AKTIVITAS ANTIHIPERGLIKEMIA EKSTRAK AIR DAUN SURIAN (Toona sinensis) PADA TIKUS PUTIH (SPRAGUEDAWLEY) YANG DIINDUKSI STREPTOZOTOSIN
YAHYA RAMADHANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Daun Surian (Toona sinensis) pada Tikus Putih (Sprague-dawley) yang Diinduksi Streptozotosin adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Januari 2017 Yahya Ramadhani NIM G84120050
ABSTRAK YAHYA RAMADHANI. Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Daun Surian (Toona sinensis) pada Tikus Putih (Sprague-Dawley) yang Diinduksi Streptozotosin. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan MEGA SAFITHRI.
Daun surian telah banyak digunakan sebagai obat tradisional dalam mengatasi berbagai macam penyakit. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak daun surian secara in vitro memiliki beberapa efek farmakologi berupa antikanker, antihiperlipidemia, dan antihiperglikemia. Namun, penelitian terkait antihiperglikemik secara in vivo masih sangat sedikit dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan adanya aktivitas antihiperglikemia ekstrak air daun surian pada tikus (Sprague-dawley) yang diinduksi streptozotosin yang ditentukan berdasarkan kadar glukosa darah, kadar insulin, serta histopatologi pankreas tikus. Tikus yang digunakan berjumlah 15 ekor yang terbagi ke dalam 5 kelompok perlakuan, yakni normal, positif, negatif, DA200 (dosis ekstrak 200 mg/kg), DA400 (dosis ekstrak 400 mg/kg). Kandungan fitokimia yang terkandung dalam ekstrak air daun surian diantaranya flavonoid, tanin, fenol hidrokuinon, saponin, dan glikosida. Ekstrak air daun surian tidak menunjukkan adanya penurunan kadar glukosa darah, namun mampu menginduksi regenerasi sel β yang diindikasikan dengan peningkatan kadar insulin hewan coba dan histopatologi pankreas. Kelompok DA200 lebih efektif dibandingkan DA400 dalam melakukan regenerasi sel dan penghambatan stres oksidatif maupun kerusakan sel pankreas. Kata kunci: Ekstrak daun surian, tikus Sprague–Dawley, antihiperglikemia, glukosa darah, insulin, histopatologi pankreas
ABSTRACT YAHYA RAMADHANI. The Activity of Surian leaves (Toona sinensis) Aqueous Extract as Antihyperglicemic Agent on White Rat (Sprague-Dawley) Induced Streptozotocin. Supervised by SYAMSUL FALAH and MEGA SAFITHRI. Surian leaves have been widely used to cure various diseases traditionally. Previous researches showed that the surian leaves extract has several pharmacological effects such as anticancer, antihyperlipidemic, and antihyperglicemic agent by in vitro method. However, researches about antihyperglycemic agents are still limited. The purpose of this study is to prove the existence of the antihyperglicemic activity of surian leaves aqueous extract on Sprague-Dawley rats induced by streptozotocin, based on blood glucose level, insulin level, and pancreatic histopathology of rats. Fifteen rats were used and devided into 5 groups: normal, positive, negative, DA200 (extract dose of 200 mg/kg), DA400 (extract 400 dose mg/kg). Phytochemical subtances contained in surian leaves aqueous extracts are flavonoids, tannins, phenols hydroquinone, saponins, and glycosides. Surian leaves aqueous extracts did not show to decrease in blood glucose levels, but it was able to induce the regeneration of βcells, indicated by increased insulin level and pancreatic histopathology. DA200 is more effective than DA400 in regenerating cells and inhibiting either oxidative stress and pancreatic cells damage. Key words: Surian leaves extract, Sprague–Dawley rats, antihyperglycemic, blood glucose, insulin, pancreatic histopathology
AKTIVITAS ANTIHIPERGLIKEMIA EKSTRAK AIR DAUN SURIAN (Toona sinensis) PADA TIKUS PUTIH (SPRAGUEDAWLEY) YANG DIINDUKSI STREPTOZOTOSIN
YAHYA RAMADHANI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
Judul Skripsi : Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Daun Surian (Toona sinensis) pada Tikus Putih (Sprague-Dawley) yang Diinduksi Streptozotosin Nama : Yahya Ramadhani NIM : G84120050
Disetujui oleh
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi Pembimbing I
Dr Mega Safithri, SSi, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah sebagai ungkapan rasa syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT dengan segala rahmat dan hidayah-Nya telah memberikan kekuatan, kesehatan dan keteguhan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Daun Surian (Toona Sinensis) pada Tikus Putih (Sprague-Dawley) yang Diinduksi Streptozotosin”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada program studi Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Syamsul Falah selaku pembimbing I dan Ibu Mega Safithri, selaku pembimbing II yang telah banyak memberikan arahan, kritikan, saran, dan motivasi kepada penulis dalam melakukan penelitian dan penyusunan skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua beserta saudara atas do’a dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis selama penyusunan skripsi ini. Terima kasih juga kepada Aida, Arifa, Enni, Iqbal, Listia, dan Melati atas kerja sama dan dukungannya dalam penelitian ini, serta kepada teman-teman Biokimia 49 atas semangat, kebersamaan, dan bantuannya. Penulis menyadari bahwa tidak ada manusia yang sempurna, sama halnya dengan karya tulis ini yang sekiranya masih memiliki banyak kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi para pembaca, khususnya penulis, Aamin.
Bogor, Januari 2017
Yahya Ramadhani
DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN METODE Waktu dan Tempat Bahan Alat Prosedur HASIL Rendemen dan Kandungan Senyawa Fitokimia Ekstrak Air Daun Surian Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Kadar Glukosa Darah Kadar Insulin Histopatologi Pankreas PEMBAHASAN Rendemen dan Kandungan Senyawa Fitokimia Ekstrak Air Daun Surian Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Kadar Glukosa Darah Kadar Insulin Histopatologi Pankreas SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
viii viii viii 1 2 2 2 2 3 6 6 7 8 9 9 10 11 12 13 15 16 18 18 18 18 24 38
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5
Perubahan bobot badan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Perubahan konsumsi pakan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Hubungan antara kadar glukosa darah dengan masa perlakuan Kadar insulin tikus masing-masing kelompok perlakuan Pewarnaan hematoksilin-eosin jaringan pankreas
7 8 9 9 10
DAFTAR TABEL 1 Pembagian kelompok dan jenis perlakuan hewan model 2 Kandungan senyawa fitokimia ekstrak air daun surian 3 Pengaruh perlakuan terhadap kadar glukosa darah tikus
4 7 8
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Diagram alir penelitian Rendemen ekstrak air daun surian Senyawa fitokimia ekstrak air daun surian Bobot badan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Hasil analisis statistika bobot badan tikus (Uji T) Konsumsi pakan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Kadar glukosa darah puasa selama perlakuan Hasil analisis statistika kadar glukosa darah (ANOVA dan Uji T) Kadar insulin tikus Hasil analisis statistika kadar insulin (ANOVA) Histopatologi Pankreas
25 25 26 27 27 29 30 30 35 36 37
1
PENDAHULUAN Diabetes melitus (DM) adalah gangguan metabolisme yang ditandai oleh hiperglikemia dan berhubungan dengan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak, protein yang terjadi akibat penurunan sekresi insulin atau penurunan sensitivitas insulin atau keduanya yang dapat menyebabkan komplikasi kronis mikrovaskuler, makrovaskuler dan neuropati (Sukandar et al. 2008). Umumnya, penyakit diabetes melitus disebabkan oleh rusaknya sebagian kecil atau sebagian besar dari sel β pulau Langerhans pada pankreas yang berfungsi menghasilkan insulin, sehingga mengakibatkan terjadinya kekurangan insulin. Selain itu, diabetes melitus juga dapat terjadi akibat adanya gangguan terhadap fungsi insulin dalam membantu pemasukkan glukosa ke dalam sel yang salah satunya disebabkan oleh faktor kegemukan (Suriani 2012). Penyakit ini diketahui tidak menular, bersifat kronis, dan cukup berbahaya karena dapat menimbulkan komplikasi, kerusakan jangka panjang dan disfungsi beberapa organ (ADA 2015). Jumlah penderita diabetes terus mengalami peningkatan dari tahun ke tahun. Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) pada tahun 2007 menunjukkan jumlah penderita diabetes sebesar 7 juta jiwa yang mengalami peningkatan hampir dua kali lipat pada tahun 2013 yakni sebesar 13 juta jiwa (Kemenkes 2014). Selama periode 2005-2008 tercatat sekitar 4.2 juta (28.5%) penderita diabetes usia 40 tahun keatas mengalami retinopati, 228924 penderita mengalami gagal ginjal pada tahun 2011, dan pada tahun 2010 terjadi 73000 kasus amputasi akibat diabetes. World Health Organization (WHO) pada tahun 2011 juga melaporkan bahwa terdapat sekitar 3.4 juta penduduk dunia meninggal dunia akibat penyakit yang berhubungan dengan hiperglikemia, dan 2.2% penduduk dunia meninggal akibat diabetes melitus pada tahun 2008 (WHO 2011). Penanganan terhadap penyakit diabetes sangatlah penting untuk dilakukan. Dewasa ini, diabetes melitus dapat ditangani secara modern, yakni dengan cara terapi insulin, injeksi insulin secara rutin, transplantasi islet pankreas, dan menggunakan sel punca manusia (Jiang et al. 2007), serta konsumsi obat golongan penghambat kinerja enzim α-glukosidase dan metformin (ADA 2015). Penggunaan dan konsumsi obat herbal dalam penanganan diabetes merupakan langkah yang baik dan tepat untuk dilakukan. Secara tradisional, banyak tanaman yang berkhasiat menurunkan kadar glukosa darah. Namun, penggunaan tanaman obat tersebut umumnya hanya berdasarkan pengalaman atau hipotesis secara empiris, dan belum didukung oleh adanya penelitian untuk uji klinis dan farmokologi (Winarto 2003). Surian merupakan tanaman yang termasuk ke dalam famili Meliaceae dengan genus Toona. Tanaman ini dikenal dengan nama Suren (Jawa), Surian (Kalimantan) atau Mapala/Molopaga (Sulawesi). Bagian tanaman surian khususnya kulit kayu dan daunnya dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat tradisional seperti tonik, obat diare, antibiotik, antikanker, dan antihiperglikemia (Chia et al. 2007; Sari et al. (2011a dan 2011b). Beberapa penelitian sebelumnya yang dilakukan secara in vitro menunjukkan bahwa tanaman surian dapat digunakan sebagai agen antidiabetes, salah satunya dengan menghambat aktivitas enzimatis α-glukosidase (Hsieh et al. 2012, Zhao et al. 2009, Wang et al. 2008, Yin et al. 2014). Penelitian yang dilakukan oleh Manurung (2016) juga
