4
ditranskipsi dan produk translasi yang dikode oleh gen (Nasution 1999). Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Primer yang berada sebelum daerah target disebut sebagai primer forward dan primer yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polimerase (Muladno 2002). Reaksi PCR pada dasarnya adalah tiruan dari proses replikasi DNA, yaitu adanya pembukaan rantai DNA utas ganda, penempelan primer, dan perpanjangan rantai DNA baru oleh DNA polimerase dari arah 5’ ke 3’. Tetapi pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Satu siklus pada teknik PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Denaturasi dilakukan pada suhu 9095oC sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase. Selanjutnya pada tahap annealing, suhu diturunkan untuk penempelan primer oligonukleotida pada sekuens yang komplementer pada molekul DNA cetakan. Suhu annealing tiap sekuens DNA bersifat spesifik dan merupakan faktor penentu keberhasilan suatu reaksi PCR. Sedangkan tahap terakhir adalah ekstensi. Tahap ekstensi dilakukan pada suhu 72o C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA polimerase. Pada tahap ini terjadi sintesis DNA komplemen dengan DNA cetakan. Ketiga tahap tersebut dilakukan berulang kali dalam mesin PCR, pada umumnya antara 25-40 siklus bergantung dari jumlah DNA yang diinginkan (Saiki et al. 1989). Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah Gram negatif yang termasuk famili Rhizobiaceae dan anggota dari genus Agrobacterium. Pada awal abad 20-an A. tumefaciens diketahui merupakan penyebab crown gall diseases yang membentuk benjolan dalam tanaman dikotil yang menyerang 90 famili tumbuhan dikotil
sehingga menimbulkan kerugian ekonomi yang besar. Tumor ini dihasilkan dari proses transfer, integrasi dan ekspresi dari transfered DNA (T-DNA) utas tunggal. T-DNA dihasilkan oleh plasmid Ti yang dipicu oleh molekul yang dilepaskan sel tanaman yang sedang tumbuh sehingga menginduksi virulance (vir) gene dari A. tumefaciens untuk menghasilkan T-DNA. Setelah terintegrasi, ekspresi dari T-DNA memicu biosintesis hormon pertumbuhan tanaman dan senyawa opines yang merupakan nutrisi bagi A. tumefaciens. Kemampuan T-DNA untuk mentransfer DNA ke organisme eukariotik dan gen yang berada di T-DNA dapat digantikan dengan gen apa saja, menjadikan A. tumefaciens sebagai vektor yang ideal untuk transfer gen ke suatu organisme eukariotik, seperti tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik, fungi dan sel manusia (Tzfira & Citovsky 2003). Agrobacterium memiliki tiga komponen genetik yang digunakan untuk menginfeksi tanaman. Komponen yang pertama adalah komponen T-DNA yaitu fragmen yang ditransfer ke sel tanaman. TDNA terletak di plasmid Ti dari Agrobacterium. Komponen kedua adalah virulance (vir) region yang mensintesis protein vir dan komponen ketiga adalah gen chromosomal virulance (chv) yang berfungsi dalam pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman (Sheng & Citovsky 1996).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian gen kitinase produk PCR adalah gen kitinase berupa isolat DNA plasmid yang sudah didapat dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) yang dimurnikan dengan Pure Link TM Quick Gel Extraction kit (Invitrogen), dan untuk verifikasi hasil dengan gel agarosa bahan yang digunakan adalah serbuk agarosa, buffer TBE 0.5 X, etidium bromida (EtBr), loading buffer (brom fenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 kb plus (Invitrogen). Teknik cloning yang dilakukan dapat dibagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap ligasi, transformasi, dan seleksi transforman. Pada tahap ligasi bahan yang digunakan antara lain vektor pGEM-T Easy (Promega), T4 DNA ligase dan buffer ligasi. Sedangkan bahan yang digunakan pada tahap transformasi dan seleksi transforman adalah sel kompeten E.coli XL1-Blue yang
5
