BAHAN DAN METODE Penelitian terdiri atas 4 tahap meliputi pengujian fisik, kimia dan mikrobiologis terhadap bungkil inti sawit (BIS). Uji biologis dilakukan dengan menggunakan metoda eksperimental terhadap ayam pedaging yang diberi ransum yang mengandung BIS dan BIS fermentasi (BISF). Penelitian Tahap I : Uji Keragaman Sifat Fisik dan Kandungan Nutrisi BIS Tujuan penelitian Tahap I ini adalah untuk mempelajari beberapa sifat fisik dan kandungan nutrisi BIS. Hal ini penting dilakukan mengingat beragamnya proses produksi BIS yang akan berpengaruh terhadap kualitas BIS. Penelitian dilakukan selama 4 minggu bertempat di Laboratorium Industri Pakan dan Laboratorium Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan. A. Bungkil Inti Sawit BIS yang digunakan berasal dari beberapa tempat proses produksi yaitu dari pabrik produksi BIS di Lampung, Langkat Sumatera Utara dan Banten. Sampel diambil dari beberapa bagian tumpukan BIS yang terdiri dari bagian atas, bawah, tengah, samping kiri dan kanan secara menyilang,
kemudian
dikumpulkan dan dilakukan pencampuran secara homogen (komposit). Kualitas BIS yang terpilih pada Tahap I digunakan untuk tahap penelitian berikutnya. B. Peralatan Peralatan yang digunakan dalam percobaan sifat fisik BIS meliputi gelas ukur, pengaduk mika, corong plastik, kertas manila, mistar segitiga siku-siku, alumunium foil, botol semprot, stopwatch, statif, Tyler sieve Rettsch 5657 Haan; Type Vibro, W. Germany. Peralatan yang digunakan dalam analisis kandungan nutrisi adalah : oven, soxhlet, penangas air, seperangkat alat bom kalorimeter, seperangkat alat analisa protein, evaporator, tanur listrik, timbangan analitik. C. Rancangan Percobaan Rancangan penelitian yang digunakan pada uji keragaman sifat fisik BIS adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 perlakuan sumber produksi BIS dan 5 ulangan. Perlakuan meliputi : A1 = BIS yang berasal dari sumber produksi di Lampung A2 = BIS yang berasal dari sumber produksi di Langkat Sumut A3 = BIS yang berasal dari sumber produksi di Banten
33 Model matematis rancangan penelitian adalah : = μ + αi + εij
Yij Keterangan : Yij
= nilai pengamatan yang mendapat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
μ
= pengaruh rata-rata
αi
= pengaruh aditif dari perlakuan sumber produksi BIS ke-i (1, 2, 3)
εij
= galat percobaan dari perlakuan sumber produksi BIS ke-i, ulangan ke-j
i
= banyaknya perlakuan sumber produksi BIS (1, 2, 3)
j
= banyaknya ulangan (1, 2, 3, 4, 5)
D. Peubah yang Diukur 1. Berat Jenis (Spesific Grafitation). Diukur dengan menggunakan prinsip Hukum Archimides, yaitu suatu benda di dalam fluida, baik sebagian ataupun seluruhnya
akan memperoleh gaya Archimides sebesar fluida yang
dipindahkan ke atasnya (Kling & Woehlbier 1983). Bahan dimasukan kedalam galas ukur 100 ml dengan menggunakan sendok teh secara perlahan sampai volume 30 ml. Gelas ukur yang sudah berisi bahan ditimbang. Aquades sebanyak 50 ml dimasukan kedalam gelas ukur . Untuk menghilangkan
udara
antar
partikel
maka
dilakukan
pengadukan
menggunakan pengaduk mika. Sisa bahan yang menempel pada pengaduk dimasukan dengan menyemprotkan aquades dan ditambahkan kedalam volume awal. Pembacaan volume akhir dilakukan setelah
konstan.
Perubahan volume aquades merupakan volume bahan sesungguhnya.
BJ =
Bobot bahan pakan (g) ________________________ Perubahan volume aquades (ml)
2. Kerapatan Tumpukan (Bulk Density). Bahan dicurahkan kedalam gelas ukur dengan menggunakan corong dan sendok teh sampai volume 100 ml. Gelas ukur yang telah berisi bahan ditimbang. Pada setiap pemasukan bahan harus sama baik cara maupun ketinggian pencurahan. Selama pencurahan harus dihindari guncangan bahan. Adapun perhitungan kerapatan tumpukan adalah dengan cara membagi berat bahan dengan volume ruang yang ditempatinya (Chung & Lee 1985). Satuan kerapatan tumpukan adalah gram/ml.
34 3. Kerapatan Pemadatan Tumpukan (Compacted Bulk Density). Pengukurannya hampir sama dengan pengukuran kerapatan tumpukan, tetapi volume bahan dibaca setelah dilakukan pemadatan dengan cara menggoyang-goyangkan gelas ukur dengan tangan selama 10 menit (Ruttloff 1981). Satuan kerapatan pemadatan tumpukan adalah gram/ml. 4. Sudut Tumpukan (Angle of Repose). Bahan dijatuhkan pada ketinggian 15 cm melalui corong pada bidang datar. Kertas manila berwarna putih digunakan sebagai alas bidang datar (lantai). Ketinggian tumpukan bahan harus selalu berada di bawah corong.
