Citokin gén-polimorfizmusok jelentősége a kissúlyú koraszülötteket érintő perinatális szövődmények kialakulásában

Citokin gén-polimorfizmusok jelentősége a kissúlyú koraszülötteket érintő perinatális szövődmények kialakulásában Dr. Treszl András

Témavezető: Dr. Vásárhelyi Barna

Semmelweis Egyetem Budapest I.sz. Gyermekgyógyászati Klinika 2005 Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola

1

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke 1. Bevezetés 1.1. A citokinek 1.1.1. Döntően proinflammatórikus hatású citokinek 1.1.1.1. Interleukin 1 (IL-1) 1.1.1.2.Tumor nekrózis faktor-α (TNF-α) 1.1.2. Döntően anti-inflammatórikus hatású citokinek 1.1.2.1. Interleukin-4 (IL-4) 1.1.2.2. Interleukin-6 (IL-6) 1.1.2.3. Interleukin-10 (IL-10) 2. Célkitűzések 3. Betegek és módszerek 3.1.1.

A

citokin-polimorfizmusok

és

a

neonatális

szepszis

kapcsolatának vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.1.2. A citokin-polimorfizmusok és az akut veseelégtelenség vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.1.3. A citokin-polimorfizmusok és a nekrotizáló enterocolitis vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.1.4. A citokin-polimorfizmusok és lélegeztetés kapcsolatának vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek 3.2. Módszerek 3.3. Statisztikai analízis 3.3.1. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszisének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások

2

3.3.2. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelenségének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások 3.3.3. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitisének

vizsgálatakor

alkalmazott

statisztikai

eljárások 3.3.4. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek lélegeztetésének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások 4. Eredmények 4.1. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszise 4.2. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelensége 4.3. Citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitise 4.4.

Citokin-polimorfizmusok

és

a

kissúlyú

koraszülöttek

kissúlyú

koraszülöttek

lélegeztetésének összefüggései 5. Megbeszélés 5.1.

A

citokin-polimorfizmusok

és

a

szepszisének összefüggései 5.2. A citokin-polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelenségének összefüggései 5.3.

A

citokin-polimorfizmusok

és

a

kissúlyú

koraszülöttek

nekrotizáló enterocolitisének összefüggései 5.4.

A

citokin-polimorfizmusok

és

lélegeztetésének összefüggései 6. Új megállapítások Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék

3

a

kissúlyú

koraszülöttek

Rövidítések jegyzéke ARF - akut veseelégtelenség AVP – arginin-vazopresszin CARS – kompenzatórikus anti-inflammációs válasz-szindróma COX2 – ciklooxigenáz-2 CRH – kortikotropin releasing hormon DIC - disszeminált intravaszkuláris koaguláció IBD – gyulladásos bélbetegség ICE - interleukin-1β konvertáló enzim IFN-γ - interferon-gamma IL-1α - interleukin-1 alfa IL-1β - interleukin-1 béta IL-4 - interleukin-4 IL-4 ra - interleukin-4 receptor alfa lánc IL-6 – interleukin-6 IL-10 - interleukin-10 IL-1 ra - interleukin-1 receptor antagonista IL-1R-AcP - IL-1 receptor akcesszor fehérje iNOS - indukálható nitrogénmonoxid-szintáz LPS - lipopoliszaharid MOF - többszervi elégtelenség NEC - nekrotizáló enterocolitis NO - nitrogénmonoxid OR - Odds ratio PAF - platelet-activating factor (vérlemezke aktiváló faktor) PCR - polimeráz láncreakció

4

PDA - perzisztáló ductus arteriosus PGE2 – prosztaglandin E2 PLA2 - foszfolipáz A2 RAS - renin-angiotenzin rendszer SIRS – szisztémás inflammációs válasz szindróma TGF-β - transforming growth factor-β (transzformáló növekedési faktor-β) Th - T helper limfociták TNF-α - tumor nekrózis faktor-alfa TSH - thyreoidea stimuláló hormon VLBW - very low birth weight (nagyon kis születési súly)

5

1. Bevezetés A koraszülöttség miatt funkcionálisan éretlen szervezet fokozottan hajlamos a perinatális szövődményekre. Emiatt magas az éretlen, kissúlyú koraszülöttek morbiditása és mortalitása [1]. A nagyon kis születési súlyú (≤ 1500 gramm) koraszülött (very low birth weight - VLBW) populáció felelős az össz-perinatális mortalitás 70%-áért; az életben maradt VLBW koraszülöttek 40%-ában pedig élethosszan tartó szövődmények alakulnak ki [1]. A nagyon kissúlyú koraszülöttek esetében a szepszis [2], az akut veseelégtelenség [3], a nekrotizáló enterocolitis [4], a perzisztáló ductus arteriosus [5], a bronchopulmonális diszplázia [6], valamint a koraszülöttek retinopátiája [7] a leggyakoribb perinatális megbetegedések közé tartozik. Az utóbbi évek kutatási eredményei szerint az említett kórképek patogenezisében, majd a szövődmények kialakulásában a gyulladásos választ szabályozó rendszer funkcionális zavarai meghatározó szerepet játszanak [8]. Az

immunválasz

effektivitásának

és

intenzitásának

a

szabályozásában a citokin-kaszkád központi szerepet tölt be. A legutóbbi évek eredményei alapján nyilvánvalóvá vált, hogy a citokin-kaszkád működése nagyon kissúlyú újszülöttekben zavart, részben a populáció éretlensége miatt [9,10]. A citokin-kaszkád aktivitását számos tényező befolyásolja – így többek között a fertőzés vagy az alkalmazott terápia. Emellett, nagy felnőtt populációkon végzett vizsgálatok alapján, öröklött tényezők (genetikai polimorfizmusok) is hatással lehetnek a citokin-termelésre [11,12], ezáltal pedig a citokin-mediált betegségek

6

kialakulására. Arra vonatkozóan kevés adat áll rendelkezésre, hogy a citokin-polimorfizmusoknak lehet-e patogenetikai jelentősége igen kissúlyú koraszülöttek citokin-mediált perinatális szövődményeinek kialakulásában. Értekezésem első részében bemutatom a citokin-kaszkád azon elemeit,

melyek

genetikai

polimorfizmusait

vizsgáltam

VLBW

populációban. Az irodalmi adatok alapján ismertetem a különböző citokinek perinatológiai kórképekben betöltött szerepét, az azokat kódoló gének polimorfizmusainak feltételezett funkcionális hatásait. Az értekezés második részében vizsgálataim eredményeiről számolok be.

7

1.1. A citokinek A citokinek viszonylag kis, 8.000-40,000 dalton molekulatömegű, farmakológiailag aktív fehérjemolekulák, melyeket bizonyos sejttípusok termelnek, hogy önmaguk (autokrin hatás), vagy más sejttípusok (parakrin hatás) működését, interakcióját befolyásolják. Jelenleg 27 citokint tartanak nyilván interleukin (IL) névvel. Más citokinek, például a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α) vagy interferon-gamma (IFN-γ) megtartották eredeti nevüket. A citokineket biológiai tulajdonságaik alapján osztályozzák, mivel nincs általános jellemző aminosav-szekvenciájuk vagy térbeli szerkezetük. A legtöbb citokint egészséges körülmények között nem termelik a sejtek, csak meghatározott ingerre. A kutatások során nyilvánvalóvá vált, hogy a citokin-gén expressziót kiváltó hatások gyakorlatilag azonosak a „sejt stresszorokkal” (például UV fény, hőhatás, hiperozmolalitás, vagy az idegen felszín) [13,14]. Bizonyos citokinek egyértelműen fokozzák a gyulladást, ezeket proinflammatórikus citokineknek [15] nevezzük, míg más citokinek ellensúlyozzák a proinflammatórikus citokinek aktivitását, ezeket antiinflammatórikus citokineknek [16] nevezzük. A kettő közötti határ nem egészen

egyértelmű,

bizonyos

körülmények

között

egyes

proinflammatórikus citokinek anti-inflammatórikus hatást fejtenek ki és viszont [17]. Az immunválaszt a gyulladásos fehérjék komplex és bonyolult hálózata alakítja ki (1. ábra). A pro- és anti-inflammatórikus citokinek egyensúlya, illetve ezen egyensúly felborulása befolyásolhatja az egyes betegségek kialakulását és azok kimenetelét (2. ábra).

8

Gyulladásos válasz 1. ábra. A pro- és anti-inflammatórikus citokinek bonyolult hálózata alakítja ki az immunválaszt. 9

Hatás T- és B-sejtek, NK sejtek, makrofágok

Proinflammatórikus válasz: IL-1, TNF-a, IL-6

Anti-inflammatórikus válasz: IL-10, IL-4, IL-6

Szisztémás „gát”

Hiper-inflammációs státusz

Hipo-inflammációs státusz

SIRS

CARS

Szisztémás inflammációs válasz szindróma

Kompenzatórikus anti-inflammációs válasz szindróma

Kardiovaszkuláris következmények (sokk), apoptózis, szervi diszfunkciók (MOF)

Az immunrendszer szuppressziója

2. ábra. A szervezetet érő stresszhatásra bekövetkező pro- és antiinflammatórikus citokinválasz.

10

Az immunrendszer pro- és anti-inflammatórikus citokinjei között dinamikus és állandóan változó egyensúly áll fenn. A gyulladás szabályozásának megértését tovább nehezíti az a tény, hogy az immunválasz egyes útjai redundánsak és több elemnek igen hasonló fiziológiai hatása van. Emellett, az IL-1 receptor antagonista kivitelével valamennyi antiinflammatórikus citokinnek van proinflammatórikus hatása is. Egy citokin végső hatását ezért több tényező is befolyásolja, így többek között: a citokin szekréciójához szükséges idő, az a környezet, ahol hatását kifejti, szinergista vagy antagonista hatású elemek jelenléte, a citokin-receptorok mennyisége, illetve az adott szövet/sejt citokin iránti érzékenysége [15].

Az ugyanazon stresszorra adott citokin válasz egyénenként eltérő. Ennek oka részben a citokineket termelő gének egyéni különbözősége (polimorfizmusa). A polimorfizmus érintheti a gén közbefogott (flanking) régióját, intronját, ritkábban exonját [18,19,20]. Ez utóbbi esetben a génpolimorfizmus aminosav eltéréssel járhat. Emellett nem csak az adott génen, hanem annak szabályozó, promoter/enhancer régiójában levő mutációk is befolyásolhatják a géntranszkripció aktiválódásának mértékét [20]. A citokineket szabályozó géneket érintő polimorfizmusoknak azért van nagy jelentősége, mert egy-egy citokinnek az optimálistól eltérő mennyiségű szintézise az egész gyulladásos kaszkád hatékonyságát befolyásolhatja. A citokin gének polimorfizmusa hatással lehet azon betegségek kialakulására és lefolyására, melyekben a citokin termelődés megváltozása kóroki szerepet játszhat.

11

1.1.1.

Döntően

proinflammatórikus

hatású

citokinek 1.1.1.1. Interleukin-1 (IL-1) Az interleukin-1 családot három, struktúrálisan rokon polipeptid: az IL-1α, az IL-1β , valamint a hatásukat gátló IL-1 receptor antagonista (IL-1 ra) alkotja [21]. A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-1α és IL-1β génje a 2-es kromoszóma hosszú karján helyezkedik el. Az IL-1β génjének több SNP-je is ismert (az adott polimorfizmus elkülönítésére használt restrikciós endonukleáz alapján: Mwo I, MspAI1, Alu1, TaqI, BsoF1). Vizsgálataimban az 5-ös exon 3954-es helyén található citozin→timin (C→T) tranzíció jelenlétét vizsgáltam (TaqI). Irodalmi adatok szerint a T jelenlétében nagyobb mennyiségű IL-1β termelődik [22]. Az IL-1β polimorfizmus hordozása együttjárt a koraszülöttség kialakulásának fokozódásával [23]. A chorioamnitisben mérhető nagy IL-1β szintek befolyásolják a magzat fejlődését és az újszülöttkori morbiditást [24]. Az IL-1α és IL-1β aminosav sorrendje eltérő, de másod- és harmadlagos szerkezetük hasonló, ugyanazon a sejtfelszíni receptorokon

12

keresztül hatnak és biológiai hatásaik is hasonlóak. Az IL-1α-t és az IL-1β-t a mononukleáris sejtek, elsősorban a fagociták szintetizálják gyulladásos stimulusok vagy bizonyos mikroorganizmusok hatására. Mindkét

citokin

31.000

dalton

molekulatömegű

prekurzor

molekulákból képződik; a hatékony fehérjék molekulasúlya 17.000 Dalton [15]. Hatásmechanizmus A legtöbb IL-1α molekula a sejt citoszoljában marad, ahol valószínűleg az IL-1 termelődés autokrin szabályozásában van szerepe. A prekurzor a sejt felszínéhez kerül és ott a membránhoz kötődik. A membránkötött prekurzor biológiailag aktív, a szomszédos sejtek parakrin szabályozásában játszhat szerepet. Az IL-1α-val szemben nagy mennyiségű IL-1β szecernálódik az extracelluláris

térbe

és

a

keringésbe.

Az

IL-1β

prekurzorát

az

intracellulárisan elhelyezkedő interleukin-1β konvertáló enzim (ICE) alakítja aktív fehérjévé (3.ábra) [25].

13

Stimululs

sejtmag

IL1β mRNA

IL1α mRNA

IL1β prekurzor

IL1β prekurzor

ICE

„érett” IL-1β IL1α prekurzor Proteáz Membrán kötött IL-1α

IL1α prekurzor

„érett” IL-1α

3. ábra. Az interleukin-1α és interleukin-1β termelődése.

Az IL-1 α-t és β-t (továbbiakban IL-1) kétféle sejtfelszíni receptor köti. A 80 kDa méretű, I. típusú receptor a legtöbb sejten megtalálható, az IL-1 hatásának transzdukciójában tölt be fontos szerepet. A 68 kDa-os, II. típusú receptor elsősorban neutrofil granulociták, monociták, csontvelői sejtek és B-limfociták felszínén található. Leírtak emellett egy, a receptor működéséhez szükséges fehérjét, az IL-1 receptor akcesszor fehérjét is (IL1R-AcP) [26]. A receptorok és az akcesszor fehérje extracelluláris részei az immunglobulin-családba tartoznak, három IgG szerű doménből állnak, az IL-1 kötő helyeik hasonlóak. Sejtfelszínenként általában 50-nél több I. típusú receptor jelenik meg. Az IL1β szignáltranszdukcióhoz szükség van az I. típusú receptor/IL-1β/IL-1RAcP komplex kialakulására [27].

14

Az I. típusú receptor citoplazmatikus része hosszabb és affinitása nagyobb az IL-1α-hoz, míg a II. típusú receptor rövidebb, 29 aminosavból álló citoplazmatikus szegmenssel rendelkezik, affinitása viszont az IL-1β felé kifejezettebb. A II. típusú receptor valószínűleg „csapdát” jelent az IL-1 számára,

ugyanis

ezen

típusú

receptor

nem

rendelkezik

a

szignáltranszdukcióhoz szükséges citoplazmatikus doménnel [21,23]. A szervezetben mindig kimutatható solubilis IL-1 receptor, mely a II. típusú receptor extracelluláris részének proteolítikus hasításával jön létre. Specifikusan köti az IL-1-t, gátolva annak sejtfelszíni receptorhoz való kötődését [21]. Az IL-1 szerepe egészségesekben Egészségesek monocitáiban sem az IL-1α, sem az IL-1β mRNS-ét nem mutatták ki. Az IL-1α kimutatható a bőrben, ahol valószínűleg a keratinociták érésében játszik szerepet. Egyes epitheliális sejtekben, neuronokban és adrenális sejtekben kimutatható IL-1, azonban ennek a homeosztázis fenntartásában betöltött szerepe nem ismert [28]. Egészségesekben az IL-1β plazma-koncentrációja 40 pg/ml alatti; szepszisben, akut szervkilökődésben, valamint a rheumatoid arthritis akut exacerbációjában szenvedő betegek esetében azonban ennél nagyságrendileg magasabb mérhető szérumszintek alakulhatnak ki [22, 23]. Az IL-1 patogenetikai szerepe egyes kórképekben Az IL-1 stimulálja a T- és a B-limfocitákat. [24, 25]

15

Az IL-1 emeli egyes mediátorok, így a PAF, a prosztaglandinok és a nitrogén monoxid szintézisét [29]. Az IL-1 ra másik kiemelkedően fontos szerepű proinflammatórikus citokinnel, a TNF-α−val szinergista módon hat (4. ábra).

IL-1, TNF-α, IFN-γ

PLA2 (II), COX2, iNOS, ↑ endoteliális adhéziós molekulák, kemokin-szintézis

PAF, PGE2 leukotriének, NO, neutrofil endoteliális adhézió, neutrofilek migrációja, neutrofilek aktivációja

Gyulladás, szöveti destrukció, funkció-veszteség

4. ábra. Az IL-1, IFN-γ és a TNF-α által létrehozott gyulladásos kaszkád. Az IL-1α és IL-1β lázat, étvágytalanságot és hipotenziót válthat ki. Fokozza a hipofízis-hormonok elválasztását és a kollagén-szintézist; a prosztaglandinok

szintézisének

fokozásával

pedig

csökkenti

a

fájdalomküszöböt. Az IL-1-nek emellett szerepe van a Langerhans-szigetek

16

béta sejtjeinek pusztulásában, a mieloid leukémia-sejtek növekedésében, az arthritises

és

colitises

gyulladásos

folyamatokban,

valamint

az

atheroszklerotikus plakkok kialakulásában [25, 26, 30].

