstaan door EMT zijn meestal minder maligne dan de kankercellen zelf maar ze zijn toch in staat tot het promoten van kankergroei en vorming van metastasen. (3) 1.2.3 TAF afgeleid van stamcellen afkomstig van het beenmerg TAF kunnen hun oorsprong vinden in de stamcellen van het beenmerg. Het beenmerg bestaat uit twee types stamcellen; de MSC en de hematopoietische stamcel (HSC). MSC kunnen omgevormd worden tot mesenchymale weefsels zoals vet, bot, spier, kraakbeen en fibroblasten. HSC beschikken over de mogelijkheid tot het samenbrengen van hematopoietische cellen en kunnen mastcellen en osteoclasten tot ontwikkeling brengen. (24) In tumoren bevorderen MSC de tumorvorming en -groei door differentiatie in TAF. Deze TAF stimuleren de neoangiogenese en vormen kankerstamcelniches met immunosuppressie. (25) Dankzij hun aangeboren veelzijdigheid voorzien ze in verschillende hulpmiddelen om maligniteit te promoten. Ze kunnen voor structurele ondersteuning zorgen maar kunnen ook de gastheerimmuunrespons onderdrukken via de vrijstelling van bepaalde signaalmoleculen. (26) MSC kunnen de groei van tumoren op twee manieren beïnvloeden. Een eerste mechanisme is dat ze zorgen voor differentiatie van multipotente MSC in weefselcomponenten zoals fibroblasten, tumor-geassocieerd bloedvatendotheel en/of gladde spiercellen. (25) Met behulp van oplosbare moleculen afkomstig van de tumor, kunnen ze omgezet worden naar TAF. (19) Circulerende cellen, afgeleid van het beenmerg zijn in staat tot het migreren naar en prolifereren in het tumorstroma en vormen zo actieve componenten van de tumor microomgeving. (3, 11) Het tweede mechanisme waarmee ze tumorgroei kunnen beïnvloeden, is dat ze niet standaard geassocieerd zijn met een bepaalde plek in het lichaam. Ze beïnvloeden de tumorvorming door de productie van verschillende angiogene (vasculair endotheliale groeifactor (VEGF), PDGF, fibroblast groeifactor (FGF)), immunosuppressieve (TGF-β1, IDO, interleukine-10 (IL-10), prostaglandine E2 (PGE2)) en metastatische (chemokine ligand 5 (CCL5)) factoren. Ze produceren verschillende tumorgroei-regulerende factoren zoals onder andere galectin-1 (gal1), COX-2, TGF-β1, angiopoietin 1 (Ag1), IL-10, VEGF,... Het aantal MSC beschikbaar voor de ondersteuning van de groei van de tumor is een cruciaal element in de vroege tumorontwikkeling (25) Fibrocyten zijn fibroblasten van hematopoietische origine. Het zijn mesenchymale cellen in het 13
bloed die snel migreren naar zones met weefselschade. Ze worden beschouwd als precursoren van geactiveerde fibroblasten. HSC worden omgezet in circulerende fibrocyten en deze vormen dan TAF. Ze brengen zowel kenmerken van fibroblasten als van hematopoietische cellen tot expressie. Ze worden door verschillende signaalmoleculen, monocyt chemoattractant proteïne1 (MCP-1) of CCL2, stromal derived factor-1 (SDF-1) en zijn receptor, chemokine receptor 4 (CXCR4), aangetrokken naar de tumor. Fibrocyten produceren ECM afbraakcomponenten zoals MMP, die in het tumorproces de vorming van metastasen bevorderen. (24) 1.2.4 TAF afgeleid van endotheelcellen Endotheelcellen kunnen TAF vormen door EndMT. TGF-β kan prolifererende endotheliale cellen een fenotypische conversie laten ondergaan zodat fibroblastachtige cellen gevormd worden. Deze transitie wordt geassocieerd met toename van FSP-1 en afname van CD31/PECAM. Het is een uniek mechanisme dat zorgt voor accumulatie van TAF die de kankerprogressie vergemakkelijken. (3) 1.2.5 TAF en myofibroblasten Tumoren worden vaak beschreven als wonden die niet helen. TAF vertonen dan ook gelijkenissen met myofibroblasten, waaronder de expressie van α-SMA. (21) Onder invloed van de juiste stimuli kunnen myofibroblasten een TAF-fenotype verwerven. (3) TAF zijn continu aanwezig in het tumorstroma, hebben een hogere proliferatieve activiteit en worden niet verwijderd door apoptose. (21) TAF induceren een gedaalde apoptose en proliferatie in een aantal cellijnen door hun effect op de celcyclus. De inhibitie van deze apoptose vindt plaats doordat deze cellen een tijdelijke celcyclusarrest vertonen. Dit veroorzaakt een positieve balans tussen levende cellen en celdood, die de proliferatie bevordert. (27) Hun activatie is onomkeerbaar en dit leidt tot overdreven ECM-depositie. (21) 1.2.6 TAF afgeleid van adipocyten Invasieve kankercellen hebben een dramatische impact op de omgevende adipocyten. Deze vetcellen vertonen een daling in het vetgehalte, een vermindering van de expressie van adipocytmerkers en een geactiveerde status gekenmerkt door overexpressie van inflammatiebevorderende cytokines. Ze bevinden zich aan het invasiefront van de tumor en blijven een adipocytmorfologie behouden. Deze worden kanker-geassocieerde adipocyten (CAA) genoemd. Ze vertonen overexpressie van de ECM en ECM-gerelateerde moleculen, wat tot progressie van onder andere borstkanker leidt. Tijdens de evolutie van de tumor, ondergaan de 14
adipocyten rond de tumor een dedifferentiatie. Eerst vormen ze CAA en daarna vormen ze fibroblastachtige cellen, die een deel van de TAF-populatie kunnen vormen. Deze van de vetcellen afgeleide fibroblasten dragen in belangrijke mate bij tot de agressiviteit van de nabijgelegen kankercellen. In een onderzoek waarbij kankercellen samen met fibroblasten afgeleid van adipocyten in een tweedimensionele of sferoide cultuur gestoken werden, vertoonden deze kankercellen een toegenomen invasieve capaciteit. Dit werd duidelijk na immunofluorescentie en immunohistochemisch onderzoek. De aanwezigheid van deze nieuwe stromale subpopulatie werd bevestigd in biopsieën van borsttumoren. (28)
1.3 TAF en signaalmoleculen betrokken in de carcinogenese
Figuur 2: Verschillende signaalmoleculen tot expressie gebracht door TAF en hun invloed op de processen betrokken in de tumorigenese.
TAF brengen verschillende signaalmoleculen, die elk hun rol spelen in het kankerproces tot expressie. (29) Ze secreteren groeifactoren en cytokines zoals TGF-β, HGF, FSP-1, PDGF/ VEGF, caveolin-1 (cav1), gal1 en SDF-1. Proliferatie van TAF is gemedieerd door lokale groeifactoren, waaronder FGF, TGF-β en andere bindweefselgroeifactoren. (3) TAF voorzien in elementen die de proliferatie toelaten en via oncogene signalisatie beïnvloeden ze de apoptose-signaalwegen. (1) TAF zijn niet alleen een directe bron van groeifactoren maar kunnen deze factoren ook vrijstellen door proteolyse van de ECM en zo secretie van nodige proteasen. (22) Al deze signaalmoleculen stimuleren de carcinogenese op verschillende manieren. Ze doen dit door het stimuleren van de angiogenese, tumorgroei en metastasevorming, door de inhibitie van de apoptose en door hun invloed op het metabolisme 15
en de inflammatie. Een aantal signaalmoleculen vrijgesteld door TAF onderdrukken de tumorvorming, maar hun rol is sterk afhankelijk van de cellen die deze signaalmoleculen tot expressie brengen en het stadium, waarin de tumor zich bevindt. 1.3.1 Tumor Groeifactor β Eén van de moleculen betrokken in het kankerproces, is TGF-β. TGF-β speelt een dubbele rol. In het vroege tumorstadium zorgt het voor tumorsuppressie en in een gevorderd stadium voor tumorpromotie. In het begin inhibeert TGF-β de vorming van tumoren door inhibitie van de groei van epitheliale cellen en door het vrijstellen van pro-apoptotische signalen onder invloed van andere cytokines zoals INF-α. In het gevorderd stadium is TGF-β geassocieerd met een toegenomen invasie en metastase dankzij toegenomen activiteit en
overexpressie van
verschillende integrines. Integrines zijn celoppervlakte-adhesiereceptor-eiwitten en zijn de voornaamste bijdragers aan de tumorprogressie door hun invloed op cel-matrix en celceladhesie. (20) TGF-β stimuleert dan de EMT. (10) TGF-β wordt geproduceerd door epitheliale kankercellen en door stromale cellen, via autocriene en paracriene mechanismen. TGF-β vrijstelling door stromale cellen bevordert de uitdrukking van β-FGF, dat betrokken is in fibroblast-myofibroblast transdifferentiatie (FMT). Ook de synthese en vrijstelling van de bindweefselgroeifactor, die de groei van de kankercellen positief beïnvloedt en die de intravasatie en metastatische verspreiding kan vermeerderen door de proliferatie van TAF te promoten, wordt door TGF-β vrijstelling gestimuleerd. TGF-β is geassocieerd met afbraak van de ECM, met stimulatie van de kankercelinvasie, met de angiogenese en met immunosuppressie. (20) TGF-β is noodzakelijk voor het induceren van de differentiatie van TAF. Zowel TGF-β1 en TGF-β2 zijn opgereguleerd in TAF en zijn cruciaal in het behouden van het geactiveerde fibroblastfenotype. De aanwezigheid van TGF-β in de tumor micro-omgeving zorgt voor promotie van de tumorgroei door activatie van TAF-afhankelijke angiogenese en door inhibitie van de anti-tumorimmuuncellen. TGF-β vermindert de INF- γ productie en verzwakt de Th1celdifferentiatie. De dendritische celbiologie wordt op verschillende manieren beïnvloed door TGF-β. TGF-β kan dendritische cellen immobiliseren door het blokkeren van de migratie en zo het transport van antigenen naar het drainerende lymfesysteem blokkeren. Zo heeft het effect op verschillende cellen in het immmuunproces, waaronder de MHC-II, cytotoxische T-cellen, effector T-cellen en Treg –cellen. (22) 16
1.3.2 Hepatocyt Groeifactor TAF produceren HGF met werking op epitheliale kankercellen via een paracrien mechanisme en met werking op de kankercellen zelf door middel van een autocrien proces. Het stimuleert de tumorprogressie. De activatie van HGF/Met-signaalweg verandert de motiliteit van kankercellen. HGF beschermt kankercellen van apoptose, wat resulteert in chemotherapieresistentie. (20) Fibroblasten die HGF tot expressie brengen vertonen een meer invasief groeipatroon dan controle fibroblasten. Dit door een verhoogde expressie en secretie van urokinase-type plasminogeen activator (uPA) en de receptor ervan, die de afbraak van de ECM bevordert. Ze zorgen ook voor een verhoogde type IV collageen degradatie en een toegenomen migratiefenotype in MCF10 DCIS. (4, 20) HGF en chemische hypoxie dragen samen bij tot de secretie van VEGF, wat leidt tot tumorangiogenese. (20) 1.3.3 Pro-inflammatoire cytokines: IL-1β, IL6, IL33, osteopontin en COX-2 Het reactief stroma bestaat uit verschillende cellen, waaronder inflammatoire. TAF mediëren de tumor-bevorderende inflammatie. Ze promoten macrofaagrekrutering en neovascularisatie, op voorwaarde dat de NF-κB signalisatie niet geïnhibeerd wordt. Immuuncellen voorzien in oplosbare groei- en overlevingsfactoren, matrix-transformerende enzymen, ROS en andere bioactieve moleculen die op verschillende manieren kankercelproliferatie en -invasie, angiogenese, en metastase vorming beïnvloeden. Door TAF worden er verschillende proinflammatoire cytokines vrijgesteld. Deze pro-inflammatoire gen-handtekening bestaat uit onder andere uit IL-1β en IL-6, twee chemokines die chemo-attractief zijn voor neutrofielen en macrofagen. (30) IL-6 is een belangrijke acute-fase-proteïne en speelt een rol in activatie van het stroma. Het vergemakkelijkt weefselfibrose, tumordesmoplasie, epitheliale groei en metastasevorming. (10) Ook COX-2 is betrokken in dit proces. COX-2 medieert de inflammatoire respons en prostaglandineproductie. (30) COX-2 gesecreteerd door geactiveerde fibroblasten
kan
de
groei
van
tumoren
promoten
door
inflammatie-geassocieerde
tumorvorming. (17) Bij de inflammatie rond de tumor, zijn ook nog een aantal andere moleculen betrokken. (30) IL-33 is lid van de IL-1-cytokine-familie samen met IL-1α, IL-1β en IL-18. Het is biologisch actief en komt tot uiting in onder andere de maag, de longen en de prostaat. Het wordt niet door immuuncellen tot expressie gebracht maar in fibroblasten, endotheliale en epitheliale cellen. IL-33 speelt een functionele rol in het promoten van de agressiviteit van TAF door EMT te induceren in kankercellen. De expressie van IL-33 in tumoren en hun omgevende TAF is sterk 17
gecorreleerd met het invasief gedrag en de klinische uitkomst van patiënten. (31) Osteopontin is een molecule dat de inflammatie, angiogenese en metastasen beïnvloedt. TAF met een inflammatie-bevorderende gen-handtekening verschijnen in de vroege, beginnende neoplasieën en blijven bestaan als neoplastische progressie naar invasief carcinoma leidt. Deze handtekening wordt geïnduceerd door IL-1β afkomstig van residentiële immuuncellen, die de adaptieve immuuncellen stimuleert tot de uitdrukking ervan. NFκB speelt een centrale rol in het mediëren van de tumor-bevorderende inflammatoire signalen. (30) 1.3.4 CCL 5 en IL-17B CCL5 en IL-17B zijn inflammatoire cytokines die immuuncellen rekruteren en activeren. CCL5 is afgeleid van MSC en promoot metastasevorming. De expressie van deze molecule neemt toe na interactie van MSC met kankercellen. CCL5 geïnduceerde Akt-activatie zorgt ervoor dat de tumorcel uit de circulatie kan treden om zo distale organen te koloniseren en het metastatisch potentieel te verhogen. De interactie tussen de tumor en MSC kan de stromale omgeving moduleren om zo metastasevorming te promoten. Een andere molecule betrokken bij het promoten van metastase door een MSC-afhankelijk mechanisme is het pro-inflammatoir cytokine IL-17B. De IL-17B-receptor is een prognostische indicator geassocieerd met invasieve tumorprogressie. IL-17 wordt geproduceerd door verschillende immuuncellen en werkt erin op. Zo reguleert het de
inflammatie, auto-immuniteit, tumorvorming en
gastheerbescherming tegen bacteriële en schimmelinfecties. (26) 1.3.5 Insuline growth factor -1 en -2 TAF produceren IGF-1 en -2, die de tumorgroei stimuleren door overleving-bevorderende signalen te geven. (1) Het paracrien effect van IGF zorgt voor proliferatie van onder andere prostaat-epitheelcellen door het opreguleren van MAPK, Akt en Cyclin D1 en neerregulatie van p27. Overexpressie van IGF-1 lokt neoplastische transformatie uit in bepaalde epithelia en verhoogt significant de invasieve capaciteit van prostaatkankercellen. Door de interactie van IGF-1 receptor en TGF-β gemedieerde activatie van Smad3, wordt de TGF-β gemedieerde apoptose geblokkeerd. (32) 1.3.6 Caveolin-1 Caveolin is een familie bestaande uit drie integrale membraaneiwitten, cav1,-2 en -3. Cav1 en 2 zijn wijdverspreid en worden sterk tot expressie gebracht in epitheliale en endotheliale cellen, fibroblasten, gladde spiercellen, adipocyten en pneumocyten. Cav1 is essentieel voor de 18
