BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

85

BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN

4.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian yang telah dilakukan mulai bulan April 2010 hingga bulan Oktober 2011 di Surabaya. Beberapa tempat yang dipergunakan

pada

saat

pelaksanaan

penelitian

adalah:

Laboratorium

Bioteknologi, Laboratorium Sumber Daya Alam, Kebun Percobaan dan Rumah Kaca Fakultas Pertanian UPN “Veteran” Jatim di Surabaya, serta Laboratorium Kimia Tanah Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya, Malang.

4.2. Kerangka Operasional Penelitian Rangkaian penelitian dalam rangka penyusunan disertasi ini, dilakukan dalam lima tahap penelitian, yaitu (1) Penelitian I, merupakan penelitian untuk memilih (screening) tanaman model yang akan diteliti selanjutnya, (2) Penelitian II, adalah penelitian terhadap tanaman model hasil seleksi pada Penelitian I, dilakukan di dalam kebun percobaan dengan bahan tanaman berupa bibit, (3) Penelitian III, adalah penelitian terhadap tanaman model yang dilakukan di dalam laboratorium dengan menggunakan teknik kultur jaringan tanaman (in vitro), (4) Penelitian IV, adalah penelitian terhadap tanaman model (puring) dengan paparan gas SO2 dosis tinggi, dan (5) Penelitian V, merupakan kajian hubungan antara indeks toleransi tanaman terhadap pencemaran udara dengan potensi fitoremediasi tanaman terhadap bahan pencemar udara. Kelima tahapan penelitian tersebut tertuang dalam kerangka operasional penelitian (Gambar 4.1).

Desertasi

GLUTATION DAN APTI SEBAGAI .....

PANGESTI NUGRAHANI


86

Penelitian 1: Identifikasi toleransi tanaman terhadap pencemaran udara berdasarkan APTI

Tanaman model

Penelitian 2: Pengaruh SO2 pada beberapa parameter biokimia tanaman model

Penelitian 3: Pengaruh SO2 pada beberapa parameter biokimia tanaman model secara kultur jaringan in vitro

Paparan SO2 dengan beberapa level dosis

Penelitian 4: Pengaruh SO2 pada beberapa parameter biokimia tanaman bibit, tanaman model

Tanaman Tanaman Model Model

Pengukuran :  kadar klorofil  kadar asam askorbat  kadar air  pH  kadar glutation  kadar S  kerusakan daun

Penelitian 5 : Kajian APTI sebagai indikator potensi fitoremediasi pencemaran SO2

Nilai APTI

Serapan SO2

Kadar Glutation

Formula APTI Baru

Gambar 4.1 Kerangka Operasional Penelitian

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


87

4.3 Variabel penelitian Variabel penelitian terdiri dari variabel bebas dan variabel terikat. Variabel setiap penelitian seperti dicantumkan pada Tabel 4.1, sedangkan definisi operasional masing-masing variabel, dijelaskan dalam Tabel 4.2. Tabel 4.1 Variabel Bebas Terikat

Variabel penelitian

Penelitian: 1

Penelitian: 2

Penelitian: 3

(a) Spesies tanaman 1

(a) spesies tanaman 2

(a) durasi

(a) (b) (c) (d) (e)

(b) konsentrasi (a) asam askobat (b) klorofil total (c) pH (d) kadar air (e) APTI

asam askorbat klorofil total pH kadar air APTI

(a) (b) (c) (d) (e)

asam askobat klorofil total pH kadar air APTI

(f) glutation (GSH)

4.4.

Penelitian: 4 (a) konsentrasi dalam durasi (a) (b) (c) (d) (e) (f)

asam askobat klorofil total pH kadar air APTI glutation (GSH) (g) Leaf Injury Index (LII) (h) Kadar S

Analisis data Analisis data dilakukan dengan analisis statistika meliputi uji normalitas

data dengan uji Kolmogorov-Sminorv dan uji homogenitas varians dengan uji Levene pada level α=0,05. Jika varian tidak homogen, dilakukan uji Robust Tests of Equality of Means dari Brown-Forsythe. Apabila uji Brown-Forsythe menunjukkan ada perbedaan signifikan diantara kelompok perlakuan (sig < 0,05), maka dilanjutkan dengan uji Games-Howell untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda. Bila uji homogenitas varian terpenuhi, dilakukan analisis ANOVA satu arah yang dilanjutkan dengan uji Beda Tukey pada level α=0,05 (Santoso, 2002). Selain itu dilakukan juga analisis korelasi untuk mengetahui tingkat keeratan hubungan antara APTI dengan kadar S, antara APTI dengan kadar glutation, dan antara kadar S dengan kadar glutation dalam daun.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


88

Tabel 4.2

Desertasi

Definisi operasional variabel

No.

Variabel

Deskripsi / definisi operasional

1.

Spesies tanaman 1

Jenis tanaman sebagai sampel dalam penelitian 1, yang ditetapkan secara sengaja (purposively sampling), sebanyak 10 spesies tanaman

2.

Spesies tanaman 2

Jenis tanaman yang dipergunakan dalam penelitian 2, yang ditetapkan berdasarkan hasil penelitian 1, yaitu T1: nusa indah dan T2: puring

3.

