AUTOATITESTEK VIZSGÁLATA ÉS KLIIKAI ÉRTÉKELÉSE Gergely Péter dr Semmelweis Egyetem Központi Immunológiai Laboratórium
Immunológiai Laboratóriumi vizsgálatok (WHO/IUIS/AACI, 1993) Immunglobulinok Antitestek • autoantitestek • antibakteriális stb. antitestek Cytokinek és receptoraik Effektorsejtek és termékeik Komplement Akut fázis reakció Lymphocyta (CD) markerek Lymphocyta funkcionális tesztek Cytotoxikus tesztek Phagocyta tesztek Basophil, eosinophil funkciók Immunhisztológia Immungenetika
Mit vár el a klinikus az autoantitest vizsgálatoktól? 1) legyen könnyen hozzáférhető (térben és időben) - a legtöbb csak néhány centrumban elérhető 2) olcsó - nagyon sok teszt költséges (és a laboratóriumnak sem éri meg) 3) megbízható - ma még nagyon sok a technikai probléma 4) legyen kellően informatív (specifikus és szenzitív) - a legtöbb teszt nem eléggé specifikus és/vagy szenzitív
NÉHÁNY TECHNIKAI PROBLÉMA 1. Antigén forrás teljes antigén tisztított antigén rekombináns antigén 2. Antitest forrás teljes (IgG, IgA, IgM) tisztított (pl. csak IgG) monoklonális/poliklonális 3. Technika IF EIA (ELISA) blot (dot blot/ WB) 4. Reprodukálhatóság interobserver (laboratóriumok között) intraobserver (laboratóriumon belül)
INFORMÁCIÓS INDEXEK Pozitív betegek száma Szenzitivitás = ----------------------------Összes beteg száma egatív betegek száma Specificitás = -------------------------------Összes nem-beteg (kontroll) száma Pozitív prediktív érték (PPV) = Annak valószínűsége, hogy pozitivitás esetén az adott betegség fennáll egatív prediktív érték (PV) = Annak valószínűsége, hogy negativitás esetén a betegség nem áll fenn
Az indexek kiszámítása: TP T SZEZITIVITÁS = --------- SPECIFICITÁS = --------TP + F T + FP TP PPV = --------TP + FP
T PV = ---------F + T
----------------------------TP = Pozitív esetek száma FP = Fals-pozitív esetek száma F = Fals-negatív esetek száma T = egatív esetek száma
Receiver Operating Characteristic (ROC) görbe (a specificitás & szenzitivitás összefüggése) 100%
AUC
100%
100 - specificitás
Különféle tesztek diagnosztikus értéke az SLE aktivitás megítéséban (a tesztek specificitása és szenzitivitása különböző cut-off értékek mellett) Teszt
Cut-off
Specificitás Szenzitivitás
Anti-DNS
56 U/ml 35 26 0.71 g/l 0.84 0.101 35 % 57 74
85% 79% 50% 68% 60% 49% 80% 63% 51%
C3
C4
57% 70% 77% 46% 57% 77% 42% 54% 79%
1. Az antinukleáris antitest (ANA) Gyüjtőfogalom, mely nagyon sokféle specificitású antitestet jelent. Az ANA sokféle szisztémás (és nem szisztémás) autoimmun betegségben, tumorokban, gyulladásokban is pozitív lehet. Az 1:40 titerben észlelt pozitivitás sok esetben önmagában nem jelent betegséget, de az 1:160 titerben pozitív lelet mindenképpen további diagnosztikai lépéseket indokol. Az ANA vizsgálat elvégzendő szisztémás autoimmun betegségek, SLE és rokon kórképek, ill. autoimmun hepatitis gyanúja esetén, valamint JIA diagnózisa esetén differenciáldiagnosztikai és prognosztikai céllal. Mintázat: a) homogén (a DNS/hiszton elleni antitesteket jelzi és gyakori SLE-ben), b) perifériás (natív DNS elleni antitesteket jelzi és SLE-ben fordul elő), c) pettyes/granuláris (ez a leggyakoribb és ENA-ra: pl. Sm, RNP, SS-A/B-re, stb. utal), d) nucleolaris (elsősorban sclerodermában fordul elő). A mintázat csupán orientációra szolgál, nem diagnózisra!
