AKTIVITAS ANTIHIPERGLIKEMIA EKSTRAK AIR KULIT KAYU SURIAN (Toona sinensis) PADA TIKUS YANG DIINDUKSI STREPTOZOTOSIN
ENNI PRASETYONINGTIAS
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
ii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Kulit Kayu Surian (Toona sinensis) pada Tikus yang Diinduksi Streptozotosin adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Januari 2017 Enni Prasetoningtias NIM G84120051
iv
ABSTRAK ENNI PRASETYONINGTIAS. Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Kulit Kayu Surian (Toona sinensis) pada Tikus yang Diinduksi Streptozotosin. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan MEGA SAFITHRI. Ekstrak air kulit kayu surian mempunyai potensi antihiperglikemia, namun penelitian secara in vivo sebagai uji praklinis belum dilakukan. Penelitian ini bertujuan menguji aktivitas antihiperglikemia ekstrak air kulit kayu surian pada tikus yang diinduksi streptozotosin berdasarkan bobot badan, glukosa darah, insulin, dan histopatologi pankreas. Sebanyak 15 ekor tikus dikelompokkan menjadi kelompok normal, kontrol negatif, kontrol positif yang diberi glibenklamida dengan dosis 5 mg/Kg BB, kelompok yang diberi ekstrak dosis 200 mg/Kg BB, dan kelompok yang diberi ekstrak dosis 400 mg/Kg BB. Ekstrak tersebut mengandung flavonoid, tanin, saponin, fenol hidrokuinon, dan glikosida. Kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB mempunyai aktivitas antihiperglikemia yang lebih baik daripada dosis 400 mg/Kg BB, yaitu dengan menekan penurunan bobot badan, menurunkan kadar glukosa darah sebesar 22.44%, kadar insulin yang tidak berbeda secara statistika dengan kelompok normal. Tidak terdapat kelainanan spesifik pada pulau Langerhans tikus kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB dan mempunyai kondisi normal, sedangkan kelompok dosis 400 mg/Kg BB mempunyai pulau Langerhans yang kecil dan berjumlah sedikit. Kata kunci: antihiperglikemia, diabetes mellitus, glukosa darah, insulin, surian.
ABSTRACT ENNI PRASETYONINGTIAS. Antihyperglycemia Activity of Surian (Toona sinensis) Bark Water Extract on Streptozotocin Induced Rats. Supervised by SYAMSUL FALAH and MEGA SAFITHRI. Water extract of surian bark have antihyperglycemia potential, but in vivo activity haven’t be done yet. This research aimed to analyze antihyperglycemia activity of surian bark water extract in streptozotocin induced rats based on body weight, fasting blood glucose, serum insulin, and pancreas hystopathology. 15 rats were grouped to normal group, negative group, positive group were given 5mg/Kg of BW glibenclamide, group were given 200 mg/Kg of BW extract, group were given 400 mg/Kg of BW extract. Surian bark water extract consisted flavonoid, tannin, saponin, phenol hydroquinon, and glycoside. The 200 mg/Kg of BW dosage had better antihyperglycemia activity than 400 mg/Kg of BW dosage, showed by surpressed body weight loss, decreased blood glucose till 22.44%, and had no statistically different of serum insulin with normal group. The 200 mg/Kg of BW group had no significant disorder in their islet Langerhans and their condition towarded normal group, but in 400 mg/Kg of BW group had little and few islet Langerhans. Keywords: antihyperglycemia, blood glucose, diabetes mellitus, insulin, surian.
AKTIVITAS ANTIHIPERGLIKEMIA EKSTRAK AIR KULIT KAYU SURIAN (Toona sinensis) PADA TIKUS YANG DIINDUKSI STREPTOZOTOSIN
ENNI PRASETYONINGTIAS
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
vi
Judul Skripsi
Nama NIM
: Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Kulit Kayu Surian (Toona sinensis) pada Tikus yang Diinduksi Streptozotosin : Enni Prasetyoningtias : G84120051
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, SSi MSi Pembimbing II
Dr Syamsul Falah, SHut MSi Pembimbing I
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
viii
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas karunia dan hidayah-Nya. skripsi dengan judul “Aktivitas Antihiperglikemia Ekstrak Air Kulit Surian (Toona sinensis) pada Tikus yang Diinduksi Streptozosin” ini dapat diselesaikan. Skripsi ini memaparkan beberapa parameter diabetes pada tikus yang diberi ekstrak air kulit kayu surian yang diinduksi streptozotosin. Penulis berterima kasih kepada Bapak, Ibu, dan Kakak-kakak yang telah mendukung penuh dalam menempuh pendidikan S1 Biokimia ini, baik moral maupun materi. Terima kasih kepada Dr Syamsul Falah, SHut MSi sebagai pembimbing utama dan Dr Mega Safithri, SSi MSi sebagai pembimbing kedua atas semua bimbingan, saran dan bantuannya. Terima kasih juga untuk Aida, Arifa, Iqbal, Dhani, Listia, dan Melati atas kerja samanya dalam penelitian ini. Tidak lupa penulis juga berterima kasih kepada sahabat, Mutiara dan Yanti atas saran dan motivasinya, serta kepada teman-teman Biokimia 49 atas semangat, kebersamaan, dan bantuannya. Semoga karya tulis ini bermanfaat bagi penulis maupun pembaca untuk kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi, khususnya dalam bidang Biokimia. Bogor, Januari 2017
Enni Prasetyoningtias
ix
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
METODE PENELITIAN
2
Alat dan Bahan
2
Prosedur
2
HASIL
6
Kadar Air Simplisia, Rendemen dan Senyawa Fitokimia Ekstrak
6
Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Tikus
6
Kadar Glukosa Darah Tikus
7
Kadar Insulin Serum Tikus
8
Histopatologi Pankreas
8
PEMBAHASAN Kadar Air Simplisia dan Rendemen Ekstrak Kulit Kayu Surian
9 9
Senyawa Fitokimia Ekstrak Air Kulit Kayu Surian
10
Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Tikus
11
Kadar Glukosa Darah Tikus
12
Kadar Insulin Serum Tikus
15
Histopatologi Pankreas
17
SIMPULAN DAN SARAN
18
Simpulan
18
Saran
18
DAFTAR PUSTAKA
19
LAMPIRAN
24
RIWAYAT HIDUP
38
viii
DAFTAR TABEL 1 Senyawa fitokimia pada ekstrak air kulit kayu surian 2 Kadar glukosa darah tikus selama perlakuan 3 Kadar insulin serum tikus pada H16
6 8 8
DAFTAR GAMBAR 1 Bobot badan tikus selama perlakuan. 2 Konsumsi pakan tikus selama perlakuan. 3 Jaringan pankreas dengan pewarnaan hematoksilin eosin 4 Mekanisme glibenklamida (sulfonil urea) sebagai antihiperglikemia 5 Prinsip kerja ELISA.
