BAB II MATERI DAN METODE PENELITIAN
2.1. Materi Penelitian 2.1.1. Lokasi Sampling dan Waktu Penelitian Dalam penelitian ini sampel diambil dari lokasi-lokasi sebagai berikut: 1. Rumah Pemotongan Hewan Pesanggaran 2. Pasar-pasar Kota Madya Denpasar a. Pasar Badung b. Pasar Kreneng Penelitian ini dilakukan selama lima minggu yaitu dari tanggal 23 Mei 2011 sampai 24 Juni 2011 dan pemeriksaan secara mikrobiologis dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
2.1.2. Bahan Habis Bahan dasar yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi yang diambil dari Rumah Pemotongan Hewan Pesanggaran dan beberapa pasar Kota Madya Denpasar. Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pengujian sampel tersebut:
Lactose Broth dari Merck dengan Cat. No. 7661, Brilliant-Green 2%-Bile Broth dari Merck dengan Cat. No. 5454, Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) dari Merck dengan Cat No.1347, pewarnaan Gram 1 set (gentian kristal violet, lugol, alkohol 96% dan air fuchsin).
Plate Count Agar (PCA) dari Merck dengan Cat No. 5463, Ox Bile dari Merck dengan Cat. No. 3756, Salmonella Shigella Agar dari Merck dengan Cat. No. 7667, Media uji biokimia (MR-VP Broth (Methyl-Red Voges Proskauer) dari Merck dengan Cat No.5712, Simon’s Citrate dari Merck dengan Cat No.2501, Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dari Merck dengan Cat No.3915, Sulfat Indol Motility (SIM) dari Merck dengan Cat No. 5470).
2.1.3. Persiapan Media Penelitian 2.1.3.1. Plate Count Agar (PCA) Untuk membuat satu liter media sebanyak 23,5 gram campuran media dilarutkan dalam aquadest sehingga didapat volume akhir 1000 ml. Campuran ini kemudian dipanaskan sampai komponennya larut dan selanjutnya dilakukan sterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit. Sebelum dituang secara aseptik ke dalam cawan petri, medium yang sudah steril ditempatkan pada suhu kamar sampai suhunya ± 40o C. Media ini digunakan untuk menumbuhkan berbagai macam bakteri, sehingga dapat ditentukan jumlah total sel bakteri yang terkandung dalam setiap gram sampel (Dwijoseputro, 1998).
2.1.3.2. Lactose Broth (LB) Double Strength Satu liter media dibuat dengan cara melarutkan 26 gram Lactose Broth dalam aquadest sehingga volume mencapai 1000 ml. Campuran ini dipanaskan sampai semua komponennya larut, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik, disterilisasi
menggunakan
Autoclave pada temperatur 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit, dan disimpan pada temperatur 4oC sampai diperlukan (Diliello, 2002).
2.1.3.3. Lactose Broth (LB) Single Strength Sebanyak 13 gram Lactose Broth digunakan untuk membuat satu liter media dengan cara melarutkan dalam aquadest sehingga mencapai volume 1000 ml. Campuran ini dipanaskan sampai semua komponennya larut, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik, disterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit, dan disimpan pada temperatur 4oC sampai diperlukan (Diliello, 2002).
2.1.3.4. Briliant Green Lactose Bile 2% Broth (BGLBB) Campuran
40
gram
BGLBB
dilarutkan
dalam
aquadest
untuk
mendapatkan satu liter media Briliant Green Lactose Bile 2% Broth (BGLBB) sehingga mencapai volume 1000 ml. Selanjutnya campuran ini dipanaskan sampai semua komponennya larut, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik, disterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit, dan disimpan pada temperatur 4oC sampai diperlukan (Diliello, 2002).
2.1.3.5. Eosin Methylene Blue (EMB) Agar Diperlukan 36 gram media EMB Agar untuk membuat satu liter media dengan cara melarutkan dalam aquadest sehingga didapat volume akhir 1000 ml. Kemudian media dipanaskan sampai semua komponennya larut, disterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit, dan dituangkan ke dalam cawan petri steril dan selama pengerjaannya dilakukan secara aseptik untuk mencegah terjadinya kontaminasi (Diliello, 2002).
2.1.3.6. Ox Bile/ Salt Bile Sebanyak 100 ml media dibuat dengan cara menimbang 1 gram media Nutrient Broth, ditambahkan media Ox Bile/ Salt Bile sebanyak 0,5 gram kemudian dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest, di panaskan sampai mendidih sehingga bahan-bahannya bercampur dengan rata, didinginkan, ditambahkan 0,5 gliserol, dimasukkan ke dalam pial sebanyak ± 20 ml, dan diautoclave pada temperatur 121oC tekanan 15 atm selama 15 menit (Ahmad, 2008).
