Citokin-szint mérések Bekő Gabriella SE Laboratóriumi Medicina Intézet Központi Laboratórium (Pest) 2011. április 20.
A citokinek általános jellemzői • Kis molekulasúlyú (8-40 kDa) glikoproteinek • Izolált sejtek termelik aktiváció hatására • Sejtek közötti kapcsolatokat közvetítik: - információ-továbbítás - immunválasz szabályozása • Hatásukra jellemző: - receptorokon keresztül hatnak - nagy affinitás a receptorokhoz - igen kis koncentrációban
A citokinek funkcionális csoportosítása I. Természetes immunitásban és Proinflammatorikus hatásúak: gyulladásos folyamatokban résztvevők
IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TNFβ, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, MIF, kemokinek (IL-8, MCP-1) Antiinflammatorikus hatásúak: IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24,IL-26
II. A limfociták aktivációját és differenciálódását szabályozók
IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-15, INFγ, TGFβ
III. Az immunsejtek érésére
IL-3, IL-7, GM-CSF, G-SCF
hatók
A citokinek az immunválasz minden fázisában hatnak: Felismerés:
Aktiváció:
Effektor fázis:
Citokinek kapcsolata
B-sejt
T-sejt
Hízósejt
Citokin-szint meghatározásának nehézségei A citokinszintek és növekedési faktorok meghatározását több tényező nehezíti: • Az ugyanolyan néven, jellel jelzett citokin a szervezetben monomer és polimer formában is jelen lehet; • Többféle alegységből áll, melynél az egyes alegységeket külön sejttípusok termelik; illetve kémiailag sem mindig jól karakterizáltak; • Mind a citokin mind a növekedési faktorok meghatározásánál, mivel fehérjékről van szó, amelyek esetleg több epitóppal rendelkeznek, a szintek mérése során alkalmazott immunanalitikai módszerek szenzitivitását és specificitását, de a referencia tartományt is alapvetően meghatározza a gyártás technológiája, a vegyszer sorozatszáma;
Citokin-szint meghatározásának nehézségei • Nyugalmi állapotban a citokinszintek a plazmában igen alacsony (pmol/ml) koncentrációban vannak jelen - jelentős hányaduk nem is detektálható; • Stimulus hatására a citokinszint többszörösére emelkedik, de ez a változás átmeneti, citokinenként különböző kinetikát mutat; • Mivel a citokinek hatásukat egy komplex rendszer részeként fejtik ki, sok esetben az 1-1 citokin klinikai jelentőségére korlátozódó mérések eredménye nem informatív
Mintavétel, tárolás • Kortizolfüggő citokineknél diurnális ingadozás • Módszerfüggő betegminta: szérum, plazma, szöveti felülúszó, testnedv, szöveti homogenizátum, heparinnal, citráttal vagy EDTA-val alvadásgátolt vér, alvadásgátolt vérből vagy szövettani mintából, biopsziából szeparált sejtek, csontvelőből, likvorból, ascitesből, ízületi folyadékból vagy bronchoalveoláris lavage-ból ülepített vagy szeparált sejtek, sejttenyészetek partikulái • Metodika függő mintatérfogat • Tárolás -70⁰C és -80 ⁰C között • Egyszeri felolvasztás
Intracelluláris citokinek és kemokinek kimutatása áramlási citometriával • A T-limphociták aktivációját követően a citokinek/kemokinek a citoplazmában feldúsulnak, és csak ezután választódnak ki • Az intracelluláris citokinek a citoplazmában fluoreszcens festékekkel jelzett specifikus ellenanyagokkal, áramlási citofluorimetriával, immunhisztokémiai módszerekkel vagy immunfluoreszcens mikroszkópos technikákkal vizsgálhatók •
A sejtfelszíni markerek egyidejű kimutatásával az adott citokintermelő sejt típusa is azonosítható, és a citokint termelő sejtek aránya is megadható
• A mikroszkópos elemzés a sejten belüli lokalizáció meghatározására alkalmas
Visceralis Leismania ellen kialakuló hosszú távú immunitás esetén az intracelluláris citokinek szintje a CD4+ és CD8+ sejtekben
A Selvapandiyan * , R Dey * , S Nylen † , R Duncan * , D Sacks † and H L. Nakhasi 1 , Intracellular Replication-Deficient Leishmania donovani Induces Long Lasting Protective Immunity against Visceral Leishmaniasis The Journal of Immunology, 2009