diperoleh dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), media Luria Bertani (LB) agar Low Salt (LA) yang telah ditambahkan ampisilin 100 mg/L + isopropil – – D – Thiogalaktopiranosida (IPTG) 100mM + 5 – bromo – 4 – kloro – 3 – indiol – – galaktopiranosida (X-Gal) 40 mg/L. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Restriksi dilakukan dengan menggunakan enzim dari Biolabs. Enzim yang digunakan adalah NcoI dan SpeI. Sedangkan transformasi dengan menggunakan sel kompeten kimia dari AGLO, bahan yang digunakan antara lain es batu, nitogen cair, media Yeast Exctract Pepton (YEP), antibiotik rifampisin 50 ppm, dan kanamisin 25 ppm. Peralatan yang digunakan untuk pemurnian gen kitinase produk PCR adalah pisau skapel, timbangan, sentrifus Eppendorf 5417R, dan penangas air. Peralatan yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir, cetakan agar, bak elektroforesis, adaptor 100 volt, dan perangkat gel doc. Selain itu peralatan lain yang digunakan adalah shaker incubator, ruang laminar, autoklaf, pH meter, magnetic stirer, dan peralatan-peralatan gelas seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmayer, dan gelas ukur. Metode Penelitian Penelitian ini dibagi menjadi 2 tahap, yaitu tahap penemuan gen dan tahap strategi konstruksi gen. Penelitian yang dilakukan sebelumnya yaitu menemukan gen kitinase yang akan digunakan untuk tahapan selanjutnya dengan cara mencari spesifikasi gen yang diinginkan pada bank data www.ncbi.nlm.nih.gov. Kemudian disain primer berdasarkan informasi yang didapatkan dari National Center for Biotechnology Information (NCBI), amplifikasi menggunakan primer spesifik, cloning pada pGEMT-Easy dan tahap selanjutnya adalah sekuensing. Setelah tahap I penelitian berhasil ditemukan maka dilanjutkan ke tahap II penelitian yaitu strategi konstruksi gen. Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR Pemurnian gen kitinase produk PCR menggunakan Pure Link TM Quick Gel Extraction dari Invitrogen. Fragmen dipotong dari gel dengan menggunakan scalpel dan ditimbang bobotnya. Gel yang sudah dipotong dilarutkan dengan menggunakan buffer GS1 (gel solubilization buffer) dengan perbandingan antara sampel dan buffer yang ditambahkan adalah 1:3. Gel diinkubasi pada
suhu 50o C selama 15 menit, dan setiap 3 menit dibolak-balikan secara perlahan agar bercampur rata dan larut. Setelah larut gel tersebut diinkubasi lagi selama 5 menit pada suhu ruang. Larutan ditransfer ke dalam tabung lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit pada suhu 25oC. Setelah disentrifus, sebanyak 500 µL GS1 ditambahkan ke dalam tabung dan diinkubasi selama 1 menit lalu disentrifus lagi dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Sebanyak 700 µL W9 (wash buffer) ditambahkan ke dalam tabung lalu diinkubasi selama 5 menit dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Setelah itu tabung disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit untuk menghilangkan sisa etanol yang ada. Lalu dielusi dengan 30 µL buffer TE (Tris-EDTA). Setelah itu diinkubasi selama 1 menit dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Hasil elusi diverifikasi pada gel agarosa 1 %. Sebanyak 2 µL hasil elusi dilarutkan dengan 1µL loading buffer dan dimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk pada gel. Gel diletakkan dalam bak elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TBE 0.5X. Lalu dihubungkan dengan adaptor dengan potensial listrik sebesar 100 volt. Setelah selesai, gel diletakkan di bawah sinar UV (perangkat gel doc) untuk melihat ada tidaknya pita yang terbentuk. Ukuran perkiraan fragmen hasil pemurnian gen kitinase produk PCR sekitar 1500 bp (Chaidamsari 2005). Cloning Gen Kitinase ke pGEMT-Easy Setelah verifikasi pada gel agarosa menunjukkan hasil sesuai dengan yang diharapkan, selanjutnya cloning gen diawali dengan ligasi gen kitinase dengan pGEMTEasy menggunakan kit dari Promega. Sebanyak 3.5 µL insert (hasil elusi) ditambahkan dengan 5 µL buffer ligase, 0.5 µL vektor pGEMT-Easy dan 1µL T4 ligase. Sehingga total campuran sebanyak 10 µL. Tabung mikro ditutup rapat dengan parafilm kemudian diputar sebentar. Setelah itu campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau semalaman pada suhu 4oC. Selanjutnya hasil ligasi akan ditransformasi ke E.coli (XL1-Blue) (Chaidamsari 2005). Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia coli (XL1-Blue) Transformasi gen kitinase ke E.coli (sel kompeten) menggunakan metode Doyle
6