Untuk mengurangi pengaruh tekanan dan
kecepatan laju aliran bahan, pengukuran bahan dilakukan dengan volume tertentu (100 ml) dan dicurahkan perlahan-lahan pada dinding corong dengan bantuan sendok teh pada posisi corong tetap sehingga diusahakan jatuhnya bahan selalu konstan. Sudut tumpukan (tg α) bahan ditentukan dengan pengukuran diameter dasar (d) dan tinggi (t) tumpukan (Ruttloff 1981). Besarnya sudut tumpukan dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : t tg α =
2t =
0.5 d
d
5. Tingkat Kehalusan (Modulus of Fineness) diukur berdasarkan Metoda Ruttloff (1981). Bahan sebanyak 300 gram dimasukan kedalam alat yang terdiri dari susunan saringan yang memiliki lubang sesuai dengan ukuran mesh. Besarnya sampel yang lolos pada setiap mesh didapat dari perhitungan : Berat sampel pada mesh tertentu (g) % sampel = _________________________________________ x 100% Total bahan (g) Setelah diketahui persentase (%) sampel pada setiap mesh, dihitung nilai konversi dengan cara : Nilai Konversi = % sampel x no perjanjian Nomor perjanjian
adalah besarnya nomor yang diberikan pada setiap
saringan berurutan dari 1 hingga 7 (dari mesh terkecil hingga mesh terbesar).
35 Jumlah total nilai konversi dibagi seratus merupakan besarnya modulus of fineness (MF). MF = Total Nilai Konversi / 100 Nilai MF menentukan katagori besar ukuran partikel bahan, dengan ketentuan yaitu : 1. Nilai MF > 4.1 - 7.0 termasuk katagori kasar (coarse) 2. Nilai MF 2.9 – 4.1 termasukl kategori sedang (medium) 3. Nilai MF 0 - < 2.9 termasuk kategori halus (fine) Dari nilai MF ini dapat dihitung rataan diameter bahan yaitu : Rataan diameter (inch) = Rataan diameter (cm)
0.00041 x 2MF
= rataan diameter (inch) x 2,54
6. Daya Ambang (Floating Rate). Sepuluh gram partikel bahan dijatuhkan pada ketinggian 3 meter dari dasar lantai, kemudian diukur lamanya waktu (detik) yang dibutuhkan sampai mencapai lantai dengan menggunakan stopwatch. Lantai tempat jatuhnya bahan diberi alas dengan alumunium foil untuk memudahkan pengamatan saat bahan jatuh. Diupayakan pengaruh udara diperkecil yaitu dengan menutup setiap lubang yang memungkinkan angin masuk (ventilasi, jendela, pintu). Daya ambang dihitung dengan cara membagi jarak jatuh (meter) dengan lamanya waktu yang dibutuhkan (detik) (Ruttloff 1981). Satuan daya ambang adalah m/detik. 7. Kandungan Bahan Kering.
Bahan ditempatkan dalam cawan porselen
kemudian dimasukan dalam oven pada suhu 105
o
C selama 24 jam.
Kandungan bahan kering dihitung sebagai selisih antara 100% dengan persentase (%) kandungan air (Van Soest & Robertson 1968) 8. Kandungan Protein Kasar. Diukur dengan menggunakan metoda Kjeldahl. (AOAC 1984). Analisis ini menggunakan
asam sulfat dengan suatu
katalisator dan pemanasan. Zat organik dari sampel dioksidasi oleh asam sulfat dan nitrogen diubah kedalam ammonium sulfat. Kelebihan asam sulfat dinetralisis dengan NaOH sampai larutan menjadi basa. Dari ammonium sulfat lalu didestilasi dalam medium asam untuk mendapatkan nitrogen secara kuantitatif. Protein rata-rata mengandung 16% Nitrogen, maka 100% :
36 16% = 6.25 harus dipakai untuk mendapatkan nilai protein kasar (Protein kasar = N% x 6.25) 9. Kandungan Serat Kasar. Bahan dilarutkan
dengan larutan H2SO4 1.25%
(setara 0.255 N) mendidih selama 30 menit dan larutan NaOH 1.25% (setara 0.313 N) mendidih selama 30 menit. Bagian yang tidak larut dinyatakan sebagai serat kasar (Metoda Van Soest & Robertson 1968). 10.Kandungan Energi bruto. Satu gram bahan dibakar dalam bom kalorimeter yang sudah diisi gas O2 dengan tekanan mencapai 25–30 atm. Pada saat pembakaran bom kalorimeter terendam dalam air yang bobotnya 1 kg. Panas pembakaran akan menaikan suhu air. Panas (kalor) yang dibutuhkan untuk menaikan suhu 1 kg air sebanyak 1 oC adalah 1 kilokalori. E. Analisis Statistik Data
keragaman
sifat
fisik
yang
diperoleh
dianalisis
dengan
menggunakan analisis sidik ragam (anova) dan untuk melihat kecenderungan dari pengaruh masing-masing perlakuan dilakukan uji Jarak Berganda Duncan (Steel & Torrie 1995) dengan menggunakan Program SAS Ver. 6.12 (SAS Institute 1996). Data kandungan nutrisi dianalisis dengan menggunakan analisis deskriptif untuk menguatkan hasil anova dari data keragaman sifat fisik. Penelitian Tahap II : Optimalisasi Proses Fermentasi BIS oleh Kapang Trichoderma reesei Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari hasil fermentasi BIS yang optimum dengan mencobakan pada dosis kapang dan ketebalan media yang berbeda. Pengukuran dilakukan terhadap perubahan media selama fermentasi dan terhadap produk fermentasi. Dosis kapang dan ketebalan media yang terbaik akan digunakan untuk penelitian selanjutnya. Penelitian ini dilakukan selama 4 bulan bertempat di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi serta Laboratorium Teknologi Pakan. A. Kapang Trichoderma reesei Kapang yang digunakan adalah Trichoderma reesei strain FNCC 6012 yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Universitas Gajah Mada Yogjakarta. Media pertumbuhan kapang yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA) FeSO4.7H2O, CuSO4.