2.1.3.7. Salmonella Shigella Agar Satu liter media dibuat dengan cara penambahan 63 gram campuran media selanjutnya, dilarutkan dalam aquadest sehingga mencapai volume 1000 ml. Media di panaskan sampai mendidih sehingga bahan-bahannya bercampur dengan rata, didinginkan sampai suhu larutan mencapai 50oC dan dituang ke dalam cawan
petri steril. Media ini merupakan media selektif yang digunakan untuk mengisolasi Salmonella (Ahmad, 2008). 2.1.3.8. Simmon’s Citrate Agar Diperlukan 23 gram campuran media untuk menghasilkan satu liter media Simmon’s Citrate Agar. Media dilarutkan dalam aquadest sehingga mencapai volume 1000 ml, dipanaskan sampai mendidih, disterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC tekanan 15 atm selama 15 menit, dan dimasukan ke dalam tabung reaksi. Media ini digunakan untuk mengetahui salah satu sifat biokimia Salmonella berdasarkan penggunaan sitrat sebagai sumber karbon (Anonim, 2008).
2.1.3.9. Sulfat Indol MotilityAgar Satu liter media dibuat dengan campuran 30 gram media dan dilarutkan dalam aquadest sehingga mencapai volume 1000 ml, dipanaskan sehingga semua komponennya larut, disterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC tekanan 15 atm selama 15 menit, dan dimasukan ke dalam tabung reaksi. Media ini digunakan untuk mengetahui sifat biokimia Salmonella berdasarkan produksi sulfat, indol dan pergerakannya (Anonim, 2008).
2.1.3.10. Triple Sugar Iron Agar Media Triple Sugar Iron Agar dibuat dengan cara melarutkan 65 gram campuran media dalam aquadest sehingga mencapai volume 1000 ml, dipanaskan sampai mendidih kemudian, di sterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC tekanan 15 atm selama 15 menit, dan dimasukan ke dalam tabung reaksi. Media ini digunakan untuk mengetahui salah satu sifat bakteri Salmonella berdasarkan produksi hidrogen sulfatnya (Anonim, 2008).
2.1.3.11. Methyl Red - Voges Proskauer Methyl Red - Voges Proskauer (MR-VP) dibuat dengan cara melarutkan 17 gram campuran media dalam aquadest sehingga mencapai volume 1000 ml,
dipanaskan sampai mendidih kemudian, disterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC tekanan 15 atm selama 15 menit, dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi (Anonim, 2008). Methyl Red digunakan untuk identifikasi organisme berbentuk Gram negatif, sedangkan Voges Proskauer merupakan tes spesifik untuk intermediasi metabolik yang dihasilkan ketika gula difermentasikan untuk menghasilkan butylenes glycol sebagai tambahan untuk asam (Ahmad, 2008).
2.1.4. Alat Penelitian Autoklaf, lemari es, timbangan, kompor, botol steril, Erlenmeyer, gelas beker, pipet, termos es, tabung tutup ulir dengan panjang 15 cm, rak tabung reaksi, cawan petri, ose bulat, ose jarum, pipet tetes, lampu spiritus, batang pengaduk, blue tipe, mikropipet dengan ukuran 500-1000 l, gunting anatomis, pinset, tisu, aluminium, vortex dan kapas. Sterilisasi alat dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit, sedangkan untuk alatalat yang tidak tahan panas disterilkan dengan alkohol 70%.
2.1.5. Reagensia Penelitian ini menggunakan reagensia NaCl 0,9% untuk mengencerkan sampel. Larutan NaCl 0,9% ini dibuat dengan cara melarutkan 0,9 gram NaCl dalam aquadest sampai volumenya mencapai 100 ml. Selanjutnya dilakukan sterilisasi menggunakan Autoclave pada temperatur 121oC tekanan 15 atm selama 15 menit (Anonim, 2010b).
2.2. Metode Penelitian 2.2.1. Pengambilan Sampel Sebanyak 250 gram sampel di ambil secara acak dari dua pedagang pada setiap tempat. Pengambilan sampel dilakukan pada minggu I, II, III, IV, dan V dengan cara memasukkan sampel ke dalam kantong plastik steril, kemudian dimasukkan ke dalam termos es dan selanjutnya di bawa ke laboratorium untuk diperiksa secara mikrobiologi. Pengambilan sampel dilakukan pada pagi hari
pukul 02.00 WITA dari Rumah Pemotongan Hewan Pesanggaran, dan pukul 04.00 WITA dari Pasar Badung dan Pasar Kreneng. Uji Mikrobiologi untuk setiap sampel dilakukan sebanyak tiga kali.
