Biotermék-technológia II

Pécs Miklós előadásában:

Biotermék-technológia II. 2012/13 ősz

KZ

Nukleotidok, vitaminok (anyagcsere-mérnökség)

Iparilag termelt nukleotidok: IMP, GMP, inozin, ATP. Az IMP és az XMP a bioszintézis láncban intermedier, vagyis köztitermék, ha ilyet akarunk gyártani, akkor valahogyan meg kell állítani a bioszintézist. Nagy tömegben a nukleotidokat az élelmiszeriparban használják ízfokozóként, az ötödik ízért, az umamiért felelősek. Japánban kezdték el használni, a szójaszószok erjesztése során a benne lévő nukleinsavak lebomlanak az enzimek hatására, így megjelennek ezek a mononukleotidok. Nagyon kis mennyiségben nátrium-glutamáthoz adva szinergikusan fokozza az ízeket. Antibiotikumok, citosztatikumok mellett alkalmazhatók, nukleinsav-szintézis során fejtik ki hatásukat, antimetabolitként beépülve (8-azaguanin). Megtalálhatóak ezen kívül szívgyógyszerekben, izomerősítőkben, vírusok reprodukcióját gátló szerekben. Milyen gyártásokat lehet alkalmazni? Az egyik az RNS-hidrolízis, a másik a de novo fermentáció. RNS-hidrolízis: Bár a baktériumokban nagyobb a fajlagos RNS-tartalom, praktikus okokból az élesztőket használják a termeltetésre. A nagy RNS-tartalomhoz intenzív fehérjeszintézisre kell rábírni az élesztőt, mert ilyenkor van szükség sok m-, t- és rRNS. Ehhez az anyagcserét nem szükséges mutációkkal befolyásolni, elég a célra megfelelő törzset kiválasztani: Candida utilis és Saccharomyces cerevisiae. A maximális RNS-tartalom érdekében a logaritmikus szakaszban érdemes csinálni (maximális szaporodás). Folytonos technológiával melasz, vagy szulfitszennylúg szénforráson 35 g/l SCP koncentráció elérhető 10-15% RNS-tartalom; 20.000 t/év gyártó kapacitás. Zn2+ koncentrációnak is fontos szerepe van, ezért annak adagolására van szükség (0,25 ppm) A nukleinsav bioszintézis során nátriumadagolás nem szükséges. A sejttömegeket fel kell dolgozni: neki lehet esni durva módszerekkel, ugyanis az RNS nagyon stabil: Sejtfeltárás: 5-20%-os NaOH-oldat, 100ºC hőmérsékleten, 8 órán át tartó forró lúgos főzéssel a fehérjék tönkremennek, az RNS feloldódik. Savval lehet kicsapni, mert a nukleinsavak gyenge savak, az erős savak csökkentik ezeknek a disszociációját, ha a csoport nem disszociál, akkor nincs töltése, ha nincs töltése, nincs hidrátburka, ha pedig nincs hidrátburka, akkor az oldhatósága csökken. Ezután van még egy alkoholos mosás, majd szárítás. Enzimes hidrolízis: Az ipari eljárások során a hidrolízist 2%-os RNS-oldatban végzik, pH=5 mellett, 4 órán keresztül, 65°C-on. A folyamat végén nukleotidok keveréke keletkezik, melyek elválasztása történhet anioncserélővel vagy metanolos frakcionált kicsapással.

De novo fermentációs gyártás: Az anyagcsere-mérnöki beavatkozásokhoz ismerni kell a bioszintézis menetét: A primer metabolitok előállításánál a génállományt úgy változtatják meg, hogy:  A bioszintézis út elágazásait lezárják, ezáltal minden anyag a céltermék irányába áramlik (auxotróf mutánsok). Ha ez létfontosságú molekulák előállítását érinti, akkor leaky (szivárgó) mutánsok, vagy tápoldat-kiegészítés.  A terméket továbbalakító reakciólépéseket eliminálják.  Felfüggesztik a túltermelést megakadályozó mechanizmusokat (antimetabolit rezisztens mutánsok) IMP és XMP termelés de novo fermentációval 1. A sejt által termelt utolsó intermedier az IMP legyen, mindkét további anyagcsereutat elzárják, de: a normális életfolyamatokhoz kis mennyiségben szükség van nukleotidokra vagy a táptalajba adagolunk kis mennyiséget vagy leaky mutánst izolálunk, ez kis mennyiségben termeli a GMP-t és AMP-t. 2. A túltermelést megakadályozó szabályozásokat megszüntetik → antimetabolit rezisztens (6merkapto-purin) mutánsokat alkalmaznak.

5’-IMP termelés direkt fermentációs technológiája A kívánt törzs jellemzői: 

Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes



Az SAMP-szintetáz enzim hiányzik (IMP átalakítás) ezek a törzsek AMP-re auxotróf tulajdonságúak.



Kicsi az IMP → XMP átalakítás katalízisét végző enzim aktivitása



GMP feed back működése



A sejt citoplazma membránja permeábilis 5’-IMP-re

A fermentáció során lényeges a megfelelő foszfát, Mg- és Mn-koncentrációk beállítása. 2-3 napos folyamat a hipoxantin-képzés, és 8 napos az 5’-IMP-termelés, mely extracelluláris termék. A szénforrás, a képződött sejttömeg és az előállított nukleotidok mennyiségének fermentáció alatti változásait a diagramok mutatják:

ATP-szintézis Az ATP biológiai úton történő előállításához a glikolízis ATP-t fogyasztó lépéseit elkerülik úgy, hogy a terméket előállító élesztősejteknek (Saccharomyces cerevisiae) a glikolízis egy köztitermékét adagolják. Az adagolt fruktóz-1,6-biszfoszfátot kémiai szintézissel állítják elő, és mellette Mg2+ ionokat adnak a rendszerhez. A glikolízis második felét működtetik így, ezáltal az ATP-termelő folyamatot részesítve előnyben, amellyel közel 100%-os P/O hányados érhető el (megvalósítója: Gánti Tibor, aki emellett a Chemoton-elméletet is kidolgozta). Korábban lóizomból állították elő, napjainkban az élesztős bioszintézisé a vezető szerep. Szívizom-erősítőként használatos (Atrifos, ATP; Reanal), évente körülbelül 1 tonna mennyiséget állítanak elő.

Vitaminok

A vitaminok általunk nem előállítható, szervezetünk számára elengedhetetlenül fontos, kis mennyiségben szükséges anyagok. A vitaminok primer metabolitok. A mikroorganizmusok felhasználhatók tiamin (B1), riboflavin (B2), fólsav (B10), pantoténsav (B5), biotin (H- vitamin), piridoxál (B6), B12 vitamin és ergoszterin (D2 provitamin) előállításához. Bizonyos vitaminok szintézisének meghatározott lépései mikroorganizmusokkal végeztethetőek, katalizálhatóak, például a D-szorbit L-szorbózzá történő bio-oxidációja Acetobacter suboxidans segítségével a C-vitamin szintézise során. Ipari méretekben azonban csak a B12 és B2 vitaminok előállítása gazdaságos. A-vitamin: Az A-vitamin (retinol) karotinoidokból képződik. A karotinoidok az A-vitamin provitaminjai, izoprén vázas vegyületek, melyekben konjugált kettős kötés rendszer található. Karotinoidok a növényekben, és egyes moszatokban is megtalálhatóak (például vörösmoszatokban, barnamoszatokban). A provitaminok vitaminná történő átalakítása során a β-karotin körülbelül hatodrésze, az egyéb karotinoknak csupán a tizede alakul át retinollá. A növényi eredetű β-karotin karoténdioxigenáz hatására alakul A-vitaminná. Állati eredetű táplálék fogyasztásával kész A-vitaminhoz is juthatunk. Míg az α- és β-karotin szerkezetében két gyűrű is található, addig a γ-karotin csak egy gyűrűt tartalmaz, a likopén pedig egyetlen gyűrűt sem. A zeoxanthin hidroxilált β-karotin származék. Előállítás • Kémiai szintézissel (polimerizáció): ez a leggyakoribb, legjellemzőbb előállítási mód • Növényekből (sárgarépa), algákból is izolálható • Élesztővel fermentációs úton Blakeslea trispora élesztő bizonyult a leghatékonyabb βkarotin termelő fonalasgombának. Kevert tenyészettel 3 g/l-es vitaminkoncentráció érhető el. A fermentációs eljárás azonban nem versenyképes (bár sokféle mikroorganizmus képes karotinoidok előállítására), a szintetikus technológiák olcsóbban kivitelezhetőek. A nyersanyagárak növekedésével ezek az arányok a jövőben megváltozhatnak a fermentációs előállítás javára. Felhasználás: Humán vitaminként történő használata mellett az A-vitamin margarin, sajt, tojástermékek engedélyezett élelmiszer-színezéke. Más színezékekkel szemben előnyösebb, mert szervezetbarát (természetes színezék). Elsőként a Roche cég állított elő β-karotint élelmiszer-ipari célokra. Az A-vitamin felhasználás körülbelül 100 tonna évente a világon.

B12-vitamin (kobalamin): A B12-vitamin ún. C1-átvivő, így egyszénatomos egységek szállításában vesz részt. A C1 egységek a metil-, metilén-, metenil-, formil-, és formimino-csoportok. (A C1 egységeket a szervezetben a metil-terahidrofolát, betain, metil-B12, S-adenozilmetionin hordozzák.) Az 1920-as évekig halálos betegségnek számító vészes vérszegénység gyógyítója két orvos volt, George Richards Minot és William Perry Murphy. Rájöttek, hogy ha betegeik nagy mennyiségű marha májat esznek, azzal a betegség kordában tartható. 1926-os felfedezésükért 1934-ben Nobel-díjat kaptak. Az 1930-as évek folyamán a kutatók világszerte próbálták izolálni a májban található gyógyító hatóanyagot, melyről úgy hitték egy B-vitamin, ezért a B12 nevet adták az anyagnak, jóval az izolálása előtt. 1934-ben Ricke és Smith májból izolálták a vészes vérszegénységet gyógyító vitamint. A vitamint először kristályos formában 1948-ban állították elő mg-os mennyiségben, mintegy hat tonna máj feldolgozásával. (A B12-vitamin szerkezetének felderítésében nagy szerepet játszott Dorothy Hodgkin munkája, melyért 1964-ben kémiai Nobel-díjat is kapott.) Az 1950es években először melléktermékként nyerték ki a B12-vitamint sztreptomicin és klóramfenikol, vagy neomicin fermentációk fermentleveiből. A vitaminhozam ekkor körülbelül 1 mg/l volt. A B12-vitamint az emberi szervezetben a bélmikroflóra képes megtermelni a vastagbélben, de ott a vitamin nem tud felszívódni, csak a gyomor és a vékonybél nyálkahártyája által kiválasztott glikoproteinhez kapcsolódva (intrinsic faktor). Az esetek többségében vitaminhiány akkor lép fel, ha nem képződik a kobalaminokat szállító intrinsic faktor. A vitamint élelmiszerekből is felvehetjük (máj, vese, szív, hal, tojás, tejtermékek). A vitamin gyógyszerként használatos vészes vérszegénység kezelésére. A B12 a takarmányiparban is használt vitamin, sertések és szárnyasok. A B12-vitamint olyan tetrapirrol gyűrű (koringyűrű, mely a porfirinhez hasonló) építi fel, melyben kobalt található. (Ha a kobaltot magnézium helyettesíti, akkor klorofillról, ha vas, akkor hem alegységről beszélünk.) A kobalamidban a ribóz C-1 atomja az 5,6dimetilbenzimidazol bázisával kapcsolódik össze, amely a CN mellett kobaltot tartalmaz további koordinációs pontként. Előállítás: A B12-vitamin előállítására többféle eljárás és többféle mikroorganizmus használatos. 

sztreptomicin fermentáció melléktermékeként (1 mg/l-es koncentráció, törzsfejlesztéssel eljutottak a 3,3 mg/l vitamin koncentrációig)



biológiai szennyvíztisztító: az eleveniszapban a sejtekben felhalmozódik a vitamin (4-10 mg B12/kg iszap).



de novo szintézises fermentáció (Farmitalia; GSK; Merck; Rhone-Poulenc ma: Sanofi; Gistt-Brocades ma: DSM).



Metanolhasznosító vegyes tenyészetekkel

A leggyakrabban alkalmazott mikroba a Pseudomonas denitrificans (ezzel a mikroorganizmussal a Merck gyógyszergyár fejlesztett ki technológiát először, mely eljárást szabadalmaztattak is az 1950-es években). Különböző Propionibacteriumok (P. shermanii, P. Freudenreichii) is alkalmazhatóak (Chinoin), valamint metántermelő anaerob baktériumok (Richter), metanol szénforráson alkalmazva. Az alkalmazott szénforrás lehet glükóz, vagy metanol. Glükózon végzett fermentációk: 

Streptomyces olivaceus (3,3 mg/l)



Propionibacter shermanii (30-40 mg/l) (100 mg/l)



Pseudomonas denitrificans (60 mg/l)

Protaminobacter ruber és Rhodopseudomonas spheroides protoplaszt fúziójával a Farmitalia által létrehozott Pseudomonas putida segítségével 120-150 mg/l koncentráció érhető el. Metanol szénforráson a sejtek termelnek B12-vitamint, mely a C1-metabolizmus koenzimje, ezért feltétlenül szükség van jelenlétére a sejtekben a C1-átvitelhez. Metanol szénforráson végzett fermentációk: 

Methanosarcina bankerii (42 mg/l)



Eleveniszap (35 mg/kg)



Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207



Propionibacterium shermanii ATCC 13673

A fermentáció kétlépcsős, egy 2-4 napig tartó anaerob és 3-4 nap hosszú aerob szakaszból áll. Így 100 mg/l-es koncentráció érhető el, azonban a termék intracelluláris, így sejtfeltárásra van szükség. Ezt hőkezelés segítségével oldják meg, melynek hatására a sejtek felszakadnak és a kiáramló vitaminnak köszönhetően vörösre festik a fermentlevet. A kezelés 10-30 perces forralásból áll, 80-120°C-on, 6,5-8,5 pH-n. Az így kapott termék az instabil hidroxi-kobalamin, melyet kémiai konverzióval alakítanak már stabilis cianokobalaminná. A nyerstermék körülbelül 80%-os tisztaságú, a gyógyszertisztaság pedig 95-98%-os, ezért a kapott vegyületet kromatográfiás eljárás segítségével tisztítják (az átlátszó oszlopon követhető a vörös színű B12-vitamin). A hozam 75%-os. 1. Pseudomonas denitrificans A fermentáció során prekurzor vegyületeket adagolnak, például 5,6-dimetilbenzimidazolt. A melaszon végrehajtott fermentáció előrehaladását betain adagolással segítik, mely növeli a bioszintézis hatékonyságát, emellett a sejtmembrán permeabilitását is növelheti. Ezt a fermentációs eljárást nem emelték ipari szintre, a kísérletek laboratóriumi körülmények között folytak. Tizenkét éves törzsfejlesztés során a kezdeti elérhető 0,6 mg/l B12-vitamin koncentrációt sikerült 60 mg/l-re növelni.