2
menyebutkan bahwa kandungan fitokimia yang terdapat pada daun surian mampu menginhibisi α-glukosidase melalui mekanisme inhibisi non-kompetitif. Aprianthi et al. (2006) menunjukkan bahwa daun surian mengandung flavonoid, tanin dan steroid. Penapisan fitokimia ekstrak air daun surian dengan metode kromatografi lapis tipis menunjukkan adanya kandungan alkaloid, flavonoid, dan polifenol (Yuhernita dan Juniarti 2011). Penelitian terkait dengan potensi ekstrak air daun surian sebagai antihiperglikemia pada tikus galur Sprague-Dawley merupakan tahap awal yang penting dalam penapisan obat antidiabetes belum pernah dilakukan. Berdasarkan hal tersebut, perlu dilakukannya penelitian mengenai aktivitas eksrak air daun surian sebagai antihiperglikemik. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan adanya aktivitas antihiperglikemia ekstrak air daun surian pada tikus yang diinduksi streptozotosin. Aktivitas tersebut dapat ditentukan berdasarkan kadar glukosa darah, kadar insulin serta histopatologi pankreas tikus. Pengujian histopatologi pankreas dilakukan untuk menentukan efek ekstrak dalam regenerasi sel β pankreas tikus.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Agustus sampai Oktober 2016. Pemeliharaan dan perlakuan hewan coba bertempat di Unit Kandang Hewan Percobaan Pusat Studi Biofarmaka Tropika. Pembuatan ekstrak, analisis fitokimia, dan pengujian kadar insulin dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor. Analisis histopatologi pankreas dilakukan di Balai Besar Veteriner Bogor. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam ekstraksi meliputi simplisia daun surian (umur tanaman 15 tahun dan berasal dari Sumedang), akuades, dan kertas saring. Bahan-bahan yang digunakan dalam perlakuan dan pemeliharaan hewan coba adalah tikus galur Sprague-Dawley (VSTEM, Bogor), pakan standar tikus (Bravo®, Indonesia) dengan komposisi protein (19-21%), lemak (5%), serat (5%), kalsium (0.9%), fosfor (0.6%), 900 IU/kg vitamin A, 1800 UI/kg vitamin D3, 80 IU/kg vitamin E, dan 800 mg/kg vitamin C (CP Rodent, Thailand), dan sekam. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis glukosa darah, insulin, dan histopatologi pankreas meliputi streptozotosin (STZ) (Sigma Aldrich®, USA), bufer sitrat, glibenklamida, ketamina, xilazina, Qayee Bio®, Insulin Rat Kit, bufer netral formalin (BNF) 10%, alkohol, xilol, hematoksilin, eosin, dan parafin. Alat Alat-alat yang digunakan dalam ekstraksi adalah penangas air, pendingin tegak, erlenmeyer, neraca analitik, dan gelas ukur. Alat-alat yang digunakan
3
dalam perlakuan dan pemeliharaan hewan coba adalah kandang hewan coba UKHP PSB, sonde, jarum suntik, pisau bedah, dan neraca analitik. Alat-alat yang digunakan untuk analisis glukosa darah, insulin, dan histopatologi pankreas meliputi glukometer Accu-Check® (provider), jarum suntik OneMed® (provider), alat bedah, sentrifus, SPECTROstar® Nano (BMG, Jerman), pipet mikro, microplate, kaca preparat, mikroskop, mikrotom, dan Tissue-Tek® (provider). Prosedur Penyiapan Simplisia (Sari et al. 2011) Daun surian terlebih dahulu dikeringanginkan hingga membentuk tekstur yang kering dan mudah hancur. Daun surian kering digerus dan digiling menggunakan Willey Mill hingga dihasilkan ukuran potongan daun yang kecil. Serbuk daun diayak menggunakan ayakan yang berukuran 40-60 mesh. Simplisia disimpan di dalam wadah plastik untuk digunakan nantinya. Ekstraksi Daun Surian (modifikasi Saryana 2014) Sebanyak 30 g simplisa daun surian dimasukkan ke dalam labu bulat beralas berukuran 500 mL. Sebanyak 300 mL akuades ditambahkan sehingga semua bahan terendam kemudian direfluks selama 1 jam pada suhu 90 oC. Hasil refluks disaring dan dipindahkan ke labu erlenmeyer lain sedangkan residu kembali direfluks dengan cara yang sama sebanyak 2 kali. Filtrat hasil refluks diuapputarkan dan dikeringbekukan sehingga didapat serbuk ekstrak. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen melalui persamaan berikut (Sani et al. 2014). endemen
obot ekstrak gram obot simplisia gram
100
Penapisan Fitokimia (Harborne 2006) Alkaloid. Sebanyak 0.025 gram sampel ditambahkan 10 mL kloroform dan 3 tetes amonia. Fraksi kloroform diambil dan diasamkan dengan 1 mL H2SO4 pekat. Fraksi asam diteteskan ke 3 plat tetes untuk ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan merah pada penambahan Dragendorf, endapan putih pada penambahan Meyer, dan endapan coklat pada penambahan Wagner. Kontrol positif yang digunakan adalah daun tapak dara. Flavonoid, tanin, dan saponin. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan 10 mL akuades dan dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Filtrat dibagi ke dalam tiga tabung. Tabung pertama untuk uji flavonoid dengan ditambahkan serbuk magnesium, 1 mL HCl, dan 1 mL amil alkohol. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna merah pada fraksi amil alkohol. Daun meniran digunakan sebagai kontrol positif. Tabung kedua untuk uji tanin dengan ditambahkan FeCl3. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna kehitaman. Teh digunakan sebagai kontrol positif. Tabung ketiga untuk uji saponin. Tabung dikocok kuat-kuat dan hasil positif ditunjukkan dengan adanya buih yang stabil. Fenolik hidrokuinon. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan 10 mL etanol 96% dan dipanaskan 1 menit kemudian disaring. Beberapa tetes filtrat dipindahkan ke plat tetes dan ditambahkan 3 tetes NaOH. Hasil positif ditandai dengan filtrat berwarna merah. Kayu manis digunakan sebagai kontrol positif.
4
Steroid dan triterpenoid. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan 10 mL etanol 96% dan dipanaskan 1 menit kemudian disaring. Filtrat dididihkan hingga pelarut menguap. Sebanyak 1 mL eter ditambahkan ke dalam hasil penguapan. Sebanyak beberapa tetes campuran dipindahkan ke cawan pinggang dan ditambahkan 3 tetes H2SO4 pekat dan 3 tetes asam asetat anhidrat. Semburat warna merah atau ungu menunjukkan hasil positif untuk triterpenoid dan semburat warna hijau menunjukkan adanya steroid. Daun katuk digunakan sebagai kontrol positif steroid, sedangkan kunyit digunakan sebagai kontrol positif triterpenoid. Glikosida. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan akuades 5 mL dan disaring. Sebanyak 1 mL pereaksi Benedict ditambahkan ke dalam 1 mL filtrat. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan berwarna merah bata atau jingga. Madu digunakan sebagai kontrol positif. Hewan Model dan Rancangan Percobaan (Prabowo 2012) Tikus diadaptasi selama satu minggu dalam kandang individual dengan kondisi ruang bersuhu 26-28 °C, kelembaban 75-95%, dan 12 jam terang/gelap. Tikus tersebut diberi air secara ad libitum dan pakan standar 20 gram per ekor. Bobot badan didata setiap satu minggu sekali, dan sisa pakan didata setiap hari. Sebanyak 15 ekor tikus berbobot badan 200-250 gram dibagi ke dalam 5 kelompok secara acak (Tabel 1). Induksi STZ dan bufer sitrat dilakukan secara intraperitoneal pada hari ke-0 (H0), STZ dilarutkan dalam 50 mM bufer sitrat pH 4.5. Dosis STZ yang digunakan berdasarkan hasil preliminary test. Pencekokkan ekstrak dan obat dilakukan selama 14 hari setelah 48 jam diinduksi diabetes. Bobot badan ditimbang satu minggu sekali dan sisa pakan ditimbang setiap hari. Pengambilan darah dilakukan pada H0 atau sebelum induksi STZ sebagai darah normal, 2 hari setelah induksi STZ sebagai darah diabetes, hari ke-7 dan ke14 setelah pencekokkan (hari ke-0, 2, 9, dan 16). Darah yang diambil adalah darah puasa, tikus dipuasakan selama 16 jam terlebih dahulu sebelum pengambilan darah. Sebanyak satu tetes darah diambil melalui ujung ekor untuk H0 dan H9, sedangkan pada H2 diambil 0.5 mL darah melalui ekor, dan pada H16 diambil sebanyak 3 mL melalui vena portal hepatika. Tikus dibius pada H16 menggunakan ketamina dan xilazina (80 mg/kg BB, 20 mg/kg BB), dibedah untuk diambil darah melalui vena portal hepatika sebanyak 3 mL, dan dieutanasia dengan metode eksanguinasi untuk diambil pankreasnya. Penelitian dilakukan di bawah pengawasan Komisi Etik Hewan Institut Pertanian Bogor. Tabel 1 Pembagian kelompok dan jenis perlakuan hewan model Kelompok Normal Kontrol Positif (KP) Kontrol Negatif (KN) Daun Air 200 (DA200) Daun Air 400 (DA400)
Jumlah Tikus (ekor) 3 3
Perlakuan Induksi Cekok 1 mL bufer sitrat 50 mM Akuades 1 mL/hari Glibenklamida 5 40 mg/kg BB STZ mg/kg BB/hari
3
40 mg/kg BB STZ
Akuades 1 mL/hari
3
40 mg/kg BB STZ
Ekstrak air daun surian 200 mg/kg BB/hari
3
40 mg/kg BB STZ
Ekstrak air daun surian 400 mg/kg BB/hari
5
Pengukuran Kadar Glukosa Darah (Du et al. 2012) Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada hari ke-0, 2, 9, dan 16 selama masa perlakuan. Sebelum pengambilan darah, tikus dipuasakan selama 16 jam terlebih dahulu. Sesaat sebelum pengambilan darah, ujung ekor tikus dibersihkan dahulu dengan alkohol 70%, kemudian ujung ekor tikus ditusuk dengan jarum hingga berdarah. Tetesan darah yang diperoleh segera diteteskan ke strip glukometer yang telah dipasang pada alat glukometer Accu-Check®. Pengukuran Kadar Insulin (Qayee Bio 2016) Preparasi Sampel. Sampel darah H16 disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, jari-jari rotor yang digunakan adalah 12 cm. Serum disimpan dalam suhu -20 °C sebelum dianalisis. Preparasi Pereaksi. Larutan pembilas, standar, enzim, pelarut standar, pelarut sampel, dan kromogen dicairkan pada suhu ruang. Sebanyak 20 mL konsentrat bufer pembilas 20x dilarutkan dalam 400 mL akuades. Larutan ini stabil untuk 4 minggu pada suhu ruang. Prosedur Uji. Sebanyak 50 µL standar dengan konsentrasi 200, 100, 50, 25, 12.5, dan 0 µIU/mL disiapkan di dalam sumur microplate, pengenceran bertingkat dilakukan dengan pelarut standar. Sebanyak 50 µL pelarut standar juga dimasukkan ke dalam sumur sebagai blanko. Sebanyak 10 µL sampel serum darah dimasukkan ke dalam mikroplat dan ditambahkan 40 µL pelarut spesial. Sebanyak 50 µL horseradish peroxidase dimasukkan ke dalam setiap sumur kemudian microplate ditutup dengan menggunakan plate sealer dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Isi microplate dibuang dan dibilas dengan 350 µL larutan pembilas sebanyak 5 kali dan dikeringkan dengan posisi terbalik di atas kertas saring. Sebanyak 10 µL kromogen A dan 10 µL kromogen B dimasukkan ke setiap sumur. Microplate ditutup dengan menggunakan plate sealer dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 10 menit. Sebanyak 50 µL larutan stop dimasukkan ke dalam masing-masing sumur sehingga terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning. Jangka waktu pembacaan absorbansi setelah pemberian larutan stop maksimal 15 menit. Larutan dibaca absorbansinya menggunakan SPECTROstar® Nano dengan protokol ELISA reader dengan panjang gelombang 450 nm. Histopatologi Pankreas (Prabowo 2012) Nekropsi, Pengambilan Sampel, dan Fiksasi Pankreas Tikus. Pankreas dicuci dengan BNF 10% setelah pembedahan kemudian direndam dalam BNF 10% selama minimal 3 hari. Pankreas diiris setebal ±3 mm, dan dimasukkan ke dalam kaset tissue berlabel dan siap untuk didehidrasi. Dehidrasi dan Penjernihan Sampel. Kaset tisu yang berisi sampel dimasukkan ke dalam keranjang dan ditempatkan pada alat tissue-processor otomatis. Proses dehidrasi pada alat ini dilakukan dengan alkohol konsentrasi bertingkat dengan urutan alkohol 70%, alkohol 80% (2 kali pada larutan yang berbeda), alkohol 90%, alkohol 96%, dan alkohol absolut (2 kali pada larutan yang berbeda), kemudian wax masing-masing selama 1 jam. Kaset tissue kemudian divakum dan di oven dengan suhu 50 °C selama 24 jam. Embedding. Proses ini dilakukan dengan menggunakan alat tissue-tec. Embedding dimulai dengan memasukkan parafin cair ke dalam kaset tissue
