2. Apoptózis
Apoptózis Bevezetés (DIA 1) A többsejtű szervezetek testének kialakulását egy jól meghatározott genetikai/epigenetikai program irányítja. Ez a folyamat nem csupán új sejtek előállításából áll, hanem a szükségtelen sejtek eltávolításából is. A kifejlett szervezeteknek szintén el kell távolítaniuk az öreg, nem megfelelően működő vagy sérült sejtjeiket. Továbbá, a vírusok által megfertőzött sejteket szintén el kell távolítani, ill. a fertőzött sejtek környezetében lévő sejteket is el kell pusztítani, hogy a fertőzés ne terjedjen tovább. Ezeket a folyamatokat a szervezet egy programozott mechanizmus révén végzi el, melynek neve apoptózis. Az apoptotikus sejthalál során egy sejt az ún. apoptotikus testekbe csomagolódik. Ez a mechanizmus megakadályozza, hogy az immunrendszer aktiválódjon, s gyulladásos folyamatok jöjjenek létre. A sejt maradványait el kell távolítani. A szomszédos sejtek és a fagociták felfalják az apoptotikus testeket még mielőtt szétesnének és kibocsátanák a tartalmukat a sejt közötti térbe. Az apoptózis kiváltásában és szabályozásban 2 fontos jelút vesz részt: a belső (mitokondriális) és a külső (halál receptor) jelutak. Apoptózis jelutak (DIA 2) (1) A belső jelút két fő módon aktiválódhat: belső stressz mechanizmusok útján, ill. a túlélési szignálok hiánya miatt. (1a) A belső stressz mechanizmusok a DNS sérülést, kémiai anyagok és sugárzás általi károsító hatásokat foglal magába. (1b) A túlélési szignálok hiánya (amit pl. éhezés okozhat) szintén aktiválhatja az apoptózis belső jelútját. Az interleukin-2 és interleukin-3 túlélési szignálok alapvetően fontosak a timociták csontvelőből thymusba (csecsemőmirigy) vándorolt sejtek túléléséhez; az NGF (nerve growth factor, idegi növekedési faktor), pedig több idegsejtféleség túléléséhez szükséges. A belső jelutat aktiváló szignálok a mitokondriumnál konvergálnak; ez a sejt szervecske az apoptózishoz szükséges kulcs faktorokat bocsát ki. A mitokondrium integrátor szerepet játszik annak eldöntésében, hogy a sejt tovább éljen vagy elpusztuljon. (2) A külső jelút szignáljai más sejtektől származnak. Rendszerint a sejtek közvetlen kontaktusa aktiválja a külső apoptózis jelutat. A külső jelút aktiválása a citotoxikus T limfociták stratégiája, ami által az idegen sejteket, vagy az idegen antigéneket prezentáló sejteket öli meg. Programozott sejthalál (apoptózis és autofágia) kontra véletlen sejthalál (nekrózis) Sok megfigyelhető morfológiai és biokémiai különbség van az apoptózis és a nekrózis között. (1) Nekrózis („balesetes” sejthalál) abban az esetben történik, amikor egy sejt extrém élettani körülmények közé kerül (pl. hipotermia, hipoxia, stb.), ami a plazmamembrán sérülését okozza. A nekrózis azzal kezdődik, hogy a sejt nem lesz képes fenntartani a homeosztázisát, ami víz és extracelluláris ionok sejtbe való beáramlásához vezet. A sejtszervecskék megdagadnak, majd szétszakadnak (sejt lízis). Mivel a sejtmembrán megsérül, a citoplazma az extracelluláris térbe ürül, ami gyulladásos folyamatokat von maga után. Egészen mostanáig úgy vélték, hogy a nekrózis egy egyszerű, passzív, szervezetlen módja a sejthalálnak. Ma már, legalábbis bizonyos esetekben, a nekrózist is a programozott sejthalál egyik típusának tartják, ahol a gyulladásos folyamatok elkerülése nem egy nem-kívánt folyamat, hanem a program része. (2) Az apoptózis egy olyan folyamat, ahol a sejt aktív részese a saját halálának (öngyilkosság). A leggyakrabban a következő folyamatoknál fordul elő: normális sejt