2. Metanolhasznosítók A Kőbányai Gyógyszergyárban (ma: Richter) dolgozó Johan Béla jelentős eredményeket ért a hazai B12-vitamin-gyártásban. A Richter Gedeon Nyrt. korábban a B12-vitamin gyártási technológiájával a világpiacon is jelentős szerepet töltött be. (Az 1960-as években a Szovjetunió jelentős szállítója volt, a 70-es évektől pedig egyre nagyobb mértékű lett a nyugati export is.) 1000 m3-es anaerob reaktort alkalmaztak, metanol rátáplálást, félfolytonos technológiával. Állandó keveréktenyészetet, mely 2-3 B12 termelő és emelett 3-4 „szinbionta” törzsből állt. (Korábban az inokulum a szennyvíztelepről érkezett.) A cég a világon az egyetlen volt, mely keveréktenyészetekkel állíttatta elő a B12-vitamint. A cég dorogi üzemében alkalmazták a keverék tenyészetes eljárást. A befertőződés veszélye csekély, mert a kizárólagos szénforrásként adott metanol sterilizáló hatást is kifejt. A fermentáció folyamatos, újraoltásra nincs szükség. Az 1950-es években a világtermelés (700 g) felét hazánkban gyártották (362 g). A folyamat nagyon olcsó, mert az eljárás anaerob (nincs szükség levegőztetésre), nem steril, közönséges vaslemez tartályokban (4 x 1000 m3) kivitelezhető, keverési igénye minimális (naponta négyszer negyedóra). Ez tette gazdaságossá a viszonylag alacsony hatóanyag koncentráció ellenére is. Az üzem az ezredfordulóig működött, ekkor már annyira elhasználódott, hogy a felújítása nem lett volna gazdaságos. A sejtfeltárást hőkezeléssel és pH állítással végezték, majd a kapott terméket cianid hozzáadásával alakították át (hidroxikobalamin → cianokobalamin). B2 vitamin: Riboflavint viszonylag sok mikroorganizmus képes szintetizálni, közöttük több baktérium, fonalasgomba és élesztő, ipari alkalmazásban azonban két fonalasgombának van nagyobb jelentősége. Kezdetben Eremothecium ashbyii törzsekkel végezték a fermentációt, majd egy genetikailag stabilabb törzsre, az Ashbya gossypii törzsre dolgoztak ki fermentációs eljárást. Ezzel a törzzsel jelentős hozamok érhetőek el, azonban így is erőteljes versenyben áll a fermentációs vitamintermelés a kémiai szintézissel. A gomba azért termeli túl a riboflavint, hogy megvédje a spóráit az UV-fénytől. Az Ashbya gossypii-vel (NRRL Y-1058 mutáns) végrehajtott fermentáció körülményei: Szénforrásként alkalmazható kukoricalekvár (CSL) + pepton + szójaolaj, glükóz, inozit (pszeudo-cukor, ciklohexán: nem oxigén zárja a gyűrűt) rátáplálással. Enyhe levegőztetés szükséges (0,3 vvm). A kívánt termék intracelluláris, ezért hőkezeléssel tárják fel a sejteket. A fermentációval 15 g/l vitaminkoncentráció érhető el. C-vitamin: A szintézisnek csak egy lépése nem kémiai: a D-szorbitból L-szorbózt csinál az Acetobacter suboxydans a Bertrand-szabály szerint: a régiospecifikus enzime, akkor oxidálja a három egymás melletti szénen lévő OH-csoport közül a középsőt ketocsoporttá, ha a három csoport sztereokémiai szempontból egy irányba néz.

Mikrobiális poliszacharidok A növényi poliszacharidokat régen alkalmazzák: keményítő, cellulóz, agar-agar, alginát, pektin, inulin... A mikróbiális poliszacharidokat csak néhány évtizede használják, pedig sokféle van belőlük: dextrán, xantán, pullulán, szkleroglükán, leván, ciklodextrin. Elsősorban reológiai tulajdonságaik miatt használják őket. Funkció a természetben: kiszáradás ellen, fagocitózis ellen, tartalék tápanya immunológiai determináns. Lehetnek extracellulárisak, vagy sejtfalhoz, illetve sejtmembránhoz kötve. A növényi poliszacharidok gyártása sokszor nem elég tiszta és reprodukálható a gyógyszergyárak számára, úgyhogy egyes anyagokat, pl. alginátot, az algából történő kivonás helyett szintézissel próbálják előállítani. Helytelenül olvadáspontnak nevezik azt a hőmérsékletet, ahol a viszkozitás drasztikusan leesik. Pszeudoplasztikusság az a tulajdonság, hogy a viszkozitás függ nyíróerőtől. Xantán bioszintézis: 12 enzimes lépésből áll, ez a 12 gén egy operonban található. Az öt építőegység a sejten belül kapcsolódik össze a sejten belül, egy lipid-carrierhez kötve, majd ez leválik és egy transzferáz enzim kilöki a citoplazma-membránon. A sejten kívül kerül állnak össze polimerré és itt kerül rá az ecetsav és a piruvát is. Móltömeg akár 10-15 millió is lehet. Ha sok xantánt akarok, akkor nem érdemes babrálni az egyes géneket, mert előtte-mögötte van egy csomó másik gén, aminek adott a sebessége. Mivel egy operonon vannak, ezért inkább a promóterhez kell hozzányúlni, nagyobb kópiaszám kell az mRNS-ből. A sejt így csinálja, lássuk, hogy csinálja az ember: mi kell hozzá? Hát mivel poliszacharidról beszélünk ezért pl. sok cukor, ez tipikusan glükóz. Kevés nitrogén kell, hogy ne szaporodjanak, hanem raktározzák el a glükózt xantán formában: magas C/N arány. A pH kb. semleges. A levegőztetés problémás, mert viszkózus a tápoldat. Nagy átmérőjű, függőleges elemekkel összekötött keverők a legjobbak. Sajnálatos pozitív visszacsatolás, hogy ahol nincs keveredés, ott nő a viszkozitás, emiatt még nehezebb keverni, így ott örökre holttér keletkezik. Gyártás: ~30.000 t/év Törzs: Xanthomonas campestris - növénypatogén (főleg káposzta, gyümölcsfák) – a technológiából nem kerülhet ki élő sejt (kimenő levegő szűrése, lé utósterilezése). A xantán burok miatt rossz az anyagátadás a környezettel, emiatt lassan növekszik, más törzsek könnyen túlnövik. Törzsfenntartás, inokulum készítés: Papírcsík inokulum technika:

Szűrőpapírcsíkba beitatva és megszárítva tartós és könnyen kezelhető törzskonzervet kapunk; hagyományos átoltásos technikánál gyorsabb, egyszerűbb törzsfenntartás. 

C-forrás: glükóz (4-5 %), mert 2-3%-os xantán már nagyon viszkózus.



N-forrás: komplex, szerves anyagok (0,05-0,1 %)



Hőmérséklet: 28-31 °C



pH: 7  0,3, a képződő savakat közömbösíteni kell



Időigény: 40-48 óra



Konverzió: 68-70 %, azaz 25-30 g/l

Down-stream: Hőkezelés: 90°C-on – pasztőrözés, a mikrobák elölése. A mikrobiális poliszacharidok vízben oldódnak, így ha csökkentem a közeg polaritását, akkor kicsapódnak: alkoholos kicsapás (hexán is kicsapja, de az nem oldódik a vízben!), le lehet szűrni, kiszárítani, megőrölni, eladni. Rengeteg alkohol (etanol) kell hozzá (1:1), ezért nagy oldószer-regenerálóra van szükség (kb. 10-12% vízig desztillálják). Dextrán: glükóz polimer, lineáris rész: α(1-6), elágazás α(1-4) kötéssel Bioszintézis: transzglikozilálás, egy lépéses. A Leuconostoc mesenteroides megfogja a szacharózt, leveszi a glükózt és ráteszi a polimer végére, a fruktóz pedig megmarad, kivéve azt az egyet, amivel kezdődik a lánc. A cukorgyárak nem igazán szeretik ezt a folyamatot, mert eldugulnak a csövek. A tejsav bacik hajlamosak annyi tejsavat termelni, hogy magukat is megöljék, ezért azt fermentáció közben semlegesíteni kell. A folyamat anaerob, nem kell levegőztetni. A nitrogén-tartalom alacsony, a sejttömeg mindössze 0,5 g/l, ez 80 g/l dextránt termel. Feldolgozás: kicsapás metanollal, szűrés, oldás pirrogénmentes vízben, újabb metil-alkoholos kicsapás. Felhasználás: Vérplazma-pótló: ehhez fel kell darabolni, mert a humán szérum albuminnak nem 500 kDa, csak 66 kDa a móltömege (de ez alá, ~55kDa-ra, a vese szűrési határa alá törik, így szép lassan lebomlik). Vagy enzimes, vagy savas hidrolízis után frakcionált kicsapás. Dextrán gél (kromatográfiás töltet, méretkiszorításos kromatográfiához): térhálósítani kell: vízoldhatatlan, inert, hidrofil szemcsék. Sephadex®: Separation Pharmacia dextrane (ma GE Healthcare, USA tulajdona). Leván: Bacillus subtilis vagy Aerobacter levanicum leván-szacharáz enzimje szintetizálja ezt a polifruktózt. A konverzió a dextrán 100% helyett csak 62%. Felhasználás: élelmiszeripar, kozmetika, gyógyszer.

Pullulán 

Törzs: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba



α-1,4- és α-1,6 glükán szerkezet



Változó molekulatömeg



Vízoldható, vizes oldata igen viszkózus



Jó adhéziós tulajdonság



Nem toxikus



Fermentáció: 4 % cukor, 5 nap, ~70 % hozam



Felhasználás: filmek (ehető is), fóliák készítése

Szkleroglükán 

Törzs: (Sclerotium Athelia rolfsii, S. glucanicum)



β-glükán: nagyrészt β(1-3) és kevés β(1-6) kötés



Vízoldható



Pszeudoplasztikus tulajdonság



Felhasználás: o kőolajfúrási iszapok stabilizálására o festékek, tinták készítésére o növényi magbevonat ragasztójaként

Alginát 

Mannuronsav β(1-4) polimer, kevés guluronsavval > anionos jellegű (vö. pektin)



Kationkötő, kationcserélő



Ca2+- ionokkal gélt képez (sejtek bezárása)



Eredetileg tengeri moszatokból nyerték ki, ma fermentálják is (Ps. aeruginosa, Azotobacter vinelandii).

Hialuronsav: Diszacharid egységekből (1-3 glükuronsav + 1-4 glükózamin) álló polimer. Polimerizációfoka változó, több milliós móltömegig. Az élőlényekben sok helyen fordul elő, legnagyobb koncentrációban, a kakastaréjban. Szerepe többféle: – Kenőanyag ízületi felszíneken – Sejtek mechanikai védelme – Sebgyógyulás folyamata – Magzati fejlődés, differenciálódás Alkalmazásai: – Égések, forrázások, sebgyógyulás – Ízületi súrlódások kezelése injekcióval – Plasztikai sebészet: feltöltés, implantátum – Kozmetikumok

Gyártás: Kétféle eljárást használnak: szervextrakció (kakastaréj), fermentáció. A fermentációs gyártás valamivel olcsóbb, de az injekciós minőséget nehezen éri el. 1. A szervek aprítása 2. Fehérjebontás alkálikus proteázzal (pH= 8) 3. Főzés híg savas oldatban 4. Szűrés 5. Kicsapás benzalkónium-kloriddal, szűrés 6. Visszaoldás NaCl oldatban 7. A maradék benzalkónium-klorid butanolos extrakciója 8. Kicsapás, mosás etanollal. Heparin: Minden szerv által termelt, véralvadásgátló szulfonált poliszacharid. Ciklodextrinek: Glükóz egységekből álló oligomer, amiben az OH-csoportok kifelé állnak, belül pedig enyhén apoláris. Van 6-os, 7-es és 8-as gyűrű (sorban: α-, β-, γ-CD). Elég sok törzs tud ilyet csinálni, α-amilázzal előkezelt keményítőből. Az α-amiláz endoenzim, ezzel kb. 10-es polimerizációig kell előbontani, ez a CGTáz (ciklodextrin-glikozil-transzferáz) szubsztrátja: 6ot összehajt, a többi felesleges 4-et levágja. Általában nem nyugvósejtesen csinálják, hanem izolált enzimekkel. Arányszabályozás: Toluol adagolásával el lehet tolni az arányt, mert βzárványkomplexet lehet kialakítani, ami csak nagyon kissé oldódik vízben, kicsapódik, végül 90% β-CD és 1% α-CD lesz. 1-dekanollal 3,7% β-CD és 36% α-CD lesz.

Mercian-eljárás: Bacillus circulans enzim, vizes oldatban: 

pH = 6, T = 55°C, 8,3 % elfolyósított keményítő nem használnak zárvány molekulát.



α-, β-, γ-CD keverék képződik, hozam: α -22,3 %, β -10,8 %, γ -5,1 %  Σ=40%



Elválasztás: szelektív adszorpcióval (folyamatos recirkuláció, hűtés 30°C-ra, majd vissza 55°C-ra)



α-megkötés: kitozán hordozón sztearinsav ligand szelektivitás: ~100 %.



β-megkötés: ciklohexán–propánamid-n-kapronsav ligandon

Irányított gyártások: α-CD: Dekanollal komplexálják, emiatt szinte csak α-CD képződik (a terméket folyamatosan elvéve az egyensúly sose áll be), a túl jó oldódás miatt viszont nehéz kikristályosítani. Desztillálják, a hozam így kb. 50%. β-CD: Hidrolízis: 33%-os keményítő, folyósítás a-amilázzal, 80°C-on, 1h, pH=7.2, Ca2+ kell. Enzim inaktiválás: 100-120°C-on 30 percig. Biokonverzió: CGT-áz enzim, 50 °C 100105 h, keverés. toluollal komplexálják, jól kiválik, szűrik, vákuum bepárlás (toluol el), kristályosítás. Hozam: ~90%. γ-CD: Nehéz előállítani, és kisebb is rá az igény, β-CD gyártás mellékterméke. Konverzió CGT-ázzal. Komplexáló szer: metil-etilketon-α-naftol keverék. Oldhatatlan komplex, mely metanolban azért oldódik. Ioncsere, aktív szenes tisztítás. Hozam: ~20% Felhasználás: Molukulacsomagolás: gyógyszerek formulázása: nő a felszívódás, vízben nem oldható vegyületek is adhatók injekciókban, hozzáférhetőség nő. Stabilizál: véd a párolgástól, oxidációtól, hőtől. Irritáló hatás csökkenthető. Példák, amiket CD-kbe raknak: prosztaglandinok, koleszterincsökkentő fokhagymaolaj, szteroidok. Élelmiszeripar: íz- és illatanyagokat stabilizálja. Vajból ki lehet venni a koleszterint β-CD-vel. Kozmetikumok: az illat hosszabb ideig megmarad. Egyéb iparágak: Mikrobiológiai konverziók: a szteroid kristályok nem oldódnak fel, ezért CD-ekkel kell bevinni a fermentlébe. Szennyvíz detoxifikálásra is lehet használni, akkor, ha valamilyen anyagot kis koncentrációban el tudja bontani a mikroorganizmus, de ha hirtelen sokat kap, akkor az elpusztítja. Ilyenkor β-CD-t adunk a léhez, ami fokozatosan, lassan adja le az anyagot. Biospecifikus elválasztás: CD-vel töltött oszlopon átfolyatunk α-amiláz-tartalmú folyadékot, amit mondjuk, tisztítani akarunk. Az enzim ráharap a CD-re, mert a keményítő szubsztrátanalógja, de lebontani nem tudja, így később lemoshatjuk

Nukleinsav manipulációs enzimek Restrikiós enzimek (RE): Önvédelmi funkciójuk van, meg tudják különböztetni a saját DNSt az idegentől, a metilezettség alapján. Minden restrikciós enzim nevének első három betűje az őt előállító mikroorganizmus latin nevéből ered, az első betű a genus nevének első betűje, a következő kettő pedig a fajnév első két betűje. Jelentőségük: A RE-k helyspecifikus endonukleázok, azaz specifikus pontokon vágják a nukleinsavak belsejét. Alkalmasak:  



DNS szekvenálására restrikciós térképezésre (a cél a teljes genom bázisszekvenciájának és ez alapján a gének kódoló régióinak meghatározása (DNS részleges emésztése endonukleázokkal, majd a keletkezett DNS darabok szekvenálása, összeillesztése, a kromoszóma szakaszok azonosítás) gének izolálására (gén manipulációban), gén átvitelre (génsebészetben rezisztencia



bevitele, markerek bevitele) plazmidok, vírusok hasonlóságának bizonyítására

Reverz transzkriptáz (RTC): megtörte a centrális dogmát, ez mRNS-ről ír a DNS-re. Először a poliA farokhoz hozzáköt egy poliT farok, majd a reverz transzkriptáz kiegészíti ezt egy- az RNS-sel komplementer szállal, amelynek egy kis szabad szakasz lesz a végén. Ezt követően NaOH-os kezelésnek vetjük alá (cDNS), majd a DNS-polimeráz befejezi a szabad szakasz folytatásaként a másik szálat is. A két szál közötti kapcsolatot az S1 nukleáz (ld. később) szünteti meg. A DNS-ligáz pedig összekapcsolja a kisebb DNS darabokat. T4 DNS-ligáz: Feladata a szomszédos nukleotidok, a cukor-foszfát gerinc összekapcsolása. Foszfodiészter-kötést képez a szintetizálódott szál fragmentumai között. A ligáz alkalmas mind tompa, mind ragadós végű DNS darabok összekapcsolására, valamint linker szakaszok DNShez illesztésére is.