7 7 9 14 15
DAFTAR LAMPIRAN 1 Gambaran umum penelitian 2 Kadar air simplisia 3 Rendemen ekstrak air kulit kayu surian 4 Senyawa fitokimia ekstrak air kulit kayu surian 5 Bobot badan tikus 6 Perubahan bobot badan tikus 7 Konsumsi pakan tikus 8 Glukosa darah tikus 9 Perubahan kadar glukosa darah tikus 10 Absorbansi standar pada panjang gelombang 450 nm 11 Standar insulin pada panjang gelombang 450 nm 12 Kadar insulin tikus 13 Hasil analisis statistika glukosa darah (ANOVA) 14 Hasil analisis statistika kadar insulin (ANOVA) 15 Hasil analisis perubahan glukosa darah (uji t berpasangan) 16 Hasil analisis statistika perubahan bobot badan
25 26 26 27 28 28 30 31 31 32 32 33 33 35 35 36
1
PENDAHULUAN Diabetes mellitus merupakan penyakit metabolik yang dicirikan dengan keadaan hiperglikemia sebagai akibat dari gangguan sekresi insulin, resisten insulin, atau keduanya. Penyakit ini tidak menular, bersifat kronis, dan cukup berbahaya karena dapat menimbulkan komplikasi, kerusakan jangka panjang dan disfungsi beberapa organ (ADA 2015). Center for Disease Control and Prevention Amerika memaparkan bahwa penderita diabetes dapat mengalami tekanan darah dan kadar Low Density Lipoprotein (LDL) tinggi, retinopati, gagal ginjal, amputasi, dan serangan jantung (CDC 2014). Peningkatan jumlah penderita diabetes mellitus dalam kurun waktu terakhir menjadi suatu perhatian untuk menekannya, baik dengan pencegahan maupun dengan pengobatannya. Kemenkes RI menyatakan bahwa proporsi diabetes mellitus pada Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) Indonesia untuk usia lebih dari 15 tahun pada tahun 2013 meningkat hampir dua kali lipat dibandingkan dengan tahun 2007 (Kemenkes 2014). International Diabetes Federation (IDF) menyatakan bahwa 78.3 juta penduduk Asia Tenggara mengidap diabetes pada tahun 2015 dan akan meningkat menjadi 140.2 juta pada tahun 2040 (IDF 2015). Secara umum, tindakan untuk menangani penyakit tersebut adalah dengan menurunkan kadar glukosa darah, yaitu dengan pola hidup sehat, obat antidiabetes oral, injeksi insulin, transplantasi jaringan pankreas, atau menggunakan sel punca manusia (Jiang et al. 2007). Pengobatan alternatif menggunakan obat herbal sebagai langkah penanganan diabetes juga semakin diminati oleh masyarakat. Berbagai penelitian juga terus dilakukan untuk mengembangkan dan menggali potensi antidiabetes dari sumber daya alam yang dapat digunakan sebagai obat herbal tersebut, termasuk surian (Toona sinensis). Daun surian telah dilaporkan mempunyai potensi menurunkan kadar glukosa darah, yaitu melalui peningkatan insulin untuk memediasi translokasi molekul transpor glukosa 4 (Glucose Transporter 4 atau GLUT4) pada jaringan adiposa (Wang et al. 2007), peningkatan aktivitas Insulin Receptor Kinase (IRK) dan jalur persinyalan insulin oleh senyawa rutin untuk meningkatkan uptake glukosa pada sel dan tikus yang mengalami resistensi insulin (Hsu et al. 2014). Hsieh et al. (2012) juga telah mengidentifikasi 24 komponen utama dari ekstrak nonpolar daun surian yang berpotensi sebagai antidiabetes pada mencit diabetes tipe 2. Kulit kayu surian yang merupakan limbah dari pemanfaatan kayu surian sebagai furnitur juga mempunyai potensi sebagai antidiabetes. Sekitar 10-15% dari bobot pohon total adalah kulit kayu (Sjostron 2007), sehingga penggunaan kulit kayu surian sebagai obat adalah langkah potensial, terlebih banyak senyawa bioaktif yang terdapat di dalamnya. Ichsan (2011) melaporkan adanya aktivitas penghambatan α-glukosidase oleh ekstrak etanol kulit kayu surian dengan IC50 0.66 mg/L dan pada ekstrak air 3.22 mg/L. IC50 ekstrak air kulit kayu surian terhadap α-glukosidase pada Monisa (2016) adalah 302.88 mg/L dan 165.75 mg/L pada fraksi taninnya. Prabowo (2012) menjelaskan bahwa konsumsi ekstrak etanol kulit kayu T. sinensis selama dua minggu dengan dosis 150 mg/Kg BB pada tikus Sprague Dawley yang telah diinduksi aloksan dapat menurunkan kadar glukosa darah sebesar 70.82%, lebih baik daripada glibenklamida, tetapi pada
2
dosis 300 mg/Kg BB justru mempunyai penurunan kadar glukosa darah yang kurang optimal. Pengujian aktivitas antihiperglikemia ekstrak air kulit kayu surian secara in vivo sebagai uji praklinis belum dilakukan. Pengujian secara in vivo pada tikus atau mencit dapat dilakukan menggunakan streptozotosin atau aloksan sebagai agen penginduksi diabetes. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menganalisis aktivitas antihiperglikemia ekstrak air kulit kayu surian secara in vivo pada tikus yang diinduksi streptozotosin. Hal tersebut diketahui melalui parameter bobot badan, glukosa darah, insulin, dan histopatologi pankreas. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai efek pemberian ekstrak air kulit kayu surian selama 14 hari pada bobot badan, kadar glukosa darah, insulin, dan keadaan sel β pankreas tikus yang mengalami hiperglikemia.
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah pendingin tegak, glukometer (Auto-Check®, Roche, Jerman), sonde oral, alat bedah, mikrosentrifus, spektronano dengan protokol ELISA reader (BMG Labtech spectronano, Jerman), pipet mikro, inkubator, mikrotom (Reichert-Jung Autocut, Jerman), pencetak parafin (TissueTek®, USA), kandang hewan coba dari Unit Kandang Hewan Percobaan Pusat Studi Biofarmaka Tropika, penangas air, dan peralatan gelas. Bahan yang digunakan diantaranya adalah kulit kayu surian berumur 15 tahun dari Sumedang, tikus galur Sprague Dawley (VSTEM, Indonesia), streptozotosin atau STZ (Sigma Aldrich®, USA), glibenklamida (Indofarma, Indonesia), kit insulin (Qayee Bio®, China), bufer netral formalin 10%, hematoksilin, eosin, parafin, akuades, dan pakan standar tikus (Bravo®, Indonesia) dengan komposisi protein (19-21%), lemak (5%), serat (5%), kalsium (0.9%), fosfor (0.6%). Prosedur Preparasi Sampel (Sari et al. 2011) Kulit kayu surian dikeringanginkan kemudian digiling menggunakan willey mill. Serbuk yang diperoleh kemudian diayak dengan ukuran 40-60 mesh dan disimpan dalam tempat kering dan bersih. Pengukuran Kadar Air Simplisia (AOAC 2005) Cawan porselain dioven pada suhu 105 oC selama 15 menit kemudian dimasukkan ke desikator selama 15 menit dan ditimbang sebagai bobot cawan kosong. Sebanyak 2 gram simplisia dimasukkan ke dalam cawan dan dioven pada suhu 105 oC sampai bobot kering stabil kemudian kadar air dihitung dalam persen.
