FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2012-2013
De rol van genetische defecten in pediatrische B-cel acute lymfatische leukemie in relatie tot prognose en behandeling
Laura ANRIJS
Promotor: Prof. Dr. F. Speleman Co-promotor: Joni Van der Meulen
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
VOORWOORD Met het schrijven van een masterproef eindigt een periode van 5 jaar studeren. Het waren 5 mooie jaren waarin ik zowel op geneeskundig als op sociaal vlak veel heb bijgeleerd. Na deze zomer loopt onze studie nog verder in 2 jaren stage waar ik vol verwachting naar uitkijk. Graag zou ik enkele mensen willen bedanken voor de steun tijdens de 2 jaren waarin ik aan deze masterproef werkte. Ten eerste mijn begeleidster Joni Van der Meulen voor de begeleiding, het beoordelen en nalezen. Ik kon met al mijn vragen altijd bij haar terecht. Ook mijn promotor Professor Speleman wil ik bedanken voor het verduidelijken van de onderzoeksvraag en voor het beoordelen en nalezen van de masterproef. Ik wil ook mijn ouders bedanken voor de steun en het vertrouwen gedurende mijn studentenjaren en voor het nalezen van mijn masterproef. Verder nog mijn broers voor de technische ondersteuning als ik pc-problemen had en speciale dank gaat naar mijn zus omdat ik altijd op haar kan rekenen voor goede raad maar ook voor ontspanning als het nodig is. Tot slot wil ik mijn vriendinnen bedanken voor de ontspannende momenten en hun onvoorwaardelijke steun.
I
INHOUDSTAFEL VOORWOORD .........................................................................................................................I INHOUDSTAFEL ................................................................................................................... II AFKORTINGENLIJST......................................................................................................... IV 1 ABSTRACT ........................................................................................................................... 1 2 INLEIDING ........................................................................................................................... 3 2.1 HEMATOPOIESE ............................................................................................................. 3 2.1.1 INLEIDING TOT DE HEMATOPOIESE ............................................................................................. 3 2.1.2 B-CEL ONTWIKKELING ................................................................................................................ 5
2.2 KANKER ............................................................................................................................ 8 2.2.1 ALGEMENE KENMERKEN VAN NORMALE CELLEN EN KANKERCELLEN ...................................... 8 2.2.2 GENETISCHE KENMERKEN VAN KANKERCELLEN ....................................................................... 9
2.3 TYPES LEUKEMIE ........................................................................................................ 12 2.3.1 LYMFATISCHE LEUKEMIE ......................................................................................................... 12 2.3.1.1 Acute lymfatische leukemie................................................................................................ 12 2.3.1.2 Chronische lymfatische leukemie ...................................................................................... 15 2.3.2 Myeloïde leukemie ................................................................................................................ 16 2.3.2.1 Acute myeloïde leukemie ................................................................................................... 16 2.3.2.2 Chronische myeloïde leukemie .......................................................................................... 17
3 METHODOLOGIE ............................................................................................................ 18 4 RESULTATEN .................................................................................................................... 19 4.1 PEDIATRISCHE B-CEL ACUTE LYMFATISCHE LEUKEMIE ........................... 19 4.1.1 ALGEMENE PATHOGENESE PEDIATRISCHE B-CEL ALL ............................................................ 19 4.1.2 PROGNOSE EN BEHANDELING IN PEDIATRISCHE B-CEL ACUTE LYMFATISCHE LEUKEMIE ....... 20 4.1.2.1 PROGNOSE ............................................................................................................................. 20 i Minimal residual disease ........................................................................................................................ 21 ii Risico classificatie systemen en detectie .............................................................................................. 21 iii Herval .................................................................................................................................................. 22
4.1.2.2 Behandeling ....................................................................................................................... 23 i Inductietherapie ..................................................................................................................................... 23 ii Consolidatie/intensificatie/reïnducatie therapie .................................................................................... 24 iii Onderhoudsbehandeling ...................................................................................................................... 25 iv Craniale profylactische therapie........................................................................................................... 26
4.1.3 GENETISCHE DEFECTEN IN B-CEL ACUTE LYMFATISCHE LEUKEMIE ........................................ 27 4.1.3.1 Hyperdiploïdie ................................................................................................................... 27 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 27 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 28
4.1.3.2 Hypodiplioïdie ................................................................................................................... 28 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 28
II
ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 29
4.1.3.3 ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) .............................................................................................. 30 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 30 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 31
4.1.3.4 TCF3-PBX1 (E2A-PBX1) .................................................................................................. 31 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 31 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 32
4.1.3.5 BCR-ABL1 ......................................................................................................................... 32 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 32 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 32
4.1.3.6 BCR-ABL1-like .................................................................................................................. 33 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 33 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 34
4.1.3.7 CRLF2 defecten ................................................................................................................. 34 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 34 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 35
4.1.3.8 MLL herschikkingen .......................................................................................................... 35 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 35 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 35
4.1.3.9 Intrachromosomale amplificatie Cx 21 ............................................................................. 36 i Pathogenese ........................................................................................................................................... 36 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 37
4.1.3.10 Dic(9;20) ......................................................................................................................... 37 i Pathogenese en genetische defecten ...................................................................................................... 37 ii Prognose en behandeling ...................................................................................................................... 37
4.1.3.11 ERG deleties .................................................................................................................... 38
5 DISCUSSIE/CONCLUSIE ................................................................................................. 39 6 REFERENTIES ................................................................................................................... 44
III
AFKORTINGENLIJST ABL1 ALL APC BCR BTG1 BTLA CBF CDKN2A CREB CREBBP CRLF2 CZS DNA DOT1L EBF1 EFS EPOR ERG ETS ETV6 FISH FLT3 GC H3K79 HSC HSCT iAMP21 IGHα IKZF1 IL7R JAK1/2 KRAS MHC II MLL MRD NF1 NUP214 NR3C1 NRAS PIK3 P2RY8
c-abl oncogene 1, non-receptor tyrosine kinase Acute lymfatische leukemie Antigen presenterende cel Breakpoint cluster region B-cell translocation gene 1 B- and T-lymphocyte-associated protein CMP binding factor Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A DNA-binding response regulato CREB binding protein Cytokine receptor-like factor 2 Centraal zenuwstelsel Deoxyribonucleic acid DOT1-like, histone H3 methyltransferase Early B cell factor 1 Ziektevrije overleving Erythropoietin receptor ETS family member related gene Transcription factor Ets variant gene 6 (TEL oncogene) Fluorescent in situ hybridisatie FMS-like tyrosine kinase 3 Germinaal centrum Histone H3 methyltransferase (DOT1L) Hematopoietische stamcellen Hematopoietische stamcel transplantatie Intrachromosomale amplificatie chromosoom 21 Immunoglobulin heavy chain alpha IKAROS family zinc finger 1 Interleukin 7 receptor Janus kinase 1/2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene Major Histocompatibility Complex II Myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia Minimal residual disease Neurofibromatosis-related protein NF-1 Nuclear pore complex protein 214 Nuclear receptor subfamily 3 Neuroblastoma RAS viral oncogene Phosphatidylinositol 3-kinase G-protein coupled purinergic receptor P2Y8 IV
PAX5 PBX1 PDGFRβ PCR PTPN11 RAS RB1 RUNX1 SH2B3 STAT TBL1XR1 TCF3 TKI TOX TP53
Paired box 5 Pre-B-cell leukemia homeobox 1 Platelet-derived growth factor receptor, beta polypeptide Polymerase chain reaction Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 Rat sarcoma (groei en proliferatie signalisatie) Retinoblastoma 1 Runt-related transcription factor 1 Lymphocyte-specific adapter protein Signal transducer and activator of transcription Transducin (beta)-like 1 X-linked receptor 1 Transducin (beta)-like 1 X-linked receptor 1 Tyrosinekinase-inhibitoren Thymocyte selection-associated high mobility group box Tumor protein p53
V
1 ABSTRACT Pediatrische B-cel acute lymfatische leukemie (B-ALL) is de meest voorkomende kinderkanker. Leukemie is een kanker van het bloed en de bloedvormende organen. In B-ALL worden de B-lymfocyten specifiek aangetast met als gevolg abnormale proliferatie en klonale expansie van immature B-lymfocyten. Hierdoor wordt de normale hematopoiese verstoord en treedt er beenmerginvasie op. Als gevolg treden klinische symptomen op zoals vermoeidheid, anorexie, nachtzweten, bleekheid, kortademigheid, botpijn, koorts, bloedingen,… Daarnaast kunnen milt- en leververgroting optreden en kunnen er klachten ontstaan betreffende het centraal zenuwstelsel.
Genetische defecten in proto-oncogenen en tumorsupressorgenen liggen aan de basis van kankerpathogenese, waarnaast omgevingsfactoren ook een rol kunnen spelen. Voor het ontstaan van kanker is één enkel genetisch defect zelden voldoende. Eerder kenmerkend is een cellulair proces waarbij verschillende defecten in meerdere genen optreden. Genetische defecten omvatten chromosomale herschikkingen, genspecifieke mutaties en epigenetische deregulatie. Wat de impact is van specifieke genetische defecten op prognose en behandeling bij pediatrische B-ALL vormt de onderzoeksvraag van deze literatuurstudie.
De subtypes gedetecteerd in pediatrische B-ALL zijn: hyperdiploïdie, hypodiploïdie, translocatie t(12;21) (ETV6-RUNX1), translocatie t(1;19) (TCF3-PBX1), translocatie t(9;22) (BCR-ABL), BCR-ABL1-like ALL, CRLF2 alteraties, MLL fusies, intrachromosomale amplificatie van chromosoom 21, dicentrische chromosomen en ERG defecten. De algemene behandelingsstrategie bestaat uit inductie-, consolidatie- en onderhoudsbehandeling. Hyperdiploïde en ETV6-RUNX1 B-ALL hebben een goede prognose en worden behandeld met standaard-risico chemotherapie. Hun 5-jaars ziektevrije overleving (EFS) bedraagt > 80%. Hypodiploïde B-ALL wordt prognostisch ingedeeld in 2 groepen. Hypodiploïde B-ALL met minder dan 44 chromosomen (5-jaars EFS ±40%) heeft een slechte prognose en wordt met hoog-risico behandelingsstrategie behandeld. Hypodiploïde B-ALL met 44-45 chromosomen heeft daarentegen een betere prognose (5-jaars EFS ±70%) en wordt met standaard-risico therapie behandeld. TCF3-PBX1 B-ALL (5-jaars EFS ±79%) behoort tot de standaard-risico B-ALL, maar intensieve intrathecale therapie is nodig om centraal zenuwstelsel (CZS) herval te vermijden. Door de recente ontwikkeling van de tyrosine kinase inhibitoren, zoals imatinib, 1
is de prognose van BCR-ABL1 B-ALL (3-jaars EFS ±80%) drastisch verbeterd alsook de prognose van sommige BCR-ABL1-like ALL (5-jaars EFS ±63%). B-ALL met CRLF2 defecten (6-jaars EFS ±63%) heeft een slechtere prognose en behoort tot een hoog-risico BALL. Deze patiënten kunnen voordeel hebben bij behandeling met JAK- en PI3K inhibitoren wanneer defecten in deze pathways voorkomen. Andere hoog-risico subtypes zijn iAMP21 (5-jaars EFS ±29%), dic(9;20) (5-jaars EFS ±62%) en MLL fusies (5-jaars EFS ±50%). De behandeling
van
deze
subtypes
omvat
een
specifieke
intensieve
hoog-risico
behandelingsstrategie.
Detectie van de genetische defecten is belangrijk om de juiste risicoclassificatie te bepalen en de juiste behandelingsstrategie op te starten. Ook de detectie en screening van specifieke mutaties met verhoogd risico voor herval is belangrijk om de prognose van de patiënten te verbeteren. Voorbeeld hiervan is de CREBBP mutatie bij hyperdiploïde B-ALL. In de toekomst is het noodzakelijk om goede diagnostische tests verder op te zetten, te optimaliseren en te implementeren om de verschillende genetische defecten accuraat te detecteren. Het is ook aangewezen om verder onderzoek naar bijkomende genetische defecten te verrichten bij patiënten met een slechte prognose, zoals iAMP21 en dic(9;20). De prognose van bepaalde B-ALL subtypes is namelijk drastisch verbeterd door de ontwikkeling van specifieke therapieën naargelang het gevonden genetisch defect. Verder onderzoek naar nieuwe therapeutische targets in andere B-ALL subtypes door identificatie van nieuwe genetische defecten is daarom zeker aangewezen.
2
2 INLEIDING Pediatrische B-cel acute lymfatische leukemie is een veel voorkomende kinderkanker (1). Om de pathogenese van de ziekte te begrijpen wordt eerst de normale hematopoiese en B-cel ontwikkeling besproken. Daarna worden de algemene mechanismen van kankerpathogenese en de verschillende types leukemie aangehaald.
2.1 Hematopoiese 2.1.1 Inleiding tot de hematopoiese De hematopoiese vindt bij de geboorte plaats in het actieve rode merg van verschillende beenderen. Gedurende de groei van het kind wordt veel actief rood beenmerg vervangen door geel vet beenmerg. De bloedvorming beperkt zich dan tot het centraal skelet en de proximale einden van de lange beenderen. Wanneer de vraag naar bloedcellen stijgt door infectie, trauma en andere oorzaken van systemische stress, kan het rode beenmerg zich opnieuw uitbreiden (2).
In het beenmerg bevinden zich de hematopoietische stamcellen (HSC) die gekenmerkt worden door hun zelfvernieuwing en hun mogelijkheid om zich in alle bloedcellijnen te kunnen differentiëren. HSC kunnen zich prolifereren waarbij uit 1 stamcel 2 dochtercellen ontstaan met exact dezelfde eigenschappen als de moedercel. Daarnaast kunnen HSC ook differentiëren tot voorlopercellen van de mature bloedcellijnen. Elk uur worden biljoenen bloedcellen geproduceerd in een gezonde volwassene, maar het aantal circulerende cellen wordt constant gehouden door de korte levensduur van de hematopoietische stamcellen. In een normale situatie bevindt zich slechts een fractie van de stamcellen in actieve deling. De meeste stamcellen bevinden zich in een rustfase waardoor vermeden kan worden dat de pool van HSC verloren gaat of beschadigd wordt. Wanneer er systemische stress ontstaat zoals bij een bloeding, infectie, chemotherapie, … zullen er meer stamcellen prolifereren en differentiëren om in het nodige aantal bloedcellen te voorzien (3).
De hematopoiese (FIG 1) omvat de ontwikkeling van de verschillende types bloedcellen uit stamcellen in het beenmerg. Eerst differentiëren de HSC in ‘short-term’ hematopoietische stamcellen (ST-HSC). Deze cellen genereren zowel de lymphoïde als myeloïde 3
voorlopercellen. Lymphoïde voorlopercellen differentïeren verder in T-lymfocyten, Blymfocyten, dendritische cellen en ‘natural killer’ (NK) cellen. In parallel genereren de myeloïde voorlopercellen enerzijds de granulocyt-monocyt voorlopercellen (GMP) die verder ontwikkelen
in
granulocyten,
monocyten
en
dendritische
cellen,
anderzijds
de
megakaryocytaire-erythrocytaire voorlopercellen (MEP) die vervolgens bloedplaatjes en rode bloedcellen vormen. Finaal kunnen de granulocyten verder differentiëren in neutrofiele, eosinofiele en basofiele cellen (3, 4).