dan nutrisi media yang terdiri atas NH4NO3, KCl,
37 B. Peralatan Alat-alat yang digunakan adalah autoclave, laminar, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, alumunium foil, kapas, pengaduk, erlenmeyer, timbangan digital, spoit, lampu spirtus, osse, plastik tahan panas, karet tahan panas termometer, higrometer, incubator, alat penghitung, spidol transparan, jangka sorong, nampan plastik, plastik wrapp, kertas koran steril, selotip, oven. Sebelum dilakukan fermentasi, kapang Trichoderma reesei diukur karakteristik pertumbuhan kapang yang meliputi jumlah koloni, diameter koloni dan persentase perubahannya. Hal ini menjadi dasar dalam penentuan waktu yang tepat dalam menginokulasi kapang untuk perbanyakan. Perbanyakan inokulum kapang dan fermentasi BIS dilakukan di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi selama 4 bulan. Pemotretan BISF dengan alat Scanning Microscope Electron (SEM) dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak. C. Rancangan Percobaan Analisis regresi digunakan untuk melihat kurva pertumbuhan kapang yang meliputi jumlah koloni dan diameter koloni. Umur pertumbuhan kapang yang diamati : 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, dan 72 jam. Model matematis rancangan penelitian adalah : Y = ax1 + bx2 Keterangan :
Y = kombinasi linier dari x1 dan x2 a dan b adalah konstanta x1 dan x2 adalah variabel bebas
Uji dosis kapang dan ketebalan media BIS menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola Faktorial dengan faktor pertama konsentrasi kapang, dan faktor kedua ketebalan media BIS, dengan ulangan sebanyak 3 kali. Faktor pertama konsentrasi kapang : D4 = konsentrasi kapang 104 CFU/cc D5 = konsentrasi kapang 105 CFU/cc D6 = konsentrasi kapang 106 CFU/cc Faktor kedua ketebalan media BIS : S1 = ketebalan media 1 cm S2 = ketebalan media 2 cm S3 = ketebalan media 3 cm Model matematis rancangan penelitian adalah :
38 Yijk
= μ + αi + βj + αi βj + εijk
Keterangan : Yijk
= nilai pengamatan satuan percobaan ke-k yang mendapat kombinasi perlakuan taraf ke-i dari konsentrasi kapang dan taraf ke-j dari faktor ketebalan media
μ
= nilai rataan umum
αI
= pengaruh taraf ke-i dari faktor konsentrasi kapang
βj
= pengaruh taraf ke-j dari faktor ketebalan media
αi βj
= pengaruh interaksi taraf ke-i (i = 1, 2, 3) dari faktor konsentrasi kapang dan taraf ke-j (j = 1, 2, 3) dari faktor ketebalan media
εijk
=
pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k (k = 1, 2, 3) yang memperoleh kombinasi perlakuan ij
D. Peubah yang Diukur 1. Jumlah koloni kapang (Pelczar & Reid 1972).
Sebelum melakukan
perhitungan koloni terlebih dahulu dibuat media Potatoe Dextrose Agar (PDA). Sebanyak 3.9 gram PDA dilarutkan dalam 100 cc air aquades steril kemudian
diaduk hingga
rata.
Larutan
tersebut
dipanaskan
hingga
seluruhnya larut. Media PDA tersebut dituangkan pada tabung reaksi sebanyak 3-4 cc yang ditutup kapas kemudian disterilkan pada suhu 121 oC selama 15 menit di dalam autoclave. Setelah dingin pada suhu 45 – 50 oC, medium yang masih cair ditempatkan dalam keadan miring dengan kemiringan 30o dan media PDA tidak mengenai kapas. Biakan murni kapang Trichoderma reesei ditanam pada media agar miring di dalam laminair, kemudian disimpan pada suhu kamar (28 oC), diinkubasi selama 48 – 72 jam. Setelah 72 jam Inokulum berupa spora ditambahkan aquades steril sebanyak 10 ml per tabung reaksi, kemudian spora dipiisahkan dengan cara permukan biakan yang berisi biakan kapang pada agar miring digores-gores dengan menggunakan pengaduk mika, selanjutnya divortex agar suspensi spora menjadi homogen dan siap dilakukan perhitungan jumlah koloni.