 ragadós és tompa végű DNS kapcsolása: A DNS-ligáz sebességét jellemzik a következő értékek: 20°C; 1 óra; ragadós vég 95%-a kapcsolódik össze 20°C; 1 óra; tompa vég 50%-a kapcsolódik össze Ezen értékek növelhetőek 8-10 %-os polietilén glikol (PEG) hozzáadásával, valamint az enzimkoncentráció növelésével.  linker szakasz kapcsolása: a linker egy kétszálú, palindrom szekvenciájú, restrikciós endonukleáz hasítási helyet tartalmazó oligonukleotid, amit a DNS-ligázzal DNS szálak végéhez kapcsolhatunk. Alkalmas klónozandó DNS szakaszok vektorba történő beépítésére, amennyiben a használt vektor és az adott linker azonos restrikciós enzimmel hasítható. Klónozandó DNS RE-val támadható (PstI)  Vektor bontása RE-val  T4 DNS ligáz köti a vektort és a DNS darabot . Terminális transzferáz: A DNS 3’ végén képes homonukleotid farkat kiépíteni, tapadós véget eredményezve. Borjú csecsemőmirigyéből nyerhető ki. Alkalmazása: 1. RE-mel emésztett DNS darabok összeillesztésére azáltal, hogy homonukleotid végeket képez és azok ragadós végként összeilleszthetőek 2. Rekombináns plazmid készítésére Klenow-enzim: A DNS-polimeráz I egy része a Klenow-fragmentum. 3 doménből áll és 3 enzimaktivitása van. Az enzimrészletet az E. coli DNS-polimeráz I enzimének részleges proteolízisével állítják elő. A Klenow-fragmentum megtartja a DNS-polimeráz I-re általánosan jellemző DNS-polimeráz (5’3’) és 3’5’ exonukleáz aktivitást, de elveszti az 5’3’ exonukleáz aktivitást. Klenow-enzim felhasználása: o Sanger DNS szekvenálás: 3’ 5’szintézis o Reverz transzkiptáz után a második lánc szintézise o Ragadós vég feltöltés és levágás

S1 nukleáz egy glikoprotein: 18% szénhidrát tartalmú, pH-optimuma= 4,0 - 4,3; Zn igényes. Nukleotid láncokat bont (egyszálút 75.000-szer gyorsabban, mint kettős szálút, a DNS-t ötször gyorsabban, mint az RNS-t) Aspergillus oryzae termeli. Felhasználása: • • • •

Egyszálú, kiugró DNS/RNS szál bontása Intron régió térképezés (?) DNS hurok lebontása cDNS-nél Ragadós vég lebontása

Bal 31 nukleáz: Alteromonas espejiana termeli. Kétszálú DNS bontására alkalmas, exonukleáz aktivitása mind a 3’, mind az 5’ végen működik. Endonukleáz aktivitása kicsi, felesleges részek eltávolítására alkalmas, de ezt a tulajdonságát igyekszünk visszaszorítani. Működéséhez Mg2+ és Ca2+ szükséges. Felhasználása: szignál szekvencia lebontása: preproinzulin  proinzulin. T4 polinukleotid kináz: E. coli T4 fágjából izolálták. Négy azonos alegységből áll, pHopt= 7,6; Topt= 37 °C. Működéséhez Mg2+ és ATP szükséges. Az 5’ véghez foszfát csoportot kapcsol, illetve kicserélődést katalizál. Felhasználás: • • •

5’ vég izotópos jelölése (Maxam-Gilbert szekvenálás, valamint Sanger módszer) 5’ foszfát addíció oligonukleotidra 3’ foszforil csoportok eltávolítása

Taq-polimeráz: Magas hőfok optimumú DNS-polimeráz. Thermus aquaticus (hőforrásból), Hőstabil, (Topt=75°C). Sebessége: 150 nukleotid/sec, pontossága viszont hagy kívánni valót maga után, ezért a jó doménjeit mostanában hibridizálták egy olyannal, ami ellenőrzi is, amit csinál. Felhasználása: PCR technikában.

Tumorellenes hatóanyagok (mikrobiális, növényi) Aktinomicinek: Kinon szerkezet: nagyon érzékeny redox reakciókra: szeretne hidrokinonná alakulni. A szerkezetből látszik az is, hogy színes, hő-, szabadgyök- és fényérzékeny. Apoláris oldószerben nem oldódik jól, vízben, alkoholban igen.

Szintézis: A két ciklopeptid tiotempláton képződik. Az aminosavak úgy kapcsolódnak össze, hogy minden egyes aminosavhoz tartozik egy őt megkötő enzimfehérje, ezek összeállnak egymás mellé körbe, mint az óra számlapján a számok. Mindegyik megköti a saját aminosavát, és attól tio a templát, hogy ezt egy SH-csoporton keresztül teszi (tioésztér forma). Amikor az enzimek mindegyik fogja a saját aminosavát, akkor egy ATP segítségével aktiválódik a rendszer, és létrejöhet a ciklopeptid. Érdekessége, hogy van egy peptid, aminek az aminosav-sorrendjét nem a DNS vagy az mRNS tárolja, hanem az enzimkomplex, aminek kötőhelyei hajlamosak megkötni bizonyos aminosavakat. A fenoxazin váz a triptofán bomlástermékeiből képződik, két egyforma vegyület dimerizálásával. Hatás: Guaninhoz kötődik, gátolja a transzkripciót, erősen az RNS-re, kevésbé a DNS-re. Előállítás: fermentációval. Igen veszélyes anyag, a gyártásnál és feldolgozásnál végig teljesen zárt technológia (containment). A készülékeket csak ártalmatlanító tisztítás után szabad megnyitni, minden elmenő anyagot helyben ártalmatlanítani kell. A technológia végén, a kristályos anyag mozgatásánál, kiszerelésénél a dolgozókat szigetelik el - „űrhajós” védőruhában dolgoznak. Felszívódás: pora bőrön át vagy belélegezve is felszívódik. Toxicitás: vörös csontvelő működését károsítja, gyomor és bélpanaszok, veseműködési zavart is okozhat (reverzibilis).

Antraciklinek: daunomicin, Adriamicin (doxorubicin)

Tulajdonságok: 

vörös kristályos anyag, sóképzésre hajlamos: hidrokloridját (.HCl) hozzák forgalomba



maró, hólyaghúzó anyag



kémiai módosítással létrehozott származékainak hatása mind gyengébb

Bioszintézis: Analóg a tetraciklinekkel, poliketid típusú, acetil-KoA-kból épül fel. Előállítás: Fermentációval. Hatás: A DNS láncok közé ékelődik, a cukor a dezoxiribóz-foszfát láncokhoz köt. (daunóz + dezoxiribóz), 60-100 bázispár / AB molekula. Gátolja a transzkripciót RNS-re, DNS-re, különösen az rRNS-re. Gátolja a DN-ázok működését is. Hatásspektrum: leukémia, szarkómák, Hodgkin-kór, stb. Toxicitás: Az általános + szívizom, szívműködés (tachycardia, arytmia). Ha a bőrre kerül, hólyaghúzó hatású (másodfokú égéshez hasonlító tünetek: hólyagok stb.). Az Adriamicin kevésbé toxikus. Felhasználás: infúzióban, erősen hígítva, mert a beadás helyén is károsítaná a szöveteket, terápiás index kicsi.

Kromomicinek: mitramicin, olivomicin

Tulajdonságok: 

sárga, kristályos anyag



pH=4 alatt hidrolizál (messze a fiziológiástól)



kétértékű ionokkal kelátot képez, Ca, Mg rendben van, de a nehezebb fémekkel alkotott kelátja oldhatatlan ezért biológiailag inaktív.

Hatás: Egy Mg2+ ionnal dimert alkot, ez illeszkedik be a DNS láncok közé. Ez is a guaninhoz kötődik. 4 bázispárnyi hosszan fedi le a DNS-t. Gátolja a transzkripciót DNS-re és RNS-re egyaránt, de a reverz transzkriptázokat nem. Hatásspektrum: malignus hypercalcaemia ellen  leviszi a Ca2+ szintet  zavarja a véralvadást Toxicitás: az általános + máj- és veseműködési zavarok Felhasználás: infúzióban, terápiás indexe kicsi

Mitozánok: mitomicin C Tulajdonságok: Kinon  vörös, bomlékony, oxidáló hatásra, fényre érzékeny kristályos anyag alkoholban jól oldódik, vízben alig. Hatás: a sejtben alakul át az aktív formává alkilezi a DNS-t = kovalensen összeköti a két láncot  nincs kiírás (irreverzíbilis pontmutációt okoz) Toxicitás: általános + bőrkiütést okoz a bőrhámra kerülve Alkalmazás: emésztőcsatorna rákjai, pikkelysömör, melanómák [csúnya bőrelváltozások, áttétek] ellen intravénás injekcióban.

Glükopeptidek: Bleomicin

Oligopeptid, egy heteroaromás gyűrűvel, és két cukor egységgel. Az egyes aminosavak nehezen ismerhetők fel, a bioszintézisből látszik, hogy szokatlan elemekből áll. Tulajdonságok: Krémszínű kristályok higroszkópos vízben jól oldódik, redox érzékeny: -SH vegyületek, H2O2, aszkorbinsav, nehézfémionok inaktiválják. Hatás: Beilleszkedik a DNS kettős spirál kisebbik hajlatába. Gátolja a timidin beépülését a DNS-be. Jelenlétében a DNS fragmentálódik. Alkalmazás: Csak parenterálisan, nincs immunszuppresszív hatása - a nyirokszövetek enzimjei lebontják - de nem is alkalmazható a nyirokrendszer tumorjai ellen.

Aminoszterolok: Szkvalamin.

Teljesen más eredet, szerkezet, támadáspont. 1992-ben izolálták a Squalus acanthias (cápafajta) májából. (felfedezés alapja: a porcos halak - így a cápák - között nagyon ritka a tumor. Keresték a védettség okát. Tulajdonságok: vízoldható, ellenálló molekula, mint a szteroidok általában

Bioszintézis: epealkoholokhoz hasonló, poliamin módosítással, prekurzorként szerepelhetnek a szteroidalkoholok. Előállítás: szintetikusan Hatás: Közvetlenül gátolja az endothel (érfal) sejtek aktivációját, mozgását és szaporodását így a tumor vérellátását csökkenti (a tumornak a gyors szaporodáshoz megfelelő vérellátással kell rendelkeznie) mikróba-, tumor-, angiogenezis (érfal regeneráció, különböző növekedési faktorok hatására) gátló hatású. Hatásspektrum: Gliómák (agydaganat), kóros érfalnövekedés okozta betegségek (rák, diabeteszes retinopátia (vaksághoz vezethet), fibrodysplasia ossificans progressiva (genetikai betegség: a nagyobb izmokban folytatódik a csontok képzése ez mozgáskorlátozottsághoz vezet)), tüdőrák, petefészekrák, egyéb tumorok, melanóma, mell-, agyrák. Felhasználás/Alkalmazás: Kemoterapikumokkal (pl. Cytoxan) kombinálva, de még csak klinikai vizsgálatokban (2000).

A mikrotubuláris rendszer

A mikrotubuláris rendszer az eukarióta sejtek tubulinból és a hozzá kapcsolódó fehérjékből álló rendszere. A mikrotubuláris rendszer érzékeli, monitorozza és megtalálja a sejt geometriai középpontját. Megtalálható az interfázisos sejt citoplazmájában, az osztódó sejt húzóorsójában, az axonban, a ciliumban és a flagellumban. A mikrotubulus kb. 25 nm vastag üreges képződmény. E merev polimer lánc egy jobbmenetes rövidmenetű és egy balmenetes hosszúmenetű hélixből áll. A tubulin, mint monomer az idegszövetben az összfehérje 10-20 %-át teszi ki. Molekulasúlya kb. 50 kDa. A tubulin nem egységes, megkülönböztetünk α- és β- tubulint, ezek egy heterodimer rendszert alkotnak. A geometriai variabilitásra utal, hogy legalább 6 különböző α, illetve βtubulint tudunk megkülönböztetni. A polimerizáció-depolimerizáció folyamatához kémiailag GTP és Mg2+ szükséges. A folyamatot a hőmérséklet döntő mértékben befolyásolja. Magas hőmérsékleten (37°C) a polimerizáció, még alacsony hőmérsékleten a depolarizáció a jellemző folyamat.

A polimerizációt befolyásoló szerek: 

Kolhicin (az őszi kikericsből izolálható antimitotikum; a köszvény gyógyításában már ősi idők óta használt szer, amely MT-polimerizációt gátol). Tumor ellen nem haszálják, mert túl sok a mellékhatása. Ültetvényeken termesztik, magját extrahálják.



Podofillotoxin: az amerikai mandragora (Podophyllum peltatum) rizómájában található lignán. Hánytató, bőrizgató, szemölcsirtó.



Vinca-alkaloidok (vinkrisztin, vinblasztin; MT polimerizációt gátló antimitotikus szerek; P-glikoprotein pumpára is hatnak)



Taxol (tiszafából izolálható; MT stabilizáló antimitotikum)

A vinca-alkaloidok terápiás alkalmazása: Mindkét természetes anyag hatékony neoplasztikus szer, mely megakadályozza az új és az abnormálisan növekedő sejtek, mint például a rákos sejtek osztódását. A rózsameténg leveléből kinyert vinblasztint, vinkrisztint és ezek félszintetikus származékait (vinorelbin, vindeszin) gyakran alkalmazzák a tumor ellenes kezelések során. Bár az egyes molekulák szerkezete között csak csekély különbség látható, de ennek ellenére terápiás hatásuk és toxicitásuk jelentősen eltér. A vinca-alkaloidok sejtspecifikus ágensek, melyek az osztódó sejteket blokkolják a mitózis folyamatában (a metafázisban). Specifikus biológiai aktivitással rendelkeznek, amely során képesek a tubulinhoz kötődni, e húzófonalak képesek a kromoszómákat a sejt megfelelő pólusaiba húzni. Az alkaloidok a heterodimer tubulin béta egységéhez kötődnek és egy irreverzibilis asszociátumot képeznek a spirális polimerrel. Ezzel megakadályozzák, hogy a tubulin húzófonalakká kapcsolódjon össze és így a sejt osztódása megáll. Alkalmazás: limfómák, tüdőrák, áttételes tumorok esetén.

Mellékhatások: az általános, + a vinkrisztin esetében idegrendszeri tünetek. A gyógyászati alkalmazásuk során főleg intravénásan, infúzióban adagolják (szulfátsók formájában). Jelentős szövetirritáló hatásuk van. Metabolizmusuk főleg a májban megy végbe. Kiürülés: kb. 24 óra alatt, a vinkrisztin eliminációja lassabb. Adagját testfelületre számolják ki (mg/m2).

A vinblasztin és vinkrisztin mennyisége a Catharantus roseusban kicsi, mindössze 5 ppm, ezért az extrahált termék ára magas. Más utak: Növényi szövettenyésztés: kalluszban és szuszpenzióban is működik, de rossz kihozatallal, mert meg kell kínozni őket a termeléshez. Alegységkapcsolás: A vinblasztin két monomer egységből épül fel, a catharantinból és a vindolinból. A vindolin koncentrációja a C. roseusban kb. 0,2%, jóval nagyobb, mint a catharantiné. Tehát célszerű a vindolint a növényből extrahálni, és catharantint szövettenyészetben előállítani, majd ezeket enzimes, vagy kémiai úton összekapcsolni. Taxol: Vízben rosszul oldódik, szervers oldószerekben viszont jól. Alkalmazása: petefészek-, méh- és emlődaganatok, agyi tumorok, tüdőrák. Hatása: sztöchiometrikusan kapcsolódik a beépült α-tubulinhoz, azaz nem a mikrotubulusok felépülését, hanem lebomlását akadályozza. Kombinálható a polimerizáció-gátlókkal. Előállítás: A természetes források nagyon korlátozottak, mert a tiszafa igen lassan nő (több száz év), és a kérgében nagyon kis mennyiségben (50-150 mg/kg) fordul elő a taxol. A tűlevélben még kevesebb, 15-50 mg/kg van. Egy beteg kezeléséhez három öreg tiszafát kell feldolgozni. Alternatív eljárások: - félszintézis más taxánvázas anyagokból - totálszintézis: megoldható, de drága (négy C*) - tőlevelek extrakciója (megújul, nem kell a fát kivágni) - növényi szövettenyésztés

Növényi hormonok A növényi hormonok kémiailag és hatástanilag egészen más anyagok, mint az állatiak.   