FIG 1. De hematopoiese startend van de hematopoïetische stamcel tot de lymfoïde en myeloïde bloedcellen. (GMP, granulocyt-monocyt precursors; LT-HSC, long-term hematopoietische stamcel; ST-HSC, shortterm hematopoïetische stamcel; MEP, megakaryocyte-erythrocyte precursors; NK, natural killer cells) (4)
De lymfocyten staan in voor de adaptieve of verworven immuniteit. Deze hematopoietische cellen omvatten bijna de helft van de circulerende bloedcellen. Er zijn 3 grote types lymfocyten, met name de T-lymfocyten, de B-lymfocyten en de NK cellen. De T-lymfocyten kunnen verder onderverdeeld worden in verschillende types namelijk de CD4+ T-cellen en de CD8+ T-cellen. Rustende CD4+ T-cellen worden geactiveerd als hun T-cel receptor (-TCR) bindt met een antigeen, waarna deze T-cellen de B-lymfocyten activeren voor productie van antilichamen of immunoglobulines. De CD8+ T-cellen vallen lichaamsvreemde cellen aan 4
door toxische stoffen uit te stoten bij herkenning. De NK cellen spelen een rol in de activatie van zowel CD4+ T-cellen en CD8+ T-cellen (5). De B-lymfocyten produceren immunoglobulines die van belang zijn in de immuniteitsafweer, deze cellen worden in punt 2.1.2 uitgebreid besproken.
De aangeboren immuniteit wordt verzorgd door de monocyten, dendritische cellen, granulocyten en NK cellen. Monocyten zijn voorlopers van weefselmacrofagen die respectievelijk instaan voor fagocytose van vreemd materiaal. Monocyten blijven slechts gedurende enkele uren in het bloed, maar kunnen vele jaren lang in weefsels vermenigvuldigen. Dendritische cellen staan in voor het opsporen van pathogenen en activatie van de lymfocyten. Neutrofiele granulocyten hebben als belangrijkste functie het opnemen en vernietigen van bacteriën, fungi en beschadigde cellen. Door chemotaxis, een proces waarbij neutrofielen door chemische stoffen worden aangetrokken, kunnen deze cellen migreren naar de plaats van infectie of inflammatie. Hierdoor wordt bij weefselbeschadiging of bacteriële infectie dan ook een sterke stijging van neutrofielen waargenomen. Eosinofiele granulocyten spelen vooral een rol in allergische reacties en bij de verdediging tegen wormen en protozoa. Basofiele granulocyten bevatten histamines welke vrijgelaten worden in acute hypersensitieve reacties (2). NK cellen zijn cytotoxische lymfocyten die effectief reageren tegen virale infecties en tumorontwikkeling. Daarnaast activeren NK cellen ook T-cellen en zorgen zo voor de interactie tussen aangeboren en verworven immuniteit (6).
Ten laatste spelen de rode bloedcellen en bloedplaatjes een belangrijke rol in de hematopoïese. De rode bloedcellen bevatten hemoglobine, een molecule die toelaat zuurstof doorheen het lichaam te vervoeren. Verder hebben de bloedplaatjes een cruciale functie in de hemostase waarbij verschillende bloedplaatjes samen een hemostatische plug kunnen vormen en zorgen voor bloedstelping en stolling (2).
2.1.2 B-cel ontwikkeling De B-lymfocyten zijn hematopoietische cellen die reageren op pathogenen door de productie van antigeen-specifieke immunoglobulines of antilichamen (7). De B-celontwikkeling start met de vorming van de primaire B-cellen of immature B-cellen uit HSC in het beenmerg of foetale lever, waarna deze cellen zich verder ontwikkelen in de perifere lymfoïde organen (milt, MALT en lymfeklieren) (7). Elke B-cel ontwikkelt een B-cel receptor (BCR) die kan 5
binden met een specifieke antigeen. De BCR bestaat uit een zware en een lichte keten, welke beide opgebouwd zijn uit een constant en een variabel domein. Het variabel domein wordt gevormd door VDJ genherschikkingen, respectievelijk ‘variable’, ‘diversity’ en ‘joining’ genherschikkingen (8). Deze genherschikkingen vinden plaats onder controle van recombinatie-activatie genen, met name RAG1 en RAG2 (7). Het eerste stadium in de B-celontwikkeling is de progenitor B-cel of de pro-B-cel welke ontwikkelt uit HSC (FIG 2). De pro-B-cel brengt CD19 en CD79a tot expressie, welke een deel van de pre-BCR vormen en de genherschikkingen kunnen initiëren (7). In het tweede stadium ontstaat de pre B-cel wanneer de V, D en J gensegmenten van de zware keten gerecombineerd zijn. Vervolgens ontwikkelt zich de immature B-cel wanneer IgM op het oppervlak tot expressie gebracht wordt. In het 4e stadium ontstaat een mature of naïeve B-cel wanneer zowel IgM als IgD geëxpresseerd worden (7). Door de multipele kopieën van elk type gensegment en de verschillende mogelijke recombinaties tussen VDJ gensegmenten, kunnen veel verschillende B-cel receptoren gegenereerd worden die in staat zijn specifieke antigenen te herkennen (8).
FIG 2. Schematische voorstelling van B-cel ontwikkeling. Primaire B-cellen ontwikkelen in de foetale lever en het beenmerg. Secundaire B-cellen ontwikkelen in de secundaire lymfoïde organen (9)
Vervolgens ontwikkelen de secundaire B-cellen via somatische hypermutatie (SMH) in de perifere lymfoïde organen (7). Nadat de mature B-cellen het beenmerg verlaten hebben, gedragen ze zich als een antigeen presenterende cel (APC). De BCR bindt met een specifiek antigeen en neemt het antigeen op via endocytose. Antigenische peptiden worden daarna door de B-cellen gepresenteerd aan CD4+ T-cellen via het major histocompatibiliteits complex II (MHCII) in de secundaire lymfoïde organen. Hierdoor worden B-cellen geactiveerd, profileren ze zich en differentiëren ze verder in germinale center (GC) B-cellen (10). De genen voor het variabel domein van de BCR ondergaan nu in hoge mate puntmutaties bij iedere celdeling van de geactiveerde B-lymfocyt, waardoor de dochtercellen kleine aminozuur 6
verschillen hebben in de variabele domeinen van hun immunoglobuline ketens, welke de diversiteit in de antilichamen vergroot (11, 12). Sommige puntmutaties verwerven een zwakkere affiniteit met het antigeen, andere verwerven een sterkere affiniteit met het antigeen. B-cellen met een lagere affiniteit zullen in apoptose gaan, terwijl de cellen met een hogere antigeen-affiniteit zullen overleven door interactie met T-cellen of folliculair dendritische cellen. De GC B-cellen kunnen verder differentiëren in enerzijds een plasmacel, die in hoge mate specifieke antilichamen produceert, of anderzijds in een geheugen B-cel (11). Plasmacellen blijven voornamelijk circuleren in het beenmerg, de longen en de gastrointestinale tractus. Geheugencellen blijven in de secundaire lymfoïde organen of recirculeren vrij om direct te reageren op secundaire antigeenblootstelling (7). De differentiatiestatus van de B-cel wordt gebruikt in de geneeskunde om het oorspronkelijke B-cel type van de B-cel leukemie te achterhalen.
7
2.2 Kanker 2.2.1 Algemene kenmerken van normale cellen en kankercellen Gedurende de embryonale ontwikkeling en in het volwassen organisme wordt het lot van een cel onder meer bepaald door de signalen die hij krijgt uit de omgeving. Extracellulaire factoren zoals peptide groeifactoren, hormonen, cytokines, extracellulaire matrixproteïnen zorgen dat cellen delen, migreren, invaderen, differentiëren of apoptose ondergaan. Deze processen worden gecontroleerd door intracellulaire signalisatienetwerken (13).
Het grootste deel van de cellen in het volwassen lichaam bevindt zich in de rustende G0 fase van de celcyclus. De start van de proliferatie is zeer nauwgezet geregeld door stimulerende of inhiberende signalen, naburige cel-cel-interacties en interactie met de onderliggende celmatrix. De balans tussen al deze factoren zorgt ervoor dat de intracellulaire signaalcascade proliferatie kan stimuleren of onderdrukken. In tumorcellen is deze balans dermate verstoord (13).
Bij gunstige omstandigheden gaan de cellen prolifereren (FIG 3). Gedurende de G1 fase zijn de cellen metabolisch actief en groeien sterk. De G1 (G=GAP) fase wordt gevolgd door de S (S=synthese) fase, waarbij de DNA replicatie plaatsvindt. Vervolgens gaan de cellen over in de G2 fase, waarin de cellen verder groeien en proteïnen synthetiseren in voorbereiding van de eigenlijke celdeling. Tenslotte komen de cellen in de M (M=mitose) fase, waarbij er 2 dochtercellen gevormd worden uit 1 moedercel. De dochterchromosomen worden verdeeld over beide cellen, gevolgd door cytokinese, de eigenlijke celdeling (14, 15). De mitose of kerndeling neemt slechts 5% in van de celcyclus, de overige tijd bevindt de cel zich in de interfase (G1,S,G2) (16).
8
FIG 3. De celcyclus met de G0 ( rustende fase), de G1, de S ( synthese), G2 en M ( mitose). De rode pijlen duiden de celcycluscheckpoints aan (17)
De cellen hebben gedurende de celcyclus een aantal controlemechanismen en cel-cyclus checkpoints (FIG 3). Deze checkpoints controleren op mogelijke DNA-schade geïnduceerd door interne en externe factoren. De celcyclus checkpoints detecteren deze schade waarna de celcyclus gestopt wordt en DNA-herstelmechanismen worden geactiveerd (18).
Dysregulatie van de celcyclus is een belangrijke eigenschap van kankerpathogenese (14, 15). Kankercellen worden met name gekarakteriseerd door de volgende 6 essentiële veranderingen in de celfysiologie (FIG 4): ongeremde celproliferatie, verlies van gevoeligheid voor differentiatiesignalen, ongelimiteerde celdeling, mogelijkheid om apoptose te vermijden, capaciteit om weefsels en organen te invaderen en versterkte inductie van angiogenese of bloedvatvorming (19).
FIG 4. De 6 kenmerken die een kankercel karakteriseren (20)
2.2.2 Genetische kenmerken van kankercellen Kanker wordt veroorzaakt door genetische defecten in proto-oncogenen en tumorsuppressor genen (21). Deze genetische veranderingen zijn meestal somatische gebeurtenissen. Daarentegen kunnen kiembaandefecten aanleiding geven tot overerfbare of familiale vormen van kanker. Eén enkel genetisch defect is zelden voldoende voor het ontstaan van een maligne 9
tumor. Kanker wordt eerder gekenmerkt als een cellulair proces waarbij verschillende defecten in meerdere genen optreden. Naast veranderingen in genen kunnen ook omgevingsfactoren en levensstijlfactoren mede aan de basis liggen van kanker, zoals het roken van sigaretten, het eten van veel rood vlees, het drinken van veel alcohol, hoge blootstelling aan de zon, omgevingsvervuilende polluenten, infecties, stress, obesitas en weinig fysieke beweging (19) (21) (22).
Een tumorsupressorgen is een gen dat onder meer de celgroei rechtstreeks kan reguleren of beschadigd DNA kan herstellen waardoor het een beschermende functie uitoefent tegen kanker. Wanneer er een defect ontstaat in een tumorsuppressorgen en de functie van het gen vermindert of verloren gaat, kunnen de cellen naar maligne cellen evolueren. De ‘two-hit hypothese’ indiceert dat beide allelen van het tumorsupressorgen moeten aangetast zijn vooraleer een maligne effect zich voordoet. Als slechts één allel van het gen is beschadigd, kan het tweede allel vaak nog een correct eiwit produceren (23).
Een proto-oncogen draagt potentieel bij tot kanker wanneer abnormale hoeveelheden van het eiwit worden aangemaakt. Genetische defecten met betrekking tot een proto-oncogen kunnen ondermeer leiden tot inhibitie van apoptose, stimuleren van de celdeling of bevorderen van de angiogenese naar de tumor (21).
De genetische defecten omvatten chromosomale herschikkingen, genspecifieke mutaties en epigenetische deregulatie. De verschillende types chromosomale herschikkingen zijn: amplificatie, duplicatie, deletie, insertie, inversie en translocatie (FIG 5) (24). De meest frequente genetische veranderingen zijn amplificaties/duplicaties van een proto-oncogen en/of deleties/mutaties van een tumorsupressorgen (25).
10
FIG 5. Schematische voorstelling van chromosomale herschikkingen: deletie, insertie, inversie, tandemduplicatie, insertionele duplicatie en translocatie (26)
Bij een chromosomale duplicatie wordt een extra kopij van een chromosomaal segment geproduceerd. Wanneer de regio’s van de duplicatie naast elkaar liggen, spreekt men van een tandemduplicatie. Bij een insertionele duplicatie liggen de identieke regio’s op verschillende locaties. Bij een amplificatie worden er multipele kopijen van één segment geproduceerd. Amplificaties en duplicaties zorgen voor toename van genetisch materiaal. Bij een chromosomale deletie gaat er een segment van een chromosoom verloren. Het effect van het verlies van genetisch materiaal hangt af van de grootte en de locatie van de deletie. Bij een chromosomale insertie wordt een extra chromosomaal segment ingevoegd. Daarnaast is een chromosomale inversie een genetische verandering waarbij een segment van het chromosoom 180° gedraaid wordt. Een reciproque translocatie is een chromosomale herschikking waarbij fragmenten van 2 niet-homologe chromosomen van plaats wisselen (24).
11
2.3 Types leukemie Leukemie is een kanker van het bloed en de bloedvormende organen, waarbij abnormale en grote hoeveelheden witte bloedcellen (WBC) deze organen progressief infiltreren. Er zijn vier types: acute lymfatische leukemie, chronische lymfatische leukemie, acute myeloïde leukemie en chronische myeloïde leukemie (27). Bij acute leukemie prolifereren grote hoeveelheden abnormale immature WBC. Bij chronische leukemie prolifereren abnormale mature witte bloedcellen. De klachten bij acute leukemie treden veel sneller en opvallender op in vergelijking met chronische leukemie, waar het klachtenpatroon eerder geleidelijk gaat (4).
Bij leukemie ontstaat een tekort aan bloedplaatjes waardoor de bloedstolling niet meer effectief is, resulterend in het voorkomen van blauwe plekken, petechiën en bloedingen. Verder zijn de witte bloedcellen dysfunctioneel waardoor het immuunsysteem niet in staat is infecties effectief af te weren. Leukemiepatiënten hebben daardoor frequenter infecties, welke kunnen gaan van banale diarree tot levensbedreigende pneumonie. Daarnaast is er een tekort aan rode bloedcellen wat kan leiden tot anemie en dyspnoe. Sommige patiënten kunnen daarnaast nog andere symptomen vertonen door opstapeling van onrijpe WBC zoals nausea door een vergrote lever (hepatomegalie) of milt (splenomegalie). Daarnaast zijn lymfadenoptahie, koorts, nachtzweten en botpijn mogelijke symptomen die voorkomen bij leukemie (4).