Konsentrasi gas SO2

Volume gas SO2 yang dimasukkan ke dalam ruang sungkup per satuan volume ruang sungkup (dinyatakan dalam ppm), terdiri dari K0: kontrol, K1= 0,1 ppm, K2=1,0 ppm, dan K3= 10 ppm

4.

Durasi paparan gas SO2

Lamanya gas SO2 berada di dalam botol kultur, (dinyatakan dalam jam). Terdiri dari P0: kontrol, P1= 1x24 jam, P2=2x 24 jam dan P5= 5x24 jam

5.

Konsentrasi gas SO2 dalam durasi paparan

Volume gas SO2 per satuan volume ruang (dinyatakan dalam ppm), selama durasi tertentu tanaman berada di dalam chamber, (dinyatakan dalam menit). Terdiri dari P0: kontrol, P1= 50 ppm selama 30‟,P2=50 ppm selama 60‟, P3= 100 ppm selama 30‟ dan P4: 100 ppm selama 60‟

6.

Kadar asam askobat

Kandungan asam askorbat dalam daun, dinyatakan dalam mili gram per gram sampel daun segar, yang diukur berdasarkan metode titrimetri DCPIP

7.

Klorofil total

Kandungan total klorofil a dan klorofil b dalam daun dinyatakan dalam mili gram per gram sampel daun segar, yang diukur menggunakan spektrometer berdasarkan metode Arnon

8.

pH

Derajat keasaman filtrat daun, yang diukur dengan menggunakan pH meter

9.

Kadar air

Berat air dalam daun per berat sampel daun segar yang diukur berdasarkan metode gravimetri dan dinyatakan dalam persen

10.

APTI

Angka indeks toleransi tanaman terhadap pencemaran udara, yaitu angka yang dihitung dengan persamaan APTI=[A(T+P) + R] / 10, dimana A: kadar asam askorbat, T: kadar klorofil, P: pH, dan R: kadar air

11.

Kadar glutation (GSH)

Kandungan glutation dalam daun dinyatakan dalam mikro gram per gram sampel daun segar, yang diukur dengan menggunakan metode Elman

12.

Leaf Injury Index (LII)

Angka indeks kerusakan daun, yaitu angka yang menyatakan luas daun yang rusak (nekrosis) dibandingkan dengan luas seluruh daun, yang ditentukan berdasarkan perkalian antara skor kerusakan daun dengan persentase kerusakan terhadap luas daun. Skor kerusakan daun mengikuti tetapan Pitcher.


PANGESTI NUGRAHANI


89

4.5 Pelaksanaan Penelitian 4.5.1 Penelitian 1:

Identifikasi toleransi tanaman terhadap pencemaran udara berdasarkan angka APTI

Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh tanaman model yang toleran dan tanaman yang sensitif terhadap paparan gas SO2. Penelitian ini dilaksanakan selama tiga bulan mulai bulan April 2010 hingga bulan Juni 2010.

Lokasi

penelitian adalah di tiga ruas jalan utama kota Surabaya, yaitu Jalan Raya Darmo, Jalan Raya Kendangsari dan Jalan Kertajaya. Analisis terhadap daun tanaman dilakukan di laboratorium Bioteknologi Tanaman,

Fakultas Pertanian UPN

“Veteran” Surabaya. Penelitian I ini merupakan penelitian observasi analitis dengan menggunakan metode cross sectional, terhadap parameter penyusun APTI (kadar klorofil, kadar asam askorbat, kadar air dan pH daun) yang terdapat pada sampel penelitian. (1)

Bahan dan alat penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan tanaman, dan

bahan kimia. Bahan tanaman berupa daun segar dari 10 spesies tanaman semak hias (Tabel 4.3 dan Gambar 4.2).

Bahan kimia yang dipergunakan untuk

penelitian ini, dipergunakan dalam analisis klorofil dan asam askorbat daun, yaitu: Aceton 80%, larutan 2,4-dichlorophenol indophenol (DCPIP) 0,1% (Merck®), dan aquadestilata. Peralatan yang digunakan adalah peralatan untuk analisis daun, terdiri dari spectrophotometer (Cole Pomer® 1100 RS), sentrifuge (Hettich® EBA 8), pH meter (Bantex®), timbangan digital (Sentra® EL 4105), oven, mortal, blender, peralatan gelas, mikro pipet, dan peralatan tulis.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


90

(2) Populasi dan sampel penelitian Populasi dalam penelitian ini adalah tanaman semak hias yang ditanam pada taman jalur hijau jalan di tiga ruas jalan utama kota Surabaya, yaitu Jalan Raya Darmo, Jalan Raya Kendangsari dan Jalan Kertajaya. Sampel penelitian ini adalah 10 spesies tanaman lanskap jenis semak hias (Tabel 4.3 dan Gambar 4.2). Prosedur pemilihan sampel spesies tanaman dari populasi dilakukan secara sengaja (purposive sampling), dengan kriteria pemilihan tanaman sebagai berikut : a. tanaman elemen lanskap yang ada pada site / tapak b. tanaman semak hias yang memiliki unsur estetika sebagai elemen lanskap c. tanaman cukup dominan pada tapak dan dikenal masyarakat Tabel 4.3 Spesies tanaman yang diteliti No.