3
Ekstraksi Kulit Kayu Surian (modifikasi Saryana 2014) Simplisia berukuran 40-60 mesh diekstraksi dengan metode refluks. Simplisia ditambahkan akuades dengan perbandingan 1:10 (b/v) di dalam labu Erlenmeyer kemudian direfluks selama 1 jam pada suhu 90 oC. Hasil refluks disaring dan filtrat dipindahkan ke labu Erlenmeyer lain sedangkan residunya direfluks dengan cara yang sama sampai 2 kali ekstraksi. Filtrat hasil refluks diuapputarkan sehingga didapat serbuk ekstrak dan disimpan dalam 4 °C. Rendemen terkoreksi ekstrak dinyatakan dalam persen. Penapisan Fitokimia (Harborne 2006) Alkaloid. Sebanyak 0.025 gram sampel ditambahkan 10 mL kloroform dan 3 tetes ammonia. Fraksi kloroform diambil dan diasamkan dengan 1 mL H2SO4 pekat. Fraksi asam diteteskan ke 3 plat tetes untuk ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan merah pada penambahan Dragendorf, endapan putih pada penambahan Meyer, dan endapan coklat pada penambahan Wagner. Kontrol positif yang digunakan adalah daun tapak dara (Heijden et al. 2004, Mujib et al. 2012). Flavonoid, tanin, dan saponin. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan 10 mL akuades, dididihkan selama 5 menit, dan disaring. Filtrat dibagi ke dalam tiga tabung. Tabung pertama untuk uji flavonoid, ditambahkan serbuk Mg, 1 mL HCl, dan 1 mL amil alkohol. Hasil positif ditunjukkan dengan warna merah pada fraksi amil alkohol. Daun meniran digunakan sebagai kontrol positif (Awomukwu et al. 2014). Tabung kedua untuk uji tanin dengan ditambahkan FeCl3. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna kehitaman. Teh digunakan sebagai kontrol positif (Funmilayo et al. 2012). Tabung ketiga untuk uji saponin. Tabung dikocok kuat-kuat dan hasil positif ditunjukkan dengan adanya buih yang stabil. Kontrol positif untuk saponin adalah daun kumis kucing (Adnyana et al. 2013). Fenolik hidrokuinon, steroid, dan triterpenoid. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan 10 mL etanol 96% dan dipanaskan 1 menit kemudian disaring. Filtrat dibagi ke dalam 2 tabung. Tabung pertama untuk uji fenolik, diambil beberapa tetes filtrat ke plat tetes dan ditambahkan 3 tetes NaOH. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna merah. Serbuk kayu manis digunakan sebagai kontrol positif (Malewska 2014). Tabung kedua digunakan untuk uji steroid dan triterpenoid dengan dididihkan sampai pelarut menguap. Sebanyak 1 mL eter dimasukkan ke dalam hasil penguapan. Sebanyak beberapa tetes campuran dipindahkan ke cawan pinggang dan ditambahkan 3 tetes H2SO4 pekat dan 3 tetes asam asetat anhidrat. Semburat warna merah atau ungu menunjukkan hasil positif untuk triterpenoid dan semburat warna hijau menunjukkan adanya steroid. Daun katuk digunakan sebagai kontrol positif steroid (Putranto et al. 2014), sedangkan kunyit digunakan sebagai kontrol positif triterpenoid (Sukandar et al. 2008). Glikosida. Sebanyak 0.025 gram ekstrak ditambahkan akuades 5 mL dan disaring. Sebanyak 1 mL pereaksi Benedict ditambahkan ke dalam 1 mL filtrat kemudian dipanaskan dalam suhu 100°C selama 5 menit. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan berwarna merah bata atau jingga. Madu digunakan sebagai kontrol positif (Ratnayani et al. 2008). Hewan Model dan Rancangan Percobaan (Prabowo 2012)
4
Tikus diadaptasi selama satu minggu dalam kandang individual dengan kondisi ruang bersuhu 26-28 °C, kelembaban 75-95%, dan 12 jam terang/gelap. Tikus tersebut diberi air secara ad libitum dan pakan standar 20 gram per ekor. Bobot badan didata setiap satu minggu sekali, dan sisa pakan didata setiap hari. Sebanyak 15 ekor tikus berumur 12 minggu dan berbobot badan 200-250 gram dibagi ke dalam 5 kelompok secara acak. Kelompok normal (N) diinduksi 1 mL bufer sitrat 50 mM secara intraperitoneal dan cekok akuades sebanyak 1 mL/hari. Kelompok kontrol negatif (KN) diinduksi STZ dan dicekok akuades sebanyak 1 mL/hari. Kelompok kontrol positif (KP) diinduksi STZ dan dicekok glibenklamida dengan dosis 5 mg/Kg bobot badan/hari. Kelompok KA200 diinduksi STZ dan dicekok ekstrak dengan dosis 200 mg/Kg BB/hari. Kelompok KA400 diinduksi STZ dan dicekok ekstrak dengan dosis 400 mg/Kg BB/hari. Dosis STZ yang digunakan adalah 40 mg/Kg BB (berdasarkan hasil preliminary test). STZ dilarutkan dalam 50 mM bufer sitrat pH 4.5 kemudian diinduksikan secara intraperitoneal pada H0. Pencekokan ekstrak dan obat dilakukan selama 14 hari setelah 48 diinduksi diabetes. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada H0, H2, H9, dan H16. Tikus dibius pada H16 menggunakan ketamin xilazin (80 mg/Kg BB, 20 mg/Kg BB), dibedah untuk diambil darah melalui vena portal hepatika sebanyak 3 mL, dan dieuthanasia dengan metode eksanguinasi untuk diambil pankreasnya. Penelitian dilakukan di bawah pengawasan Komisi Etik Hewan Institut Pertanian Bogor. Pengukuran Kadar Glukosa Darah (Du et al. 2012) Sesaat sebelum pengambilan darah, ujung ekor tikus dibersihkan dahulu dengan alkohol 70%, kemudian ujung ekor tikus ditusuk dengan jarum hingga berdarah. Tetesan darah yang diperoleh segera diteteskan ke strip glukometer yang telah dipasang pada alat glukometer Accu-Check®. Pengukuran Kadar Insulin (Qayee Bio 2016) Preparasi Sampel. Sampel darah H16 disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, jari-jari rotor yang digunakan adalah 12 cm. Serum dipisahkan dengan pellet dan disimpan dalam suhu -20 °C sebelum dianalisis. Preparasi Pereaksi. Larutan pembilas, standar, enzim, pelarut standar, pelarut sampel, dan kromogen disamakan suhunya dengan suhu