Az ANA meghatározás Miért IIF módszerrel? miért HEp-2 sejten? Az alábbi információk nyerhetők: 1. ANA pozitivitás/titer (≥1:160) 2. kromatin pozitivitás/negativitás, kromatin festődés (pl. anti-centromer) 3. a mitózisban szepet játszó különféle proteinek elleni antitestek kimutatása
4. ANA mintázat (pl. homogén, pettyes, stb) 5. különleges ANA formák (pl. PCNA, CENP-F) 6. citoplazma mintázat (mitokondrium, riboszóma, aktin, aminoacil tRNS szintetáz, stb)
7. citoszkeleton festődés
a) homogén
b) perifériás
c) granuláris (pettyes)
d) nucleolaris
ANA mintázatok: a) homogén, b) perifériás, c) granuláris, d) nucleolaris
POZITÍV ANA KÜLÖNFÉLE BETEGSÉGEKBEN (%-ban) SLE Gyógyszer-indukálta LE MCTD Sjögren syndroma Felty syndroma PSS PM/DM RA CAH Tüdőfibrosis Tuberculosis Neoplasia Kontroll
80-100 70 100 70 70-100 75-85 30 15-30 40-60 20 50 10 <5
Pozitív ANA titer egészséges gyermekekben és felnőttekben (HEp-2, 1:32 hígítás) % 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -5
-10
-15
-20
-40
>40
korcsoportok Craig et al, J Rheumatol 26:914, 1999
ANA pozitivitás SLE-ben, egyéb autoimmun betegségekben és kontrollokban % pozitiv 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
SLE Egyéb Kontroll
1
2
IF AA
3
4
5
6
7
ELISA
Emlen & eill, Arthritis Rheum 40:1612, 1997
Anti-DNS EIA kitek szenzitivitása és specificitása
%
100 80 60 Szenzitivitás
40
Specificitás
20 0 I
II
III IV
V
VI VII IX
Kit r. Tan et al. Arthritis Rheum 42:455, 1999
ANA vizsgálatok összehasonlítása IIF: indirekt immunfloreszcencia (HEp2 sejteken) 1 és 2: ELISA teljes HEp-2 sejtmag bevonaton kappa
egyezés % 82
0,7
80
0,6 0,5
78
0,4
76
egyezés %
74
kappa 0,3 0,2
72
0,1 0
70 IIF-1
IIF-2
1-2
Kappa koefficiens (Cohen): >0,2 gyenge egyezés 0,2-0,4 mérsékelt egyezés 0,4-0,6 közepes egyezés 0,6-0,8 jó egyezés 0,8-1,0 nagyon jó egyezés
IIF-1
IIF-2
1-2
Az ANA nagyon sokféle antitestet foglal magába, a legfontosabbak: • • • • • • •
Anti-(natív) DNS antitest Hiszton antitest Centromer antitest ENA (extrahálható nukleáris antigének elleni antitestek) PCNA antitest Ku antitest Kromatin elleni antitestek
Továbbiak: coilin, DEK, egyesláncú-DNS, IFI 16, Mi-2, nucleosoma, nucleoláris antitestek ANA pozitivitás esetén az antitest típusát meg kell határozni!
Algoritmus az ANA további vizsgálatára (Golightly & Golightly, 2002)
Anti--(natív) DNS antitest: (kettősszálú DNS elleni antitest) az Anti SLE diagnózisához szükséges, és a betegség monitorozására is alkalmas. Negativitása gyakorlatilag kizárja az aktív SLE-t. A jelentősen magasabb érték nagyon nagy valószínűséggel SLE-t jelez. A 100-at meghaladó érték általában betegségaktivitás mellett szól. Hiszton antitest: (H1, H2, H3, H4 elleni antitestek) nagyon sok szisztémás autoimmun betegségben (SLE, gyógyszer-indukálta lupus, RA, JIA , PSS , stb), előfordul. Diagnosztikai jelentősége a gyógyszer-indukálta lupus diagnózisa.
Crithidia luciliae teszt
A nucleosoma szerkezete
A nucleosoma elleni antitestek és a natív DS elleni antitestek kapcsolata SLE-ben Paraméter
Aktív SLE
Inaktív SLE Összesen
1 Anti-DNS +, anti-Nuc +
5
42
47
2 Anti-DNS-, anti-Nuc +
4
18
22
3 Anti-DNS +, anti-Nuc -
0
4
4
4 Anti-DNS -, anti-Nuc -
0
41
41
Összesen
9
105
114
Centromer antitest: (60 kDa centromer protein elleni antitest)
elsősorban sclerodermában (CREST szindrómában) ritkábban PBCben fordul elő. Diagnosztikai jelentősége: scleroderma gyanúja, differenciáldiagnózisa (CREST vs. PSS), Raynaud syndroma differenciáldiagnózisa – a pozitivitás a scleroderma későbbi kialakulását jelzi, ill. PBC prognosztikája – a pozitív lelet a scleroderma egyidejű fennállására utal.