2.3.1 Lymfatische leukemie Bij de lymfatische leukemie treedt er een verstoring op in respectievelijk de B-cel of T-cel lymfoïde cellijn (4). De lymfatische leukemieën worden onderverdeeld in acute en chronische lymfatische leukemie. 2.3.1.1 Acute lymfatische leukemie Acute lymfatische leukemie (ALL) is een veel voorkomende kinderkanker die in mindere mate ook gedetecteerd wordt bij volwassenen. ALL kan onderverdeeld worden in B-cel acute lymfatische leukemie (B-ALL) en T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL), waarbij respectievelijk de B-cellen of de T-cellen abnormaal gaan prolifereren en klonaal expanderen. Het succes in de behandeling van ALL is enorm gestegen de voorbije jaren. Algemeen is de 5-jaars ziektevrije overleving (EFS) van ALL ±65%. Voor kinderen met ALL is de 5-jaars 12
ziektevrije overleving gemiddeld ±80%, het cijfer varieert wel naargelang de leeftijd van het kind (FIG 6) (1). De 5-jaars ziektevrije overleving bedraagt voor volwassenen slechts ±40%. De overleving is zeer sterk verbonden met de respons op therapie (FIG 7) (28). De prognose voor kinderen is duidelijk beter wat onder meer te verklaren valt door het beter verdragen van sterkere chemotherapie (29-31). De piekincidentie voor kinderen met pediatrische ALL is de leeftijd van 2-5 jaar (32). Het ‘lifetime’ risico op ALL is 0,13% (31).
FIG 6. Overlevingspercentage bij pediatrische ALL volgens leeftijd (1)
FIG 7. Overlevingspercentage bij volwassen ALL patiënten met goede respons op therapie vergeleken met patiënten met slechte respons op therapie (28)
13
De klinische symptomen van ALL zijn afhankelijk van de graad van beenmerginvasie. Typische symptomen daaraan gelinkt zijn vermoeidheid, anorexie, nachtzweten, bleekheid, kortademigheid, botpijn, koorts, bloedingen. Invasie van extra medullaire organen geeft lymfadenopathie, hepatomegalie of splenomegalie. Minder frequent invaderen lymfoblasten ook het centraal zenuwstelsel. Dat laatste geeft aanleiding tot de volgende klachten: hoofdpijn, braken, lethargie en craniale zenuwstoornissen. Lymfoblasten kunnen daarnaast ook testis, tonsillen, adenoïden, borsten en gastro-intestinale tractus invaderen. Jonge kinderen presenteren zich vaak met arthralgie en botpijn door de infiltratie van de lymfoblasten in het bot en gewrichten en door de expansie van het beenmerg (4).
De behandeling van ALL is complex. Ten eerste wordt inductietherapie ingesteld om de normale hematopoïetische functie te herstellen. Deze therapie bestaat uit glucocorticoïden, vincristine en asparaginase. Vervolgens is consolidatietherapie (of intensificatietherapie) een noodzakelijke therapie voor alle ALL patiënten met als doel resterende leukemiecellen te vernietigen. De meest gebruikte strategie is asparaginase, vincristine, dexamethasone met of zonder anthracycline, mercaptopurine en methotrexaat. Daarna wordt onderhoudstherapie ingesteld gedurende 24 tot 36 maanden om herval na remissie te vermijden. Deze therapie bestaat uit methotrexaat en 6-mercaptopurine. Tot slot is ook centraal zenuwstelsel profylaxie nodig om doorheen de bloed-hersen-barrière te behandelen. Voor hoog-risico patiënten biedt allogene beenmergtransplantatie een extra overlevingsvoordeel (30, 33).
Chromosomale translocaties komen zeer frequent voor in ALL en omvatten vaak genen die coderen voor transcriptiefactoren (TF) welke een kritische rol spelen in de controle van de hematopoiese. Chromosomale translocaties kunnen via 2 verschillende mechanismen transcriptiefactoren gaan activeren (FIG 8). Bij het eerste mechanisme wordt de transcriptiefactor geactiveerd doordat de TF onder controle komt te staan van een enhancer element van een sterk geëxpresseerd gen. In ALL worden transcriptiefactoren getransloceerd aan de enhancer elementen van de immunoglobuline of TCR genen, welke respectievelijk sterk geëxpresseerd zijn in de B- of T-cellen (FIG 8A). Bij het tweede mechanisme wordt de transcriptiefactor gefusioneerd met een ander gen of transcriptiefactor, waarbij een chimere transcriptiefactor met veranderde functie gevormd wordt (FIG 8B) (34).
14
FIG 8 Twee mogelijke mechanismen van chromosomale translocatie met betrekking tot transcriptiefactoren (34)
In een volgende hoofdstuk (hoofdstuk 4) wordt verder ingegaan op pediatrische B-cel acute lymfatische leukemie. 2.3.1.2 Chronische lymfatische leukemie Chronische lymfatische leukemie (CLL) kent een grote heterogeniteit in de overleving van de patiënt. Sommige patiënten overleven jaren met CLL zonder therapie, terwijl bij anderen de ziekte een agressiever verloop kent. In de beginstadia is het moeilijk het ziekteverloop te voorspellen (35). De gemiddelde leeftijd van een patiënt gediagnosticeerd met CLL is 72 jaar. Onder de 20 jaar komt de ziekte nagenoeg nooit voor. De ziekte wordt gediagnosticeerd bij 20.9% van de CLL patiënten tussen 55 en 64 jaar; bij 26.5% tussen de 65 en 74 jaar en bij 27.8% tussen de 75 en 84 jaar. Chronische lymfatische leukemie is de meest voorkomende leukemie, het ‘lifetime’ risico bedraagt 0,49% (31).
De behandeling van chronische lymfatische leukemie is sterk geëvolueerd doorheen de jaren. De huidige strategie voor jonge CLL patiënten is de combinatie van chemotherapie met monoclonale antilichamen. Ondanks grote vooruitgang met deze behandelingsstrategie, blijft CLL een zeer moeilijk te behandelen ziekte met zeer variabele verloop. Allogene beenmergtransplantatie is de enige curatieve optie en moet, indien mogelijk, altijd overwogen worden (36).
15
2.3.2 Myeloïde leukemie Bij de myeloïde leukemie is de myeloïde cellijn aangetast, waardoor de normale vorming van RBC, plaatjes en monocyten, granulocyten en dendritische cellen wordt verstoord. 2.3.2.1 Acute myeloïde leukemie Acute myeloïde leukemie (AML) omvat 90% van de acute leukemieën. De incidentie van AML stijgt met de leeftijd en de ziekte is vrij zeldzaam bij kinderen (37). Bij AML gebeurt er geen uitrijping van de witte bloedcellen, waardoor er op korte tijd een groot tekort is aan gedifferentieerde functionele bloedcellen. AML wordt gekenmerkt door de proliferatie en accumulatie van onrijpe hematopoïetische cellen in het beenmerg en bloed. Deze maligne cellen belemmeren de groei en maturatie van normale erythroïde, myeloïde en megakaryocytaire voorlopercellen. AML is een complexe ziekte, waarbij meer dan 100 genetische defecten geobserveerd zijn (4).
De behandeling van AML wordt bepaald naargelang de leeftijd en de klinische conditie van de patiënt. De standaardbehandeling is de combinatie van het chemotherapeuticum daunorubicin (een anthracycline) gedurende 3 dagen met cytarabine gedurende 7 dagen. Hoe jonger de patiënt, hoe beter de overlevingskansen. De klinische remissie bij patiënten onder de 60 jaar bedraagt ±70%, maar de 5-jaars algemene overleving bedraagt slechts ±47%. Als er een geschikte donor beschikbaar is, kan allogene beenmergtransplantatie een alternatieve behandeling bieden bij hoog-risico groepen. Een recente ontwikkeling zijn alternatieve nucleoside analogen zoals cladribine, fludarabine en clofarabine. Hun effect op klinische remissie wordt nog onderzocht (38, 39).
Een gen betrokken in AML pathogenese welke als moleculair target kan dienen is het FLT3 gen. Een interne tandemduplicatie van het FLT3 gen wordt gedetecteerd bij 20-30% van de volwassenen met AML. FLT3 is een receptor tyrosine kinase met een cruciale rol in de hematopoïese. De aanwezigheid van een FLT3 defect is een belangrijke prognostische factor met een slechtere prognose (4, 40, 41). Als behandeling zijn specifieke FLT3-inhibitoren ontwikkeld, welke een nieuwe gerichte moleculaire therapie bieden (42).
16
2.3.2.2 Chronische myeloïde leukemie Chronische myeloïde leukemie (CML) omvat 15% van alle leukemieën en treedt vooral op bij ouderen (43). CML wordt gekarakteriseerd door een toename in immature en mature myeloïde cellen welke accumuleren in het beenmerg en het bloed (44). De diagnose van CML wordt dikwijls bij toeval gedetecteerd gedurende een routine controle of bij onderzoek naar een andere ziekte (4). CML verloopt in 3 klinische fasen: de chronische fase, de accelererende fase en de blastencrisis. De chronische fase duurt enkele jaren. De accelererende fase duurt 46 maanden met toename van de ziekteactiviteit en een hogere proliferatie van abnormale myeloïde cellen. De blastencrisis duurt enkele maanden met een zeer snelle expansie van blast-cellen (45).
Karakteristiek voor CML is de chromosomale translocatie waarbij het Philadelphia chromosoom wordt gevormd. Deze translocatie treedt op tussen de lange armen van chromosoom 9 en 22 t(9;22)(q34;q11.2), en resulteert in het BCR-ABL1 fusiegen. Het chimere BCR-ABL1 eiwit heeft een gedereguleerde tyrosine kinase activiteit (44). Hiertegen werkt de specifieke BCR-ABL1 tyrosinekinase-inhibitor (TKI) ‘imatinib’ (Gleevec®, Novartis) (FIG 9) (46). Behandeling met imatinib is de standaardtherapie bij aanwezigheid van de BCR-ABL fusie. Bij intolerantie voor imatinib wordt interferon α + cytarabine gegeven. Bijwerkingen van imatinib zijn o.a. oedeem (60%), nausea (50%), spierkrampen (49%), diarree (45%), ... De algemene overlevingskans na 5 jaar follow-up met imatinib is 89% (47). Imatinib wordt in de chronische fase van CML gebruikt waardoor de overgang naar de blastcrisis gedurende verscheidene jaren kan worden uitgesteld (45).
FIG 9 Het monoclonale antilichaam imatinib bezet de ATP bindingsplaats. Hierdoor wordt de fosforylatie van het substraat en de ‘downstream’ signaaltransductie cascade verhinderd (46)
17
3 METHODOLOGIE Voor het bekomen van relevante informatie voor het schrijven van deze masterproef, werden artikels opgezocht in de wetenschappelijke elektronische databank Pubmed. Via de begeleider werden om te starten enkele goede reviews bekomen en van daaruit werd de kapstok voor de masterproef opgesteld.
Voor meer algemene info over de onderzoeksvraag werden volgende zoektermen gebruikt: ‘pediatric’-‘B-cell’-‘acute lymphoblastic leukemia’. Om de onderzoeksvraag verder uit te werken werden de zoektermen: ‘prognosis’-‘treatment’ gebruikt in combinatie met één van de volgende
zoektermen:
‘hyperdiploidy’-‘hypodiploidy’-‘ETV6-RUNX1’-‘TCF3-PBX1’-
‘BCR-ABL1’-‘BCR-ABL1 like ALL’-‘CRLF2’-‘MLL’-‘iAMP21’. Ook zoeken via volgende auteurs leverde relevante informatie op: ‘Downing’-‘Mullighan’-‘Pui’.
Voor de inleiding werd geen limiet gezet op de publicatiedatum van de wetenschappelijke artikels. Voor de resultaten werden altijd de meest recente artikels weerhouden en het merendeel heeft een publicatiedatum van recenter dan 2006. Voor de masterproef werden enkel Engelse artikels weerhouden en de scriptie werd geschreven in het Nederlands. De literatuurstudie werd beëindigd eind maart 2013. Voor het opstellen van de bibliografie werd het referentieprogramma Endnote gebruikt.
18
4 RESULTATEN 4.1 Pediatrische B-cel acute lymfatische leukemie 4.1.1 Algemene pathogenese pediatrische B-cel ALL B-ALL is de meest voorkomende pediatrische maligniteit. Door herval na therapie blijft het een belangrijke doodsoorzaak bij jonge mensen (48). De gemiddelde 5-jaars ziektevrije overleving van de pediatrische B-ALL is afhankelijk van de studie 80-85% (30). De belangrijkste genetische defecten gedetecteerd in pediatrische B-ALL zijn: hyperdiploïdie, hypodiploïdie, translocatie t(12;21) (ETV6-RUNX1), translocatie t(1;19) (TCF3-PBX1), translocatie t(9;22) (BCR-ABL), BCR-ABL1-like ALL, CRLF2 alteraties, MLL fusies, intrachromosomale amplificatie van chromosoom 21, dicentrische chromosomen en ERG defecten (TABEL 1 en FIG 10) (29, 49, 50). Het in kaart brengen van het volledige repertoire van genetische laesies is belangrijk daar deze genetische defecten van prognostisch belang zijn en de uitkomst van de behandeling kunnen beïnvloeden. Daarnaast zijn alteraties betrekkende tot PAX5, IKZF1, JAK1/2, CRLF2, CREBBP en TP53 de meest frequente in pediatrische B-ALL. Bijvoorbeeld deleties, translocaties en mutaties van PAX5 worden terug gevonden in 30% van de B-ALL patiëntenstalen. Daarnaast worden alteraties van CREBBP en TP53 vaak gedetecteerd bij herval na remissie (30, 48).
FIG 10. Genetische subtypes en hun frequentie in pediatrische ALL (50)
19
TABEL 1. Genetische subtypes en hun frequentie van pediatrische B-ALL. Adapted from: Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia (50)
Subtype
Frequency (%)
Hyperdiploidy (> 50 chromosomes) Hypodiploidy (< 40 chromosomes)
20-30 1-2
t(12;21)(p13;q22) ETV6-RUNX1 t(1;19)(q23p13) TCF3-PBX1
15-25 2-6
t(9;22)(q34;q11.2) BCR-ABL1
2-4
PAX5 rearrangement
2
ABL1, PDGFRB, JAK2 rearrangements
2-5
t(4;11)(q24;q32)MLL-AF4
1-2
CRLF2 rearrangement (IGHα-CRLF2, PAR1 deletion, and P2RY8-CRLF2
5-7
ERG deletion
7
Comment Excellent prognosis with antimetabolire-based therapy Poor prognosis, high frequency of RAS pathway and IKAROS gene family mutations Expression of myeloid antigens; excellent outcome Increased incidence in African Americans: Generally excellent prognosis: association with CNS relapse Historically dismal outcome, improved with addition of imatinib to intensive chemotherapy Multiple partners, commonly from dic(7;9), dic/t(9;12) and dic(9;20); outcome unknown Identified in BCR-ABL1-like ALL; multiple rearrangements encoding chimeric proteins, fusing 5’ partners with 3’ kinase domains; associated with IKZF1 alteration and very high leukocyte count; potentially amenable tot tyrosinekinase-inhibitor therapy Common in infant ALL (especially <6 months of age): poor prognosis Extremely common in DS ALL (55%): association with IKZF1deletion/mutation and JAK1/2 mutation; poor-prognosis in non-DS ALL Subtype of B-ALL with a distinct gene expression profile: favorable outcome
Met standaard chromosomale moleculaire genetische analyses worden in 75-80% van de patiënten met pediatrische B-ALL genetische abnormaliteiten geïdentificeerd. Met totale genoomanalyse wordt in virtueel elk B-ALL patiëntenstaal genetische abnormaliteiten geïdentificeerd (30).