ruang. Sebanyak 20 mL konsentrat bufer pembilas 20X dilarutkan dalam 380 mL akuades. Prosedur Pengujian. Sebanyak 50 µL standar dengan konsentrasi 0, 12.5, 25, 50, 100, dan 200 µIU/mL (International Unit menyatakan jumlah insulin) disiapkan di dalam sumur microplate dengan teknik pengenceran bertingkat menggunakan pelarut standar. Sebanyak 50 µL pelarut standar juga dimasukkan ke dalam sumur sebagai blanko. Sebanyak 10 µL sampel sarum darah dimasukkan ke dalam mikroplat dan ditambahkan 40 µL pelarut spesial. Sebanyak 50 µL horseradish peroxidase dimasukkan ke dalam setiap sumur kemudian mikroplat ditutup dengan menggunakan plate sealer dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Isi mikroplat dibuang dan dibilas dengan 350 µL larutan pembilas sebanyak 5 kali dan dikeringkan dengan posisi terbalik di atas kertas saring. Sebanyak 10 µL kromogen A dan 10 µL kromogen B dimasukkan ke setiap sumur. Mikroplat ditutup dengan menggunakan plate sealer dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 10 menit. Sebanyak 50 µL larutan stop dimasukkan ke dalam
5
masing-masing sumur sehingga terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning. Larutan dibaca absorbansinya mengunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 450 nm. Jangka waktu pembacaan absorbansi setelah pemberian larutan stop maksimal 15 menit. Kadar insulin diperoleh melalui persamaan garis pada kurva standar. Histopatologi Pankreas (Prabowo 2012) Fiksasi Pankreas Tikus. Pankreas dicuci dengan bufer netral formalin (BNF) 10% kemudian direndam dalam BNF 10% selama minimal 3 hari. Pankreas diiris setebal ±3 mm, dimasukkan ke dalam kaset jaringan berlabel. Dehidrasi dan Penjernihan Sampel. Kaset jaringan yang berisi sampel dimasukkan ke dalam keranjang dan ditempatkan pada alat tissue-processor otomatis. Proses dehidrasi pada alat ini dilakukan dengan alkohol konsentrasi bertingkat dengan urutan alkohol 70%, alkohol 80% (2 kali pada larutan yang berbeda), alkohol 90%, alkohol 96%, dan alkohol absolut (2 kali pada larutan yang berbeda), kemudian wax masing-masing selama 1 jam. Kaset jaringan kemudian divakum dan di oven dengan suhu 50 °C selama 24 jam. Pelekatan Jaringan pada Parafin. Parafin cair dimasukkan ke dalam kaset jaringan sebanyak seperempat bagian cetakan. Parafin dibiarkan membeku selama beberapa menit, dan kemudian dilepaskan dari cetakan. Pemotongan. Hasil pelekatan jaringan pada parafin dipotong setebal 4-5 μm menggunakan mikrotom. Hasil cetakan diletakkan di atas permukaan air yang dipanaskan sampai suhu 40 °C. Setelah itu potongan diletakkan pada preparat dan dikeringkan dalam inkubator selama 2 jam pada suhu 56 °C. Pewarnaan Jaringan Pankreas. Sediaan yang diperoleh kemudian dicelupkan ke dalam xilol (2 kali pada larutan yang berbeda), kemudian alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80% masing-masing 2 menit, dan dicuci dengan air keran selama 1 menit. Preparat kemudian dicelupkan ke dalam larutan Mayer’s haematoxylin, lalu dicuci dengan air keran (30 detik), air keran (2 menit), dan dicelupkan ke dalam pewarna eosin (2-3 menit). Preparat dicuci dengan air keran selama 30-60 menit, dan dicelupkan ke dalam alkohol 95% dan alkohol absolut (10 kali), alkohol absolut (2 menit), xilol (1 menit), dan xilol (2 menit). Preparat segera dikeringkan dan ditetesi dengan zat perekat albumin:gliserin (1:1), dan selanjutnya ditutup dengan kaca objek. Preparat tersebut kemudian dilabel dan pulau Langerhans diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 200 kali. Analisis Statistika Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) lima kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan. Analisis beda nyata antar variabel menggunakan Uji F dilanjutkan uji Duncan pada selang kepercayaan 95%, sedangkan analisis signifikansi perubahan menggunakan Uji t berpasangan. Analisis dilakukan menggunakan program komputer SPSS versi 20.
6
HASIL Kadar Air Simplisia, Rendemen dan Senyawa Fitokimia Ekstrak Simplisia kulit kayu surian mempunyai kadar air sebesar 9.71±0.05%. Ekstraksi menghasilkan rata-rata rendemen terkoreksi sebesar 6.96±2.41%. Hasil uji senyawa fitokimia ditunjukkan oleh Tabel 1. Ekstrak air kulit kayu surian mengandung flavonoid, tanin, saponin, fenol hidrokuinon, dan glikosida. Tabel 1 Senyawa fitokimia pada ekstrak air kulit kayu surian Uji Hasila Hasil reaksi Alkaloid Dragendorf Meyer Wagner Flavonoid Tanin Saponin Steroid Triterpenoid Fenol hidrokuinon Glikosida a
+ + + + +
Tidak terbentuk endapan merah Tidak terbentuk endapan putih Tidak terbentuk endapan coklat Warna merah Warna biru kehitaman Buih stabil Warna tetap coklat kemerahan Warna tetap coklat kemerahan Warna merah Endapan merah bata
(-) menunjukkan hasil negatif, (+) menunjukkan hasil positif
Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Tikus Bobot badan semua kelompok tikus mengalami kenaikan dari H-8 ke H0, kemudian turun pada H2. Kelompok normal terus mengalami peningkatan bobot badan selama perlakuan, sedangkan kelompok lain masih mengalami penurunan bobot badan (Gambar 1). Hanya kelompok kontrol negatif dan KA400 yang mengalami penurunan bobot badan yang signifikan pada taraf nyata 95% (p<0.05). Rata-rata konsumsi pakan semua tikus pada masa adaptasi (M0) adalah 14.42 gram. Tikus kelompok normal mempunyai rata-rata konsumsi pakan yang hampir sama saat M0, minggu pertama (M1) dan kedua (M2) perlakuan. Konsumsi pakan tikus kelompok negatif dan positif terus meningkat, sedangkan KA200 dan KA400 meningkat pada M2 (Gambar 2).