2.2.2. Prosedur Pemeriksaan Dalam pengujian di laboratorium, parameter yang diamati adalah total bakteri, kehadiran bakteri golongan Coliform dan Coli fecal (Escherichia coli) dan kehadiran Salmonella sp. pada sampel.
2.2.2.1. Penentuan Total Koloni Total Plate Count (TPC) adalah untuk menunjukkan jumlah mikroba yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri yang ditumbuhkan pada media agar. Untuk menghitung koloni bakteri pada sampel ditentukan dengan metode TPC (Fardiaz, 1989). Sampel daging ditimbang sebanyak 10 gram, dipotong kecil-kecil secara aseptik, dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi 90 ml larutan NaCl 0,9% steril dan dikocok sampai homogen untuk mendapatkan nilai pengenceran sebesar 10-1. Selanjutnya, sampel diencerkan lagi 10 kali dengan cara mengambil 1 ml sampel dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan NaCl 0,9%, sehingga diperoleh nilai pengenceran 10-2. Pengenceran dilanjutkan dengan cara yang sama sampai diperoleh nilai pengenceran 10-6. Kemudian sebanyak 1 ml dari hasil pengenceran 10-1 sampai 10-5 dimasukan ke dalam cawan petri yang telah dibuat tanda 10-1 sampai 10-5, dituang dengan media PCA sebanyak ±20 ml yang bersuhu 45ºC dan diinkubasi selama 18-24 jam dalam keadaan terbalik. Penghitungan dilakukan pada cawan petri yang ditumbuhi antara 25-250 koloni. Dalam penelitian ini juga dihitung jumlah koloni pada cawan petri kontrol media dan kontrol air pengencer. Jumlah koloni pada masing-masing cawan petri terlebih dahulu dikurangi dengan jumlah koloni pada petri dish kontrol. Total koloni pada masing-masing petri dish setelah dikurangi koloni pada kontrol dikalikan dengan faktor pengencer untuk mendapatkan total mikroba dalam 1 gram daging sapi.
2.2.2.2. Penentuan Kandungan Coliform Sampel yang berupa daging ditimbang sebanyak 10 gram, dimasukkan ke dalam 40 ml larutan NaCl 0,9% dan dikocok sampai homogen. Selanjutnya di ambil 10 ml, dimasukkan kedalam 90 ml larutan NaCl 0,9% dan dikocok sampai homogen. Bahan yang telah diencerkan ini siap dikerjakan dengan menggunakan Metode MPN (Most Probable Number) yang terdiri atas beberapa tahap pengerjaan yaitu uji praduga (Presumtive Test) dilanjutkan dengan uji penguat (Confirmation Test) dan uji pelengkap (Completed Test). Nilai MPN penguat dapat dilihat pada tabel MPN berdasarkan jumlah tabung positif yang telah dihasilkan dari test penguat (Confirmation Test).
a. Uji Praduga Coliform (Presumtive Test) Pengujian ini dilakukan dengan cara menggunakan 3 seri tabung yang berisi Summary Double Strength yang dilengkapi dengan tabung Durham dalam keadaan terbalik. Tiga tabung pertama diinokulasi dengan 10 ml sampel, tiga tabung kedua diinokulasi dengan 1 ml sampel dan tiga tabung ketiga diinokulasi dengan 0,1 ml sampel. Semua tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Karena bakteri golongan Coliform dan Escherichia coli mempunyai kemampuan memfermentasi media lactose broth pada suhu tersebut dalam waktu 2 x 24 jam, maka jika dalam waktu tersebut terlihat adanya gas dalam tabung durham, tes ini dinyatakan positif (diperkirakan ada bakteri golongan Coliform/ Escherichia coli) (Fardiaz, 1993).
b. Uji Penguat Coliform (Confirmation Test) Tes ini menggunakan media Briliant Green Lactose Bile Broth (BGLB). Disediakan tabung berisi media BGLB yang jumlahnya sesuai dengan jumlah tabung media lactose broth yang menunjukan hasil positif. Dari masing-masing tabung media lactose broth yang positif diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam masing-masing media BGLB yang sesuai dengan desimalnya. Selanjutnya diinkubasi dalam suhu 35-37oC. Tabung BGLB yang positif yaitu menunjukkan adanya gas pada tabung durham, dicatat untuk dicocokkan dengan menggunakan
tabel Most Probable Number (MPN) (Fardiaz, 1993).