4.1.2 Prognose en behandeling in pediatrische B-cel acute lymfatische leukemie 4.1.2.1 Prognose De prognose wordt bepaald op basis van verschillende factoren waaronder minimal residual disease, leeftijd, aantal witte bloedcellen en genetische defecten. Via risicoclassificatiesystemen wordt bepaald of het om een hoog-risico B-ALL met ongunstige prognose of een standaard-risico B-ALL met gunstige prognose gaat.
20
i Minimal residual disease Minimal residual disease (MRD) staat voor het klein aantal overgebleven leukemiecellen na behandeling. MRD wordt meestal gemeten door middel van polymerase ketting reactie (PCR). De aan- of afwezigheid van residuele maligne cellen is significant gecorreleerd met het risico op herval. Patiënten met een hoog-risico op herval hebben een MRD van ≥ 10-2 blasten op 2*10-5 beenmergcellen direct na de therapie of hebben een MRD van ≥ 10 -3 blasten op 2*10-5 beenmergcellen op een later tijdstip. De aan- of afwezigheid van MRD is de sterkste onafhankelijke prognostische factor voor ALL (51). Bijvoorbeeld IKZF1 deleties zijn dikwijls geassocieerd met een hoge MRD waarde na behandeling. Deze defecten zijn significant geassocieerd met een ongunstige prognose en verhoogd risico op herval (49). ii Risico classificatie systemen en detectie Precieze risicoclassificatie op kans van herval is essentieel om te zorgen dat patiënten met hoog-risico een intensieve behandeling krijgen en patiënten met standaard-risico niet over behandeld worden met toxische agentia (30). Huidige risicoclassificatie is gebaseerd op klinische variabelen zoals leeftijd en WBC aantal, immunofenotype (pro B-cel, pre B-cel,…), detectie van cytogenetische en moleculaire veranderingen en vroege respons op therapie op basis van MRD (49). Genotypes bij pediatrische B-ALL met een gunstige prognose zijn hyperdiploïdie (> 55 chromosomen) en ETV6-RUNX1. Genotypes met een ongunstige prognose zijn hypodiploïdie (< 44 chromosomen), intrachromosomale amplificatie van chromosoom 21, BCR-ABL1 en MLL herschikkingen (30, 52). CRLF2 defecten hebben een hoog-risico op herval onafhankelijk van leeftijd, WBC aantal bij diagnose, MRD en cytogenetica (53).
Identificatie van de verschillende genetische subtypes gebeurt door gedetailleerde cytogenetische analyse waaronder karyotypering en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Karyotypering is het onderzoek van de chromosomen. Dit is zeer tijdrovend en neemt doorgaans 2 weken tijd in beslag. Chromosomen kunnen best bekeken worden tijdens de metafase van de celdeling. Levende cellen zijn dus een absolute vereiste voor het onderzoek en worden bekomen door bloed op natrium heparine af te nemen. De witte bloedcellen hieruit worden tot deling aangezet, waarna colchicine de celdeling stopt na een 3-tal dagen in het metafasestadium. Door middel van een hypotone oplossing zal de celkern vervolgens opzwellen en openbarsten waardoor de chromosomen mooi verspreid gaan liggen. Daarna 21
worden de chromosomen aangekleurd met één van de verschillende beschikbare technieken. Een voordeel van de karyotypering is dat het volledige genoom in één onderzoek kan gescreend worden op afwijkingen, een nadeel is dat de resolutie slechts 5 Mb bedraagt. Daarnaast moeten meerdere karyotypen nagekeken worden en moeten de chromosomen van een 20-tal cellen geteld worden om een volledige analyse van de chromosomen te bekomen (54).
Een tweede techniek die vaak wordt toegepast in de diagnostiek is FISH. Deze techniek geeft informatie over zowel delende als niet-delende cellen. Het te onderzoeken cellulaire DNA wordt eerst enkelstrengig gemaakt door het te verhitten. Wanneer specifieke probes bij het cellulair DNA worden gevoegd kunnen de complementaire bindingen gevormd worden. De FISH probes zijn gecloneerde DNA-fragmenten voorzien van een fluorescente merkstof. Na het wegwassen van het overtollig DNA kan de aan- of afwezigheid van specifieke DNAsequenties gedetecteerd worden. Recente ontwikkelingen hebben ervoor gezorgd dat alle 24 chromosomen met een specifieke kleur kunnen worden aangetoond (54, 55). iii Herval Herval komt in 20-25% van de pediatrische B-ALL patiënten voor. De overlevingskansen na herval zijn slechts ±30% (56, 57) Genetische analyses van pediatrische B-ALL patiëntenstalen tonen aan dat er verschillen zijn in de genomische alteraties bij diagnose en herval. Secundaire karyotypische en genetische alteraties worden frequent verworven bij herval. De meeste diagnose-herval B-ALL stalen hebben wel eenzelfde klonale oorsprong. In 8% van de gevallen is het genoom bij herval hetzelfde als bij initiële diagnose. Daarnaast hebben 34% van de patiënten met herval een cel met genetische alteraties geëvolueerd vanuit de leukemiecel. Verder ontstaat bij herval bij 51% van de gevallen een cel met genetische alteraties geëvolueerd vanuit een preleukemische cel. Tenslotte is er bij 7% van de patiënten met herval sprake van een nieuwe secundaire leukemie ontstaan uit normale voorloper cellen (FIG 11). Bij 20% van de pediatrische B-ALL patiënten die hervallen komt een mutatie voor in het CREBBP gen. Deze mutatie draagt bij tot resistentie tegen de glucocorticoïd therapie. Verder komen TP53 mutaties vaak frequenter voor bij herval dan bij diagnose van pediatrische B-ALL stalen (50).
22
FIG 11. Verschillende mogelijke evoluties van voorloper B-cellen bij diagnose of relaps (50)
4.1.2.2 Behandeling i Inductietherapie Het doel van remissie-inductie therapie is meer dan 99% van de leukemiecellen elimineren en de normale hematopoiese herstellen. Remissie-inductie therapie bestaat uit glucocorticoïden (prednisolone of dexamethason), vincristine en asparaginase. Deze therapie is niet myelosupressief waardoor niet het complete beenmerg onderdrukt wordt. Verder heeft deze therapie sterk antileukemische effecten en werken de drugs synergistisch. Juiste behandeling naargelang risicostratificatie is essentieel. Hoog-risico patiënten hebben intensieve therapie nodig, terwijl standaard-risico patiënten moeten gespaard worden van onnodige toxiciteit. Bij kinderen met hoog-risico B-ALL wordt een intensieve en snelle inductietherapie gegeven. Die therapie bestaat uit 4 of meer geneesmiddelen en zorgt voor verbeterde prognose en lagere kans op geneesmiddelresistentie. Bij standaard-risico patiënten moet de remissie-inductie therapie eerder gematigd zijn op voorwaarde dat er adequate postinductietherapie gegeven wordt. Gematigde remissie-inductietherapie wordt ingesteld om morbiditeit en mortaliteit door bijwerkingen te verminderen. Bij deze therapie wordt MRD geëvalueerd na 2 weken remissie-inductietherapie, waarop de intensiteit van de verdere behandeling bepaald wordt. Voor genezing is het niet noodzakelijk dat er na inductietherapie complete hematologische of immunologische remissie is. Momenteel kan men reeds bij 98% kinderen een complete remissie bereiken na de inductietherapie (30, 58).
23
Asparaginase is een hoeksteen van de behandeling van pediatrische B-ALL en wordt gebruikt bij zowel remissie-inductie als intensificatietherapie bij alle patiënten. Asparaginase is een hydrolase enzym die de vorming van asparagine inhibeert (FIG 12). Asparagine is een aminozuur dat noodzakelijk is voor de functiecellen. Leukemiecellen zijn zelf niet in staat tot synthese van asparagine en halen deze uit de bloedbaan. Door hoge asparaginase spiegels in de bloedbaan te handhaven, is de asparagine spiegel laag en zullen de neoplastische leukemiecellen in apoptose gaan. De andere humane cellen staan zelf in voor de synthese van asparagine en ondergaan dus geen apoptose (59). Intensieve therapie met asparaginase heeft de
klinische
uitkomst
significant
verbeterd.
Asparaginase
is
een
cytotoxisch
chemotherapeuticum (60). De 2 voornaamste bijwerkingen van asparaginase zijn pancreatitis en trombose. Deze komen frequenter voor bij kinderen van 10 jaar of ouder en zorgen voor een grotere morbiditeit (30).
Glucocorticoïden zijn immunosuppressief en onderdrukken o.a. de B-cellen. Glucocorticoïden maken ook een belangrijk deel uit van de behandeling van pediatrische B-ALL. Het uitstellen van glucocorticoïd gebruik tot na inductie geeft inferieure resultaten. 6mg/m2/d dexamethason geeft een significant betere therapierespons dan 40mg/m2/d prednisolone. Dexamethason geeft ook een significant betere 6-jaars ziektevrije-overleving (85%) in vergelijking met prednisolone (77%) en CZS herval is significant gedaald met dexamethason (3.7%) t.o.v. prednisolone (7.1%). Dexamethason wordt ook succesvol in post-inductie behandelingsstrategieën gebruikt. Bijwerkingen van glucocorticoïden zijn o.a. verhoogde kans op infecties, skeletale manifestaties zoals avascualaire necrose, osteoporose, osteopenie en verhoogde kans op breuken. Ook proximale spierzwakte en neuropathieën zijn bijwerkingen van glucorticoïdentherapie. Neuropathieën kunnen ook optreden bij het gebruik van vincristine, een andere belangrijk onderdeel van de behandelingsstrategie. Vincristine is een vinca alkaloïd die dimere microtubulines bindt waardoor de mitose in de metafase wordt stilgelegd (FIG 12). Vincristine inhibeert dus actief delende cellen zoals maligne leukemiecellen (61). ii Consolidatie/intensificatie/reïnducatie therapie Wanneer de normale hematopoiese hersteld is na de inductietherapie, volgt de intensificatietherapie. Intensificatietherapie is essentieel voor alle B-ALL patiënten en heeft als doel leukemiecellen te vernietigen die niet direct opspoorbaar zijn. Mogelijke strategieën van de behandeling zijn: hoge dosis methotrexaat met mercaptopurine, hoge dosis 24
asparaginase of reïnductie therapie. Bij hoog-risico pediatrische B-ALL patïenten kan het aanbevolen zijn een combinatie van de verschillende behandelingsstrategieën toe te passen (58).
Intensificatie van de behandeling met methotrexaat verbetert duidelijk de prognose van patiënten met intermediair of hoog-risico. Bij standaard-risico moet het nut van intensificatie van de methotrexaat behandeling nog verder onderzocht worden. Methotrexaat is een antifolaat metaboliet en inhibeert het enzym dihydrofolaat reductase (DHFR) waardoor een tekort aan foliumzuur ontstaat. Op die manier wordt de DNA synthese verhinderd. Cytarabine interfereert ook met de DNA-synthese (FIG 12). Dit is een geneesmiddel met goede therapierespons bij MLL pediatrische B-ALL (62). Methotrexaat wordt toegediend via infuus aan B-ALL patiënten. De duur van het infuus is een belangrijke determinant voor de intracellulaire concentratie van actieve methotrexaat. Lage graad van accumulatie van methotrexaat in leukemiecellen is significant gecorreleerd met een hoger risico op herval in vergelijking met intermediair of hoge graad van accumulatie in leukemiecellen. Afhankelijk van het genetisch subtype kan een verschillende duur van methotrexaat behandeling aangeraden zijn (63). iii Onderhoudsbehandeling Onderhoudsbehandeling is essentieel bij patiënten met B-ALL ter voorkoming van herval en wordt gedurende 24 maanden toegediend. De meest gebruikte behandelingsstrategie is een combinatie van een lage dosis methotrexaat in wekelijkse dosis en mercaptopurine in dagelijkse dosis. Overdreven gebruik van mercaptopurine wordt niet aangeraden daar het risico op neutropenie toeneemt, waarna de behandeling gestopt moet worden (30, 58).
Mercaptopurine is een essentieel onderdeel bij consolidatie- en onderhoudstherapie. Mercaptopurine is een thiopurine met immunosuppresief effect door stilleggen van de purine nucleotide synthese (FIG 12). Therapierespons hangt af van het intracellulair metabolisme van dit geneesmiddel. Metabolieten van mercaptopurine zijn thioguanine nucleotiden (TGN) en metabolieten gemethyleerd door thiopurine S-methyltransferase enzyme (TPMT). De TPMT activiteit verschilt interindividueel en beïnvloedt de balans tussen effectiviteit en toxiciteit. Hoge spiegels TGN geven risico op myelosuppressie met neutropenie, terwijl hoge spiegels gemethyleerde metabolieten risico op hepatotoxiciteit geven (64). 25
FIG 12. Chemotherapeutica grijpen aan op verschillende punten van de DNA en eiwitsynthese (62)
iv Craniale profylactische therapie Craniale radiotherapie werd toegepast om de verspreiding van maligne cellen in het centraal zenuwstelsel te verhinderen. Craniale bestraling kan echter verschillende laattijdige complicaties
geven
zoals
secundaire
kankers,
neurocognitieve
achteruitgang
en
endocrinopathieën. Bij een dosis van 12 Gy is het cumulatieve risico op secundaire neoplasieën na 15 jaar 1,7%. Door deze negatieve secundaire effecten is het gebruik van deze behandelingsstrategie sterk verminderd (30).
In plaats van craniale radiatie wordt momenteel vaak een systemische en intrathecale therapie gegeven. Bij intrathecale therapie wordt de chemo doorheen de dura mater in de spinale ruimte geïnjecteerd. Het gebruik van craniale bestraling zorgt voor een licht verbeterde 5-jaars ziektevrije overleving t.o.v. triple intrathecale therapie (85,6% versus 81%), maar deze winst 26
wordt door de complicaties op lange termijn teniet gedaan De intrathecale therapie kan bestaan uit single intrathecale therapie met toediening van methotrexaat of de triple intrathecale therapie met toediening van methotrexaat, cytarabine en hydrocortisone (30).