6
(sebanyak seperempat bagian cetakan). Cetakan kemudian dipenuhi dengan parafin cair dan diberi label. Parafin dibiarkan membeku selama beberapa menit, dan kemudian dilepaskan dari cetakan. Pemotongan dengan Rotary Microtom. Setelah parafin membeku, dilakukan pemotongan pankreas setebal 4-5 μm dengan menggunakan rotary microtom. Hasil cetakan diletakkan di atas permukaan air yang dipanaskan sampai suhu 40 °C. Setelah itu potongan diletakkan pada preparat dan dikeringkan dalam inkubator selama 2 jam (minimal) pada suhu 56 °C. Pewarnaan Jaringan Pankreas. Sediaan yang diperoleh kemudian diwarnai dengan menggunakan pewarnaan Haematoxylin Eosin (HE) dengan urutan xilol (2 kali pada larutan yang berbeda) dan alkohol absolut masing-masing selama 2 menit, dan selanjutnya dengan alkohol 95%, alkohol 80%, lalu dicuci dengan air keran masing-masing selama 1 menit. Pewarnaan kemudian dilanjutkan ke tahap pewarnaan dengan menggunakan Mayer’s haematoxylin, lalu dicuci dengan urutan sebagai berikut: air keran (masing-masing selama 30 detik), litium karbonat (selama 15-30 detik), air keran (selama 2 menit), dan eosin (selama 2-3 menit). Pewarnaan kemudian dilanjutkan dengan mencuci sediaan dengan air keran selama 30-60 menit, dan mencelupkannya ke dalam alkohol 95% dan alkohol absolut (masing-masing sebanyak 10 kali), alkohol absolut (selama 2 menit), xilol (selama 1 menit), dan xilol (selama 2 menit). Setelah proses pewarnaan selesai, kaca preparat segera dikeringkan dan ditetesi dengan zat perekat albumin:gliserin (1:1), dan selanjutnya ditutupi dengan kaca objek. Preparat tersebut kemudian dilabel sesuai dengan dan diamati di bawah mikroskop cahaya. Analisis Statistika Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) lima kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan. Analisis beda nyata antarvariabel menggunakan Uji F (ANOVA) pada selang kepercayaan 95%, sedangkan analisis signifikansi perubahan glukosa dan bobot badan menggunakan Uji T berpasangan. Uji Duncan dilakukan untuk uji lanjut pada uji F. Analisis dilakukan menggunakan program SPSS 2.0.
HASIL Rendemen dan Kandungan Senyawa Fitokimia Ekstrak Air Daun Surian Ekstrak air daun surian didapatkan melalui proses ekstraksi dengan metode refluks yang menggunakan pelarut air. Rendemen yang dihasilkan pada ekstrak air daun surian memiliki nilai sebesar 29.56±7.81%. Data perhitungan rendemen ekstak air daun surian dapat dilihat pada Lampiran 2. Hasil pengujian kandungan fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak air daun surian mengandung flavonoid, tanin, fenol hidrokuinon, saponin, dan glikosida (Tabel 2). Gambar hasil pengujian fitokimia dapat dilihat pada Lampiran 3.
7
Tabel 2 Kandungan senyawa fitokimia ekstrak air daun surian Hasila
Hasil Reaksi
Kontrol positif
+ + + -
Tidak terbentuk endapan putih Tidak terbentuk endapan coklat Tidak terbentuk endapan merah Warna merah Warna hijau/biru kehitaman Warna merah Hijau
+ (daun tapak dara) + (daun tapak dara) + (daun tapak dara) + (daun meniran) + (daun teh) + (serbuk kayu manis) + (daun katuk)
Triterpenoid
-
Merah
Saponin Glikosida
+ +
Buih stabil Endapan merah bata
Senyawa fitokimia Alkaloid Meyer Wagner Dragendorf Flavonoid Tanin Fenol Hidrokuinon Steroid
a
+ (kunyit) + (daun kumis kucing) + (madu)
(+) = terdapat senyawa; (-) = tidak terdapat senyawa
Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Keberlangsungan proses adaptasi dan perlakuan ditentukan oleh salah satu faktor, yakni bobot badan. Perubahan bobot badan selama adaptasi maupun perlakuan ditujukkan pada Gambar 1. Peningkatan bobot tikus cukup signifikan selama masa adaptasi, yakni 1-12 % (Tabel 3). Penurunan bobot badan yang signifikan terjadi pada H2 setelah injeksi sterptozotosin pada setiap kelompok tikus (5-13 %), terkecuali kelompok normal yang tetap mengalami peningkatan bobot badan. Selama masa perlakuan, kelompok normal tetap mengalami peningkatan bobot badan, sedangkan kelompok lainnya terus mengalami penurunan bobot badan. Penurunan bobot badan yang signifikan terlihat pada kelompok kontrol negatif, DA200, dan DA400 (p<0.05) (Gambar 1). Konsumsi pakan untuk setiap kelompok perlakuan tikus mengalami peningkatan selama masa adaptasi dilakukan. Penurunan konsumsi pakan terjadi setelah injeksi streptozotosin, namun hanya bersifat sementara dan kembali mengalami peningkatan pada H+6 dan H+9 yang menunjukkan adanya kenaikan jumlah konsumsi pakan setiap kelompok tikus setelah diberikan perlakuan (Gambar 2).
Bobot badan (g)
270
Normal
250 Daun Air 400 mg/kg BB Kontrol Negatif
230 210
Daun Air 200 mg/kg BB Kontrol Positif
190 170 150 H-8
H-1
H+2 H+4 H+9 H+16 Hari perlakuan
Gambar 1 Perubahan bobot badan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan
8
Konsumsi pakan (g)
25
Daun Air 400 mg/kg BB Kontrol Negatif
20 15
Daun Air 200 mg/kg BB Kontrol Positif
10 5
Normal
0 H-8
H-1 H+3 H+6 H+9 H+12 H+15 Hari perlakuan
Gambar 2 Perubahan konsumsi pakan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Kadar Glukosa Darah Pengukuran kadar glukosa darah setiap kelompok tikus dilakukan pada hari ke-0, ke-2, ke-9, dan ke-16. Hari ke-0 merupakan kadar glukosa darah tikus semua kelompok sebelum diinjeksi streptozotosin dan masih berada di batas normal glukosa darah dengan nilai 61-94 mg/dL (Tabel 4). Kadar glukosa darah tikus selain kelompok normal mengalami kenaikan yang signifikan (214-324%) pada hari ke-2 setelah injeksi streptozotosin (p<0.05) (Gambar 3 dan Tabel 5) Pemberian perlakuan kemudian dilakukan pada setiap kelompok tikus yang mengalami diabetes dan kelompok normal Hasil yang didapatkan setelah 7 hari perlakuan (hari ke-9) menunjukkan adanya penurunan kadar glukosa darah sebesar 29.45% pada kelompok kontrol positif, namun tidak signifikan (p>0.05). Lain halnya dengan kelompok kontrol negatif, DA200, dan DA400 yang terus mengalami kenaikan kadar glukosa darah (Gambar 3) dengan persen kenaikan masing-masing sebesar 12.18%, 8.31%, dan 22.32% (Tabel 5). Kelompok normal pada hari ke-9 tetap berada pada batas glukosa darah normal dengan rentang 83108 mg/dL. Setelah 14 hari perlakuan (hari ke-16), kelompok kontrol positif kembali menunjukkan penurunan kadar glukosa darah sebesar 3.06% dari hari ke9 atau sebesar 31.62% dari hari ke-2 (Tabel 5). Kelompok kotrol negatif, DA200, dan DA400 tetap mengalami kenaikan dengan persentase masing-masing sebesar 11.35%, 14,82%, dan 20.08% dari hari ke-9. Kenaikan yang dialami oleh ketiga kelompok tersebut cukup signifikan (Gambar 3). Kelompok normal masih berada pada kadar glukosa darah normal dengan rentang 97-146 mg/dL (Tabel 4). Tabel 3 Pengaruh perlakuan terhadap kadar glukosa darah tikus Kelompok N KP KN DA200 DA400 a
H0 75.33 ± 11.85a 76.33 ± 9.29a 79.67 ± 5.51a 85.00 ± 21.38a 85.00 ± 7.94a
Kadar glukosa darah (mg/dL)a H2 H9 88.00 ± 19.31a 94.67 ± 12.58a,b 323.67 ± 143.91a 228.33 ± 175.80a 320.33 ± 65.32b 361.33 ± 61.10b 297.00 ± 21.66b 321.67 ± 69.97b 267.33 ± 47.86b 327.00 ± 29.87c
H16 128.67 ± 27.46b 221.33 ± 118.75a 402.33 ± 73.70b 369.33 ± 25.70b 392.67 ± 25.79d
Nilai dinyatakan dalam rata-rata ± SD (n=3). Huruf yang sama pada baris yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada taraf nyata 95% (p<0.05)
Kadar glukosa (mg/dL)
9
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
Kontrol Negatif Daun Air 200 mg/kg BB Daun Air 400 mg/kg BB Kontrol Positif Normal H0
H+2 H+9 Hari perlakuan
H+16
Gambar 3 Hubungan antara kadar glukosa darah dengan masa perlakuan Kadar Insulin
[Insulin] (mIU/mL)
Kadar insulin merupakan salah satu parameter penting dalam menentukan efek farmakologi dari suatu penelitian. Kadar insulin tikus yang diperoleh dapat dilihat pada Gambar 4. Kadar insulin antar kelompok tidak berbeda nyata pada taraf nyata 95% (p>0.05). Kelompok DA400 memiliki kadar insulin yang tertinggi dengan nilai 0.3147 mIU/mL yang kemudian disusul oleh kelompok kontrol negatif dengan dengan nilai kadar insulin sebesar 0.2127 mIU/mL, sedangkan kadar insulin terkecil ditunjukkan oleh kelompok kontrol positif dengan nilai 0.1596 mIU/mL (Gambar 4). Data pengujian dan kurva standar kadar insulin tikus dapat dilihat pada Lampiran 7. 0.5 [VALUE]±0.16a 0.45 0.4 0.35 0.3 [VALUE]±0.06a 0.25 [VALUE]±0.01a [VALUE]±0.03a 0.2 [VALUE]±0.02a 0.15 0.1 0.05 0 Normal Kontrol Positif Kontrol Negatif Daun Air 200 Daun Air 400 mg/kg BB mg/kg BB Perlakuan
Gambar 4 Kadar insulin tikus masing-masing kelompok perlakuan Histopatologi Pankreas Pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) dilakukan untuk melihat secara kualitatif morfologi umum jaringan pankreas tikus perlakuan. Gambaran
10
mikroanatomi sel pulau Langerhans yang berupa perubahan diameter sel Pulau Langerhans pada setiap kelompok perlakuan ditunjukkan pada Gambar 5. Angka 1 menunjukkan folikel pankreas, angka 2 menunjukkan pulau Langerhans. Kelompok normal menunjukkan bentuk sel yang normal dan terlihat tidak adanya kerusakan serta terdapat sel α dan β. Kerusakan sel terlihat pada kelompok kontrol negatif yang memperlihatkan adanya sel pulau Langerhans yang kosong dan berjumlah sedikit serta didominasi oleh sel α, sedangkan kelompok kontrol positif menggambarkan islet pankreas berukuran besar dan didominasi oleh sel α. Kelompok DA200 dan DA400 tidak menunjukkan adanya kelainan yang signifikan dan mengandung sel α dan β pada islet pankreasnya, namun lebih didominasi oleh sel α Gambar 5).