Az interleukin-1 szerepe egyes megbetegedések kialakulásában Szeptikus sokkban az IL-1 közvetlenül az érfalra hatva a PAF (platelet-activating

factor)

és

a

nitrogénmonoxid

szintézise

révén

vazodilatációt okoz, mely sokk kialakulásához vezet [31]. Colitis ulcerosában és Crohn-betegségben jellemzőek a bélfal aktivált neutrofilokban gazdag infiltratív léziói. Az IL-1 patogenetikai hatását alátámasztja az, hogy állatkísérletekben, akut, immunkomplex mediált colitisben az IL-1 hatásának gátlása csökkenti a gyulladást. Humán vizsgálatok szerint a nyálkahártya IL-1β/IL-1 ra arányának megváltozása fontos patogenetikai tényező a gyulladásos bélbetegségek kialakulásában [32]. Akut és krónikus mieloid leukémiás sejtek számára az IL-1β valószínűleg növekedési faktort jelent. Az IL-1β normál esetben sem a perifériás mononukleáris sejtekben, sem a csontvelői aspirátum sejtjeiben nem mutatható ki, akut mieloid leukémiában szenvedő betegek sejtjeiben viszont detektálható. IL-1β elleni antitestek szignifikánsan csökkentik ezen sejtek spontán proliferációját és in vitro kolónia-képző képességét [33]. Az 1. típusú cukorbetegség patogenezisében az IL-1β fontos szerepet játszik. Izolált Langerhans-szigeteket IL-1β-val inkubálva a béta-sejtek elpusztultak. Spontán autoimmun diabéteszes patkányokban az IL-1-ra adásakor a diabétesz később lépett fel [34].

17

Az IL-1β szerepe újszülöttkori kórképekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Berner és mtsai [35] szeptikus újszülöttek köldökzsinórvérében határozták meg többek között az IL-1β szérumszintjét. Szeptikus újszülöttekben a citokin szintje lényegesen magasabb volt egészséges, illetve szepszis-gyanús, de nem szeptikus újszülöttekkel összehasonlítva. A szepszis esetén a felszabaduló citokinek jelentősen befolyásolják a vesefunkciót nem csak szisztémás, hanem helyi hatásaik révén is. A „vese-specifikus” gyulladásos citokin-válasz a TNF-α elválasztásával kezdődik, ezt követi az IL-1β. Ε két citokin pedig fontos szerepet töltenek be a súlyos fertőzéssel összefüggésben levő akut veseelégtelenség (ARF) kialakulásában [36]. Korábbi tanulmányok szerint az IL-1β megváltozott termelése szerepet játszhat a nekrotizáló enterocolitis (NEC) kialakulásában is. NECes újszülöttek szérumában magasabb IL-1β szintet mértek. Kimutatták, hogy az IL-1β mRNS-e a NEC-es újszülöttek bélrezekátumainak a mucosájában és a teljes bélfal vastagságában emelkedettebb [37]. Bronchopulmonáris diszpláziában (BPD) szenvedő újszülöttek esetén már az amnionfolyadék IL-1β szintje magasabb volt a kontroll újszülöttekéhez képest. BPD-s újszülötteknél a légutak IL-1β szintje közvetlenül a születés után megemelkedik és ezen gyulladásos markerek szintje magasabb marad [38].

18

1.1.1.2. Tumor nekrózis faktor-α (TNF- α) Bevezetés A TNF-α nemcsak a természetes immunitás egyik legfontosabb mediátora, hanem direkt citotoxikus hatása révén számos betegség patogenezisében is meghatározó szerepet játszik. Kiemelkedő sajátsága, hogy befolyásolja egyéb citokinek termelődését. A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete A TNF-α gén a 6-os kromoszóma rövid karján, a 21:3 lokuszon helyezkedik el [39]. 4 exon és 3 intron kódolja azt a 230 aminosavból álló 25 kDa-os prekurzor molekulát, ami a TNF-α-t termelő sejtek membránjában helyezkedik el. Bár ennek is lehet biológiai hatása, mivel befolyásolja a sejtek közötti kapcsolatot, az aktív forma proteolízis során keletkezik. Az így létrejövő, 157 aminosavból álló 17 kDa-os monomerek hármasával összekapcsolódva alkotják az aktív trimer TNF-α molekulákat [40]. Felnőttekben

széles

körben

tanulmányozták

a

TNF-α

polimorfizmusait, ezen belül is kiemelt figyelmet kapott a promoter régió – 308-as helyén található guanin-adenin (G→A) tranzíció jelenléte (ezt a polimorfizmust TNF2-nek, vagy a tranzíciónál hasító endonukleáz alapján NcoI-nek is nevezik). Az A jelenlétében nagyobb a keringő TNF-α plazmaszintje a gén fokozott transzkripciója miatt [41]. A promoter régió egy másik helyén, a –238-as pozícióban ismert egy másik guanin-adenin

(G→A)

polimorfizmus

(MspI),

mely

-

legalábbis

pszoriázisban szenvedő betegekben - csökkent TNF-α termeléssel járt [42]. A TNF-α, de más citokinek, így az IL-1β, IL-6 és IL-8 emelkedett

19

szérumszintjei következményekkel járnak az anyára és a magzatra is. [43,44,45,46]. A TNF-α G-308A alléljének a prevalenciáját vizsgálták spontán koraszülő nőkben. Dizon-Townson és mtsai nem találtak különbséget a polimorfizmus előfordulásában kontroll és spontán koraszülő nők között [47]. Ezzel ellentétben mások összefüggést írtak le a TNF-α -308A hordozása és a chorioamnionitis és a spontán koraszülés között. [48,49]. Bioszintézis és szabályozás A TNF-α-t döntően a makrofágok termelik, elsősorban endotoxinstimuláció, interferon-γ, vagy migrációgátló faktor hatására. A citokin produkciójában részt vesznek az aktivált T-sejtek, hízósejtek, natural killersejtek, Kupffer-sejtek, asztrociták, gliasejtek, oszteoblasztok. A TNF-α termelés

egyik

legkifejezettebb

stimulusát

az

endotoxint

vagy

lipopoliszacharidot termelő Gram-negatív baktériumok jelentik [50]. A Gram-pozitív baktériumok, vírusok és paraziták a makrofág sejtek serkentése révén indukálnak fokozott TNF-α szintézist. A TNF-α termelését proinflammatórikus és anti-inflammatórikus citokinek is befolyásolják. Az IFN-γ a TNF-α termelés egyik fontos, szinergista hatású stimulánsa, az IL-10 viszont csökkenti a TNF-α szintézist. Szérumszintje diurnális ingadozást mutat: legnagyobb mennyiségben éjjel és a hajnali órákban található a keringésben [51,52]. A TNF-α-gén átírása és emiatt a TNF-α vérszintje egészséges emberben a jelenlegi metodikákkal a kimutathatósági küszöböt nem éri el. Aktiváció, pl. gyulladás hatására a TNF-α-mRNS szintje 15-30 percen belül kezd emelkedni, de ezt proteinszintézis egyelőre nem kíséri.

20

Az mRNS-ről átíródó, a membránba kihelyeződő 25 kDa-os prekurzor molekula hasítását egy metalloproteáz enzim, a TNF-α konvertáló enzim végzi.

Az

enzim

aktivitását,

ezáltal

az

aktív

forma

képződését

lipopoliszacharidok és citokinek, többek között maga a TNF-α is befolyásolja. A plazminogén és a plazmin fokozza az enzim termelődését és elősegíti a biológiailag hatékony forma kialakulását. [53, 54] A TNF-α hatásmechanizmusa A TNF-α hatásait specifikus receptor család közvetíti. A receptorok apoptotikus, illetve proliferatív szignált közvetítenek. Közös jellemzőjük, hogy két egyforma transzmembrán doménből állnak, melyekben a receptorcsaládra

jellemző

módon

ciszteinben

gazdag

extracelluláris

láncszakaszok vannak. Ezek az aminosav-szekvenciák általában 3-6-szor ismétlődnek. Egyes receptorokban egy 60 aminosavból álló citoplazmatikus szekvencia is jelen van, ami felelős az apoptotikus szignál közvetítéséért [55]. A receptorokat a nagyfokú ligand-specificitás jellemzi. Általában 3 ugyanolyan molekulából felépülő, ún. homotrimer ligandumokat kötnek. A TNF-α két receptorhoz, az 55 kDa-os és a 75 kDa-os receptorhoz egyforma affinitással kapcsolódik. Ezen receptorok a szervezet szinte valamennyi testi sejtjén megtalálhatók. A 75 kDa-os típus nagyobb mennyiségben van jelen az endotél- és hemopoetikus sejteken [56]. A két receptor eltérő hatásokat közvetít (5. ábra).

21

Gram-negatív baktériumok ↓

Lipopoliszacharid ↓ Makrofág sejtek ↓

TNF-α

75 kDa-os receptor

55 kDa-os receptor

Fokozza az 55 kDa-os receptor által mediált hatásokat

T-sejt proliferáció

Apoptózis Tumorsejt lízis in vitro

Dermális nekrózis

Tumor hemorrhágiás nekrózisa

Inzulinrezisztencia

Sokk, szövetkárosodás

Láz

5. ábra. A TNF receptorok által közvetített hatások.

22

A TNF-α receptorok aktiválódása két lépcsőben történik. Ennek során a keringő TNF-α trimer egyik molekulája a két alegységből álló receptor egyik kötőhelyéhez kötődik. Ezután a receptor másik, szabad alegységén lévő kötőhely úgy mozdul el, hogy a TNF-α trimer egy másik alegysége hozzá tudjon kötődni. A receptornak ez az elmozdulása felel azután az intracelluláris válasz kiváltásáért [57]. A transzmembrán receptorok mellett létezik egy, a véráramban keringő receptortípus is, ami a transzmembrán receptorok extracelluláris doménjének lehasításából származik. A hasítást végző enzim a TNF-α konvertázhoz hasonlóan szintén metalloproteáz. Az enzim aktivitását elsősorban a keringő lipopoliszacharidok mennyisége, a TNF-α és más citokinek

szabályozzák.

Az

oldott

receptor

a

TNF-α

moláris

koncentrációjához képest kb. 1000-szeres többletmennyiségben van jelen, de funkciója még nem teljesen ismert. Elképzelhető, hogy a szolubilis TNF receptor megkönnyíti a citokin prezentációját a célsejtek számára, vagy a szervezet számára veszélyes immunsejt-túlstimulációtól védi a szöveteket a biológiailag aktív TNF-α megkötésével. Lehet, hogy mindkét folyamat végbemegy, vagyis excesszív TNF-α termelődés esetén a szolubilis receptor megköti a citokint, majd ebből a raktárból a TNF-α kisebb mennyiségekben távozik. Több betegségben (pl. szisztémás lupus (SLE), malignomák, szepszis, krónikus infekció) megfigyelték a szolubilis receptortípus mennyiségének növekedését [58]. A TNF-α által kiváltott hatások A TNF-α-t eredetileg elsősorban a tumorok növekedését gátló fehérjének tartották, mivel BCG-vel, majd endotoxinnal beoltott állatok szérumával kezelve előzőleg tumor-transzplantáción átesett egerekben a

23

daganat hemorrhágiás nekrózisát és regresszióját tapasztalták [59]. Később kiderült, hogy a citokin nemcsak a tumorsejtek, hanem a szervezet más, szöveti sejtjeinek differenciálódását, növekedését és metabolizmusát is befolyásolja. Kis koncentrációban a TNF-α aktiválja a védekező gyulladásos reakciókat. Elősegíti az érendotél sejteken az ELAM-1, VCAM-1 és ICAM1 adhéziós molekulák expresszálódását, ezáltal adhezívvé teszi azokat a neutrofilek, monociták és limfociták számára. Fokozza a neutrofil és eozinofil sejtek, makrofágok bactericid hatását. A TNF-α részt vesz a specifikus immunválasz koordinálásában is: hatására fokozódik a Blimfociták immunglobulin- és a fibroblasztok kolóniastimuláló faktor termelése. Akutan, nagy koncentrációban a TNF-α pirogén hatású. Emellett aktiválja az alvadási rendszert és ennek révén szövetkárosodást (akut renális tubuláris nekrózist, gasztrointesztinalis nekrózist, akut légzési distresszt, diffúz intravaszkuláris koagulopátiát és sokkot) vált ki. A TNF-α hosszú ideig tartó túltermelésekor a cachexia tünetei lépnek fel.

24

A TNF-α tumorsejtekre kifejtett direkt citotoxikus hatását több in vitro kísérlet bizonyította [60,61]. Emellett a TNF-α más citokinek és citotoxicus faktorok (pl. nitrogénmonoxid) aktiválásával közvetve is részt vesz a tumorsejtek elleni immunválaszban. A TNF-α daganatellenes hatását kifejezettebbnek találták vaszkularizált daganatok esetében [62]. A központi idegrendszerben a nagy TNF-α szint szövetkárosító hatású. Kis koncentrációban viszont az agyi homeosztázis fenntartásának egyik fontos eleme; fokozza az asztrociták [63] és a neuronális progenitor [64] sejtek proliferációját, elősegítve a károsodott idegszövet regenerációját. A TNF-α ezt a hatását nagy valószínűséggel az idegi növekedési faktor termelésének stimulálásával fejti ki [65]. Nagyobb (néhány nanogramm/liter) koncentrációban a TNF-α fokozza az endotélsejtek prokoaguláns aktivitását [66]. Az endothél sejtek aktin filamentumainak újrastruktúrálásával a sejtek közötti kapcsolat erőssége csökken (a sejtek elvesztik "tight junction" összeköttetéseiket) [67]. Ez plazmaproteinek vesztéséhez és a szövetközti folyadék felhalmozódásához vezet. A miokardiumon a TNF-α a nitogénmonoxid termelés serkentésével negatív inotrop hatást fejt ki [68,69]. A TNF-α szerepe újszülöttkori kórképekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Endotoxin sokkban a TNF-α magas szintje szerepet játszik a perifériás vaszkuláris rezisztencia kialakulásában és a szív teljesítményének

csökkenésében.

A

kapillárisok

„résein”

keresztül

fokozódik a folyadékvesztés az extracelluláris térbe. A pulmonalis endotélsejtek aktiválódása, a granulociták degranulációja és a kapillárisokon

25

keresztüli folyadékvesztés miatt az alveolusokban folyadék halmozódik fel és respiratórikus distressz szindróma fejlődik ki. Berner és mtsai szeptikus újszülöttek köldökzsinórvérében határozták meg a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-8 szérumszintjét. A koraszülöttségtől függetlenül szeptikus újszülöttekben valamennyi citokin szintje lényegesen magasabb volt egészséges, illetve olyan újszülöttekkel összehasonlítva, akiknél felmerült a szepszis lehetősége [35]. Atici és mtsai szerint a TNF-α szérumszintje szeptikus újszülöttekben szignifikánsan magasabb [70]. Súlyos infekció hatására romlik a vese perfúziója, ennek a folyamatnak a mediátorai többek között a gyulladásos citokinek. Szepszisben a keringő citokinek mind szisztémás, mind helyi hatásaik révén is befolyásolják a vesefunkciót. A gyulladásos citokin-válasz a TNF-α szecernálásával kezdődik, ezt követi az IL-1β, majd ezután jelenik meg az anti-inflammatórikus IL-6. Egyes irodalmi adatok szerint a TNF-α, fontos szerepet játszik a NEC patogenezisében [71,72]. A patkányoknak parenterálisan beadott TNF-α hatására sokk és gasztrointesztinális nekrózis alakult ki. NEC-es újszülöttekben magasabb szérum TNF-α szintet mértek [73]. Viscardi és mtsainak vizsgálatai szerint a TNF-α és az IL-1β szintje a NEC-es újszülöttek bélrezekétumainak teljes vastagságában magasabb, ami felveti ezen citokinek patogenetikai szerepét a helyi gyulladásos folyamat mediálásában [74]. A BPD-s újszülöttekben mind az amnionfolyadékban, mind pedig a légutakban magasabb TNF-α szintet mértek [75].

26

A gyulladásos bélbetegségek kialakulásának vizsgálata során már korábban felvetődött a gyulladáskeltő citokinek, ezen belül a TNF-α fokozott termelődésének a lehetősége. Állatkísérletben rekombináns TNF-α hatására a vékonybélben iszkémiás nekrózis alakult ki [76,77]. Szoros összefüggést találtak a gyulladásos bélbetegség súlyossága és a szérum, illetve széklet TNF-α koncentráció között [78].

1.1.2.

Döntően

anti-inflammatórikus

hatású

citokinek 1.1.2.1. Interleukin-4 (IL-4) A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-4 20000 daltonos glikoprotein. Pleiotrop hatású, mely befolyásolja a T helper (Th) sejtek differenciálódását. Az IL-4-et az érett Th2 sejtek, valamint a hízósejtek és a bazofil sejtek termelik [79]. Az IL-4 hatására a Th prekurzor sejtek Th2 irányba differenciálódnak. A Th2 sejtek ugyancsak termelnek IL-4-et, mely így a citokin autokrin termelődése révén tovább erősíti a sejtproliferációt (6. ábra). A Th2 sejtek termelte IL-4 és IL10 a makrofág eredetű IL-12 termelés csökkentése révén a Th1 válasz szuppressziójához vezet. Az IL-4 hatását az IL-4 receptor közvetíti. A receptort kódoló gén a 16-os kromoszóma rövid karján helyezkedik el. A receptor α lánca egy 140 000 daltonos fehérje, mely nagy affinitással köti az IL-4-et, emellett

27

receptora az IL-13-nak is. A receptor α lánc génjének 1902-es hely leírtak egy adenin → guanin (A→G) tranzíciót, mely MspI restrikciós endonukleáz enzimmel hasítható. A guanin jelenlétében az 576-os aminosav argininra változik. Funkcionális vizsgálatok szerint az arginin hatására fokozott szignáltranszdukciós aktivitású receptor keletkezik [80], melynek szerepet tulajdonítanak az atópia kialakulásában [81]. Biológiai hatás Az IL-4 részt vesz a Th2 válasz irányításában: aktiválja a hízósejtek és stimulálja az IgE antitestek termelését azáltal, hogy a B sejteket IgE szekretáló sejtekké alakítja [82]. Az IL-4 több, strukturális sejt működését is befolyásolja. Fokozza a vaszkuláris endotél és a bőr fibroblasztjainak proliferációját, gátolja viszont a felnőtt humán asztrociták és vaszkuláris simaizomsejtek proliferálódását [83]. Az IL-4 patogenetikai szerepe Az IL-4 gátolja a gyulladásos citokinek expresszióját és elválasztását. A monocita eredetű citokinek (például a IL-1, TNF-α, IL-6) hatását blokkolja. Emellett gátolja a makrofágok citotoxikus tevékenységét és nitrogénmonoxid termelését. Fokozza viszont az IL-1 ra termelődését [84]. Bakteriális fertőzés esetén az IL-4 hatása összetett és még nem minden részletében felderített. A Gram-negatív bakteriális pneumonia állatmodelljében az IL-4 fokozta a Pseudomonas aeruginosa elleni aktivitást [85]. Gram-pozitív baktériumok okozta fertőzésben viszont az IL-4 a

28

Staphylococcus aureus számára növekedési faktort jelentett, mely szisztémás infekcióhoz és fokozott szeptikus mortalitáshoz vezetett [86].