(1996). Setelah disimpan semalaman pada suhu 4oC, hasil ligasi ditempatkan di dalam freezer yang selanjutnya akan dimasukkan ke dalam sel kompeten. Sebanyak 10 µL kitinase hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL XL1-Blue (sel kompeten). Kemudian dikocok perlahan hingga tercampur rata. Lalu diinkubasi di dalam es selama 30 menit, setelah itu diinkubasi dalam penangas air pada suhu 42o C selama 50 detik. Selanjutnya tabung tersebut segera dimasukkan ke dalam es selama 10 menit. Setelah dimasukkan ke dalam es larutan tersebut ditambahkan dengan 800 µL LB (Luria Bertani) + glukosa dan dikocok selama 1.5 jam pada suhu 37o C dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dikocok, larutan diambil sebanyak 100 µL dan disebar menggunakan segitiga penyebar ke dalam media LA yang mengandung ampisilin 100ppm + IPTG (isopropil – – D – thiogalaktopiranosida) 100mM + X-Gal (5bromo-4-kloro-3-indiol- -galaktopiranosida) 40 mg/L. Selanjutnya diinkubasi semalam pada suhu 37oC. Seleksi transforman dilakukan dengan pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang terbentuk adalah sel E.coli yang berhasil ditransformasi, sedangkan yang tidak berhasil ditransformasi akan mati akibat penambahan ampisilin. Dua jenis koloni akan terbentuk pada cawan petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil disisipi. Sedangkan koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil disisipi. Setiap koloni putih yang terbentuk diberi nomor dan ditandai. Koloni yang berwarna putih kemudian dengan tusuk gigi steril diambil sedikit untuk PCR DNA koloni dan sedikit dipindahkan ke medium LB agar dalam cawan petri (duplikat koloni). Konfirmasi Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan Konfirmasi koloni transforman menggunakan metode Chaidamsari (2005) dan dilakukan dengan teknik PCR DNA koloni. Proses PCR DNA koloni menggunakan mesin PCR (Biometra Tpersonal). Proses ini diawali oleh pemecahan sel (lisis) dengan pemanasan pada suhu 96o C selama 5 menit kemudian suhu turun menjadi 50oC dan berlangsung selama 90 detik, suhu naik kembali menjadi 96oC selama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnya pada suhu 45o C, 1 menit pada suhu 96oC dan 40o C selama 1 menit. Setelah pemanasan pada proses lisis, campuran PCR (buffer lengkap, molecular
water, dNTPs, primer M13F, M13R dan Taq polimerase) ditambahkan pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu 94oC selama 30 detik, 55oC selama 1 menit dan 2 menit pada 72oC selama 30 siklus dan selanjutnya 72oC selama 5 menit. PCR DNA koloni dilakukan menggunakan primer universal M13 F dan R serta koloni bakteri sebagai cetakan. Hasil PCR DNA koloni diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih kemudian dikultur dalam medium LB cair yang telah ditambahkan ampisilin dan diinkubasi pada shaker-incubator suhu 37oC, 150 rpm. Dari kultur bakteri yang tumbuh, selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi diverifikasi kembali pada gel agarosa. Tahap selanjutnya akan dilakukan sekuensing fragmen gen terklon. Pengurutan basa (sekuensing) fragmen gen terklon dilakukan di Lembaga Molekuler Eijkmen Jakarta menggunakan primer universal M13F dan M13R. Hasil sekuen selanjutnya dianalisis menggunakan program bioedit dan BLASTX untuk membandingkan sekuen nukleotida yang ditranslasi pada seluruh open reading frame (ORF) dengan sekuens protein pada basis data. Analisis menggunakan BLASTX bertujuan untuk mengetahui kesesuaian urutan basa yang didapatkan dengan urutan basa yang ada dalam bank data. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan dalam media LB yang mengandung ampisilin kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC, 150 rpm. Plasmid diisolasi dengan menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Sebanyak 3–4 mL dipindahkan ke dalam tabung mikro lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm (6753 rcf) pada suhu 25oC selama 2 menit. Selanjutnya pelet yang dihasilkan diresuspensikan kembali dengan 250 µL suspension buffer + RNAse. Setelah itu ditambahkan kedalamnya 250 µL lysis buffer dan tabung dibolak-balikan secara perlahan sebanyak 6-8 kali, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Lalu sebanyak 350 µL binding buffer ditambahkan kedalamnya dan dibolak-balikan secara perlahan sebanyak 3-6 kali, kemudian diinkubasi selama 5 menit di dalam es. Setelah disimpan di dalam es, suspensi
7
tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan, dipindahkan ke dalam tube filter (kolom) dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Selanjutnya sebanyak 500 µL wash buffer I ditambahkan kedalamnya dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Kemudian ditambahkan lagi dengan wash buffer II sebanyak 700 µL dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Tabung filter (kolom) disentrifus dalam keadaan kosong untuk menghilangkan sisa etanol yang ada. Kemudian ditransfer ke dalam tabung 1.5 mL yang baru. Lalu dilarutkan dengan elution buffer sebanyak 30 µL, larutan diinkubasi selama 1 menit untuk melarutkan DNA yang berada pada membran filter, selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit. DNA plasmid diverifikasi pada gel agarosa 1 %. Restriksi Gen Kitinase dan pCambia 1303 dengan Enzim Restriksi Restriksi dilakukan dengan menggunakan enzim dari Biolabs. Plasmid yang mengandung gen kitinase dipotong menggunakan enzim Nco1 dan Spe1. Restriksi DNA plasmid dan pCambia 1303 dilakukan dengan dimasukkannya 7 µL DNA plasmid dan ditambahkan dengan 8.8 µL dH2O, 0.2 µL BSA, 2 µL buffer 2 (SpeI), 1 µL enzim SpeI dan 1 µL enzim NcoI sehingga volum total yang ada didalam tabung mikro tersebut sebanyak 20 µL. Campuran diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya hasil restriksi dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 0.5%. Setelah itu gel ditempatkan di bawah lampu ultraviolet (UV) untuk melihat gen kitinase yang sudah terpisah sempurna dengan vektor (pGEMT). Tahap selanjutnya fragmen gen kitinase dipotong dari gel menggunakan scalpel untuk elusi dan hasil elusi dicek pada gel agarosa 1 % (Chaidamsari 2005). Ligasi Gen Kitinase dengan pCambia 1303 Ligasi dilakukan dengan menggunakan T4 ligase dan buffer ligase dari Promega. Sebanyak 1 µL hasil elusi dicampurkan dalam tabung steril 500 µL dengan buffer (2x) sebanyak 5 µL, vektor pCambia sebanyak 3 µL dan T4 ligase sebanyak 1 µL sehingga volume total menjadi 10 µL. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau semalaman pada suhu 4oC (Chaidamsari
2005). Selanjutnya hasil ligasi gen kitinase dengan pCambia akan ditransformasi ke sel kompeten (XL-1 Blue). Sel kemudian disebarkan diatas medium LB agar yang telah ditambahkan dengan kanamisin 25 ppm. Setelah itu diinkubasi semalam pada suhu 37 o C. Seleksi transforman dilakukan dengan pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang terbentuk adalah koloni berwarna putih. Koloni putih yang tumbuh dari gen kitinase diduplikat dan diisolasi DNA plasmidnya. Koloni putih tersebut mengandung DNA rekombinan. Koloni tersebut juga dibuat duplikatnya dan dikulturkan dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 ppm. Lalu dikocok pada kecepatan 150 rpm selama semalam pada suhu 37oC. Dari kultur bakteri yang tumbuh, selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi diverifikasi kembali pada gel agarosa 1%. Transformasi Menggunakan Sel Kompeten Kimia ke Agrobacterium tumefaciens Strain AGLO Setelah hasil verifikasi pada agarosa sesuai dengan yang diharapkan, tahap selanjutnya adalah restriksi kembali gen kitinase dengan enzim restriksi yang sama. Tujuan dari restriksi ini adalah untuk mengecek gen kitinase tersebut sudah masuk ke dalam vektor atau tidak. Selanjutnya jika gen kitinase tersebut sudah masuk ke dalam vektor ekspresi maka tahap selanjutnya akan ditransformasikan ke dalam Agrobacterium. Transformasi ke Agrobacterium menggunakan metode Chaidamsari (2005), dengan cara sebanyak 5-10 L DNA plasmid dimasukkan ke dalam 500 L sel kompeten, diamkan di dalam es selama 15 menit. Setelah itu, diinkubasi di dalam es, diinkubasi kembali selama 5 menit di dalam nitrogen cair dengan suhu –260oC dan setelahnya 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian sebanyak 1 mL YEP (Yeast Exctract Pepton) ditambahkan kedalamnya dan dikocok selama 3 jam pada suhu 28oC dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dikocok, larutan tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm (3800 rcf) selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan sebagian dibuang dan sebanyak 200 L supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet yang terbentuk. Setelah itu sebanyak 200 L larutan tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam media LA yang telah berisi antibiotik kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50 ppm.