Nama Tanaman

Nama Latin

Famili

1.

Batavia

Jathropa pandurifolia

Euphorbiaceae

2.

Bugenvil

Bougenvillea speciosa

Nygtaginaceae

3.

Hanjuang

Cordyline terminalis discolor

Agavacea

4.

Kana

Canna sp.

Cannacea

5.

Kembang sepatu

Hibiscus rosa-sinensis

Malvaceae

6.

Nusa Indah

Mussaendah philipica

Rubiaceae

7.

Puring

Codiaeum variegatum

Euphorbiaceae

8.

Sansivera

Sansiveira trifasciata

Agavaceae

9.

Soka

Ixora sinensis

Rubiaceae

10.

Ubi hias

Ipomoea batatas

Convolvulaceae

Sampel daun dari setiap spesies tanaman diambil secara acak sebanyak 10 gram dari setiap lokasi penelitian, dengan tiga kali ulangan.

Daun yang

diambil sebagai sampel adalah daun sehat, segar dan dewasa.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


91

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 0

Gambar 4.2.

Spesies tanaman yang diteliti: (1) Batavia, (2) Bugenvil, (3) Hanjuang, (4) Kana, (5) Kembang sepatu, (6) Nusa Indah (7) Puring, (8) Sansivera, (9) Soka, (10) Ubi hias

(3)

Prosedur pengambilan data Pelaksanaan penelitian dimulai dengan pengambilan sampel daun di

lokasi penelitian yang telah ditentukan.

Daun segar selanjutnya dibawa ke

laboratorium untuk dilakukan analisis, guna mendapatkan data yang diperlukan. Data yang diperlukan untuk menetapkan APTI tanaman adalah data kandungan asam askorbat daun, klorofil total daun, pH daun dan kadar air daun. Untuk memperoleh data tersebut dilakukan pengukuran terhadap masing-masing sampel daun seperti pada Gambar 4.3. Asam askorbat (A)

Filtrat daun Tanaman sampel

pH (P) Daun segar

Gambar 4.3.

Desertasi

Klorofil total (T) APTI= [A(T+P)+R]/10

Kadar air (R)

Skema perhitungan nilai APTI


PANGESTI NUGRAHANI


92

a. Pengukuran asam askorbat Kadar asam askorbat dalam daun diukur dengan metode DCPIP (SAPS, 2000).

Sebanyak 10 gram daun dihancurkan dengan blender dalam 50 mL

aquadest, disaring dan filtrat disentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 2.000 rpm, hingga jernih. Diambil masing-masing 1 mL filtrat, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya dititrasi, dengan larutan DCPIP (2,6 - Dichlorophenol indophenol) 0,1% (kemurnian 97%), menggunakan mikropipet 10 µL. Titrasi dihentikan bila filtrat berubah warna menjadi biru, dan dicatat jumLah mL DCPIP. Kandungan askorbat dalam daun ditentukan dengan perhitungan bahwa 1 mL larutan 0,1% DCPIP (MWt 290,08) setara dengan 6,071x10 -4 g asam askorbat (MWt 176,12), sehingga banyaknya (mg) asam askorbat per gram sampel adalah: mL DCPIP x 6,071x10−4 x vol. filtrat x 1000 𝐴= berat bahan (g) b. Pengukuran klorofil total Klorofil total daun diukur dengan menggunakan spectrofotometer berdasarkan metode Arnon yang dilakukan oleh Liu dan Ding (2007), Das dan Prasad (2010). Sebanyak 0,5 gram daun dihancurkan dengan mortar dalam 10 mL aquadestilata, dan disaring dengan saringan stainless steel. Dipipet 2,5 mL dari larutan tersebut, ditambahkan 10 mL Aceton 80%, kemudian disentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 2.000 rpm. Selanjutnya dilakukan pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 645 nm dan 663 nm. Kadar klorofil total (T) dalam mg/g dihitung berdasarkan persamaan: T = 0,1

bb 20,8 D663 + 8,02 D645 bk

bb/bk adalah perbandingan antara berat basah dan berat kering bahan (daun).

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


93

c. Pengukuran pH daun Filtrat daun dibuat dengan cara menimbang 4 gram daun segar, dihancurkan dalam 40 mL aquadest dengan menggunakan blender, disaring dan disentrifuge pada kecepatan 2.000 rpm selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan pengukuran pH terhadap filtrat daun dengan menggunakan pH meter yang telah dikalibrasi dengan buffer pH 7 (Apriantono et al., 1989).

Pengukuran pH

dilakukan tiga kali untuk tiap sampel daun, sebagai pengulangan. d. Pengukuran kadar air daun Kadar air daun dihitung berdasarkan metode gravimetri (Balittanah, 2005) dengan persamaan: Kadar air (%) = (bb – bk) / bb x 100. Dimana bb adalah berat basah, dan bk adalah berat kering sampel daun.

Sampel daun

dipanaskan pada suhu 105o C selama 4 jam untuk menghilangkan air. e. Penetapan nilai APTI Penetapan nilai APTI tanaman dilakukan setelah data asam askorbat, klorofil total, pH, dan kadar air diperoleh.