Vizsgált gének: IL-4, IL-4 Rα, IgERβ Th2 sejtek B sejt

Th0 sejtek IgE termelés Hízósejt

Leukotriének Hisztamin PAF ACE

bronchokonstrikció

6. ábra. Az IL-4 hatása a Th sejtek differenciálódására.

Az IL-4 immunregulációs és anti-inflammatórikus hatású és centrális szerepet tölt be a bél immunológiájában. Gátolja a makrofágok kolóniaképződését, a monociták H2O2 termelését, és egyes gyulladásos mediátorok, így a TNF-α és az IL-1β szintézisét [87,88].

29

Az intesztinális traktus extenzív gyulladásával járó gyulladásos bélbetegségekben (IBD) az IL-4 meghatározó szerepet tölt be. IBD-s betegekben a gyulladt nyálkahártya IL-4 termelő sejtjeinek száma csökkent. Emellett a gyulladt bélszakasz lamina propriájából izolált mononukleáris sejtjei kevesebb IL-4 mRNS-t tartalmaznak és a citokint is kisebb mennyiségben szekretálják mint a kontroll sejtek [89,90]. A nagyon hasonló citokin-profil miatt felmerült, hogy a NEC és a Crohn-betegség, kialakulásának pathomechanizmusában jelentős hasonlóságok mutathatók ki [91]. Bár a NEC és az IL-4 kapcsolatáról nem állnak rendelkezésre irodalmi adatok, mégis felvethető ennek a citokinnek a jelentősége a betegség kialakulásában.

30

1.1.2.2. Interleukin-6 (IL-6) A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-6 gén a 7-es kromoszóma rövid karján van. A gén 5 exonból és 4 intronból áll, transzkripcionális szabályozása meglehetősen összetett [92]. Az IL-6 promoterének –174-es pozíciójában található guanin→citozin (NlaIII) polimorfizmus funkcionálisan jelentős, mivel a citozin jelenlétében kisebb plazma IL-6 szinteket mértek [93]. A C allél esetében kisebb a bazális, valamint a LPS-re és az IL-1-re adott transzkripciós válasz, mint a G allél esetében. Egyes kisebb vizsgálatokban hasonlónak találták a spontán abortáló és kontroll nők között az IL-6 G-174C, IL-10 G-1082A, IFNγ A-874 T és TNF-α G-308A polimorfizmusok előfordulási gyakoriságát [94,95,96,97]. Az IL-6 promoter -174 C/C genotípusa ritkább volt koraszülő nőkben [98]. Az IL-6 funkcionális formája egy homodimer, ahol az alegységek 4 α-helikális globuláris doménből állnak. Hatásmechanizmus Az IL-6 hatásait az egyetlen transzmembrán fehérjéből álló IL-6 receptoron keresztül fejti ki. A citokin hatására a receptor egy másik transzmembrán receptort, a gp 130-at homodimerizálja és ez indítja el a szignál-transzdukciót. Az IL-6 receptor T-sejteken, aktivált B-sejteken, valamint perifériás monocitákon és makrofágokon található meg. Az IL-6nak van szolubilis formája is, mely a membránreceptor extracelluláris

31

doménjéből áll. A citokin a gp 130-at még a szolubilis receptoron át is képes aktiválni, még akkor is, ha a sejtek felszínén nincs is transzmembrán receptor [99]. Biológiai hatás

Az IL-6-ot monociták, makrofágok és endotélsejtek termelik. Sokáig proinflammatórikus citokinnek tekintették, mely LPS hatására a TNF-α-val és az IL-1-gyel együtt aktiválódik [99]. A legtöbb citokinhez hasonlóan az IL-6-nak is van pro- és anti-inflammatórikus tulajdonsága. Bár az akut fázisfehérjék aktiválásában is részt vesz, kifejezett anti-inflammatórikus hatásokkal rendelkezik. A citokin limfoid és nem-limfoid sejtekben is képződik és befolyásolja T és B-sejtek differenciálódását és proliferációját. Emellett az IL-6-nak igen sokrétűek a hatásai, részt vesz az endokrin és a metabolikus folyamatok szabályozásában is (2. táblázat) [100].

32

Hematológiai hatások Multipotens hematológiai őssejtek proliferációja Mielóma és plazmocitóma sejt-növekedés Immunológiai hatások B-sejtek differenciálódása és érése B-sejtek immunoglobulin termelése T-sejtek differenciálódása és érése Hepatológiai hatások Hepatocita stimuláció Az akut fázis reakció génjeinek (C-reaktív protein, haptoglobin, fibrinogen) indukciója Neurológiai hatások Idegsejt differenciálódás Gliózis (transzgén egérben) Kardiológiai hatások Miokardium hipertrófia Endokrin hatások Termogenezis indukciója (endogen pirogén) Hipotalamo-adrenális tengely stimulációja Vazopresszin szekréció stimulációja Növekedési-hormon elválasztás stimulációja Thyreoid tengely szuppressziója Szérum lipid-szintek csökkentése Oszteoporózis (posztmenopauzás, vagy a hipogonadizmus miatt)

2. táblázat. Az IL-6 hatásai.

Az IL-6 csökkenti a TNF-α és az IL-1 termelődését. Ugyancsak csökkenti egyéb, proinflammatórikus hatású fehérjék (GM-CSF, IFN-γ) szintézisét, viszont nem befolyásolja más anti-inflammatórikus citokinek, mint az IL-10 és a transforming growth factor-β (TGF-β) termelődését [101]. Az IL-6 fokozza az IL-1 ra ás a szolubilis TNF-α receptorok elválasztását. A katekolaminok fokozzák az IL-6 termelődését, az ösztrogének és az androgének viszont csökkentik. Az IL-6 fokozza a kortikotropin releasing

33

hormon (CRH), növekedési hormon (GH) és az arginin-vazopresszin (AVP), csökkenti a thyreoidea stimuláló hormon (TSH) termelődését (7. ábra) [102].

Stressz

Kortizol

Katekolaminok

Ösztrogének, androgének

Kortizol

Lipidek

7. ábra. Az IL-6 endokrin és metabolikus hatásai. Az IL-6 újszülöttekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Romagnoli és mtsai szeptikus koraszülöttekben nagyobb IL-6 és IL-10 szintet mértek egészséges koraszülöttekhez képest [103]. Berner és mtsai szeptikus újszülöttek köldökzsinórvérében határozták meg az IL-6 szérumszintjét [104]. A koraszülöttségtől függetlenül szeptikus újszülöttekben az IL-6 szérumszintje lényegesen magasabb volt egészséges,

34

illetve olyan újszülöttekkel összehasonlítva, akiknél felmerült a szepszis lehetősége. Kashlan szerint a köldökzsinór vér IL-6 koncentrációja igen érzékeny indikátora a koraszülöttek szepszisének [105]. Egy nemrégiben megjelent vizsgálatban Krueger és mtsai azt találták, hogy a szepszis diagnózisát a szérum IL-6 és IL-8 mérésekkel meg lehet erősíteni [106]. A szepszis fennállásakor a keringésbe jutó mediátorok, így a citokinek is jelentősen befolyásolják a vesefunkciót nemcsak szisztémás, hanem helyi hatásaik révén is. A vesében a gyulladásos citokin-válasz a TNF-α elválasztásával kezdődik, ezt követi az IL-1β, majd ezután jelenik meg az anti-inflammatórikus IL-6. Korábbi tanulmányok szerint az immunregulációs citokinek (TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10) megváltozott termelése szerepet játszhat a NEC kialakulásában. NEC-es újszülöttek szérumában magasabb IL-6, szintet mértek. A köldökzsinórvér IL-6 szintje magasabb volt azon újszülöttek esetében, akiknél a születés után közvetlenül nekrotizáló enterocolitis alakult ki [107]. Egy másik vizsgálatban az anti-inflammatórikus IL-6 és IL-10 citokinek szérumszintje a NEC-es gyulladásos folyamat progressziójával párhuzamosan fokozódott [108]. Bronchopulmonáris

diszpláziában

szenvedő

újszülötteknél

az

amnionfolyadékban a születés előtt 5 nappal már magasabb IL-6 szintet mértek [109] A BPD-s újszülöttek pulmonáris mosófolyadékában magasabb IL-6 szintet mértek [110].

35

1.1.2.3. Interleukin-10 (IL-10) Az IL-10-et a CD4+/CD8+ T-sejtek, valamint B-sejtek, makrofágok, aktivált hízósejtek és keratinociták termelik. A citokin génje az 1-es kromoszómán helyezkedik el. Az IL-10 a humán immunválasz legfontosabb anti-inflammatórikus hatású citokinje; gátolja a Th1 eredetű gyulladásos fehérjék szintézisét. Gátolja emellett a monocita/makrofág eredetű proinflammatórikus proteinek termelődését. A makrofágokra kifejtett hatékony immunszuppresszív hatásával ellentétben az IL-10 stimulálja a Bsejtek proliferációját, differenciálódását és antitesttermelését. A citokin génje, polimorfizmusai és szerkezete Az IL-10 két, 160 aminosavból álló, szorosan összekapcsolódó 18 kDa-os homodimer formájában van jelen a keringésben. Az IL-10 génjének promoter régiójában több polimorf hely is ismert (-1082, -819, -592). A –1082-es helyen lévő G→A tranzíció hatására a stimulált Tsejtek kisebb mennyiségű IL-10-et termeltek. Egyes tanulmányok szerint ugyanakkor a magasabb IL-10 szintek mellett, infekciós kórképekben szereplő betegek között magasabb a mortalitás [111]. Egy meta-analízisben a nagy IFNγ és kis IL-10 termelődéssel járó polimorfizmus hordozó nők között gyakoribb volt a koraszülés [112]. Egy másik vizsgálat alapján azon nők esetében, akik kis Th2/Th3 és nagy Th1 citokin szinttel járó polimorfizmus mintázatuk volt, gyakoribb volt a koraszülés [113].

36

A citokin receptora egy 110 kDa-os sejtfelszíni molekula, mely közvetíti a TNF-α, IL-1, IL-6, GM-CSF termelődését gátló hatást. Csökkenti emellett a TNF-α receptorok sejtfelszíni expresszióját [116]. Szisztémás fertőzésekben az IL-10 szintje a plazmában is mérhetővé válik és jelentősen befolyásolja az immunválaszt. Megfigyelték például, hogy

magas

IL-10

valószínűséggel

és

halnak

kis

TNF-α

meg

szérumszintű

meningococcus-okozta

betegek

kisebb

fertőzésekben.

Állatkísérletben az IL-10 adására javult az endotoxémia túlélése. Az IL-10 génkiütött egerek sokkal érzékenyebbek az endotoxin kiváltotta sokkra, mint a normál állatok. Az IL-10 knock-out egerekben a humán gyulladásos bélbetegségekhez igen hasonló krónikus gyulladásos enteritis alakul ki. Jelenleg már klinikai vizsgálatok folynak az IL-10 gyulladásos bélbetegségekben való terápiás alkalmazásával kapcsolatosan [114]. Az IL-10 szerepe újszülöttekben Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt. Szeptikus koraszülöttekben nagyobb IL-6 és IL-10 szintet mértek egészséges koraszülöttekhez képest [115]. A génpolimorfizmusok hatását ezidáig főként vesetranszplantációban tanulmányozták. Egyes vizsgálatok szerint az IL-10 polimorfizmusa befolyásolja a graft túlélését [115]. A rendelkezésre álló adatok szerint az IL-10 citokin szintjei megváltoznak NEC-ben. Egy másik vizsgálatban az anti-inflammatórikus IL-6 és IL-10 citokinek szérumszintje a NEC-es gyulladásos folyamat progressziójával párhuzamosan fokozódott [108].

37

2. Célkitűzések 1.

A citokin-gén polimorfizmusok a gyulladásos fehérjék termelésének

megváltoztatásával befolyásolják a bakteriális infekcióra adott immunválasz mechanizmusát is. Felnőttek esetében több vizsgálatban is összefüggést mutattak ki egyes genetikai polimorfizmusok és a szepszis lefolyása és kimenetele között [11]. Újszülöttek esetében azonban eddig csak a TNF-β gén NcoI polimorfizmusának hatását vizsgálták neonatális infekcióban. Nem ismert

ugyanakkor

egyéb,

a

citokin-kaszkád

más

tagjait

érintő

polimorfizmusok patognosztikus és prognosztikus szerepe a koraszülöttek szepszisének kialakulásában. Vizsgálataink célja az volt, hogy egyéb immunmoduláns citokinek, így a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL-10 polimorfizmusainak hatását tanulmányozzuk az infekció, illetve a szepszis kialakulására és progressziójára kissúlyú koraszülöttekben. 2.

A súlyos szisztémás infekció az akut veseelégtelenség (ARF)

kialakulásának egyik fontos kockázati tényezője. A kapcsolat - legalábbis részben – a renális hipoperfúzión keresztül valósul meg. Az állatkísérletes és felnőttekben végzett vizsgálatok adatait extrapolálva felvetődik egyes gyulladásos citokinek, így a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 szerepe. Ezek a fehérjék a glomeruláris endotél és mezangiális sejtek károsításával közvetlenül, a vazoaktív mediátorok (endotelin, prosztaglandinok és a nitrogénmonoxid) révén pedig közvetve is befolyásolhatják a renális hemodinamikát. Vizsgálatunk célja az volt, hogy a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 citokinek polimorfizmusainak szerepét vizsgáljuk a kissúlyú koraszülöttek renális diszfunkciójának kialakulásában.

38

3.

A nekrotizáló enterocolitis (NEC) a gasztrointesztinális traktus súlyos,

életet veszélyeztető megbetegedése, mely VLBW újszülöttek közel 10%-át érinti. A NEC kialakulásának főbb kockázati tényezői a bakteriális kolonozáció, a szepszis, a hipoxia, a hipoperfúzió és intesztinális iszkémia, éretlenség, umbilikális katéterezés és a korai enterális táplálás. Ugyanakkor a NEC pontos patomechanizmusa még ma sem ismert. Korábbi tanulmányok szerint az immunregulációs citokinek (TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10) megváltozott termelése szerepet játszhat a NEC kialakulásában. NEC-es újszülöttek szérumában magasabb TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 és IL-11 szintet mértek. Emellett a gasztrointesztinális rendszer gyulladásos folyamataiban az IL-4 csökkent szintézisét is leírták. NEC-es

újszülötteknél

azonban

a

citokin-gének

funkcionális

polimorfizmusainak esetleges patogenetikai szerepére vonatkozóan nincs irodalmi adat. Vizsgálatunk célja ezért a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6, és IL10 gének polimorfizmusainak a NEC kialakulásában és prognózisában betöltött szerepének vizsgálata volt. 4. Koraszülöttekben megszületéskor a tüdő még nem fejlődött ki teljesen. A tüdő fejlődése során az analikuláris állapotból a szakkuláris állapot kialakulása a 22. gesztációs héten kezdődik, a másodlagos szeptumképződés pedig a 30-32. héten indul meg. A koraszüléshez igen gyakran társul proinflammatórikus állapot [116]. Több vizsgálat is foglalkozott a gyulladás tüdőérést

befolyásoló

és

károsító

hatásával.

Nem

álltak

azonban

rendelkezésre irodalmi adatok a funkcionális citokin polimorfizmusok BPD kialakulását befolyásoló hatásáról. Vizsgálatunk célkitűzése az volt, hogy tanulmányozzuk a funkcionális citokin génpolimorfizmusok összefüggését a mechanikus lélegeztetés és az oxigénszupplementáció idejével.

39

3. Betegek és módszerek A vizsgálatban részt vevő újszülötteket a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati Klinikáján születtek és az ottani, illetve a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekgyógyászati Klinikájának Perinatális Intenzív Centrumaiban kezelték. Vizsgálatunkba 216 VLBW koraszülöttet (születési súly: ≤1500 gramm) vontunk be. A kórtörténet mellett a betegek nevét, valamint születés idejét és helyét is feljegyeztük. A szülők tájékozott beleegyezésüket adták a szűrőpapírra szárított vérminták diagnosztikus és tudományos célú felhasználásához. A vérmintákat a születést követő 5. napon vették le anyagcsere-betegség szűrés céljából, majd a Budai Gyermekkórház PKU laboratóriumában tárolták. A betegek adatait kizárólag arra használtuk, hogy a PKU-laborban tárolt szűrőpapírjait azonosítsuk, a mintákat ezután anonim módon kezeltük; valamennyi minta sorszámot kapott, a további analízis és adatfeldolgozás során ezeket a számokat használtuk a betegek neve helyett. Az anyagcsere-szűrés a megszületést követő 5. napon vagy az oralis táplálás megkezdését követően történik, ezért vizsgálataink retrospektív jellegéből adódóan azok az újszülöttek, akik ezen időpont előtt haltak meg, már nem kerültek be az analízisünkbe A vizsgálati protokollt a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati Klinikájának, az I. sz. Gyermekklinikájának és a Budai Gyermekkórház intézeti etikai bizottsága jóváhagyta (TUKEB engedély száma: 16/2003).

