Automatizáció az endokrin laboratóriumi vizsgálatokban Kıszegi Tamás Pécsi Tudományegyetem Laboratóriumi Medicina Intézet
A kezdet RIA módszer felfedezése 1960 Rosalyn Yalow és Soloman Berson
Kizárólag manuális módszerek
A folytatás: 1970-es évek • Enzim jelölés kidolgozása (glutáraldehides keresztkötés) Avrameas és Pierce • 1971 Engvall és Perlmann elsı ELISA publikáció • Boehringer-Mannheim, Abbott, Organon Teknika – elsı ELISA kit-ek • Automatizáció megindítása (96 lyukú lemezek, pipettorok, fotométerek)
A folytatás: 1990-es évektıl • Batch típusú analizátorok, elsısorban RIA, késıbb ELISA • Homogén immunoassay (EMIT-Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), automatizáció kezdete • Monoklonális antitestek elterjedése • Nemizotópos jelölések kifejlesztése • Automata analizátorok fejlesztése – késıbb betegorientált készülékek
Megoldandó problémák • Jelölés – detektálás
• Homogén vagy heterogén assay?
Jelölık típusai - fluoreszcens FITC primer amino csoport
Jelölık típusai - fluorofor Kumarin származékok (metil-umbelliferonfoszfát észter)
Jelölık típusai – fluoreszcens kelát (lantanida)
Idıfelbontású gerjesztés és mérés
Jelölık típusai – energia transzfer Az energiatranszfer:
Europium cryptate és XL 665 fluoreszcens jelölı Excitation transfar Energy
N
N
3+
Eu
N N N
N
N N
Long-lived fluorescene
6 2 0 nm
Long-lived fluorescene
6 6 5 nm
Idıfelbontású gerjesztés és mérés
Jelölık típusai - lumineszcenciás
NaOH vagy peroxidáz enzim hatására világít
Jelölık típusai - lumineszcenciás Chemilumiscence Luminol O
NH 2 O Luminol
H2O 2 OH-
-
=
=
NH NH
=
=
O
NH 2 O
O + hν O
NaOH vagy peroxidáz enzim hatására világít
Jelölık típusai - lumineszcenciás Dioxetan foszfát észter Alkalikus foszfatáz (AP) enzim aktivitás hatására gerjesztıdik és fotont emittál
Jelölık típusai – elektro kemilumineszcencia (ECL)
Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium (II) complex TPA: tripropylamine
A lumineszcens jel típusai
Rövid felvillanás
Hosszú idıtartamú, közel konstans fény
A lumineszcens jel típusai
Rövid felvillanás, de sokszor ismételhetı, a jel kumulálódik (ECL)
Lumineszcenciás detektálás elve
Foton számlálásos mérési elv: foton/idıegység
Heterogén (szilárd fázisú módszerek) • • • • •
Bevont csı 96 lyukú lemez Makro gyöngy Mikro gyöngy (mikro partikulum) Mátrix cella
Bevont csı Félautomata módszer Akridinium észter jelölés
Mikro plate módszer (DELFIA)
Idıfelbontású heterogén immuno assay
Mikro plate módszer (DELFIA) méréstechnikája
Makro gyöngy módszer
Enzim katalizált kemilumineszcenciás assay (dioxetane foszfát észter)
Mikro gyöngy módszer
Mágneses mikro gyöngyök, ECL heterogén assay
Mikro gyöngy módszer Fény detektálás
Streptavidinnel Biotinilált borított anti-PTH mágneses 1. antitest mikrogyöngy
PTH a mintában
Ruténiummal jelölt 2. anti-PTH antitest
Fényjel
PTH koncentráció
Példa a mikro gyöngy szendvics assay felhasználására (ECL)
Mikro gyöngy módszer
Különbözı heterogén ECL assay típusok
Mátrix cellás MEIA módszer Egylépéses kompetitív heterogén mikropartikuláris immunoassay Minta + AP enzim konjugált antianalit IgG Mikro gyöngy: anti-fluoreszcein IgG-analit komplex vetélkedik a szabad jelzett antitesttel Üvegszálas mátrix cellában kötıdés 4-metil-umbelliferil-foszfát szubsztrát - fény
Cellulóz mátrix csapda: fluoreszcens immunoassay
Homogén módszerek • Fluoreszcencia polarizációs immunoassay
• Energia transzferen alapuló immunoassay
Analitikai teljesítıképesség • Nagy méréstartomány • Nagy érzékenység (pmol/l, fehérjékre pg/ml) • Jó specificitás • Interassay precizitás < 10% • Jó valódiság • A mért értékek reagens- és készülék függıek!
TNF-alfa kontroll kártya alacsony tartomány (77-119pg/ml) 140 120 100 80 átlag: 107,5 szórás: 7,1 VK: 6,6
60 40 0
5
10
15
20
25
30
mérések száma (db)
TNF-alfa a célérték %-ában
TNF-alfa a célérték %-ában
TNF alfa kontroll kártyája
TNF-alfa kontroll kártya magas tartomány(394-623pg/ml) 140 120 100 80 átlag: 104,9 szórás: 8,7 VK: 8,3
60 40 0
5
10
15
20
mérések száma (db)
25
30
Interferenciák – heterofil antitestek • A módszer méréstartományában interferenciát okozó antitest titer a mintában • Multispecifikus heterofil antitestek (több faj immunglobulinjával reagálhatnak) • Monospecifikus heterofil antitestek (a reagensben lévı antitesttel interferálnak) • Rf multispecifikus antitest
Interferenciák – specifikus autoantitestek • Mérendı paraméter-specifikus antitestek jelenléte a mintában • Leggyakoribb interferenciák: FT4, FT3, Tg AFP, CEA, CA 15.3, CA 125 Prolaktin FSH, LH, HCG • Konzultáció a klinikussal!
Mérési bizonytalanság Paraméter Ferritin CA 19.9 hGH Inzulin ATPO Valproinsav IgE
Szint 1 6,5 12,1 10,9 10,4 21,1 9,01 15,3
Szint 2 6,1 9,4 12,4 8,9 14,3 9,34 9,4