kicserélődés (turn over), szövet homeosztázis, embriogenezis, az immuntolerancia indukciója és fenntartása, az idegrendszer fejlődése, stb. Az apoptotikus sejtek tipikus morfológiai és biokémiai jellemzőket mutatnak, melyek a következők: kromatin aggregáció, sejtmagi és citoplazmás kondenzáció, a sejtmag és citoplazma apoptotikus testekbe csomagolása. Az apoptotikus test tartalmaz riboszómákat, mitokondriumokat és magi anyagot. Az apoptotikus testeket hamar felismerik és bekebelezik a környező epitél sejtek vagy a fagociták. E hatékony mechanizmusnak köszönhetően, nem keletkezik gyulladás a EXTRA KÖVETELMÉNY
16. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
1
2. Apoptózis sejtpusztulás helyén. Azokat a folyamatokat, amelyek apoptózis felé viszik a sejtet pro-apoptotikus, amelyek védik az apoptózis ellen anti-apoptotikus folyamatoknak nevezzük. (3) Az autofágia („önevés”) a programozott sejthalál egy másik formája, mely a sejt komponenseinek degradációja a saját lizoszómák segítségével. Apoptózist alkalmazó sejtek lehetnek hibás, fölösleges, funkció nélküli sejtek és sejtciklusukban megsérült sejtek, valamint vírussal fertőzött sejtek. A granzimek szerin proteázok, melyeket a citotoxikus T sejtek és a természetes ölősejtek (NK: natural killer) juttatnak a „kivégzendő” sejtbe. A granzimek feladata a apotózis indukálása vírus-fertőzött sejtekben. A granzimek megvágják a kaszpázokat (főként a Casp 3-at), - ezáltal aktiválják őket -, mely végeredményben a CAD (kaszpáz-aktiválta DNáz) aktivizálódáshoz, és így a DNS fragmentálódásához, majd apoptózishoz vezet.
(I.)
A mitokondriális (belső) útvonal (DIA 3) A mitokondrium a sejt energetikai központja, fő funkciója az ATP előállítása. E fontos szerep mellett, a mitokondrium a sejtbe érkező vagy a sejtben keletkező pro- és anti-apoptotikus információkat is integrálja, s dönt a sejt további sorsáról, amely az életben maradás vagy sejthalál közötti választást jelenti. Más szavakkal, a mitokondrium a sejt egészségi állapotának egyfajta szenzora. A mitokondrium képes érzékelni a DNS molekula törését, a topoizomeráz enzim (a DNS kitekerését végzi) gátlását, a citoplazmás stresszt és sok egyéb stimulust. Ezek a stimulusok permeabilizálják a mitokondrium membránját, ami több szabályozó fehérje citoplazmába való ürülését eredményezi. A permeabilizációt végző fehérjék főként az ún. Bcl-2 család tagjai közül kerülnek ki. A citokróm c (Cyt C) a citoplazmában kapcsolódik az Apaf-1 faktorral és a prokaszpáz 9-el (ezt a komplexet nevezzük apoptoszómának), s ennek hatására a prokaszpáz 9 aktív kaszpáz 9-é alakul át, amely a kaszpáz 3 aktivációját eredményezi. (DIA 3b) A dián Apaf-1 és kaszpáz 9 génekben mutáns (knockout) egerek ujjfejlődési defektusai láthatók. A citokrom c egyrészt egy redox protein, másrészt egy teljesen más funkciót betöltő jelmolekula is. Több más ilyen kettős (vagy többszörös) funkcióval rendelkező fehérje található a sejtekben. Valószínűleg, az ismereteink bővülésével, a jövőben még több fehérjéről fog kiderülni, hogy multifunkcionális szereppel rendelkezik. Kaszpázok (DIA 4) Az apoptózis kulcsfigurái a kaszpázok, amelyek az apoptotikus sejt zsugorodásában, DNS fragmentációjában és egyéb folyamatokban játszanak szerepet. A kaszpázok cisztein proteázok, amely azt jelenti, hogy az aktív helyükön cisztein aminosavat tartalmaznak. Jelenleg 14 emlős kaszpáz féleség ismert, ebből 11 az embernél is megtalálható. A kaszpázok hatásának lényege az, hogy proteolízissel lehasítanak egy peptid darabot