Auxinok Citokininek Gibberellinek: csak ez fermentációs termék, ezzel foglalkozunk

A japán földművesek régóta tartottak a rizs növény egy megbetegedésétől, amit „bakanae”nak (bolond palántának) neveztek. A fertőzött növény sokkal magasabbra nőtt, mint a többi, ettől végül is kidőlt és nem lehetett learatni. A 1898-ban Kurosava azonosította, hogy az abnormális növekedést egy parazita gomba jelenléte okozza (Gibberella fujikuroi = imperfect alakja a Fusarium moniliforme). Az ötvenes években felújították a kutatásokat, és egy sor anyagot izoláltak, amelyek elősegítik a rizs palánták növekedését. A növekedést az a jelenség okozza, hogy a gomba anyagcseréje során a növényi növekedési hormonnal azonos molekulát állít elő, ráadásul jóval nagyobb mennyiségben, mint a növényi sejtek. Ma már több mint 110- féle gibberellin származék ismeretes (melynek körülbelül 30%-a biológiailag aktív). Gibberellineket alapvetően a magasabb rendű növények termelik, a növekedésüket irányító fitohormonok egyik csoportja. A gomba csak „véletlenül” termeli ezt a hormonhatású szekunder metabolitot. A gibberellinek, mint hormonok, nem csak a lineáris növekedés fokozzák, hanem 

gyorsítják a virág kifejlődését, növelik a méretét (el lehet érni, hogy kétnyári növények már az első nyáron virágozzanak).



magas szintjük megzavarja a virágok ivarát (kétivarú virágok helyett egyivarúak fejlődnek, és fordítva)



gyorsítják a magvak csírázását (malátázás)

Kémiailag a gibberellinek a terpének közé tartoznak, azaz izoprén egységekből épülnek fel. Biokémiailag a gibberellinek szénváza a kaurénvázból származtatható, de a bioszintézis során a középső hattagú gyűrű öttagúvá szőkül, így alakul ki a gibberellán alapváz. Ez két karbonsav csoporttal kiegészülve alkotja a gibberellinsavat (GA). Szénatomszám szerint a gibberellinek két csoportra oszthatók: C-19-es és C-20 vegyületekre. A gibberellinsav származékokat az egyszerűség kedvéért számozással azonosítják, GA1 –től GA45-ig. A három legaktívabb természetes gibberellinsav molekula: A GA1 fordul elő a legtöbb növényben, a GA4 a káposztafélékben, a GA3 pedig az a közös forma, amit a növények és a G. fujikuroi egyaránt termelnek. A további azonosított gibberellinek (a bioszintézis köztitermékei, vagy bomlástermékek) inaktívak, vagy elhanyagolható aktivitásúak. Az aktivitást egy standardizált törpe rizsfajta növekedésével mérhetjük. A bioszintézis a kloroplasztban kezdődik, ott alakul ki a kaurénváz. A második szakasz az endoplazmás retikulumban megy végbe, a B gyűrű beszőkülésével kialakul a gibberellán

váz. Továbblépve a citoszolban működik a GA20-oxidáz, amely GA köztitermékeket hoz létre. Ezután következik a GA3-oxidáz, amely létrehozza a ténylegesen aktív és hatékony GA4et és GA1-et. A gibberellinsav gyártása A gibberellinsav (GA3) fermentációs úton előállítható. A fermentációhoz használt törzs a Gibberella fujikuroi, levegőztetett, szubmerz tenyészetben. A tenyésztési hőmérséklet 25 fok, a pH gyengén savas, 3,5 alá nem csökkenhet. A folyamat tipikus szekunder metabolit fermentáció, a növekedési és termékképzési fázis elkülönül egymástól. A folyamat kulcsmetabolitja a glicin, melynek jelenléte nagyon fontos a sejtek növekedéséhez, a termékképzés viszont már glicin-limitben történik.

Az ábra régi adataihoz képest a modernebb technológiákban a fermentáció ideje lerövidült, és az elérhető gibberellin koncentráció elérte az 1-2 g/l-t. A termék intracelluláris, ezért a folyamat végén autolízis elérésére törekednek, így a termék kiszabadul az oldatba. Feldolgozás: A gibberellinek izolálása semleges közegben megvalósítható anioncserélő gyantán, mivel gyenge savként viselkedik. További lehetőséget jelent a szerves oldószeres extrakció savas közegben, ahol disszociációja visszaszorul, és jobban oldódik szerves oldószerben.

Alkaloidok (fermentált és extrahált - anyarozs, opiát-csoport) Az elsődleges anyagcsere folyamatai és molekulái közvetlenül részt vesznek a normális növekedésben, létfenntartásban és energiatermelésben (anabolizmus és katabolizmus). Hiányukban az élőlény általában elpusztul. A másodlagos anyagcsere folyamatai és molekulái nem vesznek részt közvetlenül ezekben a folyamatokban, célszerűségük, hasznosságuk nehezen értelmezhető. Nem létfontosságúak, megjelenésük csak bizonyos életszakaszokban jellemző. Alkaloid: növényi eredetű, nitrogénatomot tartalmazó, szekunder metabolitok. Régi, empirikus név, arra utal, hogy a N-atom miatt legtöbbször bázikus természetű molekulák. Az anyarozs vagy varjúköröm (Claviceps purpurea) nevű gabonaparazita feketés, sötétlila színű növényi kórokozó, fitopatogén gomba, amely az érett gabonakalászban a virágok helyén egy megnyúlt, 2–5 cm hosszú, görbült, fekete szkleróciumot képez, ez a gomba egyik fejlődési stádiuma. Leállítja vérkeringést, zsibbadást, elhalást okoz. Az anyarozst mesterségesen fertőzött gabonatáblákon termesztik a gyógyszeripari felhasználása miatt (pl. anyaméh-összehúzó, vérzéscsillapító, vérnyomáscsökkentő hatása), mert mint obligát parazita, fermentációs tenyésztése nehézkes. Ergometrin - a szülés megindítására, gyorsítására és érösszehúzó hatása miatt a szüléssel kapcsolatos vérzések csökkentésére használják. Lizergsav-dietilamid (LSD): Fiziológiás függőséget (addikciót) nem okoz. Legveszélyesebb mellékhatása az ún. flashback, amely az egyszeri használat után évek múltán is, bármikor jelentkezhet. Ópium alkaloidok: A Papaver somniferum [= mák, fő termelési helye az aranyfélhold (Afganisztán, Irán, Pakisztán) és az aranyháromszög, (Vietnám, Myanmar, Thaiföld)] tucatnyi hasonló szerkezetű vegyületet termel: morfin, kodein (3-metilmorfin), narkotin, kotarnin, tebain (paramorfin), papaverin, stb. A kábítószerekhez a zöld mákgubó tejnedvét használják. Magyarországon: Kabay-eljárás (Kabay János, BME-VBK, Tiszavasvári) 1925: Előállítás: Bázikus anyagok 1. Extrakció híg savval (sóképzés) 2. Tisztítás, koncentrálás, a bázis kicsapása lúggal 3. Benzolos oldás – csak a morfin oldhatatlan 4. Bepárlás, lúgos oldás – csak a narkotin oldhatatlan

Digitálisz-glikozidok: A gyűszűvirág fajok (Digitalis purpurea, D. lanata) hatóanyagai. A szívizom ionháztartását befolyásolják, meghosszabbítják az akciós potenciál idejét, ezzel növelik a perctérfogatot. Szívelégtelenség esetén használják. Kémiai szerkezet: Szteránvázas aglikon, + 3 cukor (digitoxóz). A szteránváz miatt a vérben jól kötődik a karrier fehérjékhez. A digoxin az aktív hatóanyag, egyetlen -OH csoportban tér el = 12-OH-digitoxin. Előállítás: A növény jelentős mennyiségű inaktív digitoxint is termel, ez egy lépésben hidroxilezéssel átalakítható az aktív digoxinná. A konverziót nem mikroorganizmussal, hanem D. lanata szövettenyészetével végzik. Csak a differenciálódott sejtek képesek az átalakításra, a kallusz nem.

Sejtszaporítás 5 napig, ezután 2 naponként digitoxin adagolás, összesen 15 nap. Melléktermékek: purpurea-glikozid-A és deacetil-lanatozid-C. Reaktor: 200 literes air-lift típusú, vagy immobilizált sejtes. Körülmények: 24 °C, levegőztetés Konverzió: ~67 %-os Hatóanyag extrakció: acetonitrillel. Dioszgenin: Szteránvázas vegyület, a mexikói yam gyökér termeli. A gyökérgumóból extrahálták, de kísérleteztek szövettenyésztéssel is. Régebben jelentős volt a termelése, ma már nem gazdaságos. Felhasználása: szteroid alapanyagként (ma inkább szitoszterolt használnak). Ösztrogén aktivitása is van (= fitoösztrogén)

Biopeszticidek Definíció szerint a biopeszticidek olyan természetes eredetű anyagok, melyeket állatokból, növényekből, baktériumokból vonnak ki különböző módszerekkel. Előnyeik: 

Természetüknél fogva kevésbé toxikusak



Csak a célkártevőkre hatnak



Kisebb mennyiségben fejtik ki hatásukat



Gyorsan bomlanak

A biopeszticidek csoportosítása:  Biokémiai rovarirtók: élőlényekből kinyert, természetes eredetű anyagok, pl: növényi hormonok, kivonatok, feromonok  Növénybe épített védelem (Plant-Incorporated-Protectants; PIPs): A növények génállományába mesterségesen bejuttatott idegen gén Bacillus thuringiensis: A faj leírása: 

Gram+, aerob, spóraképző (parasporális test)



Morfológia: kb. 1 μm átmérőjű, 2-5 μm hosszú pálca



A spóra ellipszis alakú, 0,8*1,6-2 μm



Kristályos fehérje zárvány - (δ-endotoxin)

Metabolizmusa: Kemoheterotróf, aerob közegben a szénhidrátokat szerves savakká, majd CO2-dá alakítja. Komplex anyagcseréje van, a glükózból keletkező ecetsavat a primer metabolizmusban felhalmozza, később hasznosítja. Életciklusa: Spóracsírázás  Növekedés, szaporodás  Spórázás és kristályképzés A δ-endotoxin hatásmechanizmusa: A bélcsatornában előbb feloldódik, majd a fehérje mindkét végén proteolízissel aktiválódik; az öt doménből kettő levágódik. A kiszabadult domének hozzákötődnek a bélhámsejteken lévő receptorokhoz, majd az egyik doménje belefúródik a sejtmembránba, ezzel lyukakat hozva létre, ami a rovar elpusztulásához vezet.

A biopeszticidek előállítási költségének a csökkentése fontos, hogy versenyképesek legyenek a kémiai növényvédőszerekkel szemben. A toxinok szekunder metabolitok, a spórázás során képződnek. A fermentáció kezdeti szakaszában a tenyészet exponenciális növekedő szakaszban van, majd amikor bizonyos tápanyag-koncentrációk a kritikus érték alá esnek, beindul a spórázás. A spórázás befejeztével a sejtek lizálnak, és kiszabadulnak a spórák és a toxinzárványok. A Bacillus thuringiensis a glükózt a glikolízissel hasznosítja, míg az acetát ionokat a citromsav ciklusba viszi. Az exponenciális növekedési fázis alatt a sejtek az acetát ionokat felhalmozzák, majd ezt hasznosítják a spórázás kezdeti szakaszában. Érdekes adat, hogy az acetát hasznosítás már akkor elkezdődik, amikor még kis koncentrációban glükóz van jelen, szemben az E.coli-val, ami csak a glükóz teljes elfogyásakor kezdi az acetát ionokat hasznosítani. Többnyire glükóz szén-forrást használnak, de a nagy (>40 g/l) glükóz koncentráció gátolja a növekedést, ezért rátáplálásos technikát alkalmaznak. A C-forrás lehet még keményítő, glicerin, dextrin, vagy melasz. A nitrogénforrás-igényéről kimutatták, hogy szervetlen nitrogén-sók (pl. (NH4)2SO4) nem elégségesek, szerves nitrogénforrásra is szükség van (húskivonat, pepton, szójaliszt). Egyéb tápanyagok (K+, Mg2+, PO43-, élesztő extraktum) hiánya is okozhat limitációt. A μT értéke 0,5 és 0,8 1/h között mozog. Az 1,25・1010 spóra/ml jó végtermék-koncentráció. Nagy a levegőztetési igénye. Az optimális pH: 6,5-7,5 között van. A tenyészet nem pH érzékeny, de azért pufferelni kell a tápközeget. Fermentációs hőmérséklet: 26-30 °C. A szervetlen ionok közül a Mg, Cu, Fe, Co, Zn, K játszik szerepet. Történtek kísérletek ún. szemiszolid tápközegen történő fermentációra, de előnyben részesítik a szubmerz eljárást. A Nyugat-Európai országokban környezetvédelmi előírás, hogy a biopeszticidek ne tartalmazzanak csírázóképes spórákat (drágítják a terméket). Megoldások: 

Spóramentes mutánsok alkalmazása



Spórák feloldása a fermentlében



Hőlabilis spórát termelő mutánsok alkalmazása

A fermentlé feldolgozásának lépései: 

Centrifugálás, szeparálás (a sejtekben van a kristály)



Adalékok hozzáadása



Porlasztva szárítás



Sterilezés

Formulázáskor figyelembe kell venni, hogy mire fogják használni, pl. ha vízbe kell, akkor jól oldódjon; ha levélre kell, akkor az kell, hogy megtapadjon. Legolcsóbb a fermentlé közvetlen felhasználása, ilyenkor nem is kell porlasztva szárítani, csak a spórákat eltávolítani. Egyebek: Szuszpenziók, tabletták, granulátumok… Minőség-ellenőrzés, analitika: Nehéz feladat, mert nincs szelektív reagense. A hatóanyagtartalmat tehát közvetett módszerrel lehet meghatározni: 

Csírázóképes spóraszámot meghatározni (arányos a kristályok mennyiségével, ha tudjuk a kristályok átlagos tömegét, akkor tudunk következtetni).



Megbízhatóbb „rovar-biotesztek” kifejlesztése (Petri csészébe 10 db lárva + levél, pusztulást számolni), nehéz sztenderdizálni.



Immunbiológiai módszerek (antitest-antigén).

Szteroidkonverziók Az emberi szervezetben a szteránvázas hormonoknak a víz- és sóháztartás szabályozásában (mineralo-kortikoidok), az anyagcserében (pl. glükokortikoidok - glükoneogenezis), a nemi működésekben (ösztrogének, gesztagének, tesztoszteron) és a gyulladásos folyamatok szabályozásában van szerepük. A gyógyszeripar sok szteroid hormont és hormon-analógot állít elő, e gyártások egy része biotechnológiai lépéseket tartalmaz. Előállításuk általában soklépéses folyamat, amelyben a biokémiai és szintetikus lépések egyaránt előfordulnak. A biokémiai lépések rendszerint egyetlen enzimes átalakítást jelentenek, azaz biokonverziókról van szó. Az átalakítások során leggyakrabban nyugvósejtes fermentációt (olyan elszaporított sejttömeg, melynek nincs szénforrása, nem szaporodik) alkalmaznak. Az alkalmazott törzsek nagyon sokfélék, lehetnek baktériumok, élesztők, fonalas gombák. A bennük azonosított, és a technológiában kihasznált enzimek eredeti szubsztrátja nem az átalakítandó szteroid, hanem valamilyen más molekula, csak a szerkezeti hasonlóság miatt az enzim felismeri, megköti és átalakítja a szteránváz bizonyos régióját. A konverziók általános lefolyása: Számos különböző technológia létezik, ezek tipikus, közös lépéseit a következőképpen foglalhatjuk össze:

A folyamat lépései tehát: Oltás, sejtszaporítás a törzs igényeinek megfelelő tápoldaton. A sejtek elszaporodása és a táptalaj részleges kimerülése után a konverzióhoz szükséges enzimet indukálják - induktor anyagot adagolnak. Ez lehet a szteroid szubsztrát kis adagja, vagy olcsóbb szintetikus molekula, pl. naftol-származék. Az indukció hatékonyságát enzimaktivitás méréssel lehet ellenőrizni. Az aktivitás általában 10-24 óra alatt eléri a kívánt szintet. A szteroid szubsztrát beadagolása: komoly problémát jelent, hogy a szteroidok rosszul oldódnak vízben, ezért azokat különböző technikákkal viszik be a fermentlébe: 

A szubsztrátot felveszik oldószerben (pl.: etanol, mert az nem nagyon károsítja a tenyészetet), és lassan a fermentorba engedik. A szteroid a vizes fázisban kikristályosodik, megfelelő kivitelezéssel igen apró, nagy felületű kristályokat kapunk.