Nilai APTI dihitung berdasarkan

persamaan (Singh et al., 1991), yaitu: APTI= [A(T+P)+R]/10, dimana A = asam askorbat (mg/g), T = klorofil total (mg/g), P = pH dan R = kadar air (%).

4.5.2 Penelitian 2: Pengaruh SO2 pada beberapa parameter biokimia tanaman puring dan nusa indah (1) Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan tanaman, media tanam dan bahan kimia. Bahan tanaman berupa bibit tanaman puring (Codiaeum variegatum L.) dan tanaman nusa indah putih (Mussaenda phillipica var. Aurora).

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


94

Penetapan jenis tanaman model untuk penelitian ini berdasarkan hasil penelitian 1, yang menunjukkan bahwa tanaman puring memiliki nilai APTI tertinggi, sedangkan tanaman nusa indah memiliki nilai APTI terendah. Bahan kimia yang dipergunakan untuk penelitian adalah bahan kimia untuk pembuatan gas SO2 yaitu natrium metabisulfit (NaHSO3) dan larutan HCl 6 M. Bahan kimia lainnya dipergunakan dalam analisis klorofil dan analisis asam askorbat, seperti pada penelitian 1. Peralatan yang digunakan adalah peralatan tanam, peralatan gelas, peralatan tulis, spektrofotometer untuk pengukuran klorofil total, pH meter untuk mengukur pH filtrat daun, sentrifuge, timbangan digital, oven, dan pipet mikro 10 µL (Gambar 4.4). Peralatan yang dipergunakan untuk paparan gas adalah spuit (jarum suntik) volume 1 mL dan 50 mL, dan sungkup plastik dengan rangka kayu berukuran 1x1x1 m3. Sungkup dilengkapi dengan lubang tempat memasukkan gas, serta sebuah kipas angin untuk meratakan distribusi gas di dalam sungkup (a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 4.4 Peralatan analisis askorbat, klorofil dan ph: (a) sentrifuge, (b) pH meter, (c) pipet mikro, (d) spektrofotometer

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


95

(2) Rancangan penelitian Penelitian disusun dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial yang terdiri dari dua faktor. Faktor perlakuan I adalah konsentrasi gas SO 2 yang terdiri gas SO2 dengan level konsentrasi K0: 0,0 ppm (kontrol), K1: 0,1 ppm, K2: 1,0 ppm dan K3: 10 ppm. Faktor perlakuan II adalah jenis tanaman, terdiri dari T1: tanaman puring, dan T2: tanaman nusa indah. Dengan demikian ada 8 satuan perlakuan kombinasi, dan setiap satu satuan perlakuan kombinasi terdiri dari satu pot tanaman, yang berisi satu batang tanaman, dengan lima kali ulangan. (3) Persiapan tanaman Spesies tanaman yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah tanaman puring (Codiaeum variegatum L.)

dan nusa indah bunga putih (Mussaenda

philipica var. Aurora). Bibit tanaman berasal dari perbanyakan vegetatif cangkok, berumur 6 bulan, yang diperoleh dari penangkar tanaman hias di Tlekung, Malang.

Tanaman ditanam dalam pot plastik berdiameter 20 cm dengan media

tanam berupa campuran tanah taman dan kompos dengan perbandingan 1:1. Bibit tanaman diaklimatisasi selama satu bulan di dalam rumah kaca. Pemeliharaan tanaman selama penelitian dilakukan dengan penyiraman secara teratur setiap hari sekali pada pagi hari. (4) Preparasi dan pemaparan gas SO2 Gas SO2 dibuat dengan metode Alyea-Mattson (Mattson, 2005), dengan mereaksikan 0,3 g natrium metabisulfit (NaHSO3) dengan larutan 5 mL HCl 6 M di dalam ruang asam. Gas SO2 yang terbentuk ditampung dalam syringe (spuit) volume 60 mL (Gambar 4.5). Reaksi yang terjadi adalah: NaHSO3 (s) + HCl (aq)

Desertasi

SO2 (g) + NaCl (aq) + H2O (l)


PANGESTI NUGRAHANI


96

(a)

(b)

(c)

Gambar 4.5

Preparasi gas: (a) penimbangan bahan kimia, (b) mereaksikan bahan, (c) gas yang terbentuk ditampung dalam syringe

Selanjutnya gas dimasukkan ke dalam bilik plastik melalui lubang gas. Bilik plastik yang dipergunakan berukuran 1m3, dilengkapi dengan kipas angin untuk meratakan aliran gas (Gambar 4.6). Volume gas SO2 yang dimasukkan ke dalam bilik adalah 0,1 mL, 1,0 mL dan 10 mL,

sesuai dengan perlakuan.

Tanaman dipapar selama satu jam setiap dua hari sekali selama empat minggu. Pemaparan gas dilakukan pada pagi hari antara pukul 08.00 hingga pukul 09.00.