vorming van caveolae. Caveolae zijn smalle invaginaties in de plasmamembraan. Ze zijn betrokken in belangrijke fysiologische functies, namelijk membraantransport, endocytose en vethomeostase maar spelen ook een rol in signaalprocessen. Caveolin speelt een belangrijke rol in de kankerprogressie en metastase maar werkt ook als onderdrukker van de tumor. Het verschil in functie is afhankelijk van de celspecifieke rol van caveolin, de fysiologische context, cellulaire transformatieprocessen en het tumorstadium. (33) Cav1-expressie in endotheliale cellen reguleert de angiogenese, de microvasculaire permeabiliteit en vasculaire transformatie. Los daarvan neemt cav1 ook deel aan een aantal pathofysiologische processen zoals inflammatie, artherosclerose en oncogene transformatie. (32) Stromaal cav1 transformeert de micro-omgeving in en rond de tumor om zo de tumorinvasie te vergemakkelijken en het metastatische potentieel van de tumor te doen toenemen. Het moduleert weefselantwoorden door krachtafhankelijke architecturale regulatie van de micro-omgeving. De rol van cav1 in tumorprogressie is niet volledig duidelijk. In de meeste primaire tumoren verminderen de cav1-niveaus. Zo laten ze proliferatie en angiogenese toe. In metastasen komt cav1 weer tot expressie, en promoot het de invasie, overleving en multitherapie-resistentie. Stroma met cav1 is gelinkt aan een slechte overleving. Bij verhoogde cav1-expressie in metastatische laesies kan het mesenchymale cav1 noodzakelijk zijn om een invasie-permissieve omgeving te vormen. Parenchymaal cav1 kan de directionele migratie en invasie promoten. De impact van cav1 op directionele tumorcel-invasie resulteert uit een toename van ECM-anisotropie en -stijfheid. (29) 1.3.7 Galectin-1 Gal1 wordt sterk tot expressie gebracht in tumoren met een slechte prognose. Gal1 is een immunosuppressief en angiogenese-bevorderend lid van de β-galactoside-bindende lectin familie. De expressie van gal1 wordt gereguleerd door hypoxie. De immunosuppressieve functie van gal1 werd bewezen doordat onderdrukking van de uitdrukking of functie ervan in kankercellen een immuunantwoord veroorzaakt tegen de tumor en zo de tumor afstoot. Gal1 is betrokken in de groei en metastasevorming van vaste tumoren. Er is een significant verband tussen de expressie van gal1 in borstkanker geassocieerde stromale cellen en de invasiegraad van de tumor en lymfeknoopmetastasen. Zo wijst een hoge expressie van gal1 in de kankercellen of in het tumorstroma op een slechte prognose. Een hoge graad van gal1 uitdrukking komt voor in MSC. Bij afwezigheid hiervan verliezen deze stamcellen hun tumorbevorderend effect. (25) 19
Dit werd bewezen door onderzoek in muisborstcarcinomen. Het inplanten van MSC in combinatie met muiskankercellen verhoogde de vascularisatie, de incidentie en de groei van palpabele tumoren en de vorming van metastasen. De belangrijke rol van gal1 werd verder aangetoond in gal1-deficiënte muizen. Bij toediening van B16F10 melanoomcellen in gal1deficiënte dieren, is tumorgroei sterk verminderd in vergelijking tot wildtype dieren. Injectie van wildtype MSC niet deficiënt voor gal1, resulteerde in dramatische tumorgroei en ontwikkeling. Deze resultaten bevestigen dat gal1 één van de kritische factoren in MSC is, dat de tumorprogressie reguleert. (25) 1.3.8 Tenascin-C TNC promoot de tumorprogressie door de celmotiliteit, metastase en dergelijke te ondersteunen. TNC wordt zowel door kankercellen als door stromale cellen geproduceerd. Door neerregulatie van weefseltype-plasminogeenactivator vergemakkelijkt het de accumulatie van fibrine en activeert het een mitogene reactie. (10) TNC, afgeleid van kankercellen en myofibroblasten genereert een metastatische niche en vergemakkelijkt zo de vorming van longmetastasen. (11) 1.3.9 Matrixmetalloproteïnasen MMP zijn zink-afhankelijke endopeptidasen die een cruciale rol spelen in kankerprogressie door het degraderen van de ECM-barrière maar ook door regulatie van signaalwegen. (34) Verder promoten ze de myofibroblastdifferentiatie, wat het tumor-ondersteunende stroma versterkt, en zo onderhouden ze de vicieuze cirkel door verdere secretie en activatie van MMP. Ze kunnen tot expressie gebracht worden door inflammatoire cellen, epitheliale cellen, fibroblasten en myofibroblasten. (10) Weefselinhibitoren van metalloproteïnasen (TIMPS) controleren de activiteit van MMP en minimaliseren zo de matrixdegradatie. (20) MMP worden geproduceerd door verschillende stromale cellen en kankercellen. TAF zijn de voornaamste bron van MMP, waaronder MMP-1, -2, -3, -9, -11, -13 en -14. MMP-1 en MMP13 kunnen collageen afbreken, MMP-2 en MMP-9 zijn gelatinasen, MMP-3 en MMP-11 maken deel uit van de stromelysines en MMP-14 is één van de membraan-type MMP. MMP hebben verschillende functies. Ze kunnen celadhesiemoleculen zoals cadherines en CD44 splitsen en TGF-β proteolytisch activeren. Zo zorgen ze voor een verhoogde tumorinvasie en angiogenese. Ze zijn betrokken in de modulatie van de inflammatoire respons door regulering van cytokines en chemokines zoals TNF-α, IL-1β, SDF-1 en MCP-1. (20) De verschillende 20
MMP hebben allemaal specifieke functies. Overexpressie van MMP-3 door TAF stimuleert epitheliale hyperplasie en abnormale vorming van vertakkingen in de klieren van de borst. Hoge MMP-2 productie in stromale cellen is noodzakelijk om tumorgroei en de pathologische neo-angiogenese van gliomen te ondersteunen. MMP-1 komt in toegenomen mate voor in peritumorale fibroblasten geïsoleerd uit een primair melanoom. Opregulatie van MMP-1 is een predictieve merker van borstcarcinomen en het kan groei- en invasiesignaalwegen bevorderen door het splitsen van PAR1 op het kankerceloppervlak. (3) De collagenase subfamilie van de MMP draagt bij tot het transformeren van de matrix doordat ze fibrillair collageen kunnen afbreken. Deze subfamilie bestaat uit MMP-1, MMP-8 en MMP13. Ook MMP-14, MMP-2 en MMP-9 vertonen collagenolytische activiteit. Deze enzymen kunnen tegengestelde functies uitoefenen tijdens kankerprogressie. MMP-8 heeft een beschermende rol, MMP-1 en MMP-13 promoten de tumorprogressie. MMP-13 komt voor in een groot aantal invasieve neoplastische tumoren. Het kan teruggevonden worden ter hoogte van het invasiefront en in stromale fibroblasten gelegen naast de kankercellen. MMP-13 bevordert de tumorgroei en promoot angiogenese door vrijstelling van VEGF. (35) MT1-MMP/MMP-14 is een krachtige matrix-afbrekend proteïnase dat een breed spectrum aan ECM-proteïnen, waaronder type I collageen afbreekt. MMP-14 moduleert vijf van de zes eigenschappen, die de tumorprogressie bevorderen. Expressie van dit proteïnase bij kankercellen is geassocieerd met zelfvoorziening in groeisignalen, met ongevoeligheid voor antigroeisignalen, met angiogenese, weefselinvasie en metastase en met het ontsnappen aan het apoptoseproces. De uitdrukking van MMP-14 door kankercellen gaat gepaard met vorming van grotere tumoren. Het zorgt ervoor dat borstkankercellen kunnen ontsnappen aan de apoptose, geïnduceerd door type I collageen. Bij afwezigheid van MMP-14-afhankelijke proteolyse, zorgt type I collageen voor apoptose door de uitdrukking van Bcl-2-interacting killer (BIK) te induceren. Er bestaat een negatieve correlatie tussen BIK mRNA niveaus en het gewicht van een tumor. BIK-expressie vermindert de tumorgroei door toegenomen apoptose. MMP-14 vermindert de concentratie aan BIK-mRNA door inhibitie van de transcriptie ervan. Dus door vrijstelling van een oplosbare anti-apoptotische factor bevordert MMP-14 de tumorprogressie zodat de kankercellen aan de apoptose kunnen ontsnappen. (34) Dit werd aangetoond na orthotopische implantatie van borstkankercellen. Weinig invasieve borstadenocarcinomacellen die MMP-14 niet tot expressie brengen, ondergaan apoptose 21
wanneer ze ingebed worden in een drie-dimensionele (3D) gel met type 1 collageen. Dit is een model van de micro-omgeving die aangetroffen wordt bij invaderende carcinomacellen. Na inbedding in deze gel werden de cellen onderzocht op morfologische karakteristieken van apoptotische cellen. Om te bepalen of de verschillende gevoeligheid voor collageengeïnduceerde apoptose gerelateerd kon worden aan de celcapaciteit om de matrix te transformeren, werd de uitdrukking van drie membraantype MMP (MMP-14, -15 en -16) onderzocht met behulp van reverse-transcriptase PCR. Daarbij viel op dat enkel MMP-14 in grote mate tot expressie gebracht werd in de twee apoptose-resistente cellijnen en afwezig was in apoptose-gevoelige cellijnen. Dit suggereert dat dit enzym een belangrijk rol speelt in de onderdrukking van de apoptose. Bij incubatie van MMP-14 uitdrukkende cellen in een 3D type I collageen gel, vertoonden deze cellen een significant verminderde apoptose. Daarna werd de beschermende rol van MMP-14 onderzocht door het effect op de apoptose geïnduceerd door type 1 collageen van cellen met een verschillende graad van activiteit van MMP-14 te vergelijken. Enkel de cellen met actief MMP-14 waren beschermd tegen deze apoptose. Wanneer de MMP-14-activiteit geïnhibeerd werd met een synthetische inhibitor werd de MMP-14 autoproteolyse, de collageendegradatie en kwam het beschermend effect tegen door type 1 collageen geïnduceerd apoptose niet meer voor. (34) 1.3.10 Urokinase-type plasminogeen acitvator uPA is een serine protease dat MMP kan splitsen en zo deze eiwitten kan activeren. (3) Het kan ECM-degradatie induceren, angiogenese vergemakkelijken en zorgen voor tumorinvasie en metastase. De expressie van uPa en de uPaReceptor is afhankelijk van het kankertype. uPa is vooral gelokaliseerd ter hoogte van het invasieve front van tumoren. Daar activeren ze plasmin tot plasminogeen en zorgen ze voor de verdere activatie van verschillende proteasen. Verhoogde niveaus van uPa en PAI-1 zijn geassocieerd met een agressief verloop. (20) 1.3.11 Fibronectin TAF vertonen een toegenomen expressie van fibronectin samen met een denovo-expressie van een variant ED-A of ED-B. (36) ED-A en ED-B fibronectin komen normaal enkel tot expressie tijdens de embryogenese. (10) ED-A fibronectin geeft aanleiding tot differentiatie van fibroblasten. (36) ED-B fibronectin zorgt voor celproliferatie en is een merker van de angiogenese. (37) Stromaal fibronectin is positief geassocieerd met het metastatisch potentieel van de tumor en MMP-secretie. Zijn opregulatie samen met transglutaminase, bevordert de metastatische verspreiding van kankercellen. (21) In het stroma is de aanwezigheid van ED-A 22
fibronectin in belangrijke mate gerelateerd aan de biologische beschikbaarheid van actief TGFβ voor het onderhouden van het reactief stroma. Het promoot de tumorgroei, EMT en door de tumor geïnduceerde lymfangiogenese. ED-B fibronectin is geassocieerd met tumorangiogenese en bevordert zo de tumorprogressie. Het wordt als een belangrijk mogelijk doelwit gezien in de therapie. (10) 1.3.12 Fibroblast-activerende proteïne FAP is een membraangebonden serineprotease van de prolyloligopeptidase familie, en bezit ook nog een type I collageen specifieke gelatinase activiteit. (20, 38) FAP komt in 90% van de humane epitheliale carcinoma voor waaronder borst-, long- en ovariumkanker. (3) Het kan rechtstreeks de ECM afbreken of indirect betrokken zijn in de activatie en modificatie van andere ECM-proteasen of protease-inhibitoren en zo vergemakkelijkt het de vorming van een tumor-permissief milieu. FAP moduleert de eiwitconcentratie van TNC en type I collageen en verhoogt de organisatie van fibronectin en collageenvezels. FAP-afhankelijke verandering in de structuur en samenstelling van ECM beïnvloedt de richting en snelheid van migratie van de kankercellen. Door samenwerking met andere matrixeiwitten kan FAP tumorcelinvasie verhogen, dit dankzij een synergetisch effect op ECM-degradatie en adhesie. FAP-α expressie is geassocieerd met laat tumorherval en slechte overleving in patiënten met rectumtumoren. (20) 1.3.13 Podoplanin Podoplanin is een transmembraan glycoproteïne van het mucine-type met sterke O-glycosylatie en hoog siaalzuurgehalte. Het speelt een rol in de tumorprogressie. Podoplanin is opgereguleerd in bepaalde kankercellen in verschillende kankertypes en in het stroma ervan. Het wordt vaak tot expressie gebracht aan de invasieve rand van tumoren. Podoplanin speelt een rol in de EMT, invasie en metastase. TAF met sterke uitdrukking van podoplanin die zich eerder in het centrum van de tumor bevinden dan aan de invasieve rand zijn geassocieerd met gunstige pathologische parameters en kunnen een verlengde ziektevrije-overleving voorspellen in colorectale tumoren. In longadenocarcinoma, oesophagale adenocarcinoma, oraal squameus cel carcinoma en invasieve borsttumoren zorgt de expressie van podoplanin voor een slechte overleving. (39) 1.3.14 Type I collageen en reactief stroma Verschillende carcinomen worden gekenmerkt door de vorming van een reactief stroma 23
geassocieerd met een uitgebreide type I collageen- en fibrinedepositie. Als invaderende kankercellen de onderliggende basale membraan doorboren, worden ze geconfronteerd met een dens 3D-reactief stroma gedomineerd door type I collageen. Om metastasen te kunnen vormen, moeten invaderende kankercellen de mogelijkheid verwerven deze nieuwe micro-omgeving te overwinnen. Type I collageen vormt een fysieke barrière voor celmigratie. Het verhindert de proliferatie van normale cellen en kankercellen en het werkt als een endogeen antigroei-signaal. Collageen induceert apoptose bij epitheliale cellen. De drievoudige helicale structuur van type I collageen is resistent voor bijna alle vormen van proteolytische splitsing. (34) Collageen wordt in belangrijke mate door TAF geproduceerd. Borsttumoren met een slechtere prognose vertonen een hoge expressie van type 1A1 collageen en COX2. Dit suggereert een belangrijke rol van fibroblasten als voornaamste bron van collageen en de vorming van een tumorpermissief gastheerweefsel. (4) Agressieve tumoren zijn gekenmerkt door een hoge concentratie aan interstitieel fibronectin en collageen. (10)