40

3.1.1. A citokin-polimorfizmusok és a neonatális szepszis kapcsolatának

vizsgálatában

részt

vevő

kissúlyú

koraszülöttek 103 igen kissúlyú koraszülött betegségének lefolyását vizsgáltuk az első posztnatális hét alatt. Feljegyeztük a legmagasabb CRP értékeket, a klinikai tüneteket, a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC), szívelégtelenség, akut veseelégtelenség és májelégtelenség esetleges kialakulását. (A többszervi elégtelenség (MOF) diagnózisát akkor állítottuk fel, ha az említett komplikációk közül kettő, vagy annál több is jelen volt.) Az infekció klinikai jeleit és tüneteit – Doellner szerint [117] – hat kategóriába soroltuk: (1) pallor és ikterusz; (2) letargia, apnoe, bradikardia, irritábilitás és idegrendszeri görcsök; (3) tachipnoe és diszpnoe; (4) hipotenzió, tachikardia és a mikrocirkuláció zavara; (5) hányás és hasi disztenzó; (6) láz, illetve hőmérséklet instabilitás. Szepszisben (legalább 1 tünet jelenléte legalább 3 kategóriában és emelkedett (>10 mg/l) CRP értékek) 33 újszülött szenvedett (1. csoport). A hemokultúra 26 újszülöttnél bizonyult pozitívnak, 7 esetben Gram-pozitív, 17 esetben Gram-negatív baktérium, 2 esetben pedig Candida tenyészett ki. 7 újszülöttnél, akik korábban antibiotikum kezelést kaptak, a hemokultúra negatívnak bizonyult, azonban a betegek a szeptikus sokk klinikai jeleit mutatták. A súlyos fertőzésben szenvedő csoportba 35 újszülöttet soroltunk, esetükben emelkedett CRP értékek (>10 mg/l) mellett egy vagy két kategória legalább 1 tünete volt jelen (2. csoport). A kontroll csoportba (legfeljebb egy kategória egyetlen tünetének fennállása és normális CRP értékek) 35 újszülött került, esetükben az első

41

posztnatális hét folyamán nem alakult ki fertőzés (3. csoport). A betegek jellegzetességeit foglalja össze a 3. táblázat.

A betegek száma Gesztációs kor (átlag [szélső értékek]) Születési súly(átlag [szélső értékek]) C-reaktív protein (mg/l) (átlag [szélső értékek]

Szeptikus újszülöttek 1. csoport

Fertőzésban szenvedő újszülöttek 2. csoport

Kontroll újszülöttek 3. csoport

33

35

35

28,6 [24-37]

29,2 [25-34]

29,7 [24-34]

1098 [640 - 1500] 1104 [660 - 1480] 90,1 [16-190]*+

58,2 [13.2-97]*

1143 [760 – 1500] 3,02 [0-9.8]+

Az alábbi kórképekben megbetegedettek száma Disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC),

5*+

0

0

Akut veseelégtelenség

16*

13*

5

Szívelégtelenség

17

12

6

Májelégtelenség

5

1

1

Többszörös szervi elégtelenség

19*

8

2

3.

táblázat.

Klinikai

jellemzők

és

perinatális

komplikációk

előfordulása a vizsgálatban szereplő kissúlyú koraszüköttekben. * p<0,05 összehasonlítva a 3. csoporttal; + p<0,05 összehasonlítva a 2. csoporttal.

42

3.1.2.

A

citokin-polimorfizmusok

veseelégtelenség

vizsgálatában

és részt

az

akut

kissúlyú

koraszülöttek A vizsgálatban részt vevő betegek az alábbi kritériumoknak feletek meg: 1., az első posztnatális hét során akut veseelégtelenség alakult ki náluk; 2., az alábbi, szepszis vagy súlyos infekció kialakulását jelző klinikai tünetek közül legalább két kategória fennált a vizsgált időszakban. A klinikai tüneteket hét kategóriára osztottuk: (1) sápadtság és ikterusz, (2) letargia, aponoe, irritábilitás és görcsök, (3) tachipnoe és diszpnoe, (4) hipotenzió, tachikardia és a mikrocirkuláció zavara; (5) hányás és hasi disztenzó; (6) láz, illetve hőmérséklet instabilitás, (7) 30 mg/l-nél magasabb CRP értékek. Az ARF kritériumait Modi [118] szerint állapítottuk meg: a szérum kreatinin 120 μmol/l és/vagy szérum karbamid 9 mmol/l felett, a diurézis pedig 1,0 ml vizelet/kg alatt. Az oliguria átlagos időtartama 85±27 óra volt. Az ARF-s újszülötteket az oliguria oldódásáig furosemiddel (1 mg/kg) és dopaminnal (0,5-2 μg/kg/perc) kezelték. Az újszülöttek kezelésében teofillint nem alkalmazatak. Egy újszülött szorult peritoneális dialízisre. 120 óra elteltével valamennyi újszülöttnél megszűnt a veseelégtelenség. Az ARF-fel járó, súlyos infekcióban vagy szepszisben szenvedő csoportba 38 újszülöttet soroltuk be, melyek részben azonosak voltak az előbbi vizsgálatban részletezettekkel. Hasonló gesztációs korú és súlyú, szepszisben vagy súlyos infekcióban igen, de ARF-ben nem szenvedő 54 újszülött alkotta a kontroll csoportot. A betegek klinikai jellemzőit és a kockázati tényezők előfordulását mutatja a 4. táblázat.

43

ARF-ben szenvedő újszülöttek A betegek száma

38

Hemokultúrával igazolt 10 szeptikus betegek száma Gesztációs kor 29,0 [25-36] (átlag [szélső értékek]) Születési súly 1181 [680-1500] (átlag [szélső értékek]) A kockázati tényezők előfordulása

Kontroll újszülöttek 54 13 30,3 [24-37] 1251 [970-1500]

Anémia

26

34

Fetalis distressz szindróma

9

9

Intracerebrális vérzés

13

15

Szívelégtelenség Respirációs distressz szindróma A kockázati tényezők fajlagos száma / beteg (átlag [szélső értékek])

13

15

20

18

2,4 [0-5]*

1,7 [0-5]

4. táblázat. A vizsgált betegek klinikai jellemzői és a kockázati tényezők előfordulása (*p<0,05). Bár az anémia, az intracerebrális vérzés, a szívelégtelenség és a respirációs distressz prevalenciája nem különbözött szignifikánsan a két csoportban, a kockázati tényezők „fajlagos száma” nagyobb volt a veseelégtelenségben is szenvedők között. A vizsgálatban részt vevő valamennyi újszülött túlélt a 10. napig. Később, az ARF-es csoportból 7-en, a nem ARF -es csoportból 6 meghaltak szepszis (n=11) vagy intracerebrális vérzés (n=2) miatt. Az ARF egyetlen esetben sem volt halálok.

44

3. 1. 3. A citokin-polimorfizmusok és a nekrotizáló enterocolitis vizsgálatában részt vevő kissúlyú koraszülöttek Vizsgálatunkban 136, 1500 grammnál kisebb születési súlyú kissúlyú koraszülött adatait elemeztük. A NEC-es és a kontroll újszülött csoport nem különbözött a gesztációs kor, a születési súly és az Apgar értékek tekintetében (gesztációs kor: 28,9±3,3 vs 29,6±2,6 hét; születési súly: 1102±259 vs 1170±240 gramm; az Apgar-értékek az 1. és az 5. percben: 5,5±2,1 és 7,6±1,8 vs 5,6±2,2 és 7,8±1,5). Feljegyeztük a betegekben fellépő egyéb

kórképek,

szívelégtelenség,

így anémia,

a

szepszis, intrauterin

bronchopulmonáris infekció,

diszplázia,

respirációs

distressz

szindróma, nyitott Botallo-vezeték, intrakraniális vérzés, pneumónia és hiperbilirubinémia

kialakulását

is.

Adatbázisunkban

46

újszülöttnél

diagnosztizáltak NEC-et. A Bell- szerinti osztályozás [119] alapján 17 újszülöttnek volt I. stádiumú (hasi disztenzió, véres széklet) NEC-je, 21 újszülöttnek volt II. stádiumú (intesztinális pneumatózis) NEC-je és 8 újszülöttnek volt bélperforációval járó III. stádiumú NEC-je. A kontrollként kiválasztott koraszülötteknek nem szenvedtek nekrotizáló enterocolitisben. A betegek klinikai jellegzetességeit foglalja össze az 5.táblázat.

45

Szepszis

NEC-es újszülöttek n=46 16*

Kontroll újszülöttek n=90 17

Bronchopulmonáris diszplázia Szívelégtelenség

8*

3

20*

22

Anémia

35

55

Intrauterin infekció

19

29

Respirációs distressz szindróma Nyitott Botallo-vezeték

23

38

20

29

Intrakraniális vérzés

12

28

Pneumónia

8

26

Hiperbilirubinémia

23

59

5. táblázat. A vizsgált betegek klinikai jellemzői és a kockázati tényezők előfordulása (*p<0,05).

46

3.1.4. A citokin polimorfizmusok és a lélegeztetés kapcsolatának

vizsgálatában

részt

vevő

kissúlyú

koraszülöttek Vizsgálatunkba 123 VLBW újszülöttet vontunk be. A betegcsoport (59 fiú és 64 lány) heterogén volt a születési súly (medián [range]: 1200 [640-1500] gramm), gesztációs kor (30 [24-36] hét), valamint a perinatális komplikációk (PDA: 46/123; légzési distressz szindróma: 59/123; szepszis: 30/133; tüdőgyulladás: 38/123; nekrotizáló enterocolitis: 41/123), a mechanikai lélegeztetés időtartama (2 [0-80] nap) és az oxigénszupplementáció ideje (10 [0-83] nap) jelenlétében. 24 beteg nem igényelt oxigén-szupplementációt; 41 beteg nem igényelt mechanikai lélegeztetést. 26 betegben alakult ki bronchopulmonáris diszplázia.

47

3.2. Módszerek A genotípus meghatározása A minták hemoglobin-tartalmát [120] hővel denaturáltuk. Az előkezelés menete: 50 μl-es PCR végtérfogat esetén a reakció összetevőiből 45 μl-t a csőbe mértünk, majd egy 2.5 mm átmérőjű darab szűrőpapírt tettünk a csőbe. A csipeszt minden szőrópapír után 96%-os alkohollal lemostuk, majd szárazra töröltük. A csöveket ezután lecentrifugáltuk, majd 99,9°C-on 2 percig, ezt követően három cikluson keresztül 55°C-on majd 99,9°C-on, végül 25°C-on hét percig inkubáltuk. A vizsgált génpolimorfizmusokat a részletezett primerek és amplifikációs protokollok felhasználásával határoztuk meg: 6. táblázat. A PCR reakció-elegy összetétele 50 μl végtérfogatra: 25 pmol a 6. táblázatban jelzett primerekből, 0.2 mmol/l dNTP, 1.5 mmol/l MgCl2, valamint 2 U Promega Taq polimeráz. A csövek tetejére 2 csepp PCR olajat tettünk, majd lezártuk őket és a 6. táblázatban jelzett programot indítottuk. Az amplifikált DNS-t 3%-os agaróz gélen, etidium-bromid festéssel vizualizáltuk.

48

6. táblázat. A genetikai polimorfizmusok vizsgálatára alkalmazott PCR módszerek protokollja.

49 Taq I

Msp I

Nla III

Ear I

IL-4R 1902*A: 107+16 IL-4R 1902*G: 89+18+16

IL-6 – 174*G: 302 IL-6 – 174*C: 134+111+57 IL-10 –1082*G: 295 IL-10 –1082*A: 275+20

Interleukin-4 receptor gén alfa lánc

Interleukin-6

Interleukin-10 promoter

Msp I

E1 (3954C): 135+114 E2 (3954T): 249

TNF-238*G: 152 TNF-238*A: 132+20

TNF-alfa promoter -238

Nco I

Interleukin-1 béta exon 5

TNF-308*G: 220 TNF-308*A: 202+18

TNF-alfa promoter –308 5'- AAT AGG TTT TGA GGG CCA TG- 3'

♦

Sense

94º, 0,5 min 55º,1 min 72º,1 min 35

94º, 0,5 min 62º, 0,75 min 72º, 1 min 35

94º, 0,5 min 55º, 0,5 min 72º, 1 min 40

5'- TTA CCT ATC CCT ACT TCC TC -3'

5' - GCC TCA GAG ACA TCT CCA GTC C -3'

5'-GCC TTG TAA CCA GCC TCT CCT-3'

5' - GTT GTC 94º, 0,5 min ATC AGA 55º, 0,5 min CTT TGA CC - 3' 72º, 0,5 min 30

5'- AGA AGA 94º, 0,16 min CCC CCC 55º, 1 min TCG GAA CC- 3' 72º, 0,5 min 35

94º, 0,16 min 55º, 1 min 72º, 0,5 min 35

A hasított Emésztés PCR kondíciók ♦ termékek mérete (Enzim) Denaturáció (bp) Annealing Extenzió Ciklusszám Fokozott TNF-alfa termelés A jelenlétében

5'- GTC AGT GTT CCT CCC AGT -3'

5' - TTG TCA AGA CAT GCC AAG TGC T -5'

5'-GCC CCC ACC AGT GGC TAC C-3'

5'- TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA - 3'

Kis IL-10 termelődés A jelenlétében

-1082

-174

1902

Fokozott szignáltranszdukció G jelenlétében Kis IL-6 termelődés C jelenlétében

Exon 5, 3954-es helyzet

Egyetlen bázis: G→A

Egyetlen bázis: G→C

Egyetlen bázis: A→G

Egyetlen bázis: C→T

Egyetlen bázis: G→A

-238

Magasabb IL-1 béta termelődés T jelenlétében

Egyetlen bázis: G→A

A polimorfizmus típusa

–308

A poliA polimorfizmus morfizmus hatása helye

Csökkent 5'- ATC TGG AGG AAG (?) TNF-alfa termelés CGG TAG TG- 3' A jelenlétében

5'- ATC TGG AGG AAG CGG TAG TG- 3'

PCR primer Antisense

3.3. Statisztikai elemzés 3.3.1. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszisének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások A PCR vizsgálatok eredményei alapján kiszámoltuk a gén-változatok allélfrekvenciáit. ugyancsak

A

vizsgált

vizsgáltuk

polimorfizmusok

tekintetbe

véve

a

együttes

hordozását

szepszishez

társuló

szövődményeket, CRP értékeket és a hemokultúrából kitenyészett kórokozókat. A születési súlyt, gesztációs kort és a CRP értékeket Kruskall-Wallis teszttel hasonlítottuk össze. A post hoc összehasonlításokat Holm-teszttel végeztük. A diszkrét változókat (a génvariánsok hordozása, kockázati tényezők megléte) χ2 próbával vagy Fisher-egzakt teszttel vizsgáltuk. A szignifikancia határa p<0,05 volt.

3.3.2. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelenségének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások A gyulladásos citokinek hatásának vizsgálatakor allélfrekvenciát és allélhordozást számoltunk. A születési súlyt, a gesztációs kort és a kockázati tényezők átlagos számát Mann-Whitney próbával hasonlítottuk össze. A kategórikus adatokat (allélfrekvencia, rizikófaktorok) χ2-próbával vagy Fisher-egzakt teszttel hasonlítottuk össze. Az I. fajú hiba csökkentése érdekében az allél-konstellációk vizsgálatakor Holm-féle poszt hoc tesztet alkalmaztunk. Logisztikus regresszióanalízis segítségével vizsgáltuk az

50

egyes allélvariáns-kombinációk független hatását az ARF kialakulására, figyelembe véve a rizikófaktorok meglétét.

3.3.3. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitisének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások A polimorfizmus-vizsgálatok eredményei alapján allélfrekvenciát számoltunk. A születési súlyt és a gesztációs kort Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a NEC-es és kontroll újszülötteket. A diszkrét változókat (allélfrekvencia, allélek együttes előfordulása) χ2 teszttel vagy Fisher-egzakt próbával hasonlítottuk össze. Logisztikus regresszióanalízist alkalmaztunk a vizsgált génvariánsok NEC kialakulására kifejtett független hatásának vizsgálatára, figyelembe véve a szepszis, a szívelégtelenség és a bronchopulmonáris diszplázia fennállását is. A szignifikancia határa p<0,05 volt.

3.3.4. A polimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek lélegeztetésének vizsgálatakor alkalmazott statisztikai eljárások A vizsgált genotípusok és az oxigénszupplementáció, mechanikai lélegeztetés és a bronchopulmonáris diszplázia közötti kapcsolatot χ2teszttel vizsgáltuk. A logisztikus regresszióanalízis során a gesztációs korra és a perinatális szövődmények jelenlétére adjusztáltuk az összefüggést. Ezután a gépi lélegeztetett (n=81) és oxigénszupplementációban részesülő (n=99)

újszülöttek

esetében

a

51

gépi

lélegeztetés

és

az

oxigénszupplementáció időtartamát log-transzformáltuk, majd az így normalizált értékekkel elemeztük a genotípusok és a lélegeztetés összefüggését. Stepwise többszörös regresszióanalízist használtunk a gesztációs kor, a genotípusok és a perinatális komplikációk, mint független változók

és

az

oxigén

szupplementáció,

összefüggésének vizsgálatára.