7
Bobot badan (gram)
300
250
200
150 -8
-1
2 Hari perlakuan
9
16
Gambar 1 Bobot badan tikus selama perlakuan. N: kelompok normal; KP: kelompok kontrol positif; KN: kelompok kontrol negatif; KA200: kelompok hiperglikemia yang diberi ekstrak dosis 200 mg/Kg BB; KA400 : kelompok hiperglikemia yang diberi ekstrak dosis 400 mg/Kg BB.
Konsumsi pakan (gram)
20 15 10 5 0
1 Minggu perlakuan
2
Gambar 2 Konsumsi pakan tikus selama perlakuan. N: kelompok normal; KP: kelompok kontrol positif; KN: kelompok kontrol negatif; KA200: kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB; KA400: kelompok ekstrak dosis 400 mg/Kg BB. Kadar Glukosa Darah Tikus Rata-rata kadar glukosa darah setiap kelompok pada H0 kurang dari 150 mg/dL, yaitu 75.33-81.00 mg/dL. Kadar glukosa darah kemudian meningkat signifikan pada H2 hingga lebih dari 200 mg/dL, kecuali pada kelompok normal yang mempunyai rata-rata sebesar 88.00 ± 19.31 mg/dL. Setelah tujuh hari perlakuan, kelompok kontrol positif mengalami penurunan kadar glukosa darah sebesar 29.45% tetapi tidak signifikan menurut taraf nyata 95% (p>0.05), sedangkan kelompok lain masih mengalami peningkatan. Kelompok kontrol positif dan perlakuan ekstrak mengalami penurunan kadar glukosa darah pada H16 meski tidak signifikan. Penurunan kadar glukosa darah terbesar dari H2 ke
8
H16 adalah pada kelompok kontrol positif sebesar 31.62% diikuti kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB sebesar 22.44%, dan kelompok ekstrak dosis 400 mg/Kg BB yang hanya 2.88%, sedangkan kelompok kontrol negatif masih mengalami peningkatan glukosa darah yang signifikan (p<0.05) (Tabel 3). Tabel 2 Kadar glukosa darah tikus selama perlakuan Kadar Glukosa Darah (mg/dL)a
Kelompok perlakuan
Perubahan H2-H16 (%)b
H0
H2
H9
H16
N
75.33 ± 11.85a
88..00 ± 19.31a
94.67 ± 12.58a,b
128.67 ± 27.46b
KP
76.33 ± 9.29a
323.67 ± 143.91a 228.33 ± 175.80a
221.33 ± 118.75a
-31.62
KN
79.67 ± 5.51a
320.33 ± 65.32b
361.33 ± 61.10b
402.33 ± 73.70b
25.60
KA200
81.00 ± 6.93a
270.33 ± 51.93b
315.67 ± 142.05b
209.67± 46.06a,b
-22.44
46.21*
KA400 79.33 ± 6.59a 312.00 ± 45.13b 362.33 ± 199.55b 303.00 ± 56.35b -2.88 a Nilai ditampilkan dalam rata-rata glukosa darah (n=3) ± SD, angka yang diikuti huruf yang sama pada baris yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada taraf nyata 95% (p<0.05). b Nilai ditampilkan dalam persen perubahan glukosa darah, tanda (*) menunjukkan perubahan signifikan pada taraf nyata 95% (p<0.05) dengan nilai negatif (-) menunjukkan perubahan negatif atau penurunan dan nilai positif menunjukkan perubahan positif atau kenaikan.
Kadar Insulin Serum Tikus Kadar insulin antarkelompok tidak berbeda nyata pada taraf nyata 95% (p>0.05). Kadar insulin kelompok positif hampir sama dengan kontrol normal. Kelompok KA200, KA400, dan kontrol negatif mempunyai kadar insulin yang lebih besar daripada kelompok normal. Tabel 3 Kadar insulin serum tikus pada H16 Kelompok Perlakuan N KP KN KA200 KA400
Kadar insulin serum (mIU/mL)a 0.1632 ± 0.02a 0.1596 ± 0.03a 0.2127 ± 0.05a 0.2106 ± 0.02a 0.2162 ± 0.07a
a
Nilai dinyatakan dalam rata-rata ± SD (n=3). Huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata pada taraf nyata 95% (p<0.05).
Histopatologi Pankreas Kelompok normal mempunyai pulau Langerhans yang terdiri atas sel α dan β (Gambar 4a). Pulau Langerhans pada kelompok kontrol negatif berukuran kecil, berjumlah sedikit, dan didominasi oleh sel α (Gambar 4b). Gambar 4c menunjukkan bahwa kelompok kontrol positif mempunyai pulau Langerhans berukuran hampir sama dengan kelompok normal dan didominasi oleh sel α. Kelompok KA200 tidak mempunyai kelainan signifikan pada pankreasnya, terdapat pulau Langerhans yang terdiri atas sel α dan β, sedangkan pada kelompok KA400 hanya terdapat beberapa pulau Langerhans yang berukuran kecil dan didominasi sel β (Gambar 4d dan 4e).
9
X X Y Y X
Y
(a)
(b)
(c) X Y
Y
X
(d)
(e)
Gambar 3 Jaringan pankreas dengan pewarnaan hematoksilin eosin perbesaran 200x, skala 50 µm. X: folikel pankreas; Y: pulau Langerhans. (a) Normal; (b) Kontrol Negatif; (c) Kontrol Positif; (d) KA200; (e) KA400.
PEMBAHASAN Kadar Air Simplisia dan Rendemen Ekstrak Kulit Kayu Surian Pengukuran kadar air dilakukan untuk mengetahui daya simpan simplisia. Kadar air simplisia kulit kayu surian adalah kurang dari 10%, yaitu 9.71%. Hal ini menunjukkan simplisia tersebut dapat mempunyai umur simpan cukup lama. Dirjen POM (2000) menyatakan bahwa kadar air yang baik untuk simplisia yang dapat disimpan dalam jangka waktu panjang adalah kurang dari 10% karena kadar air tinggi di dalam simplisia dapat memicu pertumbuhan jamur atau kapang dan reaksi enzimatis pembusukan yang mempengaruhi kandungan senyawa bioaktifnya. Simplisia kulit kayu surian pada Ichsan (2011) dan Monisa (2016) juga di bawah 10%, yaitu masing-masing 9.04%, dan 6%. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh metode pengeringan atau penyimpanan simplisia sebelum digunakan. Ekstraksi dalam penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan zat atau bioaktif yang terkandung di dalam simplisia kulit kayu surian. Banyaknya senyawa yang terekstrak dapat diduga melalui besarnya rendemen yang diperoleh. Rendemen terkoreksi ekstrak air kulit kayu surian adalah 6.96%. Ichsan (2011) melakukan ekstraksi kulit kayu surian dengan pelarut air dan metode pemanasan pada suhu 100 oC selama 4 jam mempunyai rendemen sebesar 2.6% dan Monisa (2016) menggunakan metode perebusan pada 80 oC selama 2 jam menghasilkan rendemen 9.07%, sedangkan Prabowo (2012) mengekstrak dengan metode maserasi dan pelarut etanol 70% memperoleh rendemen sebesar 4.8%.