4.1.3 Genetische defecten in B-cel acute lymfatische leukemie 4.1.3.1 Hyperdiploïdie i Pathogenese en genetische defecten Hyperdiploïde pediatrische B-ALL omvat de grootste subgroep en betreft 20-30% van de casussen. Verder wordt deze subgroep onderverdeeld in de hyperdiploïde B-ALL (47-50 chromosomen) en de hoog hyperdiploïde B-ALL (51-67 chromosomen). Karyotypisch is er een overvloed aan chromosomen aanwezig. Het meest frequent zijn trisomieën en tetrasomieën van chromosoom X, 4, 6, 8, 10, 14, 17, 18 en 21. Door het teveel aan chromosomen is er een opregulatie van de genexpressie van de genen gelegen op de extra chromosomen. Het hyperdiploïde karyotype is vaak reeds aanwezig bij de geboorte van het kind, maar er is een latentieperiode van een aantal jaren tot dat de leukemie tot ontwikkeling komt (65). De maldistributie van chromosomen wordt meest frequent veroorzaakt tijdens een enkele abnormale non-disjunctie deling. Hierbij is er een onjuiste verdeling van de chromosomen tijdens (mitose of) meiose gedurende de ontwikkeling in utero. Andere oorzaken van hyperdiploïde B-ALL zijn zeldzamer (66). Hyperdiploïde B-ALL is in 1/3 van de gevallen geassocieerd met mutaties in FLT3 (tyrosine kinase receptor), NRAS-KRAS (behoren tot de RAS-eiwitten) en PTPN11 (proteïne tyrosine phosphatase). Deze genen produceren allemaal eiwitten die instaan voor de celsignalisatie en kunnen zo celgroei en differentiatie induceren. Studies toonden aan dat hyperdiploïde B-ALL niet specifiek geassocieerd is met deze mutaties en gelijkaardige mutaties ook in andere subgroepen van BALL voorkomen. Ook microdeleties van CDKN2A (cycline-afhankelijke kinase inhibitor), ETV6 (ETS familie transcriptiefactor), IKZF1 (transcriptiefactor), PAX5 (PAX familie transcriptiefactor), RB1 (tumorsuppressor die celgroei inhibeert) en TCF3 (transcriptiefactor) komen frequent voor bij hyperdiploïde B-ALL (65, 67).
27
ii Prognose en behandeling Hyperdiploïde B-ALL heeft een gunstige prognose met een 5-jaars ziektevrije overleving van 80-85%, afhankelijk van de studie. Leukemische blastcellen met een hyperdiploïd karyotype hebben een sterke gevoeligheid voor chemotherapie, met name voor asparaginase en voor anti-metabolieten zoals 6-mercaptopurine en methotrexaat (68-70). Deze hyperdiploïde cellen hebben namelijk een grotere neiging om spontaan in apoptose te gaan bij in vitro cultivering. Daarnaast kunnen deze blasten na behandeling een abnormaal hoge intracellulaire hoeveelheid methotrexaat vasthouden. Dit is te verklaren doordat een gen, coderend voor een transporter, die opname van methotrexaat in de cel bewerkstelligt, sterker tot expressie komt in deze cellen. Dit gen ligt op chromosoom 21 en meer dan 79% van de hyperdiploïde B-ALL gevallen hebben een trisomie of tetrasomie van chromosoom 21 (29).
Vijftien tot twintig procent van de hyperdiploïde B-ALL patiënten hervalt en heeft een ongunstige uitkomst. Bij hyperdiploïde B-ALL is het monitoren van MRD niet voldoende om het risico op herval te bepalen. De meeste patiënten met herval van hyperdiploïde B-ALL worden namelijk niet onder de categorie van hoog-risico MRD geclassificeerd (66).
Bij hyperdiploïde B-ALL met herval worden in >60% van de gevallen mutaties en deleties in CREBBP gevonden. Deze defecten zijn een negatieve prognostische factor voor herval en dragen bij tot therapieresistentie. CREBBP speelt een cruciale rol bij celgroei en ontwikkeling. Bij hyperdiploïde B-ALL is het screenen op CREBBP-mutaties een relevante parameter voor vroege detectie van potentieel herval (66). 4.1.3.2 Hypodiplioïdie i Pathogenese en genetische defecten Hypodiploïde B-ALL wordt gekarakteriseerd door het voorkomen van minder dan 46 chromosomen in de blastcellen en komt voor in 5-6% van de pediatrische B-ALL. Hypodiploïde B-ALL wordt naargelang het chromosomenaantal onderverdeeld in verschillende types: het ‘bijna diploïde’ type met 44-45 chromosomen, het ‘hoog hypodiploïde’ type met 40-43 chromosomen, het ‘laag hypodiploïde’ type met 32-39 chromosomen en het ‘bijna haploïde’ type met 24-31 chromosomen (71). Het hypodiploïde karyotype kan reduplicatie ondergaan waardoor er een hyperdiploïd karyotype ontstaat. Dit is 28
gekend als gemaskeerde hypodiploïde B-ALL (72). Het ‘bijna diploïde’ type B-ALL komt in 5% van alle gevallen van de pediatrische B-ALL voor, de hypodiploïde B-ALL met minder dan 44 chromosomen komt slechts in 1% van de gevallen voor (73). Bij het ‘bijna-diploïde’ type ontstaan er vaak fusiechromosomen met 2 centromeren en chromosomale herschikkingen zoals ETV6-RUNX1. Voor het ‘laag hypodiploïde’ type zijn genetische veranderingen in TP53, RB1, CDKN2A/2B en IKZF2 kenmerkend. TP53 en IKZF2 genalteraties komen respectievelijk voor in 91.2% en 50% van de patiënten met laag hypodiploïde pediatrische B-ALL. Dit in tegenstelling tot patiënten met andere subtypes hypodiploïde B-ALL waar deze alteraties zelden voorkomen. Bij het ‘bijna haploïde’ type ontstaan in meer dan 2/3 van de patiënten alteraties die resulteren in activatie van receptor tyrosine kinases en RAS signalisatiewegen. Deze alteraties omvatten deleties, amplificaties of mutaties van NF1, NRAS, KRAS, MAPK1, FLT3 en PTPN11. Daarnaast worden bij diagnose IKZF3 defecten en alteraties van CREBBP frequent teruggevonden in het ‘bijna haploïde’ type B-ALL (72). ii Prognose en behandeling Prognostisch worden patiënten met hypodiploïde B-ALL in 2 subgroepen onderverdeeld, namelijk de groep van cases met 44 of 45 chromosomen en de groep met minder dan 44 chromosomen. Hypodiploïde B-ALL met minder dan 44 chromosomen heeft een extreem slechte uitkomst. De 5-jaars ziektevrije overleving bedraagt slechts ±40%. Bij hypodiploïde B-ALL met 44 of 45 chromosomen bedraagt de 5-jaars ziektevrije overleving ±70 % (FIG 13). Hypodiploïde B-ALL met minder dan 44 chromosomen wordt volgens intensieve hoog-risico behandelingsstrategie behandeld. Hypodiploïde B-ALL met ≥ 44 chromosomen heeft een standaard-risico en er is geen nood aan extra intensieve therapie. Bij pediatrische hypodiploïde B-ALL met mutaties in genen betrokken in RAS en PI3K signalisatiewegen kunnen PI3K inhibitoren een mogelijke nieuwe therapie vormen (72-74).
29
FIG 13 Overlevingscurves van patiënten met hypodiploïde B-ALL met meer of minder dan 44 chromosomen (74)
4.1.3.3 ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) i Pathogenese en genetische defecten Het t(12;21) subtype waarbij een ETV6-RUNX1 fusiegen wordt gevormd is samen met hyperdiploïde B-ALL de meest voorkomende vorm van pediatrische B-ALL en komt in 25% van de gevallen voor (75). Het fusiegen ontstaat door translocatie van ETV6 gen op chromosoom 12p13 met het RUNX1 gen op chromosoom 21q22 (76). Deze translocatie wordt opgespoord door middel van FISH. ETV6 is één van de ETS transcriptiefactoren, RUNX1 is een transcriptiefactor en is een component van core binding factor (CBF) complex. Zowel ETV6 als RUNX1 zijn noodzakelijk gedurende de normale hematopoiese (50). Het fusiegen ontstaat vaak reeds in utero en is detecteerbaar bij de geboorte. Pediatrische B-ALL zal pas jaren later na secundaire genetische alteraties tot ontwikkeling komen. In cellen met de translocatie bindt de chimere transcriptiefactor ETV6-RUNX1 op doelwitgenen van RUNX1 en verstoort de normale genexpressie van deze doelwitgenen. Dit leidt onder meer tot een verhoogde expressie van anti-apoptotische genen en de erythropoietine receptor en ook activatie van JAK-STAT signalisatie (75).
30
In ETV6-RUNX1 B-ALL komen genetische alteraties veel frequenter voor ten opzichte van andere pediatrische B-ALL subtypes. Deze alteraties omvatten onder meer deleties van transcriptiefactoren zoals PAX5 en EBF1, deleties van lymphoïde signaalmolecules zoals BTLA en TOX, alteraties van transcriptionele co-activators zoals TBL1XR1, alteraties van de glucocorticoïd receptor NR3C1 en van het apotose regulator gen BTG1 (50). ii Prognose en behandeling Het subtype ETV6-RUNX1 heeft een gunstige prognose en een 5-jaars ziektevrije overleving van ±83%. Deze gunstige prognose is voornamelijk te wijten aan de gevoeligheid van ETV6RUNX1 voor asparaginase (68, 70). In 10% van de ETV6-RUNX1 B-ALL gevallen ontstaat er een duplicatie van het verworven chromosoom met de translocatie t(12;21). Dit is geassocieerd met een verhoogd risico op vroeg herval doordat dit een verhoogde resistentie teweegbrengt tegen prednisolone. Resistentie voor prednisolone is een onafhankelijke negatieve prognostische factor (68, 76). 4.1.3.4 TCF3-PBX1 (E2A-PBX1) i Pathogenese en genetische defecten Het subtype TCF3-PBX1 komt voor in 3-5% van de pediatrische B-ALL patiënten. De translocatie t(1;19)(q23;p13) fusioneert het TCF3 gen op chromosoom 19 met het PBX1 gen op chromosoom 1 (70). Het chimere eiwit geproduceerd door het TCF3-PBX1 fusiegen blokkeert de normale hematopoietische maturatie. Zowel de verhoogde expressie van PBX1 en het blokkeren van de TCF3 transcriptiefactor spelen een rol in de leukemogenese. Dit genotype is gecorreleerd met een initieel hoog aantal WBC, voorkomen in het niet-kaukasisch ras en centraal zenuwstelsel (CZS) infiltratie. De gemiddelde leeftijd op het moment van diagnose van TCF3-PBX1 B-ALL is 7 jaar. In tegenstelling tot andere pediatrische B-ALL types ontstaat de translocatie t(1;19) niet in utero (70, 77). In 2/3e van de gevallen zijn er additionele alteraties. Eén van de meest frequente (42%) secundaire veranderingen is een deletie van chromosoom 9p, waarop het CDKN2A en PAX5 gen gelegen zijn. Beide genen staan in voor normale hematopoiese. Een andere veel voorkomende secundaire genetische alteratie is de vorming van isochromosoom 9q, hierbij is er een heterozygote deletie van 9p en een duplicatie van het andere 9q chromatide. Andere genetische veranderingen zijn deleties van chromosoom 6q en chromosoom 13q, waarop het RB1 gen gelegen is (70). 31
ii Prognose en behandeling De prognose van TCF3-PBX1 B-ALL is sterk gestegen met verbetering van de therapie. De 5jaars ziektevrije overleving bedraagt ±79 % (70). De incidentie van herval voor TCF3-PBX1 B-ALL is ongeveer 20%, welke niet hoger ligt dan het herval in andere types B-ALL. Verhoogd risico op herval met infiltratie in het centraal zenuwstelsel (CZS) is wel geassocieerd met het TCF3-PBX1 subtype B-ALL. Bij diagnose is de aanwezigheid van de translocatie t(1;19) een onafhankelijke risicofactor voor CZS-herval. Bij aanwezigheid van blastcellen in de cerebrospinale vloeistof bij initiële diagnose van TCF3-PBX1 B-ALL, ontwikkelt ongeveer 25% van de patiënten CZS-herval. Daarentegen ontwikkelt 5% van de patiënten CZS-herval, wanneer er geen blasten in het cerebrospinale vocht gedetecteerd worden bij initiële diagnose. Het is dus zeer belangrijk om TCF3-PBX1 type B-ALL goed te identificeren om zo intensievere intrathecale therapie te kunnen instellen en de prognose nog verder te verbeteren van deze subgroep (50, 70, 77). 4.1.3.5 BCR-ABL1 i Pathogenese en genetische defecten BCR-ABL1 pediatrische B-ALL behoort tot de hoog-risico B-ALL groep en komt voor bij 6% van de pediatrische B-ALL patiënten. Zoals reeds vroeger in de thesis aangehaald, is deze fusie zeer frequent aanwezig in CML (zie 2.3.2.2). In BCR-ABL1 positieve (Ph+) B-ALL ontstaat er een t(9;22)(q34;q11) translocatie en komen vaak (84%) deleties van het IKZF1 gen voor. IKZF1 deleties komen daarentegen niet voor in CML. IKZF1 codeert voor een IKAROS transcriptiefactor welke noodzakelijk is voor de ontwikkeling van alle lymfoïde cellijnen. IZKF1 defecten zijn geassocieerd met slechte prognose zowel in Ph+ als Ph- B-ALL (48, 49, 78). ii Prognose en behandeling Voor de ontdekking van tyrosinekinase-inhibitoren behoorde Ph+ B-ALL tot één van de subtypes van pediatrische B-ALL met een zeer slechte prognose. De 5-jaars ziektevrije overleving na chemotherapie bedroeg toen ±34,2%. De 5-jaars ziektevrije overleving na hematopoïetische stamceltransplantatie (HSCT) was ±43,5%. Zelfs bij patiënten met gunstige
32
prognostische factoren zoals jongere leeftijd, snelle therapieresponsen en laag aantal WBC bij diagnose bleef de prognose slecht (79).