Jellegzetes kromatin festődés
ENA (extrahálható nukleáris antigének elleni antitestek): 1. SS-A (Ro) és SS-B (La) – nonhiszton nukleoproteinek 2. Scl-70 – DNS topoizomeráz I 3. Jo-1 – (aminoacil (hisztidil) tRNS szintetáz) 4. RNP (U1-RNP) - különféle uridinban gazdag nukleoproteinek 5. Sm – 29 kDa nukleoprotein 6. Egyéb: PCNA, Ku, Mi-2, PMScl, PM-1
SS-A (Ro) és SS-B (La) antitestek: Diagnosztikai jelentősége: primer vagy szekunder Sjögren syndroma (SS), SLE, SCLE, neonatalis lupus gyanúja ill. diagnózisa esetén van. Az SS-A és B nagyon gyakran együtt fordul elő. Scl-70 antitest : PSS-ben fordul elő, és rossz prognosztikai faktor. A Raynaudos betegek egy része pozitív, ezekben a PSS kialakulásának kockázata nagy. Jo-1 antitest: myositisben (anti-szintetáz szindrómában) fordul elő. Diagnosztikai jelentősége: myositis (anti-szintetáz syndroma) diagnózisa/differenciáldiagnózisa, ismeretlen eredetű fibrotizáló alveolitis differenciáldiagnosztikája. Ha a Jo-1 negatív myositisban alveolitis van, a HEp-2 sejtek cytoplazmájának mintázata diagnosztikai jelentőségű lehet.
ENA (folytatás) Anti szintetáz antitestek (a HEp-2 sejtek citoplazmájában, ANA negatív)
(U1)-RNP antitest: MCTD-ben diagnosztikai kritérium, SLE-ben gyakran pozitív és elsősorban a bőr-nyálkahártya laesiokkal függ össze, PSS-ben kevésbé gyakori és a tüdőfibrosissal kapcsolatos.. Sm antitest: SLE-ben diagnosztikai és prognosztikai marker (CNS, vese, ill. bőr involvatio előfordulását jelzi).
További ENA-k: PCNA, Ku, MI-2, PMScl, PM-1, stb.
PCNA („proliferating cell nuclear antigen”) antitest: SLE-re specifikus. A PCNA+ betegeknek vese és CNS involvatioja van. Diagnosztikai jelentősége: SLE gyanúja (kivált anti-DNS és Sm negativitás esetén) van. Ku antitest: az antigének: különféle DNS-kötő/dependens nonhiszton proteinek (valójában nem ANA). Az antitestek polymyositis/scleroderma overlap szindrómáiban fordulnak elő. Riboszomális proteinek elleni antitestek: szintén gyüjtőnév, szisztémás autoimmun betegségekben, elsősorban SLE-ben fordulnak elő.
riboszóma elleni antitestek
PCNA ANA pozitív, kromatin negatív
kromatin elleni antitestek
(a nyíl az osztódó sejt kromatin pozitivitását mutatja)
(a kromatin nem festődik )
Citoplazma elleni antitestek: pl. AMA, Jo-1 Citoszkeleton elleni antitestek: pl. cytokeratin, actin, tropomyosin, vimentin, vinculin, stb. AMA
vimentin
actin
2. Anti-neutrofil citoplazma antitestek (ANCA): neutrofilek citoplazmájában lévő antigének gyüjtőneve. Fontosabb formái: proteináz 3 (PR3), myeloperoxidáz (MPO), elasztáz, laktoferrin, baktericid permeabilitást fokozó protein (BPI). A festődés mintázata háromféle: citoplazma (c), perinuclearis (p) és atípusos lehet. A c-ANCA mintázat leggyakrabban a PR3 és BPI, a p-ANCA mintázat pedig leggyakrabban a MPO jelenlétére utal, de ilyet ad az elasztáz és laktoferrin is. A BPI gyakran atípusos festődést ad.