Extracelluláris citokinek kimutatása ELISA technikával • A citokinek klasszikus ELISA-val való kimutatásakor a kettős szendvics módszert alkalmazzák →fajlagossága igen nagy • Ezzel a módszerrel a citokinek mennyisége a biológiai aktivitásuktól függetlenül mérhető, ezért – főként a rövid életidejű fehérjék esetében – az eredmény nem mindig jelzi a tényleges biológiai aktivitást • A mérést az is befolyásolja, hogy a különböző citokinek oldott formájú receptorokhoz vagy inhibitorokhoz kötött formában is előfordulhatnak
Citokinek mérése immunkémiai automatával • Az "ECLIA" (elektrochemilumineszcens immunoassay ) Elecsys, Modular E és Cobas e immunkémiai analizátorokon alkalmazható módszer, mellyel Interleukin-6-ot mérhetünk humán szérumban és plazmában • Az IL-6 az akut gyulladás korai indikátora, koraszülött és újszülöttkori szepszisben jól használható marker • Immunolyte automatára IL6, IL8 és TNF-α teszteket fejlesztettek. • Ezek a proinflamatorikus citokinek akut gyulladásban, sepsisben segíthetik a korai diagnózist. • Az automatákon mért citokinszintek előnye → egy-két órán belül, ügyeleti időben is elkészül az eredmény
Hong DS, Angelo LS, Kurzrock R. Interleukin-6 and its receptor in cancer: implications for translational therapeutics Cancer. 2008
IL-6 szerepe carcinomában
Hong DS, Angelo LS, Kurzrock R. Interleukin-6 and its receptor in cancer: implications for translational therapeutics Cancer. 2008
IL-6 szerepe gyulladásban, szepszisben
IL-6 és IL-8 koncentrációk alakulása halállal végződő szepszis esetén
S HARBARTH, K HOLECKOVA, C FROIDEVAUX et all : Sepsis Network Diagnostic Value of Procalcitonin, Interleukin-6, and Interleukin-8 in Critically Ill Patients Admitted with Suspected Sepsis Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006
A különböző biomarkerek értéke a szepszis előrejelzésében (ROC) analízissel
Shawn D. Carrigan1, George Scott2 and Maryam Tabrizian Toward Resolving the Challenges of Sepsis Diagnosis Clinical Chemistry. 2004
Perinatális szepszis és citokinprofil • Minden, a prokalcitonin és/vagy a CRP szint alapján szeptikus újszülöttnél magasabb volt az IL-6 szint. • Az emelkedett IL-8 szintű 15 gyermek közül 6-nál az egészséges referenciatartományon belül volt a prokalcitonin és a CRP szintje; • azaz az első napon 90 pg/ml feletti IL-8 és/vagy 2,5 µg/l feletti prokalcitonin- és/vagy 3 mg/l feletti CRP-szint a perinatális szepszis tüneteit mutató újszülöttek 95%-ánál jelen volt. Antibiotikum adása előtt (1. életnap)
Antibiotikus kezelés alatti 1. nap (2. életnap)
Antibiotikus kezelés alatti 2. nap (3. életnap)
IL-6 (pg/ml)
18,2 (10,54 – 29,27)
8,2 (3,47 – 14,025)
4,3 (2,4 – 6,9)
IL-8 (pg/ml)
66,16 (38,72 – 162,9)
50,34 (17,08 – 101,27)
52,26 (32,19 – 123,5)
3,555 (2,3 – 5,5)
2,945 (1,968 – 3,922)
2,165 (1,715 – 3,15)
15,56 (8,24 – 28,34)
1,535 (0,688 – 7,858)
0,35 (0,215 – 0,665)
2,5 (0,675 – 9,4)
1,7 (0,6 – 9,7)
0,7 (0,1 – 4,625)
15,7 (10,725 – 22,95)
10,75 (9 – 14,35)
12 (9,7 – 15,7)
Paraméterek
IL-10 (pg/ml) Prokalcitonin-szint (ng/ml) CRP-szint (mg/l) Fehérvérsejtszám (G/l)
IL-6 a Crohn-betegség aktivitásának követésében • IL-6 szintek mérése valószínűleg felhasználható a betegség aktivitásának követésére immunszuppresszív kezelés bevezetését követően, a terápiás válasz korai kimutatásában, szemben a hagyományosan vizsgált laborparaméterekkel Müllner, Katalin Edit (2007) Endotoxinok, citokinek, szabad gyökök szerepének, farmakogenetikai eltéréseknek a vizsgálata Crohnbetegség kezelésében és aktivitásának nyomon követésében
Multiplex rendszerek I. Biochip technika • Egyszerre 12 citokint, kemokint és növekedési faktort mérünk 100 µl mintából • A mérés elve háromféle immunoassay EGYÜTTES alkalmazása : 1. kompetitív immunoassay (enzimmel jelölt analit) 2. sandwich immunoassay (enzimmel jelölt antitest) 3. antibody capture immunoassay
• A Randox Evidence InvestigatorTM a chemiluminescens jeleket egyszerre – méri egy hűtött CCD kamerával és – standard kalibrációs görbékhez hasonlítva kiértékeli egy speciális programmal a teljes array-n.
