15
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian (BBKP) Tanjung Priok Wilayah Kerja Bogor, mulai bulan Oktober 2011 sampai Februari 2012.
Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah isolat C. gloeosporioides dan isolat khamir hasil isolasi dari buah avokad, buah avokad lokal dari Garut, akuades steril, media Potato Dextrose Agar (PDA), Martin Agar (MA), Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC), Yeast Glucose Chloramphenicol Agar (YGCA), Kitin Agar 0.2%, Green Bean Agar (GBA), Potato Dextrose Broth (PDB), alkohol 70%, fungisida benomil, dan primer umum 18S rDNA dengan forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan reverse primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’).
Metode Isolasi C. gloeosporioides dari Buah Avokad Isolasi C. gloeosporioides dilakukan dengan metode penanaman jaringan buah avokad yang bergejala antraknosa pada media GBA dan PDA. Buah avokad dari lapangan dicuci dengan air steril. Buah yang bergejala dipotong pada bagian antara yang sehat dan sakit, kemudian dipotong kecil-kecil dan direndam dalam klorox (NaOCl) 1% selama 2 menit, selanjutnya dicuci dengan air steril dan ditanam pada media PDA secara aseptik. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang (27 0C –30 0C) hingga koloni cendawan tumbuh pada media. Pemurnian isolat C. gloeosporioides dilakukan dengan mengambil kultur C. gloeosporioides dan dibiakkan lagi dalam media GBA hingga diperoleh kultur murni.
Isolat yang sudah murni disimpan dan diremajakan kembali dalam
medium PDA sebelum digunakan untuk percobaan.
16
Isolasi Khamir dari Buah Avokad Isolasi khamir dilakukan dengan metode pencucian dan pengkayaan. Metode pencucian dilakukan dengan merendam buah avokad dalam air steril sebanyak dua kali berat buah kemudian digoyang dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Air rendaman buah avokad kemudian diencerkan dengan seri pengenceran 10 -1, 10-2, 10 -3, 10-4, dan 10-5 kemudian disebar pada media Martin Agar. Khamir yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan mengambil koloni tunggal khamir dan menggoreskannya pada media PDA yang telah ditambah Streptomycin 2%. Isolat yang telah murni disiapkan untuk perlakuan selanjutnya. Metode pengkayaan dilakukan dengan mengambil daging buah avokad yang telah matang sebanyak 10 g, kemudian dimasukkan dalam 90 ml media YGC dan digoyang dengan kecepatan 140 rpm selama 72 jam. Bagian bawah diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan dalam 9 ml air steril dan diencerkan berseri mulai 10 -1, 10-2, 10-3, 10 -4, 10-5. Setiap pengenceran diambil 0.1 ml dan diratakan pada media YGCA kemudian diinkubasi selama 48 jam. Pemurnian khamir dilakukan dengan mengambil koloni tunggal khamir pada media YGCA dan disimpan pada media PDA miring.
Pengujian in Vivo Khamir terhadap Penyakit Antraknosa pada Buah Avokad Pengujian dilakukan dengan modifikasi teknik pelukaan (Korsten et al. 2005). Buah avokad disterilkan dengan natrium hipoklorit (NaOCl) 1% selama 2 menit kemudian dicuci 2 kali dengan akuades steril dan dikeringanginkan. Buah avokad yang telah disterilkan dicelupkan dalam suspensi khamir pada konsentrasi 10 6 sel/ml dan 107 sel/ml yang telah ditambah 1% Tween 20 dan dikeringanginkan.
Inokulasi cendawan C. gloeosporioides konsentrasi 10 7
konidia/ml dilakukan dengan meneteskan 30 µl suspensi C. gloeosporioides tersebut pada buah dengan 3 (tiga) titik inokulasi pada bagian ujung, tengah dan pangkal buah avokad. Sebagai pembanding, buah avokad yang telah disterilkan dicelupkan dalam larutan fungisida benomil 0.5% dan dikeringanginkan kemudian diinokulasi C. gloeosporioides 10 7 konidia/ml dengan meneteskan 30 µl suspensi
17
C. gloeosporioides tersebut pada buah dengan 3 (tiga) titik inokulasi pada bagian ujung, tengah dan pangkal buah. Seluruh perlakuan diulang tiga kali. Kejadian penyakit diamati dan dihitung setiap hari selama 7 hari pengamatan dengan rumus sebagai berikut :
KP =
KP
=
Kejadian penyakit
=
Jumlah titik inokulasi yang menunjukkan gejala sakit
=
Jumlah titik inokulasi yang diamati
Uji Antibiosis in Vitro Khamir terhadap C. gloeosporioides Khamir digoreskan pada media PDA tepat di tengah petridish (Ø 9 mm) secara tegak lurus sebanyak 1 lup inokulasi. Biakan murni C. gloeosporioides berumur 14 hari yang diambil dengan bor gabus (Ø 5 mm), diletakkan pada sisi kanan dan kiri goresan khamir dengan jarak + 3 cm kemudian diinkubasikan pada suhu kamar. Pengamatan dilakukan dengan mengukur lebar zona hambat khamir terhadap C. gloeosporioides setiap hari sampai hari ke-15 inkubasi (Gambar 6).