Pada
perhitungan jumlah koloni dipersiapkan media PDA yang sudah steril sama seperti diatas hanya saja tempatnya pada cawan petri. Sederetan tabung reaksi yang berisi 9.9 ml aquades steril dipersiapkan sebanyak 5 tabung dan diberi label mulai dari pengenceran 10-2 sampai 10-6. 0.1 ml larutan spora dimasukan kedalam tabung 10-2, kemudian dari tabung tersebut diambil 0,1 ml untuk dituangkan pada tabung 10-3 dan satu lagi dimasukan dalam cawan petri dan demikian seterusnya. Sebelum pengambilan larutan spora dalam
39 tabung harus dihomogenkan dengan vortex. Cawan petri disimpan pada suhu kamar
(28
o
C), dan diinkubasi selama 48 – 72 jam. Lakukan
pengamatan setiap 6 jam untuk perhitungan jumlah koloni. 1 Jumlah koloni /ml = jumlah koloni dalam cawan petri
X pengenceran
2. Perubahan diameter koloni kapang (Santiago et al. 2006). Persiapan pengukuran diameter koloni kapang hampir sama dengan perhitungan jumlah koloni. Media PDA yang sudah steril ditempatkan dalam cawan petri. Bagian bawah cawan petri dibuat garis vertikal dan horizontal tepat ditengah cawan petri. Hal ini untuk memudahkan dalam pengukuran maupun penempatan spora kapang. Osse yang sudah steril dicelupkan pada larutan spora dan ditusukan pada media PDA tepat dipersilangan garis vertikal dan horisontal. Pengamatan diameter pertumbuhan kapang dilakukan setiap 6 jam.
Perubahan Diameter Koloni (%) =
A–B A
x 100%
Keterangan : A = diameter koloni saat pengamatan B = diameter koloni saat pengamatan sebelumnya 3. Suhu media selama fermentasi. Media BIS yang difermentasi diukur suhunya setiap 24 jam. 4. pH media selama fermentasi. Media BIS yang difermentasi pada waktu tertentu diambil kemudian digerus dengan mortar dan ditambahkan aquades dengan perbandingan 1 : 5. pH diukur saat angka tidak berubah lagi. 5. Kandungan Bahan Kering (Metoda Weende). Diukur dengan cara bahan yang ditempatkan dalam cawan khusus dioven pada suhu 105 oC selama 24 jam. Kandungan bahan kering dihitung sebagai selisih antara 100% dengan persentase (%) air 6. Kandungan Protein Kasar (Metoda Kjeldahl). Analisis ini menggunakan asam sulfat dengan suatu katalisator dan pemanasan. Zat organik dari sampel dioksidasi oleh asam sulfat dan nitrogen diubah kedalam ammonium sulfat. Kelebihan asam sulfat dinetralisis dengan NaOH sampai larutan menjadi basa. Dari ammonium sulfat lalu didestilasi dalam medium asam untuk
40
Autoklaf 121oC selama 15 menit
Pengayakan BIS Saringan 2 mm
Inkubasi suhu Ruang 28 oC Selama 96 jam
Pemanenan
Pengeringan Oven 50 oC selama 24 jam
Penambahan Nutrient Media NH4NO3 0.5% KCl 0.05% MgSO4.7H2O 0.05% FeSO4.7H2O 0.01% CuSO4.7H2O 0.0001%
Penambahan Inokulum kapang Trichoderma reesei Konsentrasi 2.13x106 CFU/cc Dosis 1 cc/100 g BIS
Penggilingan
Penyimpanan
Gambar 9 Skema fermentasi BIS oleh kapang Trichoderma reesei mendapatkan
nitrogen
secara
kuantitatif.
Karena
protein
rata-rata
mengandung 16% Nitrogen, maka 100% : 16% = 6.25 harus dipakai untuk mendapatkan nilai protein kasar (Protein kasar = N% x 6.25) 7. Kandungan NDF (Metoda Van Soest & Robertson 1968) . Diukur dengan cara melarutkan bahan pakan dengan Neutral detergen soluble (NDS). Bagian yang tidak larut dinyatakan sebagai dinding sel atau Neutral detergen fiber (NDF) 8. Kandungan ADF (Metoda Van Soest & Robertson 1968 ). Diukur dengan cara dinding sel (NDF) dilarutkan kembali dengan larutan asam. Bagian yang tidak larut dalam larutan asam tadi dinyatakan sebagai Acid detergen fiber (ADF). 9. Kandungan Hemiselulosa (Metoda Van Soest & Robertson 1968 ). Dihitung dengan cara kandungan NDF dikurangi dengan kandungan ADF diperoleh hemiselulosa.
41 10. Penampakan visual pertumbuhan kapang. Dilihat penampakan media BIS selama fermentasi oleh kapang Trichoderma reesei setiap 24 jam dan dibandingkan perubahan setiap perlakuan. E. Analisis Statistik Data optimalisasi hasil fermentasi BIS oleh kapang Trichoderma reesei yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis sidik ragam (anova) dan untuk melihat kecenderungan dari pengaruh masing-masing perlakuan dilakukan uji Jarak Berganda Duncan (Steel & Torrie 1995) dengan menggunakan Program SAS Ver. 6.12 (SAS Institute 1996). Penelitian Tahap III : Degradasi Polisakarida Mannan BIS oleh kapang Trichoderma reesei Tujuan penelitian pada Tahap III ini adalah mempelajari kemampuan kapang Trichoderma reesei dalam mendegradasi polisakarida mannan BIS. Pada tahap ini terdapat peubah yang dilakukan secara in vitro pada ayam pedaging yaitu energi metabolisme, retensi nitrogen dan kecernaan mannan. Penelitian dilakukan selama 4 bulan bertempat di Laboratorium Teknologi Pakan, Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Laboratorium Kimia Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong. Pada Tahap III ini dilakukan
isolasi
mannan
baik
dari
BIS
maupun
dari
BISF.