(6) Prosedur pengambilan data Pengambilan dan pengumpulan data dilakukan 24 jam setelah perlakuan terakhir. Daun tanaman dipetik dari tangkainya, dimasukkan ke dalam kantong plastik dan dibawa ke laboratorium untuk keperluan analisis. Prosedur analisis daun untuk memperoleh data asam askorbat, klorofil, pH dan kadar air daun, dilakukan seperti pada penelitian 1.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


97

(a)

(a)

(b)

Gambar 4.6 Paparan gas SO2 dalam bilik plastik: (a) bilik plastik; (b) memasukkan gas ke dalam bilik

4.5.3 Penelitian 3: Pengaruh SO2 pada beberapa parameter biokimia tanaman puring (Codiaeum variegatum L. ) kultur jaringan in vitro Penelitian 3 dilakukan terhadap tanaman puring sebagai tanaman model hasil penelitian 1. Penelitian dilakukan di dalam laboratorium kultur jaringan secara in vitro, mulai bulan Januari 2011 hingga bulan Oktober 2011. (1) Bahan dan Alat Penelitian Bahan tanam (eksplan) yang digunakan digunakan untuk kultur jaringan in vitro adalah tunas pucuk (shoot tip) tanaman puring berasal dari kebun koleksi Fakultas Pertanian UPN “Veteran” Surabaya (Gambar 4.7). Sterilisasi eksplan dilakukan dengan menggunakan larutan Tween-20,

Sublimat (HgCl2) 0,1%,

Alkohol 70%, larutan Clorox (Bayclin®) 5%, 20% dan 70%, larutan deterjen, larutan fungisida (Dithane®) dan bakterisida (Benlate®) 2 g/L air, Bethadine® serta aquadestilata steril.

Desertasi

Media tanam menggunakan media dasar Murashige dan


PANGESTI NUGRAHANI


98

Skoog (MS) yang diberi tambahan zat pengatur tumbuh (BA atau IBA, dan NAA), agar, dan gula pasir. Komposisi media MS dicantumkan pada Lampiran 1. Bahan kimia digunakan untuk analisis asam askorbat, dan klorofil seperti dalam penelitian 1.

Bahan lain adalah bahan kimia yang

digunakan untuk

analisis glutation (GSH) daun, yaitu alkohol 50%, Trichloro acetic acid (TCA), Ellman‟s reagent (5,5-Dithiobis 2-Nitrobenzoic Acid, DTNB Merck® 103291), buffer phosphat pH 8, dan larutan standar GSH (L-Glutation, Fluka® 49750). Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah peralatan kultur jaringan berupa Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, lampu bunsen, scapel, pinset, cawan petri, erlenmeyer dan botol kultur. Peralatan untuk keperluan analisis daun, sama dengan peralatan pada penelitian 1.

(2) Rancangan penelitian Penelitian ini disusun dalam Rancangan Acak Lengkap satu faktor, dengan lima kali ulangan, setiap ulangan terdiri dari lima botol kultur, dan setiap botol kultur berisi satu tanaman (plant-let). Faktor perlakuan adalah durasi (lamanya) gas SO2 berada di dalam botol kultur, terdiri dari P1: kontrol, P2: 1x24 jam, P3: 2x 24 jam, P4: 5x24 jam. Banyaknya gas SO2 yang dimasukkan ke dalam botol kultur adalah 0,01 mL. Volume botol kultur adalah 300 mL, sehingga konsentrasi gas SO2 di dalam botol kultur masing-masing adalah 330 ppm.

(3) Persiapan bahan kultur jaringan in vitro Bahan tanam (eksplan)

diambil dari tunas pucuk (shoot tip) tanaman

puring sepanjang 2 cm dengan 2-3 ruas daun.

Desertasi


Sterilisasi eksplan dilakukan

PANGESTI NUGRAHANI


99

mengikuti prosedur Nasib et al. (2008) dan Bhot et al. (2010) yang dimodifikasi berdasarkan beberapa kali percobaan pendahuluan. Sterilisasi permukaan dimulai dengan pencucian bahan tanam dengan menggunakan larutan deterjen, dilanjutkan dengan pencucian pada air mengalir selama 30 menit.

Setelah itu dilakukan

perendaman dalam larutan fungisida (Dithane®) dengan konsentrasi 2 g/L air, selama 15 menit dan perendaman dengan bakterisida (Benlate®) selama 15 menit. Sterilisasi dilanjutkan di dalam LAF dengan larutan alkohol 70% selama 30 menit, kemudian dibilas dengan aquades steril tiga kali, dilanjutkan dengan perendaman di dalam larutan sublimat (HgCl2) 0,1% selama 10 menit. Sterilisasi berikutnya adalah sterilisasi bertingkat dengan larutan Clorox (cairan pemutih Bayclin®), dengan konsentrasi 70%, 50% dan 5% masing-masing selama 30 menit. Sebelum penanaman, eksplan dibilas dengan aquadest steril yang diberi beberapa tetes antiseptik Bethadine®. Setelah sterilisasi, eksplan ditanam dalam botol kultur yang telah berisi media tanam MS dengan hormon pertumbuhan IBA 1 mg/L.