1.4 TAF en genetische veranderingen TAF reageren niet enkel op groeifactoren en cytokines maar ondergaan soms genetische veranderingen. (3) De ontwikkeling van tumoren wordt gestuurd door het verwerven van een viertal progressieve mutaties in oncogenen of tumorsuppressorgenen. (14) Doordat stromale cellen zich minder snel vermenigvuldigen dan de sterk proliferatieve kankercellen, hebben ze minder last van de selectie, die deze kankercellen ondergaan. Daardoor moeten deze cellen zich minder aanpassen en vertonen ze minder mutaties. Genetische mutaties in deze stromale cellen zijn dus subtieler en meer verspreid dan in kankercellen. (18) Deze genetische veranderingen kunnen los van de originele tumor voorkomen. (3) Over het wel of niet optreden van genetische mutaties in het stroma is er echter nog volop discussie. Het stroma wordt gezien als genetisch stabiel vooral in vergelijking tot de sneldelende tumormassa. Sommige studies hebben genomische modificaties van het tumorstroma beschreven, waaronder amplificaties, verlies aan heterozygositeit en kleine mutaties. In tegenstelling daartoe, beschrijven andere studies het stroma als een genetisch stabiel element. Zo kon men geen karyotypische veranderingen vinden in TAF van orale carinomen. TAF afkomstig van pancreastumoren vertonen geen variaties in de somatische kopijen of immunohistologische evidentie voor p53 mutaties. Deze discrepantie kan te wijten zijn aan het feit dat de TAF-populatie niet per se afgeleid is van normale fibroblasten. Het genetisch gewijzigd stroma kan een onderdeel van de tumorcellen die EMT ondergaan hebben, 24
vertegenwoordigen. Uit de verschillende studieresultaten blijkt dat deze discrepantie ook te wijten kan zijn aan de soort test gebruikt om deze mutaties op te sporen. (18) In de meeste gevorderde tumoren kunnen somatische mutaties van bijvoorbeeld p53 en PTEN optreden. Deze twee genen zijn tumorsuppresorgenen. Als reactie op verschillende stressfactoren neemt hun concentratie toe en leiden ze tot groeiarrest en apoptose. Verstoring hiervan leidt tot kankerprogressie. De inactiviteit van deze twee genen wordt vaak gezien in TAF rond de tumor, en de expressie ervan wordt beïnvloed door kankercellen. Een paracrien mechanisme dat selectieve druk uitoefent, promoot de expansie van p53-negatieve TAF. (3, 40) Bij verlies van p53 ontstaat er een een zeer proliferatief mesenchym. Maar deze reactie treedt niet op in de omgeving van alle epitheliale cellen. p53-activatie onderdrukt de proliferatie van stromale fibroblasten, waardoor het een selectieve druk tegen p53 in dat deel veroorzaakt. Coevolutie van het stromale compartiment, met selectie van genetisch veranderde cellen kan optreden als gevolg van oncogene stress in het epitheel. (40)
2. Carcinogenese en de rol van TAF 2.1 Algemeen Ontwikkeling van de tumor en progressie naar een gevorderd stadium vereist de succesvolle co-evolutie van zowel kankercellen als stromale cellen. (17) Twee interactieve signaalwegen, die kanker en stromale cellen linken, ontwikkelen zich daarbij. In de ‘efferente’ signaalweg zorgen kankercellen voor een reactieve reactie in het stroma en in de ‘afferente signaalweg’ beïnvloeden geactiveerde stromale cellen de maligniteit van kankercellen. De activatie van TAF is een redox-gereguleerd proces. TGF-β1 zorgt voor de generatie van ROS in TAF, die de verantwoordelijke boodschappers zijn voor het bekomen van het myofibroblastfenotype, voor neerregulatie van de gapjuncties tussen de verschillende TAF en voor de tumor-bevorderende activiteit in onder andere huidtumoren. De rol van TAF in tumorprogressie is veelzijdig aangezien ze de maligne groei zowel kunnen promoten als inhiberen. Net zoals immuuncellen, inhiberen TAF de vroege stadia van tumorprogressie, voornamelijk door de vorming van gapjuncties tussen geactiveerde fibroblasten te stimuleren en zo contactinhibitie uit te oefenen op kankercellen. (21) De kankercelgroei wordt bevorderd door de expressie van groeifactoren door kankercellen en door verlies van, en mutaties in apoptose-bevorderende eiwitten in de cel. (42) TAF zijn in de tumorgroei van belang als acceptor, en als producent van tumorpromotende signalen. (7) Ze 25
stimuleren de proliferatie van de kankercellen rechtstreeks door het secreteren van verschillende groeifactoren, hormonen en cytokines. (1) Verder scheiden ze ook SDF-1, FGF-2 en VEGF die de angiogenese doen toenemen en SDF-1, IGF-2, HGF, Gremlin-1 en secretedfrizzled gerelateerd proteïne-1 (SRFP-1) die de tumorcelproliferatie stimuleren, uit. Ze zorgen voor de secretie van TGF-β, TNC, tenascin-W, HGF en MMP die de tumorcelinvasie bevorderen. SFRP-1 geproduceerd door TAF voorkomt de apoptose van kankercellen. (17) Daarnaast beschikken ze over celoppervlakte-eiwitten en ECM-proteïnen die de tumorgroei ook bevorderen. De meeste elementen hebben verschillende effecten en werken in op verschillende celtypes. (7) TAF kunnen, doordat ze zo overvloedig aanwezig zijn rond de tumor, de groei van kankercellen stimuleren door hun invloed op de metabole signaalwegen. Tijdens de proliferatie van kankercellen, verkiezen deze cellen gebruik te maken van anaerobe glycolyse, zelfs in de aanwezigheid van zuurstof. TAF kunnen bepaalde complementaire metabole signaalwegen bufferen en producten recycleren van het anaerobe metabolisme zodat G Model
ARTICLE IN PRESS
YSCBI-1095; No. of Pages 9 de kankercellen blijven groeien. (3) 2
J. Harper, R.C.A. Sainson / Seminars in Cancer Biology xxx (2014) xxx–xxx
Figuur 3: Cellulaire van TAFandentheprocessen waarmee ze progression. kankerprogressie beïnvloeden. EC: Fig. 1. Cellular origins oorsprong of cancer associated fibroblasts processes by which they affect cancer CAFs can originatekunnen from a variety of tissue types through a number of different cellular processes. These include EMT and EndMT from tumour epithelia and endothelial cells, respectively. They can also derive from pericytes, endotheliale cellen, ITGA11: integrine-alpha 11. (41) adipocytes and circulating mesenchymal stem cells originating from the bone marrow. Increased levels of transforming growth factor beta (TGF-!) in the microenvironment can also cause resident tissue fibroblasts to acquire a CAF phenotype, which is associated with expression of a variety of CAF-specific markers (as indicated). Once present in the tumour microenvironment, they can affect tumour growth, survival, progression and dissemination through the processes stated.
2.2 TAF en hun invloed op de ECM
observed during wound healing. However, unlike wound healing,
of "-SMA (smooth muscle actin) but this has been demonstrated to
the activated phenotype of CAFs is not reversible and is long not exclusively label CAFs [27]. Due to this discrepancy, other markTAF worden gezien als deP53cellen verantwoordelijk voor de used synthese, degradatie enwhich modificatie lasting. Inactivation of both and PTEN have been described ers have been to identify CAFs and include FAP, appears in CAFs that are in close proximity to tumour cells, suggesting
to be expressed selectively on pericytes and activated fibroblasts
alteration which could partially explain the non-reversibility of
which regulates both cytoskeletal integrity and cell cycle progres-
originate,de like cancer cells, through reaction, fibroblast 1 (FSP1), that these cells during tumour/stroma van de ECM. Ze could kunnen productie vangenetic ECM-eiwitten verhogen, zoalsspecific typeprotein I, III en V their activated phenotype [18]. On the other end, an important sion, neuron–glial antigen-2 (NG2), CD90 [28], vimentin, integrin collageen, integrines, laminin, en 11, trombospondine (TSP). (20)"/bDe ECM source alpha of CAFs seems fibronectin, to be mesenchymalTNC, stem cells (MSCs) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR residing in the bone marrow. MSCs were shown to be attracted to
"/!). Although we now have a bigger toolbox of potential mark-
MSCs were shown to acquire an activated CAF phenotype solely
same tumour, may not express all these markers.
[21]. In breast cancer, myofibroblasts have been demonstrated to
promoting role of CAFs [29], and a number of pro-tumourigenic
been described as undergoing transformation into fibroblast-like
of factors involved in the degradation of the extracellular matrix
of endothelial cells and the down-regulation of E-cadherin in a process described as endothelial to mesenchymal transition (EndMT) [23]. Another cell type linked to blood vessels and demonstrated to be a source of activated fibroblasts is the pericyte. In fact, as demonstrated with endothelial cells, TGF-! triggers the trans-differentiation of quiescent perivascular pericytes into myofibroblasts to promote tumour growth and metastasis [24].
ination of cancer cells. These factors include plasminogen activators and matrix metalloproteinases [30]. As mentioned above, CAFs are not only a direct source of growth factors (such as HGF, VEGFA, b-FGF and EGF), but they can also release these factors via proteolysis of the ECM by secreting the necessary proteases. Another role attributed to CAFs is the establishment of the metastatic niche (the seed and soil hypothesis). The idea is that early stroma acti-
and to proliferate within the microenvironment to become ers to identify, and study CAFs, it is TAF clear thatzorgen none of these speelt een belangrijke roltumour in het proces van maligne groei isolate en invasie. (1) voor myofibroblasts [19,20]. For example, human bone marrow-derived markers can identify all CAFs and that each CAF, even within the
transformatie vanwithdeconditioned ECM.media De obtained architectuur beïnvloedt verschillende from tumourvan cells de ECM of scientific literature now supports belangrijke the tumourupon culture A large body trans-differentiate from epithelial cells (via EMT) [22] and this may properties have been assigned to CAFs. These include the modcelfuncties zoals proliferatie, differentiatie, migratie, de ontwikkeling en overleving van constitute another source of CAFs. Similarly endothelial cells have ulation of the stroma in a paracrine fashion through the release
kanker. cells Dethrough structuur van deThisECM bepaalt de celmorfologie, integrinesignalisatie en het the action of TGF-!. involves the delamination (ECM), a process that is critical for the growth, invasion and dissem26
cellulaire cytoskelet. Zo kunnen ze de celcyclus controleren. De ECM wordt zowel fysiologisch als pathologisch getransformeerd, zoals bij de vorming van fibrose en kanker. TAF zijn een belangrijk element in de transformatie van de ECM omdat ze voornamelijk verantwoordelijk zijn voor de productie van ECM-proteïnen (collageen, fibronectin) en van proteasen en andere enzymen betrokken in de post-transcriptionele verandering van de ECM-proteïnen. (21) In vaste tumoren ziet men een toegenomen matrixdepositie en een progressieve verstijving van de ECM. De verstijving van ECM is gecorreleerd met een toegenomen aantal covalente bindingen tussen collageenmoleculen. De vernetting van collageen wordt gekatalyseerd door LOX. (21) Dit is een enzym dat het verweven van het collageen- en de elastinebundels katalyseert en zo de strekkracht van de ECM beïnvloedt. (10) LOX wordt tot expressie gebracht in de fibroblasten gedurende de vroege stadia van borstkankervorming. In een later stadium wordt LOX ook geïnduceerd in hypoxische kankercellen en promoot het de agressieve tumorgroei. ECM-transformatie door LOX-activiteit bevordert in positieve zin de kankercelmigratie en -invasie. (21) Inhibitie van LOX vermindert de kankercelmotiliteit en invasie en verhindert de vorming van metastasen in bepaalde borstkankermodellen. (4) LOX wordt geactiveerd onder invloed van hypoxie en hypoxie-induceerbare factoren (HIF). Kankercellen ondergaan genetische en adaptieve veranderingen zodat ze in hypoxische condities kunnen overleven. Deze veranderingen promoten een agressief tumorfenotype geassocieerd met metastasen en slechte prognose. (43) Daarbij draagt ECM-rigiditeit in tumoren, samen met een verminderd vasculair en lymfatisch netwerk, bij tot toegenomen interstitiële vochtdruk, leidend tot een gedaalde afgifte van chemotherapeutische middelen in de tumor. (21) Toegenomen LOX-activiteit en expressie is geassocieerd met een slechte prognose in verschillende tumoren. (4, 10) Naast collageen zijn er twee andere ECM-componenten, voornamelijk geproduceerd door TAF, belangrijk in de tumor micro-omgeving. Dit zijn fibronectin en hyaluron. Fibronectin kan een ligand zijn voor verschillende leden van de integrine-receptorfamilie en reguleert zo de collageenfibrilstructuur, die een belangrijke rol speelt in de celadhesie, -migratie en -groei. TAF mediëren de overexpressie van hyaluron in de tumoromgeving, wat een rol speelt in de rekrutering van tumor-geassocieerde macrofagen (TAM). TAM zijn belangrijke regulatorcellen betrokken in de tumorneovascularisatie via de rekrutering van endotheelcellen. (21) De meeste vaste tumoren vertonen een extensieve proliferatie van de stromale fibroblasten en een verhoogde depositie van ECM-componenten. Dit zorgt voor de vorming van het 27