c-ANCA
p-ANCA
Az ANCA screen indikációi: ANCA pozitív vasculitisek (Wegener granulomatosis, mikroszkopikus polyangiitis) gyanúja, nephritisek differenciáldiagnosztikája, krónikus gyulladásos bélbetegség (IBD) gyanúja, primer sclerotizáló cholangitis gyanúja, vérzéses alveolitis differenciáldiagnosztikája. Proteináz 3 (PR3) antitest: nagyon specifikus Wegener granulomatosisra (>95%), még az atípusos formákra (pl. izolált perifériás neuritis, idiopathiás necrotizáló nephritis, stb) is. Gyakran pozitÍv IBD-ben is. Előfordul még egyéb vasculitisekben is. Myeloperoxidáz (MPO) antitest: Előfordulás: mikroszkópikus polyangiitisben (60-80%), egyéb eredetű focalis necrotizáló glomerulonephritisben, gyorsprogressziójú glomerulonephritisekben, ritkán Wegener granulomatosisban, ChurgStrauss syndromában. Goodpasture syndromában (30-40%), illetve a szisztémás autoimmun betegségek (RA, SLE, stb) bizonyos százalékában.
3. Antifoszfolipid antitestek: Szintén gyüjtőfogalom, különféle anionos és neutrális foszfolipidek, illetve az ezeket kötő különféle glikoproteinek elleni antitestek. A legfontosabb formái: a cardiolipin, ill. a foszfatidilszerin elleni antitestek, valamint a béta-2glikoprotein I és a protrombin elleni antitestek – melyeket enzim immunesszével (EIA) mérünk, illetve a lupus antikoaguláns (LA), és. hexagonális foszfolipid teszt, melyeket funkcionális tesztben mérünk. Diagnosztikai jelentőség: Az antitestek a primer és szekunder antifoszfolipid syndromában (APS) fordulnak elő. A tesztek (anti-cardiolipin + anti-β2GPI + LA) elvégzendők: primer vagy szekunder APS gyanúja esetén, SLE-ben a thrombosisveszély rizikójának felmérésére, valamint ismeretlen thrombopeniában, SLE gyanúja esetén (diagnosztikai kritérium), esetleg az APS kezelés monitorozására.
4. Szervspecifikus antitestek: Az antimitokondriális antitest (AMA) - pozitivitása primer biliáris cirrhosisban (PBC) diagnosztikus értékű, de ritkán a teszt pozitív lehet egyéb autoimmun (u.n. overlap) hepatitisben is. A símaizom elleni antitest (SMA) PBC-ben, autoimmun hepatitisben szinte mindig pozitív, de számos (vírusos, alkoholos) májbetegségben is lehet pozitív, ezért diagnosztikus értéke csekély. Az ANA-val együtt az autoimmun hepatitis osztályozására használható: az 1. típusban pozitív. Az anti-mikroszómális antitest (LKM-1) krónikus hepatitisekben fordul elő, a 2. típusú autoimmun hepatitisre jellemző. A májspecifikus proteinek elleni antitestek szintén a 2. típusú autoimmun hepatitisre jellemzők. Az anti-reticulin antitestek jelenléte felveti coeliakia gyanúját. A parietális sejt elleni antitestek autoimmun eredetű krónikus atrophiás gastritisre (ill. idiopathiás anaemia pernicosára) jellemzőek.
AMA
anti-reticulin anti-reticulin
SMA
PCA PCA
(patkány vese, ill. gyomor metszeten)
A pajzsmirígy elleni antitestek: az anti-thyreoglobulin és antimicrosomális antitestek (más néven anti-peroxidáz, TPO antitestek) autoimmun pajzsmirígy betegségekben (Hashimoto thyreoiditisben és idiopathiás myxoedemában) diagnosztikus értékűek. Gyakran pozitívak, habár mennyiségük kisebb Graves kórban és néha pajzsmirígy adenocarcinomában is. A mellékvese (kéreg) elleni antitestek autoimmun (idiopathiás) Addison kórban mutathatók ki. A diagnózishoz nem szükségesek, csak a betegség kóreredetére utalnak. Az anti-glomeruláris bazálismembrán (GBM) antitest Goodpasture syndromában (illetve anti GBM nephritisekben) pozitív és egyben diagnosztikus értékű.