Penanaman

dilakukan di dalam LAF dengan mempergunakan peralatan yang telah disterilisasi dalam autoklaf. Eksplan ditanam dalam botol kultur sebanyak 3 atau 4 eksplan per botol. Selanjutnya botol kultur disimpan di dalam ruang inkubasi sampai berumur satu bulan. Setelah satu bulan, dilakukan pemindahan eksplan dengan media MS yang diberi hormon pertumbuhan IBA 3 mg/L. Eksplan yang telah tumbuh tunas (2 bulan) selanjutnya dipindahkan lagi dalam media MS dengan hormon pertumbuhan NAA 3 mg/L untuk penumbuhan perakaran (1 bulan). Rangkaian kegiatan kultur in vitro ini berlangsung selama 4-5 bulan (Gambar 4.7).

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


100

2

1

1 cm

1 cm 4

3

Gambar 4.7 Kegiatan kultur tanaman puring in vitro: (1) tunas pucuk; (2) pemisahan tanaman (3) sub kultur (4) plant-let in vitro

(4) Preparasi dan paparan gas Persiapan gas SO2 dilakukan dengan mengikuti prosedur Mattson (2005), seperti pada penelitian 2. Paparan gas SO2 dilakukan dengan cara menyuntikkan jarum syringe melalui tutup botol kultur. Lubang bekas suntikan gas SO 2 pada tutup botol ditutup kembali dengan menggunakan selotip.

Volume gas yang

disuntikkan ke dalam botol kultur sebanyak 1 mL. Pada akhir periode perlakuan, daun tanaman digunting dan dikeluarkan dari botol untuk dianalisis.

(5) Prosedur pengumpulan data Prosedur analisis daun untuk mendapatkan data kadar asam askorbat, klorofil total, pH dan kadar air, dilakukan seperti prosedur pada penelitian tahap1. Selain itu dilakukan juga estimasi terhadap kadar glutation (GSH) dalam daun berdasarkan kurva standar yang dibuat.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


101

a.

Estimasi kadar glutation (GSH) Pengukuran kadar glutation (GSH) dilakukan dengan metode Ellman

(Ellman, 1959; Boyne dan Ellman, 1972; Rani et al., 2004). Sebanyak satu gram bahan segar (daun) dihancurkan dalam 2 mL alkohol 50% dengan menggunakan mortal. Setelah halus, ditambahkan 5 mL larutan TCA 10%, kemudian diputar dalam sentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 2.000 rpm. Dekantan yang diperoleh dipipet sebanyak 1 mL ditambah dengan 0,5 mL pereaksi Ellman (19,8 mg DTNB dalam 100 mL sodium sitrat 0,1%) dan 3 mL buffer phosphat (0,2 M pH 8).

Selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 412 nm. Kadar glutation ditentukan berdasarkan kurva standar, dalam satuan µL/g. b.

Pembuatan kurva standar GSH Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan GSH 4

nmol/µL dalam larutan buffer fosfat 0,1 M pH 8. Larutan dipipet sebanyak 200, 400, 600, 800 dan 1000 µL ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL buffer fosfat pH 8 dan aquadest hingga volume 10 mL. Sebanyak 3 mL larutan tersebut ditambah dengan 0,02 mL larutan DTNB, dan ditunggu selama satu jam sebelum pengukuran OD (optical density) menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 412 nm. Kurva standar dan persamaan garis linear yang terbentuk seperti pada Gambar 4.8.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


102

0,8 0.8 0,7 0.7

Absorbansi

0,6 0.6 0,5 0.5 0,4 0.4

y = 0,011x - 0,019 R² = 0,987

0,3 0.3 0,2 0.2 0,1 0.1 0 0 0

20

40

60

80

GSH (µL/g)

Gambar 4.8

4.5.4 Penelitian 4:

Kurva standar GSH pada panjang gelombang 412 nm

Pengaruh SO2 pada beberapa parameter biokimia tanaman puring bibit

Penelitian ini adalah penelitian terhadap tanaman puring bibit dengan perlakuan paparan gas SO2 dosis tinggi. Selain mengukur nilai APTI dan kadar glutation daun tanaman puring pada paparan SO 2 dosis tinggi, juga dilakukan pengamatan terhadap kerusakan daun dan kadar S dalam daun.

(1). Bahan dan peralatan penelitian Bahan penelitian berupa bibit tanaman puring, media tanam dan bahan kimia. Bibit tanaman puring berasal dari perbanyakan vegetatif cangkok, berumur 6 bulan, yang diperoleh dari penangkar tanaman hias di Tlekung, Malang. Bahan kimia dipergunakan selain untuk pembuatan gas SO2, dan analisis kandungan asam askorbat, dan klorofil total daun, seperti pada penelitian 2, juga diperlukan untuk analisis kadar S dalam daun. Bahan kimia untuk analisis kadar S dalam daun adalah

Desertasi

HNO3 pekat (65 %) p.a., HClO4 pekat (60 %) p.a., Standar S 50


PANGESTI NUGRAHANI


103

ppm, Larutan BaCl2-Tween, Larutan campuran asam, yaitu CH3COOH glasial 100 % p.a., HCl pekat 37 % p.a. dan H3PO4 pekat 70 % p.a. Peralatan yang dipergunakan adalah peralatan untuk preparasi dan paparan gas SO2 serta peralatan untuk analisis asam askorbat, klorofil total, pH, dan kadar air, seperti pada penelitian 2. Namun selain itu digunakan juga beberapa peralatan untuk analisis kadar S, yaitu: tabung digestion dan block digestion, pengocok tabung, tabung reaksi, serta Spektrofotometer UV-VIS. Untuk keperluan paparan gas SO2 pada tanaman tidak menggunakan sungkup plastik, melainkan menggunakan Plant Growth Chamber, yang terbuat dari plexi glass dengan rangka logam stainless ukuran volume 1,12 m3 (122x122x76 cm3).

