BAB IV METODE PENELITIAN
4.1
Rancangan Penelitian sampel
Penentuan kadar optimal disinfektan
Penentuan efektivitas disinfektan
data
Skema 4.1 Rancangan Penelitian
4.2
Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Terapan Program Studi
Kimia Terapan Program Pasca Sarjana Universitas Udayana mulai tanggal 10 Januari sampai dengan 30 Juli 2011.
26
27
4.3
Bahan dan Alat Penelitian
4.3.1 Bahan penelitian Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain : akuades yang telah disterilkan, bakteri Salmonella thyphosa dalam agar nutrisi (sebagai gram negatif) dan bakteri Staphylococcus aureus dalam agar nutrisi (sebagai gram positif) yang diperoleh dari laboratorium mikrobiologi RSU Sanglah, besi (II) sulfat heptahidrat Merck p.a., fenol kristal Merck p.a., hidrogen peroksida 30% Merck p.a., kaldu nutrisi (Nutrient Broth), kalsium hipoklorit kristal Merck p.a., larutan NaCl fisiologis 0,9%, Mc Farland III (109 kuman/mL), dan spiritus. 4.3.2 Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : autoclave, Digital Oxygen Meter DO-5510 Lutron, pHmeter pHep HI 96107 Pocket-Sized Hanna Instruments, inkubator, kawat ose, labu ukur, pencatat waktu (stopwatch), tabung reaksi, pipet volume, mikro pipet, dan timbangan Digital Ohaus Carat Series.
4.4
Prosedur Penelitian
4.4.1 Penentuan kadar optimal disinfektan Penentuan kadar optimal disinfektan meliputi langkah-langkah: penyiapan media, penyiapan inokulum, penyiapan larutan baku dan sampel uji, kemudian dilakukan uji koefisien fenol untuk mengetahui kemampuan disinfeksi masingmasing bahan (Depkes RI, 1991).
28
Media adalah tempat untuk pertumbuhan mikroorganisme, yang berupa kaldu nutrisi (Nutrient Broth). Komposisi kaldu nutrisi adalah 10 g pepton, 5 g ekstrak daging, 5 g garam dapur (NaCl), 1,25 mL buffer fosfat pH 6,8 dan akuades sampai volume akhir 1 L. Inokulum berupa biakan bakteri Salmonella thyphosa dan inokulum berupa biakan bakteri Staphylococcus aureus yang diperoleh dari laboratorium mikrobiologi RSU Sanglah masing-masing diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% hingga diperoleh kekeruhan 0,5 Mc Farland III. Selanjutnya inokulum berupa biakan Salmonella thyphosa yang telah diencerkan diisikan ke dalam tabung reaksi sebanyak 0,5 mL/tabung. Perlakuan yang sama dikenakan juga terhadap inokulum berupa biakan bakteri Staphylococcus aureus. Larutan baku yang digunakan berupa larutan fenol 5% b/v yang dibuat dengan cara melarutkan 5 g kristal fenol ke dalam akuades steril hingga volume akhir menjadi 100 mL, kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades steril hingga diperoleh beberapa larutan dengan konsentrasi 0,2%; 0,1%; 0,067%; 0,05%; 0,033%; 0,025%; dan 0,020%. Larutan sampel yang digunakan berupa larutan disinfektan uji yaitu kaporit, hidrogen peroksida, dan pereaksi Fenton (H 2O2/Fe2+) yang masingmasing memiliki konsentrasi 5% sebagai larutan induk. Larutan kaporit 5% dibuat dengan melarutkan 5 g kristal kaporit ke dalam akuades steril hingga volume akhir menjadi 100 mL, kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades steril hingga diperoleh beberapa larutan dengan konsentrasi 0,2%; 0,1%; 0,05%; 0,025%; 0,0125%; 0,0083% dan 0,00625%.
29
Larutan hidrogen peroksida 5% dibuat dengan memipet sebanyak 10 mL larutan hidrogen peroksida 30% dan ditambah 50 mL akuades steril , kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades steril hingga diperoleh beberapa larutan dengan konsentrasi 0,2%; 0,1%;
0,05%; 0,025%; 0,0125%; 0,00833%; dan
0,00625%. Larutan uji hidrogen peroksida ini masing-masing dibagi menjadi 2 bagian. Satu bagian digunakan untuk uji hidrogen peroksida, sedangkan sebagian lagi digunakan untuk uji pereaksi Fenton dengan penambahan larutan FeSO 4 yang konsentrasinya sama tetapi volume berbanding sebagai 5 : 1. Larutan FeSO4 dibuat dengan cara melarutkan 5 g kristal FeSO4 ke dalam akuades steril hingga volume akhir menjadi 100 mL, kemudian diencerkan dengan akuades steril hingga diperoleh beberapa larutan dengan konsentrasi 0,2%; 0,1%; 0,05%; 0,025%; 0,0125%; 0,0083%; dan 0,00625%. Larutan FeSO4 ini harus dibuat baru, karena mudah teroksidasi menjadi Fe3+. Uji koefisien fenol dilakukan dengan menambahkan larutan hasil pengenceran sebanyak 4,5 mL ke dalam tabung reaksi yang telah diisi 0,5 mL biakan bakteri dan masing-masing dibiarkan dalam waktu 5, 10, dan 15 menit. Selanjutnya biakan bakteri yang telah ditambah desinfektan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Data yang diperoleh diisikan ke dalam Tabel 4.4.1a, dan Tabel 4.4.1b.