4. Eredmények

52

mint

függő

változó

4. 1. Citokinpolimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek szepszise A vizsgált allélok esetén teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. A TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL-10 kódoló gének polimorfizmusainak gyakorisága nem különbözött a 3 csoport között (7. táblázat). Szeptikus újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma (a mutáns allél gyakorisága)

Fertőzésben szenvedő újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma (a mutáns allél gyakorisága)

Kontroll újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma (a mutáns allél gyakorisága)

Betegek száma

33

35

35

TNF-α G-308A

25/08/00 (0,121)

28/07/00 (0,100)

28/06/00 (0,086)

TNF-α G-238A

33/00/00 (0,000)

32/03/00 (0,043)

31/04/00 (0,057)

20/11/02 (0,227)

20/13/02 (0,243)

21/12/02 (0,229)

45/23/06 (0,227)

22/12/01 (0,200)

25/09/01 (0,157)

18/13/02 (0,257)

15/14/06 (0,371)

18/15/01 (0,243)

06/17/10 (0,561)

09/20/06 (0,457)

10/20/05 (0,428)

interleukin-1β C3954T interleukin-4 receptor α-lánc A1902G interleukin-6 G-174C interleukin-10 G-1082A

7. táblázat. A TNF-α-t, IL-1β-t, IL-4 ra-t, IL-6-ot és IL-10-et kódoló gének polimorfizmusainak gyakorisága. Rövidítések: V: vad típus; M: mutáns allél. A vizsgált génvariánsok előfordulási gyakorisága hasonló az egészséges populációban mérhető megoszláshoz. A szepszisben megbetegedettek

53

esetében nem volt gyakoribb a genetikai polimorfizmusok együttes hordozása sem. A szeptikus csoportban nem tudtunk összefüggést kimutatni a génvariánsok és a hemokultúrából kitenyészett mikroorganizmusok típusa között. Nem találtunk kapcsolatot a szívelégtelenség, az akut veseelégtelenség és a májelégtelenség

kialakulása,

valamint

a

vizsgált

polimorfizmusok

hordozása között. Az öt DIC-es beteg közül viszont négy újszülött egyszerre hordozta az IL-1β és az IL-10 gének polimorf variánsait.

4.2. Citokinpolimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek akut veseelégtelensége A vizsgált allélok esetén teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. A TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 allélek előfordulási gyakoriságát mutatja a 8. táblázat. A két csoport az allélfrekvenciák tekintetében nem különbözött egymástól. A TNF-α x IL-6 variánsok együttes előfordulása azonban magasabb volt az ARF-es újszülöttek között (26% vs 6%, p<0,01). Hasonló különbséget tapasztaltunk a TNFα x IL-10 „konstelláció” esetében (34% vs 13%, p<0,05), 9. táblázat. Az ARF-es újszülöttek közül 7-es, a kontroll újszülöttek közül pedig 3-an hordozták egyszerre a mutáns TNF-α, IL-6 és IL-10 variánsokat (p=0,09), 9. táblázat. Az akut veseelégteleség lefolyása és súlyossága azonos volt a mutáns és a vad allélt hordozók között.

ARF-es újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma

54

Kontroll újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma

(a mutáns allél gyakorisága) 38

(a mutáns allél gyakorisága) 54

25/13/00 (0,171)

44/10/00 (0,093)

26/08/04 (0,211)

30/20/04 (0,259)

interleukin-6 G-174C

19/15/04 (0,303)

28/21/05 (0,287)

interleukin-10 G-1082A

08/23/07 (0,526)

12/26/16 (0,537)

Betegek száma TNF-α G-308A interleukin-1β C3954T

8. táblázat. A TNF-α-t, IL-1β-t, IL-6-ot és IL-10-et kódoló gének polimorfizmusainak gyakorisága. Rövidítések: V: vad típus; M: mutáns allél.

55

A mutációk együttes előfordulása ARF-ben szenvedő újszülöttekben (a betegek száma (%))

A mutációk együttes előfordulása ARF-ben kontroll újszülöttekben (a betegek száma (%))

A betegek száma

38

54

TNF-α 308 x IL-1β

4 (11%)

3 (5%)

TNF-α 308 x IL-6

10 (26%)

3 (6%)*

TNF-α 308 x IL-10

13 (34%)

7 (13%)

IL-1-β x IL-6

8 (21%)

12 (21%)

IL-1-β x IL-10

7 (18%)

17 (30%)

IL-10 x IL-6

14 (36%)

20 (36%)

9. táblázat. A TNF-α, IL-1 β, IL-6, IL-10 genetikai variánsok együttes előfordulása ARF-ben szenvedő és kontroll újszülöttekben * p<0,005, odds ratio: 6,1 [95% konfidencia intervallum: 1,5 – 23,9]

4.3. Citokinpolimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek nekrotizáló enterocolitise A vizsgált allélok esetén teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. A TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL-10 citokineket kódoló gének polimorfizmusainak eloszlását mutatja a 10. táblázat. Az TNF-α, IL-1β, IL6 és IL-10 génvariánsok tekintetében nem találtunk különbséget a két betegcsoport között.

56

A NEC-es újszülöttek csoportjában ritkább volt az IL-4 ra gén polimorf variánsának a hordozása (0,224 vs 0,125, OR: 2,51, 95%-os konfidencia intervallum: 1,11-5,69). Kontroll újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma (a mutáns allél gyakorisága)

NEC-es újszülöttek: a VV/VM/MM genotípusú újszülöttek száma (a mutáns allél gyakorisága)

A betegek száma

90

46

TNF-α G-308A

72/18/00 (0,1)

35/11/00 (0,12)

TNF-α G-238A

83/06/01 (0,04)

43/03/00 (0,03)

interleukin-1β C3954T

52/31/07 (0,25)

28/14/04 (0,229)

53/30/07 (0,224)

36/10/00 (0,125)*

48/38/04 (0,255)

19/24/03 (0,315)

22/50/18 (0,477)

07/24/15 (0,562)

interleukin-4 receptor α-lánc A1902G interleukin-6 G-174C interleukin-10 G-1082A

10. táblázat. A TNF-α-t, IL-1β-t, IL-4 ra-t, IL-6-ot és IL-10-et kódoló gének polimorfizmusainak gyakorisága. Rövidítések: V: vad típus; M: mutáns allél; *p<0,05. A

szepszis,

bronchopulmonáris

diszplázia

és

a

szívelégtelenség

kialakulását a NEC kockázati tényezőinek tekintettük. Az IL-4 ra mutáns allélja esetében az OR 0,37 (0.13-0.97) volt. Nem találtunk különbséget a két csoport között a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 allélok előfordulásában. Ezek a genetikai változatok a NEC rizikófaktorainak figyelembe vétele mellett sem voltak összefüggésben a betegség kialakulásával.

57

Az egyes génvariánsok együttes hordozása és a NEC kialakulása között nem találtunk kapcsolatot.

4.4. Citokinpolimorfizmusok és a kissúlyú koraszülöttek lélegeztetésének összefüggései A vizsgált allélok esetén teljesült a Hardy-Weinberg egyensúly. A TNF-α -308A allél prevalenciája 0,12, az IL-1β 3954T prevalenciája 0,23, az IL-6 -174C prevalenciája 0,27, az IL-10 -1082A prevalenciája pedig 0,46 volt. Az adatok megfelelnek a magyar referencia értékeknek [121]. Egyik genotípus sem mutatott összefüggést a bronchopulmonáris diszplázia kialakulásával. (Az analizált esetek kis száma miatt azonban további

vizsgálatok

szükségesek

a

polimorfizmusok

és

a

bronchopulmonáris diszplázia kialakulása közötti kapcsolat kizárására.) Az 11. táblázat mutatja a stepwise többszörös regresszióanalízis eredményeit.

tényezők

béta érték P érték

58

Az addícionális lélegeztetés ideje (eβ*24)

A mechanikus lélegeztetés hossza Respirációs distressz 0,967 szindróma Születési súly (1000 g) -0,28

<0,001

63

0,007

46 / (-1000g)

ATNF-α -308A allél megléte

0,004

50

distressz 0,60

0,014

44

0,41

0,020

36

0,0008

39

0,737

Az oxigénszupplementáció teljes hossza Respirációs szindróma Tüdőgyulladás

A TNF-α -308A allél jelenléte 0,48

11. táblázat. A stepwise logisztikus regresszió-analízis eredményei

A TNF-α -308A allélt hordozó betegeket mintegy 40 órával hosszabb ideig lélegeztették (p=0,004), valamint átlagosan 36 órával (p=0,0008) nyújtotta meg az oxigénszupplementáció idejét.

59

5. Megbeszélés 5.1.

A

citokinpolimorfizmusok

és

a

kissúlyú

koraszülöttek szepszisének összefüggései Korábbi vizsgálatok szerint az újszülöttek korai szepszise emelkedett citokin-szintekkel jár együtt (ld. 1.1.1.1. és 1.1.1.2. pontok). A koraszülöttségtől függetlenül szeptikus újszülöttekben valamennyi mért citokin szintje magasabb volt egészséges, illetve olyan újszülöttekkel összehasonlítva, akiknél felmerült a szepszis lehetősége. Atici és mtsai [65] magasabb szérum TNF-α szintet mért szeptikus újszülöttekben. Egy másik vizsgálat [115] szerint a köldökzsinór vér IL-6 koncentrációja igen érzékeny indikátora a koraszülöttek szepszis szindrómájának. A magasabb szérum IL-6 és IL-8 mérésekkel a szepszis diagnózisát meg lehetett erősíteni, vagy ki lehetett zárni [118]. A citokinek szérumszintjében bekövetkező változások, legalábbis részben, genetikailag meghatározottak. Felnőttekben a TNF-α és az IL-1 ra polimorfizmusait összefüggés találtak egyes infekciós megbetegedések kialakulása és kimenetele közt [11,122]. A TNF2 allél előfordulását gyakoribbnak találták szeptikus sokkban megbetegedett, valamint a sokkban meghalt betegek között [11]. Újabb vizsgálatok szerint az IL-6 -174GG genotípus hordozása fokozott szepszis-rizikóval járt együtt koraszülöttekben, valamint VLBW újszülöttekben [123,124]. A vizsgált polimorfizmusok között a TNF-α, IL-1β, IL-6 és az IL-10 allélek variánsai proinflammatórikus irányba tolják el a citokin-kaszkád egyensúlyát; az IL-4 ra pedig az IL-4 antiinflammatórikus hatásait erősíti (lásd 5. táblázat). Mivel a citokinek nem önmagukban, hanem komplex

60

hálózat részeként hatnak, a szeptikus újszülöttek esetében a génvariánsok közötti lehetséges interakciók lehetőségét is megvizsgáltuk. Eredményeink

szerint

a

vizsgált

génvariánsok

előfordulási

gyakorisága szeptikus és nem-szeptikus újszülöttekben nem tér el egymástól. Emellett a vizsgált polimorfizmusok együttes hordozása nem befolyásolta a fertőzés kialakulásának- vagy annak súlyosságának, illetve a vese, máj-, szív- és a többszörös szervi elégtelenség felléptének valószínűségét. Bár a DIC-ben szenvedő betegek igen kis száma miatt nem lehet következtetéseket levonni, mégis érdekes, hogy az öt DIC-es betegből négyen hordozták a mutáns IL-1β és IL-10 allélokat. Nemrégiben megjelent adatok szerint endotoxin kiváltotta sokkban és DIC-ben emelkedett IL-1 [125] és csökkent IL-10 [126] szintet találtak. Felvetődhet annak a lehetősége, hogy az IL-1β és IL-10 genetikai variánsainak hordozása a nagyobb pro- és kisebb anti-inflammatórikus citokintermelő kapacitása révén szerepet játszhat a szepszis talaján kialakuló DIC létrejöttében.

További

vizsgálatok

szükségesek

ezen

genetikai

polimorfizmusok és a DIC kialakulása közötti összefüggés megállapítására. Megfigyeléseinket részben alátámasztják Weitkamp és mtsai eredményei, akik azt találták, hogy a TNF-β NcoI polimorfizmusa -mely fokozza a proinflammatórikus hatást- nem prognosztikus markere a betegség progressziójának a nagy kockázatú újszülöttekben [82]. Eredményeink alapján nem tudjuk megmagyarázni a gyulladásos citokin polimorfizmusok eltérő összefüggését szeptikus újszülöttek és felnőttek

között.

További

vizsgálatok

szükségesek

a

vizsgált

génvariánsoknak aktivált immunrendszer és az interleukin-termelés

61

befolyásolása közötti összefüggés megállapítására kissúlyú koraszülöttek esetében.

5.2.

A

citokinpolimorfizmusok

és

a

kissúlyú

koraszülöttek akut veseelégtelenségének összefüggései Eredményeink szerint a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 allélek variánsainak hordozása hasonló az ARF-es és a kontroll csoportban; tehát egyetlen vizsgált mutáns allél hordozása nem jelent kockázati tényezőt a súlyos fertőzésben szenvedő újszülöttek számára a veseelégtelenség kialakulásának kockázata szempontjából. Ugyanakkor a magas TNF-αtermeléssel és kis IL-6 termeléssel járó genotípusok előfordulása (ahol fokozott pro- és csökkent anti-inflammatórikus citokin-termelő kapacitás alakul ki) gyakoribb volt azoknál az újszülötteknél, akiknél a súlyos infekció talaján alakult ki a veseműködés zavara. Eredményeink alapján feltehető, hogy a genetikai konstelláció fokozhatja a szisztémás, illetve a vesében kialakuló gyulladás mértékét és ezáltal befolyásolhatja az ARF kimenetelét a kissúlyú koraszülöttekben. A szepszis fennállásakor a keringésbe jutó mediátorok, így a citokinek is jelentősen befolyásolják a vesefunkciót nem csak szisztémás, hanem helyi hatásaik révén is. A „vese-specifikus” gyulladásos citokinválasz először a TNF-α elválasztásával kezdődik, ezt az IL-1β követi, majd ezután jelenik meg az anti-inflammatórikus IL-6 (ld. 1.1.1.1. valamint [34]). A

citokin

gének

termelődését

befolyásoló

gészakaszok

polimorfizmusai jelentős mértékben befolyásolhatják a termelődő citokin mennyiségét. A termelődő citokinek pedig befolyásolják a kialakuló helyi, illetve szisztémás immunválasz intenzitását.

62

A

génpolimorfizmusok

összefüggéseit

vesebetegségekkel

kapcsolatban ezidáig főként vesetranszplantációban tanulmányozták. Egyes vizsgálatok szerint a TNF-α, IL-6 és IL-10 polimorfizmusok befolyásolják a graft túlélését [127,128]. A TNF-α polimorfizmus önmagában is befolyásolta a transzplantátum kilökődését. Ha a recipiensek a TNF-α szinttel járó allélt hordozták, prognózis sokkal jobb a fokozott TNF-α termeléssel járó variánshoz képest [129]. Más adatok szerint a donor IL-6 – 174C/C genotípusa önmagában is kockázati tényezőt jelent a graft kilökődésére vonatkozóan (ld 1.1.2.2. fejezet)[130]. A recipiens-donor viszonylatban az IL-4 és az IL-10 genotípusoknak is szerepe lehet a transzplantáció kimenetelében [131]. Ezen adatok szerint a citokin genotípusok befolyásolják a vese gyulladásos folyamatának súlyosságát és a renális hipoperfúzió hosszú távú hatását. Mindkét mechanizmusnak szerepe van a szepszis talaján kialakult ARF-ben. Bár egyes vizsgálatok szerint az immunológiailag aktív mediátorok fontos szerepet töltenek be a szepszisben kialakuló ARF patomechanizmusában, ezidáig nem álltak rendelkezésre adatok arra vonatkozóan, hogy a TNF-α, IL-1β, IL-6 és az IL-10 gének funkcionális polimorfizmusai, [132,133,134,135] melyek a pro- és anti-inflammatórikus citokinek között fennálló egyensúlyt a proinflammatórikus oldal felé tolják el (lásd 5. táblázat), befolyásolják-e az akut veseelégteleség kialakulását súlyos, szisztémás infekcióban szenvedő kissúlyú koraszülöttek esetében. Mivel a citokinek nem önmagukban fejtik ki hatásukat, hanem komplex hálózatot alkotnak, ezért az egyes génvariánsok együttes hordozásának a veseelégtelenség kialakulására kifejtett hatását is megvizsgáltuk. Felvetődik a kérdés, hogy ezen genetikai variánsok hatásukat vajon közvetlenül az ARF kialakulására fejtik ki, vagy inkább a szepszis talaján

63

kialakuló ARF rizikótényezőinek befolyásolása révén. Bár ez a kérdés további vizsgálatot igényel, eredményeink szerint a TNF-α és IL-6 genetikai variánsok együttes jelenléte akkor is szignifikáns összefüggést mutatott az ARF kialakulásával, ha tekintetbe vettük a rizikófaktorok meglétét is, mely arra utal, hogy ezen polimorfizmusok együttállása a neonatális akut veseelégtelenség kialakulása szempontjából független rizikótényezőt jelent.

5.3.