10
Ekstraksi yang dilakukan mendapatkan ekstrak yang lebih banyak daripada Ichsan (2011) karena pemanasan yang dilakukan lebih lama dan suhu lebih tinggi dimungkinkan dapat merusak beberapa jenis senyawa fitokimia, sedangkan Monisa (2016) mempunyai rendemen lebih besar dimungkinkan karena waktu ekstraksi lebih lama sehingga lebih maksimal. Rendemen yang diperoleh juga lebih sedikit dibandingkan dengan Prabowo (2012) karena sifat etanol 70% lebih semipolar sehingga dapat mengekstrak lebih banyak senyawa fitokimia yang bersifat polar, semipolar, dan nonpolar. Ekstraksi dalam penelitian ini menggunakan metode refluks, yaitu perendaman simplisia oleh pelarut yang dipanaskan dan uap pelarut akan kembali ke perendaman karena adanya pendingin tegak. Suhermanto (2013) menyatakan bahwa prinsip refluks hampir sama dengan perebusan, yang membedakan adalah adanya pendingin tegak untuk mengembalikan uap pelarut ke campuran simplisia dan pelarut sehingga dapat mencegah penguapan pelarut yang berlebih. Pelarut yang digunakan adalah air, sehingga metode ini tepat digunakan untuk mencegah tumbuhnya mikroorganisme saat ekstraksi. Metode maserasi tidak dipilih karena perendaman simplisia dalam air dapat memicu pertumbuhan mikroorganisme, sedangkan metode soxhlet juga tidak dipilih karena suhu tinggi dalam metode tersebut memungkinkan terjadi kerusakan senyawa fitokimia. Pemilihan air sebagai pelarut juga didasarkan pada Hsu et al. (2014) dan Prasad et al. (2010), bahwa senyawa yang berpotensial sebagai antidiabetes pada Toona sinensis adalah dari golongan flavonoid dan asam galat yang juga dapat larut pada pelarut polar. Penggunaan panas dan pengulangan pada ekstraksi untuk memaksimalkan senyawa fitokimia yang tersekstrak (Rostagno dan Prado 2013). Penggunaan suhu 90 °C bertujuan mencegah kerusakan bahan aktif akibat panas berlebih, dan senyawa flavonoid dan asam galat tidak rusak pada suhu 90 °C (Hsu et al. 2014). Selain itu, suhu dan pelarut yang digunakan dalam ekstraksi berkaitan dengan kebiasaan masyarakat Cina yang menggunakan tanaman ini sebagai minuman dan obat tradisional dengan cara diseduh menggunakan panas. Senyawa Fitokimia Ekstrak Air Kulit Kayu Surian Penapisan senyawa fitokimia yang dilakukan bertujuan menganalisis keberadaan senyawa fitokimia di ekstrak air kulit kayu surian yang diduga sebagai senyawa bioaktif dalam aktivitas antihiperglikemia. Ekstrak air kulit kayu surian mengandung flavonoid, saponin, tanin, fenolik hidrokuinon, dan glikosida (Tabel 1). Senyawa fitokimia tersebut bersifat polar sehingga dapat terekstrak oleh air. Steroid dan triterpenoid bersifat nonpolar sehingga tidak dapat terekstrak air, sedangkan saponin merupakan glikosida yang gugus aglikonnya berupa steroid dan gugus glikon berupa gula yang larut dalam polar sehingga dapat terekstrak dengan pelarut air (Podolak et al. 2010). Ichsan (2011) menyatakan bahwa ekstrak air kulit kayu surian mengandung flavonoid, saponin, dan fenol hidrokuinon sedangkan ekstrak air kulit kayu surian pada Monisa (2016) mengandung flavonoid, triterpenoid, saponin, dan tanin. Hsu et al. (2014) juga menyatakan bahwa T. sinensis mengandung banyak senyawa asam galat, kuersetin, dan rutin. Perbedaan senyawa fitokimia pada jenis tumbuhan yang sama dapat dipengaruhi
11
oleh umur, variasi genetik, lokasi tumbuh, dan metode serta pelarut ekstraksi (Kardono 2003). Senyawa yang diduga dapat menurunkan kadar glukosa darah adalah flavonoid. Hsu et al. (2014) menyatakan bahwa rutin yang termasuk golongan flavonoid dalam T. sinensis dapat meningkatkan aktivitas reseptor insulin kinase, translokasi GLUT4 pada sel yang mengalami resistensi insulin, serta menurunkan glukosa darah pada mencit yang mengalami resistensi insulin. Asam galat juga meningkatkan translokasi GLUT4 melalui jalur Akt yang tidak bergantung insulin dan meningkatkan ekspresi Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) (Prasad et al. 2010). Bobot Badan dan Konsumsi Pakan Tikus Tikus merupakan hewan yang sensitif dengan lingkungannya sehingga perlu diadaptasikan sebelum penelitian dilakukan. Proses adaptasi memungkinkan tikus mengenali dan nyaman dengan lingkungannya. Hal tersebut dapat ditunjukkan dengan tikus yang tidak mengalami stres, bobot badan dan konsumsi pakan yang terus meningkat, dan kondisi kesehatan yang baik (Arts et al. 2014). Bobot badan tikus diukur untuk mengetahui pengaruh perlakuan, memantau kondisi klinisnya, dan dapat digunakan sebagai indikator kecukupan periode aklimatisasi (Lee et al. 2012). Bobot badan tikus dapat dipengaruhi oleh jumlah konsumsi pakan, aktivitas tikus, tingkat stress, dan pengaruh perlakuan penelitian (Poetra 2015) Tikus percobaan yang digunakan mengalami peningkatan bobot badan selama masa adaptasi (Gambar 1), menunjukkan bahwa tikus telah menyesuaikan diri dengan lingkungannya dan tidak mengalami stres. Induksi streptozotosin membuat terjadinya penurunan bobot badan tikus dan terus menurun selama perlakuan, kecuali pada kelompok normal. King (2012) menyatakan bahwa induksi secara kimia dengan menggunakan streptozotosin atau aloksan pada hewan model diabetes menyebabkan persentase kerusakan yang tinggi pada sel β pankreas sehingga produksi insulin menjadi rendah dan memicu hiperglikemia dan penurunan bobot badan. Penurunan bobot badan pada kelompok ekstrak dan kontrol positif tidak signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak dan glibenklamida dapat menekan penurunan bobot badan tikus. Sarkar et al. (2011) menyatakan bahwa obat golongan sulfonilurea cocok untuk pasien diabetes yang tidak mengalami bobot badan berlebih, dan obat tersebut dapat meningkatkan bobot badan. Bobot badan yang terus menurun ini berkorelasi dengan kondisi diabetes mellitus. CDC (2014) menjelaskan bahwa diabetes mellitus mempunyai gejala klinis hiperglikemia, poliuria, polidipsia, polifagia, dan penurunan berat badan. Tikus kelompok normal juga mengalami penurunan bobot badan pada H2 pascainduksi bufer sitrat. Hal ini disebabkan tikus mengalami stres sesaat setelah perlakuan induksi. Setelah induksi bufer sitrat, tikus kelompok normal terus mengalami peningkatan bobot badan seperti tikus normal pada umumnya. Konsumsi pakan tikus meningkat selama masa adaptasi menunjukkan bahwa tikus telah mengalami penyesuaian dengan lingkungannya. Konsumsi pakan selama masa adaptasi adalah 10-15 g (Gambar 2), menunjukkan bahwa tikus pada kondisi baik karena konsumsi pakan tikus normal adalah 5-10 g/100g BB