De huidige therapie bestaande uit tyrosinekinase-inhibitoren (TKIs) zoals imatinib, nilotinib of dasatinib heeft de prognose van Ph+ B-ALL drastisch verbeterd. Combinatie van imatinib met intensieve chemotherapie zorgde voor een 3-jaars ziektevrije overleving van ±80%, dit is meer dan een verdubbeling ten opzichte van de therapie zonder imatinib (50, 78, 80). Een nadelig effect van de behandeling met imatinib is het ontstaan van resistentie tegen de therapie. Deze resistentie is typisch te wijten aan verworven mutaties in het ABL1 gen en dit in de regio coderende voor het kinase domein. Hierdoor kan imatinib niet meer binden en wordt de BCR-ABL1 tyrosine kinase activiteit niet meer geïnhibeerd (79). Een mogelijk oplossing voor deze resistentie is het inzetten van 2e generatie TKI zoals dasatinib en nilotinib. Beide inhibitoren hebben een sterkere werking in het onderdrukken van de BCR-ABL1 kinase activiteit. Bij imatinib resistentie zijn dasatinib en nilotinib wel nog therapeutisch actief. Enkel bij de aanwezigheid van een T315I mutatie in BCR-ABL1, treedt ook resistentie op tegen deze 2e generatie TKIs. Een bijkomend voordeel van dasatinib is de goede penetratie door de bloedhersenbarrière. Bij Ph+ B-ALL met cerebrospinaal vochtinfiltratie is dit een belangrijke therapeutisch voordeel. Dasatinib geeft als bijwerking pleurale vochtuitstortingen (79, 80). De meest belangrijke genetische prognostische factor voor Ph+ ALL is de aanwezigheid van IKZF1 deleties. Multivariate analyse toonde aan dat er een significant hoger risico op herval is bij aanwezigheid van IKZF1 deleties (69,1%) versus geen IKZF1 deleties (40,4%). IKZF1 deleties zijn ook significant gecorreleerd met een verhoogde resistentie tegen chemotherapie (78). 4.1.3.6 BCR-ABL1-like i Pathogenese en genetische defecten Ph- B-ALL met IKZF1 alteraties hebben een genexpressieprofiel gelijkaardig aan Ph+ B-ALL en werd recent benoemd als Ph-like B-ALL. Deze subgroep bevat 10% van de pediatrische BALL patiënten en komt meer frequent voor dan Ph+ B-ALL. Kenmerkend voor Ph-like ALL zijn de herschikkingen en mutaties in genen coderend voor tyrosine kinases en cytokine 33
receptors (48). Naast IKZF1 alteraties bevat 50% van de Ph-like B-ALL een CRLF2 herschikking en in 50% van deze gevallen komt eveneens een mutatie in 1 van de JAK genen voor (30, 52). Nieuwe fusies en mutaties zoals NUP214-ABL1 en mutaties in EPOR, PDGFRβ, EBF1, FLT3, IL7R en SH2B3 werden gedetecteerd via genoomwijde sequencing analyse. Deze verschillende alteraties leiden tot activatie van RAS en JAK/STAT pathways met transformatie van leukemiecellen tot gevolg (52). ii Prognose en behandeling De 5-jaars ziektevrije overleving van Ph-like B-ALL en Ph- B-ALL patiënten is respectievelijk ±63% en ±86%. Ph-like B-ALL behoort dus tot de hoog-risico B-ALL patiëntengroep. Aanwezigheid van IKZF1 alteraties leidt tot significant hogere risico stratificatie (48). Tyrosine kinase inhibitors in combinatie met chemotherapie hebben tot een drastische verbetering in de prognose van sommige patiënten met Ph-like B-ALL geleid. De ABL1 inhibitor, dasatinib, heeft een therapeutische efficaciteit bij de NUP214-ABL1 fusie. Daarnaast hebben patiënten met PDGFRβ alteraties een complete hematologische en moleculaire respons op imatinib. De JAK2 inhibitor, rexulotinib, heeft therapeutische efficaciteit bij B-ALL patiënten met JAK2 mutaties, SH2B3 deleties en IL7R mutaties/deleties. Tenslotte hebben JAK of PI3K inhibitors een therapeutische doeltreffendheid bij CRLF2 genherschikkingen (52). 4.1.3.7 CRLF2 defecten i Pathogenese en genetische defecten Verhoogde CRLF2 expressie wordt in 5-7% van de standaard-risico en in 14% van de hoogrisico pediatrische B-ALL stalen waargenomen. Daarnaast zijn 50% van de Down-syndroom patiënten met pediatische B-ALL gekenmerkt met CRLF2 overexpressie. De meest frequente oorzaak van CRLF2 overexpressie zijn chromosoomherschikkingen leidend tot vorming van het IGHα-CRLF2 fusiegen en/of de vorming van het P2RY8-CRLF2 fusiegen. Daarnaast komen minder frequent ook CRLF2 mutaties voor in het deel coderende voor het transmembranair domein (50). CRLF2 defecten zijn significant gecorreleerd met JAK mutaties en IKZF1 deleties/mutaties. De Spaanse/Latino etniciteit is ook significant gecorreleerd met CRLF2 herschikkingen (50, 53)
34
ii Prognose en behandeling Patiënten met een hoge CRLF2 expressie hebben een slechtere prognose na therapie in vergelijking met patiënten met een lagere CRLF2 expressie. De ziektevrije overleving na 6 jaar bedraagt respectievelijk ±61% en ±83%. De prognose is het slechtst bij P2RY8-CRLF2, de 6-jaars ziektevrije -overleving bedraagt ±30% met een extreem hoge 6-jaars kans op herval van ±71%. CRLF2 defecten zijn een prognostische risicofactor voor herval. Patiënten waarbij CRLF2 defecten gedetecteerd worden, moeten behandeld worden met hoog-risico behandelingsstrategieën. De voorkeur voor intensieve chemotherapie of hematopoietische stamceltransplantatie moet nog onderzocht worden in klinische trials (81). De mutaties en herschikkingen die gecorreleerd zijn met CRLF2 defecten vormen nieuwe belangrijke therapeutische doelwitten. JAK of PI3K inhibitors hebben therapeutische doeltreffendheid bij pediatrische B-ALL patiënten met CRLF2 alteraties (52, 53, 82) 4.1.3.8 MLL herschikkingen i Pathogenese en genetische defecten MLL herschikkingen komen voor in 6% van de pediatrische B-ALL patiënten en in 80% van de zuigelingen (< 1 jaar) met B-ALL (83). Verschillende MLL herschikkingen worden waargenomen: t(4;11) MLL-AF4 in 50%, t(9;11) MLL-AF9 in 10% en t(11;19) MLL-ENL in 20% van de gevallen (50, 84, 85). Door fusie van MLL met AF4, AF9 en ENL verliest MLL zijn specifieke histonmethyltransferase activiteit. Met name, MLL wild-type is in staat lysine 4 van histone 3 (H3K4) te methyleren waardoor transcriptionele activatie van zijn doelwitgenen kan plaatsvinden. Daarentegen verzorgen de MLL fusies een alternatieve histon methyl transferase activiteit. De MLL herschikkingen zorgen namelijk voor abnormaal sterke activatie van HOXA9, welke op zijn beurt overexpressie van DOT1L induceert. DOT1L is in staat lysine 79 van histon 3 (H3K79) te methyleren, waardoor andere doelwitgenen sterk tot expressie gebracht worden (83). Verder worden bij MLL getransloceerde B-ALL patiënten frequent (17%) FLT3 mutaties weergevonden (86). ii Prognose en behandeling De MLL subgroep heeft karakteristiek een extreem ongunstige prognose. Met recente therapieën wordt een 5-jaars ziektevrije overleving bekomen van ±50%, oudere studies gaven 35
een 5-jaars ziektevrije overleving van 1 op 3. In deze groep worden zeer hoge remissieinductiecijfers bekomen, maar het veel voorkomen van herval is de hoofdreden van de slechte prognosecijfers (85, 87-89). De prognosecijfers variëren naargelang het MLL fusietype en leeftijd. Vb. bij het MLL-AF9 type bedraagt de 5-jaars ziektevrije overleving ±38% bij kinderen jonger dan 1 jaar en ±50% bij kinderen tussen de 1-9 jaar. Bij het MLL-ENL type is er een 5-jaars ziektevrije overleving van ±26% bij kinderen jonger dan 1 jaar, ±67% bij kinderen tussen de 1 en 9 jaar en ±60% bij kinderen van 10 jaar of ouder (84).
De slechte prognose van de MLL subgroep is te wijten aan de verhoogde resistentie voor glucocorticoïden en asparaginase. De MLL subgroep vertoont wel een hogere gevoeligheid voor cytarabine, waardoor hoge dosissen methotrexaat en cytarabine aanbevolen zijn (68, 88, 89). Zuigelingen met B-ALL zonder MLL translocaties (kiembaan MLL) hebben een veel betere prognose. Behandeling met uitsluitend chemotherapie is voldoende om een 5-jaars ziektevrije overleving van meer dan 90% te bekomen (90).
Mutaties van FLT3 komen frequent voor in MLL getransloceerde B-ALL patiëntenstalen. In in vivo studies werd aangetoond dat FLT3 inhibitoren potentieel therapeutisch effect hebben. Deze FLT3 inhibitoren worden momenteel getest in klinische trials (50). Verder worden ook DNA-demethylerende agentia zoals decitabine onderzocht en getest (84). 4.1.3.9 Intrachromosomale amplificatie Cx 21 i Pathogenese Intrachromosomale amplificatie van chromosoom 21 (iAMP21) komt voor bij 2% van de pediatrische B-ALL gevallen (50, 91). De plaats van de amplificatie is variabel, maar FISH analyse toonde aan dat er een gemeenschappelijke regio van amplificatie is op chromosoom 21. In deze regio is onder meer het RUNX1 gen gelegen, waardoor er multipele kopijen van RUNX1 aanwezig zijn. Alle patiënten met iAMP21 hebben een gemeenschappelijk pro-B-cel immunofenotype, een laag aantal WBC, een laag aantal plaatjes, een significant hogere leeftijd en een slechte prognose (91, 92).
36
ii Prognose en behandeling iAMP21 heeft een slechte prognose en behoort tot de hoog-risico B-ALL groep (91). Patiënten met iAMP21 hebben een 5-jaars ziektevrije overleving van ±29%. Bij iAMP21 is er daarenboven 3x meer kans op herval ten opzichte van B-ALL patiënten zonder iAMP21. Patiënten met iAMP21 moeten dus volgens een hoog-risico strategie behandeld worden. Wanneer er een trage respons op chemotherapie geobserveerd wordt, moet bij eerste remissie beenmergtransplantatie overwogen worden (92). 4.1.3.10 Dic(9;20) i Pathogenese en genetische defecten Dic(9;20) B-ALL komt in 2-3% van de pediatrische B-ALL voor. Een dicentrisch chromosoom is een fusiechromosoom met 2 centromeren. In dit geval ontstaat het dicentrisch chromosoom tussen chromosoom 9 en 20. Ringchromosoom is een andere benaming voor deze alteratie. Dic(9;20) kan moeilijk gedetecteerd worden met karyotypering daar het verward kan worden met monosomie 20 en/of deletie van de chromosoom 9p. Door de ontwikkeling van FISH-analyse wordt dit subtype wel makkelijk gedetecteerd en kunnen de dicentrische chromosomen worden aangetoond. Verschillende studies zijn het eens dat de alteratie dic(9;20) eerder voor een verlies aan genetisch materiaal zorgt dan voor een nieuw fusiegen. De piekleeftijd voor dic(9;20) ligt tussen 1 en 3 jaar. Ongewoon voor pediatrische B-ALL is de genderdominantie in dit subtype. De meisje/jongen ratio bedraagt namelijk 2/1. De reden voor deze verstoorde genderdistributie is nog niet gevonden. In 40% van de gevallen is dic(9;20) de enige alteratie. In 60% van de gevallen zijn er een additionele defecten: in 33% van de gevallen een CDKN2A deletie, in 28% een amplificatie van chromosoom 21 en in 10% een amplificatie van chromosoom X (93). ii Prognose en behandeling Dic(9;20) B-ALL is geassocieerd met relatief hoge WBC aantallen, CZS invasie en een hervalkans van ¼, waardoor 79% van deze gevallen een niet standaard-risicoclassificatie krijgen. Herval kan in deze subgroep snel optreden, namelijk tijdens de behandeling of kort na de behandeling. De 5-jaars ziektevrije overleving bedraagt ±62% voor dic(9;20) B-ALL. De 5-jaars algemene overleving is ±82% wat inhoudt dat behandeling na herval vaak succesvol is (93). 37
4.1.3.11 ERG deleties Een nieuw subtype in pediatrische B-ALL wordt gekarakteriseerd door een deletie van ETS family member Related Gene (ERG), welke voorkomt in ongeveer 3% van de pediatrische BALL gevallen. Tot nu zijn er nog geen andere gekende alteraties gevonden in B-ALL patiëntenstalen met ERG deleties. Het ERG subtype is gekarakteriseerd met een gunstige prognose. Verder is er in de literatuur nog maar weinig informatie beschikbaar over de klinische impact of behandeling van deze B-ALL subgroep (94).
38
5 DISCUSSIE/CONCLUSIE Acute lymfatische leukemie is de meest voorkomende pediatrische maligniteit. B-ALL omvat ongeveer 80% van de ALL patiënten (48). De pediatrische B-ALL wordt onderverdeeld in verschillende genetische subtypes welke elk geassocieerd zijn met een specifieke prognose en behandeling. De detectie van deze specifieke genetische alteraties door middel van gedetailleerde moleculair-genetische analyses zoals karyotypering en FISH in B-ALL is dus van groot belang (50).
In de voorbije jaren is er een enorme verbetering gebracht in chemotherapeutische behandelingen van B-ALL met als resultaat een sterke stijging in de overlevingskansen. Recent werden gepersonaliseerde therapieën tegen specifieke therapeutische doelwitten ingevoerd zoals onder meer TKI behandeling in Ph+ B-ALL. Verder onderzoek naar nieuwe defecten en nieuwe therapeutische doelwitten is noodzakelijk voor verdere verbetering van behandelingsresponsen. Daarnaast is het van groot belang langetermijncomplicaties bij BALL patiënten verder te onderzoeken om minder toxische behandelingen te helpen ontwikkelen (30).
Het klassieke behandelingsschema van pediatrische B-ALL bestaat uit een remissie-inductie, intensificatie en onderhoudsbehandeling. De remissie-inductietherapie bestaat uit glucocorticoïden, vincristine en asparaginase. Door de verbeteringen in chemotherapie gaat 98% van de kinderen in complete hematologische of immunologische remissie. De intensificatietherapie volgt na de remissie-inductietherapie wanneer patiënten in remissie zijn. Dit is een essentiële stap
in
het
behandelingsplan
voor
alle
B-ALL
patiënten.
Mogelijkheden
voor
intensificatietherapie zijn een hoge dosis methotrexaat met mercaptopurine, een hoge dosis asparaginase of reïnductietherapie. Ook combinaties van deze verschillende behandelingsmogelijkheden zijn een optie, dit bijvoorbeeld bij hoog-risico pediatrische B-ALL patiënten. Asparaginase en methotrexaat in aangepaste dosis naargelang risicogroep heeft de klinische uitkomst drastisch verbeterd. Vervolgens wordt een onderhoudsbehandeling gestart van 24 maanden. Hierbij is de meest gebruikte strategie een combinatie van wekelijks een lage dosis methotrexaat en dagelijks een lage dosis mercaptopurine. Het gebruik van profylactische craniale irradiatie is omstreden daar er ernstige lange termijn complicaties kunnen optreden. Enkel bij hoog-risico patiënten wordt deze behandeling nog overwogen. Triple intrathecale
39
therapie vermindert significant het risico op CZS herval, maar moet in combinatie met systemische methotrexaat gegeven worden om algemeen herval te vermijden (30).
In B-ALL werden reeds verschillende genetische defecten geïdentificeerd. B-ALL patiënten worden opgesplitst naargelang de genetische subgroep in verschillende prognostische groepen. Hyperdiploïde B-ALL komt voor bij 20 tot 30% van de pediatrische B-ALL patiënten. Kenmerkend voor dit subtype is de aanwezigheid van een overvloed aan chromosomen dat gedetecteerd kan worden via karyotypering (65). Hyperdiploïde B-ALL is sterk gevoelig aan chemotherapie en de 5-jaars ziektevrije overleving bedraagt 80-85%. Hyperdiploïde B-ALL heeft een gunstige prognose en patiënten worden behandeld met de standaardtherapie (68-70, 80). CREBBP mutaties komen in >60% van de cases met herval voor en zijn een negatieve prognostische factor. Deze mutaties verhogen de therapieresistentie Het screenen voor CREBBP mutaties is dus belangrijk om mogelijks herval vroeg te detecteren (29, 66).