Hasil yang diperoleh
selanjutnya dikalikan dengan seri pengenceran.
c. Uji Pelengkap Coliform (Completed Test) Masing-masing tabung BGLB yang positif diambil satu ose ditanam ke dalam cawan petri yang berisi media EMB Agar. Uji pelengkap Coliform bertujuan untuk melihat apakah isolat yang diambil benar merupakan bakteri Coliform. Dari pertumbuhan koloni pada cawan yang berisi EMB Agar, dipilih masing-masing satu koloni yang mewakili Coli fekal dan satu koloni yang mewakili Coli non fekal. Dari masing-masing koloni tersebut dibuat pewarnaan Gram dengan hasil bakteri berbentuk batang bersifat Gram negatif (Fardiaz, 1993).
2.2.2.3. Pemeriksaan Bakteri Salmonella sp. Pemeriksaan bakteri Salmonella sp., diawali dengan memotong daging kecil-kecil kemudian di masukkan ke dalam media Ox Bile ±20 ml dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 36-37oC. Selanjutnya dengan menggunakan jarum steril diambil satu ose dari biakan Ox Bile, ditanam pada media selektif Salmonella Shigella Agar dengan cara streak dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Koloni tersangka yang tumbuh tersebut diuji dengan uji biokimia yaitu uji TSI Agar, uji SIM medium, Uji Simon’s Citrat, dan Uji MRVP.
a. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSI) Uji TSI dilakukan untuk mengetahui terbentuknya H2S hasil metabolisme bakteri yang ditumbuhkan dalam media TSI. Pengujian ini dilakukan dengan cara mengambil koloni dari media selektif dengan menggunakan jarum ose kemudian ditusukkan pada bagian tengah media sampai menyentuh bagian dasar media. Kemudian jarum ose diangkat dan digoreskan pada permukaan agar miring media, diinkubasi selama 18-24 jam pada temperatur 37oC. Hasil positif ditunjukkan
perubahan warna dari orange kemerahan menjadi kuning dan terjadi warna hitam pada media, sedangkan hasil negatif jika tidak terjadi perubahan warna baik pada bagian miring atau pada bagian bawah media (Mulyadi et al., 2011).
b. Uji Sulfat Indol MotilityAgar (SIM) Uji SIM dilakukan untuk mengetahui pergerakan (motilitas) serta produksi indol dari bakteri uji. Uji motilitas bakteri dilakukan dengan cara mengambil koloni dari media selektif dengan menggunakan jarum ose kemudian ditusukkan pada bagian tengah media sedalam ¾ bagian media. Kemudian biakan tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Hasil pengujian motilitas bakteri dikatakan negatif (bakteri tersebut tidak motil / tidak melakukan pergerakan), bila pada bagian kiri dan kanan daerah bekas tusukan jarum ose tidak terdapat bentukan serupa akar dan dikatakan positif (bakteri tersebut motil/melakukan pergerakan) bila pada bagian kiri dan kanan daerah bekas tusukan jarum ose terdapat bentukan serupa akar. Hasil uji indol, dikatakan negatif apabila tidak terjadi perubahan warna pada bagian permukaan media dan dikatakan positif apabila terjadi perubahan warna dari bening muda menjadi merah pada bagian permukaan media dan berbentuk cincin (Mulyadi et al., 2011). c. Uji Simon’s Citrat (SC) Uji Simon’s Citrat digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri uji dalam menggunakan citrat sebagai sumber karbon. Pengujian ini diawali dengan mengambil koloni dari media selektif dengan menggunakan jarum ose kemudian digoreskan pada permukaan miring media Agar Simon’s Citrat. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Hasil pengujian dikatakan positif bila terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru, dan negatif bila tidak terjadi perubahan warna pada media (Mulyadi et al., 2011).
d. Uji Methyl Red - Voges Proskauer (MR-VP) Pengujian ini diawali dengan mengambil koloni dari media selektif dengan menggunakan jarum ose kemudian dilarutkan pada permukaan media. Uji Methyl
Red dilakukan dengan meneteskan pH indikator Methyl Red untuk mengetahui konsentrasi asam yang dihasilkan. Tes positif akan merubah warna media dari kuning menjadi merah dan tes negatif tidak terjadi perubahan warna pada media. Sedangkan voges proskauer bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri uji membentuk asetil metil karbinol yang akan teroksidasi menjadi diasetil. Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna merah pada permukaan media setelah ditetesi 2-3 tetes larutan KOH 40% dan 5% alfa naftol. Tes negatif tidak terjadi perubahan warna pada media (Mulyadi et al., 2011).
2.3. Analisis Data Data yang diperoleh berupa data kuantitatif dan selanjutnya diolah secara deskritif kualitatif. Data yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan Batas Maksimum Cemaran Mikroba Dalam Makanan sesuai dengan STANDAR NASIONAL INDONESIA (SNI.: 01-6366-2000) (Tabel 1).