Adapun
pelaksanaannya meliputi proses pengayakan, penghalusan ukuran (grinding), hot water extraction, penyaringan, pemusingan, freeze dry, rehidrasi. A. Kapang Trichoderma reesei Bahan yang digunakan kapang Trichoderma reeseii strain FNCC 6012, BIS, agar powder, gula pasir, ekstrak tauge, aquades steril, NH4NO3, KCl, FeSO4.7H2O, CuSO4, alkohol 70%, spirtus, NaOH, H2SO4, aquades, pecahan kaca. B. Peralatan Alat-alat yang digunakan adalah autoclave, laminar, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, alumunium foil, kapas, pengaduk, erlenmeyer, timbangan digital, spoit, lampu spirtus, osse, plastik tahan panas, karet tahan panas, pipet, termometer, higrometer, nampan plastik, plastik wrapp, kertas koran steril, selotip,
oven, Unico Camspec UV-Spectrophotometer,
alat filtrasi, Bio Rad
fraction collector, LC-MS Mariner Biospectrometry LC Perkin Elmer Series 200.
42 C. Rancangan Percobaan Pada tahap ini dilakukan uji t karena hanya membandingkan 2 perlakuan. Perlakuan yang diberikan meliputi : BIS
= Bungkil inti sawit
BISF = Bungkil inti sawit fermentasi Model matematis yang digunakan : t hit = Y – μ √ s2/n Keterangan : Y
= nilai rata-rata populasi
μ
= nilai tengah 2
√ s /n = simpangan baku D. Peubah yang diukur 1. Kandungan Mannan pada BIS dan BISF Disini dilakukan pemisahan beberapa komponen polisakarida yang terdapat
pada BIS. Komponen yang terbanyak,
(mannan) dipisahkan dan
diambil. Mannan yang diambil diupayakan komponen murni tanpa ikatan lignin. Pada petunjuk isolasi polisakarida dinding sel, umumnya terdiri atas tahapan penyiapan sampel, ekstraksi dari gula-gula netral, lipida dan pigmen, ekstraksi polisakarida yang larut dalam air, penghilangan lignin, ekstraksi dan fraksinasi dari polisakarida yang larut dalam alkali serta ekstraksi dari selulosanya (Southgate 1976). Adapun tahapan isolasinya adalah sebagai berikut (Metoda Southgate) : a. BIS dipersiapkan dalam keadaan kering udara b.
100 gram BIS di grinder dengan menggunakan mortar dengan penambahan 50 gram pecahan kaca selama 15 menit, kemudian ditambahkan aquades sedikit demi sedikit sebanyak 500 ml dan penggilingan dilanjutkan selama 15 menit.
c. Hot water extracted pada suhu 121 oC selama 15 menit menggunakan autoklaf. Setelah ekstraksi dingin secara perlahan dilakukan penyaringan dengan kain. d. Supernatan yang diperoleh dilakukan pemusingan dengan alat sentrifuse pada kecepatan 4 000 rpm. Supernatan hasil pemusingan dibekukan selama 24 jam untuk persiapan freeze dry. e. Freeze dry dilakukan selama 24 jam atau sampai benar-benar kering.
43 Pengujian kandungan mannan : Sebelum dilakukan pengujian dengan LC-MS sampel dipersiapkan mengikuti prosedur sebagai berikut : a. Supernatan yang sudah kering diambil sekitar 5 g dan dilarutkan dengan aquades dengan perbandingan 1 : 1. b. Larutan supernatan diambil 0.5 cc dan masukan dalam botol ampul. Tambahkan 0.5 cc Trifluoro acetic acid (TFA) 4 M. Ujung ampul dipanaskan dan diupayakan dalam keadaan hampa udara.. Simpan ampul dalam oven 105 oC selama 3 jam. c. Ujung ampul dipatahkan dan tambahkan 2-3 tetes larutan ethyl acetate 1 N untuk dinetralkan. d.
Pindahkan dalam tabung sampel kemudian lakukan freeze dry kembali.
e.
Sampel sebanyak 1 ml diambil dan diencerkan dengan acetonitril dan siap diinjeksikan pada LC-MS
2. Kecernaan Mannan Pada pengukuran kecernaan mannan, sampel yang dianalisa berupa feses dari ayam yang diberi bahan pakan BIS dan BIS fermentasi melalui pencekokan seperti halnya persiapan pada pengujian energi metabolisme. Sampel yang berupa feses diukur mannan nya mengikuti prosesedur yang sama seperti pada pengukuran mannan pada bahan pakan.