(a)
(b)
(b)
(d)
(e)
Gambar 5 Pewarnaan hematoksilin-eosin jaringan pankreas (x200). (a) Kelompok Normal; (b) Kelompok Kontrol Positif; (c) Kelompok Kontrol Negatif; (d) Kelompok DA200; (e) Kelompok DA400.
11
PEMBAHASAN Rendemen dan Kandungan Senyawa Fitokimia Ekstrak Air Daun Surian Ekstraksi daun surian menggunakan simplisia daun surian yang telah dihaluskan dan dikeringkan. Kandungan air simplisia daun surian diukur untuk mengetahui jumlah total kandungan air simplisia dalam satuan persen. Perhitungan kadar air yang dilakukan Manurung (2016) dengan ulangan sebanyak 3 kali pada sampel yang sama yakni simplisia daun surian menghasilkan nilai rata-rata kadar air sebesar 9.28%. Nilai tersebut menunjukkan hasil perhitungan yang baik dengan angka kadar air kurang dari 10%. Kadar air yang rendah mampu mencegah proses enzimatik dan kerusakan simplisia oleh mikroba (Safithri et al. 2016). Umumnya, bahan (simplisia) yang sudah kering memiliki kadar air ± 810 % (Sembiring 2007). Selain itu, nilai tersebut sesuai dengan kriteria Standar Nasional Indonesia untuk kategori rempah-rempah bubuk (BSN 1995). Tujuan utama ekstraksi pada tanaman obat adalah memperoleh senyawasenyawa bioaktif tanaman yang memiliki peran farmakologi dan menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak diinginkan melalui perlakuan dengan pelarut selektif (Tiwari et al. 2011). Metode refluks dipilih sebagai metode dalam melakukan proses ekstraksi simplisia daun surian dengan pelarut air. Penggunaan metode refluks diharapkan dapat mengekstraksi senyawa bioakif secara maksimal (Firdiyani et al. 2015). Penggunaan pelarut air bertujuan mengikat senyawa polar dengan baik (Haryadi 2012), yakni senyawa polar golongan flavonoid yang memiliki potensi sebagai antihiperglikemia, asam amino, gula, dan senyawa fitokimia lainnya (Sani et al. 2014). Pada metode refluks, simplisia dan pelarut ditempatkan pada wadah yang sama dan kemudian dipanaskan dengan suhu 90 °C. Fungsi pemanasan pada metode refluks adalah memaksimalkan proses ekstraksi metabolit sekunder. Ekstrak air daun surian yang didapatkan kemudian ditimbang untuk mengetahui rendemen ekstrak yang diperoleh. Rendemen hasil proses ekstraksi daun surian memiliki nilai rata-rata sebesar 29.56 ± 7.81% (Tabel 1). Hal tersebut menunjukkan bahwa rendemen yang dihasilkan cukup banyak dan memungkinkan terdapat banyak senyawa fitokimia yang berhasil terekstraksi. Pelarut air yang digunakan menyebabkan beberapa senyawa fitokimia dapat dengan mudah terekstrak dan menghasilkan rendemen yang cukup tinggi (Adhianata 2012; Melodita 2011). Hasil rendemen yang didapatkan tidak jauh berbeda dengan rendemen ekstrak daun surian pada penelitian sebelumnya (33.54%) (Haryadi 2012). Senyawa fitokimia merupakan senyawa golongan metabolit sekunder dalam tumbuhan yang memiliki fungsi tertentu. Daun surian mengandung banyak senyawa fitokimia yang memiliki banyak aktivitas farmakologi seperti antioksidan (Hseu et al. 2008), antihiperlipidemia (Hwei et al. 2008), antikanker (Chen et al. 2009), dan antidiabetes (Zhao et al. 2009). Analisis senyawa fitokimia daun surian dilakukan untuk menduga senyawa-senyawa fitokimia yang berperan terhadap aktivitas antihiperglikemik. Senyawa fitokimia yang diidentifikasi meliputi senyawa golongan alkaloid, flavonoid, tanin, fenol hidrokuinon, steroid, triterpenoid, saponin, dan glikosida.
12
Pengujian senyawa fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak air daun surian mengandung, flavonoid, saponin, tanin, fenolik hidrokuinon, dan glikosida (Tabel 2). Hasil ini sesuai dengan pernyataan Haryadi (2012) yang menyebutkan bahwa senyawa fitokimia yang bersifat lebih polar seperti fenol, flavonoid, dan tanin sebagian besar terekstrak ke dalam pelarut polar (air). Kepolaran senyawa fenol, flavonoid, dan tanin ini disebabkan oleh adanya gugus hidroksil pada senyawa tersebut. Berdasarkan hasil penelitian Chen et al. (2000), daun surian kaya akan senyawa flavonoid, alkaloid, terpen, dan antraquinon. Selain itu, Negi et al. (2011) juga melaporkan bahwa tumbuhan genus Toona mengandung senyawa fitokimia flavonoid, fitosterol, tanin, fenol, alkaloid, triterpen, dan antrakuinon. Steroid dan triterpenoid yang tidak teridentifikasi pada ekstrak air daun surian karena memiliki sifat kepolaran yang berbeda dengan pelarut yang digunakan. Hal tersebut dapat menyebabkan steroid dan triterpenoid tidak ikut terekstrak. Hal tersebut sesuai dengan penelitian Haryadi (2012) yang menyatakan bahwa senyawa-senyawa yang bersifat nonpolar seperti steroid dan triterpenoid akan terekstrak ke dalam pelarut yang bersifat nonpolar (n-heksana). Senyawa fenolik yang terkandung pada daun surian ini memiliki berbagai efek farmakologi, salah satunya adalah sebagai antidiabetes atau antihiperglikemik (Zhao et al. 2009). Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder yang sangat melimpah dan secara luas terdistribusi di dalam tanaman (Dai dan Mumper 2010). Senyawa flavonoid yang terkandung pada daun surian dan diduga mampu menurunkan kadar glukosa darah adalah rutin. Senyawa aktif ini berperan sebagai antioksidan yang dapat mencegah dan mengurangi radikal bebas dengan cara bereaksi langsung pada radikal bebas tersebut (Chattopadhyay dan Bandyopadhyay 2005). Dugaan ini juga didasari oleh hasil penelitian Hsu et al. (2014) yang menyatakan bahwa bahwa rutin yang merupakan senyawa golongan flavonoid dalam Toona sinensis memiliki efek farmakologi, yakni sebagai antihiperglikemia.
Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Masa adaptasi tikus dilakukan dengan tujuan memberikan penyesuaian terhadap keadaan kandang dan lingkungan sekitarnya, sehingga tikus dapat menyesuaikan diri dengan keadaan sekitarnya. Bobot badan yang terus meningkat mengindikasikan bahwa tikus merasa nyaman terhadap lingkungan dan memiliki kondisi fisik yang baik, terlebih jika disertai dengan konsumsi pakan yang baik. Bobot badan dan konsumsi pakan tikus diukur untuk memantau gejala klinis yang dialami tikus baik pada masa adaptasi maupun masa perlakuan. Peningkatan dan penurunan bobot badan tikus sangat dipengaruhi oleh konsumsi pakan, lingkungan, tingkat stres, serta aktivitas tikus. Tingginya konsumsi pakan sangat berpotensi meningkatkan bobot badan tikus (Agustina 2014). Peningkatan bobot badan terhadap tikus percobaan terus terjadi selama masa adaptasi (Gambar 1). Hal ini menunjukkan kondisi klinis dan kondisi fisik tikus dalam keadaan yang baik. Kondisi tikus yang seperti ini sangat tepat untuk dijadikan sebagai hewan coba (Widiartini et al. 2013) Adanya tahap injeksi streptozotosin mengakibatkan terjadinya penurunan bobot tikus yang signifikan pada taraf nyata 95% (p<0.05) (Gambar 1). Hal ini sesuai dengan penelitian Zafar dan Naqvi (2010) yang menunjukkan adanya penurunan bobot badan yang
13
signifikan terhadap hewan coba setelah diberi perlakuan injeksi streptozotosin. Hasibuan et al. (2016) juga menyatakan bahwa induksi streptozotosin dosis 50 mg/kg dapat menurunkan bobot badan. Injeksi senyawa diabetonik mengakibatkan hewan coba akan mengalami penurunan bobot badan akibat terjadinya deplesi cairan tubuh, percepatan penguraian lemak dan jaringan adiposa, serta penurunan nafsu makan (Oyedepo 2012). Penurunan bobot badan yang signifikan ditunjukkan oleh kelompok kontrol negatif dan kelompok ekstrak (p<0.05) selama masa perlakuan. Hal ini mengindikasikan bahwa pemberian ekstrak terhadap tikus tidak dapat menekan penurunan bobot badan yang terjadi. Penurunan bobot badan juga terjadi pada tikus kelompok normal setelah diinjeksi dengan bufer sitrat, namun penurunan yang terjadi hanya bersifat sementara. Hal ini diduga akibat tikus mengalami stres setelah masa injeksi, namun kembali normal setelah beberapa hari berikutnya yang ditandai dengan peningkatan bobot badan yang wajar dialami tikus normal pada umumnya. Kelompok kontrol positif menunjukkan penurunan bobot badan yang tidak terlalu signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif dan kelompok ekstrak, sehingga dapat dikatakan bahwa pemberian glibenklamida mampu menekan penurunan bobot badan yang terjadi pada tikus diabetes. Obi et al. (2015) menyebutkan bahwa bobot badan tikus diabetes yang diberi glibenklamida cenderung mengalami peningkatan bobot badan. Konsumsi pakan yang meningkat ditunjukkan oleh hampir semua kelompok perlakuan tikus selama masa adaptasi, terkecuali kelompok DA200 yang konsumsi pakannya cenderung menetap. Hal ini mengindikasikan bahwa proses adaptasi dan penyesuaian lingkungan berhasil diterapkan dengan baik. Konsumsi pakan yang meningkat ataupun normal menunjukkan tikus dalam keadaan yang baik dan sehat (tidak menunjukkan stres psikologis (Theresia 2012). Rakhmawati dan Yunita (2009) menyatakan bahwa kebutuhan pakan tikus normal per ekor setiap harinya bisa mencapai 20-30 gram, sehingga kebutuhan energi tikus per hari (20 gram) adalah 68.6 kkal. Secara keseluruhan, konsumsi pakan setiap kelompok tikus mengalami penurunan setelah induksi streptozotosin, namun kembali meningkat pada H+3, kecuali kelompok kontrol positif yang mengalami kenaikan konsumsi pakan pada saat H+6. Terjadinya peningkatan konsumsi pakan ini selaras dengan salah satu gejala klinis DM yaitu polifagia atau lapar yang berlebihan (CDC 2014). Konsumsi pakan tikus kelompok normal cenderung tetap dan stabil, tapi mengalami penurunan pada akhir masa perlakuan (Gambar 2).