12
(Wolfensohn dan Lloyd 2013). Terdapat beberapa hal yang dapat mempengaruhi konsumsi pakan tikus, diantaranya faktor genetik yang dapat berupa ukuran badan atau potensial tumbuh; kemampuan reproduktif; perubahan metabolik, dan faktor lingkungan yang meliputi siklus hidup, kondisi mikrobial lingkungan, perlakuan penelitian yang menginduksi stres, dan bahan tambahan pada pakan (Suckow et al. 2006). Konsumsi pakan yang stabil pada kelompok normal menunjukkan tikus berada pada kondisi sehat dan normal. Kelompok kontrol negatif yang mengalami peningkatan konsumsi pakan yang terus-menerus menunjukkan gejala klinis diabetes, yaitu polifagia atau lapar yang berlebihan (CDC 2014). Kelompok kontrol positif mengalami peningkatan konsumsi pakan tetapi tidak signifikan. Hal ini disebabkan oleh pengaruh glibenklamida yang menurunkan glukosa darah sehingga mengurangi tingginya gejala diabetes yang ditimbulkan. Kelompok KA200 dan KA400 mempunyai peningkatan konsumsi pakan menunjukkan bahwa kelompok tersebut masih mempunyai gejala diabetes mellitus. Penelitian Prabowo (2012) menunjukkan penurunan bobot badan tikus yang diinduksi aloksan, tetapi tikus yang diberi ekstrak etanol kulit kayu surian dosis 150 mg/Kg BB dan tikus yang diberi glibenklamida penurunannya dihambat. Selain itu, induksi tersebut juga menyebabkan terjadinya kenaikan konsumsi pakan, namun terjadi penurunan konsumsi pakan pada kelompok glibenklamida dan ekstrak dosis 150 mg/Kg BB setelah dua minggu perlakuan. Hasibuan et al. (2016) juga menyatakan bahwa induksi streptozotosin dosis 50 mg/Kg BB dapat menurunkan bobot badan tikus, dan pemberian formula campuran ekstrak sirih merah dan kulit kayu manis 5:3 dengan dosis 630, 1260, dan 1890 mg/Kg BB selama 14 hari dapat menekan penurunan bobot badan tikus dan menjaga kestabilannya. Penelitian tersebut menunjukkan terjadi kenaikan konsumsi pakan pada tikus diabetes sementara penurunan pada tikus diabetes yang diberi pengobatan. Kadar Glukosa Darah Tikus Glukosa darah merupakan parameter utama untuk mendiagnosis diabetes mellitus. Kondisi hiperglikemia adalah ciri utama penyakit tersebut. Pengukuran glukosa darah dilakukan dengan menggunakan glukometer Accucheck. Prinsip kerja alat tersebut adalah glukosa dehidrogenase yang terdapat di strip mengonversi glukosa dari sampel menjadi glukonolakton. Setiap reaksi menghasilkan dua elektron yang bereaksi dengan koenzim penerima elektron. Elektron yang dihasilkan diteruskan oleh elektroda glukometer sebagai sinyal (arus listrik) untuk ditampilkan sebagai konsentrasi glukosa berdasarkan rumus Cottrel (Owiredu et al. 2009). Pengukuran pada H0 dilakukan untuk mengonfirmasi bahwa tikus yang digunakan merupakan tikus normal, tidak mengalami hiperglikemia sebelum digunakan. Glukosa darah semua tikus pada H0 termasuk dalam glukosa darah tikus normal (Tabel 2). Menurut Wolfensohn dan Lloyd (2013), kadar glukosa darah normal tikus Sprague Dawley jantan normal adalah 50-135 mg/dL. Efek STZ yang diinduksikan pada tikus secara intraperitoneal pada H0 dapat terlihat pada 48 jam setelah induksi (Wu dan Huan 2008). STZ merusak sel β pankreas sehingga sel tersebut tidak dapat menghasilkan insulin dan
13
mengakibatkan glukosa darah meningkat (Gambar 3). Goud et al. (2015) menjelaskan bahwa mekanisme perusakan sel β pankreas oleh senyawa ini belum sepenuhnya diketahui, tetapi beberapa hipotesis menyatakan bahwa senyawa ini bersifat toksik intraseluler melalui karbamoilasi dan alkilasi komponen seluler, melepaskan nitrit oksida (NO), pembentukan radikal bebas dan stress oksidatif, serta inhibisi O-NAGase setelah masuk ke sel. STZ merusak secara spesifik pada sel yang mengandung GLUT 2, yaitu sel β pankreas, hati, dan ginjal pada tikus karena bersifat hidrofilik dan mempunyai struktur analog dengan glukosa. Tikus yang diinduksi STZ mengalami kenaikan glukosa darah yang signifikan hingga lebih dari 200 mg/dL (Tabel 2), menunjukkan bahwa tikus mengalami hiperglikemia. Wu dan Huan (2008) menyatakan bahwa kondisi hiperglikemia pada tikus setelah diinduksi STZ ditunjukkan dengan glukosa darah yang lebih dari 150 mg/dL. Tikus kelompok kontrol positif telah menunjukkan penurunan kadar glukosa darah pada hari ketujuh pemberian glibenklamida (H9), meskipun penurunannya belum signifikan (p>0.05). Tikus kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB dan 400 mg/Kg BB mengalami kenaikan glukosa darah pada minggu pertama perlakuan ekstrak sekitar 16%, namun menunjukkan penurunan pada minggu kedua (Tabel 2). Peningkatan kadar glukosa darah pada tikus perlakuan ekstrak di minggu pertama diduga mekanisme perusakan sel oleh STZ masih berlangsung tetapi ekstrak belum mampu menurunkan kadar glukosa darah. Pencekokan yang dilakukan selama dua minggu menunjukkan penurunan glukosa darah pada kelompok ekstrak dan kontrol positif (Tabel 2). Glibenklamida yang dicekokkan ke tikus kelompok kontrol positif dapat menurunkan kadar glukosa darah melalui mekanisme peningkatan sekresi insulin. Mekanisme kerja jenis obat ini adalah dengan berikatan dengan reseptor sulfonilurea yang merupakan subunit kanal KATP pada sel β pankreas. Ikatan tersebut dapat menutup kanal KATP, membran sel mengalami depolarisasi dan membuat kanal kalsium terbuka. Hal ini membuat kalsium masuk ke dalam sel memicu kontraksi mikrotubulus dan eksositosis insulin. Obat ini juga menginduksi sekresi insulin pada kadar glukosa plasma lebih rendah (Gambar 4, Sola et al. 2015). Sel β pankreas yang masih hidup atau sel baru hasil regenerasi dipicu sekresi insulinnya oleh obat tersebut sehingga dapat meningkatkan pengambilan glukosa oleh sel dan glukosa darah turun.