desmoplastich/reactief stroma dat geassocieerd is met een slechte prognose. (20) Desmoplasie is een fibrotische status gekenmerkt door een accumulatie van type I en III collageen en degradatie van type IV collageen. Desmoplasie wordt vaak gevonden in pre-metastatische en metastatische regio’s. (9, 21) De covalente binding van collageen en elastine wordt gemoduleerd door LOX, een enzym gesecreteerd door fibroblasten. Dit is een belangrijk mechanisme verantwoordelijk voor de vorming van desmoplastisch stroma en fibrose. Inhibitie van LOX vermindert significant het verweven fibrillair collageen, fibroblast-activatie, endotheelcelrekrutering en de productie van groeifactoren en cytokines. (20)
2.3 TAF en hun invloed op het metabolisme TAF spelen een rol in het ingewikkelde metabolisme van tumoren. Ze voorkomen dat er een tekort aan energie ontstaat door het Warburgeffect. (21) Tijdens hun proliferatie maken kankercellen gebruik van glycolyse, zelfs in aanwezigheid van voldoende zuurstof. Dit noemt men ook wel de aerobe glycolyse of het Warburgeffect. (3) Kankercellen zijn ‘verslaafd’ aan glucose. Normale cellen kunnen vetzuren en aminozuren verbranden. Maar in kankercellen vormt glucose de belangrijkste energiebron en de belangrijkste bron van cellulaire bouwstenen vereist voor celproliferatie. Dankzij de hoge glycolyse kunnen kankercellen genieten van een selectief groeivoordeel op vlak van bio-energie en -synthese. (9). De stromale cellen zullen instaan voor het bufferen en recycleren van producten van het Warburgeffect om zo de invasieve kankergroei te onderhouden. (21) Tumoren met minder agressieve klinische karakteristieken hebben een lagere concentratie aan nucleïnezuren, aminozuren en glycolyse-bijproducten. Meer agressieve tumoren hebben een hogere concentratie aan deze Warburg-geassocieerde metabolieten. Glucose-oxidatie is afhankelijk van zowel stromale als epitheliale karakteristieken. Een signaalweg dat een prominente rol speelt in dit proces bij borsttumoren is de HGF/c-MET signaalweg. Het promoot de tumorvorming, verhoogt metastasevorming en medieert medicatieresistentie in de meest agressieve borsttumoren. HGF reguleert de glucose-transporter 1 (GLUT1) -expressie, die op zijn beurt de glucose-opname reguleert. Inhibitie van exogene HGF blokkeert de GLUT1-expressie en vermindert de glucose-opname. Deze resultaten werden bekomen na vergelijkend onderzoek tussen borsttumorweefsel en normaal borstweefsel van verschillende patiënten. Met behulp van micro-array en massaspectrometrie werden de metabolieten onderzocht. Genexpressie en klinische karakteristieken van de patiënten werden geëvalueerd in associatie met het metabole fenotype. Om de rol van stromale interacties in het gewijzigd 28
metabolisme te evalueren werden co-culturen gevormd van borstkankercellen en primaire TAF. Cytokine-array identificeerde HGF als mogelijke mediator van stromale-epitheliale interactie. Antilichaamneutralisatie van HGF resulteerde in verminderde expressie van GLUT1 en verminderde glucose-opname door het epitheel. (44) Fibroblasten in contact met epitheliale kankercellen, ondergaan differentiatie en produceren lactaat en pyruvaat via aerobe glycolyse. Pyruvaat kinase M2 en lactaatdehydrogenase worden sterk tot expressie gebracht in het stroma van borsttumoren, waar er een tekort aan Cav1expressie is. Fibroblasten, die geactiveerd worden door deletie van Cav1 of door neerregulatie van Cav1 vertonen een stabilisatie van HIF-1. Deze neerregulatie treedt op door oxidatieve stress, geïnduceerd wanneer TAF in contact staan met kankercellen. De metabole consequentie in TAF is de HIF-1-gemedieerde verandering naar aerobe glycolyse en de eliminatie van mitochondriale activiteit door mitofagie. In colorectale carcinoma brengt het stroma enzymen, die de aerobe glycolyse bevorderen tot expressie. (21)
2.4 TAF en hun invloed op de tumorangiogenese Groei en metastase van kankercellen vereisen de inductie van angiogenese. Een cruciaal proces in de ontwikkeling en groei van vaste tumoren. (42) Kankercellen maken gebruik van verschillende strategieën om in voldoende zuurstof te voorzien zodat ze aan de metabole vraag kunnen antwoorden. Deze strategieën vereisen vorming van nieuwe bloedvaten en aantrekking van het omgevende stroma. (14) Zonder angiogenese kunnen tumoren niet groter worden dan 1 mm3. (24) Vorming van nieuwe bloedvaten rond een tumor is dus een essentieel pathofysiologisch proces voor de groei en de progressie ervan. (17) Tumorneovascularisatie kan plaatsvinden doordat nieuwe bloedvaten ontspringen uit bestaande vaten, door invaginatie van het lumen en door het afsplitsen van vaten. Andere mogelijkheden zijn bloedvaten die ontstaan uit de kankercellen, stimulatie van endotheliale kenmerken van kankercellen, vorming van lymfevaten en rekrutering van endotheliale voorlopercellen. (14) TAF kunnen een rol spelen in de vascularisatie op twee verschillende manieren. Enerzijds kunnen ze zorgen voor de productie van groeifactoren en cytokines, die de angiogenese kunnen bevorderen. Anderzijds kunnen ze een directe rol spelen door vasculaire ondersteuning. TAF en hun expressie van α-SMA linken deze cellen aan pericyten. Een pericyt is een fibroblastachtige cel die een ondersteunende rol speelt voor endotheliale cellen in tumoren en normale systemen. Ze zorgen voor stabilisatie van de bloedvatwand, beïnvloeden de vasculaire permeabiliteit, 29
inhiberen de endotheliale celproliferatie en promoten endotheliale celoverleving en -maturatie. (24) Angiogenese wordt bevorderd door toegenomen expressie van verschillende groeifactoren, cytokines en ECM-eiwitten geproduceerd door tumor-geassocieerde stromale cellen. (17) TAF voorzien in angiogenese-bevorderende factoren, en daarbij speelt het stroma een belangrijkere rol dan de tumor zelf. (1) PDGF en VEGF zijn twee moleculen verantwoordelijk voor de angiogenese. TAF zijn de voornaamste bron van VEGF, een essentiële molecule in het proces van tumorangiogenese. VEGF wordt zowel door kanker epitheelcellen als TAF geproduceerd. Kanker-stroma interactie kan de productie van VEGF verhogen. VEGF en hun receptoren zijn de voornaamste mediatoren van angiogenese en lymfangiogenese, waarbij niet enkel endotheliale proliferatie, overleving en migratie betrokken is maar ook de vorming van vasculaire structuren. Ze beïnvloeden de vasculaire doorlaatbaarheid en dit leidt tot een toegenomen interstitiële vochtdruk in het tumorstroma dat geassocieerd is met chemotherapie resistentie. (7) PDGF/PDGFR-signalisatie is betrokken in de angiogenese en voorziet fibroblasten van een sterk mitogeen signaal. (20, 10) PDGF rekruteert beenmergvoorlopercellen, zorgt ervoor dat deze differentiëren in endotheliale cellen of gladde spiercellen en promoot endotheliale/gladde spiercelgroei en/of migratie. PDGF-β afgeleid van endotheliale cellen rekruteert pericyten naar de vaatwand. Pericyten secreteren Ag1 om de overleving en het groeien van endotheliale cellen te promoten, en endotheliale stabiliteit te bevorderen en dit zorgt voor vasculaire maturatie. PDGF induceert angiogenese door rekrutering van VEGF-producerende stromale fibroblasten. Blokkering van deze signaalweg kan de stromale reactie, het totaal oppervlakte aan microvasculatuur en het aantal pericyten verminderen. PDGF/PDGFR-signalisatie kan EMT induceren, verschillende subtypes van TAF rekruteren en activeren en de interstitiële vochtdruk verhogen. (20) TAF produceren FGF, die ook een rol speelt in de tumorangiogenese. (7) Toegenomen secretie van het angiogenese-bevorderende chemokine SDF-1 door stromale fibroblasten wordt gevonden in borst- en prostaatcarcinomen. SDF-1 bevordert de nieuwvorming van bloedvaten door de rekrutering van endotheliale voorlopercellen in de tumor. TAF spelen een rol in het mediëren van resistentie tegen anti-angiogene therapie.(17)
30
2.5 TAF en hun invloed op de inflammatie Inflammatie wordt veroorzaakt door heterotypische interacties tussen maligne kankercellen, vasculair endotheel, fibroblasten, adipocyten, inflammatoire cellen en immuuncellen. In tumoren bevordert de inflammatoire respons de overleving van maligne cellen en stimuleert het de pathofysiologische angiogenese. Heterotypische interacties tussen maligne cellen en de onderliggende stromale cellen zijn de drijvende kracht tijdens de progressie. Ontstoken tumorgeassocieerd vetweefsel voedt groeiende maligne cellen door te werken als een bron van vasculair endotheel en geactiveerde pro-inflammatoire cellen waaronder vooral macrofagen. Veranderingen in het stroma of het nabije weefsel kunnen optreden bij tumorprogressie en kunnen actief bijdragen tot de overleving en verspreiding van maligne cellen. In dit proces is er een belangrijke rol voor IL-6 weggelegd. (45) In de micro-omgeving van ontwikkelde tumoren treedt immunosuppressie op en zo kunnen tumoren groeien en zich verspreiden zonder geëlimineerd te worden door het immuunsysteem van de patiënt. TAF worden gelinkt aan de rekrutering en regulatie van aangeboren en adaptieve immuuncellen. Tumoren kunnen bepaalde types inflammatoire cellen manipuleren en ervoor zorgen dat ze immunosuppressief worden zodat ze kunnen groeien en zich verspreiden. Verschillende somatische mutaties en epigenetische modificaties kunnen accumuleren in oudere patiënten en deze zorgen ervoor dat de kankercellen niet aangevallen worden door de gastheer. Ze verstoppen zich voor immuuncellen door bijvoorbeeld de expressie van MHC-I te verminderen en zo de antigenpresentatie te beïnvloeden. Ze doen dit ook door de immuuncelprofielen te beïnvloeden door een verandering van een Th1- naar een Th2-polarisatie te induceren. Of ze doen dit door rechtstreeks immuuncellen te elimineren, via verhoogde expressie van Fas-ligand of TNF-gerelateerde apoptose-inducerend ligand, die de apoptose induceren. Al deze processen zorgen ervoor dat de kankercel een slechte stimulator van en een slecht doel voor het gastheerimmuunsysteem vormt. (22) TAF induceren inflammatie in de kankeromgeving. (3) Inflammatie zorgt voor tumorinitiatie, groei, -progressie en metastase. (1) Chronische inflammatie geeft aanleiding tot tumor-vorming doordat het de celproliferatie bevordert. (3) TAF nemen deel aan het inflammatoir proces door de productie van cytokines en chemokines en door de activiteit te moduleren en verschillende immuuncellen aan te trekken. (1,3) TAF trekken massaal macrofagen, neutrofielen en lymfocyten aan in de richting van het tumorstroma door secretie van specifieke oplosbare factoren. TAF mediëren zo niet alleen de kwaliteit maar ook de kwantiteit van het 31
immuunantwoord. (45) Ze kunnen het immuunsysteem reguleren door indirecte effecten op de tumor micro-omgeving via de stijfheid van het stroma, via de angiogenese, door inductie van hypoxie en via het beïnvloeden van het metabolisme. Ze kunnen het immuunsysteem ook beïnvloeden door de vrijstelling van verschillende signaalmoleculen. TAF zijn onder andere een belangrijke bron van VEGF en dit heeft een grote impact op immuuncellen. VEGF zorgt voor immunosuppressie door het beïnvloeden van Tvoorloper-cellen. VEGF inhibeert de maturatie en functie van dendritische cellen en antigen-presenterende cellen. Overexpressie van VEGF-
ARTICLE IN PRESS
activiteit in tumoren kan aanleiding geven tot infiltratie van Treg-cellen en Tsuppressor-cellen
G Model
YSCBI-1095; 4
No. of Pages 9
afgeleid van het myeloid die de belangrijkste stimulatoren de immunosuppressie. (22) J. Harper, R.C.A. Sainson / Seminars in Cancer Biology xxxzijn (2014)van xxx–xxx
Figuur 4: Regulatie van het aangeboren en adaptief immuunsysteem door TAF. In de micro-omgeving resulteert continue communicatie tussen verschillende celtypes in paracriene en autocriene activatie van TAF. Dit geeft aanleiding tot chemokine- en cytokinevrijstelling in het stroma. Deze chemokines en cytokines richten zich op verschillende immuunceltypes. Ze hebben eenthe immunosuppressief op witte bloedcellen die een rol spelen Mast cells, an immune cell type that perhaps produces greatstatus of effect other leukocytes involved in innate immunity (suchin as NK en adaptief systeem. (46)shown to be regulated by CAFs derived from est repertoire of chemokines and cytokines,het cells) has areaangeboren tissue resident also been
Fig. 2. Regulation of the innate and adaptive immune system by CAFs. In the microenvironment, continual crosstalk between different cell types results in paracrine and autocrine activation of CAFs that, in turn, gives rise to a predominately NF-KB-mediated wave of chemokine and cytokine release into the stroma. These chemokines and cytokines target several immune cell types and have an immuno-suppressive function on both adaptive and innate white blood cells.
sentinel cells that are rarely observed outside connective tissue [51]. Recently, there have been reports linking these cells to an increase in tumour angiogenesis and reorganisation of the tumour microenvironment in mouse models of cancer [52]. Complex interactions between mast cells, tumour cells and pancreatic stellate cells (the cells often described as CAF precursors and responsible for the desmoplastic reaction observed in pancreatic cancer) in a model of PDAC has been described. Pancreatic tumour and stellate cells were able to stimulate mast cell activation in vitro, as judged by TNF-! release into the media, whilst tumour cells also promoted mast cell migration. Reciprocally, mast cells could promote tumour and stellate cell proliferation in vitro through release of IL-13 and tryptase. When these cell–cell “interactions” were blocked a clear suppression of tumour growth was observed. This demonstrates that manipulating the interactions between cells in the tumour microenvironment is possible and can have profound effects on tumourigenesis [53]. In conclusion, CAFs have been demonstrated to secrete several chemokines involved in the recruitment of innate immune cells, such as monocytes, mast cells and neutrophils, and their acquisition of an immunosuppressive and pro-tumour phenotype (Fig. 2). Certain factors derived from activated myofibroblasts may have
metastatic melanoma through the action of prostaglandin E2 [56] therefore suggesting a broader immune-regulatory role for CAFs outside of the myeloid lineage.