A

citokinpolimorfizmusok

és

a

kissúlyú

koraszülöttek nekrotizáló enterocolitisének összefüggései A rendelkezésre álló adatok szerint a TNF-α, IL-6, IL-10 és IL-1 citokinek szintjei megváltoznak NEC-ben. NEC-es újszülöttek Pannethsejtjeiben, lamina propria eozinofil sejtjeiben és a réteget infiltráló makrofágokban a TNF- α expresszója kifejezettebb volt [136]. A gyulladásos bélbetegségek kialakulásának vizsgálata során már korábban felvetődött a gyulladáskeltő citokinek, ezen belül a TNF-α fokozott termelődésének a lehetősége. Állatkísérletben rekombináns TNF-α hatására a vékonybélben iszkémiás nekrózis alakult ki [137,138]. Szoros összefüggést találtak a gyulladásos bélbetegség súlyossága és a szérum, illetve széklet TNF-α koncentráció között [139]. A köldökzsinórvér IL-6 szintje magasabb volt azon újszülöttek esetében, akiknél a születés után közvetlenül nekrotizáló enterocolitis alakult ki. Egy másik vizsgálatban az anti-inflammatórikus IL-6 és IL-10 citokinek szérumszintje a NEC-es gyulladásos folyamat progressziójával párhuzamosan fokozódott. Viscardi és mtsainak vizsgálatai szerint a TNF-α és az IL-1β szintje a NEC-es újszülöttek bélrezekátumainak teljes vastagságában magasabb,

64

ami felveti ezen citokinek patogenetikai szerepét a helyi gyulladásos folyamat mediálásában [140]. Az IL-4 immunregulációs és anti-inflammatórikus hatású és centrális szerepet tölt be a bél immunológiájában. Gátolja a makrofágok kolóniaképződését, a monociták H2O2 termelését, és egyes gyulladásos mediátorok, így a TNF-α és az IL-1β szintézisét [141,142,143,144,145]. Az intesztinális traktus extenzív gyulladásával járó gyulladásos bélbetegségekben (IBD) az IL-4 meghatározó szerepet tölt be. IBD-s betegekben a gyulladt mukóza IL-4 termelő sejtjeinek száma csökkent. Emellett a gyulladt bélszakasz lamina propriájából izolált mononukleáris sejtjei kevesebb IL-4 mRNS-t tartalmaznak és a citokint is kisebb mennyiségben szekretálják mint a kontroll sejtek. Bár a NEC és az IL-4 kapcsolatáról nem állnak rendelkezésre irodalmi adatok, mégis felvethető ennek a citokinnek a jelentősége a betegség kialakulásában [146,147,148]. Noha megváltozik,

ismert, a

hogy

citokinek

a

NEC-ben termelődését

a

citokinek

szérumszintje

befolyásoló

funkcionális

polimorfizmusoknak a betegség patogenezisében betöltött szerepe eddig nem volt ismert. Eredményeink szerint az IL-4 ra allél variánsa gyakoribb volt a kontroll újszülöttekben a NEC-es betegekhez képest; ami felveti ezen polimorfizmus protektív szerepét a nekrotizáló enterocolitis kialakulásával szemben a kissúlyú koraszülöttek körében. Ezen mutáció az anti-inflammatórikus IL-4 fokozott szignáltranszdukciójával jár (lásd 5. táblázat). Nemrégiben több vizsgálatban is tanulmányozták ezen allélvariáns szerepét IBD-s betegekben. Egy vizsgálatban az IL-4 ra A1902G mutációt ugyanolyan arányban hordozták a Crohn-betegségben szenvedők és a kontrollok [149]; Aithal és mtsai

65

viszont Crohn-betegek között gyakoribbnak találták a polimorf variáns hordozását [150]. Vizsgálatunkban nem találtunk összefüggést az egyéb polimorf variánsok és a NEC patogenezise között. A TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 allélvariánsok előfordulási gyakorisága nem különbözött a NEC-es és a kontroll újszülöttek között. Emellett nem találtunk összefüggést a vizsgált allélek együttes előfordulása és a NEC kialakulása között. Eredményeink szerint tehát ezen polimorfizmusok nem töltenek be meghatározó szerepet a nekrotizáló enterocolitis kialakulásában.

66

5.4.

A

citokinpolimorfizmusok

és

a

kissúlyú

koraszülöttek lélegeztetésének összefüggései Az oxigénszupplementációt igénylő respirációs diszfunkció igen gyakori koraszülöttekben. Az oxigénpótlás a koraszülöttek többségében mindössze néhány napig tart, bizonyos esetekben azonban néhány hétig, vagy akár hónapig is szükség lehet rá. A tüdő krónikus gyulladása (bronchopulmonáris diszplázia) általában a 28. posztnatális napot (vagy a 36. posztkoncepcionális hétet) meghaladó oxigénszupplementáció-igény felléptekor alakul ki. [151]. A súlyos perinatális gyulladással járó állapotok, a koraszülöttség, de még a nem megfelelő lélegeztetés is fokozhatja a gyulladásos citokinek termelődését a tüdőben. A pro- és anti-inflammatórikus citokinek közötti egyensúly megbomlása a neutrofil granulociták aktivációját és migrációját okozza, mely a tüdőszövet destrukciójához vezet [167]. Ezidáig Adcock és munkatársai [152] vizsgálták a bronchopulmonáris diszplázia és a citokin-polimorfizmusok kapcsolatát újszülöttekben. A bronchopulmonáris diszplázia kialakulásának kockázata és a TNF-α G308A allél hordozása között nem találtak kapcsolatot. Jóllehet nem tudtunk kimutatni összefüggést egyetlen genotípus hordozása és a bronchopulmonáris diszplázia kialakulásának kockázata közt, eredményeink szerint azonban a TNF-α G-308A allél hordozása –mely fokozott TNF-α szintekkel jár- befolyásolhatja az arra rászoruló újszülöttek oxigén-szupplementációs igényét. Ez az eredményünk megerősíti a nagy TNF-α szintek korábban leírt, a tüdő patogenezisében betöltött központi szerepét [153]. Érdekes módon eredményeink ellentmondanak a felnőttekben talált adatoknak. Yende és mtsai azt találták, hogy koronária bypass műtét után a

67

kis szérum TNF-α szinttel járó genotípust hordozókban (pl. LT-α

+250

G és

TNF-α -308A allél) hosszabb volt a mechanikai lélegeztetés ideje [154]. Eredményeink alátámasztják azt a feltevést, hogy a TNF-α G-308A polimorfizmusa szerepet játszhat a kissúlyú koraszülöttek mechanikai lélegeztetés-, illetve oxigén szupplementáció igényének befolyásolásában.

68

6. Fontosabb új megállapítások 1. Kissúlyú koraszülöttekben fellépő szepszis vizsgálata során nyert új megállapítások Szeptikus újszülöttekben esetén a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL10 gének funkcionális polimorfizmusainak előfordulási gyakorisága nem tért el a kontroll csoportban, valamint a felnőttekben észlelt gyakoriságtól, így hordozásuk nem jelent fokozott kockázatot. Nem találtunk összefüggést a génvariánsok és a CRP értékek között. Bár a DIC-ben szenvedő betegek igen kis száma miatt nem lehet következtetéseket levonni, mégis érdekes, hogy az öt DIC-es betegből négyen hordozták a mutáns IL-1β és IL-10 allélokat.

2. Súlyos fertőzésben szenvedő, kissúlyú koraszülöttekben fellépő akut veseelégtelenség vizsgálata során nyert új megállapítások Az akut veseelégtelenségben megbetegedett újszülöttek esetén a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL-10 gének funkcionális polimorfizmusainak előfordulási gyakorisága nem tért el a kontroll csoportban, valamint a felnőttekben megállapított gyakoriságtól. A TNF-α x IL-6, illetve a TNF-α x IL-10 variánsok együttes hordozása (mely a fokozott proinflammatórikus válasz felé tolja el a citokin kaszkádot) gyakoribb volt az akut veseelégtelenségben szenvedő újszülöttek közt.

69

3. Kissúlyú koraszülöttekben fellépő nekrotizáló enterocolitis vizsgálata során nyert új megállapítások A nekrotizáló enterocolitisben megbetegedett újszülöttek között ritkább volt az IL-4 ra polimorf variánsának hordozása. A nekrotizáló enterocolitisben megbetegedett újszülöttek esetén a TNF-α,

IL-1β,

IL-6

és

IL-10

gének

funkcionális

polimorfizmusainak előfordulási gyakorisága nem tért el a kontroll csoportban, valamint a felnőttekben megállapított gyakoriságtól.

4. A citokinek és a kissúlyú koraszülöttekben lélegeztetésének vizsgálata során nyert új megállapítások

A TNF-α -308A allélt hordozó betegeket mintegy 40 órával hosszabb ideig lélegeztették. A TNF-α -308A allél hordozása átlagosan 36 órával nyújtotta meg az oxigénszupplementáció idejét.

70

Köszönetnyilvánítás Köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Dr. Vásárhelyi Barnának, akinek vezetése mellett munkámat végezhettem. Tanácsaival irányította

munkámat,

segített

a

kísérletek

megtervezésében,

végrehajtásában és az eredmények publikálásában. Dicsért, ha sikerült a kísérlet és optimizmusával ő nyugtatott, ha az eredmények meglepőnek tűntek. Prof. Tulassay Tivadarnak köszönhetem, hogy PhD munkámat az I.sz Gyermekklinikán végezhettem. Biztosította számomra azt a kutató hátteret, melyben a feltételek adottak voltak a zavartalan munkához. Kutató munkám kezdetén és az alatt irányt mutatott a tudományos kutatói magatartás és gondolkodás elsajátításában. Köszönettel tartozom Dr. Szathmári Miklósnak, aki tudományos pályámon elindított, munkámat mindvégig figyelemmel kísérte és észrevételeivel, tanácsaival segítette. Dr. Szabó Miklós és Dr. Nobilis András igen nagy segítséget nyújtott a klinikai kérdések, problémák adekvát megközelítésében. Dr. Szalai Csabától segítséget kaptam a vizsgálatban alkalmazott módszerek beállításában. Dr. Schuler Ágnes biztosította vizsgálataink számára a PKU szűrőpapírokat. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekklinika Kutató Laborjában dolgozó minden munkatársnak: a PhD hallgatóknak és az asszisztenseknek.

71

Az értekezés témakörében megjelent dolgozatok (impakt faktorokkal)

1. Treszl A, Vásárhelyi B, Tulassay Zs, Szathmári M: A tumor nekrózis faktor-alfa élettana és szerepe egyes betegségek patogenezisében Magyar Belorvosi Archívum 2000; 53: 397-403 2. Treszl A, Kocsis I, Szathmári M, Schuler Á, Tulassay T, Vásárhelyi B: Genetic variants of the tumor necrosis factor-alpha promoter gene do not influence the development of necrotizing enterocolitis Acta Paediatrica 2001; 560:1182-1185. if 2001: 1,582 3. Treszl A, Tóth-Heyn P, Kocsis I, Nobilis A, Schuler Á, Tulassay T, Vásárhelyi B. Interleukin genetic variants and the risk of renal failure in infants with infection. Pediatr Nephrol 2002; 17:713-717 if2002: 1,391 4. Treszl A, Héninger E, Kálmán A, Schuler Á, Tulassay T, Vásárhelyi B: Lower prevalence of IL-4 receptor α-chain gene 1902G variant in very low birth weight infants with necrotizing enterocolitis. J Ped Surg, 2003; 38:1374-1378 if2002: 1,087 5. Treszl A, Kocsis I, Szathmári M, Schuler Á, Héninger E, Tulassay T, Vásárhelyi B : Genetic variants of TNF-α, IL-1β, IL-4 receptor α-chain, IL-6 and IL-10 genes are not risk factors for sepsis in low birth weight infants Biol Neonate 2003;83: 241-245 if2002: 1,072

Az értekezés témakörében megjelent dolgozatok összesített impakt faktora: 5,132 Nem az értekezés témakörében megjelent dolgozatok (2001. évi impakt faktorok) 1. Treszl A, Niethammer M, Tulassay T, Szathmári M: A dehidroepiandroszteron és a dehidroepiandroszteron-szulfát összefüggése a cardiovascularis betegségek előfordulásával és a cardiovascularis kockázati tényezőkkel nőkben. Magyar Belorvosi Archívum, 2000; 53: 41-47. 2. Újhelyi R, Treszl A, Vásárhelyi B, Holics K, Tóth M, Arató A, Tulassay T, Tulassay Zs, Szathmári M: Cystas fibrosisban szenvedő betegek csontsűrűsége és anyagcseréje - követéses vizsgálat. Magyar Belorvosi Archivum, 2001;54:210-216. 3. Nobilis A, Kocsis I, Tóth-Heyn P, Treszl A, Schuler Á, Tulassay T, Vásárhelyi B: Variance of ACE and AT1 receptor gene do not influence the risk of neonatal acute renal failure, Pediatric Nephrology, 2001;16:1063-1066. if2001: 1,391 4. Szathmári M, Vásárhelyi B, Treszl A, Tulassay T, Tulassay Zs: Association of dehydroepiandrosterone-sulphate and testosterone deficiency with bone turnover in men with inflammatory bowel disease. Int J Colorect Dis 2002;17:63-66 if2001: 1,709 5. Héninger E, Treszl A, Kocsis I, Dérfalvi B, Tulassay T, Vásárhelyi B. Genetic variants of the interleukin-18 promoter region (-607) influence the course of

72

necrotising enterocolitis in very low birth weight neonates. Eur J Pediatr 2002; 161:410-411 if2001: 1,22 6. Krikovszky D, Vásárhelyi B, Treszl A, Körner A, Tordai A, Tulassay T, Madácsy L: Genetic polymorphism of interleukin-1beta is associated with risk of type 1 diabetes mellitus in children, Eur J Ped, 2002;161:507-508. if2001: 2,44 7. Fekete A, Treszl A, Tóth-Heyn P, Vannay Á, Tordai A, Tulassay T, Vásárhelyi B. Association between heat shock protein 72 gene polymorphism and acute renal failure in premature neonates. Pediatr Res. 2003; 54: 452-5 if2001: 3,289 8. Treszl A, Szabó M, Dunai Gy, Nobilis A, Machay T, Tulassay T, Vásárhelyi B: Angiotensin II type 1 receptor A1166C polymorphism and prophylactic indomethacin treatment induced ductus arteriosus (DA) closure in very low birth weight neonates. Ped Res 2003; 54: 753-5 if2001: 3,289 9. Szathmári M, Treszl A, Vásárhelyi B: Left ventricular mass index and ventricular septum thickness are associated with serum dehydroepiandrosterone-sulphate (DHEAS) levels in hypertensive women, Clin Endocrinol (Oxf). 2003; 59:110-4. if2001: 2,465 10. Nagy A, Kozma GT, Keszei M, Treszl A, Falus A, Szalai C. The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. J Allergy Clin Immunol. 2003; 112: 729-34 if2002: 6,282 11. Vásárhelyi B, Bencsik P, Treszl A, Bardóczy Z, Tulassay T, Szathmári M. The effect of physiologic hyperinsulinemia during an oral glucose tolerance test on the levels of dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfate (DHEAS) in healthy young adults born with low and with normal birth weight. Endocr J. 2003;50: 68995. if: 0,847 12. Újhelyi R, Treszl A, Vásárhelyi B, Holics K, Tóth M, Arató A, Tulassay T, Tulassay Z, Szathmári M. Bone Mineral Density and Bone Acquisition in Children and Young Adults with Cystic Fibrosis: A Follow-up Study. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2004;38:401-406 if: 2,078

Nem az értekezés témakörében megjelent dolgozatok összesített impakt faktora: 25,01 A PhD ösztöndíj ideje alatt megjelent dolgozatok összesített impakt faktora: 30,142

73

Összefoglalás Bevezetés: A koraszülöttség miatt funkcionálisan éretlen szervezet fokozottan hajlamos a perinatális szövődményekre. Emiatt magas az éretlen, kissúlyú koraszülöttek morbiditása és mortalitása. A nagyon kis születési súlyú (<1500 gramm) koraszülött (VLBW) populáció felelős az össz-perinatális mortalitás 70%-áért. Az életben maradó újszülöttek 40%ában pedig kései szövődmények alakulnak ki. A VLBW koraszülöttek esetében a szepszis, az akut veseelégtelenség, a nekrotizáló enterocolitis, a bronhopulmonális diszplázia a leggyakoribb perinatális megbetegedések közé tartoznak. A legutóbbi évek eredményei alapján nyilvánvalóvá vált, hogy a citokin-kaszkád funkciója koraszülöttekben zavart, részben a populáció éretlensége miatt. Célkitűzés: Vizsgálataim során arra kerestem választ, hogy a citokin kaszkád genetikai polimorfizmusoknak van-e patogenetikai jelentősége VLBW koraszülöttek perinatális szövődményeinek kialakulásában. Módszerek: A Semmelweis Egyetem II.sz. Nőgyógyászati Klinikájának Perinatális Intenzív Centrumában kezelt koraszülöttek fenilketonuria szűrésre levett vérmintáiból polimeráz láncreakció és restrikciós hosszúság polimorfizmus módszerrel meghatároztam a vizsgált allélek genotípusát. Eredmények: Vizsgálataim során megállapítottam, hogy a szeptikus kissúlyú koraszülöttekben a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α), interleukin-1 béta (IL-1β), interleukin-4 receptor alfa lánc (IL-4 ra), interleukin-6 (IL-6) és interleukin-10 (IL-10) gének funkcionális polimorfizmusainak előfordulási gyakorisága nem tért el a kontroll csoporttól, valamint a felnőttekben megállapított gyakoriságtól. Az akut veseelégtelenségben megbetegedett újszülöttek esetén a TNF-α, IL-1β, IL-4 ra, IL-6 és IL-10 gének funkcionális polimorfizmusainak előfordulási gyakorisága nem tért el a kontroll csoportban, valamint a felnőttekben megállapított gyakoriságtól. A TNF-α x IL-6, illetve a TNF-α x IL-10 variánsok együttes hordozása azonban gyakoribb volt az akut veseelégtelenségben szenvedő újszülöttek közt. A TNF-α x IL-6, illetve a TNF-α x IL-10 variánsok együttes hordozása összefüggést mutatott az IRDS és az akut veseelégtelenség rizikófaktorainak kialakulásával. A nekrotizáló enterocolitisben megbetegedett újszülöttek között ritkább volt az IL-4 ra polimorf variánsának hordozása. A nekrotizáló enterocolitisben megbetegedett újszülöttek esetén a TNF-α, IL-1β, IL-6 és IL-10 gének funkcionális polimorfizmusainak előfordulási gyakorisága nem tért el a kontroll csoportban, valamint a felnőttekben megállapított gyakoriságtól. a TNF-α 308A allélt hordozó betegeket mintegy 40 órával hosszabb ideig lélegeztették, valamint átlagosan 36 órával nyújtotta meg az oxigénszupplementáció idejét.