Olajokkal, tenzidekkel és detergensekkel megolvasztják a szteroidot (lesterilezik), és az olvadt anyag apró cseppekre diszpergálható (emulzióképzés). Lehűtve az apró cseppekből apró szemcsék/kristályok lesznek, nagy fajlagos felülettel.



A ciklodextrinek molekulája alkalmas apoláris jellegű molekulák befogadására, így a szteroidokkal is zárványvegyületet képez. Ez egy reverzibilis folyamat, a szabad és kötött molekulák kémiai egyensúlyban vannak. Ahogy az átalakulás során a szabad szubsztrát molekulák fogynak, a komplexből felszabadulva folyamatosan pótlódnak.

A rosszul oldódó szubsztrát tehát apró, nagy fajlagos felületű kristályok formájában van jelen a lében, a vizes fázis telített oldatnak tekinthető. A mikroba az oldatból felveszi a szubsztrátot, átalakítja, és leadja a terméket. A termék is rosszul oldódó szteroid, koncentrációja gyorsan eléri az oldhatósági határt, és ez is kikristályosodik a fermentléből. Ezt a jelenséget kristályfermentációnak nevezik. Látszólag nem történik semmi, a folyadékban a kristályok mennyisége nem változik, a szubsztrát és a termék koncentrációja állandó (telítési), a konverzió mégis megtörténik. Végtermékgátlás nem lép fel, hátránya viszont, hogy tömegátadási problémák léphetnek fel. Feldolgozás: A szteroid egy része oldott, a másik része szilárd fázisban van, ilyenkor rendszerint teljes/totál extrakciót végeznek erősen apoláris oldószerrel, pl. diklór-metánnal, mely minden apoláris anyagot kiold. Az oldószer lehajtása után vegyes anyag marad vissza (pl. szubsztrát, termék és melléktermékek együtt). A következő lépésben olyan oldószert alkalmaznak, mely szelektíven old ki egy komponenst = ez a szelektív-, vagy differenciál-extrakció. A szterán alapváz: Ahol R2 metilcsoport, R1 metil vagy H, az R3 variábilis szubsztituens. A különböző szteroidok előállításához alapanyagként növényi, állati és szintetikus szteroidokat használnak fel. Növényi eredető szteroid a szitoszterin, mely a szójaolajban és egyes fafajták anyagában található, illetve a sztigmaszterin, amely a babfélékben fordul elő. A koleszterint állatok epeváladékából nyerik, míg szintetikus úton hasonló vegyületeket pl. ß-naftol és borostyánkősav-anhidrid reakciójával állíthatunk elő. Az egyes konverziókat az alapanyagokból kiindulva, lépésről lépésre tárgyaljuk, így jutunk el az egyes funkcionális csopotokhoz. Szitoszterolból előállított vegyületek: Androszténdion (AD): Az átalakítást Mycobacterium phlei-vel végzik. A konverzió hatásfoka kb. 70%-os: 24 g/l szitoszterinből  10g/l AD + 3g/l szitoszterin + 1g/l egyéb anyag keletkezik. A teljes fermentlevet extrahálják diklór-metánnal, majd szűrik. A szelektív extrakciót 85%-os metanollal végzik, amely az androsztén-diont oldja, a szitoszterint viszont nem. A reakció második lépése kémiai szintézis, vízmentes THF-ben hajtják végre fém kálium és acetilén gáz jelenlétében. A keletkezett etiszterol maga is gyógyszerhatóanyag (progeszteronhatású) de további progeszteron származékokat (két szénatomos egység a D gyűrűn) és spironolaktont (vízhajtó) állítanak elő belőle.

9α-hidroxi-androsztén-dion (9αOH-AD) Mikroorganizmus: Mycobacterium smegmatis. A biokonverzióban 30 g/l-es koncentrációban bevitt szitoszterinből a mólsúly csökkenést és a melléktermék képződést figyelembe véve 14,5 g/l elméleti konverzió érhető el. Az üzemi fermentációnál 10-11 g/l-es átlagszint érhető el. (Konverziós fok ~ 70%). A szitoszterinből a szénforrásként alkalmazott glicerinnel és különböző tenzidekkel (Tween80, Struktol, polipropilén-glikol) együtt vizes rendszerben intenzív keverés mellett 121C°-on (sterilezés hőfoka) szuszpenziót készítenek. A szuszpenziót kiegészítik az egyéb táptalaj-komponensekkel (szójaliszt, NH4Cl, KH2PO4, CaCO3). Beállítják a táptalaj pH-ját, majd 121C°-on sterilezik. A kétszeri hőkezelés során a tenzidek jelenlétében a szitoszterin átkristályosodik és igen apró szemcsemérető lapos, illetve tős kristályok képződnek. A fermentáció során a szaporodó Mycobacterium megkötődik a szitoszterin kristályok felületén, és ott megy végbe a biokonverzió. Feldolgozás: szelektív oldószerként di-izopropil-étert alkalmaznak, amely a szitoszterolt oldja, a 9-OH-AD-t nem. A második lépés itt is kémiai, a vízelvonáshoz 85%-os H3PO4-ban főzik, melynek hatására a 9. és a 11. szénatom között kettős kötés alakul ki, erre később könnyen addícionáltathatunk pl. vizet, vagy HF-ot. Mindkét esetben az elektronszívó csoport a 11 C atomra orientálódik, a kialakuló szerkezet a gyulladásgátló szteroidok alapja.

Víz addíciónál az OH csoport a 11-es szénatomra kötődik. A 11-OH-AD-hez fém káliumot és acetilént adva 11-OH-etiszterol keletkezik, melynek C2 oldalláncát több lépésben átalakítva hidrokortizon állítható elő. Gyulladásgátlók: HF-ot addícionáltatva fluorid származékokat, szuperkortikoidokat (nagyhatású gyulladás-gátlókat) kapunk. A hidrokortizon gyulladásgátló és további gyulladásgátlók alapanyaga, amelyet a klasszikus úton Reichstein-S (PL)–acetátból állítottak elő, de a 11OH-etiszteronból is kialakítható. A hidrokortizon is hatékony gyulladásgátló, de kedvezőtlenül hat a só– és vízháztartásra, ezért kis módosítással prednizolont állítanak elő belőle, amely szintén jó gyulladásgátló, azonban kevesebb a mellékhatása. A prednizolon vízoldhatósága különböző szubsztituensek hozzákapcsolásával növelhető: A prednizolonból állítják elő a Ftorocort® (Richter) kenőcs hatóanyagát, a triamcinolon-acetonidot.

Nemi hormonok Androgén szteroid hormonok hatása kettős: 1. Androgén hatás    

A férfi nemi szervek kifejlődése és növekedése A normális férfi szexuális működés fenntartása A másodlagos nemi jellegek kialakítása Szükségesek a hímivarsejtek éréséhez

2. Anabolikus hatás  Izomtömeg növelése  Fékezik a katabolizmust és a lebontó folyamatokat Orvosilag csak az anabolikus hatás a cél (roborálás). Olyan származékokat keresnek, amelynél az anabolikus hatás nagyobb, az androgén pedig kisebb. Ezeket egyes sportolók és a testépítők doppingszerként is alkalmazzák (sztanozolol, nandrolon). A korábban bemutatott gyártású androszténdion tehát a férfi nemi hormonok közé tartozik. Az emberi szervezetben végbemenő bioszintetikus utak és az ipari gyártás reakciósora nem esik egybe. A humán út a koleszterinből indul, az ipari gyártásnál az AD a megfelelő kiindulási anyag. Tesztoszteron: A tesztoszteron egy lépésben ketoredukcióval állítható elő az androszténdionból, azaz közvetve szitoszterolból. A konverziót szelektált Saccharomyces cerevisiae élesztő törzzsel végzik Magyarországon gyártott anabolikus jellegű tesztoszteron származék a Nerobol, melyet az orvosi gyakorlatban roborálásra fejlesztettek ki, egyes sportolók és testépítők viszont doppingszerként használják. Gyártása: Metilezés → metil-tesztoszteron.

Dehidrogénezés, ugyanolyan, mint a hidrokortizon → prednizolon átalakításnál. Az A-gyűrű a három konjugált kötés miatt síkba merevedik. Eredmény: anabolikus hatás marad, androgén hatás csökken.

Női szteroid hormonok két, eltérő szerkezetű és hatású csoportba sorolhatók: 1. A természetes ösztrogének fiziológiai szerepe     

A női nemi szervek kifejlődése A másodlagos nemi jellegek kialakítása (női, férfi) A peteérésben és a fogamzásban A csontsűrűség szabályozásában (női, férfi) Anyagcserében

2. A természetes gesztagének fiziológiai szerepe  A terhesség megtartása  A peteérés és ovuláció gátlása  A spontán méhösszehúzódások gátlása

Szintetikus nor-szteroidok Nor-szteroidok: a nor-jelző a szerves kémiában arra utal, hogy a molekulában egy szénatom hiányzik. Ebben az esetben a 19-es metil csoport hiányzik. Szeko-szteroidok: a szeko-előtag felnyitott gyűrűre utal, itt a C gyűrű nyitott, a 8-14 kötés hiányzik Szintetikus gyártás: β-naftol és borostyánkősav-anhidrid alapanyagból. A termékek fontos fogamzásgátlók

Feldolgozás: a kivált terméket és a sejteket leszűrik, majd a szűrőlepényt etil-acetáttal extrahálják. Az etil származék (etolon) gyártása teljesen analóg a módon történik.

Állati sejttenyésztés, sejtvonalak, tenyésztés Az élőlények hierarchikus szerveződése: Sejt → Szövet → Szerv → Szervrendszer Egyedfejlődés: embrionális őssejt→differenciálódott sejtek Történeti áttekintés: … 1952 Gey: humán rákos sejtek tenyésztése: HeLa-sejtek, a rákos sejtekben nem működnek az ellenőrző mechanizmusok 1967 Van Wezel: a mikrokarrieres sejttenyésztés (az állati sejtek nagy része csak felülethez tapadva képes szaporodni). 1970 rDNS technika alkalmazása állati szöveteknél 1975 Köhler-Milstein: hibridóma sejt előállítása és mAb termelés in vitro A sejttenyésztés alapjai Sejttenyésztés: diszpergált sejtek fenntartása in vitro körülmények között. Szövettenyésztés: a szövet fenntartását jelenti oly módon, mely lehetővé teszi a sejtek differenciálódását ill. a struktúra és/vagy funkció megőrzését. Állati sejt/szövettenyésztés: egészen más, mint a mikroorganizmusok tenyésztése. A szövetekből elkülönített, diszpergált sejtek szaporítása in vitro. A sejtvonalak nagy része csak felülethez kötve növekszik (monolayer, kontaktgátlás) → speciális tenyésztő edények. Van néhány, ami szuszpenzióban is szaporodik (CHO, BHK, VeRo, HeLa), mint a mikrobák → fermentorszerű készülékek. Általában emlős sejteket tenyésztenek, de előfordul madár és rovar sejtek tenyésztése is. Jelentősége: 

Kutatás: az állati sejtekre jellemző biokémiai utak, különböző sejtszintű szabályozások



Rekombináns fehérjék előállítására (pl. interferonok, növekedési hormonok, stb.)



Monoklonális ellenanyag termeltetésére (hibridóma sejtekkel



Állati vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából



Sérült szövetek rekonstrukciója, nem funkcionáló szövetek helyettesítése a saját szövetek tenyésztésével, melyre nincs immunológiai válasz; embrionális eredetű és szöveti őssejt alkalmazása



állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése

A fenntartás korlátja: A gerincesek legtöbb sejtje csak korlátozott számban osztódik az izolálást követően, azaz a tenyészet elöregszik (szeneszcencia). Okai: 

a kromoszómavégek (telomérák) minden osztódási ciklusban bekövetkező megrövidülése



aktiválódnak a sejtciklust ellenőrző (és azt leállító) mechanizmusok Csak a tumor- és a rovarsejtek osztódnak korlátlanul (immortality).

Szaporítható sejttípusok: Szinte minden szövet szaporítható, az izom és ideg kevésbé. Fibroblaszt (kötőszövet): generációs ideje kicsi, felületeken gyorsan nő, túlnövi az egyéb szöveteket. Epitheliális (hám) sejtek: sok specializálódott sejt van. Májsejtek (jellemzőjük a jó regenerációs képesség), tüdősejtek, vesesejtek, Vérsejtek és nyiroksejtek (immunsejtek), csontvelő, csont, porc szövet, szív- és simaizom szövetek. Endokrin sejtek (adrenális, agyalapi mirigy, pankreasz-sziget-sejtek). Korai embrionális eredetű sejtek jól szaporodnak, rágcsálók (pl. egér, patkány, hörcsög) sejtjei is. Leggyakoribb szuszpenziós sejtvonalak: Emlősök: – CHO (chinese hamster ovary, – BHK (baby hamster kidney), – Vero (afrikai zöld majom vese epitéliás sejtje) Emberi: – Namalwa (lymphoblastoid sejtvonal), – MRCS (humán embrionális tüdő sejtek) – HeLa (tumor, méh) – Myeloma sejtvonal: mAb termelés. Rovarok: – Spodoptera frugiperda - hangya Az állati sejttenyésztés tápoldatai: reprodukálni kell a természetes környezetet: vér, sejtközti folyadék (sokkomponensű, drága) Szénforrás: glükóz (mint a vércukor), glutamin!  energia és N-forrás. A glutaminból a glutaminolízis folyamata során szabadul fel az energia (a glutamin-szintézis tükörfolyamata). Ez az energiatermelés az oxigén ellátottság függvénye. A hibridóma és tumor sejtekben nagyon intenzíven folyik a glikolízis és a glutaminolízis folyamata is. + 15–20 féle aminosav, vitaminok, koenzimek, lipidek, ásványi ionok (pontos összetétel, ozmózisnyomás). Szérum: a sejtvonalak nagy része igényli a vérfehérjék jelenlétét is, enélkül a legtöbb sejtvonal elpusztul. Ezt újszülött állatok (borjú, csikó) vérszérumával biztosítják (5-15%). Ez nagyon drága (és nehezen reprodukálható), ezért törekszenek a minimalizálására, helyettesítésére vagy teljes elhagyására. Komplex rendszer, az albumin mellett sok szabályozó, serkentő és gátló faktort tartalmaz. A szérum hátrányai:

    

drága nehezen reprodukálható, változó összetételű fertőzésveszély (baktériumok, vírusok) ellenanyagok (immunfehérjék) lehetnek benne a fehérjék bonyolultabbá teszik a céltermék kinyerését

Ezért törekednek a szérummentes, kémiai komponensekből összemért tápoldatok használatára. A szérum részleges vagy teljes pótlására hidrofil polimerekkel, pl. dextránnal próbálkoznak. Néhány sejttípusra sikerült szintetikus médiumot kidolgozni. A sejtek érzékenyek a szervetlen ionok pontos koncentrációjára, pl az üveg edényekből kioldódó anyagokra, ezért vagy műanyag edényeket, vagy víztöltéssel többször autoklávozott üveget használnak tenyésztésükhöz. Hígításhoz, mosáshoz, kezeléshez nem elegendő a „fiziológiás sóoldat”, hanem sokkomponensű vérpótló oldatokat használnak pl.: PBS = phosphate buffered salin BSS = buffered salin solution A víznek is különlegesen tisztának kell lennie (ionmentes, szervesanyag-mentes, endotoxinmentes, pirogénmentes) és ezt is műanyag edényben tárolják. Körülmények: A sejtek nagyon érzékenyek pl. a nyírásra:  nagyon kíméletes keverés,  a levegőztetésnél sem lehetnek buborékok Az oxigénigény nagyon kicsi, rendszerint elég a fejtérfogatot átöblíteni levegővel. Sok sejtvonal kedveli a CO2 jelenlétét (2-5%). Hőmérséklet: emlős sejteknél 37°C, madársejteknél 41°C, rovarsejteknél 28 °C. Forgó palackok: Műanyag (eldobható) és üveg is, üveg: 1-10 l, hasznos térfogat: 0,1-1,5 l, 14 rpm, inkubátor szekrényben vagy szobában, szuszpenziós és tapadós tenyésztésre is jó. Tenyésztés ~7 napig, utána lefejtés  proteázos kezeléssel a sejt szuszpenzióba vihető. Olcsó, de munkaigényes, több száz palackot kell kezelni. Mikrokarrieres tenyésztés: van Wezel 1967: DEAE Sephadex® A50-en, kis szuszpendált gyöngyök felületén, átmérő: 100-300μm, sűrűség: 1,02-1,05g/cm3 (lebegésben tartható). A fermentor térfogatának 8-15%-a hordozó, felülete 0,5-1,5 m2/l, ami 10-30 forgó palacknak felel meg = nagy produktivitás.