Andere belangrijke moleculen betrokken in de inflammatoire reactie rond de tumor zijn
3.2. The effects ofin CAFs de on adaptive immunity d.m.v. een macrofagen. Macrofagen worden actief aangetrokken tumorregio CAFs have also been implicated in modulating adapchemotactische gradiënt. Ze stellen verschillende factoren vrij die het gedrag thevan tive immune response. However, a problem yet to be properly
for investigating the interplay between CAFs and adapendotheelcellen beïnvloeden, waaronder VEGF, addressed HGF, MMP-2, IL-8. Dit bleek uit een studie tive immune cells is the lack of complex relevant multi-cellular in vitro assays. In addition, a high proportion of the in vivo work waarbij peritumoraal vetweefsel onderzocht werdcarried in een melanoma muismodel. In vergelijking out in this field has been conducted in immuno-deficient animals (that allow engraftment of human tumours onto mice),
met controle vetweefsel, vertoont vetweefsel naast geïmplanteerde eenB cell verminderde thus hindering the effects oftumoren CAFs on T and functions. Recent studies using immuno-competent GEM models, demonstrated that
grootte van de adipocyten, een meer uitgebreidenormal fibrose, eenfibroblasts toegenomen angiogenese en eencells dermal can be “educated” by carcinoma to express pro-inflammatory genes, mainly through activation of the NF-#" pathway in the activated fibroblasts. Using PDGFR! to 32 select normal and tumour derived fibroblasts, the group of Hanahan identified an NF-#" dependent pro-inflammatory gene signature in CAFs isolated from different murine models of cancers originating in the skin, the breast and the pancreas. CAFs derived from a fourth
dens macrofaaginfiltraat. Een cytokine muiseiwit-array toonde de opregulatie van inflammatoire mediatoren aan, waaronder IL-6, chemokine ligand 1 (CXCL1), MCP-1, macrofaag inflammatoire proteïne 2 (MIP-2) en TIMP-1 in peritumoraal weefsel in vergelijking tot overeenkomstig vetweefsel. (45) Normaal produceren gerekruteerde macrofagen, cytokines en chemokines. Deze beïnvloeden de rekrutering en acties van andere immuuncellen. Zo doden ze kankercellen en presenteren ze antigenen aan de cytotoxische T-cellen. Maar kankercellen secreteren bioactieve moleculen, waaronder IL-4, IL-6, kolonie-stimulerende factor 1 (CSF-1) en VEGF, die de omzetting van het fenotype van de macrofagen beïnvloeden. Deze worden dan omgezet van het M1- naar het immunosuppressief M2-fenotype, die ook wel tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) genoemd worden. Deze geven aanleiding tot apoptose in geactiveerde CD8+ T-cellen en zorgen voor de inhibitie van de maturatie van dendritische cellen. TAM vormen een aantal signaalmoleculen en promoten tumormetastase door inhibitie van de immuunrespons, door stimulatie van de angiogenese en door het vergemakkelijken van de intravasatie en uitzaaiing in verafgelegen zones. Een hoge densiteit aan TAM is geassocieerd met een slechte prognose, vooral in borst-, prostaat-, ovarium- en cervixcarcinomen. (42) Verschillende pro-inflammatoire factoren geproduceerd door TAF houden de kankerregio in een staat van chronische inflammatie die kankercelmetastase vergemakkelijkt. (3) Zo induceren ze de angiogenese en brengen ze immuunevasie tot stand. (1) De inflammatie-bevorderende handtekening in fibroblasten wordt geïnduceerd door paracriene signalen afkomstig van kankercellen. (4) Ze produceren factoren die bijdragen tot de rekrutering van tumorstimulerende inflammatoire cellen. CXCL14 tot expressie gebracht door prostaat-TAF, verhoogt het aantal macrofagen van de tumor en promoot zo de tumorgroei. (7) TAF vertonen een specifieke pro-inflammatoire handtekening verantwoordelijk voor hun tumor-bevorderende rol. Studies uitgevoerd op TAF afkomstig van prostaatkanker, toonden aan dat de van TAFafgeleide chemokine CXCL14 de tumorgroei promoot. Dit gebeurt door stimulatie van de groei en de migratie van fibroblasten, door monocyten aan te trekken en angiogenese te stimuleren. Expressie van CCL7, CXCL1, CXCL2 en CXCL8, die geassocieerd zijn met neutrofielen en myeloïde cellenrekrutering, bevorderen ziekte-progressie en -verspreiding. (20) TAF bepalen, via de vrijstelling van verschillende signaalmoleculen de immuunreactie op kankercellen. En door het beïnvloeden van het aangeboren en adaptief immuunsysteem, 33
beïnvloeden ze de prognose van tumoren. Zo is het immunosupprieve Th2-fenotype geassocieerd met een slechte prognose. (22) De opregulatie van de cytokines IL-6, IL-8 en IL1β is geassocieerd met het inflammatoire netwerk dat tumorvorming, angiogenese en metastasevorming promoot. (20) NFκB is een belangrijke factor in het onderhouden van het inflammatie-bevorderende fenotype van de fibroblasten. (4) TNC kan de migratie van monocyten in de tumorzone en de adhesie van T-lymfocyten aan fibronectin inhiberen. TSP-1 kan antigeen-presenterende cellen en T-lymfocyten beïnvloeden door interactie met de immuuncellen of door activatie van groeifactoren. TAF spelen een belangrijke rol in de onderdrukking van de immuunrespons door INF-γ en TNF-α afhankelijke mechanismen van celdood te onderdrukken en door in te werken op de natuurlijke celdoodfunctie zoals cytotoxiciteit en cytokineproductie. (20)
2.6 TAF en de krachtsafhankelijke transformatie van de matrix Tumorproliferatie is een essentiële stap voor de daaropvolgende invasie. (3) Fibroblasten sturen de tumorprogressie door modulering van biomechanische krachten. Biomechanische krachten controleren de weefselontwikkeling en passen de weefselhomeostase aan. (4) De krachtsafhankelijke transformatie van de matrix is afhankelijk van integrine-α3 en -α5. Integrine-α5β1 reguleert de MMP-expressie en activiteit. In TAF is integrine-α5β1 opgereguleerd. Deze molecule speelt een belangrijke rol in TAF-gestuurde tumorvorming en metastase door toegenomen beweeglijkheid van de cel. Verder kunnen integrines ervoor zorgen dat geactiveerde endotheliale cellen contact zoeken met ECM-eiwitten. Ze kunnen bindingsplaatsen voor endotheliale cellen, endotheliale stamcellen en inflammatoire cellen voorzien op de plaats van de angiogenese en ze kunnen signalen activeren voor endotheliale celmigratie en -overleving. (20)
3. Metastase en invasie en de rol van TAF 3.1 Algemeen Vorming van metastasen is een complex proces bestaande uit verschillende stappen met sequentiële moleculaire en cellulaire evenementen. (14) Kankers die evolueren naar een maligne status verwerven de mogelijkheid om het omgevend weefsel te invaderen en metastasen te verspreiden via bloed- en lymfevaten. (1) Kankermetastasen geven aanleiding tot meer dan 90% van de mortaliteit van vaste tumoren. De vorming bestaat uit verschillende stappen, dat aan primaire kankercellen de kans geeft om los te komen van hun oorsprong en andere organen te koloniseren. (26) De verschillende stappen betrokken in het metastatisch 34
proces zijn lokale invasie, intravasatie, overleving in de bloedsomloop, extravasatie, kolonisatie en ontwikkeling van micrometastasen in verre weefsels resulterend in de vorming van macroscopisch waarneembare metastasen. (17, 26) Al deze processen worden intrinsiek geregeld door de kankercellen en extrinsiek door het omgevende stroma. (26)
V. Catalano et al. / Seminars in Cancer Biology 23P (2013) 522–532
525
Figuur 5: verschillende stappen van de metastase en de signaalmoleculen die een belangrijke rol spelen in dit proces. primary(47) tumor growth, hypoxia acts as inductor of “glycolytic” phenotype and executor of Fig. 2. Regulatory functions of hypoxia in different steps of metastasis. (1) During EMT. (2) Under hypoxia, tumor cells gain an improvement in motility and invasion capacity, facilitating thereby detachment and dissemination from the primary site. (3 and 4) Increased expression of VEGF and MMPs induced by hypoxia is critical to penetrate the vasculature and promote the subsequent exit. (5) By the recruitment of bone marrowderived cells and CD11b+ myeloid cells to secondary organs, LOX secreted by hypoxic tumor cells forms the premetastatic niche. (6) Hypoxia-dependent induction of CXCR4 and angiogenesis contribute to the successful metastatic colonization. Epithelial mesenchymal transition (EMT), lactate dehydrogenase A (LDHA), pyruvate dehydrogenase kinase 1 (PDK1), Lysyl oxidase (LOX), autocrine motility factor (AMF), cathepsin D (CTSD), matrix metalloproteinase (MMPs), vascular endothelial growth factor (VEGF), angiopoietin-like 4 (ANGPTL4).
De metastasecapaciteit van carcinomen is afhankelijk van autonome celeffecten in antwoord op
genetische of epigenetische veranderingen en van de interactie tussen tumor-geassocieerd
stroma en carcinomacellen die de invasie- en metastasecascade bevorderen. Een grote
CD44 and its variant isoforms have already been identimetastatic growth requires also adequate ROS defense ability to concentratie aan myofibroblasten in het stroma is geassocieerd met een toegenomen risico op fied as tumor metastasis-associated proteins. Ectopic expression successfully colonize secondary sites. Interestingly, knockdown of of CD44v6 splice variant metastatic non the redox protein 2 has been reported to inhibit invasie en confers metastase en eenpotential slechtereto klinische prognose. (17)thioredoxin-like Opdat kankercellen zouden metastatic tumor cell lines, promoting Met activation by its ligand tumorigenesis and metastasis of human breast cancer cell lines HGF that is mainly secreted by mesenchymal cells [53]. The imporupon transplantation into immunodeficient mice by enhancing 35 tance of the CD44v6 and Met multimeric signaling in cancer ROS levels and reducing NF-!B activity [56]. It has also been progression has been strengthened by the observation that adeinvestigated the role of CD44v-xCT in lung metastasis. By pronoma growth in the ApcMin/+ mice model was reduced by inhibiting moting xCT-dependent GSH synthesis, CD44 expression allows the CD44v6 expression through short hairpin RNA/nanoparticles mouse 4T1 breast cancer cells to evade high levels of ROS pro-
kunnen ontsnappen aan de primaire tumorzone moeten ze een maligne migratiefenotype verwerven. (48) Na extravasatie is het belangrijk dat de cellen zich nestelen, prolifereren en angiogenese induceren zodat ze kunnen overleven en groeien in een vreemde en vijandige omgeving. Dit fenomeen wordt niet enkel gestuurd door genetische en/of epigenetische veranderingen in de kankercellen maar ook door niet-neoplastische stromale cellen. Hypoxie is een belangrijke sturende factor in het metastaseproces. (14) Stromale componenten zoals endotheliale en immuuncellen worden steeds meer als cellen noodzakelijk voor de vorming van metastasen gezien. (49) De ‘seed and soil’ hypothese suggereert dat succesvolle groei van metastatische cellen afhankelijk is van de interacties en eigenschappen van kankercellen (seeds) en hun mogelijk doelorgaan (soil). (14) De ‘soil’ vergemakkelijkt het stoppen van de migrerende cellen ter hoogte van een bepaalde doelorgaan en bevordert de adhesie en de extravasatie van de kankercellen. (42) Daarbij is ook de rol van kankerstamcellen als mogelijke cellen van metastatische origine belangrijk. De eerste stap bij het ontwikkelen van metastasen is EMT. Het mechanisme van EMT brengt epitheliale cellen in de bloedbaan en verhindert zo anoikis, de verankering-onafhankelijke celdood. Ook het omgekeerd proces van EMT, namelijk MET die de conversie naar moedercelmorfologie en groei van macrometastasen in het doelorgaan promoot, helpt in de ontwikkeling van metastasen. (14)
3.2 TAF en de pre-metastatische niche Tumoren hebben de neiging om specifiek naar bepaalde organen te migreren. Net zoals bepaalde planten enkel groeien in een bepaald ecosysteem, gebeurt hetzelfde met primaire kankermetastasen. Mechanische krachten zorgen ervoor dat kankercellen afgeleverd worden in specifieke secundaire zones. Maar de succesvolle innesteling en groei tot een klinisch relevante metastase is afhankelijk van een receptieve micro-omgeving. De afgelegen micro-omgeving wordt voorbereid en klaargemaakt voor de komst van kankercellen en vormt zo een basis voor de toekomstige metastatische groei. De vorming van een pre-metastatische niche bestaat uit een specifieke sequentie van gebeurtenissen, die de influx van kankercellen voorafgaat. Het bestaan van een pre-metastatische niche wijst erop dat metastase naar een bepaald orgaan geen toevallige gebeurtenis is maar een vooraf bepaald evenement. (47) Uit recente studies blijkt dat activatie van fibroblasten een noodzakelijk event is in de vorming van een pre-metastatische niche. Systemische signalen, waaronder humorale factoren afkomstig van de primaire tumor zorgen ervoor dat in het doelorgaan een niche voorbereid wordt voor 36
daaropvolgende vasthechting van kankercellen en groei van metastasen. Verschillende stappen spelen een rol in dit proces waaronder verhoogde depositie van fibroblast-afgeleid fibronectin in de gastheeromgeving en secretie van LOX door de tumor. LOX zorgt voor de initiatie van de metastatische niche. TAF is een belangrijke producent van systemisch werkende metastasebevorderende factoren. (4) Activatie van onder andere beenmergcellen geeft aanleiding tot de vorming van een pre-metastatische niche in organen op afstand. De moleculen die hierbij betrokken zijn, zijn leden van VEGF familie, osteopontin en LOX. (1) Het metastasestimulerend effect van LOX in de pre-metastatische niche, is secundair aan de activatie van fibroblasten, aangezien LOX-depositie en enzymatische activiteit geconcentreerd is ter hoogte van zones met fibronectin-deposities. De niche-bevorderende effecten van LOX bestaan uit verweving van type IV collageen. Dit laatste rekruteert eerst myeloide cellen en daarna kankercellen en van het beenmerg-afgeleide cellen. (4) Cancer Metastasis Rev (2013) 32:449–464
459
Fig.Ontwikkeling 2 Timeline of pre-metastatic niche development during niche primary tijdens increasing of DTCs reach in secondary Figuur 6: van de pre-metastatische de numbers progressie van depre-metastatic primairesites tumor. Initiële tumor progression. Initial malignant lesions contain tumor cells underorgans. Upon arrival, some DTCs survive and enter dormancy until a maligne laesies bestaan uit kankercellen die ongecontroleerde proliferatie ondergaan. De primaire tumor wordt going uncontrolled proliferation. The primary tumor becomes hypoxic, suitable microenvironment is established. The DTC-containing prepromotes the and en recruitment of local and metastatic niches then promote further niche cellen, formation waaronder to allow hypoxisch which en ditthen promoot de mobilization mobilisatie rekrutering van lokale van hetcanbeenmerg-afgeleide bone marrow-derived cells including fibroblasts, endothelial cells, tumor spread. The established primary tumor continues to fibroblasten, endotheliale cellen, lymfocyten en immuuncellentertiary om een ondersteunende micro-omgeving te vormen. lymphocytes, and immune cells to create a supportive primary tumor promote pre-metastatic niche formation and release DTCs. Once the Tegelijkertijd bereikenIngemobiliseerde beenmerg voorlopercellen de secundaire en zo vormen microenvironment. parallel, mobilized bone marrow progenitors microenvironment at secondaryorganen sites is suitable, adept DTCs areze re-een also reach secondary organs, predisposing them as future sites of DTC: leaseduitgezaaide from dormancy kankercel(50) and outgrow into metastatic lesions capable of toekomstige zone voor metastasen. metastases (such as the lung in breast cancer). Early DTCs begin to promoting metastasis from metastases arrive at these sites. Tumor cells continue to leave the primary site, and