Kadar Glukosa Darah Salah satu parameter penting yang digunakan dalam menganalisis penyakit diabetes melitus adalah pengukuran kadar glukosa darah. Pengukuran kadar glukosa darah tikus dilakukan untuk mengamati kondisi klinis tikus selama masa adaptasi maupun masa perlakuan. Kadar glukosa darah tikus diukur pada hari ke-0, ke-2, ke-9, dan ke-16 dengan menggunakan glukometer tipe Accucheck. Alat ini memiliki fungsi untuk mengukur kadar glukosa darah melalui reaksi enzimatik, yakni dengan cara menempatkan sampel darah ke zona reaksi pada strip, kemudian glukosa dalam sampel darah bereaksi dengan pereaksi pada elektroda, maka kadar glukosa darah dapat terdeteksi oleh alat. Pereaksi yang terkandung
14
pada elektroda tersebut adalah glukosa oksidase. Kadar glukosa darah akan ditampilkan pada alat setelah 5 detik (Fitrianingsih et al. 2015). Pengukuran pada hari ke-0 bertujuan mengetahui kadar glukosa darah awal sebelum diberikan perlakuan dan memastikan bahwa tikus yang digunakan berada pada kondisi klinis yang normal. Kadar glukosa darah setiap kelompok tikus pada hari ke-0 menunjukkan kadar glukosa darah yang normal (Tabel 4). Peningkatan kadar glukosa darah secara signifikan terjadi setelah 48 jam induksi streptozotosin atau pada hari ke-2 (p<0.05), kecuali pada kelompok normal yang tidak diberi perlakuan induksi streptozotosin. Induksi streptozotosin secara intraperitoneal pada tikus dilakukan untuk mendapatkan kondisi diabetes pada hewan coba. Umumnya, glukosa darah tikus diabetes yakni berkisar lebih dari 200 mg/dL (Qinna dan Badwan 2015). Hal ini sesuai dengan data kadar glukosa darah tikus diabetes yang didapatkan, yakni berada pada rentang 267-323 mg/dL (Tabel 4). Peningkatan kadar glukosa darah terjadi dikarenakan streptozotosin mampu merusak dan memiliki toksisitas yang spesifik dengan sel β pankreas sehingga sel tersebut tidak dapat menghasilkan insulin dan mengakibatkan peningkatan kadar glukosa darah. Selain itu, senyawa ini bersifat toksik intraseluler melalui karbamoilasi dan alkilasi komponen seluler, melepaskan nitrit oksida (NO), pembentukan radikal bebas dan stres oksidatif (Goud et al. 2015). Pemberian perlakuan terhadap seluruh kelompok tikus selama tujuh hari (hari ke-9) menunjukkan adanya penurunan kadar glukosa darah pada kelompok kontrol positif yang dicekok glibenklamida. Hal ini dikarenakan glibenklamida mampu menurunkan kadar glukosa darah secara signifikan pada tikus yang mengalami diabetes (Obi et al. 2015). Mekanisme kerja glibenklamida yaitu dengan merangsang sekresi hormon insulin dari granula sel-sel β pulau Langerhans pankreas. Interaksinya dengan saluran kalium sensitif ATP pada membran sel-sel β menimbulkan depolarisasi membran yang akan membuka kanal kalsium, sehingga ion kalsium akan masuk ke dalam sel β kemudian merangsang pergerakan granula yang berisi insulin dan akan terjadi sekresi insulin (Obi et al. 2015; Masharani dan Karam 2001). Glibenklamida merupakan golongan senyawa sulfonilurea yang mampu meningkatkan sekresi insulin dan meningkatkan transpor glukosa darah menuju jaringan periferal (Farougue dan Meredith 2003; Abdel et al. 2004). Kelompok kontrol negatif dan ekstrak mengalami peningkatan kadar glukosa darah (Tabel 5). Peningkatan kadar glukosa darah pada kelompok kontrol negatif terjadi akibat pemberian streptozotosin dan tidak diberikan perlakuan penyembuhan, sehingga tetap memiliki kadar glukosa darah yang tinggi. Kelompok yang diberi pencekokan ekstrak juga mengalami peningkatan kadar glukosa darah, hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak air daun surian tidak menunjukkan efektivitas dalam penurunan kadar glukosa darah. Peningkatan kadar glukosa darah pada kelompok DA400 lebih siginifikan (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok DA200. Dosis yang lebih besar pada kelompok DA400 diindikasikan memiliki kandungan metabolit sekunder yang lebih banyak dibandingkan dengan dosis DA200. Kandungan flavonoid yang tinggi dapat menjadi penyebab terjadinya penurunan aktivitas antihiperglikemik karena ekstrak dengan dosis tinggi dapat kehilangan sifat antioksidannya dan menjadi prooksidan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Dewi et al. (2007) yang menyebutkan bahwa senyawa golongan fenolik (flavonoid) dengan konsentrasi
15
yang tinggi dapat mengubah sifat antioksidannya menjadi prooksidan dengan membentuk oksigen reaktif akibat kegagalan siklus redoks. Bouayed dan Bohn (2010) menyatakan bahwa flavonoid, fenolik, vitamin C, vitamin D, dan senyawa antioksidan lain dapat bertindak sebagai prooksidan jika dalam konsentrasi tinggi, adanya logam berat, atau pH yang tidak sesuai. Setelah hari ke-16, kelompok kontrol positif kembali mengalami penurunan kadar glukosa darah, sedangkan kelompok kontrol negatif dan kelompok ekstrak tetap mengalami peningkatan kadar glukosa darah. Pemberian ekstrak selama dua minggu tidak menunjukkan adanya efek penurunan kadar glukosa darah. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak air daun surian memiliki daya hambat yang rendah terhadap aktivitas enzim α-glukosidase. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Monisa (2016) yang menunjukkan bahwa ekstrak air daun surian memiliki aktivitas penghambatan α-glukosidase paling kecil dengan IC50 sebesar 323.27 μg/mL. Selain itu, kenaikan kadar glukosa darah yang terus terjadi juga dapat diakibatkan karena hati tikus mengalami kerusakan, sehingga glukosa tidak dapat diserap dengan maksimal oleh hati. Terganggunya fungsi hati mengakibatkan terjadinya penurunan efektivitas dalam melakukan pengambilan glukosa dan juga berpotensi merusak post-reseptor sel target pada jaringan sel hati yang bisa mengakibatkan terjadinya resistensi insulin (Saltiel dan Kahn 2001; Kawaguchi et al. 2011; Groop 1999). Selama masa perlakuan, kelompok kontrol normal memiliki kadar glukosa darah yang berada pada batas normal. Batas normal kadar glukosa darah tikus adalah 60-110 mg/dL (Safithri dan Fahma 2008).
Kadar Insulin Efek pemberian perlakuan kepada semua kelompok tikus terhadap kadar insulin diketahui melalui pengukuran kadar insulin pada hari ke-16. Kadar insulin darah pada kelompok kontrol positif hampir serupa dengan kadar insulin kelompok normal (Tabel 6). Kelompok normal mempunyai kadar insulin yang hampir sesuai dengan kadar normal insulin tikus Sprague-dawley, yakni sebesar 6,85 ± 5,46 µg/L atau setara dengan 0.1507 mIU/mL (Hasibuan et al. 2016). Hal ini menunjukkan glibenklamida mampu meningkatkan produksi insulin sampai kadar normal yang disebabkan oleh kemampuan glibenklamida yang dapat menginduksi sekresi insulin (Mogensen 2007). Kadar insulin yang didapatkan pada kelompok ekstrak DA200 dan DA400 lebih besar dibandingkan dengan kontrol normal dan kontrol positif (Gambar 4). Hal ini menunjukkan pemberian ekstrak daun surian mampu meningkatkan produksi insulin. Peningkatan produksi insulin memiliki keterkaitan regenerasi sel β pankreas. Zhang et al. (2014) menyebutkan bahwa ekstrak daun surian dapat membantu peningkatan regenerasi sel β pankreas yang telah dirusak oleh aloksan. Selain itu, tingginya kadar insulin dapat disebabkan oleh tingginya kadar glukosa darah yang menginduksi sel β pankreas untuk meningkatkan produksi insulin (Saltiel dan Kahn 2001). Kadar insulin yang tinggi seharusnya mampu menurunkan kadar glukosa melalui penyerapan glukosa oleh hati maupun jaringan lainya. Kadar glukosa yang tetap tinggi dapat disebabkan oleh adanya kerusakan jaringan pada hati hewan coba (Saltiel dan Kahn 2001; Kawaguchi et al. 2011), yang dapat diindikasikan dari tingginya kadar AST dan ALT pada hewan coba. Peningkatan
16
kadar glukosa darah pada kelompok DA400 terlihat lebih signifikan (p<0.05) dibandingkan dengan DA200 (Gambar 3), hal ini disebabkan oleh adanya kenaikan kadar AST dan ALT pada tikus kelompok DA400 yang mencapai angka AST sebesar 452.98 IU/L dan ALT sebesar 208.78 IU/L (Maulana, komunikasi pribadi). Kadar normal AST dan ALT pada tikus berada pada kisaran 69-191 IU/L (AST) dan 26-120 IU/L (ALT) (Suckow et al. 2001). Adanya kerusakan hati yang dialami oleh kelompok perlakuan ekstrak menyebabkan glukosa tidak dapat diserap dengan baik oleh hati, sehingga glukosa darah terus mengalami peningkatan walaupun terdapat kadar insulin yang tinggi. Keadaan kadar glukosa darah dan kadar insulin yang tinggi juga terjadi pada kalompok kontrol negatif. Berdasarkan kondisi tikus yang memiliki kadar glukosa darah yang tinggi dan disertai dengan kadar insulin yang tinggi, kelompok perlakuan tikus diduga mengalami penyakit diabetes tipe 2. Diabetes melitus tipe 2 (DMT2) merupakan suatu kelompok penyakit metabolik yang dicirikan oleh kondisi hiperglikemik akibat kelainan sekresi insulin oleh sel β pankreas, gangguan kerja insulin atau (resistensi insulin), atau keduanya (Groop 2001; Masharani dan Karam 2001). Dugaan ini diperkuat oleh metode perlakuan induksi STZ yang menggunakan dosis rendah (45 mg/kg) dan pakan tinggi energi. Induksi STZ dosis rendah yang umumnya digunakan pada hewan coba tikus yakni 15-50 mg/kg bobot badan tikus (Skovsø 2014). Graham et al. (2011) menyebutkan bahwa pakan tinggi energi mengandung kadar protein ≥19 , hal ini sesuai dengan pakan standar yang digunakan selama penelitian yang memiliki komposisi protein sebesar 19-21%. Induksi STZ dosis rendah yang disertai pakan tinggi energi mampu menginduksi terjadinya diabetes tipe 2 secara efektif pada hewan coba (Wang et al. 2007).