Kecernaan mannan
dihitung berdasarkan selisih antara kandungan mannan dalam bahan pakan dengan mannan pada feses. Kandungan mannan bahan – kandungan mannan feses Kecernaan mannan (%) = __________________________________________ x 100% Kandungan mannan bahan
3. Kandungan Total Gula Terlarut Prinsip penetapan kadar total gula terlarut berdasarkan Metoda Phenol (Dubois et al. 1956). Gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan phenol dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna oranye kekuningan yang stabil. Untuk mengukur kandungan total gula terlebih dahulu dilakukan pemisahan protein dari karbohidratnya berdasarkan berat molekulnya menggunakan filtrasi gel sephadex-50. Total gula diukur dengan
44 menggunakan metode Phenol pada panjang gelombang 490 ηm dengan Dglukosa sebagai standar. Persiapan dalam Pengukuran Total Gula terlarut Metoda Phenol : Larutan standar glukosa Pipet 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm glukosa, masing-masing kedalam tabung reaksi. Tambahkan 1 ml larutan phenol 5% dan dikocok dengan vortex. Tambahkan dengan cepat 5 ml larutan asam sulfat pekat dengan cara dituangkan secara tegak lurus permukaan larutan. Biarkan selama 10 menit, homogenkan dengan vortex kemudian ditempatkan dalam penangas air selama 15 menit. Absorbansnya diukur pada 490 ηm. Persamaan reaksi dari larutan standar glukosa dibuat berdasarkan nilai absorbansinya terhadap konsentrasi glukosa. Kadar glukosa sampel didapat dengan cara memasukan nilai absorbansinya ke persamaan regresi yang didapatkan.
Untuk penetapan total gula, sampel harus berupa cairan yang
jernih, saring jika ada endapan dengan kertas saring Whatman no. 2. Prosedur selanjutnya sama seperti persiapan pembuatan standar glukosa. Total gula (mg/g) = (C x S x Fp)/M Keterangan : C = Konsentrasi bahan (ppm)
S = Volume supernatan (ml)
Fp = Faktor pengenceran
M = Berat sampel (g)
4. Pengujian Energi Metabolisme Sejati (True Metabolizable Energy/TME) Pada tahap ini diuji BIS yang terfermentasi (BISF) dengan kapang pendegradasi mannan pada ternak unggas. Metode yang digunakan yaitu Metode Sibbald (1983). Hasil yang diperoleh adalah seberapa jauh peningkatan TME akibat perlakuan kapang pendegradasi mannan.
TME (kal/g)
{(a x EBp) – (b-EBf)} - (ret N x K) = _______________________________________ a
Keterangan : TME
= Energi metabolis sejati
EBp = Energi bruto bahan pakan
EBf
= Energi bruto feses ayam yang diberi pakan
45 Ret N = Retensi nitrogen a
= Jumlah konsumsi bahan pakan (gram)
b
= Jumlah ekskreta ayam yang diberi bahan pakan (gram)
K
= Energi equivalent per gram asam urat (kalori) atau sama dengan 8,22 kkal/gram asam urat
Persiapan pengujian energi metabolisme sejati Prosedur Kerja : Ayam dipuasakan selama 36 jam, kemudian
ransum perlakuan yang
sudah dibuat pellet dimasukan dengan paksa menggunakan tunnel dan plunner pada 30 ekor ayam masing-masing sebanyak 35 gram. Setelah 36 jam pemberian pakan, ekskreta dikumpulkan, dibersihkan dari bulu-bulu kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 70 oC selama 49 jam. Setelah kering dilakukan penimbangan, lalu digiling dan dianalisa energi bruto (EB) ekskreta dan jumlah ekskreta. 5. Retensi Nitrogen Semu Retensi nitrogen semu merupakan selisih antara jumlah nitrogen yang dikonsumsi dengan nitrogen endogenous (yang terdapat pada urine dan ekskreta). Pengukuran kandungan nitrogen dalam ekskreta dilakukan koleksi feses selama 1 kali 24 jam. Ekskreta ditampung, dibersihkan dari bulu-bulu, kemudian disemprotkan asam sulfat 0.3 N untuk mencegah penguapan nitrogen. Selanjutnya dikeringkan di dalam oven bersuhu 60 oC selama 24 jam. Setelah itu digiling halus dan dianalisa kandungan nitrogennya. Retensi N semu (g/hari) = Konsumsi N (g/hari) – Ekskresi N (g/hari) E. Analisis Statistik Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji t (Steel & Torrie 1995) dengan menggunakan program MINITAB® Release 14 Statistical Software (MINITAB Inc. 2004). Penelitian Tahap IV : Pengaruh Tingkat BIS dan BISF dalam Ransum terhadap Penampilan Ayam Pedaging Tujuan penelitian pada Tahap IV ini adalah untuk mengetahui penampilan ayam pedaging yang
diberi perlakuan ransum berbagai tingkat BIS maupun
46 BISF. Penelitian ini dilakukan secara invitro untuk memperkuat hasil analisis pada penelitian Tahap III. A. Ternak Day old chick (DOC) commercial stock Cobb CP 707 digunakan sebanyak 350 ekor, tanpa pemisahan jantan dan betina (unsexed) dengan ratarata bobot DOC 42.84 ± 1.75 gram dan koefisien variasi sebesar 4.09%. B. Kandang dan Peralatan Kandang penelitian yang digunakan adalah kandang koloni ukuran 1x1x1 meter dengan alas litter menggunakan sekam padi. Masing-masing unit terdiri atas 10 ekor, sehingga seluruh unit kandang berjumlah 35 unit. Setiap unit kandang dilengkapi lampu pemanas/penerangan 40 watt, tempat pakan, tempat minum. Pada minggu pertama sekam ditutupi kertas koran. Tempat ransum menggunakan nampan plastik (feeder tray) dan tempat minum kecil ukuran 1 liter. Ruangan kandang dilengkapi 2 exhaus pan dan 1 kipas angin besar. Peralatan lain yang digunakan adalah alat pengukur temperatur dan kelembaban ruangan, timbangan digital, kantong plastik tempat pakan, sapu, dan alat tulis. C. Ransum Bahan pakan yang digunakan dalam formulasi ransum adalah tepung jagung kuning, bungkil kedele, dedak padi halus, BIS, BISF, corn gluten meal, tepung ikan, crude palm oil, CaCO3, premix, dikalsium phosfat, garam dan DLmetionin. Perlakuan terdiri atas 7 macam ransum , yaitu: R0 = Ransum kontrol (setara 0 ppm mannan BIS) R1 = Ransum dengan 10% BIS (setara 1 532.16 ppm Mannan BIS) R2 = Ransum dengan 15% BIS (setara 2 298.24 ppm mannan BIS) R3 = Ransum dengan 20% BIS (setara 3 064.32 ppm mannan BIS) R4 = Ransum dengan 10% BISF (setara 1 404.48 ppm mannan BISF) R5 = Ransum dengan 15% BISF (setara 2 106.72 ppm mannan BISF) R6 = Ransum dengan 20% BISF (setara 2 808.96 ppm mannan BISF) Formula ransum penelitian didasarkan pada kebutuhan ransum ayam pedaging fase starter, yaitu protein kasar 22% dan energi metabolisme 3 000 Kkal/kg (NRC 1994). Pada Tabel 10 disajikan komposisi ransum dan komposisi nutrisinya disajikan pada Tabel 11.