Hypodiploïde pediatrische B-ALL komt minder frequent voor, met name in 5-8% van de gevallen. Naargelang het aantal chromosomen zijn er verschillende subtypes te onderscheiden die gekenmerkt zijn met een verschillende prognose en behandeling. Met name, patiënten met 44 of meer chromosomen hebben een 5-jaars ziektevrije overleving van ±70% en worden behandeld met de standaardtherapie. Daarentegen hebben patiënten met minder dan 44 chromosomen een 5-jaars ziektevrije overleving van ±40% en worden behandeld met hoogrisico intensieve behandelingsstrategie. De laatstgenoemde groep van patiënten hervallen vaak vroeg tijdens de behandeling. Het gebruik van PI3K inhibitoren bij hypodiploïde B-ALL patiënten met RAS en PI3K mutaties is een nieuwe therapeutische behandeling die momenteel verder onderzocht wordt en mogelijks kan bijdragen tot een betere prognose (7274).
Het B-ALL subtype t(12;21), waarbij een ETV6-RUNX1 fusiegen gevormd wordt, komt voor in 25% van de pediatrische B-ALL patiënten (75). Dit subtype heeft een gunstige prognose met een 5-jaars ziektevrije overleving van ±83% (70). Deze gunstige prognose is te wijten aan een grote gevoeligheid voor asparaginase. In 10% van de ETV6-RUNX1 B-ALL gevallen ontstaat er een duplicatie van het verworven chromosoom met de translocatie t(12;21). Dit is geassocieerd met een verhoogd risico op vroeg herval doordat dit een verhoogde resistentie teweegbrengt tegen prednisolone (76). Detectie van deze duplicatie is dus belangrijk om de prognose verder te verbeteren. 40
TCF3-PBX1 pediatrische B-ALL komt voor in 3-5% van de pediatrische B-ALL patiënten. Dit genotype is gecorreleerd met een initieel hoog aantal WBC, voorkomen in het nietkaukasisch ras en CZS infiltratie (70, 77). De prognose is de laatste jaren sterk gestegen door verbetering van de therapie. De 5-jaars ziektevrije overleving bedraagt ±79% (70). Opvallend in deze subgroep is het verhoogd risico op herval met infiltratie van het centraal zenuwstelsel. Een negatieve prognostische factor is de aanwezigheid van blasten in het cerebrospinale vocht bij initiële diagnose. Het is bij deze zeer belangrijk om het B-ALL subtype TCF3-PBX1 te onderscheiden van de andere subgroepen om zo een intensievere intrathecale therapie te kunnen toepassen (50, 77). Ph+ B-ALL komt in 6% van de pediatrische B-ALL gevallen voor. Deletie van het IKZF1 gen is zeer frequent (84%) in deze subgroep en is significant geassocieerd met slechtere prognose en verhoogde resistentie voor chemotherapie (50, 78). Tot recent was de prognose van Ph+ ALL zeer slecht, maar door de recente ontwikkeling van tyrosinekinase-inhibitors is de overleving van deze subgroep drastisch verbeterd. Toediening van imatinib in combinatie met intensieve chemotherapie zorgt namelijk voor een 3-jaars ziektevrije overleving van ±80% (80). Resistentie tegen deze moleculaire therapie kan mogelijks optreden en is vaak te wijten aan verworven mutaties in het ABL1 gen. Tweede generatie TKI’s werden reeds ontwikkeld zoals dasitinib en nilotinib die ingeval van resistentie tegen imatinib toegepast worden. De focus van toekomstig onderzoek in deze subgroep situeert zich op het optimaal gebruik van een combinatie van chemotherapie, beenmergtransplantatie en TKI’s (50, 78, 79). Verder is het ook belangrijk om te onderzoeken of de goede prognose zich voortzet op langere termijn.
Een volgend subtype omvat de Ph-like B-ALL patiëntengroep. Deze patiënten worden gekarakteriseerd door het voorkomen van IKZF1 alteraties en een genexpressieprofiel gelijkaardig aan Ph+ B-ALL. Bij de helft van deze patiëntengroep worden verder CRLF2 defecten gevonden en 50% van deze CRLF2 gedereguleerde patiënten dragen ook JAK mutaties. Ph-like B-ALL heeft een slechte prognose met een 5-jaars ziektevrije overleving van ±63%. Tyrosine kinase inhibitoren en de JAK2 inhibitor rexulotinib hebben bij de aanwezigheid van specifieke deleties en mutaties een therapeutische efficaciteit (30, 48, 52).
CRLF2 overexpressie veroorzaakt door genetische defecten komt voor in 5-7% van de standaard-risico en in 14% van de hoog-risico pediatrische B-ALL patiëntenstalen. 41
Kenmerkend is het voorkomen van CRLF2 defecten in de helft van de Down-syndroom patiënten met pediatische B-ALL. Patiënten met CRLF2 overexpressie hebben een ziektevrije overleving na 6 jaar van ±63%. Door voorkomen van mutaties in JAK en PI3K signalisatiemoleculen, vormen JAK of PI3K inhibitoren een nieuwe therapeutische mogelijkheid in de CRLF2 subgroep (50, 52, 53, 81).
MLL herschikkingen worden waargenomen bij 6% van de pediatrische B-ALL en komen zeer frequent (80%) voor bij zuigelingen (< 1 jaar) (83). De MLL subgroep heeft karakteristiek een ongunstige prognose met een 5-jaars ziektevrije overleving van ±50%. De verhoogde resistentie voor glucocorticoïden en asparaginase draagt bij tot de slechte prognose. Daarentegen vertoont de MLL subgroep een hogere gevoeligheid voor cytarabine, waardoor hoge dosissen methotrexaat en cytarabine aanbevolen zijn (68, 88). Zuigelingen met B-ALL zonder MLL translocaties (kiembaan MLL) hebben een veel betere prognose met een 5-jaars ziektevrije overleving van <90% op basis van chemotherapie (90). Verder komen mutaties van FLT3 frequent voor in MLL getransloceerde B-ALL patiëntenstalen waartegen FLT3 inhibitors een interessante therapeutische optie zijn (50).
Intrachromosomale amplificatie van chromosoom 21 komt voor bij 2% van de pediatrische BALL patiënten. Deze patiëntengroep heeft een 5-jaars ziektevrije overleving van ±29%. Deze subgroep heeft dus een zeer slechte prognose en wordt behandeld volgens een hoog-risico intensieve behandelingsstrategie. Beenmergtransplantatie bij trage respons op chemotherapie kan als mogelijke therapeutische strategie worden toegepast bij bekomen van eerste remissie (50, 91, 92).
Het dic(9;20) B-ALL subtype komt in 2-3% van de B-ALL gevallen voor. De 5-jaars ziektevrije overleving bedraagt ±62% en intensieve hoog-risico behandelingsstrategie wordt toegepast. Dit subtype is in ±60% van de gevallen met additionele alteraties geassocieerd, waaronder deletie van CDKN2A (±30%) en amplificatie van chromosoom 21 (±28%) en X (±10%) (93).
Een nieuw subtype in pediatrische B-ALL wordt gekarakteriseerd door het voorkomen van ERG deleties. Deze deleties worden gedetecteerd in 3% van de B-ALL gevallen. De prognose is gunstig bij dit subtype, maar er zijn weinig exacte cijfers en gegevens over prognose en behandeling beschikbaar (94). 42
TABEL 2. Genetische defecten van pediatrische acute B-cel lymfatische leukemie in relatie tot prognose en behandeling
Subtype pediatrische B-ALL Hyperdiploïdie
Prognose 5- jaar EFS: ±81%
Hypodiploïdie
(< 44 Cx)
5-jaars EFS: ±40%
(≥ 44 Cx) ETV6-RUNX1
5-jaars EFS: ±70% 5-jaars EFS: ±83%
TCF3-PBX1
5-jaars EFS: ±79%
BCR-ABL 1
3-jaars EFS: ±80%
BCR-ABL1 like
5-jaars EFS: ±63%
CRLF2 defecten
6-jaars EFS: ±63%
MLL herschikkingen
5-jaars EFS: ±50%
MLL kiembaan ALL iAMP21
5-jaars EFS: >90% 5-jaars EFS: ±29%
Dic(9;20)
5-jaars EFS: ±62%
Therapeutische interventie Standaard behandelingsstrategie: inductie- , intensificatie- en onderhoudstherapie Hoog-risico intensieve behandelingsstrategie Standaard behandelingsstrategie Standaard behandelingsstrategie, hoge gevoeligheid voor L-asparaginase Behandelingsstrategie met intensieve intrathecale therapie TKI (imatinib, dasatinib en nilotinib) in combinatie met intensieve chemotherapie Intensieve chemotherapie in combinatie met imatinib, rexulotinib of dasatinib naargelang genetische alteratie JAK-inhibitoren en PI3K inhibitoren in combinatie met hoog-risico intensieve behandelingsstrategie Hoog-risico intensieve chemo, allogene stamceltransplantatie, FLT3 inhibitoren, DNA-methylerende agentia,… Standaard behandelingsstrategie Hoog-risico intensieve behandelingsstrategie. Bij remissie en slechte respons op chemotherapie: beenmergtransplantatie Intensieve behandelingsstrategie
EFS= ziektevrije overleving
Er is de laatste jaren een grote vooruitgang geboekt in de prognose van verschillende subtypes pediatrische B-ALL. Dit komt door de ontwikkeling van specifieke therapieën naargelang de gevonden genetische defecten (TABEL 2). Het is dus zeker aangewezen onderzoek te doen naar nieuwe genetische defecten om zo nieuwe therapeutische targets in andere subtypes pediatrische B-ALL te kunnen ontwikkelen.
43
6 REFERENTIES 1.
Lightfoot TJ, Johnston WT, Simpson J, Smith AG, Ansell P, Crouch S, et al. Survival from
childhood acute lymphoblastic leukaemia: the impact of social inequality in the United Kingdom. European journal of cancer. 2012 Jan;48(2):263-9. 2.
Kumar PJ, Clark ML. Acute clinical medicine. 2nd ed. Edinburgh ; New York: Saunders;
2006. xiii, 742 p. p. 3.
Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE. Essential haematology. 6th ed. Malden, Mass.: Wiley-
Blackwell; 2011. xi, 454 p. p. 4.
Hoffman R. Hematology : basic principles and practice. 5th ed. Philadelphia, PA: Churchill
Livingstone/Elsevier; 2009. xxvii, 2523 p. p. 5.
Jiang H, Chess L. An integrated view of suppressor T cell subsets in immunoregulation. The
Journal of clinical investigation. 2004 Nov;114(9):1198-208. 6.
Vivier E, Raulet DH, Moretta A, Caligiuri MA, Zitvogel L, Lanier LL, et al. Innate or adaptive
immunity? The example of natural killer cells. Science. 2011 Jan 7;331(6013):44-9. 7.
Sagaert X, De Wolf-Peeters C. Classification of B-cells according to their differentiation
status, their micro-anatomical localisation and their developmental lineage. Immunology letters. 2003;90(2-3):179-86. 8.
Market E, Papavasiliou FN. V(D)J recombination and the evolution of the adaptive immune
system. PLoS biology. 2003 Oct;1(1):E16. 9.
Laura Mustonen JA, Olli Lassila, Kalle-Pekka Nera. Bursa of Fabricius. onlinelibrarywiley.
2010 15 september. 10.
Honjo T, Alt FW, Neuberger MS. Molecular biology of B cells. Amsterdam ; Boston: Elsevier;
2004. xiv, 589 p. p. 11.
Parham P, Janeway C. The immune system. 3rd ed. London ; New York: Garland Science;
2009. 12.
Diaz M, Casali P. Somatic immunoglobulin hypermutation. Current opinion in immunology.
2002;14(2):235-40. 13.
Abeloff MD. Abeloff's clinical oncology. 4th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier;
2008. xxx, 2555 p. p. 14.
Cooper GM, Hausman RE. The cell : a molecular approach. 4th ed. Washington, D.C.
Sunderland, Mass.: ASM Press ; Sinauer Associates; 2007. xix, 820 p. p. 15.
Viallard JF, Lacombe F, Belloc F, Pellegrin JL, Reiffers J. [Molecular mechanisms controlling
the cell cycle: fundamental aspects and implications for oncology]. Cancer radiotherapie : journal de la Societe francaise de radiotherapie oncologique. 2001 Apr;5(2):109-29. Mecanismes moleculaires controlant le cycle cellulaire: aspects fondamentaux et implications en cancerologie.
44
16.
Manning AL, Dyson NJ. pRB, a tumor suppressor with a stabilizing presence. Trends in cell
biology. 2011 Aug;21(8):433-41. 17.
Noguchi E. The Cell Cycle and Checkpoint controls: Departement of Biochemistry and
molecular Biology. Dextrel university college of medicine; 2004-2006. Available from: http://eishinoguchi.com/checkpoint.htm. 18.
Giordano A, Romano G. Cell cycle control and dysregulation protocols : cyclins, cyclin-
dependent kinases, and other factors. Totowa, N.J.: Humana Press; 2004. xiii, 185 p. p. 19.
Nebert DW. Transcription factors and cancer: an overview. Toxicology. 2002 Dec 27;181-
182:131-41. 20.
Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011 Mar
4;144(5):646-74. PubMed PMID: 21376230. 21.
Croce CM. Oncogenes and cancer. The New England journal of medicine. 2008 Jan
31;358(5):502-11. 22.
Anand P, Kunnumakara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Tharakan ST, Lai OS, et al. Cancer
is a Preventable Disease that Requires Major Lifestyle Changes. Pharmaceutical research. 2008 Sep;25(9):2097-116. English. 23.
Baker SJ, Markowitz S, Fearon ER, Willson JK, Vogelstein B. Suppression of human
colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53. Science. 1990 Aug 24;249(4971):912-5. 24.
Modern Genetic Analysis, (1999).
25.
Kashiwagi H, Uchida K. Genome-wide profiling of gene amplification and deletion in cancer.
Human cell. 2000 Sep;13(3):135-41. 26.
Sarah V. Docotoraal proefschrift, Genomic structural variation in patients with intellectual
disability and congenital anomalies. 2012. 27.
National Cancer Institute (U.S.). Progress against leukemia. Rev. ed. Bethesda, Md.,: U.S.
National Institutes of Health; for sale by the Supt. of Docs., U.S. Govt. Print. Off.; 1968. 13 p. p. 28.
Bajel A, George B, Mathews V, Viswabandya A, Kavitha ML, Srivastava A, et al. Adult ALL:
treatment outcome and prognostic factors in an Indian population using a modified German ALL (GMALL) protocol. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2007 Oct;21(10):2230-333. English. 29.
Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. The New England journal
of medicine. 2004 Apr 8;350(15):1535-48. 30.