74

Summary Introduction: Preterm neonates have an increased predisposition for the development of complications because of immaturity. The most common perinatal complications in neonates with very low birth weight (birth weight ≤ 1500 gram, VLBW) are sepsis, acute renal failure (ARF), necrotizing enterocolitis (NEC) and bronchopulmonary dysplasia (BPD). Lately, it has been shown that functional imbalances of the inflammatory system play a crucial role in the pathogenesis of the diseases above and in the development of the subsequent complications. The cytokine cascade plays a central role in the regulation of the effectivity and intensity of the immune response. Based on the research carried out in the last several years it is now evident that the function of the cytokine cascade is disturbed in children with very low birth weight, partly because of the immaturity of this population, because of the therapy applied, and partly because of the infections. Aims: The aim of our study was to investigate the role of functional polymorphisms of the cytokine cascade in the development of perinatal complications in VLBW neonates. Methods: DNA was extracted from blood spots taken for metabolic screening. Allele specific primers and restriction endonucleases were used to study the polymorphisms. Results: The measured frequencies of TNF-α, IL-1β, IL-6 of IL-10 alleles did not differ between ARF and non-ARF groups and corresponded to those in healthy reference populations. The presence of at least one polymorphic allele at both the TNF-α and IL-6/IL-10 however, was more often found in ARF than in non-ARF babies (26% vs. 6%,). The prevalence of the studied genetic variants did not differ between septic and healthy groups. Prevalence of alleles investigated was similar to frequencies measured in healthy populations. The prevalence and number of carriers of IL-4 receptor alpha chain mutant variants were lower in the NEC group. The presence of sepsis, bronchopulmonary dysplasia, and heart failure were identified as independent risk factors for the development of NEC. The adjusted odds ratio for NEC was 0.37 (95% confidence interval: 0.13 to 0.97) in the case of IL-4 receptor alpha chain mutant variant. The carrier state of the TNF-α -308A allele was associated with a 40-hour longer period of mechanical ventilation and with an additional 36 hours of oxygen supplementation on average.

75

Irodalomjegyzék 1 Hack M, Flannery DJ, Schluchter M, Cartar L, Borawski E, Klein N. Outcomes in young adulthood for very-low-birth-weight infants. N Engl J Med. 2002;346:149-157. 2 Lewis DB, Wilson CB: Developmental immunology and role of host defenses in neonatal susceptibility to infection; in Remington JS, Klein JO (eds): Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, ed 4. Philadelphia, Saunders, 1995, pp 2099. 3 Stapleton FB, Jones DP, Green RS. Acute renal failure in neonates: incidence, etiology and outcome. Pediatr Nephrol. 1987;1:314-320. 4 Walther FJ, Verloove-Vanhorick SP, Brand R, Ruys JH. A prospective survey of necrotising enterocolitis in very low birthweight infants. Paediatr Perinat Epidemiol. 1989 ;3:53-61. 5 Evans N, Moorcraft J. Effect of patency of the ductus arteriosus on blood pressure in very preterm infants. Arch Dis Child. 1992;67:1169-1173. 6 De Dooy JJ, Mahieu LM, Van Bever HP. The role of inflammation in the development of chronic lung disease in neonates. Eur J Pediatr. 2001; 160 : 457-463 7 Flynn JT. Retinopathy of prematurity: perspective for the nineties. Acta Ophthalmol Scand Suppl. 1995;214:12-14; discussion 14-16. 8 Ward RM, Beachy JC. Neonatal complications following preterm birth. BJOG. 2003;110 Suppl 20:8-16. 9 Goldman S, Ellis R, Dhar V, Cairo MS. Rationale and potential use of cytokines in the prevention and treatment of neonatal sepsis. Clin Perinatol. 1998;25:699-710. 10 Baier RJ, Loggins J, Kruger TE. Interleukin-4 and 13 concentrations in infants at risk to develop Bronchopulmonary Dysplasia. BMC Pediatr. 2003; 3:8. 11 Mira JP, Cariou A, Grall F, Delclaux C, Losser MR, Heshmati F, Cheval C, Monchi M, Teboul JL, Riche F, Leleu G, Arbibe L, Mignon A, Delpech M, Dhainaut JF. Association of TNF2, a TNF-alpha promoter polymorphism, with septic shock susceptibility and mortality: a multicenter study. JAMA. 1999;282:561-568. 12 Demeter J, Messer G, Rajczy K, Patscht K, Penzes M, Kenez A. Polymorphism of TNF-alpha, LT-alpha, the IL-6 promoter and the IL-1 receptor antagonist at the DNA level in a Hungarian population and the relation to infectious, autoimmune and malignant diseases. Magy Belorv Arch 2000; 53: 185–193 13 Garssen J, Vandebriel RJ, van Loveren H. Molecular aspects of UVB-induced

76

immunosuppression. Arch Toxicol Suppl. 1997;19:97-109. 14 Heck DE, Gerecke DR, Vetrano AM, Laskin JD. Solar ultraviolet radiation as a trigger of cell signal transduction. Toxicol Appl Pharmacol. 2004;195:288-297 15 Dinarello CA. Proinflammatory cytokines. Chest. 2000;118:503-508. 16 Opal SM, DePalo VA. Anti-inflammatory cytokines. Chest. 2000;117:1162-1172. 17 Cavaillon JM. Pro- versus anti-inflammatory cytokines: myth or reality. Cell Mol Biol. 2001;47:695-702. 18 Zheng C, Huang DR, Bergenbrant S, Sundblad A, Osterborg A, Bjorkholm M, Holm G, Yi Q. Interleukin 6, tumour necrosis factor alpha, interleukin 1beta and interleukin 1 receptor antagonist promoter or coding gene polymorphisms in multiple myeloma. Br J Haematol. 2000;109:39-45. 19 Reich K, Westphal G, Konig IR, Mossner R, Schupp P, Gutgesell C, Hallier E, Ziegler A, Neumann C. Cytokine gene polymorphisms in atopic dermatitis. Br J Dermatol. 2003;148:1237-1241. 20 Kube D, Mormann M, Tomiuk J, Rieth H, Hua TD, Kremsner PG, Vockerodt M. Simultaneous analysis of interleukin-10 gene microsatellites and single-nucleotide polymorphisms in parallel with tumour necrosis factor and interferon-gamma short tandem repeats by fluorescence-based polymerase chain reaction. Genes Immun. 2003;4:459-468. 21 Dinarello CA. Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor antagonist. Int Rev Immunol. 1998;16:457-499. 22 Moos V, Rudwaleit M, Herzog V, Hohlig K, Sieper J, Muller B. Association of genotypes affecting the expression of interleukin-1beta or interleukin-1 receptor antagonist with osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2000;43:2417-2422. 23 Witkin SS, Vardhana S, Yih M, Doh K, Bongiovanni AM, Gerber S. Polymorphism in intron 2 of the fetal interleukin-1 receptor antagonist genotype influences midtrimester amniotic fluid concentrations of interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist and pregnancy outcome. Am J Obstet Gynecol. 2003;189:14131417. 24 Saji F, Samejima Y, Kamiura S, Sawai K, Shimoya K, Kimura T. Cytokine production in chorioamnionitis. J Reprod Immunol. 2000;47:185-196. 25 Tocci MJ. Structure and function of interleukin-1 beta converting enzyme. Vitam Horm. 1997;53:27-63.

77

26 Dayer JM. Evidence for the biological modulation of IL-1 activity: the role of IL1Ra. Clin Exp Rheumatol. 2002;20(5 Suppl 27):S14-20 27 Dinarello CA. Interleukin-1. Cytokine Growth Factor Rev. 1997;8:253-265 28 Dinarello CA The biological properties of interleukin-1. Eur Cytokine Netw. 1994;5:517-531. 29 Dinarello CA. The IL-1 family and inflammatory diseases. Clin Exp Rheumatol. 2002;20(5 Suppl 27):S1-13. 30 Johannesen J, Karlsen AE, Nerup J, Pociot F. No association or linkage to IDDM of an interferon regulatory factor-1 gene polymorphism in a Danish population. The Danish Study Group for Diabetes in Childhood. Eur J Immunogenet. 1997;24:377-383. 31 Dubois MJ, Vincent JL. Clinically-oriented therapies in sepsis: a review. J Endotoxin Res. 2000;6:463-469. 32 Cominelli F, Pizarro TT. Interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 1996;10 Suppl 2:49-53; discussion 54. 33 Kurzrock R, Wetzler M, Estrov Z, Talpaz M. Interleukin-1 and its inhibitors: a biologic and therapeutic model for the role of growth regulatory factors in leukemias. Cytokines Mol Ther. 1995;1:177-184. 34 Sjoholm A. Aspects of the involvement of interleukin-1 and nitric oxide in the pathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus. Cell Death Differ. 1998;5:461-468. 35 Berner R, Welter P, Brandis M. Cytokine expression of cord and adult blood mononuclear cells in response to Streptococcus agalactiae. Pediatr Res. 2002;51:304309. 36 Mariano F, Guida G, Donati D, Tetta C, Cavalli PL, Verzetti G, Piccoli G, Camussi G. Production of platelet-activating factor in patients with sepsis-associated acute renal failure. Nephrol Dial Transplant. 1999;14:1150-1157. 37 Viscardi RM, Lyon NH, Sun CC, Hebel JR, Hasday JD. Inflammatory cytokine mRNAs in surgical specimens of necrotizing enterocolitis and normal newborn intestine. Pediatr Pathol Lab Med. 1997;17:547-559. 38 Kazzi SN, Romero R, McLaughlin K, Ager J, Janisse J. Serial changes in levels of IL-6 and IL-1beta in premature infants at risk for bronchopulmonary dysplasia. Serial changes in levels of IL-6 and IL-1beta in premature infants at risk for bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 2001;31:220-226.

78

39 Old LJ. Tumor necrosis factor (TNF). Science. 1985 ;230:630-632. 40 Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I, Lu SD. A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell. 1988;53:45-53. 41 Wilson AG, di Giovine FS, Blakemore AI, Duff GW. Single base polymorphism in the human tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) gene detectable by NcoI restriction of PCR product. Hum Mol Genet. 1992;1:353. 42 Kaluza W, Reuss E, Grossmann S, Hug R, Schopf RE, Galle PR, Maerker-Hermann E, Hoehler T. Different transcriptional activity and in vitro TNF-alpha production in psoriasis patients carrying the TNF-alpha 238A promoter polymorphism. J Invest Dermatol. 2000;114:1180-1183. 43 Bracci R, Buonocore G. Chorioamnionitis: a risk factor for fetal and neonatal morbidity. Biol Neonate. 2003;83:85-96. 44 Arias F, Victoria A, Cho K, Kraus F. Placental histology and clinical characteristics of patients with preterm premature rupture of membranes. Obstet Gynecol. 1997;89:265-271 45 Dexter SC, Malee MP, Pinar H, Hogan JW, Carpenter MW, Vohr BR Influence of chorioamnionitis on developmental outcome in very low birth weight infants. Obstet Gynecol. 1999;94:267-73. 46 Gomez R, Romero R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Berry SM. The fetal inflammatory response syndrome. Am J Obstet Gynecol. 1998;179:194-202. 47 Dizon-Townson DS, Major H, Varner M, Ward K. A promoter mutation that increases transcription of the tumor necrosis factor-alpha gene is not associated with preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 1997;177:810-813. 48 Simhan HN, Krohn MA, Zeevi A, Daftary A, Harger G, Caritis SN. Tumor necrosis factor-alpha promoter gene polymorphism -308 and chorioamnionitis. Obstet Gynecol. 2003;102:162-166. 49 Roberts AK, Monzon-Bordonaba F, Van Deerlin PG, Holder J, Macones GA, Morgan MA, Strauss JF, Parry S. Association of polymorphism within the promoter of the tumor necrosis factor alpha gene with increased risk of preterm premature rupture of the fetal membranes. Am J Obstet Gynecol. 1999;180:1297-1302. 50 Tracey KJ, Cerami A. Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic target. Annu Rev Med. 1994;45:491-503.

79

51 van der Poll T, van Deventer SJ. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis. Infect Dis Clin North Am. 1999;13:413-426 52 Petrovsky N, Harrison LC. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 1998;16:635-649. 53 Panagakos FS, O'Boskey JF Jr, Rodriguez E. Regulation of pulp cell matrix metalloproteinase production by cytokines and lipopolysaccharides. J Endod. 1996;22:358-361. 54 Lee E, Vaughan DE, Parikh SH, Grodzinsky AJ, Libby P, Lark MW, Lee RT. Regulation of matrix metalloproteinases and plasminogen activator inhibitor-1 synthesis by plasminogen in cultured human vascular smooth muscle cells. Circ Res. 1996;78:4449. 55 Bazzoni F, Beutler B. The tumor necrosis factor ligand and receptor families. N Engl J Med. 1996;334:1717-1725. 56 Porteu F, Brockhaus M, Wallach D, Engelmann H, Nathan CF. Human neutrophil elastase releases a ligand-binding fragment from the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor. Comparison with the proteolytic activity responsible for shedding of TNF receptors from stimulated neutrophils. J Biol Chem. 1991;266:18846-18853. 57 Bazzoni F, Alejos E, Beutler B. Chimeric tumor necrosis factor receptors with constitutive signaling activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92:5376-5380 58 Aderka D. The potential biological and clinical significance of the soluble tumor necrosis factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 1996;7:231-240. 59 Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, Green S, Fiore N, Williamson B. An endotoxininduced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72:3666-3670. 60 Asami T, Imai M, Tanaka Y, Hosaka Y, Kato K, Nakamura N, Horisawa Y, Ashida Y, Kanamori T, Nobuhara M, et al. In vivo antitumor mechanism of natural human tumor necrosis factor involving a T cell-mediated immunological route. Jpn J Cancer Res. 1989;80:1161-1164. 61 North RJ, Havell EA. The antitumor function of tumor necrosis factor (TNF) II. Analysis of the role of endogenous TNF in endotoxin-induced hemorrhagic necrosis and regression of an established sarcoma. J Exp Med. 1988;167:1086-1099. 62 Isaka T, Yoshimine T, Maruno M, Hayakawa T. Morphological effects of tumor necrosis factor-alpha on the blood vessels in rat experimental brain tumors. Neurol Med

80

Chir (Tokyo). 1996;36:423-427. 63 Selmaj KW, Farooq M, Norton WT, Raine CS, Brosnan CF. Proliferation of astrocytes in vitro in response to cytokines. A primary role for tumor necrosis factor. J Immunol. 1990;144:129-135. 64 Merrill JE. Tumor necrosis factor alpha, interleukin 1 and related cytokines in brain development: normal and pathological. Dev Neurosci. 1992;14:1-10. 65 Gadient RA, Cron KC, Otten U. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha synergistically stimulate nerve growth factor (NGF) release from cultured rat astrocytes. Neurosci Lett. 1990;117:335-340. 66 Nawroth PP, Stern DM. Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor. J Exp Med. 1986;163:740-755. 67 Stolpen AH, Guinan EC, Fiers W, Pober JS. Recombinant tumor necrosis factor and immune interferon act singly and in combination to reorganize human vascular endothelial cell monolayers. Am J Pathol. 1986;123:16-24. 68 Beutler BA. The role of tumor necrosis factor in health and disease. J Rheumatol. 1999;26 Suppl 57:16-21. 69 Yokoyama T, Vaca L, Rossen RD, Durante W, Hazarika P, Mann DL. Cellular basis for the negative inotropic effects of tumor necrosis factor-alpha in the adult mammalian heart. J Clin Invest. 1993;92:2303-2312. 70 Atici A, Satar M, Cetiner S, Yaman A. Serum tumor necrosis factor-alpha in neonatal sepsis. Am J Perinatol. 1997;14:401-404. 71 Hsueh W, Caplan MS, Sun X, Tan X, MacKendrick W, Gonzalez-Crussi F. Plateletactivating factor, tumor necrosis factor, hypoxia and necrotizing enterocolitis. Acta Paediatr Suppl. 1994;396:11-17. 72 Muguruma K, Gray PW, Tjoelker LW, Johnston JM. The central role of PAF in necrotizing enterocolitis development. Adv Exp Med Biol. 1997;407:379-382. 73 Sun XM, Hsueh W. Bowel necrosis induced by tumor necrosis factor in rats is mediated by platelet-activating factor. J Clin Invest. 1988;81:1328-1331. 74 Viscardi RM, Lyon NH, Sun CC, Hebel JR, Hasday JD. Inflammatory cytokine mRNAs in surgical specimens of necrotizing enterocolitis and normal newborn intestine. Pediatr Pathol Lab Med. 1997;17:547-559. 75 De Dooy JJ, Mahieu LM, Van Bever HP. The role of inflammation in the development of chronic lung disease in neonates. Eur J Pediatr. 2001;160:457-463.