47 Tabel 10 Susunan ransum perlakuan dalam penelitian pada ayam pedaging Bahan ransum
R0
Ransum perlakuan R2 R3 R4
R1
R5
R6
………………….………….% ………..…..…………………. Tepung Jagung Bungkil Kedelai Dedak Padi Halus Bungkil Inti Sawit (BIS) Bungkil Inti Sawit Fermentasi (BISF) Corn Gluten Meal Tepung ikan CPO CaCO3 Premix A 1) Dikalsium Phosfat Garam DL-methionin Jumlah 1 )
48 17 12.8 0
47 15 5.8 10
46 14 2.8 15
44 12.8 1 20
47 15 5.8 0
46 14 2.8 0
44 12.8 1 0
0 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
0 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
0 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
0 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
10 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
15 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
20 5 10 5 1 0.5 0.33 0.25 0.12 100
Keterangan : Kandungan per kg : Vitamin A 10.0 IU, Vitamin D3 3.3 IU, Vitamin E 30 IU, Riboflavin 6.0g, Thiamin 4g, Pyridoksin 3.3g, Asam pantothenat 15.0g, Viatmin B12 0.015g, Niasin 50.0g, Vitamin K 2.0g, Asam folat 1.0g, Biotin 0.2g, mangan 70.0g, Seng 60.0g, Kuprum 8.0g, Selenium 0.3g, Besi 70.0g
Tabel 11 Kandungan nutrisi ransum perlakuan Nutrisi
R0
R1
Mannan (ppm) Protein kasar (%) 1) Serat kasar (%) Lemak kasar (%) ME (kkal/kg) 2) Imbangan EM/PK Arginin (%) Glisin+serin (%) Histidin (%) Isoleusin (%) Leusin (%) Lysin (%) Methionin (%) Methionin+sistin (%) Phenilalanin (%) Threonin (%) Triptophan (%) Valin (%) Ca (%) P tersedia (%) Cl (%) Mg (mg) K (%) Na (%) Cu (mg) I (mg)
0 22.15 3.98 9.69 3 076 138.89 1.317 1.896 0.566 0.878 1.994 1.155 0.590 0.923 1.007 0.824 0.234 1.038 1.043 0.460 0.247 2 411 0.770 0.211 14.744 0.100
191.52 21.99 5.40 9.29 3 066 139.43 1.401 1.866 0.545 0.915 1.902 1.107 0.587 0.907 0.991 0.808 0.227 1.038 1.090 0.459 0.255 1 990 0.747 0.210 13.264 0.100
Kandungan Nutrisi R2 R3 R4 287.28 21.93 6.16 9.14 3 052 139.20 1.446 1.854 0.535 0.935 1.856 1.085 0.586 0.900 0.985 0.801 0.224 1.039 1.114 0.459 0.260 1 821 0.743 0.209 12.524 0.100
383.04 21.84 7.02 9.11 3 021 138.32 1.493 1.842 0.524 0.953 1.804 1.062 0.586 0.892 0.977 0.794 0.220 1.041 1.137 0.459 0.265 1 748.6 0.752 0.208 11.766 0.100
103.74 22.35 4.90 9.19 3 077 137.65 1.401 1.866 0.545 0.915 1.902 1.107 0.587 0.907 0.991 0.808 0.227 1.038 1.084 0.460 0.256 1 990 0.747 0.210 13.264 0.100
R5 155.61 22.47 5.41 8.98 3 068 136.55 1.446 1.854 0.535 0.935 1.856 1.085 0.586 0.900 0.985 0.801 0.224 1.039 1.105 0.460 0.261 1 821 0.743 0.209 12.524 0.100
R6 207.48 22.56 6.03 8.89 3 042 134.82 1.493 1.842 0.524 0.953 1.804 1.062 0.586 0.892 0.977 0.794 0.220 1.040 1.125 0.461 0.267 1 748.6 0.752 0.208 11.766 0.100
Standar NRC 1994 22* 3 000* 139.13 1.25 1.25 0.35 0.80 1.20 1.10 0.50 0.90 0.72 0.80 0.20 0.90 1.00 0.45 0.20 600 0.30 0.20 8.00 0.35
48 Kandungan nutrisi ransum perlakuan (lanjutan) Fe (mg) 120.32 104.17 96.82 Se (mg) 0.292 0.262 0.249 Zn (mg) 83.98 80.90 79.42 Vitamin A (mg) 6 003 6 003 6 003 Vitamin D (IU) 1 000 1 000 1 000 Vitamin E (IU) 25.03 20.57 18.53 Vitamin B12 (mg) 0.016 0.016 0.016 Biotin (mg) 0.157 0.120 0.104 Choline (mg) 1 228.5 1 195.8 1 182.1 Folacin (mg) 0.725 0.571 0.503 Niacin (mg) 79.454 58.774 49.779 Pantothenic acid 11.484 9.954 9.284 (mg) Pyridoxin (mg) 6.822 6.092 5.762 Riboflavin (mg) 4.283 4.390 4.451 Thiamin (mg) 6.375 4.675 3.920