Előnyei: 

nagy felületet be lehet bevinni egy adott reaktor-térfogatba



viszonylag homogén környezet



nincs szükség új reaktortípusokra

Lépések: inokulum: forgó palackból a tenyészetet tripszinnel leoldják. A sejtek megtapadnak a gyöngy felületén: átlagosan 5-6 sejt egy gyöngyön, elszaporodnak, egy rétegben nőnek (kontaktgátlás), néha több rétegben. Tapadás: két folyamat kombinációjaként jön létre: 1. a sejtek adszorpciója a felületre (elektrosztatikus és van der Waals erők) 2. molekuláris kapcsolódás a felülettel és sejt terjedés (ragasztó fehérjék) Függ: sejtvonaltól, mikrokarrierek jellemzőitől, a sejt növekedési fázisától, a médium összetételétől és a sejt/mikrokarrier számaránytól Reaktorok: keverős, fluid ágyas, air-lift Nyírás: immobilizált sejtek érzékenyebbek a nyírásra, lekerekített keverők, a keverő átmérője a reaktor átmérőjéhez képest nagyobb, mint mikrobatenyésztő reaktorok esetén. Levegőztetés: történhet indirekt módon: membránon vagy nagy permeábilitású szilikon csövön keresztül (gázdiffúzió, néhány 100 l-ig), direkt levegőztetés: a felszálló és szétpukkanó buborékok sejteket károsítják, ez ellen felületaktív anyagokat, pl Pluronic F-68, habzásgátlókat alkalmaznak. A gyöngyök könnyen ülepednek, felfrissíthető a tápoldat, perfúziós tenyésztés. A gyöngyöket használat után elbontják Makropórusos hordozók: A tapadási felület további növelése. Általánosan használt anyagok: üveg, polisztirol, zselatin, kollagén, cellulóz, polietilén, méretük átlagosan 500μm Pórusok belsejébe is települnek a sejtek, így a folyadék nyírásától is védve vannak Hátrányok: 

a részecskék felülete tele van gödrökkel és repedésekkel, emiatt a folyadékban való mozgásuk is szabálytalan, fokozott turbulencia károsíthatja a felületi sejteket



a tápanyagok és oxigén koncentráció csökkenése a gyöngyön belül

Egyéb lehetőségek felületi tenyésztésre: 

Aggregátumok: a legtöbb tapadós sejt képes aggregátumokat képezni Indukálás: pl. Ca2+ ionok megfelelő koncentrációjával Előnyeik: megegyeznek a mikrokarrieres technikával



Mikrogyöngyökkel indukált aggregáció: sokkal kisebb, mint a mikrokarrier (90-400 mm), nem benövik a sejtek, hanem aggregálódnak tőle.



Gélbe zárás, mikrokapszulázás. agaróz gél, Ca2+-alginát.

Spinner flask: A középső nyak tartja a keverőt (vitorla vagy golyóvégű üvegbot, mint a harangnyelv), ezt mágnessel lehet kívülről kevertetni. Kevert reaktoroknál lekerekített turbulenciamentes keverőket kell használni, hogy megkíméljék a sejteket. Olyanokat alkalmaznak, mint a tengeralattjáróknál, az alaki hasonlóság nem véletlen: örvénymentes, csendes működés szükséges. Perfúziós reaktorok: Kétfelé osztják a folyadékteret, az egyik részben van a tápoldat és a sejtek, a másik térben a tápoldat és a buborékok. A kettő között membrán van: az oxigén átmegy a sejtekhez, de a buborékok nem. Az elválasztó lehet egy egyszerű fémszita is, amin nem férnek át a sejtek. Kívül vannak a sejtek. Ívszita: Ha tangenciális áramlás van, akkor csak a lyukak átmérőjéhez képest feleakkora szemcsék férnek át, ugyanez van, ha nem a folyadék, hanem maga a szita forog. Ugyanúgy perfúziós eljárás, ha nem szita van, hanem ultraszűrű membrán. Ebben az esetben is a sejtvisszatartás van, csak a kis molekulák férnek át a membránon. A tápoldatot „kint” telítik oxigénnel, majd visszapumpálják. Ha a buborékok nem ártanak a sejteknek, akkor lehet air-liftet alkalmazni:

Fluidágyas reaktorok: Hasonlítanak a mikrokarrieres megoldáshoz is, csak 30%-kal sűrűbbek a víznél a szemcsék, ez teszi lehetővé, hogy legyen kihordás, vagyis a szemcsék ne menjenek ki a sejtekkel együtt. A biztonság kedvéért a tartály felfelé tágul, így fent lelassul a folyadékáramlás.

Kell tápoldat készítő rész, ezt szűréssel sterilezni kell, bekerül egy tárolóba. Ez megy a főreaktorhoz, amin van egy oldalági levegőztető. Ha kész van, akkor, jön az aratás: el kell választani a sejteket, a vizet eltávolítani, HPLC-n tisztítani, esetleg liofilizálni.

Összefoglalás: Batch: rossz produktivitás, a sejtkoncetráció 106 sejt/ml, egy hét alatt Fed-batch: Hosszabb ideig lehet tartani, hiszen az elfogyasztott tápanyagokat tudjuk pótolni. glükóz + aminosavak, 3 hét, nagyobb produktivitás Folytonos (perfúziós): sejtkoncentráció 107 sejt/ml, 6 hét, termék is koncentráltabb, a szükséges reaktortérfogat a szakaszosnak csak 1%-a. A reaktor és módszer kiválasztása az alapján történik, hogy mennyi a szükséges termék menynyiség: 

rEPO: 100mg/beteg: elegendő a forgó palack,



tPA: 100mg/ beteg: fermentor (PA: plazminogén aktivátor: vérrög feloldódást segíti elő.)

Sterilitás: A mikroorganizmusok gyors szaporodási képességük miatt igen hamar túlnövik a tenyészetet. Észlelés: a savasodást az fenolvörös indikátor kimutatja. A mikrobafertőzés általában környezetből jön: Pseudomonas, Staphylococcus, E. coli, Candida, Aspergillus, stb. törzsek, akár patogének is. Megelőzésére egyes esetekben antibiotikumot adnak a tápoldatba (csak prokarióták ellen jó, élesztő ellen nem). A vírusokat nehezebb észlelni, hosszan lappanghatnak, forrásuk általában a szövet izolátum vagy a savó. Sejtpreparálás tenyésztéshez: A szövetet szét kell szedni sejtekre, ennek két módszere van: Mechanikus disszociáció a sejtek enzimatikus kezelés nélküli szétválasztása mechanikus úton 

a szövet megfelelő átmérőjű tűn keresztül fecskendőbe történő fel-le szívogatásával (pl. lágy, könnyen diszpergálható agyszövet esetén);



a szövet megfelelő pórusmérető műanyag szitán történő átpréselésével.

Enzimes disszociáció: kollagenáz, tripszin, tripszin+EDTA, proteáz enzimek alkalmazásával történik. A sejtszuszpenzió steril nylon szűrőn át történő szűrése a sikeresen diszpergált sejtek és a megmaradt, nagyobb szövetdarabok szétválasztása céljából. A sejtek alacsony fordulaton történő ülepítése centrifugával. A sejtüledék reszuszpendálása, a felülúszót ekkor friss tápfolyadékra cseréljük. Sejtszámlálás, a kívánt sejtsűrűség beállítása: •

Elektronikus sejtszámlálóval (részecskeszámláló)

•

Bürker kamrás számlálással

•

Affinoszlopon: az antitest megköti a specifikus felületi antigént tartalmazó sejteket.

•

Citofluoriméterrel (nem csak számol, hanem jellemez és osztályoz is): a sejtszuszpenzióhoz fluoreszcens festéket adnak, ami hozzákötődik a sejt nukleinsavaihoz. Egy kapillárison viszik át a sejteket (egyesével, libasorban) és gerjesztő fénnyel megvilágítják. A mért floureszcens fény a sejtszámon kívül sok egyéb információt ad (méret, nukleinsav-tartalom, ezek eloszlása)

Ha elérték a megfelelő sejtsűrűséget, a tenyészetből szubkultúrákat készítenek, ezek egy részét tárolásra/deponálásra előkészítik, illetve közvetlenül továbbtenyésztésre, manipulációra vagy termelésre használják fel. Szubkultúra: egy genetikailag homogén tenyészetet több résztenyészetre osztanak, amelyeknek további felhasználása eltérő lehet. Elkészítése: tripszin+EDTA oldattal inkubáljuk 37°C-

on a sejteket, mikroszkóp alatt követjük, majd 2-3 perc után szérumot adunk hozzá, hogy leállítsa az emésztést. Alacsony fordulatszámon centrifugáljuk le a sejteket, távolítsuk el a felülúszót, majd reszuszpendáljuk a sejteket friss, szérumot tartalmazó tenyésztő oldatban vagy fagyasztó médiumban. Sejtvonalak eltartása: Egy sejtvonal átlagosan 100 átoltás után elöregszik, szaporodó képessége csökken, majd a szaporodás leáll. Ezért „gazdálkodni” kell a szaporítási ciklusokkal. Célszerű a preparálás után kevés átoltással számos szubkultúrát készíteni, és ezek nagy részét tartósítani. Ez az ún. „master cell bank”, amihez vissza lehet nyúlni, ha a használatban lévő tenyészetek elöregedtek, vagy befertőződtek. Az egyes munkahelyeken (labor, üzem) is létrehoznak tartósan tárolt szubkultúrákat a kapott sejtvonalakból, amihez vissza lehet nyúlni a szaporodó tenyészetek elvesztése esetén („working cell bank”). Célszerű a tenyészeteket és az átoltásokat törzskönyv-szerűen nyilvántartani. Lefagyasztás: A füleltről való leválasztás után, a szubkultúrát, egy 0-4 °C közti fagyasztómédiumban szuszpendáljuk, ami hidrofil anyagokat, cukrokat tartalmaz, ezek a jégkristályok kialakulását szabályozzák. A sejtszuszpenzió 1 ml-es adagjait speciális fagyasztóedénykékbe pipettázzuk, -80 °C-ra hűtjük (1-3°C/perc), egy éjszakát itt marad. Másnap helyezzük a sejteket tartalmazó fagyasztó edényt a folyékony nitrogént tartalmazó tárolóba. Mind a folyadék fázisú (-196 °C), mind a gáz halmazállapotú nitrogén (-156 °C) megfelelő hűtést biztosít. Felolvasztás: A sejteket tartalmazó tárolóedényt gyorsan olvasszuk ki 37 °C-os vízfürdőben, kíméletes rázatás közben. Amint a jégkristályok kiolvadnak, a sejteket óvatosan pipettázzuk át egy előmelegített, komplett tenyésztőoldatot tartalmazó centrifugacsőbe. A sejteket alacsony fordulatszámú centrifugálással ülepítsük, majd öntsük el a krioprezervatív anyagot tartalmazó felülúszót (ezek jelenlétében a sejtek ugyanis törékenyek). A sejteket óvatosan reszuszpendáljuk a tenyésztő médiumban, meghatározzuk a sejtszámot és az életképességet (viabilitást). Mérjük ki a sejteket a kívánt számban a megfelelő tenyésztőedénybe. Az inokulumban legalább 3 x 105 élő sejt/ml legyen.

Glikozilálások Glikozilálás: A poszttranszlációs módosítások legnagyobb fajtája: a fehérjeláncra komoly mennyiségű egyéb anyagokat, pl. szénhidrátokat rakunk rá. Azért van erre szükség, mert sok fehérje nem csak aminosavakból áll, hanem másokból is, a biológiai aktivitásokhoz pedig kellenek ezek az addícionált csoportok. Ez alapvetően meghatározza az alkalmazható organizmus típusát is. Prokariótákat (pl. E. colit), amelyek nem képesek glikozilálni, csak olyan egyszerű rekombináns fehérjék gyártásánál használhatunk fel, amelyek nem tartalmaznak szacharidokat (pl. inzulin). Az élesztők képesek ugyan a termelt fehérjék glikozilálására, de túlnyomórészt mannánokat kapcsolnak rájuk, ami eltér a humán fehérjék mintázatától. Ahol a szénhidrát mintázat pontos reprodukciójára van szükség, ott emlős sejtvonalakat kell alkalmazni, még ha ezek a technológiák nehézkesebbek és költségesebbek is, mint a mikroorganizmusok tenyésztése. A glikozilálás típusai: A cukorrészek az aminosavlánc elkészülte után kerülnek rá a molekulára. Ez csak bizonyos funkciós csoporttal rendelkező aminosavakon lehetséges: 

N-glikozilálás: az Asn-X-Ser/Thr/Cys aminosavhármas nitrogénjén, ahol X bármely aminosav lehet, csak a két széle számít. Sokkal bonyolultabb.



O-glikozilálás: Ser vagy Thr-on.

N-glikozilálás: Az N-glikozilálás során először egy 14 cukoregységből áll szerkezet alakul ki, az ER membránjába horgonyozott dolichol (19 tagú poli-izoprénil pirofoszfát: bazinagy) templáton. Ez tevődi át a fehérjére és soklépéses érési folyamat eredményeképpen jön létre a végső, komplex forma.

Oligomannóz (köztes) forma: a teljes szerkezet bioszintézis során kétszer is előforduló köztitermék. Komplex és hibrid formák: a fehérjéken kialakuló végső láncok. Nyele 2 N-AGA, aztán az elágazásnál 3 db mannóz.

A fehérjékben előforduló Asn-X-Ser/Thr egységeknek mintegy kétharmad részéhez kapcsolódik cukorrész. A továbbiak sztérikus okok vagy az X aminosav savas jellege miatt fedetlenek maradnak. A fehérjék szénhidrát részeik kialakulása során hosszú utat tesznek meg a sejten belül. A riboszómáról az ER lumenjébe kerülnek, onnan transzport vezikulákban végig haladnak a Golgi komplex cisz-, médium- és transz rétegein és csak ezután kerülnek a felhasználási helyükre. Az útvonal minden állomásán lokalizált enzimek végeznek egy-egy átalakítást az oligoszacharidokon, mint a gyárakban a szerelőszalag. Az első hét egység beépülése az ER külső felületén történik, aztán „befordul” a lumenbe és ott folytatódik.

Ha kész a cukorlegyező, akkor ezt rá kéne tenni a fehérjére: OST = oligoszachariltranszferáz enzim figyeli, hogy mikor jön az Asn-X-Ser/Thr hármas. Ennek felbukkanása esetén helyezi át a 14- oligoszacharidot a dolicholról a fehérjére, ami aztán megüresedve vissza tud menni a „gyártószalag” elejére.