Histopatologi Pankreas Pengamatan histopatologi pankreas dilakukan dengan mengamati bentuk morfologi struktur jaringan pankreas tikus yang diwarnai dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE). Pewarnaan ini terdiri dari dua komponen warna, yaitu Hematoksilin dan Eosin. Hematoksilin merupakan zat warna yang bersifat basa sehingga dapat mewarnai inti sel yang bersifat asam sedangkan eosin adalah zat warna yang bersifat asam sehingga dapat mewarnai sitoplasma yang bersifat basa (Banks 1993). Prinsip pewarnaan HE adalah adanya kompleks kimia aktif yang dibentuk oleh hematein (Hematoksilin teroksidasi oleh kalium iodat) dengan kalium aluminium sulfat. Kompleks ini memiliki muatan positif sehingga mampu mengikat ke situs anionik yang terdapat pada protein histon kromatin. Eosin adalah zat warna asam yang berinteraksi dengan protein sitoplasma yang kaya akan asam amino untuk membentuk kompleks merah/merah muda. Pewarnaan Eosin (staining sitoplasma) dalam kombinasi dengan Hematoksilin (pewarnaan nuklir) adalah metode yang paling banyak digunakan dalam pengujian histopatologi (Bio-Optica 2015) Gambaran islet Langerhans kelompok normal tidak menunjukkan adanya kerusakan jaringan dan bentuknya terlihat normal serta mengandung sel α dan β, namun lebih didominasi oleh sel α. Kerusakan sel terlihat pada kelompok kontrol negatif yang diindikasikan dari sel pulau Langerhans yang terlihat kosong, kecilnya ukuran islet Langerhans, terdapat sel β dengan jumlah yang sedikit dan
17
didominasi oleh sel α. Kerusakan tersebut disebabkan oleh induksi STZ yang mengakibatkan terjadinya degenerasi sel dan kerusakan sel β pankreas (Akbarzadeh et al. 2007; Ikebukuro et al. 2002). Islet Langerhans yang lebih didominasi oleh sel α dibandingkan dengan sel β disebabkan oleh terjadinya kondisi hiperglikemik kronis yang mengakibatkan penurunan sel penghasil insulin dan peningkatan aktivitas sel penghasil glukagon (Brereton et al. 2014). Peningkatan sekresi insulin yang telah dijelaskan sebelumnya menyatakan bahwa pemberian glibenklamida pada kelompok kontrol positif dapat meningkatkan sekresi insulin. Hal ini berkorelasi dengan hasil histopatologi yang menunjukkan besarnya ukuran islet Langerhans yang berpotensi dalam menginduksi sekresi insulin, walaupun regenerasi sel belum terjadi secara keseluruhan dan kondisi islet yang lebih didominasi oleh sel α. Penggunaan glibenklamida mampu menghambat terjadinya stres oksidatif dan kerusakan sel pada pankreas (Erejuwa et al. 2010). Pemberian glibenklamida pada hewan coba yang mengalami diabetes juga dapat mencegah terjadinya penurunan sekresi insulin dan mempertahankan ataupun meningkatkan jumlah sel penghasil glukagon. Selain itu, efektivitas penggunaan glibenklamida lebih tinggi dalam menstabilkan kadar glukosa darah dibandingkan dengan terapi insulin, serta dapat menormalkan kerusakan sel yang terjadi pada islet pankreas (Brereton et al. 2014). Kelompok DA200 tidak menunjukkan adanya kelainan yang signifikan dan hampir menyerupai kelompok normal serta mengandung sel α maupun sel β pada islet pankreasnya, tetapi lebih didominasi oleh sel α. Namun, ukuran islet Langerhans kelompok DA200 terlihat lebih besar dibandingkan dengan kelompok DA400. Hal tersebut menunjukkan bahwa pemberian ekstrak air daun surian dengan dosis 200 mg/kg BB terlihat lebih efektif dalam menginduksi regenerasi sel dan menghambat terjadinya stres oksidatif maupun kerusakan sel pankreas. Senyawa fitokimia yang terkandung dalam ekstrak air daun surian memiliki peranan sebagai agen protektif sel pankreas. Hal ini sesuai dengan pernyataan Dembinska-Kiec et al. (2008) yang menyebutkan bahwa aktivitas antioksidan senyawa flavonoid yang terkandung dalam berbagai macam tanaman dapat bertindak sebagai agen protektif dengan cara mengurangi aktivitas peroksidasi lipid, meningkatkan sekresi insulin, serta meningkatkan kadar glutation dan betakaroten dalam plasma tikus yang mengalami diabetes. Kelompok DA400 memiliki ukuran islet Langerhans yang kecil dan lebih didominasi oleh sel α. Kecilnya ukuran islet Langerhans ini disebabkan oleh kerusakan sel β pankreas akibat induksi streptozotosin (STZ). STZ merupakan agen mikrobial dan agen alkilasi yang mampu menginduksi diabetes pada hewan coba melalui nekrosis spesifik pada sel β pankreas (Damasceno et al. 2014), sehingga menyebabkan degradasi pulau langerhans sel β pankreas Abeeleh et al. 2009). Penggunaan dosis ekstrak 400 mg/kg BB tidak menunjukkan adanya kemampuan dalam menginduksi regenerasi sel yang diindikasikan dari gambaran kondisi islet pankreas hewan coba kelompok DA400. Hal ini disebabkan karena dosis ekstrak 400 mg/kg BB merupakan dosis dengan konsentrasi yang tinggi dan bisa mengakibatkan hilangnya aktivitas antioksidan senyawa golongan fenolik, bahkan mengubah sifat antioksidan menjadi prooksidan dengan membentuk oksigen reaktif akibat kegagalan siklus redoks (Dewi et al. 2007). Efek dari senyawa prooksidan tersebut mengakibatkan terjadinya stres oksidatif dan kerusakan pada sel dan jaringan pankreas (Endang dan Sukma 2016).
18
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak air dari simplisia daun surian mengandung berbagai jenis senyawa metabolit sekunder diantaranya flavonoid, tanin, fenol hidrokuinon, saponin, dan glikosida. Berdasarkan parameter yang ada, ekstrak daun surian tidak mampu menekan penurunan bobot badan hewan coba dan tidak menunjukkan adanya peningkatan bobot badan. Ekstrak air daun surian tidak memiliki pengaruh dalam menurunkan kadar glukosa darah, tetapi mampu meningkatkan kadar insulin melalui proses regenerasi sel β pankreas. Kelompok DA200 lebih efektif dalam regenerasi sel β pankreas dibandingkan dengan DA400. Saran Perlu dilakukan pengukuran kadar insulin secara berkala agar mudah dalam melakukan analisis. Pengujian dan identifikasi senyawa secara kuantitatif dan optimasi dosis ekstrak yang digunakan perlu dilakukan. Pemberian perlakuan dengan waktu yang lebih lama perlu dilakukan untuk melihat efek ekstrak pada jangka waktu yang lebih pajang. Diperlukan adanya uji lanjut imunohistokimia secara kuantitatif dalam menganalisis histopatologi pankreas.
DAFTAR PUSTAKA [ADA] American Diabetes Association. 2015. Diagnosis and classification of diabetes melitus. Diabet Care. 38(1): 1-94. Abdel RAA, Maged MY, Nehad RE. 2004. Improvement of glucose level, lipid profile, some enzyme activities and structure of pancrease and liver in diabetic rats treated with glibenclamide. Nat Sci Series. 12(2): 139-156. Abeeleh MA, Ismail ZB, Alzaben KR, Abu-halaweh SA, Al-Essa MK, Abuabeeleh J, Alsmady MM. 2009. Induction of diabetes mellitus in rats using intraperitoneal streptozotocin : A comparison between 2 strains of rats. European J Sci Res. 32(3): 398-402. Adhianata H. 2012. Uji aktivitas senyawa anti mikroba ekstrak mikroalga (Tetraselmis chuii) metode sonikasi [skripsi]. Malang (ID): Universitas Brawijaya. Agustina. 2014. Pengaruh pemberian kitosan terhadap kadar kolesterol total tikus (Sprague-dawley) yang diberi pakan tinggi asam lemak trans [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Akbarzadeh A, Norouzian D, Mehrabi MR, Jamshidi SH, Farhangi A, Verdi AA, Mofidian SMA, Rad BL. 2007. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian J Clin Biochem. 22(2): 60-64.
19
Aprianthi SE, Fidrianny I, Nawawi A, 2006. Telaah kandungan kimia daun suren (Toona sinensis (Adr. Juss.) M. J. Roemer) [skripsi]. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Banks WJ. 1993. Applied Veterinary Histology. 3rd ed. Florida (USA): CV Mosby. Bio-Optica. 2015. Hematoxylin Eosin Staining Kit. Milan (IT): Bio-Optica. Bouayed J, Bohn T. 2010. Exogenous antioxidants-double-edged swords in cellular redox state. Oxid Med Cell Longevity. 3(4): 228-237. Doi: 10.4161/oxim.3.4.12858. Brereton MF, Iberl M, Shimomura K, Zhang Q, Adriaenssens AE, Proks P, Spiliotis II, Dace W, Mattis KK, Ramracheya R. 2014. Reversible changes in pancreatic islet structure and function produced by elevated blood glucose. Nat Comm. 5(4639): 1-11. BSN. 1995. SNI 01-3709-1995: Spices Powder. Jakarta (ID): National Standardization Agency of Indonesia. [CDC] Centers for Disease Control and Prevention. 2014. National Diabetes Statistics Report: Estimates of Diabetes and Its Burden in the United States 2014. Atlanta (US): Department of Health and Human Services. Chattopadhyay RR, Bandyopadhyay M. 2005. Possible mechanism of hepatoprotective activity of Azadirachta indica leaf extract against paracetamol induced hepato damage in rat: part III. Indian J Pharmacol. 37(3): 184-185. Chen HM , Wu YC, Chia YC, Chang FR, Hsu HK, Hsieh YC, Chen CC, Yuan SS. 2009. Gallic acid, a major component of Toona sinensis leaf extracts, contains a ROS-mediated anticancer activity in human prostate cancer cells. J Canlet. 10: 1016. Chen TS, Luo ZP, Cui HA, Zhen XQ, Liu ZZ. 2000. Preliminary study of chemical constituens from leaves of Toona sinensis. J Sci Tech. 20: 1-2. Chia YC, Wang PH, Huang YJ, Hsu HK. 2007. Cytotoxic activity of Toona sinensis on human lung cancer cells. Nat Sci Council Rep. 4(1): 230-237. Dai J, Mumper RJ. 2010. Plant phenolic: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules. 15 : 7313-7352. Damasceno DC, Netto AO, Iesi IL, Gallego FQ, Corvino SB, Dallaqua B, Sinzato YK, Bueno A, Calderon IMP, Rudge MVC. 2014. Biomed Res Int. 2014: 111. Dembinska-Kiec A, Mykkänen O, Kiec-Wilk B, Mykkänen H. 2008. Antioxidant phytochemicals against type 2 diabetes. Br J Nutr. 99: 109–117. Dewi JR, Estiasih T, Murtini ES. 2007. Aktivitas antioksidan dedak sorgum lokal varietas coklat (Sorghum bicolor) hasil ekstraksi berbagai pelarut. J Tek Pertanian. 8(3): 188-197. Du W, Peng SM, Liu ZH, Shi L, Tan LF, Zou XQ. 2012. Hipoglycemic effect of the water extract of pe-erh tea. Agr Food Chem. 1(60): 10126-10132.