3.3 TAF en de vorming van metastasen Tumor-derived exosomes also have other functions that
(TLR) signaling pathway has been demonstrated to be critical for tumor exosome-mediated expansion of these CD11b+/Grfurther implicate them as drivers of pre-metastatic niche forTAF spelen cruciale exosomes rol insuppress de thetumor-stroma-interactie. Ze ondersteunen de mation. een Firstly, tumor-derived function 1+ MDSCs and induction(20) of the proinflammatory cytokines of DCs [71, 72], NK cells [73], and T lymphocytes [74, 75] that promote metastasis [77]. Significantly, several studies kankercelinvasie en metastasen. TAFtworondom de tumor zijn niet alleen in staat tot het promoten through various mechanisms. Secondly, recent studies have also demonstrated the potent immunosuppressive funchave demonstrated a role for tumor-derived exosomes in the tions of MDSCs expanded by tumor-derived exosomes, on differentiation and mobilization of MDSCs. Xiang and colboth DCs [78] and T cells [75, 77]. leagues reported that exosomes secreted by breast cancer cells Exosomes are emerging as important mediators of tumor 37 could be taken up by bone marrow cells and promote their progression, with more and more research focused on their + + differentiation into CD11b /Gr-1 MDSCs, capable of modiroles in the primary tumor microenvironment. The ability of exosomes to promote tumor growth at both the primary site fying the tumor microenvironment and promoting tumor and secondary organs through immunosuppression of the growth through the expression of COX2, IL-6, VEGF, and
van groei van de kankercellen. Ze kunnen ook de invasie van kankercellen vermeerderen door cel-cel interacties en verschillende invasie-stimulerend moleculen, waaronder cytokines, chemokines en verschillende inflammatoire mediatoren vrij te stellen. TAF induceren invasieve groei door transiënte heterotypische cel-cel contacten of door paracriene factoren. Opdat kankercellen zouden kunnen invaderen in het circulatiesysteem moet de basale membraan en de ECM doorbroken worden. Daarbij kan de vervormde ECM de expressie van bepaalde genen die essentieel zijn voor de structurele ondersteuning en cytoskeletale organisatie veranderen. (3) Bij het gebruik van co-culturen van fibroblasten en kankercellen werd gedemonstreerd dat de fibroblast een leidende cel is bij invasie. (3,4) Metastatische cellen brengen TAF afkomstig van de primaire tumor naar de metastatische site. In het begin beschermen TAF de metastatische cellen, die in de bloedstroom circuleren, van apoptose. Als ze toekomen in de metastatische site voorzien ze de kankercellen van een vroegtijdig groeivoordeel. (21) Ze stimuleren de tumoren tot het vormen van metastasen in de lymfeknopen, tot het ontwikkelen van een groter tumorvolume en een hogere histopathologische graad. Al deze elementen zijn geassocieerd met een slechtere prognose. (20)
3.4 TAF en de vorming en activatie van micrometastasen Na het uitzaaien in metastatische zones kunnen kankercellen ofwel afsterven, in cellulaire rusttoestand gaan, of rustende of groeiende micrometastasen vormen afhankelijk van de angiogenese en de controle door het immuunsysteem. Er is maar een klein aantal cellen die verder groeien tot micro- en macrometastasen. Tumoren kunnen in het lichaam overleven gedurende jaren onder de vorm van microscopische laesies die zich in een slaaptoestand bevinden. De anti-angiogene factoren gesecreteerd door de primaire tumoren zijn deels verantwoordelijk voor de slaaptoestand van deze metastasen. (42) Zo kunnen sommige metastasen zich pas laat ontwikkelen en een belangrijke oorzaak zijn van kanker-specifiek overlijden. Het ontwikkelen van laattijdige metastasen is het gevolg van het activeren van metastasen, die zich in rusttoestand bevonden. (49) Metastatische kankercellen ontsnappen van de primaire tumor voordat deze volledig verwijderd wordt. Ze migreren naar verafgelegen zones als verspreide kankercellen of ontwikkelen micrometastasen. In beide gevallen slagen ze er niet in om macrometastasen te vormen. Ze kunnen dan jaren na een succesvolle behandeling beginnen groeien, macrometastasen vormen en aanleiding geven tot het overlijden van de patiënt. De activatie van deze cellen kan het gevolg zijn van veranderingen in de omgeving of in de kankercellen zelf. Bij de activatie 38
bevinden deze cellen zich ter hoogte van pre-metastatische niches en beginnen ze te groeien door veranderingen in deze niche. TAF en de ECM die ze vormen zijn de belangrijkste componenten, aangezien ze aanwezig zijn vanaf het begin van de nichevorming. Ze kunnen tussenkomen in het activeren van de rustende kankercellen door productie van oplosbare factoren of ECM-eiwitten, die signaalwegen of proliferatie kunnen activeren. Indirect kunnen ze tussenkomen door angiogenese of immunosuppressie. (49)
4. TAF als predictieve merker 4.1 Algemeen De tumor micro-omgeving draagt bij tot elk aspect van de kankervorming en vormt zo een veelbelovend doelwit voor de kankertherapie. Door de therapie te richten op de kankercellen en de belangrijke componenten van de tumor micro-omgeving, verbetert de klinische uitkomst van de patiënten significant in vergelijking tot het toedienen van chemotherapie, enkel gericht op de kankercellen. (42) Een belangrijk percentage aan patiënten, bij wie de tumor chirurgisch verwijderd wordt en die adjuvante therapie krijgen, hervallen en ontwikkelen metastasen. Dit fenomeen wordt gedreven door resistentie tegen conventionele therapie zoals chemo- en radiotherapie. (14) Het tumorstroma speelt een belangrijke rol bij deze resistentie. (1) AntiTAF therapie kan een effect hebben op drie vlakken; via anti-tumor eigenschappen, antiangiogenese en de mogelijkheid om de opname door tumoren van chemotherapie te verhogen. (20) TAF zijn immers genetisch stabiel in vergelijking tot kankercellen, en verminderen zo het risico op medicatieresistentie ten gevolge van genomische instabiliteit.(19, 21) TAF zijn voornamelijk verantwoordelijk voor de structuur van de ECM die de diffusie van antikanker-medicatie door vaste tumoren verhindert. (21) Verder kunnen ze de epitheliale proliferatie, angiogenese en invasie van tumoren ondersteunen. Tumorstroma kan een effectieve immuunreactie tegen de tumor verhinderen. Therapie gericht tegen TAF kan op twee manieren werken, ofwel is het rechtstreeks gericht tegen deze cellen ofwel richt het zich op de interactie tussen het epitheel en TAF. Inhibitie van de proliferatie van stromale cellen kan verhoogde aflevering van cytotoxische agentia aan de kankercel bevorderen. (19)
4.2 Kenmerken van TAF die respons op medicatie bepalen In de behandeling van kanker is apoptose het mechanisme waarmee cytotoxische stoffen kankercellen doden. (51) De therapie, die men bij tumoren toepast is afhankelijk van verschillende prognostische en predictieve merkers. Deze zijn de lymfeknoopstatus, de grootte 39
van de tumor, de histologische graad en de verschillende receptoren en signaalmoleculen, die ze tot expressie brengen. TAF kunnen de periode tot herval, de kanker-specifieke overleving en de algemene overleving van patiënten in bepaalde tumoren bepalen. Men kan met behulp van deze kenmerken ook de sensitiviteit of weerstand tegenover de therapie bepalen. (52) Zo kan men aan de hand van gen-handtekeningen van TAF de respons op therapie bepalen. (1) Op therapeutisch vlak kunnen TAF op verschillende manieren als doelwit gezien worden. Medicatie kan interfereren met de door TAF gesecreteerde tumor-promotorsignalen en kan interfereren met de rekrutering of expansie van TAF. Leden van de PDGF-familie zijn goed ontwikkelde regulatoren van TAF en pericyten. Het viseren van de stromale PDGFR, verbetert de medicatieopname. Daarbij induceert inhibitie van de stromale PDGFR een anti-tumoreffect in cervix en colorectale tumoren. (7) Het ontdekken van de stuwende kracht van tumorprogressie en de relatie tussen kankercellen en de micro-omgeving zijn fundamenteel in het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën die zorgen voor een betere respons op therapie. (14) En die de micro-omgeving zelf als doelwit voor de therapie gebruiken. (42) Er zijn nu al een aantal middelen gericht tegen de micro-omgeving die gebruikt worden in de behandeling van tumoren. Zo is er anti-angiogene medicatie, die eventueel in combinatie met chemotherapie toegediend wordt. (42) De angiogenese van de tumor kan succesvol geïnhibeerd worden dankzij een gehumaniseerd antilichaam tegen VEGF. (53) Dankzij de inhibitie van de angiogenese, inhibeert het ook de groei van tumoren. Dit middel heeft echter ook een aantal beperkingen, het richt zich vooral op immature bloedvaten in tumoren en deze therapie is maar tijdelijk. Want deze behandeling leidt tot verhoogde activatie van signalisatie met andere angiogenese-bevorderende factoren. En zo herstelt de tumor-neovascularisatie. Gelijktijdige inhibitie van verschillende anti-angiogene factoren kan ten goede komen aan deze patiënten. En zo kunnen verschillende moleculen betrokken in het tumorproces als doelwit dienen. (42) Een dens verweven matrix geeft aanleiding tot toegenomen groei en invasie van de tumor. Daardoor zorgt behandeling met een LOX-inhibitor, voor verminderde tumorgroei in bepaalde borstkankermodellen en kunnen zo de vorming van metastasen inhiberen. LOX-inhibitoren hebben echter geen effect op metastasen, die zich al ontwikkeld hebben.(4) Verschillende elementen van het kankerproces beïnvloed door TAF, kunnen de resistentie voor medicatie moduleren. Stijfheid van de ECM in tumoren rijk aan TAF is geassocieerd met een inefficiënte aflevering van medicatie en resistentie voor de behandeling. Zo kan vermindering 40
van de verzameling aan geactiveerde fibroblasten de opname van medicatie verbeteren. (22) TAF laten namelijk een verhoogde massa aan ECM in het tumorstroma neerslaan. Als resultaat comprimeert de gecondenseerde ECM de bloedvaten rond de tumor en verhindert zo de perfusie van de geneesmiddelen door de bloedvatwand. De adhesie van kankercellen aan de ECM, kan medicatieresistentie mediëren. Een andere manier om resistentie te ontwikkelen, is de secretie van verschillende eiwitten en groeifactoren, die de effecten van de therapeutische interventies teniet doen. (42) Stimuli afkomstig van de micro-omgeving, zoals diegene betrokken bij EMT en hypoxie zorgen indirect voor chemoresistentie door een specifiek fenotype te induceren in de kankercellen. Kankerstamcellen die voor metastasen en progressie zorgen, kunnen in rust gaan. Daardoor kunnen ze ontsnappen aan therapieën met genotoxische middelen, die actieve proliferatieve cellen viseren. (14) TAF kunnen de medicatieresistentie van tumoren promoten. Ze doen dit op allerlei verschillende manieren. Ze kunnen resistentie induceren tegen targettherapie, die gebruik maakt van bijvoorbeeld tyrosinekinase-inhibitoren. Ze kunnen het transport van bepaalde geneesmiddelen door de capillairen beïnvloeden door regulatie van de interstitiële druk in de tumoren via de PDGFR. (1) Verder kunnen ze aanleiding geven tot medicatieresistentie door het kortsluiten van de anti-VEGF behandeling, door activatie van PDGF-C signaalweg en dus resistentie opwekken tegen anti-angiogene therapie. En ze veroorzaken resistentie tegen RAFinhibitoren door secretie van HGF. (18)
4.3 TAF en radioresistentie Radioresistentie van kankercellen is een multifactoriële eigenschap. Een belangrijk element in de reactie op radiotherapie, is de intrinsieke cellulaire radiosensitiviteit, die afhankelijk is van de herstelcapaciteit van radiatie-geïnduceerde DNA laesies. Bijkomende essentiële factoren zijn hypoxie, differentiële genexpressie, groeifactorreceptoren, mutaties in proto-oncogenen en tumorsuppressorgenen, expressie van receptor tyrosinekinase en adhesie van cellen aan de ECM-moleculen gemedieerd door celoppervlakreceptoren, namelijk de integrines. Interacties tussen integrines en de tyrosine kinase receptor zijn mogelijk door specifieke intracellulaire signalisatie en ondersteunende proteïnen, waarvan caveolin er één is. Cav1 wordt gelinkt aan DNA-herstel aangezien het onderdrukken van cav1 resulteert in toegenomen aantal residuele DNA-dubbelstrengige breuken in bestraalde 3D celculturen. (33) Tijdens cytotoxische kankertherapie zoals radiotherapie is er een groot gehalte aan celdood. 41
Cellen sterven af of blijven doorleven afhankelijk van de schade die ze ondervonden hebben. Afstervende en afgestorven cellen worden geabsorbeerd door macrofagen en andere overlevende cellen in de omgeving. Het klein aantal aan overlevende kankercellen kunnen traag prolifereren en de tumor herstellen. Oude studies hebben aangetoond dat tumoren reageren op radiotherapie met een proces dat versnelde repopulatie genoemd wordt. In dit proces kunnen het klein aantal overlevende cellen, die aan de dood ontsnapt zijn na blootstelling aan radio- of chemotherapie, de aangetaste tumor snel herbevolken door proliferatie aan een opvallend hoger tempo. Afstervende kankercellen gebruiken het apoptoseproces om krachtige groei-stimulerende signalen te verwerven die de repopulatie van tumoren die radiotherapie ondergaan, bevorderen. Verschillende moleculaire mechanismen dragen bij tot uitgebreide tumorgroei na radiatie. Zo is de door radiatie geïnduceerde opregulatie van angiogenese geassocieerd met een activatie van stroomopwaarts gelegen transcriptiefactoren zoals HIF-1. Andere studies hebben aangetoond dat macrofagen betrokken zijn in het vergemakkelijken van het herstel van de tumor na radiatie. Afstervende cellen kunnen groei-promotende signalen vrijstellen die de proliferatie van overlevende cellen bevorderen. (51) Caspase-3 (casp3), een cysteïne protease betrokken bij initiatie en uitvoering van geprogrammeerde celdood, is een belangrijke regulator van groei-promotende signalen gegenereerd door afstervende cellen. Casp3 reguleert de expressie van PGE2, wat de groei van overlevende kankercellen kan stimuleren. Casp3-deficiëntie in kankercellen of in tumorstroma gaf aanleiding tot een belangrijke tumorsensitiviteit voor radiotherapie in xenograft muismodellen. Patiënten met tumoren met een hoger gehalte aan geactiveerd casp3 in het tumorweefsel zijn gecorreleerd met een opvallend toegenomen herval en overlijden. Caspases beïnvloeden het apoptoseproces op verschillende wijzen. Zo stimuleren ze de differentiatie en dedifferentiatie en de T-cel activatie. Verder beïnvloedt casp3 de manier waarop het immuunsysteem van de gastheer tegen de kankercellen zal reageren, wat de wijze van overlijden van deze cellen, via necrose of apoptose, zal beïnvloeden. (51) Dit alles kon men besluiten na een experiment waarbij men muisborstkanker 4T1-cellen, die door X-stralen bestraald werden bezaaide met muis borstkanker 4T1-cellen gemerkt met vuurvlieg luciferase. Men monitorde de groei van een klein aantal gemerkte levende cellen via bioluminescentie beeldvorming. Daaruit bleek dat 4T1 met luciferase gemerkte cellen significant sneller groeiden wanneer ze zich in de buurt van afstervende cellen bevonden dan 42