8
Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28o C dalam kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm. Setelah diinkubasi selama 2 hari, hasilnya adalah terbentuknya koloni berwarna putih. Koloni yang terbentuk kemudian diambil dengan tusuk gigi steril dan diberi nomor lalu dimasukkan ke dalam media agar untuk dibuat duplikatnya dan dikulturkan dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50 ppm. Selanjutnya dikocok selama 2 malam dengan kecepatan 150 rpm dan dilakukan isolasi DNA plasmid. Setelah itu, dilakukan restriksi kembali dengan menggunakan enzim NcoI dan SpeI. Keberhasilan tahap ini dapat dilihat berdasarkan hasil restriksi dengan enzim NcoI dan SpeI. Tahap selanjutnya dari penelitian ini, akan dilanjutkan oleh peneliti yang lain dari hasil yang didapatkan akan ditransformasikan melalui Agrobacterium ke eksplan tanaman kelapa sawit.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR Strategi dalam konstruksi gen harus mempertimbangkan dua hal yaitu urutan nukleotida gen yang akan dikonstruksi dan vektor ekspresi yang akan digunakan. Gen kitinase (chi) telah diamplifikasi oleh peneliti sebelumnya. Hasil PCR produk yang didapat dari tahap penelitian sebelumnya, dimurnikan terlebih dahulu untuk menghilangkan komponen-komponen yang dapat menghambat proses kloning selanjutnya. Hasil pemurnian PCR produk gen chi ditunjukkan pada Gambar 3. Berdasarkan hasil yang didapat, terlihat bahwa pada sumur 2 terdapat pita yang cukup tebal dengan ukuran yang sesuai dengan pita marka 1500 bp. Hasil dari gambar ini menunjukkan bahwa produk PCR yang telah murni adalah benar gen chi yang diinginkan.
2000 bp 1500 bp 1000 bp
M
1
M
1
2
2
Gambar 3 Pemurnian PCR produk gen chi. (M) marker, (1&2) gen chi.
Cloning Gen Kitinase Hasil PCR pada pGEMT-Easy Fragmen hasil amplifikasi (PCR) yang diverifikasi pada gel agarosa (Gambar 3), dipotong dari gel dan dimurnikan untuk digunakan pada tahap cloning. Cloning dibagi menjadi tahap ligasi, transformasi ke dalam sel kompeten, dan seleksi transforman. Vektor cloning yang digunakan pada penelitian adalah pGEMT-Easy dari Promega. Seperti terlihat pada Gambar 4, plasmid yang digunakan memiliki basa timin pada bagian ujungnya (3’ T-overhang). Basa T dari vektor dapat berikatan dengan fragmen gen hasil PCR yang memiliki kelebihan basa adenin, tanpa memerlukan tahapan restriksi terlebih dahulu. Proses ligasi terjadi dengan adanya bantuan enzim T4 DNA ligase, yaitu enzim yang membentuk ikatan fosfodiester diantara fragmen gen (insert) dan basa dari plasmid yang digunakan. Proses tersebut dapat dilakukan pada suhu ruang selama satu jam atau diinkubasi pada suhu 4o C selama semalam. Proses ligasi antara gen kitinase dan vektor cloning dalam hal ini telah berhasil dilakukan.
Gambar 4 Vektor klon pGEMT-Easy dan peta restriksi yang dimiliki (Promega 1999). Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia coli (XL-1 Blue) Produk ligasi yang telah berhasil, kemudian ditransformasi ke dalam sel E. coli XL1- Blue kompeten. Berdasarkan koloni yang terbentuk pada media (Gambar 5), menunjukkan bahwa hasil kloning gen kitinase ke dalam pGEMT-Easy telah berhasil dilakukan. Transformasi dilakukan dengan pemberian kejut panas (heat shock) pada suhu 42oC selama 50 detik. Prinsip utama dari proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari 0oC ke 42oC terhadap sel yang telah diberi perlakuan dengan CaCl2. Garam CaCl2