egymásról, s így egy egymást aktiváló kaszpázokból álló kaszkád folyamat alakul ki. Az inaktív kaszpázokat prokaszpázoknak nevezzük, melyek az említett peptid szakasz levágásával aktiválódnak. A kaszkád során az első aktiválás (peptid levágás) egy autokatalitikus folyamat, tehát, egy kaszpáz saját magát aktiválja. Ezt az első, autokatalitikus proteázt nevezzük iniciátor kaszpáznak, a többi proteázt pedig az effektor kaszpáznak. A kaszpáz útvonal végén a célfehérjék állnak, amiket egy kaszpáz elbont, ilyenek pl. a nukleáris laminok. A Bcl-2 proteinek a mitokondrium membránját permeabilizálják (átjárhatóvá teszik), amelyek több fehérje citoplazmába kerülését teszik lehetővé. Ilyen fehérje pl. a Cyt C, amely kétféleképpen fejt ki hatását (1) jelmolekulaként működik, (2) nem látja el a szerepét az elektron transzport láncban, s ezért az ATP termelés nem működik normálisan. A Bcl-2 proteinek 3 alcsaládba sorolhatóak. (DIA 5) (1) Bcl-2 protektorok (védők) (pl. Bcl-2 és Bcl-XL) megvédik a sejtet az apoptózistól (anti-apoptotikus faktorok). (2) Bcl-2 killerek (gyilkosok; pl. Bax és Bak) pro-apoptotikus proteinek, melyek a sejtet elpusztításában működnek közre. (3) Bcl-2 regulátorok (szabályozók; pl. Bad, Bid, Bim, Puma, Noxa) elősegítik a sejthalált gátolván a EXTRA KÖVETELMÉNY
16. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
2
2. Apoptózis protektorokat és serkentvén a killereket. Ezek a fehérjék elsődlegesen a halál-elősegítő faktorok mitokondriumból való kibocsátását segítik, ha erre megfelelő jelet kapnak a belső útvonaltól. A Bcl-2 család tagjai a nagyon konzervatív BH doménjeik (Bcl-2 homology domains) alapján csoportosíthatók, melyekből 1-4 számú lehet jelen egy adott fehérjében. Megjegyzés: a Bcl-2 megnevezést használjuk az egész fehérje családra, ill. ezek közül az egyik fehérjére: a Bcl-2 e fehérje család prototípusa (jellemző tagja), innen az elnevezés. Nukleázok az apoptózisban Az apoptózis során a DNS molekulák degradálódnak. A degradációt végző nukleázok két osztályba sorolhatók: (1) Sejt-autonóm nukleázok a haldokló sejt DNS-ét emésztik meg. Ezek közül a legismertebb a kaszpáz-aktiválta DNáz (CAD). A CAD normálisan egy gátló molekulával az ICAD (inhibitor of CAD) képez komplexet. Az ICAD egy chaperon, amely nem csupán gátolja a CAD molekulát, hanem annak riboszómán való képződésekor segít a CAD megfelelő térszerkezetének kialakításában. Az ICAD ezen kettős funkciója garantálja, hogy csak inaktív CAD képződjön az egészséges sejtekben. Az apoptózis során a kaszpáz 3 elbontja az ICAD-ot, s így a CAD nukleáz felszabadul a gátlás alól. Ezek a nukleázok nem létfontosságúak, hiányukat túléli a szervezet. (2) A hulladék eltakarító nukleázok a sejt halála után eltüntetik a maradék DNS-t. Ezek a nukleázok vagy a fagocitáló sejtek lizoszómáiban fordulnak elő, vagy az extracelluláris térbe ürülnek, s ott végzik el az utómunkálatokat. Az egyik legfontosabb ilyen típusú nukleáz, a DNase II: a mutáns gént tartalmazó egér embrióban a nem-degradált DNS felhalmozódik, s az állat még a születése előtt elpusztul. Az apoptózis szabályozása a Bcl-2 proteinek által (DIA 6) (A) Apoptotikus stimulus hiányában, az anti-apoptotikus Bcl-2 proteinek megkötik és gátolják a BH123 proteint a mitokondriális membrán külső felszínén (és a citoszólban is). (B) Az apoptotikus stimulus hatására, a BH-3 only proteinek az anti-apoptotikus Bcl-2 proteinekhez kötődnek, s ezért a továbbiakban nem lesznek képesek gátolni a BH123 proteineket, amelyek így aktiválódnak és