Biochip citokin panelek Cytokine Array I [serum & plasma] • Epidermal Growth Factor (EGF) • Interleukin-1 alpha (IL-1a) • Interleukin-1 beta (IL-1b) • Interleukin-2 (IL-2) • Interleukin-4 (IL-4) • Interleukin-6 (IL-6) • Interleukin-8 (IL-8) • Interleukin-10 (IL-10) • Interferon- gamma (IFN-g) • Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) • Tumour Necrosis Factor-alpha (TNF-a) • Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Cytokine Array III [serum & plasma] • Interleukin-5 (IL-5) • Interleukin-15 (IL-15) • Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) • Macrophage Inflammatory Protein 1alpha(MIP-1a) • Tumour Necrosis Factor beta (TNF-b)
Cytokine Array IV [serum] • Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) • Soluble IL-2 Receptor Alpha (sIL-2Ra) • Soluble IL-6 Receptor (sIL-6R) • Soluble Tumour Necrosis Factor Receptor I (sTNFRI) • Soluble Tumour Necrosis Factor Receptor II (sTNFRII)
A világ első Protein Biochip Array teljes automata rendszere
teljesen automatizált rendszer a panelek gyors multiplex vizsgálatára→ 1200 vizsgálat / óra.
Teljes automata (EVIDENCE) • Ebben a rendszerben egy chip felületére maximum 23 analit (antitest) köthető. Panelek: • kardiális, cerebrális, pajzsmirigy, női hormon, drog kimutató, anti-mikrobiális, szintetikus szteroid, adhéziós molekula, és többféle tumor monitorozó proteinarray, a colorectalis tumorok szűrésére pedig DNA-arrayt (RanplexCRC), Nyugat-Európában, Amerikában klinikai rutin laboratóriumokban is használják.
Multiplex rendszerek II. Bio-Plex technika Mikrogyöngyöket vörös és infravörös festékkel színezik. 100-féle gyöngytípus
befogó molekula analit
jelző molekula
A gyöngyökhöz monoklonális antitesteket kötnek, a citokin jelenlétekor fluoreszcens jel keletkezik. A gyöngyök összekeverhetők és a microplate lyukaiból egyszerre mérhetők.
A gyöngyöket 2 színű lézer világítja meg. Piros fény a gyöngy típus zöld fény a fluoreszcens jel intenzitás Egyszerre akár 27-féle citokin 50 µl mintából!
Citokinszint-mérő technikák összehasonlítása •
Az egyes rendszerekben mért IL-6 szintek szorosan összefüggtek egymással. IL-6 szint Roche, Biochip és Biop lex módszerrel IL-6 (p g/ml) 10000 1000 100 10 1 1
2
3
4
5
6
IL-6 (Roche)
•
•
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 beteg azonosító
IL-6 Biochip
IL-6 Bioplex
A Bioplex rendszerrel mért IL-6 szintek közel szignifikáns mértékben magasabbak voltak, mint az Roche (p = 0,07), illetve Biochip (p = 0,06) rendszerrel mért értékek. A Bioplex és a Biochip rendszerekkel mért citokinszintek közötti összefüggés erőssége citokintől függően tág határok között változott (r = 0,28 – 0,97).