Pui CH, Mullighan CG, Evans WE, Relling MV. Pediatric acute lymphoblastic leukemia:
where are we going and how do we get there? Blood. 2012 Aug 9;120(6):1165-74. 31.
(U.S.) NCI. Surveillance Epidemiology and End Results. Available from: www.cancer.gov.
32.
Pui CH, Robison LL, Look AT. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet. 2008 Mar
22;371(9617):1030-43.
45
33.
Stock W. Adolescents and young adults with acute lymphoblastic leukemia. Hematology / the
Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program. 2010;2010:21-9. 34.
Look AT. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science. 1997 Nov
7;278(5340):1059-64. 35.
Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Mechanisms of disease: Chronic lymphocytic leukemia.
New Engl J Med. 2005 Feb 24;352(8):804-15. English. 36.
Lu K, Wang X. Therapeutic advancement of chronic lymphocytic leukemia. Journal of
hematology & oncology. 2012;5:55. 37.
Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Cancer statistics, 2002. CA: a cancer journal for
clinicians. 2002 Jan-Feb;52(1):23-47. 38.
Burnett AK. Treatment of acute myeloid leukemia: are we making progress? Hematology / the
Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program. 2012;2012:1-6. 39.
Burnett A, Wetzler M, Lowenberg B. Therapeutic advances in acute myeloid leukemia.
Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2011 Feb 10;29(5):487-94. 40.
Liang DC, Shih LY, Hung IJ, Yang CP, Chen SH, Jaing TH, et al. FLT3-TKD mutation in
childhood acute myeloid leukemia. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2003 May;17(5):883-6. 41.
Masson K, Ronnstrand L. Oncogenic signaling from the hematopoietic growth factor receptors
c-Kit and Flt3. Cellular signalling. 2009 Dec;21(12):1717-26. 42.
Hatzimichael E, Georgiou G, Benetatos L, Briasoulis E. Gene mutations and molecularly
targeted therapies in acute myeloid leukemia. American journal of blood research. 2013;3(1):29-51. 43.
Brincker H. Population-based age- and sex-specific incidence rates in the 4 main types of
leukaemia. Scandinavian journal of haematology. 1982 Sep;29(3):241-9. 44.
Alvarez RH, Kantarjian H, Cortes JE. The biology of chronic myelogenous leukemia:
implications for imatinib therapy. Seminars in hematology. 2007 Jan;44(1 Suppl 1):S4-14. 45.
Calabretta B, Perrotti D. The biology of CML blast crisis. Blood. 2004 Jun 1;103(11):4010-22.
46.
Mughal TI, Goldman JM. Molecularly targeted treatment of chronic myeloid leukemia:
beyond the imatinib era. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 2006;11:209-20. 47.
Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, Gathmann I, Kantarjian H, Gattermann N, et al. Five-year
follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. The New England journal of medicine. 2006 Dec 7;355(23):2408-17. 48.
Roberts KG, Morin RD, Zhang J, Hirst M, Zhao Y, Su X, et al. Genetic alterations activating
kinase and cytokine receptor signaling in high-risk acute lymphoblastic leukemia. Cancer cell. 2012 Aug 14;22(2):153-66.
46
49.
Mullighan CG, Su X, Zhang J, Radtke I, Phillips LA, Miller CB, et al. Deletion of IKZF1 and
prognosis in acute lymphoblastic leukemia. The New England journal of medicine. 2009 Jan 29;360(5):470-80. 50.
Mullighan CG. Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia. The Journal
of clinical investigation. 2012 Oct 1;122(10):3407-15. 51.
Cave H, van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J, et al. Clinical
significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. European Organization for Research and Treatment of Cancer--Childhood Leukemia Cooperative Group. The New England journal of medicine. 1998 Aug 27;339(9):591-8. 52.
Harrison CJ. Genomic analysis drives tailored therapy in poor risk childhood leukemia.
Cancer cell. 2012 Aug 14;22(2):139-40. 53.
Harvey RC, Mullighan CG, Chen IM, Wharton W, Mikhail FM, Carroll AJ, et al.
Rearrangement of CRLF2 is associated with mutation of JAK kinases, alteration of IKZF1, Hispanic/Latino ethnicity, and a poor outcome in pediatric B-progenitor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2010 Jul 1;115(26):5312-21. 54.
DePaepe A. Klinische genetica: uit PROBLEMEN VAN DE KLINISCHE GENETICA,
VERLOSKUNDE PEDIATRIE EN ADOLESCENTIE. 2012:33-7. 55.
Amann R, Fuchs BM. Single-cell identification in microbial communities by improved
fluorescence in situ hybridization techniques. Nature reviews Microbiology. 2008 May;6(5):339-48. 56.
Mullighan CG, Phillips LA, Su X, Ma J, Miller CB, Shurtleff SA, et al. Genomic analysis of
the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 2008 Nov 28;322(5906):1377-80. 57.
Carroll WL, Bhojwani D, Min DJ, Raetz E, Relling M, Davies S, et al. Pediatric acute
lymphoblastic leukemia. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program. 2003:102-31. 58.
Pui CH, Evans WE. Treatment of acute lymphoblastic leukemia. The New England journal of
medicine. 2006 Jan 12;354(2):166-78. 59.
Piatkowska-Jakubas B, Krawczyk-Kulis M, Giebel S, Adamczyk-Cioch M, Czyz A, Lech
Maranda E, et al. Use of L-asparaginase in acute lymphoblastic leukemia: recommendations of the Polish Adult Leukemia Group. Polskie Archiwum Medycyny Wewnetrznej. 2008 Nov;118(11):664-9. 60.
Pieters R, Hunger SP, Boos J, Rizzari C, Silverman L, Baruchel A, et al. L-asparaginase
treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on Erwinia asparaginase. Cancer. 2011 Jan 15;117(2):238-49. 61.
Bostrom BC, Sensel MR, Sather HN, Gaynon PS, La MK, Johnston K, et al. Dexamethasone
versus prednisone and daily oral versus weekly intravenous mercaptopurine for patients with standardrisk acute lymphoblastic leukemia: a report from the Children's Cancer Group. Blood. 2003 May 15;101(10):3809-17.
47
62.
Pui CH, Jeha S. New therapeutic strategies for the treatment of acute lymphoblastic leukaemia.
Nature reviews Drug discovery. 2007 Feb;6(2):149-65. 63.
Mikkelsen TS, Sparreboom A, Cheng C, Zhou Y, Boyett JM, Raimondi SC, et al. Shortening
infusion time for high-dose methotrexate alters antileukemic effects: a randomized prospective clinical trial. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2011 May 1;29(13):1771-8. 64.
Adam de Beaumais T, Jacqz-Aigrain E. Pharmacogenetic determinants of mercaptopurine
disposition in children with acute lymphoblastic leukemia. European journal of clinical pharmacology. 2012 Sep;68(9):1233-42. 65.
Paulsson K, Horvat A, Strombeck B, Nilsson F, Heldrup J, Behrendtz M, et al. Mutations of
FLT3, NRAS, KRAS, and PTPN11 are frequent and possibly mutually exclusive in high hyperdiploid childhood acute lymphoblastic leukemia. Genes, chromosomes & cancer. 2008 Jan;47(1):26-33. 66.
Inthal A, Zeitlhofer P, Zeginigg M, Morak M, Grausenburger R, Fronkova E, et al. CREBBP
HAT domain mutations prevail in relapse cases of high hyperdiploid childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2012 Aug;26(8):1797-803. 67.
Davidsson J, Paulsson K, Lindgren D, Lilljebjorn H, Chaplin T, Forestier E, et al. Relapsed
childhood high hyperdiploid acute lymphoblastic leukemia: presence of preleukemic ancestral clones and the secondary nature of microdeletions and RTK-RAS mutations. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2010 May;24(5):924-31. English. 68.
Meijerink JP, den Boer ML, Pieters R. New genetic abnormalities and treatment response in
acute lymphoblastic leukemia. Seminars in hematology. 2009 Jan;46(1):16-23. 69.
Paulsson K, Johansson B. High hyperdiploid childhood acute lymphoblastic leukemia. Genes,
chromosomes & cancer. 2009 Aug;48(8):637-60. 70.
Andersen MK, Autio K, Barbany G, Borgstrom G, Cavelier L, Golovleva I, et al. Paediatric B-
cell precursor acute lymphoblastic leukaemia with t(1;19)(q23;p13): clinical and cytogenetic characteristics of 47 cases from the Nordic countries treated according to NOPHO protocols. British journal of haematology. 2011 Oct;155(2):235-43. PubMed PMID: 21902680. 71.
Safavi S, Forestier E, Golovleva I, Barbany G, Nord KH, Moorman AV, et al. Loss of
chromosomes is the primary event in near-haploid and low-hypodiploid acute lymphoblastic leukemia. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2013 Jan;27(1):248-50. 72.
Holmfeldt L, Wei L, Diaz-Flores E, Walsh M, Zhang J, Ding L, et al. The genomic landscape
of hypodiploid acute lymphoblastic leukemia. Nature genetics. 2013 Mar;45(3):242-52. 73.
Raimondi SC, Zhou Y, Mathew S, Shurtleff SA, Sandlund JT, Rivera GK, et al. Reassessment
of the prognostic significance of hypodiploidy in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 2003 Dec 15;98(12):2715-22.
48
74.
Nachman JB, Heerema NA, Sather H, Camitta B, Forestier E, Harrison CJ, et al. Outcome of
treatment in children with hypodiploid acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2007 Aug 15;110(4):1112-5. 75.
Torrano V, Procter J, Cardus P, Greaves M, Ford AM. ETV6-RUNX1 promotes survival of
early B lineage progenitor cells via a dysregulated erythropoietin receptor. Blood. 2011 Nov 3;118(18):4910-8. 76.
Stams WA, Beverloo HB, den Boer ML, de Menezes RX, Stigter RL, van Drunen E, et al.
Incidence of additional genetic changes in the TEL and AML1 genes in DCOG and COALL-treated t(12;21)-positive pediatric ALL, and their relation with drug sensitivity and clinical outcome. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2006 Mar;20(3):410-6. 77.
Jeha S, Pei D, Raimondi SC, Onciu M, Campana D, Cheng C, et al. Increased risk for CNS
relapse in pre-B cell leukemia with the t(1;19)/TCF3-PBX1. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, UK. 2009 Aug;23(8):1406-9. 78.
Martinelli G, Iacobucci I, Storlazzi CT, Vignetti M, Paoloni F, Cilloni D, et al. IKZF1 (Ikaros)
deletions in BCR-ABL1-positive acute lymphoblastic leukemia are associated with short disease-free survival and high rate of cumulative incidence of relapse: a GIMEMA AL WP report. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009 Nov 1;27(31):5202-7. 79.
Hunger SP. Tyrosinekinase-inhibitor use in pediatric Philadelphia chromosome-positive acute
lymphoblastic anemia. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program. 2011;2011:361-5. 80.
Schultz KR, Bowman WP, Aledo A, Slayton WB, Sather H, Devidas M, et al. Improved early
event-free survival with imatinib in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia: a children's oncology group study. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009 Nov 1;27(31):5175-81. 81.
Cario G, Zimmermann M, Romey R, Gesk S, Vater I, Harbott J, et al. Presence of the P2RY8-
CRLF2 rearrangement is associated with a poor prognosis in non-high-risk precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia in children treated according to the ALL-BFM 2000 protocol. Blood. 2010 Jul 1;115(26):5393-7. PubMed PMID: WOS:000279435200016. English. 82.
Machida U, Kami M, Hirai H. Detection of residual disease in childhood acute lymphoblastic
leukemia. The New England journal of medicine. 1999 Jan 14;340(2):153-4. 83.
Stam RW, Schneider P, Hagelstein JA, van der Linden MH, Stumpel DJ, de Menezes RX, et
al. Gene expression profiling-based dissection of MLL translocated and MLL germline acute lymphoblastic leukemia in infants. Blood. 2010 Apr 8;115(14):2835-44. 84.
Tamai H, Inokuchi K. 11q23/MLL acute leukemia : update of clinical aspects. Journal of
clinical and experimental hematopathology : JCEH. 2010;50(2):91-8.
49
85.
Pieters R. Infant acute lymphoblastic leukemia: Lessons learned and future directions. Current
hematologic malignancy reports. 2009 Jul;4(3):167-74. 86.
Armstrong SA, Kung AL, Mabon ME, Silverman LB, Stam RW, Den Boer ML, et al.
Inhibition of FLT3 in MLL. Validation of a therapeutic target identified by gene expression based classification. Cancer cell. 2003 Feb;3(2):173-83. 87.
Hilden JM, Dinndorf PA, Meerbaum SO, Sather H, Villaluna D, Heerema NA, et al. Analysis
of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report on CCG 1953 from the Children's Oncology Group. Blood. 2006 Jul 15;108(2):441-51. 88.
Pieters
R.
SIOP
Education
Book
-
2010
2010.
Available
from:
https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:tgosVMCYwpAJ:https://www.cure4kids.org/ums/hom e/courses/detail/download_document.php?courses_id%3D128%26document_id%3D1099+Pieters+Inf ant+acute+lymphoblastic+leukemie+cytarabine&hl=en&gl=be&pid=bl&srcid=ADGEESjn4fQ384x9y lsroEI7v367Waf1F4C2_ZYQiSV89SQyyC_TCcyLHepsi_wNk8DHhWTU_UHiHia4GFcNH8hAbE MpBg9M-tM9jP81iF6a0gQZ0omOLFvQQjxnTpnrz75ph4SdnVU&sig=AHIEtbS1kuaB8fnBTYzSFQyKbv40Rp58sw. 89.
Abstracts of the 44th Congress of the International Society of Paediatric Oncology (SIOP)
2012, October 5-8, 2012, London, United Kingdom. Pediatric blood & cancer. 2012 Dec 1;59(6):9651152. 90.
Nagayama J, Tomizawa D, Koh K, Nagatoshi Y, Hotta N, Kishimoto T, et al. Infants with
acute lymphoblastic leukemia and a germline MLL gene are highly curable with use of chemotherapy alone: results from the Japan Infant Leukemia Study Group. Blood. 2006 Jun 15;107(12):4663-5. English. 91.
Robinson HM, Harrison CJ, Moorman AV, Chudoba I, Strefford JC. Intrachromosomal
amplification of chromosome 21 (iAMP21) may arise from a breakage-fusion-bridge cycle. Genes, chromosomes & cancer. 2007 Apr;46(4):318-26. 92.
Moorman AV, Richards SM, Robinson HM, Strefford JC, Gibson BE, Kinsey SE, et al.
Prognosis of children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) and intrachromosomal amplification of chromosome 21 (iAMP21). Blood. 2007 Mar 15;109(6):2327-30. 93.
Forestier E, Gauffin F, Andersen MK, Autio K, Borgstrom G, Golovleva I, et al. Clinical and
cytogenetic features of pediatric dic(9;20)(p13.2;q11.2)-positive B-cell precursor acute lymphoblastic leukemias: a Nordic series of 24 cases and review of the literature. Genes, chromosomes & cancer. 2008 Feb;47(2):149-58. 94.
Mullighan CG, Downing JR. Global genomic characterization of acute lymphoblastic
leukemia. Seminars in hematology. 2009 Jan;46(1):3-15.
50