wanneer ze er alleen voor stonden. Opvallend was daarbij de dosis-afhankelijke respons van de voedende cellen. Zo stimuleerden de niet-bestraalde voedende cellen de overblijvende kankercellen niet tot groei, in tegenstelling tot de cellen bestraald met een hoge dosis die een sterk groei-bevorderend signaal gaven aan de overblijvende kankercellen. In vitro geldt deze theorie ook voor afstervende fibroblasten. Bij het inspuiten van de hogergenoemde cellen in een muis, gaf dit hetzelfde resultaat in vivo. Met behulp van muis embryogene fibroblasten en de MCF7-kankercellijn, deficiënt in casp3, werd aangetoond dat dit caspase een belangrijke rol speelt in dit proces. In deze experimenten vertoonden bestraalde tumoren ook een toegenomen 1220
M. Rebucci, C. Michiels / Biochemical Pharmacology 85 (2013) 1219–1226
neovascularisatie en een 2.toegenomen instroom van macrofagen leads die to de angiogenese en Mechanisms common to several drugs (Fig. 1) FOXO sequestration in the cytosol; and ASK1 (apopto
signal-regulating kinase 1) which, when phosphorylated, activa
tumorgroei bevorderen. Deze cellen vertonen geen radioresistentie door 2.1. Activating mutation of oncogenes ordus inactivating mutation of c-Jun N-terminal kinase intrinsieke (JNK) and p38 mitogen-activated prot tumor suppressor genes renders cancer cells resistant to cell death per
kinases, hence inducing apoptosis [11]. mTOR is also a ma
se of autophagy (see below). resistentie maar door een snellere inductie van de celgroei in de tumor.regulator (51) A second signaling pathway that
is often overactivated cancer cells is the Ras/Raf/MAPK pathway. Ras is a small G protein also activated downstream of the growth factor tyros kinase receptor. It then activates the MAP (mitogen activat protein) kinase cascade of which Raf is the first enzyme. ‘‘Gainfunction’’ mutations in the three genes encoding Ras, in BRAF, t gene encoding Raf, and in downstream transcription factors lead unregulated proliferation but also in pro-survival signals. Another example is addiction of cancer cells to NFactivation: constitutive activation of this transcription factor observed in most cancer cells and inhibition of its activ suppresses the growth of these cells [12]. Several mechanis have been described that explain this persistent activation bo from genomic alterations but also as a consequence of t intratumoral inflammation [13]. NF-kB not only regulates t transcription of inflammatory proteins but also enhances t expression of anti-apoptotic proteins amongst which are BCLand several IAPs. In addition to the overall induction of positive growth signa tumor cells also suppress proliferation inhibitors. This is achiev by inactivating mutations in tumor suppressor genes. The (retinoblastoma) gene was the first to be discovered as an an oncogene. RB ‘‘loss-of-function’’ mutations have been detected various human tumors [14]. The protein Rb (pRb) regulates c cycle progression by sequestering the EF2 transcription fac needed for cyclin E and A expression. Disruption of this pathw favors cell cycle entry as well as modulates cancer cell sensitivity different chemotherapeutic molecules: both elevated and dim ished sensitivity has been reported [15,16]. The mechanis underlying these opposite effects are still unclear but may invo checkpoint bypass as well as regulation of chromosomal stabili A second well described tumor suppressor is PTEN (phosph tase and tensin homologue deleted from chromosome 10). PTEN a phosphatase that removes phosphate groups from the hyperph sphorylated phosphatidylinositol molecules generated by PI3 hence reverting the mitotic signal originating from growth fac binding to their receptor. Inactivating methylation of PT promoter and disruptive mutations in PTEN gene result unregulated activation of the PI3K/Akt pathway, hence mentioned here above in potent survival signaling [16,17]. Mo and more reports showed that PTEN plays a role in the response cancer cells to oncoprotein targeting molecules: loss of PTEN lea to both primary and acquired increased resistance [18]. One exception is p53 mutation, that according to the can type, may increase or decrease resistance to drug toxicity. p53, t guardian of the genome, is a transcription factor activated up stresses amongst which is DNA damage, which increases t expression of genes involved in cell cycle arrest (e.g. p21), D repair (e.g. GADD45, PCNA) and, if the damage can not be resolv in the induction of apoptosis (e.g. Bax, PUMA, NOXA, Fas,. . .). T gene TP53 is the most frequent target of genetic alterations, bei mutated in more than half of human tumors [19]. There is eviden that, in addition to favor genomic instability, p53 mutation is a associated with changes in responses to anti-cancer agents sin wild-type p53 induced apoptosis in response to these dru Hence, in general, studies in vitro in numerous cancer cell lines well as in patients demonstrated that cells or tumors harbori mutated p53 are more resistant to drugs compared to wild-ty p53 cells when treated with a wide variety of molecules (fo review, see [16]) and is associated with treatment failure [20]. T kunnencan induceren (55)by the loss of the upregulation of the p be explained
Dysregulated proliferation signaling pathways is the most described cause of cell transformation. Overexpression of growth factors enabling autocrine mitotic signal, mutation of growth factor receptors as well as mutation/overexpression of signal transduction proteins lead to sustained proliferative signaling and aberrant proliferation [8]. Less known is that proliferation circuits and viability circuits are intimately connected: indeed, proliferative signals do also simultaneously provide survival signals. These survival signals not only prevent cancer cell death per se but also promote cell viability when exposed to stresses, such as the ones generated by anticancer drugs. One of the most well described examples is ‘‘gain-of-function’’ gene alterations in the PI3K/Akt/mTOR pathway. Phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) are lipid kinases activated downstream of growth factor receptors. These enzymes generated hyperphosphorylated phosphatidylinositol molecules that serve as anchoring platforms for two kinases, PDK and Akt, leading to Akt and mTOR activation. Both enzymes then phosphorylate different substrates involved in regulating cell cycle entry but also antiapoptotic proteins [9]. Numerous activating mutations into PI3KCA as well as activation of Akt by genetic mutations, genome amplification or by mutations in upstream signaling components have been reported in human tumors [10]. Among Akt antiapoptotic substrates are Bad, a BH3-only Bcl2 family member which is sequestered in the cytosol, hence maintained inactive, upon phosphorylation; caspase 9 whose phosphorylation is inactivating; FOXO1, FOXO3A and FOXO4 that are forkhead transcription factors which unphosphorylated, localize in the nucleus and induce the transcription of a wide array of target genes involved in the cell cycle and apoptosis such as CDN1B (p27Kip1) and CDN1A (p21Cip1), Fas-L (TNFL6) and BIM. Phosphorylation
4.4 TAF en chemotherapie
Zowel intrinsieke als verworven resistentie is het resultaat van verschillende genetische en
epigenetische veranderingen, die optreden in kankercellen. (54) Bij vergelijking van verschillende specimens van patiënten voor en na cytotoxische behandeling was er een significante toename in TAF. Tumoren en dus TAF die behandeld werden met chemotherapie
promoten de zelf-vernieuwing van kanker-initiërende cellen (KIC). Ze promoten ook de in vivo tumorgroei, geassocieerd met een toegenomen secretie van specifieke cytokines en
chemokines, waaronder interleukine-17A (IL-17A). Chemotherapie induceert transformatie van de tumormicro-omgeving, die de cellulaire hiërarchie van de tumor via gesecreteerde factoren
ondersteunt. Men richt chemotherapie liever op niet-KIC omwille van hun autonome resistentie voor chemotherapie. (53)
Figuur 7: Overzicht vanFig. mechanismen die therapieresistentie 1. Overview of drug resistance common mechanisms.
43
Er zijn verschillende mechanismen die therapieresistentie kunnen induceren. (figuur 7) Activerende mutaties van oncogenen of inactiverende mutaties van tumorsuppressorgenen zorgen ervoor dat kankercellen resistent worden voor celdood. Signaalwegen die vaak genieten van een mutatie met bevorderende functie is de PI3K/Akt/mTOR signaalweg of de Ras/Rad/MAPK signaalweg, die dan overgeactiveerd wordt. Mutaties die functieverlies veroorzaken, treden bijvoorbeeld op in tumorsuppressorgenen zoals het retinoblastoomgen en PTEN. Een ander mechanisme dat resistentie kan veroorzaken, is het beïnvloeden van de medicatie-export. Dit leidt vaak tot multitherapieresistentie. Deze resistentie treedt op doordat de toegenomen uitvloei van medicatie de intracellulaire medicatieconcentratie doet dalen en zo de intracellulaire effecten vermindert. Dit wordt gemedieerd door de ATP-binding cassette (ABC) transporterfamilie. Resistentie kan verder geïnduceerd worden door veranderingen in DNA-schade herstelprocessen. De meeste antikanker agentia induceren DNA-schade om kankercellen te doden. Een aantal deficiënties in deze DNA-schade signalisatie kunnen leiden tot chemoresistentie aangezien celcyclusarrest niet optreedt. Een laatste mechanisme dat resistentie kan veroorzaken is verandering in de apoptose-signaalweg. Kankercellen hebben verschillende strategieën ontwikkelt om aan celdood te ontsnappen of dit te beperken. Ze doen dat onder andere door overexpressie van anti-apoptotische eiwitten zoals Bcl-2, Mcl-1, FLIP, IAPs, enzovoort. Ze doen dit ook door inactivatie van apoptose-bevorderende genen zoals bijvoorbeeld mutaties in genen die voor caspases coderen. (54) Fibroblasten zijn relatief resistent voor chemotherapie, onder andere door hun lage proliferatieve index. (38) Resistentie voor chemotherapie kan geassocieerd zijn met het uitgroeien van klonen die over voordelige genetische laesies beschikken en zo aanleiding geven tot recidieven. Maar ook cellulaire diversiteit afgeleid van niet-genetische bronnen draagt bij tot de terugkerende tumorgroei. Chemotherapie stimuleert TAF tot het vormen van een chemoresistente-niche door vrijstelling van cytokines waaronder IL-17A. Na cytotoxische behandeling treedt er een significante toename op van het percentage aan TAF. Dit suggereert dat de behandeling de transformatie van de tumormicro-omgeving kan induceren en dat TAF signalen aan de micro-omgeving kunnen geven die dan de cellulaire hiërarchie beïnvloeden. Chemotherapie gestimuleerde TAF promoten de groei van KIC. De aanwezigheid van TAF zorgt voor een toename van de tumorincidentie en vermindert de latentie van tumorvorming door KIC, waardoor de grootte van de tumor toeneemt. (53) Na onderzoek naar de cytokines die betrokken waren bij deze gevolgen van chemotherapie, kon 44
men 3 mogelijke moleculen naar boven brengen de DTK (TYRO3) receptor, IL-17A en TGF-β. In andere studies kwam de betrokkenheid van HGF ook naar boven. Bij nader onderzoek viel de toename aan stromale expressie van IL-17A na de therapie in vergelijking met voor de therapie, op. TAF antwoorden dus op de chemotherapie door expressie van bepaalde factoren waaronder IL-17A die de cellulaire hiërarchie kunnen beïnvloeden. IL-17A stimuleert KIC, celoverleving en DNA-synthese. Het verdubbelt de migratieratio van KIC waardoor het de tumorinvasie en metastasering kan beïnvloeden. IL-17A zou dus een belangrijk doelwit kunnen vormen in de kankerbehandeling, zelfs in afwezigheid van een functioneel immuunsysteem. Het draagt bij tot de therapeutische resistentie van KIC door regulatie van het fenotype ervan. Het promoot de basale KIC-groei en beschermt deze van chemotherapie-geïnduceerde groeiinhibitie. IL-17A kan verschillende genen activeren en inhiberen in de KIC. Eén van de signaalwegen dat IL-17A in dit proces kan beïnvloeden is NF-κB. Dit suggereert dat de opregulatie van NF-κB voor een mechanisme zorgt dat mogelijks bijdraagt tot het onderhouden van KIC. En dat therapie ontwikkelen tegen NF-κB of zijn doelgenen de effecten van TAF, na cytotoxische behandeling veroorzaakt door IL-17A kan inhiberen. (53) FAP dat specifiek door TAF tot expressie gebracht wordt, is een goed doelwit voor kankertherapie. (20) FAP+-cellen in het stroma kunnen de antitumor-immuunrespons beïnvloeden. (38) Maar TAF vertonen net als kankercellen grote verschillen in medicatiesensitiviteit. Dus FAP-inhibitie kan de tumorcelgroei niet in alle kankertypes stoppen. (20) FAP+ TAF in het reactieve stroma vormen een genetisch meer stabiele target. (38) Dankzij de vooruitgang in de genetica van bepaalde tumoren, zoals colorectale kankers, konden er nieuwe moleculaire doelwitten, die tijdens de ontwikkeling en progressie van tumoren gewijzigd worden, gedefinieerd worden. Deze moleculen vertoonden echter weinig doeltreffendheid bij therapie hierop gericht. Tumor-onderdrukkende signaalwegen vertonen de meeste genetische laesies maar zijn een heel moeilijk pharmacologisch doelwit. Moleculaire targettherapie, zoals de anti-EGFR-moleculen, cetuximab en panitumumab verhogen de activiteit van conventionele chemotherapie maar zijn niet genezend. (53) De laatste jaren is er grote vooruitgang geboekt in de therapie van geavanceerde tumoren die zich richt op belangrijke mutaties dankzij inhibitoren van smalle moleculen. Deze strategie is zeer succesvol in tumoren, die ‘verslaafd’ zijn aan de signalen van één oncogen. Voorbeelden van dergelijke therapie zijn; Bcr-Abl-inhibitoren in chronische myeloïde leukemie, KITinhibitoren in gastro-intestinale stromale tumoren en EML4-ALS en EGFR-inhibitoren in 45
longtumoren. Ook in het kader van melanomen is deze therapie veelbelovend, waarbij BRAFinhibitoren gebruikt werden. Alhoewel de anti-tumorrespons indrukwekkend is bij doelwittherapie, is deze echter van korte duur. (56) TAF zijn betrokken bij de adaptieve mechanismen, die de resistentie voor de therapie vergemakkelijken. Ze produceren kritische overlevingssignalen die de kleine populatie overlevende kankercellen toelaten te ontsnappen aan therapie. De gastheer micro-omgeving voorziet een chemoprotectieve niche die een kleine populatie aan kankercellen de kans geeft om te ontsnappen aan de therapie. Een goed bestudeerd voorbeeld van door de omgeving gemedieerde therapieresistentie is deze veroorzaakt door adhesie van kankercellen aan de ECM. Dit ziet men bijvoorbeeld in melanomen. Deze resistentie kan ook veroorzaakt worden door activatie van overlevingssignaalwegen door cel-celadhesie. Daarom is het van belang dat zowel de gastheer als de tumor aangevallen worden als men genezing van de tumor wil bekomen. (56)
E. Algemeen besluit-discussie Uit dit literatuuronderzoek blijkt duidelijk en alle onderzoekers zijn het erover eens, dat de tumor micro-omgeving een cruciale rol speelt in de tumorvorming, ontwikkeling van metastasen en resistentie tegen medicatie gericht tegen tumoren. Zoals hoger aangegeven beïnvloeden TAF de TNM-classificatie op verschillende wijzen. Op de eerste plaats bepalen ze de graad en invasie van de tumor, door hun invloed op de tumor zelf en de ontwikkeling ervan. Tumoren en hun micro-omgeving werken heel sterk samen bij het ontwikkelen van maligniteiten. Ze hebben TAF nodig voor hun groei door de rol die ze onder andere spelen bij de angiogenese. Ze stellen verschillende groeifactoren en cytokines vrij, die de groei, de inflammatie en de ontwikkeling van metastasen beïnvloeden. Zo geven ze aanleiding tot tumoren met een meer agressief fenotype. Verder spelen TAF een rol in het ontwikkelen van metastasen. Dit doen ze door het vormen van een pre-metastatische niche, door intravasatie en extravasatie te bevorderen door hun invloed op de ECM. De patiënt zal daardoor meer metastasen ontwikkelen wat zijn prognose negatief beïnvloedt. Verder bevorderen TAF de ontwikkeling van tumoren door hun rol in het metabolisme van deze cellen. TAF zijn predictieve merkers. Door hun effect op de bloedvatvorming en de ECM kunnen ze de opname van bepaalde medicijnen reguleren. Wat de patiënt meestal niet ten goede komt. Verder kunnen ze therapie-resistentie induceren door de diffusie van medicatie te verhinderen, 46