Anti-TG
Mellékvese elleni antitest,
Anti-TPO
Anti-GBM antitest
Majom pajzsmirígy, mellékvese és vese metszet
Coeliakia (gluten szenzitivitás) diagnosztika: Ezek az antitestek a coeliakia (gluten-szenzitív enteropathia) és a vele rokon bőrbetegségek (pl. dermatitis herpetiformis) diagnózisára, ill. monitorozására szolgálnak. Az anti retikulin antitest kevésbé specifikus, elsősorban szűrővizsgálatra szolgál. A gliadin, endomysium, illetve szöveti transzglutamináz (tTG) elleni antitestek közül az utóbbiak a leginkább specifikusak. Az IgA tTG magas szintje önmagában jelzi a coeliakia meglétét. Az IgG tTG meghatározására IgA hiányban van szükség.
Endomysium elleni antitestek
Acetilkolin receptor elleni antitestek: Myasthenia gravisban a betegség kialakulásáért felelős antitestek. Ennek ellenére nem mindig sikerül az antitesteket kimutatni, kimutathatóságuk a betegség súlyosságától is függ.
Hámantigének elleni antitestek: A desmosoma (desmoglein 1 és 3) elleni antitestek pemphigus vulgarisban és foliaceusban fordulnak elő. Az epidermalis basalmembrán elleni antitestek bullosus pemphigoidban és rokon betegségekben (pl. dermatitis herpetiformisban) észlelhetők.
Intercelluláris festődés pemphigusban
EBM festődés pemphigoidban
5. A rheumatoid faktor (RF) pozitív rheumatoid arthritisben (RA-ban) (pontosabban a betegek nagyobb részében), és egyúttal az RA-ban diagnosztikai kritérium is. Igen gyakran pozitív Sjögren syndromában és esszenciális kevert kryoglobulinaemiában, negativitása azonban nem kizáró. Az RF nagyon sok betegségben (autoimmun betegségekben, infekciókban, stb.) lehet pozitív, specificitása nagyon alacsony. 6. CCP (ciklikus citrullinált peptid) antitest RA-ra jellemző antitest, mely specifikusabb, mint az RF. A RA korai (nemspecifikus) stádiumában gyakran pozitív. A CCP pozitivitás rossz prognosztikai tényező.
POZITÍV RF KÜLÖFÉLE BETEGSÉGEKBE (%-ban) RA SLE SS PSS Kryoglobulinaemia MCTD Vírus infekciók Endocarditis Májcirrhosis Sarcoidosis Tüdőfibrosis Silicosis Neoplasia Kontroll
50-90 15-35 75-95 20-30 40-100 50-60 15-65 25-50 15-40 3-33 10-50 30-50 5-25 <5
7. C1q antitest: a hypocomplementaemiás urticaria-vasculitisben (HUV) 100%-ban pozitív. SLE-ben 17-58%-ban fordul elő (elsősorban veseérintettségben), szintje a betegség aktivitásával laza kapcsolatban van. Membranoproliferativ glomerulonephritisben 88%-ban fordul elő. A HUV diagnózisához szükséges vizsgálat.
Javasolt tesztek különféle autoimmun betegségekben: SLE
ANA, anti-DNS, anti-Sm, anti-CL/LA, CH50, C3, C4 (neopterin, sIL-2R, SS-A, SS-B, RF, CRP) RA RF, CRP (ANA, C3, C4) JCA RF, ANA, CRP SS SS-A, SS-B, ANA, RF PSS Scl-70, anti-centromer, ANA ( anti-(U1) RNP) MCTD ANA, anti-(U1) RNP PM/DM ANA, Jo-1^ Vasculitisek ANCA, CRP, ANA, RF, kryoglobulin Autoimmun hepatitisek ANA, AMA, LKM-1, SMA, egyéb májspecifikus autoantitestek, kryoglobulin Hashimoto thyreoiditis anti-TPO, anti-TG
KONKLÚZIÓK • Egyetlen immunológiai teszt sem helyettesíti a klinikai adatok és egyéb vizsgálatok gondos analízisét, illetve a diagnosztikus GONDOLKODÁST • Nincs autoimmun diagnosztikus teszt panel! • A legtöbb diagnózis a klinikum és rutin laboratóriumi tesztek alapján születik meg. Az immunológiai tesztek kb. 20%-ban járulnak hozzá a diagnózishoz. • Csak néhány olyan teszt van, melynek megfelelő a szenzitivitása és a specificitása (pl. az anti-DNS tesztnek SLE-ben). Ezért legyünk óvatosak a pozitív és negatív eredmények interpretálásakor! • A (nem immunológus) orvosoknak is ismerniük kell a teszteket, de legalább azok interpretálását. • Ne kérjünk fölöslegesen immunológiai laboratóriumi teszteket!