3 cm
Isolat khamir
Ukur dan hitung lebar zona hambat khamir terhadap pertumbuhan patogen (r1 + r2)
Digoreskan transversal sebanyak 1 lup inokulasi
Letakkan biakan murni C. gloeosporioides Gambar 6 Uji antibiosis in vitro khamir terhadap C. gloeosporioides
Uji Kemampuan Kitinolitik Khamir berumur 3–5 hari digoreskan pada media kitin agar 0.2 % secara tegak lurus sebanyak 1 lup inokulasi tepat di tengah petridish (Ø 9 mm) dan
18
diinkubasikan pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 7 hari terhadap zona bening yang terbentuk pada tepi koloni khamir (Gambar 7).
Isolat khamir
Media kitin agar 0.2%
Khamir digoreskan secara tegak lurus sebanyak 1 lup inokulasi
Pengamatan zona bening yang terbentuk pada tepi koloni khamir setiap hari selama 7 hari pengamatan
Gambar 7 Uji kemampuan kitinolitik khamir pada media kitin agar 0.2% Identifikasi Khamir Empat isolat khamir yang dipilih diidentifikasi secara morfologi dan molekuler dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer umum 18S rDNA dengan forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3’) dan reverse primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) (Mirhendi et al. 2007). a). Ekstraksi DNA khamir Biakan khamir pada media PDB diambil sebanyak 1 ml, disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 5 menit kemudian ditambah bufer Harju sebanyak 200 µl dan divortex selama 1 menit. Setelah itu, didinginkan dalam es selama 2 menit kemudian diinkubasi pada suhu 95 0C selama 1 menit dan didinginkan kembali dalam es selama 2 menit kemudian diinkubasi pada suhu 95
0
C selama 1 menit.
Selanjutnya divortex selama 30 detik,
ditambahkankloroform sebanyak 200 µl dan divortex selama 2 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 5 menit, ambil supernatan kemudian tambahkan 400 µl etanol dingin dan diinkubasi dalam suhu -20 0C selama 30 menit. Setelah itu, sentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 8 menit. Pelet kemudian diambil dan ditambah dengan 500 µl etanol dingin kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 8 menit. Pelet yang terbentuk diambil dan disuspensikan dalam 30 µl ddH2O (nuclease free water) (Harju et al. 2004).
19
b). Polymerase Chain Reaction (PCR) Sebanyak 2 µl larutan DNA diamplifikasi dengan volume reaksi 25 µl yang terdiri atas 12.5 µl master mix (Qiagen), 1 µl forward primer (ITS1), 1 µl reverse primer (ITS4), dan 8.5 µl dH2O. Amplifikasi menggunakan primer 18S rDNA yaitu pasangan forward primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan reverse primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’). Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR Fast Thermal Cycler Gene Amp PCR System 9800 (PE Applied Biosystems, Norwalk, USA) dengan siklus denaturasi awal 95 0C selama 5 menit, denaturasi 95 0C selama 45 detik, annealing 55 0C selama 30 detik dan extension 72 0C selama 1 menit 30 detik. Langkah ke 2–4 diulang sebanyak 35 siklus dan final extension 72 0
C selama 7 menit. Elektroforesis dilakukan dalam 1.5% w/v gel agarose
(TopVision, Frementas) dengan marker GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Fermentas) dan diwarnai dengan ethidium bromide. Hasil PCR disikuen di PT First Base Genetica Science menggunakan pasangan primer ITS1 dan ITS4.
Analisis homologi nukleotida khamir
menggunakan BLAST (Blast Local Alignment Search Tool) pada situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) di www.blast.ncbi.nlm.nih.gov. Analisis Data Seluruh pengujian dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 5 ulangan. Data yang diperoleh dianalisis dengan Minitab 16. Pengaruh perlakuan dianalisis dengan sidik ragam dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (Fisher’s test) dengan tingkat kepercayaan 95%.