door de secretie van bepaalde signaalmoleculen, die het effect van de medicatie teniet doen, door export van de geneesmiddelen te bevorderen, enzovoort. Het stroma stimuleert de vorming van tumor op verschillende manieren en zo vormt het een veelbelovend doelwit voor de therapie. De klinische uitkomst van patiënten verbetert in belangrijke mate bij het toedienen van therapie zowel op het stroma als op de kankercellen gericht. En zo worden tumoren nog beter behandelbaar. Door therapie op TAF te richten, kan de tumorgroei geremd worden door anti-tumor eigenschappen, door anti-angiogenese en mogelijkheid om de opname van chemotherapie te verhogen. Chemotherapie-resistentie kan onder invloed van TAF optreden op verschillende manieren. Verstijving van de ECM, inductie van een specifiek fenotype en secretie van eiwitten die effecten van de therapeutische interventies tenietdoen, zijn verschillende technieken waarmee TAF de respons op therapie kunnen reguleren. Radioresistentie treedt op door inductie van de groei van de overblijvende kankercellen door de afstervende cellen. TAF zijn intrinsiek ook relatief resistent voor therapie omwille van hun lage proliferatieve index. Ze kunnen aanleiding geven tot het uitgroeien van klonen die over voordelige genetische laesies beschikken en zo kunnen ze leiden tot recidieven. Verder zorgen ze voor de vorming van een chemoprotectieve niche. Een van de grote uitdagingen in dit gebied, blijft het definiëren van TAF en de individuele factoren betrokken in de klinisch relevante tumor-stroma interacties. Deze cellen hebben een sterk heterogene oorsprong en functie zodat het heel moeilijk is om exact te weten welke cellen een rol spelen als TAF. Het blijft een vraagteken of alle TAF dezelfde rol hebben en of deze afhankelijk is van het weefsel waarvan ze afgeleid zijn. Negentig procent van de kankergeassocieerde overlijdens, worden veroorzaakt door metastasen. Toch is het mechanisme dat aanleiding geeft tot de vorming van micro- en macrometastase en de evolutie van micrometastase naar macrometastase nog niet volledig opgehelderd. Ook is het nog niet duidelijk of het de hoeveelheid stroma of de complexiteit aan cellen is, die invloed heeft op de prognose, of dat het specifieke celtypes zijn, die de overleving van de patiënt gaan bepalen. Dit verschilt sterk van tumor tot tumor. Door de complexiteit aan signaalmoleculen betrokken in dit proces en de vele cellen die met elkaar communiceren blijft het een uitdaging om te bepalen welke merkers het sterkst geassocieerd zijn met het klinisch gedrag van een tumor. Er zou verder ook meer duidelijkheid moeten komen over het wel of niet optreden van mutaties in het tumorstroma. 47
Men gaat ervan uit dat men door het beschrijven van een gen-handtekening de TAF-populatie veel gemakkelijker zal kunnen definiëren en men dus beter zal kunnen voorspellen wat de prognostische rol van deze cellen is. Deze handtekening zou in de toekomst gebruikt kunnen worden om de respons op therapie te kunnen bepalen. Maar ook dit moet nog wat uitgewerkt worden. Dankzij de experimenten waarbij er onderzoek verricht werd naar de rol van afstervende cellen in het stimuleren van de kankergroei tijdens de therapie, heeft men een vermoeden dat afstervende cellen ook een rol spelen bij de gewone tumorgroei. Zo bevorderen de groeipromotende signalen van afstervende cellen de tumorgroei, zelfs in de afwezigheid van cytotoxische stoffen. Hoe dit exact werkt, moet men nog verder onderzoeken. Cytokines geproduceerd in respons op cytotoxische behandeling kunnen werken als ondersteuning voor de ontwikkeling en het behoud van bepaalde tumoren en vormen een nieuw therapeutisch doelwit. TAF leveren een belangrijke bijdrage in het ontwikkelen van resistentie tegen bepaalde therapieën. Om herval te verminderen zal het van belang zijn een doeltreffende combinatietherapie te ontwikkelen die zich zowel op de tumor zelf als op het stroma richt, zodat er geen resistentie meer optreedt. Maar wat het effect van het inhiberen van verschillende signaalwegen op de tumoren juist is en welke paradoxale reacties er eventueel zouden kunnen optreden, moet verder onderzocht worden. Verder zou men ook nog therapie, dat zich richt op rekrutering en activatie van TAF moeten ontwikkelen zodat de TAF niet meer zouden kunnen leiden tot groei van de tumoren. De kennis over de rol van TAF in het tumorproces wordt dus steeds uitgebreider. Het is bewezen dat deze cellen op verschillende vlakken het tumorproces beïnvloeden. Maar er moet nog wat onderzoek verricht worden naar de verschillende elementen die het meest effect hebben bij dit alles. Zo zal men in de toekomst deze cellen kunnen gebruiken in de therapie en aan de hand van deze cellen kunnen bepalen wat de prognose is van bepaalde tumoren. De recente artikelen tonen aan dat er de laatste jaren heel wat vooruitgang is geboekt in de zoektocht naar de rol van TAF. Verder onderzoek zal echter moeten uitwijzen of deze cellen op termijn zouden kunnen zorgen voor genezing van kanker.
F. Referenties 1. 2.
Bracke M., Lardon F., Vandeberghe P., Vanderkerken K. Kanker biomedisch bekeken. Standaard uitgeverij Professional, Antwerpen, 2013. Pietras K., Östman A. Hallmarks of cancer: interaction with the tumor stroma. EXPERIMENTAL CELL RESEARCH 2010; 316: 1324-1331.
48
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.
24. 25. 26. 27. 28. 29.
Xing F., Saidou J., Watabe K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. FRONT BIOSCI. 2011; 15: 166-179. Strell C., Rundqvist H., Östman A. Fibroblasts – a key host cell type in tumor intiation, progression and metastasis. UPSULA JOURNAL OF MEDICAL SCIENCE 2012; 117: 187-195. Lotti F. et al, Chemotherapy activates cancer-associated fibroblasts to maintain colorectal initiating cells by IL-17A. THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE 2013; 22p. Chang H.Y. et al., Gene expression signature of fibroblast serum response predicts human cancer progression: similarities between tumors and wounds. PLOS BIOLOGY 2004; 2: 0206-0214. Östman A., Augsten M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth – bystanders turning into key players. GENETICS & DEVELOPMENT 2009; 19: 67-73. Koukourakis M.I., Giatromanolaki A. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: a metabolic survival role for tumor-associated stroma. CANCER RES 2006; 66: 632-637. Sceneay J., Smyth M. J., Möller A., The pre-metastatic niche: finding common ground. CANCER METASTASIS REVIEW 2013; 32; 449-464. Figure 2, Timeline of pre-metastatic niche development during primary tumor progression; 459. Rybinski B., Franco-Barraza J., Cukierman E., The wound healing, chronic fibrosis and cancer progression triad. PHYSIOLOGICAL GENOMICS 2014, article in press. B.I. Koh, Kang Y., The pro-metastatic rol of bone marrow-derived cells- a focus on MSCs and regulatory T cells. EMBO REPORTS 2012: 13 (5). Mitsuko F., Yoshikzazu Y., Ichiro A., Angiogenesis: complexity of tumor vasculature and microenvironment. CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN 2009; 15: 1854-1867. Sleeman J.P., The metastatic niche and stromal progression. CANCER METASTASIS REVIEW 2012; 31: 429-440. Catalano V. et al., Tumor and its microenvironment; A synergistic interplay. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2013; 23P: 522-532. Goa F., Liang B., Reddy S. T., Farias-Eisner R., Su X., Role of inflammation-associated microenvironment in tumorigenesis and metastasis. CURRENT CANCER DRUG TARGETS 2014; 14: 30-45. Kalluri R, Zeisberg M., Fibroblasts in cancer. NATURE 2006; 6; 392-401. Shimoda M., Mellody K.T. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. SEMINARS IN CELL & DEVELOPMENT BIOLOGY 2010; 21: 19-25. Madar S., Goldstein I., Rotter V.,’ Cancer- associated fibroblasts’- more than meets the eye. TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE 2013; 19: 447-453. Gonda et al, Molecular biology of cancer-associated fibroblasts: can these cells be targeted in anti-cancer therapy? SEMIN CELL DEV BIOL 2010; 21(1): 2-10. Zhang J., Liu J. Tumor stroma as targets for cancer therapy. PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS 2013; 137: 200-215. Cirri P., Chiarugi P., Cancer-associated fibroblasts and tumour cells: a diabolic liaison driving cancer progression. CANCER METASTASIS REV 2012; 31: 195-208. Harper J, Sainson R. C. A., Regulation of the anti-tumour immune response by cancer associated fibroblasts. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2014. Zhang J., Liu J. Tumor stroma as targets for cancer therapy. PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS 2013; 137: 200-215. Figure 2, Eight possible origins of CAF in the tumor micro-environment; locally resident quiescent fibroblasts via fibroblast to myofibroblast transdifferentiation (FMT), cancer epithelial cells via epithelial to mesenchymal transition (EMT), endothelial cells via endothelial to mesenchymal transition (EndMT), mesenchy- mal stem cells from the bone marrow, pericytes, smooth muscle cells, adipocytes, and inflammatory cells; p. 202. Mc Donald L. T., La Rue A. C., Hematopoietic stem cell derived carcinoma-associated fibroblasts: a novel origin. INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY 2012; 5: 863-873. Szebeni G. J. Et al., Identification of galectin-1 as a critical factor in function of mouse mesenchymal stromal cell-mediated tumor promotion. PLOS ONE 2012; 7(7): e 41372. B.I. Koh, Kang Y., The pro-metastatic rol of bone marrow-derived cells- a focus on MSCs and regulatory T cells. EMBO REPORTS 2012: 13 (5). Berdiel-Acer M. et al, Hepatic carcinoma-associated fibroblasts promote an adaptive response in colorectal cancer cells that inhibit proliferation and apoptosis: nonresistant cells die by nonapoptotic cell death. NEOPLASIA 2011; 10: 931-946. Bochet L. et al., Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. AACR JOURNALS 2013; 73: 5657-5668. Goetz et al., Biomechanical remodeling of the microenvironment by stromal Caveolin-1 favors tumor invasion and metastasis. CELL 2011; 146(1): 148–163.
49
30. Erez N. et al, Cancer-associated fibroblasts are activated in incipient neoplasia to orchestrate tumorpromoting inflammation in an NF-kB-dependent manner. CANCER CELL 2010; 17: 135-147. 31. Chen S-F. et al, The paracrine effect of cancer-associated fibroblast-induced interleukin-33 regulates the invasiveness of head and neck squamous cell carcinoma. JOURNAL OF PATHOLOGY 2013; 231: 180189. 32. Franco O. E., Show A. K., Strand D. W., Hayward S.W., Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. SEMINARS IN CELL & DEVELOPMENTAL BIOLOGY 2010; 21: 33-39. 33. Hehlgans S., Cordes N., Caveolin-1: an essential modulator of cancer radio- and chemoresitance. AMERICAN JOURNAL CANCER RES 2011; 1(4): 521-530. 34. Maquoi E. et al., MT1-MMP protects breast carcinoma cells against type I collagen-induced apoptosis. ONCOGENE 2012; 31: 480-493. 35. Lecomte et al., Bone marrow-derived myofibroblasts are the providers of pro-invasive matrix metalloproteinase 13 in primary tumor. NEOPLASIA 2012; 14: 943-951. 36. Kohan M., Muro A.F., White E. S., Berkman N., EDA-containing cellular fibronectin induces fibroblast differentiation through binding to alpha4beta7 integrin receptor and MAPK/Erk 1/2-dependent signaling. FASEB JOURNAL 2010; 24: 4503-4512. 37. Khan Z.A., Chan B. M., Uniyal S., Barbin Y. P., Farhangkhoee H., Chen S., Chakrabarti S., EDB fibronectin and angiogenesis – a novel mechanistic pathway. ANGIOGENESIS 2005; 8: 183-196. 38. Brennen W.N. et al., Targeting carcinoma-associated fibroblasts within the tumor stroma with a fibroblast activation protein-activated prodrug. J NATL CANCER INST 2012; 104: 1320-1334. 39. Choi S-Y. et al., Podoplanin, α- smooth muscle actin or S100A4 expressing cancer-associated fibroblast are associated with different prognosis in colorectal cancers. JOURNAL OF KOREAN MEDICAL SCIENCE 2013; 28: 1293-1301. 40. Hill R, Song Y, Cardiff RD, Van Dyke T. Selective evolution of stromal mesenchyme with p53 loss in response to epithelial tumorigenesis. CELL 2005; 123: 1001–1011. 41. Harper J, Sainson R. C. A., Regulation of the anti-tumour immune response by cancer associateder fibroblasts. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2014. Figure 1, Cellular origins of cancer associated fibroblasts and the processes by which they affect cancer progression. 42. Goa F., Liang B., Reddy S. T., Farias-Eisner R., Su X., Role of inflammation-associated microenvironment in tumorigenesis and metastasis. CURRENT CANCER DRUG TARGETS 2014; 14: 30-45. 43. Sceneay J., Smyth M. J., Möller A., The pre-metastatic niche: finding common ground. CANCER METASTASIS REVIEW 2013; 32: 449-464. 44. Brauer H. A. et al., Impact of tumor micorenvironment and epithelial phenotypes on metabolism in breast cancer. CLINICAL CANCER RESEARCH 2013; 19: 571-585. 45. Wagner M. et al., Inflamed tumor-associated adipose tissue is a depot for macrophages that stimulate tumor growth and angiogenese. ANGIOGENESIS 2012; 15: 481-495. 46. Harper J, Sainson R. C. A., Regulation of the anti-tumour immune response by cancer associateder fibroblasts. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2014. Figure 2, Regulation of the innate and adaptive immune system by CAFs. 47. Catalano V. et al., Tumor and its microenvironment; A synergistic interplay. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2013; 23P; 522-532. Figure 2, regulatory functions of hypoxia in different steps of metastasis, p525. 48. Peinado H., Lavotshkin S., Lyden D., The screted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thougts. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2011; 21: 139-146. 49. De Wever O., Van Bockstal M., Mareel M., Hendrix A., Bracke M., Carcinoma-associated fibroblasts provide operational flexibility in metastasis. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2014. 50. Sceneay J., Smyth M. J., Möller A., The pre-metastatic niche: finding common ground. CANCER METASTASIS REVIEW 2013; 32; 449-464. Figure 2, Timeline of pre-metastatic niche development during primary tumor progression; 459. 51. Huang Q. et al, Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy. NATURE MEDICINE 2011; 7; 860-867. 52. Paulsson J., Micke P., Prognostic relevance of cancer associated fibroblasts in human cancer. SEMINARS IN CANCER BIOLOGY 2014. 53. Lotti F. et al, Chemotherapy activates cancer-associated fibroblasts to maintain colorectal initiating cells by IL-17A. THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE 2013; 22p. 54. Rebucci M., Michiels C., Molecular aspects of cancer cell resistance to chemotherapie. BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY 2013; 85; 1219-1226. 55. Rebucci M., Michiels C., Molecular aspects of cancer cell resistance to chemotherapie. BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY 2013; figure 1: Overview of drug resistance common mechanisms, p1220. 56. Paraiso K. H. T., Smalley K. S. M., Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY 2013; 85; 1033-1041.
50