20
Endang TH, Sukma DH. 2016. Ekstrak metanol daun kelor menurunkan kadar TNF-α dan IL-6 serum, serta MDA kolon tikus yang diinduksi DMBA. J Ked Brawijaya. 29(1): 25-31. Erejuwa OO, Sulaiman SA, Wahab MSA, Sirajudeen KNS, Salleh MSM, Gurtu S. 2010. Antioxidant protective effect of glibenclamide and metformin in combination with honey in pancreas of streptozotocin induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 11: 2056-2066. Farougue HMO, Meredith IT. 2003. Effect of inhibition of ATP-sensitive potassium channels on metabolic vasodilation in the human forearm. Clin Sci. 104:39-46. Firdiyani F, Agustini TW, Ma'ruf WF. 2015. Ekstraksi senyawa bioaktif sebagai antioksidan alami Spirulina platensis segar dengan pelarut yang berbeda. J Pengelola Hasil Perikanan Ind. 18(1): 28-37. Fitrianingsih SP, Mulqie L, Lukmayani Y, Liana M. 2015. Efek pemberian ekstrak jamur kuping hitam terhadap penurunan kadar glukosa darah secara in vivo. Prosiding Seminar Nasional [Internet]. [Waktu dan tempat pertemuan tidak diketahui]. Bandung (ID): Universitas Islam Bandung. hlm 371-376; [diunduh 2016 Okt 12]. Tersedia pada: http://prosiding.lppm.unisba.ac.id/index.php/kesehatan/article/viewFile/134 9/pdf Goud BJ, Dwarakanath V, Swamy BKC. 2015. Streptozotocin- a diabetogenic agent in animal models. Int J Pharm Pharmac Res. 3(1): 253-269. Graham ML, Janecek JL, Kittredge JA, Hering BJ, Schuurman HJ. 2011. The streptozotocin-induced diabetic nude mouse model: Differences between animals from different sources. Comp Med. 61(4): 356-360. Groop LC. 1999. Insulin Resistance: The Fundamental Trigger of Type 2 Diabetes. Diabetes, Obesity and Metabolism. New York (US): Mc Graw H. Groop LC. 2001. Type 2 Diabetes Mellitus: Pathogenesis and Treatment. In Endocrinology and Metabolism. New York (US): Mc Graw-Hill. Harborne JB. 2006. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Terjemahan dari: hytochemical Methods. Bandung (ID): Penerbit ITB. Haryadi D. 2012. Senyawa fitokimia dan sitotoksisitas ekstrak daun surian (Toona sinensis) terhadap sel vero dan MCF-7 [skripsi]. Bogor (ID): IPB. Hasibuan MS, Yasni S, Bintang M, Ranti AS. 2016. Antihyperglycemic activity of Piper crocatum leaves and Cinnamomum burmannii bark mixture extract in streptozotocin-induced diabetic rats. J Math Fund Sci. 48(2): 178-191 Hseu YC, Chang WH, Chen CS, Liao JW, Huang CJ, Lu FJ, Chia YC, Hsu HK, Wu JJ, Yang HL. 2008. Antioxidant activities of Toona sinensis leaves extracts using different antioxidant models. J Food Chem Toxicol. 46: 105114. Hsieh TJ, Tsai YH, Liao MC, Dub YC, Lien PJ, Sun CC, Chang FR, Wu YC. 2012. Anti-diabetic properties of non-polar Toona sinensis Roem extract prepared by supercritical-CO2 fluid. Food Chem Toxicol. 50: 779–789.
21
Hsu CY, Shih HY, Chia YC, Lee CH, Ashida H, Lai YK, Weng CF. 2014. Rutin potentiates insulin receptor kinase to enhance insulin-dependent glucose transporter 4 translocation. Mol Nutr Food Res. 1-9. Hwei WP, Tsai MJ, Hsu CY, Wang CY, Hsu HK, Weng CF. 2008. Toona sinensis roem (Meliaceae) leaf extract alleviates hyperglycemia via altering adipose glucose transporter 4. J Food Chem Toxicol. 46: 2554-2560. Ikebukuro K, Adachi Y, Yamada Y, Fujimoto S, Seino Y, Oyaizu H. 2002. Treatment of Streptozotocin-induced diabetes mellitus by transplantation of islet cells Plus bone Marrow cells via portal vein in rats. Transplantation. 73(4): 512-8. Jiang W, Shi Y, Zhao D, Chen S, Yong J, Zhang J, Qing T, Sun X, Zhang P, Ding M. 2007. In vitro derivation of fungtional insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Cell Res. 17(28): 333-344. Kawaguchi T, Taniguchi E, Itou M, Sakata M, Sumie S, Sata M. 2011. Insulin resistance and chronic liver disease. World J Hepatol. 3(5): 99-107. Kemenkes RI. 2014. Situasi dan analisis diabetes. [Internet]. [diunduh 2016 Sep 24]. Tersedia pada http://www.depkes.go.id Manurung LVM. 2016. Kinetika inhibisi α-glukosidase oleh ekstrak daun surian (Toona sinensis Roem.) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Masharani U, Karam JH. 2001. Pancreatic Hormones & Diabetes Mellitus. In Basic & Clinical Endocrinology. 6th ed. New York (US): Mc Graw Hill. Melodita R. 2011. Identifikasi pendahuluan senyawa fitokimia dan uji aktivitas antioksidan ekstrak daun cincau hitam dengan perlakuan jenis pelarut [skripsi]. Malang (ID): Universitas Brawijaya. Mogensen CE. 2007. Pharmacotherapy of Diabetes: New Developments: Improving Life and Prognosis for Diabetic Patients. New York (US): Springer. Monisa FS. 2016. Jenis tanin, total tanin dan aktivitas penghambatan αglukosidase dari ekstrak daun dan kulit batang surian (Toona sinensis Merr.) [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Negi JS, Bisht VK, Bhandari AK, Bharti MK, Sundriyal RC. 2011. Chemical and pharmacology aspect of Toona (Meliaceae). Res J Phytochem. 5(1): 14-21. Obi BC, Okoye TC, Joshua EP, Onyeto CA, Alumanah EO. 2015. Comaparative study of the antidiabetic and biochemical effects of metformin, glibenclamide and repaglinide in alloxan-induced diabetic rats. Afr J Pharm Pharmacol. 9(44): 1026-1036. Oyedepo TA. 2012. Effect of Citrus maxima (Merr.) fruit juice in alloxan-induced diabetic wistar rats. Sc. J Med Clin Trials. 2012: 125-137. Prabowo AF. 2012. Potensi antidiabetes ekstrak kulit kayu suren (Toona sinensis) pada tikus Sprague-dawley yang diinduksi aloksan [skripsi]. Bogor (ID): IPB. Qayee-Bio. 2016. Rat insulin ELISA kit instruction. Shanghai (CN): Qayee-Bio
22
Qinna NA, Badwan AA. 2015. Impact of streptozotocin on altering normal glucose homeostasis during insulin testing in diabetic rats compared to normoglycemic rats. Drug Design, Dev Therapy. (9): 2515–2525. Rakhmawati, Yunita. 2009. Pengaruh pemberian tepung bekicot (Achatina Fulica) terhadap peningkatan kadar hemoglobin tikus strain wistar yang diberi diet non protein [makalah]. Malang (ID): UB. Safithri M, Fahma F. 2008. Potency of Piper crocatum decoction as an antihiperglycemia in rat strain Sprague dawley. HAYATI. 15(1): 45-48. Safithri M, Kurniawati A, Syaefudin. 2016. Formula of Piper crocatum, Cinnamomum burmanii, and Zingiber officinale extracts as a functional beverage for diabetics. Int Food Res J. 23(3): 1123-1130. Saltiel AR, Kahn CR. 2001. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414: 799-806. Sani RN, Nisa FC, Andriani RD, Maligan JM. 2014. Analisis rendemen dan skrining fitokimia ekstrak mikroalga. J Pangan Agroind. 2(2):121-126. Sari RK, Syafii W, Achmadi SS, Hanafi M, Laksana YT. 2012. Aktivitas antikanker dan kandungan kimia ekstrak kayu teras suren (Toona sureni). J Ilmu Teknol Kayu Trop. 10(1): 1-11. Sari RK, Syafii W, Achmadi SS, Hanafi M. 2011. Aktivitas antioksidan dan toksisitas ekstrak etanol Surian (Toona sinensis). JITHH. 4(2): 46-52. Saryana RV, Suryanto E, Sangi MS. 2014. Perbandingan aktivitas antioksidan dari tongkol jagung (Zea mays) segar dan kering dengan metode refluks. Jurnal MIPA UNSRAT Online. 3(2): 92-96. Sembiring B. 2007. Warta Puslitbangbun. Edisi ke-13. Jakarta (ID): Gramedia. Skovsø S. 2014. Modeling type 2 diabetes in rats using high fat diet and streptozotocin: A review. J Diabet Inves. 5: 349-358. Suckow MA, Danneman P, Brayton C. 2001. The Laboratory Mouse. New York (US): CRC Pr. Sukandar EY, Andrajati R, Sigit JI, Kusnandar. 2008. Iso Farmakoterapi. Jakarta (ID): ISFI. Suriani N. 2012. Gangguan metabolisme karbohidrat pada diabetes melitus [makalah]. Malang (ID): Universitas Brawijaya. Theresia R. 2012. Potensi ekstrak etanol daun wungu (Graptophyllum pictum (L.) Griff) pada tikus sprague-dawley diabetes yang diinduksi aloksan [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Tiwari P, Kumar B, Kaur G, Kaur H, Kaur M. 2011. Phytochemical screening and extraction: A review. J Int Pharm Sci. 1: 98-106. Wang HJ, Jin YX, Shen W, Neng J, Wu T, Li YJ, Fu ZW. 2007. Low dose streptozotocin (STZ) combined with high energy intake can effectively induce type 2 diabetes through altering the related gene expression. Asia Pac J Clin Nutr. 16(1): 412-417.