aggregálódnak a mitokondriális membránon és serkentik a mitokondrium membránok közötti tér részében elhelyezkedő proteinek kibocsátását a citoszólba. Néhány aktivált BH3-only protein képes a BH123 proteinekhez való közvetlen kapcsolódással is stimulálni ezeknek a proteineknek a mitokondriumból való kibocsátását. Kaszpáz inhibítorok és aktivátorok (DIA 7) az iniciátor kaszpázok véletlenül aktivizálódhatnak, s így ok nélkül is megölhetik a sejtet. Ezért fontos, hogy legyenek olyan mechanizmusok, amelyek kiszűrik az ilyenfajta zajokat. Az apoptózis proteinek inhibítora (IAP; inhibitor of apoptosis proteins) a kaszpázokat kétféleképpen gátolja: (1) a kaszpáz aktív helyéhez kapcsolódik, s ezáltal blokkolja a szubsztrátjához való hozzáférést; (2) néhány IAP ubikvitin ligáz is egyben, s így lebontásra kijelöli a kaszpáz molekulát. Ha az IAP molekulák inaktiválják a kaszpázokat, akkor hogyan képes az apoptózis valaha is inicializálódni? Úgy, hogy a sejtek IAP-gátló molekulákat is termelnek. Ilyen molekula pl. a DIABLO (más néven smac; second mitochondrial activator of caspases). A DIABLO normálisan a mitokondriumban van jelen, csak az apoptózis beindulásakor szabadul ki a citoplazmába, s ekkor inaktiválja az IAP molekulákat, ami a kaszpázok aktivizálódásához vezet. Az IAP-k és anti-IAP-k szerepe az apoptózisban (DIA 8) (A) Apoptotikus stimulus hiányában az IAPk megakadályozzák a véletlenszerű apoptózist, amit a kaszpázok spontán aktivizálódása indítana el. Néhány IAP egyben ubikvitin ligáz is, melyek a kaszpázokat proteaszómákban való degradációra jelölik ki. (B) Amikor az apoptotikus szignálok aktiválják a belső jelutat, a mitokondrium membránok közötti részéből kibocsátott fehérjék között vannak az anti-IAP proteinek, amelyek megkötik és blokkolják az IAP-k aktivitását. Ugyanebben az időben, a kibocsátott citokróm C az apoptoszómák összeállását váltja ki, amelyek aktiválják a kaszpáz kaszkádot, s végül apoptózishoz vezetnek. Az ER stressz (DIA 9) Nyugalmi állapotban a pro-apoptotikus Bax és Bak (Bax/Bak) fehérjéket a Bcl-2 inaktív állapotban tartja a mitokondrium és az endoplazmás retikulum (ER) membránjain, míg a Bim (BH3) a dinein citoszkeleton molekulához kötött, tehát gátolt állapotban, van jelen. A súlyos ER stressz a c-Jun N-terminális kináz (JNK) aktiválásához és a C/EBP homológ protein (CHOP; iniciációs EXTRA KÖVETELMÉNY
16. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
3
2. Apoptózis fázis) indukciójához. Mind a JNK és a CHOP megszünteti az Bcl-2 anti-apoptotikus hatását; a CHOP blokkolja a BCL2 expresszióját, míg a JNK foszforilálja azt. A JNK szintén foszforilálja a Bim-et, ami annak citoszkletetontól való elválását és egyben az aktiválódását okozza (elkötelezettségi fázis). Ezek a változások aktivizálják a Bax és Bak proteineket, s ezáltal a jel átvitelét az ER-től a mitokondrium felé, mely végül véghezviszi az apoptózist (kivitelezési/kivégzési fázis). A kaszpázok valószínűleg magán az ER membrán felszínén és az apoptoszómában is aktivizálódnak, miután a halál jelek (Ca2+, kaszpáz 12 és egyéb) a mitokondriumba kerültek és a citokróm c kiszabadult. A 9b dián a kék jel az inaktív, a piros jel az aktív molekulákat jelöli; a kerekített formák a pro-apoptotikus, míg a szögletes formák az anti-apoptotikus molekulákat jelölik. ATF6, activating transcription factor 6; IRE1, inositol-requiring enzyme 1; PERK, pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase; TRAF2, TNF-receptor-associated factor 2; UP, uniporter, C12, caspase 12.