Chamber dilengkapi dengan peralatan termohigrometer,

blower dan tabung gas serta gas detector (Gambar 4.9).

Gambar 4.9 Plant Growth Chamber

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


104

(2) Rancangan penelitian Penelitian disusun dalam Rancangan Acak Lengkap satu faktor, dengan lima kali ulangan. Faktor perlakuan adalah konsentrasi gas SO 2 dalam durasi (lamanya) waktu tanaman berada di dalam chamber. Perlakuan terdiri dari P0: Kontrol; P1: paparan gas SO2 50 ppm selama 30 menit; P2: paparan gas SO2 50 ppm selama 60 menit ; P3: paparan gas SO2 100 ppm selama 30 menit; dan P4: paparan gas SO2 100 ppm selama 60 menit. Paparan dilakukan sehari sekali, dan diulang selama 12 hari (12 kali pemaparan). (3) Persiapan bahan tanam bibit dan paparan gas SO 2 Bibit tanaman puring diaklimatisasi dan dipersiapkan selama dua bulan di dalam rumah kaca, sebelum mendapat perlakuan paparan gas SO 2. Tanaman ditanam dalam pot plastik berdiameter 20 cm dengan media tanam berupa campuran tanah taman dan kompos dengan perbandingan 1:1. Pemeliharaan tanaman dilakukan selama penelitian dengan penyiraman secara teratur setiap hari. Pada saat paparan gas SO2, tanaman dimasukkan ke dalam Plant Growth Chamber. Permukaan tanah pada pot ditutup dengan plastik untuk menghindari gas SO2 terserap dalam tanah. Gas SO2 dibuat di dalam ruang asam secara microscale laboratory, dengan mereaksikan natrium metabisulfit dengan HCl 6 M (Mattson, 2005), seperti pada penelitian 2 dan 3. Gas yang terbentuk ditampung di dalam tabung gas dan dihembuskan dengan blower ke dalam chamber. Chamber dilengkapi dengan kipas angin kecil, agar gas dapat tersebar merata di seluruh chamber. Volume gas yang dimasukkan (dihembuskan) ke dalam chamber dan lamanya tanaman berada di dalam chamber, disesuaikan dengan perlakuan penelitian. Selama paparan gas

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


105

berlangsung, suhu dan kelembaban di dalam chamber dipantau melalui thermohigrometer.

Setelah paparan dalam

setiap periode selesai, tanaman

dikembalikan ke dalam rumah kaca. Pada akhir masa perlakuan, daun tanaman diambil untuk dianalisis di dalam laboratorium.

(4)

Prosedur pengambilan data Prosedur analisis daun untuk mendapatkan data kadar asam askorbat,

klorofil total, pH, kadar air, dan kadar glutation, dilakukan seperti prosedur pada penelitian 1, 2 dan 3. Pada penelitian ini dilakukan juga pengukuran kadar sulfur dalam daun dan penetapan indeks kerusakan daun. a. Pengukuran kadar sulfur dalam daun Analisis daun untuk mengetahui kadar sulfur dalam daun, dilakukan di Laboratorium Ilmu Tanah Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya, Malang. Kadar sulfur dalam tanaman ditetapkan dengan metode pengabuan basah (Balittanah, 2005). Preparasi sampel daun dilakukan dengan cara mengeringkan daun dalam oven dengan suhu 70o C selama 24 jam hingga berat tetap, kemudian dihaluskan dengan mesin grinder yang menggunakan filter dengan kehalusan < 0,5 mm. Selanjutnya dilakukan penetapan faktor koreksi kelembaban berdasarkan kadar air. Ditimbang 1 gram contoh tanaman, dipanaskan dalam oven suhu 105oC selama 4 jam kemudian ditimbang kembali. Kadar air dan faktor koreksi ditetapkan berdasarkan perhitungan: Kadar air (%) = kehilangan bobot/bobot contoh asal x 100 Faktor koreksi (fk) =

100/(100 - % kadar air)

Metode pengabuan basah untuk menetapkan kadar S dilakukan sebagai berikut. Ditimbang 0,5 g contoh tanaman yang telah dipreparasi ke dalam tabung