23
Wang PH, Tsai MJ, Hsu CY, Wang CY, Hsu HK, Weng CF. 2008. Toona sinensis Roem (Meliaceae) leaf extract alleviates hyperglycemia via altering adipose glucose transporter 4. Food Chem Toxicol. 46: 2554–2560. Widiartini W, Siswati E, Setiyawati A, Rohmah IM, Prastyo E. 2013. Pengembangan usaha produksi tikus putih (Rattus norvegicus) tersertifikasi dalam upaya memenuhi kebutuhan hewan laboratorium [makalah]. Semarang (ID): Universitas Diponegoro. Winarto WP. 2003. Sambung Nyawa. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. [WHO] World Health Organization. 2011. Diabetes [Internet]. [diunduh 2016 Sep 24]. Tersedia pada http://www.who.int/medicentre/factsheests/fs312/en/ Yin Z, Zhang W, Feng F, Zhang Y, Kang W. 2014. α-Glucosidase inhibitors isolated from medicinal plants. Food Sci Hum Well. 3: 136-174. Yuhernita, Juniarti. 2011. Analisis senyawa metabolit sekunder dari ekstrak metanol daun surian yang berpotensi sebagai antioksidan. Makara Sains. 15(1): 48-52. Zafar M, Naqvi SNH. 2010. Effects of STZ-induced diabetes on the relative weights of kidney, liver and pancreas in albino rats: A comparative study. Int J Morphol. 28(1):135-14. Zhang Y, Dong H, Wang M, Zhang J. 2014. Attenuation of Quercetin from Toona sinensis Leaves on Hyperglycemia. Yangling (CN): Northwest A&F Univ. Zhao J, Zhou XW, Chen X , Wang QX. 2009. α-Glucosidase inhibitory constituent. Chem Nat Compounds. 45: 244-246.
24
LAMPIRAN
25
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Adaptasi tikus Spraguedawley
Penyiapan Ekstrak Air Daun Suren
Induksi diabetes dengan streptozotosin
Perlakuan ekstrak air daun suren pada tikus diabetes
Pengukuran kadar glukosa darah
Pengukuran kadar insulin
Lampiran 2 Rendemen ekstrak air daun surian Ulangan Bobot Bobot Simplisia plastik+ekstrak (g) (g) 1 25.0010 11.3584 2 50.0060 14.6043 a Rata-rata a
Bobot plastik (g) 2.5875 2.5875
Histopatologi pankreas
Bobot ekstrak (g) 8.7709 12.0168 20.7877
Nilai ditunjukkan dengan % rendemen ± SD
Contoh perhitungan
obot ekstrak ) x100 obot simplisia 8.7709 ( ) x100 25.0010 = 35.08%
endemen terkoreksi (
Rendemen (%) 35.08 24.03 29.56 ± 7.81
26
Lampiran 3 Senyawa fitokimia ekstrak air daun surian Hasila
Hasil Reaksi
Meyer
-
Tidak terbentuk endapan putih
Wagner
-
Tidak terbentuk endapan coklat
Dragendorf
-
Tidak terbentuk endapan merah
Flavonoid
+
Warna merah
Tanin
+
Warna hijau/biru kehitaman
Fenol Hidrokuinon
+
Warna merah
Steroid
-
Hijau
Triterpenoid
-
Saponin
+
Senyawa fitokimia
Gambar Sampel
Alkaloid
Merah
Buih stabil
0 Glikosida a
+
Endapan merah bata
(+) = terdapat senyawa; (-) = tidak terdapat senyawa
Kontrol +
27
Lampiran 4 Bobot badan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Kelompok
Ulangan
NORMAL
1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD
KN
KP
DA200
DA400
H-8 177 217 202 198.67 20.21 229 235 242 235.33 6.51 183 200 208 197.00 12.77 246 197 182 208.33 33.47 244 232 230 235.33 7.57
H-1 187 218 223 209.33 19.50 245 227 266 246.00 19.52 193 210 195 199.33 9.29 275 218 208 233.67 36.14 272 249 248 256.33 13.58
Bobot badan (g) H+2 H+4 182 184 208 223 205 219 198.33 208.67 14.22 21.46 206 196 215 188 263 190 228.00 191.33 30.64 4.16 166 159 199 186 189 194 184.67 179.67 16.92 18.34 231 238 191 193 175 177 202.67 31.63 231 224 220 225.00 5.57
199.00 28.84 220 220 220 220.00 0.00
Lampiran 5 Hasil analisis statistika bobot badan tikus (Uji T) Kontrol Normal
H+9 185 217 206 202.67 16.26 190 188 248 208.67 34.08 157 192 199 182.67 22.50 230 189 174 197.67 28.99 214 205 214 211.00 5.20
H+16 183 222 213 206.00 20.42 176 172 221 189.67 27.21 147 199 189 178.33 27.59 218 181 161 186.67 28.92 200 196 196 197.33 2.31
28
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
DA200
DA400
29
Lampiran 6 Konsumsi pakan tikus selama masa adaptasi dan perlakuan Kelompok
Ulangan
NORMAL
1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD
KP
KN
DA200
DA400
H-8 10 16 14 13.33 3.06 11 11 12 11.33 0.58 14 12 20 15.33 4.16 20 13 17 16.67 3.51 14 12 13 13.00 1.00
H-1 7 16 13 12.00 4.58 10 14 12 13.00 2.00 12 17 20 16.33 4.04 20 13 15 16.00 3.61 16 13 14 14.33 1.53
Konsumsi pakan (g) H+3 H+6 H+9 7 10 20 16 20 20 9 13 20 10.67 14.33 20.00 4.73 5.13 0.00 8 11 20 16 3 20 9 13 12 11.00 9.00 17.33 4.36 5.29 4.62 2 20 11 3 20 20 20 20 16 8.33 20.00 15.67 10.12 0.00 4.51 11 20 20 13 12 11 17 20 20 13.67 17.33 17.00 3.06 4.62 5.20 15 6 20 9 20 20 11 20 20 11.67 15.33 20.00 3.06 8.08 0.00
H+12 8 18 15 13.67 5.13 11 20 19 16.67 4.93 20 20 15 18.33 2.89 18 14 20 17.33 3.06 20 20 20 20.00 0.00
H+15 6 14 12 10.67 4.16 13 16 19 16.00 3.00 18 20 20 19.33 1.15 19 13 20 17.33 3.79 20 20 20 20.00 0.00
30
Lampiran 7 Kadar glukosa darah puasa selama perlakuan Kelompok Daun-Air 200 mg/kg
Rata-Rata Daun-Air 400 mg/kg
Rata-Rata Kontrol positif
Rata-rata Kontrol negatif
Rata-rata Kontrol normal
Rata-rata a
Ulangan
H-0
H+2
H+9
H+16
1
102
317
289
355
2 3
92 61
300 274
274 402
354 399
85.00 ± 21.38 297.00 ± 21.66
321.67 ± 69.97
369.33 ± 25.70
1
82
247
315
400
2 3
94 79
233 322
305 361
414 364
85.00 ± 7.94
267.33 ± 47.86
327.00 ± 29.87
392.67 ± 25.79
1
87
354
431
354
2 3
72 70
167 450
137 117
125 185
76.33 ± 9.29
323.67 ± 143.91
228.33 ± 175.80
221.33 ± 118.75
1
86
375
428
486
2 3
77 76
248 338
308 348
347 374
79.67 ± 5.51
320.33 ± 65.32
361.33 ± 61.10
402.33 ± 73.70
1
89
92
108
146
2 3
69 68
105 67
93 83
143 97
75.33 ± 11.85 88.00 ± 19.31
94.67 ± 12.58
128.67 ± 27.46
Nilai dinyatakan dalam rata-rata ± SD (n=3).
Lampiran 8 Hasil analisis statistika kadar glukosa darah (ANOVA dan Uji T)
31
32
33
34
35
Lampiran 9 Kadar insulin tikus Kelompok
Ulangan 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD 1 2 3 Rata-rata SD
NORMAL
KN
KP
DA200
DA400
Absoransi terkoreksi 0,098 0,067 0,078
Kadar Insulin 0.188939 0.14197 0.158636 0.163182 0.023812 0.277576 0.183636 0.176818 0.212677 0.056307 0.188939 0.127576 0.162424 0.159646 0.030776 0.205606 0.19197 0.19803 0.198535 0.006832 0.501061 0.243485 0.199545 0.314697 0.162884
0,1565 0,0945 0,09
0,098 0,0575 0,0805
0.109 0.1 0.104
0.304 0.134 0.105
Contoh perhitungan (DA200) Kadar insulin (
Absorbansi intersep mIU mIU ) ( ) IU/mL x F x slope 1000 IU mL 0.109 0.0267
=(
0.0033
mIU
) IU/mL x 5 x 1000
IU
= 0.2056 mIU/mL Kurva Standar Insulin 0.8 y = 0.0033x - 0.0267 R² = 0.9974
Absorbansi
0.6 0.4 0.2 0 0 -0.2
50
100
150
Konsentrasi
200
250
36
Lampiran 10 Hasil analisis statistika kadar insulin (ANOVA)
37
Lampiran 11 Histopatologi Pankreas Kelompok
Keterangan
N
Pulau Langerhans berukuran besar dan didominasi oleh sel α
KP
Pulau Langerhans berukuran besar dan didominasi oleh sel α
KN
Pulau Langerhans yang kosong dan berjumlah sedikit serta didominasi oleh sel α
DA200
Pulau Langerhans didominasi oleh sel α
DA400
Pulau Langerhans didominasi oleh sel α
(1) Folikel pankreas; (2) Pulau Langerhans.
Gambar
38
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Maros pada tanggal 14 Maret 1994. Penulis merupakan putri ke-12 dari 12 bersaudara dari ayah (Alm) Muchtar dan ibu Maryam. Penulis merupakan lulusan SMA Negeri 1 Maros tahun 2012 dan pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN Undangan. Penulis melaksanakan studi di IPB sebagai penerima beasiswa Bidik Misi DIKTI. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai organisasi, diantaranya adalah anggota Ikatan Keluarga Mahasiswa Indonesia Sulawesi Selatan (IKAMI Sul-Sel) periode 2012/2013 dan 2013/2014, kepala divisi Sport and Art Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) tahun 2013/2014, anggota divisi Sport and Art (CREBs) 2014/2015, dan anggota Bidik Misi Music Club periode 2013/2014 dan 2014/2015. Penulis juga pernah mengikuti kegiatan praktik lapangan di Balai Penelitian Tanaman Industri dan Penyegar (Balittri) pada bulan Juli sampai Agustus 2015 dengan judul Analisis Kandungan Senyawa Fitokimia dan Aktivitas Antioksidan serta Kadar Polifenol Ekstrak Kulit Biji Kakao (Theobroma cacao L.). Kepanitian yang pernah diikuti penulis diantaranya adalah sebagai divisi acara dan perlombaan Biochemistry Champions League (BCL) periode 2013/2014 dan 2014/2015, divisi Master of Dicipline pada Masa Perkenalan Fakultas (MPF) periode 2013/2014, dan ketua panitia Escape Biochemistry periode 2014/2015. Penulis pernah mengikuti dan menjadi ketua dalam kegiatan PKM-M didanai DIKTI tahun 2014 yang berjudul “Green Art Education Pendidikan dan Pelatihan Karya Seni Terapan erbahan Dasar Limbah kepada Siswa SM N 1 Damaga”. Selain itu penulis juga pernah meraih juara 1 dalam Pertandingan Voli Semarak sBidik Misi 2013, dan juara 1 akustik dalam ajang SPIRIT FMIPA 2015.