81

76 Neurath MF, Fuss I, Pasparakis M, Alexopoulou L, Haralambous S, Meyer zum Buschenfelde KH, Strober W, Kollias G. Predominant pathogenic role of tumor necrosis factor in experimental colitis in mice. Eur J Immunol. 1997;27:1743-1750. 77 Watkins PE, Warren BF, Stephens S, Ward P, Foulkes R. Treatment of ulcerative colitis in the cottontop tamarin using antibody to tumour necrosis factor alpha. Gut. 1997;40:628-633. 78 Casellas F, Papo M, Guarner F, Antolin M, Armengol JR, Malagelada JR. Intraluminal colonic release of immunoreactive tumour necrosis factor in chronic ulcerative kolitis. Clin Sci (Lond). 1994;87:453-458. 79 Delespesse G, Demeure CE, Yang LP, Ohshima Y, Byun DG, Shu U. In vitro maturation of naive human CD4+ T lymphocytes into Th1, Th2 effectors. Int Arch Allergy Immunol. 1997;113:157-159. 80 Sandford AJ, Chagani T, Zhu S, Weir TD, Bai TR, Spinelli JJ, Fitzgerald JM, Behbehani NA, Tan WC, Pare PD. Polymorphisms in the IL4, IL4RA, and FCERIB genes and asthma severity. J Allergy Clin Immunol. 2000;106(1 Pt 1):135-140. 81 Hershey GK, Friedrich MF, Esswein LA, Thomas ML, Chatila TA. The association of atopy with a gain-of-function mutation in the alpha subunit of the interleukin-4 receptor. N Engl J Med. 1997;337:1720-1725. 82 Renauld JC. New insights into the role of cytokines in asthma. J Clin Pathol. 2001;54:577-589. 83 Estes ML, Iwasaki K, Jacobs BS, Barna BP. Interleukin-4 down-regulates adult human astrocyte DNA synthesis and proliferation. Am J Pathol. 1993;143:337-341. 84 Fernandes JC, Martel-Pelletier J, Pelletier JP. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology. Biorheology. 2002;39:237-46. 85 Kikuchi T, Crystal RG. Antigen-pulsed dendritic cells expressing macrophagederived chemokine elicit Th2 responses and promote specific humoral immunity. J Clin Invest. 2001;108:917-927. 86 Hultgren O, Kopf M, Tarkowski A. Staphylococcus aureus-induced septic arthritis and septic death is decreased in IL-4-deficient mice: role of IL-4 as promoter for bacterial growth. J Immunol. 1998;160:5082-5087. 87 Jansen JH, Wientjens GJ, Fibbe WE, Willemze R, Kluin-Nelemans HC. Inhibition of human macrophage colony formation by interleukin 4. J Exp Med. 1989;170:577-582. 88 Crawford RM, Finbloom DS, Ohara J, Paul WE, Meltzer MS. B cell stimulatory

82

factor-1 (interleukin 4) activates macrophages for increased tumoricidal activity and expression of Ia antigens. J Immunol. 1987;139:135-141. 89 West GA, Matsuura T, Levine AD, Klein JS, Fiocchi C. Interleukin 4 in inflammatory bowel disease and mucosal immune reactivity. Gastroenterology. 1996;110:1683-1695. 90 Karttunnen R, Breese EJ, Walker-Smith JA, MacDonald TT. Decreased mucosal interleukin-4 (IL-4) production in gut inflammation. J Clin Pathol. 1994;47:1015-1018. 91 Bush TG. Enteric glial cells. An upstream target for induction of necrotizing enterocolitis and Crohn's disease?. Bioessays 2002;24:130-140. 92 Simpson RJ, Hammacher A, Smith DK, Matthews JM, Ward LD. Interleukin-6: structure-function relationships. Protein Sci. 1997;6:929-955. 93 Olomolaiye O, Wood NA, Bidwell JL. A novel NlaIII polymorphism in the human IL-6 promoter. Eur J Immunogenet. 1998;25:267. 94 Babbage SJ, Arkwright PD, Vince GS, Perrey C, Pravica V, Quenby S, Bates M, Hutchinson IV. Cytokine promoter gene polymorphisms and idiopathic recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol. 2001;51:21-27. 95 Baxter N, Sumiya M, Cheng S, Erlich H, Regan L, Simons A, Summerfield JA. Recurrent miscarriage and variant alleles of mannose binding lectin, tumour necrosis factor and lymphotoxin alpha genes. Clin Exp Immunol. 2001;126:529-534. 96 Karhukorpi J, Laitinen T, Karttunen R, Tiilikainen AS. The functionally important IL-10 promoter polymorphism (-1082G-->A) is not a major genetic regulator in recurrent spontaneous abortions. Mol Hum Reprod. 2001;7:201-203. 97 Reid JG, Simpson NA, Walker RG, Economidou O, Shillito J, Gooi HC, Duffy SR, Walker JJ. The carriage of pro-inflammatory cytokine gene polymorphisms in recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol. 2001;45:35-40. 98 Simhan HN, Krohn MA, Roberts JM, Zeevi A, Caritis SN. Interleukin-6 promoter 174 polymorphism and spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol. 2003;189:915-918. 99 Luheshi GN. Cytokines and fever. Mechanisms and sites of action. Ann N Y Acad Sci. 1998;856:83-89. 100 Febbraio MA. Signaling pathways for IL-6 within skeletal muscle. Exerc Immunol Rev. 2003;9:34-39. 101 Cavaillon JM. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 1994;48:445-

83

453. 102 Bodey B, Bodey B Jr, Siegel SE, Kaiser HE. The role of the reticulo-epithelial (RE) cell network in the immuno-neuroendocrine regulation of intrathymic lymphopoiesis. Anticancer Res. 2000;20:1871-1888. 103 Romagnoli C, Frezza S, Cingolani A, De Luca A, Puopolo M, De Carolis MP, Vento G, Antinori A, Tortorolo G. Plasma levels of interleukin-6 and interleukin-10 in preterm neonates evaluated for sepsis. Eur J Pediatr. 2001;160:345-350. 104 Berner R, Csorba J, Brandis M. Different cytokine expression in cord blood mononuclear cells after stimulation with neonatal sepsis or colonizing strains of Streptococcus agalactiae. Pediatr Res. 2001;49:691-697. 105 Kashlan F, Smulian J, Shen-Schwarz S, Anwar M, Hiatt M, Hegyi T. Umbilical vein interleukin 6 and tumor necrosis factor alpha plasma concentrations in the very preterm infant. Pediatr Infect Dis J. 2000;19:238-243. 106 Krueger M, Nauck MS, Sang S, Hentschel R, Wieland H, Berner R. Cord blood levels of interleukin-6 and interleukin-8 for the immediate diagnosis of early-onset infection in premature infants. Biol Neonate. 2001;80:118-123. 107 Morecroft JA, Spitz L, Hamilton PA, Holmes SJ. Plasma interleukin-6 and tumour necrosis factor levels as predictors of disease severity and outcome in necrotizing enterocolitis. J Pediatr Surg. 1994;29:798-800. 108 Romagnoli C, Frezza S, Cingolani A, De Luca A, Puopolo M, De Carolis MP, Vento G, Antinori A, Tortorolo G. Plasma levels of interleukin-6 and interleukin-10 in preterm neonates evaluated for sepsis. Eur J Pediatr. 2001;160:345-350. 109 Yoon BH, Romero R, Kim KS, Park JS, Ki SH, Kim BI, Jun JK. A systemic fetal inflammatory response and the development of bronchopulmonary dysplasia. Am J Obstet Gynecol. 1999;181:773-779. 110 Kotecha S, Wilson L, Wangoo A, Silverman M, Shaw RJ. Increase in interleukin (IL)-1 beta and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid obtained from infants with chronic lung disease of prematurity. Pediatr Res. 1996;40:250-256. 111 Bazrafshani MR, Ollier WE, Hajeer AH. A novel PCR-RFLP assay for the detection of the single nucleotide polymorphism at position -1082 in the human IL-10 gene promoter. Eur J Immunogenet. 2000;27:119-120.

84

112 Daher S, Shulzhenko N, Morgun A, Mattar R, Rampim GF, Camano L, DeLima MG. Associations between cytokine gene polymorphisms and recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol. 2003;58:69-77. 113 Costeas PA, Koumouli A, Giantsiou-Kyriakou A, Papaloizou A, Koumas L. Th2/Th3 cytokine genotypes are associated with pregnancy loss. Hum Immunol. 2004;65:135-141. 114 Lindsay JO, Hodgson HJ. Review article: the immunoregulatory cytokine interleukin-10--a therapy for Crohn's disease? Aliment Pharmacol Ther. 2001;15:17091716. 115 Asderakis A, Sankaran D, Dyer P, Johnson RW, Pravica V, Sinnott PJ, Roberts I, Hutchinson IV. Association of polymorphisms in the human interferon-gamma and interleukin-10 gene with acute and chronic kidney transplant outcome: the cytokine effect on transplantation. Transplantation. 2001;71:674-677. 116 Jobe AH, Ikegami M. Mechanisms initiating lung injury in the preterm. Early Hum Dev. 1998;53:81-94. 117 Dollner H, Vatten L, Linnebo I, Zanussi GF, Laerdal A, Austgulen R. Inflammatory mediators in umbilical plasma from neonates who develop early-onset sepsis. Biol Neonate. 2001;80:41-47. 118 Modi N (1999) Disorders of the kidney and urinary tract. Textbook of neonatology. Churchill-Livingston, Edinburgh, pp 1009-1037 119 Bell MJ, Ternberg JL, Feigin RD, Keating JP, Marshall R, Barton L, Brotherton T. Neonatal necrotizing enterokolitis. Therapeutic decisions based upon clinical staging. Ann Surg. 1978;187:1-7. 120 Szalai C, Czinner A, Revai K. The frequency of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase G985 mutation in the Hungarian population. Eur J Pediatr. 1996;155:256. 121 Treszl A, Kocsis I, Szathmari M, Schuler A, Heninger E, Tulassay T, Vasarhelyi B. Genetic variants of TNF-[FC12]a, IL-1beta, IL-4 receptor [FC12]a-chain, IL-6 and IL10 genes are not risk factors for sepsis in low-birth-weight infants. Biol Neonate. 2003;83:241-245. 122 Fang XM, Schroder S, Hoeft A, Stuber F. Comparison of two polymorphisms of the interleukin-1 gene family: interleukin-1 receptor antagonist polymorphism contributes to susceptibility to severe sepsis. Crit Care Med. 1999;27:1330-1334.

85

123 Harding D, Dhamrait S, Millar A, Humphries S, Marlow N, Whitelaw A, Montgomery H. Is interleukin-6 -174 genotype associated with the development of septicemia in preterm infants? Pediatrics. 2003;112:800-803. 124 Ahrens P, Kattner E, Kohler B, Hartel C, Seidenberg J, Segerer H, Moller J, Gopel W; Genetic Factors in Neonatology Study Group. Mutations of genes involved in the innate immune system as predictors of sepsis in very low birth weight infants. Pediatr Res. 2004;55:652-656. 125 Esmon CT. Possible involvement of cytokines in diffuse intravascular coagulation and thrombosis. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol. 1999;12:343-359. 126 Vizi ES, Szelenyi J, Selmeczy ZS, Papp Z, Nemeth ZH, Hasko G. Enhanced tumor necrosis factor-alpha-specific and decreased interleukin-10-specific immune responses to LPS during the third trimester of pregnancy in mice. J Endocrinol. 2001;171:355361. 127 Poli F, Boschiero L, Giannoni F, Tonini M, Scalamogna M, Ancona G, Sirchia G Tumour necrosis factor-

gene polymorphism: implications in kidney transplantation.

Cytokine 2000;12:1778-1783. 128 Hahn AB, Kasten-Jolly JC, Constantino DM, Graffunder E, Singh TP, Shen GK, Conti DJ TNF- , IL-6, IFN-gamma, and IL-10 gene expression polymorphisms and the IL-4 receptor

-chain variant Q576R: effects on renal allograft outcome.

Transplantation 2001;72:660-665. 129 Sankaran D, Asderakis A, Ashraf S, Roberts IS, Short CD, Dyer PA, Sinnott PJ, Hutchinson IV Cytokine gene polymorphisms predict acute graft rejection following renal transplantation. Kidney Int 1999;56:281-288. 130 Marshall SE, McLaren AJ, McKinney EF, Bird TG, Haldar NA, Bunce M, Morris PJ, Welsh KI Donor cytokine genotype influences the development of acute rejection after renal transplantation. Transplantation 2001;71:469-476. 131 Poole KL, Gibbs PJ, Evans PR, Sadek SA, Howell WM Influence of patient and donor cytokine genotypes on renal allograft rejection: evidence from a single centre study. Transpl Immunol 2001;8:259-265. 132 Kohan DE Role of endothelin and tumour necrosis factor in the renal response to sepsis Nephrol Dial Transplant 1994;9:73-77. 133 Knotek M, Rogachev B, Wang W, Ecder T, Melnikov V, Gengaro PE, Esson M, Edelstein CL, Dinarello CA, Schrier RW Endotoxemic renal failure in mice: role of

86

tumor necrosis factor independent of inducible nitric oxide synthase. Kidney Int 2001;59:2243-2249. 134 Johnson JP, Rokaw MD Sepsis or ischemia in experimental acute renal failure: what have we learned? New Horiz 1995;3:608-614. 135 Karnik AM, Bashir R, Khan FA, Carvounis CP Renal involvement in the systemic inflammatory reaction syndrome. Ren Fail 1998;20:103-116. 136 X. Tan, W. Hsueh and F. Gonzalez-Crussi, Cellular localization of tumor necrosis factor (TNF)-alpha transcripts in normal bowel and in necrotizing enterocolitiscolitis. TNF gene expression by Paneth cells, intestinal eosinophils, and macrophages. Am J Pathol 1993;142: 1858–1865. 137 Neurath MF, Fuss I, Pasparakis M, Alexopoulou L, Haralambous S, Meyer zum Buschenfelde KH, Strober W, Kollias G. Predominant pathogenic role of tumor necrosis factor in experimental colitis in mice. Eur J Immunol. 1997;27:1743-1750. 138 Watkins PE, Warren BF, Stephens S, Ward P, Foulkes R. Treatment of ulcerative colitis in the cottontop tamarin using antibody to tumour necrosis factor alpha. Gut. 1997;40:628-633. 139 Casellas F, Papo M, Guarner F, Antolin M, Armengol JR, Malagelada JR. Intraluminal colonic release of immunoreactive tumour necrosis factor in chronic ulcerative kolitis. Clin Sci (Lond). 1994;87:453-458. 140 Viscardi RM, Lyon NH, Sun CC, Hebel JR, Hasday JD. Inflammatory cytokine mRNAs in surgical specimens of necrotizing enterocolitis and normal newborn intestine. Pediatr Pathol Lab Med. 1997;17:547-559. 141 Niessner M, Volk BA. Phenotypic and immunoregulatory analysis of intestinal Tcells in patients with inflammatory bowel disease: evaluation of an in vitro model. Eur J Clin Invest. 1995;25:155-164. 142 Jansen JH, Wientjens GJ, Fibbe WE, Willemze R, Kluin-Nelemans HC. Inhibition of human macrophage colony formation by interleukin 4. J Exp Med. 1989;170:577582. 143 Crawford RM, Finbloom DS, Ohara J, Paul WE, Meltzer MS. Crawford RM, Finbloom DS, Ohara J, Paul WE, Meltzer MS. B cell stimulatory factor-1 (interleukin 4) activates macrophages for increased tumoricidal activity and expression of Ia antigens. J Immunol. 1987;139:135-141. 144 Schreiber S, Heinig T, Panzer U, Reinking R, Bouchard A, Stahl PD, Raedler A.

87

Impaired response of activated mononuclear phagocytes to interleukin 4 in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 1995;108:21-33. 145 Bush TG. Enteric glial cells. An upstream target for induction of necrotizing enterocolitis and Crohn's disease? Bioessays. 2002;24:130-140. 146 Nemetz A, Nosti-Escanilla MP, Molnar T, Kope A, Kovacs A, Feher J, Tulassay Z, Nagy F, Garcia-Gonzalez MA, Pena AS. IL1B gene polymorphisms influence the course and severity of inflammatory bowel disease. Immunogenetics. 1999;49:527-531. 147 Koss K, Satsangi J, Welsh KI, Jewell DP. Is interleukin-6 important in inflammatory bowel disease? Genes Immun. 2000;1:207-212. 148 Koss K, Satsangi J, Fanning GC, Welsh KI, Jewell DP. Cytokine (TNF alpha, LT alpha and IL-10) polymorphisms in inflammatory bowel diseases and normal controls: differential effects on production and allele frequencies. Genes Immun. 2000;1:185-190. 149 Olavesen MG, Hampe J, Mirza MM, Saiz R, Lewis CM, Bridger S, Teare D, Easton DF, Herrmann T, Scott G, Hirst J, Sanderson J, Hodgson SV, Lee J, MacPherson A, Schreiber S, Lennard-Jones JE, Curran ME, Mathew CG. Analysis of singlenucleotide polymorphisms in the interleukin-4 receptor gene for association with inflammatory bowel disease. Immunogenetics. 2000;51:1-7. 150 Aithal GP, Day CP, Leathart J, Daly AK, Hudson M. Association of single nucleotide polymorphisms in the interleukin-4 gene and interleukin-4 receptor gene with Crohn's disease in a British population. Genes Immun. 2001;2:44-47. 151 . De Dooy JJ, Mahieu LM, Van Bever HP. The role of inflammation in the development of chronic lung disease in neonates. Eur J Pediatr. 2001; 160 : 457-463. 152 Adcock K, Hedberg C, Loggins J, Kruger TE, Baier RJ. The TNF-alpha -308, MCP-1 -2518 and TGF-beta1 +915 polymorphisms are not associated with the development of chronic lung disease in very low birth weight infants. Genes Immun. 2003;4:420-426. 153 De Dooy JJ, Mahieu LM, Van Bever HP. The role of inflammation in the development of chronic lung disease in neonates. Eur J Pediatr. 2001;160:457-463. 154 Yende S, Quasney MW, Tolley EA, Wunderink RG. Clinical relevance of angiotensin-converting enzyme gene polymorphisms to predict risk of mechanical ventilation after coronary artery bypass graft surgery. Crit Care Med. 2004;32:922-927.

88