Az utolsó 3 ráépült glükóz közben levágódik, így visszakapjuk ugyanazt az oligomannóz köztes formát. A fehérjerész chaperonhoz kötődik, transzportvezikulába kerül és elmegy a ciszGolgiba. A cisz-Golgi rétegben a további bioszintézis eltérő az élesztőkben és az emlős sejtekben. Az élesztők további mannóz egységeket építenek hozzá, miáltal nagy, immunogén oligomannánok jönnek létre. Az emlős sejtekben viszont mannóz egységek hasadnak le a „komplex” és „hibrid” egységek kialakulása során. A Golgi komplex középső ciszternáiban a mannóz egységek száma tovább csökken (3) és megkezdődik az új egységek (N-acetilglükózamin és fukóz) beépítése. A transz-Golgi komplex fejezi be a szénhidrátláncok kialakítását galaktóz és N-acetil-neurámsav egységek rákapcsolásával. Innen a kész fehérjék többfelé távozhatnak (citoplazma, lizoszóma, extracelluláris). Bioszimilaritás: Kémiailag nem tökéletesen egyforma anyagoknak lehet nagyon hasonló hatása, így ki lehet mutatni, hogy a vérben lévő EPO teljesen humán-e. Az O-glikozilálások egész más mechanizmussal mennek végbe. A kész fehérjelánc megfelelő OH csoportjára egyenként kapcsolódnak a cukrok UDP-aktivált formában. Az alap ez esetben az N-acetil-galaktózamin kötése és ehhez kapcsolódik egy galaktóz és/vagy egy N-acetilglükózamin. Erre az elágazó triszacharidra épülhet még sokféle, változatos felépítésű cukor. O-glikozilálások hordozzák a vércsoport tulajdonságokat is (glikoforin).

Rekombináns fehérjék Gyártás lehet: Prokariótákkal (baktériumokkal) • • •

Könnyen, gyorsan szaporíthatók, olcsó táptalaj, de: a termék sokszor intracelluláris (zárványtest), és nincs poszttranszlációs modifikáció (metilezés, glikozilálás)

Eukariótákkal (állati szövettenyészetben) • • •

Lassú szaporodás, drága tápoldat, kényes fermentáció, kisebb koncentráció, de: biológiailag aktív termék.

Milyen fehérjét lehet előállítani? Nyilván olyat, ami visszahozza azt a sok költséget, amit belefektetünk, tehát nem tömegenzimeket. Az egészségügy az a terület, ami ezt meg tudja fizetni. Funkció szerint:    

Hormonok (inzulin, eritropoietin) Enzimek (általában – orvosi célra; VIII faktor, tPA, aszparagináz) Antitestek (terápia - analitika; Herceptin, ProstaScint) Vakcinák (aktív és passzív immunizálás)

Legnagyobb piaci részesedése az EPO-nak van, viszont nincs már nagyon növekedési potenciálja. Ezután a monoklonális antitestek jönnek, majd inzulin, ezekben nagy még a potenciál az FDA-nál levő engedélykérelmek alapján. Véralvadási fehérjék előállítása: Gyógyszerként előállított fehérjék: Alvadási oldal: Faktor VIII, Faktor IX Gátló oldal: szöveti plazminogén aktivátor (tPA), antitrombin, hirudin, urokináz (uPA), (heparin, sztreptokináz) Szöveti plazminogén aktivátor (tPA): A vérrögök az erek elzárásával életveszélyes állapotokat hozhatnak létre: szívinfarktus, agyi katasztrófa, mélyvénás trombózis (dobogós halálok). A vérrög térhálósított fibrinből van. A vérrögök feloldásához szükséges egyik faktor a tPA Nagyon specifikus szerin-proteáz. A kialakult térhálós fibrin szövedéket (var a seben, vagy vérrög az ereken belül) a plazmin bontja le. (Mikroba-eredetű: sztreptokináz) Plazminogén előanyag formájában kering a vérben. A tPA-nak gyenge az aktivitása fibrin távollétében, a fibrin aktiválja. Az aktív plazmin is – autokatalízis. A trombin is aktiválja a tPproA-t tPA-vá.

Plazminogén aktiválása:  szöveti plazminogén aktivátor (tPA, 70 kDa-os fehérje, a fibrin aktiválja),  sztreptokináz (Streptococcus-ok termelik, 45 kDa-os fehérje, aszpirin stimulálja, mellékhatások léphetnek fel)  urokináz (uPA, a vese termeli, a vizeletben is megtalálható, 54 kDa)

Kék: aktiválás, Piros: gátlás

Szívinfarktusnál szívkatéteren keresztül lehet megközelíteni a vérrögöt, így juttatják be az enzimoldatot, ami felpuhítja. A véralvadás 5 perces folyamat, a vérrögoldás viszont több napig tart. A fibrinogén kering a vérben, ezt az aktív trombin alakítja át fibrin monomerekké, ami aztán polimerizálódik. Az így létrejött fibrint a plazmin bontja le.

Így néz ki a tPA (5 domén):

Nehéz lánc: 2db 82 AS-ból álló hurok (kringle domén), mely homológ a plazminogénnel, a protrombinnal, és az urokinázzal. Az N-terminálison 43 AS-ból álló finger domén, nagy aktivitásért ez felelős. Könnyű lánc: aktív centrum - His, Asp, Ser - ez homológ más Serproteázokkal (tripszin, plazmin, trombin). Előállítás: Ez volt az első rekombináns fehérje termék, 1989-ben a Genentech (már a Roche tulajdona) kezdte el gyártani. A gént melanóma (bőrrák) sejtekből izolálták, és áttették E. coliba, és megpróbálták expresszáltatni. Ez gyenge aktivitást mutatott, mert nem volt glikozilálva, és a diszulfidhidak sem alakultak ki megfelelően. Ekkor még nem tudták, hogy a prokarióták nem tudnak glikozilálni, és csak lassan tudnak diszulfidhidakat kialakítani, mert nekik csak egy citoplazmaterük van, nincsenek kis szervecskéik. Ráadásul reduktív a közeg, ami a hidrogénezésnek, a hidak felbomlásának kedvez, pedig a tPA extrém sok diszulfid-hidat tartalmaz  emlős sejttenyészetben kell gyártani. Klónozás: SV40-be, transzfekció: CHO DHFR-deficiens (dihidrofolát-reduktáz) sejtekbe Sok génkópia épült be (Ca-foszfátos módszer). Tápközegek: - Tenyésztés 10 %-os szérumon, aztán tápoldatcsere: 0,5 % szérum + inzulin, progeszteron, kortizon: a tPA izolálás egyszerű, mivel alig van jelen szérumfehérje, klasszikus kromatográfiás módszerekkel lehetséges. - Tenyésztés és termelés végig 10%-os szérumon: izolálás adszorpcióval MAB kolonnán. Proteáz inhibitort (Aprotinin) is kell hozzáadni, hogy ne egyék meg egymást a szerin-proteázok és Tween-80 (0,01%) jelenlétében, egy lépcsőben végzik a specifikus megkötést.

Antihemofíliás faktor = Faktor VIII: Véralvadási faktor, hiánya vérzékenységet okoz. Génje az X kromoszómán helyezkedik el  a nemhez kötött recesszív öröklődés iskolapéldája ( Habsburgok). A veleszületett vérzékenységet 80%-ban a F-VIII hiánya okozza. Pótlásával (~hetente) a véralvadás normalizálható. Proteolítikus enzim, szerin-proteáz. A F-IX-el, trombinnal, foszfolipiddel (PL) és Ca2+-nal együtt (= tenáz komplex) a F-X-et aktiválja. Önmagában nincs enzimaktivitása. A F-VIII-at proteázok aktiválják, de a vérben az egyéb proteolítikus enzimek gyorsan (~1 óra) el is bontják. Eredetileg egyetlen hatalmas glikoprotein láncként szintetizálódik (300 kDa), amely háromféle doménből áll össze. Érése során két proteolítikus hasítás révén a B domén jelentős része leválik, és két eltérő alegységből álló heterodimer keletkezik: •

A1-A2-B nehéz lánc, 92 kDa és A3-C1-C2 könnyű lánc, 73 kDa

A vérben ez az inaktív (zimogén) forma kering, a von Willebrand (FIN) faktorhoz kötött állapotban. A F-VIII aktiválását Arg mellett hasító szerin-proteázok végzik, amelyek kiszabadítják az A-doméneket. Három fragmentből álló komplex jön létre, amit kétértékű fémion (pl. Mg2+) tart össze. A B-doménnek nincs további szerepe. Módosítás: 1. Az A2 és A3 fragment közti laza kapcsolatot egy diszulfid híd beépítésével erősítették meg. Az aktív molekula élettartama jelentősen növekedett. 2. Az emlős sejtekben kifejezett F-VIII lassan termelődik (túl nagy mRNS – instabil, chaperon igény, ER – Golgi transzport). Méret csökkentés: a B-domén kihagyása. Az aktivitást nem befolyásolta, de a hiányzó glikozilek miatt még lassabban érlelődött. Megoldás: a hosszú B lánc helyett egy rövid összekötő szakaszt építettek be, rajta egy N-glikozilálási hellyel (Asn).  15-25-szörös növekedés. Gyártás: Transzformált CHO-sejtekkel (szuszpenziós, szérummentes tápoldat, inzulin van benne, de az is rekombináns, ~60 jól definiált komponens). 500 l reaktor, folytonos fermentáció, hígítási sebesség ~1 /nap. Affinkromatográfia (pl. szelektív kötődése a vW-faktorhoz) Vírus inaktiválás (szolvent-detergens módszerrel). Formulázás HSA (humán szérum albumin), vagy egyéb állati fehérje nélkül. Az állati fehérje mentesség megszünteti a vírus-, vagy prion átvitel veszélyét, de nyomnyi hörcsög-fehérjét azért tartalmaz. Hirudin: A pióca nyálában található alvadásgátló. A népi gyógyászatban régen használták a piócát, később patikában is árulták (sőt: PhH VI). Trombin inhibítora, annak aktív centrumához kötődik. Szerkezet: 65 AS, 3 diszulfid-híd, térszerkezete ismert. GYOKI: kidolgozták a hirudin előállítását piócából: Éheztetés, fagyasztás, darálás, extrakció vizes pufferrel, szennyezések kicsapása alkohollal, vákuumbepárlás, acetonos frakcionálás, zeolit töltetes kromatográfia, majd liofilezés. Majd kidolgozták a rekombináns hirudin gyártását: élesztőbe klónozták. Koncentráció: 10 mg/l (kevés).

Vér Áramló folyadék, amely anyagokat és hőt szállít a szervezeten belül, és beállítja az állandó belső környezetet a sejtek számára. A sejtközti folyadékban diffúziós transzport működik, ez lassú és korlátozott a hatótávolsága, de ez nagyobb élőlényeknél már kevés, a vér viszont áramlik = konvekciós transzport. Kétirányú: a sejtekhez viszi a tápanyagokat és az oxigént, elszállítja az anyagcseretermékeket, a szén-dioxidot és a hőt. Lazarostos kötőszövet. Mennyisége kb. 5 liter. Összes szárazanyag: 17 %, de térfogatra az alakos elemek 45- 50 %-ot tesznek ki. Vér = vérplazma + sejtes elemek (centrifugálás esetén) Vér = szérum + vérlepény (alvadás után) Alvadás esetén a fibrinháló és a véralvadási faktorok aktív formája is benne vannak a szérumban, míg a plazmában csak az előanyagok.

A krioprecipitátumban (fagyasztással kicsapott vérkészítmény) van a vW-faktor, F-8, F-13, fibrinogén. A felülúszóban van: F-2,7,9,10. Plazmafehérjék: 40 - 50 g/l Albumin 10 - 25 g/l Immunoglobulinok 2 - 4 g/l

Fibrinogén

9 - 10 g/l 6 nagy mólsúlyú fehérje (transzferrin, haptoglobin…) 8,5 g/l kb. 110 különböző plazmafehérje (többek közt alvadási faktorok és enzim inhibitorok)

Albumin felhasználása: nincs biokémiai funkciója, csak ozmózisnyomást emeli, pufferol, volumenpótlásra használják, 5 és 20%-os oldatban. PPS (plazma protein oldat): ugyanúgy plazmapótlásra való, de jobb kihozatala. Immunoglobulinok felhasználása: IgG subcutan/intavénásan: primer immunhiányos (PID) szindrómákban szenvedők kezelésre. Tetanusz IgG, Anti-CMV (Cytomegalovirus) IgG, megelőzésre. Hepatitisz B, rubeola, veszettség, kullancscsípés kezelése. Hemosztatikumok felhasználása: 

Faktor VIII: A-hemofíliások kezelése.



FVIII + vW-faktor: von Willebrand betegség kezelése.



Faktor IX: B-hemofíliások kezelése.



F-2,7,9,10: Orálisan alvadásgátolt (vérhígítót szedő) betegek kezelése, ha mégis szükség van az alvadás elősegítésére.



Fibrinogén: fibrinogén hiány szubsztitúciója.

A véralvadás folyamata egy kaszkádreakció; az egyes lépésekben a faktorok szelektív és részleges proteolízissel aktiválják a következő enzimet. Két indítási lehetőség:  Külső (extrinsic) út: a sérülés következtében kívülről a vérbe kerülő anyagok váltják ki.  Belső (intrinsic) út: „szokatlan”, negatív töltésű szilárd felület váltja ki, csak a vér belső anyagai vesznek részt. Az üveg épp ilyen anyag, ezért ha vérrel dolgoznak, akkor bevonatos kémcső kell. A kétféle alvadási reakciósor a X (Stuart) faktor aktiválásával közösen folytatódik. Az Xa faktor a III, IV és V faktorokkal (foszfolipid, kalcium, akcelerin) katalizálja a protrombin  trombin (II  IIa) átalakulást (alsó index „a”: aktivált forma).

A vérlemezkék a téglák, a fibrin pedig a habarcs köztük. A trombin a fibrinogén  fibrin folyamatot katalizálja. A fibrin ezután lineáris kötegekké polimerizálódik, majd a XIIIa (LakiLóránd) faktor térhálósítja.

A véralvadás gátlása:     

Ca2+ megkötése, oxaláttal vagy citráttal heparin (poliszacharid, állati szervekből) hirudin (pióca, rec-fehérje) kumarin-származékok (rágcsálóirtó szer, ellenmérge: K-vitamin) Antitrombin III: proteáz-inhibitor, heparin segíti a kötődést a faktorokhoz. Gátolt fehérje: Trombin, F-2,10,12,11,8.

Gyártástechnológia: II. Világháború idején kezdett kifejlődni a technológia: először volt a Cohn-féle frakcionálás (8-40% etanol + pH változtatgatással csinált öt frakciót, az elsőben volt a VIII-faktor, akkor még csak így lehetett hozzájutni), aztán Kistler/Nitschmann-módszer, majd jöttek a kromatográfiás technológiák és a 90-es években a rekombináns készítmények. Vírusinaktiválás: Állati eredetű anyagokban lehetnek vírusok. Bár törekednek rá, hogy egyre kevesebbet használjanak, pl. szérummentes táptalaj, de affin-kromatográfiánál és formulázásnál is lehetnek állati vagy emberi eredetű anyagok. Lehetséges módjai: hőkezeléses inaktiválásnál probléma, hogy a fehérjék előbb mennek tönkre, mint a DNS/RNS. El lehet távolítani még őket ultraszűréssel, és kicsapással. Kémiai módszerek: szolvens-detergens eljárás, jód

alkalmazása. Fotokémiai módszerek: bizonyos anyagokat a vírusok magukba szívnak, majd ezt megfelelő hullámhosszúságú fénnyel gerjeszthetjük. Szolvens-detergens eljárás:      

Solvent: 1 % TNBP tri-n-butil-foszfát Detergens: 1 % detergens (Triton X-100, Tween) 4 óra 30º C-os hőkezelés Extrakció „biobarát anyaggal”: növényi olajjal (pl. steril szójaolaj) Kromatográfiás tisztítás (C18 tölteten) Ultraszűrés (a vírus meghalt, de el is kell távolítani)

Tökéletes vírusmentesítés csak végtelen idő alatt lehet, a hatékonyságot logban mérik: hány loggal csökken a víruskoncentráció kezelés hatására.