(II.) A halál receptor (külső) útvonalat (DIA 10) a FASL (vagy TRAIL) ligand halál receptorokhoz (FAS; DR4 vagy DR5) való kapcsolódása aktiválja. Egyes citokinek és a TNF saját receptorokhoz való kapcsolódása is apoptózist idézhet elő. A ligandok kapcsolódása mindegyik esetben a receptorok aggregálódásával (több receptor molekula összekapcsolódásával) jár, ami FADD és a kaszpáz 8 (Casp 8) molekulák receptorhoz való kapcsolódását eredményezi. A Casp 8 autokatalitikus módon aktiválja saját magát (levág magáról egy peptidet; iniciátor kaszpáz), majd az aktív Casp 8 a Casp 3 proteolitikus vágását végzi, amely több pro-apoptotikus folyamatot indít el, pl. a CAD (kaszpázaktiválta DNáz) stimuláció, amely DNS degradációt okoz. A halál receptorok apoptotikus jeleket közvetítenek, melyeket olyan specifikus ligandok iniciálnak, mint pl. a Fas ligand, a TNF és a TRAIL. Ezek a ligandok másodpercek alatt aktiválják a kaszpáz kaszkádot. A ligand kapcsolódása a halál receptorhoz lipid raft fúzióhoz vezet, ami a halál receptorok csoportosulását eredményezi. A receptor csoportosulás fontos a jel amplifikáció szempontjából. A ligand kötődés a receptor intracelluláris doménjében (halál domén) konformáció változást idéz elő, ami különböző apoptotikus proteinek receptorhoz való kapcsolódását teszi lehetővé. A halál domén és a hozzákapcsolódó proteinek komplexét DISC-nek (Death Inducing Signaling Complex) nevezzük. E folyamat utolsó lépése valamelyik kaszpáz (rendszerint a casp 8, ritkábban casp 10) DISC-hez való kapcsolódása, ami az apoptózis inicializálásához vezet. A halál receptorok működése egyszerűbb, mint a TNFR-é: a FADD közvetlenül (TRADD nélkül) is verbuválódhat a halál receptorokhoz. TNF receptor (TNFR) jelfolyamat A tumor nekrózis faktort (TNF)-a T-sejtek és az aktivált makrofágok termelik fertőzés hatására. A TNF a TNF receptorhoz (TNFR) kapcsolódik, s ez kapcsolódás többféle jelfolyamatot is beindíthat: (1) Néhány sejtben az NF-kB és AP-1 aktivációját eredményezi, ami sok gén indukciójával jár. (2) Más sejtekben azonban, a TNF apoptózist is indukálhat, bár a TNF kapcsolódása a TNFR-hez önmagában ritkán elég az apoptózis inicializálására (a Fas ligand kötődés elegendő erre). A TNF-TNFR kapcsolódás a receptor trimerizációját okozza, amely lehetővé teszi az intracelluláris adapter molekula, a TRADD (TNFRassociated death domain) kapcsolódását a halál doménekhez. TRADD azzal a képességgel rendelkezik, hogy több különböző proteint képes magához vonzani. A TRAF2 (TNF-associated factor 2) verbuválása pl. az NF-kB útvonal inicializálásához vezet. A TRADD kapcsolódhat a FADD-hoz is, amely apoptózis indukálhat azáltal, hogy odaverbuválja és elhasítja a prokaszpáz 8 molekulákat. A külső jelút erősítése (DIA 11) A halál receptorok, szemben a TNF receptorokkal, csak az apoptózisban játszanak szerepet. Az apoptózis külső útvonalát erősítheti a belső jelúttal való kapcsolódás. E folyamat során a