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


106

digestion. Ditambahkan 5 mL HNO3 p.a. dan 0,5 mL HClO4 p.a. dan dibiarkan satu malam. Besoknya dipanaskan dalam digestions block dengan suhu 100oC selama satu jam, kemudian suhu ditingkatkan menjadi 150 o C. Setelah uap kuning habis, suhu digestions block ditingkatkan menjadi 200o C. Destruksi dinyatakan selesai setelah keluar asap putih dan sisa filtrat ± 0,5 mL, selanjutnya tabung diangkat, ditunggu hingga dingin. Filtrat diencerkan dengan air bebas ion hingga volume tepat 50 mL dan dikocok dengan pengocok tabung hingga homogen. Selanjutnya dipipet masing-masing 1 mL filtrat dan larutan standar S ke dalam tabung kimia. Ditambahkan masing-masing 7 mL asam campur dan 2,5 mL larutan BaCl2-Tween kemudian dikocok dengan pengocok tabung sampai homogen. Setelah 30 menit kemudian diukur dengan Spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 432 nm. Kurva standar dibuat dengan cara memipet larutan standar S 50 ppm sebanyak 0; 1; 2; 4; 6; 8 dan 10 mL. Masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan dengan larutan HClO4 0,6 %, hingga volume menjadi 10 mL. Deret larutan standar ini memiliki kepekatan: 0; 5; 10; 20; 30; 40; 50 ppm S. Selanjutnya ditetapkan kadar S dengan perhitungan: Kadar S (%) = ppm kurva x 1000-1 mL filtrat x 100-1 mg contoh x fk = ppm kurva x 50/1000 x 100/500 x fk = ppm kurva x 0,01 x fk b. Kerusakan morfologis daun (Leaf Injury Index) Pengukuran tingkat kerusakan daun dilakukan tiga hari setelah perlakuan terakhir, dengan pengamatan makroskopis terhadap gejala klorosis dan nekrotik pada daun.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


107

Tabel 4.4 Skor kerusakan daun (Pitcher et al.,1991)

Skor

Kerusakan 0,0

Tanpa kerusakan

0,05

Klorosis ringan

0,10

Klorosis parah

0,25

Nekrotik kecil pada permukaan atas daun

0,50

Nekrotik besar pada permukaan atas daun

0,75

Nekrotik luas pada dua permukaan daun

1,0

Nekrotik sangat luas pada dua permukaan daun

Kerusakan relatif terhadap luas daun, dinyatakan dalam Leaf Injury Index(LII), yang merupakan perkalian skor kerusakan daun dengan persentase kerusakan terhadap luas daun. Skoring kerusakan ditentukan berdasarkan tetapan menurut Pitcher et al. (1991), seperti pada Tabel 4.6.

4.5.5 Penelitian 5: Kajian APTI dan glutation sebagai indikator potensi fitoremediasi dan toleransi tanaman terhadap paparan gas SO2 Penelitian 5 merupakan kajian terhadap nilai APTI berdasarkan hasil Penelitian 1 hingga Penelitian 4. Kajian ini adalah pendekatan untuk memperoleh formula APTI yang dimodifikasi dengan memasukkan indikator glutation. Penelitian dilakukan dengan membuat analisis korelasi-regresi terhadap variabel APTI dengan kadar S dalam daun, antara APTI dengan kadar glutation daun, antara kadar S dengan kadar glutation. Model persamaan regresi APTI baru, akan disusun dengan menggunakan analisis faktor yang dilanjutkan dengan analisis regresi. Analisis faktor merupakan salah satu metode multivariat yang digunakan untuk menganalisis variabel yang diduga memiliki keterkaitan satu

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


108

sama lain sehingga keterkaitan tersebut dapat dijelaskan dan dipetakan atau dikelompokkan pada faktor yang tepat (Santoso, 2002).

Analisis dilakukan

dengan menggunakananalisis statistika dengan tahapan sebagai berikut: (a) Identifikasi kecukupan data Kecukupan data atau sampel dapat diidentifikasi melalui nilai Measure of Sampling Adequacy (MSA) dan Kaiser-Meyer-Olkin (KMO). Mengacu pada landasan teori bahwa sekelompok data dikatakan memenuhi asumsi kecukupan data adalah jika nilai MSA dan KMO lebih besar daripada 0,5 (Santoso, 2002). (b) Identifikasi korelasi antar variabel Antar variabel harus memenuhi asumsi berkorelasi yaitu dengan melihat nilai Sig. 0,00 kurang dari α 0,05 yang berarti tolak H0. (c) Penentuan jumlah faktor dan pengelompokan variabel berdasarkan loading factor. Keputusan pengambilan jumLah faktor didasarkan pada nilai eigenvalue dari matriks korelasi antar variabel.

Nilai eigenvalue yang diambil untuk

menentukan berapa banyaknya faktor yang terbentuk adalah nilai eigenvalue yang lebih besar dari satu. (d) Rotasi faktor dan pembuatan factor score (e) Pengelompokan variabel ke dalam faktor baru Pembagian variabel ke dalam kelompok faktor tertentu didasarkan pada perbandingan nilai loading factor secara mutlak mana yang lebih besar antar loading factors.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI


109

(f) Penamaan faktor baru yang terbentuk Pemberian nama faktor merupakan ketentuan dari peneliti, pemberian nama tersebut

berdasarkan

variabel

yang

dapat

diukur

langsung

untuk

menggambarkan faktor yang merupakan variabel yang tidak dapat diukur secara langsung. (g) Validasi. Validasi faktor dilakukan untuk menguji kestabilan faktor baru yang terbentuk. Validasi dilakukan dengan membagi dua data, kemudian dilakukan analisis faktor. Selanjutnya dilakukan perbandingan nilai komponen matrik yang terbentuk pada tahap mula-mula dan tahap setelah validasi.

Desertasi


PANGESTI NUGRAHANI

BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN

Recommend Documents