IX-faktor: Humafactor-9 márkanéven gyártja a Human BioPlazma Kft., Gödöllő (melynek 100%-os tulajdonosa az olasz Kedrion S.p.A.): humán koagulációs IX-es faktor (aka Christmas-faktor) koncentrátum, speciális intravénásan alkalmazható vérzéscsillapító szer, hemofília-B kezelésére. A májban szintetizálódik. Szintéziséhez K-vitaminra van szükség, a vitamin hiányában funkcionálisan inaktív  alvadási zavar. Koncentrációja a plazmában 3-5 μg/ml. Az egyik legstabilabb véralvadási faktor, a vérkeringésben féléletideje 18-24 óra. Viszonylag kicsi, 56 kDas egyláncú glikoprotein. Három fő doménből áll:  Gla-domén: az N-terminális szakaszon 12 gamma-karboxiglutaminsavat tartalmaz.  EGF (Epidermal Growth Factor) domén: itt egy másik szokatlan aminosav, hidroxiaszparaginsav található.  Szerin-proteáz domén: analóg a tripszinnel és a többi alvadási proteázzal.

Hiánya vérzéses hajlamot okoz, a betegség neve hemofília-B, vagy Christmas-betegség. A vérzéses tünetek szoros korrelációban vannak a faktorhiány mértékével. Ha a plazma IX-es faktor tartalma a normálhoz képest: 

< 1% súlyos



1-4% közepesen súlyos



5-25% enyhe (75%-t (!) el lehet veszteni)

A IX-es faktor gén az X-kromoszóma hosszú karján helyezkedik el. A hemofília recesszív jelleggel öröklődik, tehát a betegség nem expresszálódik, ha a normális allél is jelen van  nemhez kötött betegség, csak férfiakat betegít meg, a nők tünetmentes hordozók. Előállítása: Teljes vérből leveszik a plazmát, fagyasztják, felolvasztják, és a felülúszóban lesz. A kulcslépés az affin-kromatográfia: heparinhoz kötődik a IX-faktor, a szennyezőket lemossák, majd eluálják citrát-pufferrel. Adnak hozzá heparint antikoagulánsként, antitrombint és lizint stabilizátornak. Sterilszűrik, liofilezik és eladják: 50.000 Ft/porampulla.

Monoklonális antitestek Az ellenanyag molekulák nagy része az úgynevezett immunglobulin (IgG) fehérjecsalád tagja Feladatuk, hogy specifikusan az adott antigénhez kapcsolódva, olyan folyamatokat indítsanak el, ami az antigén hatástalanításához vezet Az antigén felületén a kapcsolódási rész: epitóp. A szervezet 107-109 nagyságrendű különböző antitest előállítására képes.

Monoklonális ellenanyagok:  egyetlen B-limfocita klón termékei  homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus)  kiszámítható hatás, kevés mellékhatás  előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben („pharmacology-grade”) állíthatók elő  jelentős a szerepük biokémia, a molekuláris genetika, és a gyógyászat területein A gyártásban az igazi áttörést a hibridóma-technológia hozta 1975-ben. Az antitesteket termelő plazmasejtek nem képesek osztódni, nem lehet sejttenyészetben szaporítani és termeltetni, csak a tumorsejtek képesek korlátlanul osztódni (immortality). E két tulajdonság egyesítésével kaphatunk olyan sejtvonalat, amely:  monoklonális antitestet termel  korlátlanul szaporítható Hogy lehet a sejtvonalhoz eljutni? Szükség van a megfelelő limfocitára, ehhez veszünk egy kísérleti állatot, tipikusan egeret, beoltjuk antigénnel, ezzel immunreakciót váltva ki. A lépét vagy nyirokcsomóját eltávolítják, homogenizálják és egyesítik szintén egérből származó tumorsejtekkel. A fúzió után többféle sejt van jelen: 

fuzionálatlan plazmasejtek



fuzionálatlan tumorsejtek



hibridómák

Ezek közül kell izolálni a hibridómákat. A szelekció azon alapul, hogy a tumorsejtekbe még a fúzió előtt két anyagcsere markert építenek be (két enzim hiánya) → HAT-médiumon (hipoxantin, aminopterin, timidin) csak a fúzionált sejtek képesek szaporodni. A purinvázasoknál az IMP a köztitermék, az aminopterin blokkolja a purinváz bioszintézisét és pirimidinvázas timin kialakulását is. Ezért menekülő útvonalként adnak hipoxantint (IMP lesz belőle) és timidint (dTMP lesz belőle) a táptalajhoz. Az ehhez szükséges enzimeket a fehérvérsejt hozza, a mielómasejt pedig a szaporodás tényét. Az antitestek több célra is felhasználhatók: 1. Nem terápiás antitestek: • Biokémiai kutatások • Immun-analitikai eljárások • Feldolgozási műveletekben (pl. affinkromatográfia) 2. Terápiás antitestek: • Diagnosztikában (pl. Prostascint: radioaktív molekula felgyülemlik) • Terápiában (elsősorban tumorok ellen: nem csak detektálni, hanem rombolni. Magic bullet: mindig célba talál, mert felismeri a tumor markert.) Az emberi antigénekkel immunizált egérben termelt antitestek az egérre jellemző aminosavszekvenciákat, glikoproteineket tartalmaznak, tehát emberbe adva fajidegen fehérjeként immunválaszt indukálnak → allergia. Hogyan kerülhető meg a probléma? → A terápiás antitestek humanizálása: Egér → Kiméra (csak a variábilis régió van az egértől) → Humanizált (csak a hipervariábilis) → Humán

A kezdeti terápiás antitestek murine (= rágcsáló) analógok voltak, in vitro jól működtek, de páciensbe beadva nem működik. A kudarc okai: rövid felezési idő (in vivo), limitált bejutás a tumorba, elégtelen funkció. A fő probléma az, hogy kicsi volt a citotoxikus stimuláló hatása. Anyaga az ismételt beadás után gyakran erős allergiás rohamot, rosszabb esetben anafilaxiás sokkot okozott, ezért modern rekombináns DNS manipulációs technikákkal tovább fejlesztették: Az egeret magát humanizálták, belenyúltak a genomjába, hogy a védelmi rendszere emberi legyen. In vitro vagy in silico módszerekkel meghatározzák a teljesen emberi szekvenciát, és ezt viszik be egy megfelelő emlős sejtvonalba. Simulect: A Novartis márkaneve, az anyag neve basilixmab, egy egér-ember kiméra MAB, IL-2 (interlukin) inhibítor. Ez felel azért, hogy megállapítsa, hogy mi az idegen test, és mi a saját. Azért adják, hogy a szervezet befogadja az átültetett vesét.

Növényi szekunder termékek … Shikonin: Tradicionális gyógyszer Japánban: Lithospermum erythrorhizon növény gyökeréből kivont piros színű naftokinon pigment Gyulladáscsökkentő, égési sérülésekre is hat és a HIV vírust gátolhatja. A tenyésztés két szakaszra osztható: - első szakasz: a sejtek elszaporítása + második szakasz: shikonin termelése Hairy root tenyészetben is termeltethető ár: 4500 USD/kg. Reaktor: keverős vagy air-lift, 750 l (viszonylag kicsi). Nagy hátrány, hogy a termék intracelluláris, a vakuolumban és az organellumokban marad. A hatóanyag-tartalmat jelentősen meg lehetett növelni: 20-szoros, mint a növényben. További koncentrációnövelés: - Extrakció hidrofób oldószerrel: n-hexadekanollal és etanollal  8x-os shikoninszint - Extrakció és elicitor: 65x-ra nőtt a termék konc.

A shikoningyártás folyamata Berberin: Izokinolin vázas alkaloid, erős sárga színnel → festékanyag. Emellett: 

Antibakteriális hatású, az emésztőrendszeri betegségekre is hat, pl. gátolja a Helicobacter pylori kolonizációját a gyomor-, illetve a nyombél nyálkahártyáján).



Immunserkentő hatás: aktiválja a makrofágokat.



Vérnyomáscsökkentő

Pl. Berberis vulgari termeli. Növényből vonják ki, de szövettenyészetben is termelik. Gyártásánál elicitor: élesztő glükán - a növekedés egy bizonyos pontján kell adagolni a kívánt hatáshoz.

Anaerob fermentáció

Aceton-butanol fermentáció: Pasteur figyelte meg először baktériumok butanoltermelését a 19. században. I. Világháború előtt – butadién előállítása szintetikus gumihoz. Chaim Weizmann (ISR) - Clostridium acetobutylicum. I. Világháború idején inkább az acetont tekintették főterméknek, TNT robbanóanyaghoz használták I. Világháború után a butanol válik fontossá a nitrocellulóz előállításához. A II. Világháború után a petróleum bázisú termékek helyettesítették a fermentációs termékeket, a 200 m3 alatti fermentorok nagy többsége megszűnt (kivétel: pl. Taiwan és Dél-Afrika). Butanolos erjesztések: A Clostridium acetobutylicum keményítőből, melaszból, pentózokból, szacharózból állít elő n-butanolt, acetont, izopropanolt és nyomokban etanolt (+ víz, sok széndioxid és hidrogén). A termékek relatív aránya függ: baktérium törzstől és a fermentációs körülményektől. Három fermentáció típust különböztetünk meg: 

Aceton - butanol fermentáció: Clostridium acetobutylicum



Butanol - izopropanol fermentáció: Clostridium butylicum



Vajsav - ecetsav fermentáció: Clostridium butyricum

Glükózból piruvát lesz, amiből AcKoa. Ez megduplázódhat, és lesz belőle acetecetsav, végül vajsav. Ha nincs oxigén, akkor a baci nem tudja mire tenni a hidrogént csak a buriril-KoA-ra, ebből lesz a butanol. Acetecetsav - CO2 = Aceton. Végtermékgátlás: 0,5%-nál kisebb koncentrációjú butanolnak nincs hatása a sejtekre, magasabb koncentrációban azonban károsítja a sejtmembránt. 1,3%-os butanol koncentráció felett a termelés leáll. Termelő törzsek: A Clostridium baktériumcsaládba tartozó mikrobák képesek keményítőt (egyesek cellulózt) közvetlenül, vagy egyszerűbb szénhidrátokat (glükózt, fruktózt, xilózt, szacharózt, laktózt, stb.) anaerob körülmények között erjeszteni. Gram-pozitív spóraképző pálcák, egyik végükön több ostorszerű mozgásszervük van. Keményítőszerű tartaléktápanyagot tárolnak. Spórázáskor a nagyméretű endospórák deformálják a sejtfalat, a sejt végén buzogányszerű dudort alkotnak.

Aceton – butanol fermentáció Törzseltartás: a spórák nagyon ellenállóak, sokáig eltarthatók. A Clostridium acetobutylicum törzskultúrákat spóra formájában, homokban akár 30 évig is tárolják. A fermentorokat (pl.: 12 x 90 m3) hővel sterilezik. Levegőztetni nem kell (anaerob), de beoltás előtt és után a levet CO2 befúvatásával keverik, egyúttal telítik széndioxiddal. A fermentáció szénforrása: melasz vagy kukoricakeményítő Az indulási pH-t 5,8-6 közé állítják, a hőmérséklet 34 °C. A fermentációs idő 36 óra. Lefutása: 

Az első szakaszban a pH csökken, kb. 5,2-re → mert szerves savak (ecetsav és vajsav) keletkeznek.



A következő szakaszban a pH emelkedik → a savakból aceton és butanol képződik. Amikor felesleges NADH2 van jelen, akkor a sejtek felveszik a megtermelt vajsavat és butanollá redukálják.



Végül a növekedés és az oldószertermelés leáll. A legnagyobb változás a gáztermelés sebességében mutatkozik (nullára csökken), ez jelzi az anyagcsere leállását. A pH visszaáll az 5,8 értékre.

A kész levet feldolgozásra továbbítják: A CO2-ot kinyerik, az acetont, butanolt, etanolt kidesztillálják, a desztilláció maradékát megszárítják és takarmányként eladják. BAE erjesztésénél is fellép a termékgátlás, 0,7-1,5% butanol-koncentrációnál. A szaporodás és a termékképzés egyaránt csökken. Tehát nagy mennyiséghez: vagy nagy fermentációs térfogat kell, vagy növelni kell a térfogati produktivitást. Erjesztő mikroorganizmusként kizárólag a Clostridium acetobutylicum törzset használják.

Törzsfejlesztés: Rekombináns DNS technológiát, hagyományos mutagenezist és szelekciót alkalmaztak, hogy módosítsák a kívánt metabolikus útvonalakat az oldószertermelő Clostridiumok-ban.

Antiszensz blokkolás: a C. acetobutylicum 824 törzsben a butanol/aceton arány növelése érdekében az mRNS transzlációt gátló komplementer RNS-t használtak („antisense RNA technology”), hogy blokkolják az aceton termelő útvonalat alkotó enzimek és a CoAtranszferáz képződését. Technológia: Az alap a szakaszos volt, de az elmúlt két évtized alatt folytonos fermentációs technológiákat fejlesztettek ki. Ezek továbbfejlesztése a sejtvisszatartásos technológia: az elvet léből a sejteket elválasztják, és a visszavezetik a fermentorba, ezzel megnövelik a sejtek koncentrációját a reaktorban és emelik a produktivitást. Downstream fejlesztések: Kísérletek az oldószer-kinyerés egyszerűbbé és gazdaságosabbá tételére. Gáz sztripelés: Fermentlén gázt (célszerűen a termelődő szén-dioxidot) áramoltatnak keresztül, ahogy a gáz átbuborékol a fermentoron, oldószer gőzöket visz magával (gőznyomás), lehűlve ezek lekondenzálnak és összegyűjthetők. A gázt recirkuláltatják a fermentorba, további oldószer kinyerésére Pervaporáció: A fermentlé egy membránnal érintkezik, amelynek másik oldalán áramló inert gáz, vagy vákuum van. A termelt oldószer molekulák beoldódnak a membrán apoláris anyagába, átdiffundálnak rajta és a másik oldalon gőzként jelennek meg. Az egyensúly akkor állna be, ha a gőzök koncentrációja eléri az adott hőmérséklethez tartozó gőznyomást. Ha viszont a gőzöket folyamatosan elvisszük egy kondenzátorba, a termelt oldószerek elvétele is folyamatossá válik. A művelet hatékonyságát két paraméterrel jellemezhetjük:  szelektivitás: az eltérő polaritású illékony anyagok áteresztésének/ visszatartásának mértéke  fluxus: az egyes komponensek anyagtranszportjának sebessége, egységnyi időre és membránfelületre vonatkoztatva Extrakció: Vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel. A butanol jobban oldódik a szerves fázisban, mint a vizesben (fermentlé) → megoszlás. A két fázis eltérő sűrűsége alapján szétválasztható (ülepítés/centrifugálás) Probléma: a szerves fázisból ki kell vonni az átoldódott termékeket, pl. desztillációval. Hátrányai: • • • •

Az alkalmazott oldószer a sejtekre nézve toxikus lehet Nehezen szétválasztható emulzió kialakulása Az extraháló oldószer vesztesége (egy kevés mindig átoldódik a fermentlébe) A sejtek akkumulációja a szerves és a vizes fázis határfelületén

Membrán-extrakció (persztrakció) a megoldás: A fermentlevet és az oldószert egy membránnal választjuk el, ezen keresztül érintkezik a két, egymással nem elegyedő folyadék. Apoláris anyagú membrán esetén a butanol beoldódik a membrán anyagába és átdiffundál rajta, míg más, hidrofil komponensek illetve fermentációs köztitermékek (pl.: ecetsav, vajsav) visszamaradnak a vizes fázisban. Nincs direkt kapcsolat a két fázis között, így az oldószer toxicitása, fázis diszperzió, emulzió- és rétegképződés drasztikusan lecsökken vagy megszűnik

Gazdasági megfontolások: Utóbbi évek gazdasági tanulmányai szerint nem gazdaságos a butanol termelése a petrolkémiai útvonalhoz viszonyítva. További fejlesztésekre van szükség, hogy versenyképes legyen a kémiai előállítással: 

 

 

Genetikailag módosított törzsek kifejlesztése: olyan új törzseket létrehozni, melyek képesek lignocellulózból származó cukrok felhasználására és rezisztensek e hidrolizátumok a mikrobiális inhibitoraival szemben Minél olcsóbb szénforrások hasznosítása (melléktermékek, hulladékok, például a kukorica rost hidrolizátuma) A szénhidrát alapanyag minél teljesebb elerjesztése és az értéktelen melléktermékek képződésének minimalizálása. Ez a kihozatal javítása mellett a szennyvízbe kerülő szerves anyag mennyiségét is csökkenti. A sejttömeg visszavezetése, nagy sejtsűrűség Fermentációs melléktermékek (CO2, H2, biomassza) hasznosítása