kaszpáz 8 aktiválja a Bid regulátor proteint (t-Bid keletkezik), amely a Bax/Bak fajtorok aggregálásához vezet. A jelút során aktiválódott kaszpáz 9 aktiválja a kaszpáz 3 molekulákat. Nincs túlélési szignál - A PI 3 kináz/Akt útvonal (DIA 12) az apoptózisban játszik szerepet. Egy extracelluláris túlélési szignál (pl. IGF, insulin-like growth factor) aktivál egy receptor tirozin kinázt (RTK), amely magához vonzza és aktiválja a PI 3-kinázt. A Pi 3 kináz a PIP-2-t PIP3-á alakítja, amely ezáltal a membránban egy dokkoló helyet képez két szerin/treonin kináz számára: ezek a PDK1 EXTRA KÖVETELMÉNY
16. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
4
2. Apoptózis (phoshoinositol-dependent kinase) és az Akt. Az Akt egy harmadik kináz (mTOR) által foszforlilálódik a szerin aminosaván, s ezáltal úgy változik meg a térszerkezete, hogy a PDK1 foszforilálni képes egy treonin aminosavát, s ez aktivizálja az Akt-ot. Az aktivált Akt disszociál a plazma membránról, és különféle célfehérjéket foszforilál, pl. a BAD gátló fehérjét. Nem-foszforilált állapotban a BAD egy vagy több inaktív állapotban lévő apoptózis-gátló faktort köt magához. A foszforilációt követően a BAD elengedi az apoptózist gátló fehérjét (pl. az Akt-ot), amely most már képes blokkolni az apoptózist, és ezáltal elősegíti a sejt túlélését - a BAD-et egy a citoplazmában általánosan előforduló fehérjéhez (14-3-3) tartja inaktív állapotban. Ha nem érkezik túlélési szignál, - mert pl. a sejt éhezik,akkor az apoptózist gátló faktorok BAD-hez kötött (tehát inaktív) állapotban maradnak, s bekövetkezik a programozott sejthalál. 3 mód, ahogy a túlélési faktorok gátolják az apoptózist (DIA 13) A túlélési szignálok az itt ismertetett módokon kívül, még legalább kétféleképpen képesek gátolni az apoptózist. A p53 protein szerepe az apoptózisban (DIA 14, 15) Sok sejttípusban, a p53-közvetítette szaporodásgátlás a p21 faktor indukciójától függ. A p21 a ciklin-dependens kináz gátló molekulája. Ha hiba történik a p53 általi p21 transzaktivációban, az kontrollálatlan sejt-szaporodáshoz, tumorok kialakulásához, vezethet. (1) A citoszólikus p53 útvonal a sejtmagi p53 a Puma faktor indukcióját eredményezi, ami aktiválja a citoszólban lévő p53 molekulát, azáltal, hogy elválasztja a Bcl-XL-től. Ezt követően, a citoszólikus p53 indukálja a Bax oligomerizálódását és mitokondriumba való transzlokációját. (2) Mitochondriális apoptotózis útvonal A mitokondriumban a p53 a Bax és Bak oligomerizációját okozza, ami a Bcl-2 és Bcl-XL antiapoptotikus hatásával antagonista (ellentétes) hatású (tehát proapoptotikus). A p53 molekula a ciklofilin D-vel komplexet képez a mitokondrium belső membránjában. Ezek a változások a mitokondrium membrán sérülését okozzák, ami a proaptotikus faktorok citoszólba való ürüléséhez vezet. MPT, mitochondrial permeability transition; U, ubiquitin.
EXTRA KÖVETELMÉNY
16. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
5