91.06 0.240 78.04 6 003 1 000 16.99 0.016 0.092 1 170.2 0.454 44.002 8.818
104.17 0.262 80.90 6 003 1 000 20.57 0.016 0.121 1 195.8 0.571 58.774 9.954
96.82 0.249 79.42 6 003 1 000 18.53 0.016 0.104 1 182.1 0.503 49.779 9.284
91.06 0.240 78.04 6 003 1 000 16.99 0.016 0.092 1 170.2 0.454 44.002 8.818
80.0 0.15 40.0 1 500 200 10 0.01 0.15 1 300 0.55 35.0 10.0
5.518 4.526 3.391
6.092 4.390 4.675
5.762 4.451 3.920
5.518 4.526 3.391
3.5 3.60 1.80
Keterangan : 1) Hasil analisis Laboratorium Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan Fapet IPB (2007) 2) Hasil perhitungan dengan ME = 0.7273 GE (Farrel 1974) Vitamin, mineral dan asam amino merupakan hasil perhitungan berdasarkan Tabel-tabel dari komposisi bahan makanan ternak untuk Indonesia (Hartadi et al. 1980) *) Standar galur super broiler (1999) diacu dalam Amrullah (2003)
D. Rancangan Percobaan Rancangan
percobaan
yang
digunakan
pada
Tahap
IV
adalah
Rancangan Acak Lengkap dengan 7 perlakuan dan 5 ulangan. Model matematis rancangan penelitian adalah : Yij = μ + αi + εij Keterangan : Yij
= nilai pengamatan perlakuan ransum ke-i dan ulangan ke-j
μ
= nilai rataan umum
αi
= pengaruh perlakuan ransum ke-i
εij
= galat percobaan dari perlakuan ransum ke-i dan ulangan ke-j
i
= banyaknya perlakuan ransum ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7)
j
= banyaknya ulangan (1, 2, 3, 4, 5)
E. Peubah yang diukur 1. Bobot badan akhir (g) Diperoleh pada penimbangan bobot badan ayam (g) umur 42 hari. 2. Pertambahan bobot badan kumulatif (g/ekor/35 hari) Dihitung dari selisih bobot badan akhir percobaan pada umur 42 hari dengan bobot awal (umur 7 hari), dihitung dalam gram. Adapun rumusnya : PBB =
W2 - W1 T2 -T1
49 Keterangan : PBB = Pertambahan bobot badan W2 = Bobot badan akhir (g) W1 = Bobot badan awal minggu (g) T2
= Waktu akhir minggu
T1
= Waktu awal minggu
3. Konsumsi ransum (g/ekor/35 hari) Selisih antara ransum yang disediakan (umur 7 hari) dengan sisa ransum ransum pada akhir percobaan (umur 42 hari), dihitung dalam gram 4. Konversi ransum Konversi ransum dihitung menggunakan rumus : Konversi ransum = Rataan konsumsi ransum (umur 7-42 hari) (g) Rataan pertambahan bobot badan (umur 7 – 42 hari) (g) 5. Persentase bobot karkas (%) Dihitung dengan menggunakan rumus : Persentase karkas (%)
Bobot karkas (g) = _________________________________ x 100% Bobot hidup pada akhir penelitian (42 hari) (g)
6. Mortalitas (%) Dihitung dengan rumus : Mortalitas (%)
= Jumlah ayam yang mati selama penelitian Jumlah seluruh ayam pada awal penelitian
x 100%
7. Indeks Prestasi (IP) Ayam Pedaging Indeks prestasi broiler dihitung dengan rumus sebagai berikut :
IP
=
Rata-rata berat panen (kg) x persentase ayam hidup (%) _______________________________________________ x 100 Konversi ransum x umur panen (hari)
Standar minimal IP ayam pedaging adalah 200. 8. Analisis income over feed and chick cost (IOFCC) Dihitung berdasarkan harga jual ayam pada akhir penelitian dikurangi oleh biaya pakan dan anak ayam selama penelitian F. Analisis Statistik
50 Data yang diperoleh dianalisis
dengan menggunakan analisis sidik
ragam (anova) dan untuk melihat kecenderungan dari pengaruh masing-masing perlakuan dilakukan uji Kontras Orthogonal (Steel & Torrie 1995) dengan menggunakan Program SAS Ver. 6.12 (SAS Institute 1996).