Biochip és Bioplex rendszer összevetése • a multiplex citokin-szint-meghatározás IL-6-szint mindig, IL-2, IL-8, IL-10, TNF-α, IL-4, IFNγ csak az esetek egy részénél mérhető egészséges felnőttekben • Az egyes mérési rendszerekkel kapott eredmények – bár bizonyos esetekben szoros kapcsolat áll fenn közöttük – alapvetően rendszerspecifikusak.→ Fontos, hogy egy adott laboratórium egy adott kísérlethez mindig ugyanazt a rendszert alkalmazza. Az egy adott rendszerrel mért citokin értékek nem használhatóak fel olyan kísérletek során, melyekben egyéb módon (is) mértek citokinszinteket. • Az esetenként gyenge erősségű összefüggéseken túl az egyes rendszerekkel mért citokin-szintek között szisztémás eltérést is kimutattunk. • Egyes rendszerek esetében a vizsgálatot végző laboratóriumnak külön-külön meg kell határoznia az egészséges populációra vonatkozó referenciaértéket, továbbá hogy milyen módszerrel történt a meghatározás.
Cirrhosisra jellemző citokinprofilok
Egészséges referenciacsoport Citokinek (pg/ml)
Alkoholos cirrhosis
Primer biliaris cirrhosis
HCV-fertőzés okozta cirrhosis
n = 26
n = 36
n = 35
n = 14
IL-10
1,08 [0,0 - 2,07]
1,20 [0,12 - 2,71]
0,47 [0,0 - 3,32]*
1,08 [0,42 - 2,86]
IL-1β
1,57 [0,0 - 4,32]
1,17 [0,0 - 3,31]
0,72 [0,0 - 3,21]
1,57 [0,0 - 2,97]
IL-2
4,18 [0,0 - 6,83]
5,50 [3,95 - 13,2]
4,88 [0,0 - 9,12]
8,18 [3,24 - 13,8]*
IL-6
1,51 [0,74 - 4,89]
10,8 [1,02 - 24,7]*
5,72 [0,0 - 17,6]*
4,80 [0,0 - 9,46]
IL-8
25,2 [6,84 - 48,1]
49,2 [7,72 - 138]
159 [14,9 - 305]*
17,7 [3,88 - 7,2]
TNFα
7,45 [2,54 - 14,4]
8,58 [2,15 - 17,51]
11,4 [0,0 - 31,3]*
4,81 [1,94 - 8,62]
•* p< 0,05 az egészséges referenciacsoporthoz képest
Jellemző citokinprofil és összefüggés a diagnosztikában használt paraméterekkel Rheumatoid arthritisben •
Our objective was to analyse the relationship between circulating cytokines, autoantibodies, acute phase reactants, and disease activity in DMARDs-naïve rheumatoid arthritis (RA) patients (n=140). All cytokines were significantly higher in the RA cohort than in healthy controls. Moderate-to-strong positive intercorrelations were observed between Th1/Th2/macrophage/fibroblast-derived cytokines. RF correlated significantly with IL-1β, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, and TNF (P<.0001), and aCCP (anticyclic citrullinated peptide antibodies) and aMCV (antimodified citrullinated vimentin antibodies) with IL-1β, IL-2, IL-4, and IL-10 (P<.0002), while IL-6 correlated best with the acute phase reactants, CRP and SAA (P<.0001).
Circulating Cytokine Profiles and Their Relationships with Autoantibodies, Acute Phase Reactants, and Disease Activity in Patients with Rheumatoid Arthritis Mediators of Inflammation 2010
A citokinprofil értéke • A labordiagnosztika mai színvonala lehetővé teszi, hogy ne csak izoláltan, egy-két citokinre vonatkozóan lehessen adatokat gyűjteni, hanem meg lehessen határozni az egy adott betegre, betegségre jellemző citokinprofilt. • Az eredmények értékelését nehezíti: (1) nem ismert, hogy a különböző multiplex rendszerek által mért adatok mennyire állnak összhangban; (2) kevés az arra vonatkozó adat, hogy az egy adott multiplex rendszerben mért értékek mennyire reprodukálhatóak; (3) a nagyszámú adat feldolgozása, az egy adott betegből ismételten végzett mérések eredményének az értékelése új statisztikai megközelítéseket indokolnak.
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