30
Tabel 4.4.1a
Sampel
Fenol
Kaporit
H2O2 H2O2/Fe2+
Waktu (menit) 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15
Daya Bunuh Larutan Fenol, Kaporit, Hidrogen Peroksida (H 2O2), dan Pereaksi Fenton (H2O2/Fe2+) Dalam Berbagai Konsentrasi Terhadap Bakteri Salmonella thyphosa Kode
Tabung
a
b
c
d
e
f
g
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
Kontrol -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
Koef Fenol
Tabel 4.4.1b Daya Bunuh Larutan Fenol, Kaporit, Hidrogen Peroksida (H 2O2), dan Pereaksi Fenton (H2O2/Fe2+) Dalam Berbagai Konsentrasi Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus Sampel
Fenol
Kaporit
H2O2 H2O2/Fe2+
Waktu (menit) 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15
Kode
Tabung
a
b
c
d
e
f
g
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
-/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
Kontrol -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+
Keterangan : Masing-masing uji dilakukan sebanyak 3 kali. Volume sampel dan kontrol yang ditambahkan masing-masing 4,5 mL. Inkubasi masing-masing dilakukan selama 48 jam pada suhu 37 oC. + : keruh (ada kehidupan bakteri) : jernih (tidak ada kehidupan bakteri) a : konsentrasi 0,2% b : konsentrasi 0,1% c : konsentrasi 0,05%, khusus untuk fenol 0,067% d : konsentrasi 0,025%, khusus untuk fenol 0,05% e : konsentrasi 0,0125%, khusus untuk fenol 0,033% f : konsentrasi 0,00833%, khusus untuk fenol 0,025% g : konsentrasi 0,00625%, khusus untuk fenol 0,020% kontrol : hanya berisi akuades steril
Koef fenol
31
4.4.2
Penentuan efektivitas disinfektan Efektivitas
masing-masing
disinfektan
ditentukan
dengan
cara
membandingkan daya bunuh bahan disinfektan pada pengenceran tertinggi yang mematikan bakteri pada waktu 10 menit tetapi tidak mematikan bakteri pada waktu 5 menit. Selanjutnya dilakukan penentuan pH dengan alat pHmeter pHep HI 96107 Pocket-Sized Hanna Instruments, jumlah oksigen terlarut (DO = Dissolved Oxygen) dan suhu dengan alat Digital Oxygen Meter DO-5510 Lutron, serta kalkulasi harga masing-masing larutan disinfektan. Disinfektan yang paling efektif adalah yang memiliki daya bunuh bakteri (koefisien fenol) paling tinggi, pH paling dekat dengan 7, DO paling tinggi, suhu paling dekat dengan suhu sekitar, dan harganya paling murah. 4.4.3 Prinsip kerja alat pHmeter Pada prinsipnya pengukuran pH dengan alat pH meter adalah didasarkan pada potensial elektro kimia yang terjadi antara larutan yang terdapat di dalam elektroda gelas yang telah diketahui dengan larutan yang terdapat di luar elektroda gelas yang tidak diketahui. Hal ini dikarenakan lapisan tipis dari gelembung kaca akan berinteraksi dengan ion hidrogen yang ukurannya relatif kecil dan aktif. Elektroda gelas tersebut akan mengukur potensial elektrokimia dari ion hidrogen atau diistilahkan dengan potential of hidrogen. Untuk melengkapi sirkuit elektrik dibutuhkan suatu elektroda pembanding. Sebagai catatan, alat tersebut tidak mengukur arus tetapi hanya mengukur tegangan. Elektroda pH meter akan mengukur potensial listrik antara raksa(II) klorida (HgCl2) pada elektroda
32
pembanding dan kalium klorida (KCl) yang merupakan larutan di dalam gelas elektroda serta potensial antara larutan dan elektroda perak. Tetapi potensial antara sampel yang tidak diketahui dengan elektroda gelas dapat berubah tergantung sampelnya. Oleh karena itu, perlu dilakukan kalibrasi dengan menggunakan larutan yang ekivalen lainnya untuk menetapkan nilai pH. 4.4.4 Prinsip kerja alat DOmeter Prinsip kerja alat DO meter adalah menggunakan elektroda atau probe yang terdiri dari katoda perak (Ag) dan Anoda timbal (Pb) yang direndam dalam larutan elektrolit. Secara keseluruhan elektroda ini dilapisi dengan membran plastik yang bersifat semipermiabel terhadap oksigen. Reaksi kimia yang terjadi adalah : Katoda :
O2 + 2 H2O + 4 e-
4 OH-
Anoda :
2 Pb + 4 OH-
2 PbO + 2 H2O + 4 e-
Aliran reaksi yang terjadi tergantung pada aliran oksigen di katoda. Difusi oksigen dari sampel ke elektroda berbanding lurus terhadap konsentrasi oksigen terlarut.
4.5
Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan metode analisis varians (ANOVA)
dua arah tanpa interaksi pada tingkat kesalahan 0,01 untuk mengetahui kadar optimal dan efektivitas masing-masing bahan disinfektan.