14
Gambar 4 Mekanisme glibenklamida (sulfonil urea) sebagai antihiperglikemia (Sola et al. 2015) Kelompok ekstrak menunjukkan aktivitas antihiperglikemianya pada minggu kedua. Dibandingkan dengan kontrol negatif yang mempunyai kadar glukosa darah yang terus naik, kelompok ekstrak mengalami penurunan (Tabel 2). Hal ini menunjukkan adanya pengaruh ekstrak yang diberikan. Meskipun penurunan tidak signifikan, tidak lebih besar dibandingkan dengan kontrol positif, dan belum mencapai kadar glukosa darah normal, ekstrak tersebut menunjukkan adanya aktivitas antihiperglikemia. Berbagai mekanisme antihiperglikemia senyawa yang ada di tumbuhan, diantaranya adalah penghambatan α-glukosidase, peningkatan pengambilan glukosa oleh sel melalui regulasi molekul transporter, aktivasi PPARγ, peningkatan adiponektin, peningkatan pembentukan glikogen, efek insulinomimetik dan insulinotropik, peningkatan d-chiro-inositol, peningkat atau mimetik incretin, peningkatan sekresi insulin melalui penempelan pada reseptor opioid, dan melalui mekanisme antioksidan (El-Abhar dan Schaalan 2014). Kulit kayu dan daun surian telah diketahui dapat menurunkan kadar glukosa darah melalui beberapa mekanisme, yaitu penghambatan α-glukosidase (Ichsan 2011, Monisa 2016), peningkatan uptake glukosa oleh sel melalui induksi pertahanan antioksidatif, fosforilasi Akt, antioksidan, dan translokasi GLUT4 (Hsu et al. 2014). Penurunan glukosa darah pada kelompok KA200 sebesar 22.44%, lebih besar daripada KA400 yang hanya mempunyai penurunan 2.88% (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antihiperglikemia kelompok KA200 lebih baik dibandingkan dengan KA400. Dosis yang lebih besar pada kelompok KA400 menunjukkan kandungan metabolit sekunder yang lebih banyak daripada dosis pada KA200. Kandungan flavonoid sebagai senyawa yang diduga sebagai antihiperglikemia yang terlalu tinggi dapat menjadi sebab terjadinya penurunan aktivitas antihiperglikemia. Hasil penelitian Prabowo (2012) juga menunjukkan bahwa aktivitas ekstrak etanol kulit kayu surian dengan dosis 150 mg/Kg BB lebih baik dibandingkan dosis 300 mg/Kg BB karena ekstrak dengan dosis tinggi kehilangan sifat
15
antioksidannya dan menjadi prooksidan. Bouayed dan Bohn (2010) menyatakan bahwa flavonoid, fenolik, vitamin C, vitamin D, dan senyawa antioksidan lain dapat bertindak sebagai prooksidan jika dalam konsentrasi tinggi, adanya logam berat, atau pH yang tidak sesuai. Sifat prooksidan tersebut berkaitan dengan karakteristik struktur flavonoid, yaitu adanya radikal hidroksil dan radikal fenolik akibat autooksidasi atau reaksi Fenton (Prochazkova et al. 2011). Selain itu, komposisi senyawa aktif dalam ekstrak juga berpengaruh pada aktivitasnya. Yang et al. (2014) menyatakan bahwa aktivitas kerja obat herbal dapat meningkat apabila menggabungkan senyawa yang bersifat sinergis, misalnya pada ekstrak Rhizoma coptidis yang mengandung banyak senyawa yang kepolarannya tinggi dapat meningkatkan aktivitas antidiabetes dan menurunkan toksisitas, sedangkan yang mengandung senyawa kepolaran rendah (umumnya alkaloid) mempunyai aktivitas antidiabetes dan toksisitas yang meningkat juga. Kadar Insulin Serum Tikus Induksi streptozotosin menyebabkan kematian sel β pankreas sehingga kadar insulin rendah atau tidak tersekresi dan menyebabkan kondisi hiperglikemia (Goud et al 2015). Pengukuran kadar insulin pada H16 dilakukan untuk mengetahui efek pemberian ekstrak terhadap produksi insulin pada tikus yang telah diinduksi streptozotosin. Pengukuran kadar insulin serum tikus dilakukan dengan menggunakan Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) model sandwich. Prinsip pengujian tersebut adalah pengukuran insulin sebagai antigen yang akan terikat secara spesifik oleh antibodi primer yang telah menempel pada permukaan sumur, kemudian antigen yang terikat antibodi primer akan dikenali oleh antibodi sekunder yang telah terkonjugasi horseradish peroxidase. Keberadaan enzim dideteksi dengan penambahan substrat yang oleh enzim tersebut dapat diubah menjadi produk berwarna (Qayee Bio 2016).
(a) (b) (c) (d) Gambar 5 Prinsip kerja ELISA (Wilson dan Walker 2010). a) antibodi primer yang menempel pada permukaan plate; b) antigen diinkubasikan dalam plate akan terikat pada antibodi primer;d) enzim yang terkonjugasi pada antibodi sekunder diinkubasikan dalam plate; e) substrat yang ditambahkan menyebabkan perubahan warna karena adanya enzim. Kelompok normal mempunyai kadar insulin 0.1632 mIU/mL, tidak jauh berbeda dengan Hasibuan et al. (2016) yang menyatakan bahwa tikus normal mempunyai kadar insulin 6.85±5.46 µg/L atau setara dengan 0.1648 mIU/mL (Tabel 3). Insulin pada kelompok normal tersebut dapat mengontrol kadar glukosa darah tetap dalam rentang normal (Tabel 2). Kontrol positif mempunyai kadar insulin yang hampir sama dengan kontrol normal. Hal ini menunjukkan pemberian glibenklamida mampu meningkatkan produksi insulin sampai kadar normal, sesuai dengan Sola et al. (2015) yang menyatakan bahwa glibenklamida
16
mempunyai mekanisme antidiabetes dengan menginduksi sekresi insulin untuk menurunkan kadar glukosa darah melalui persinyalan insulin. Kadar glukosa darah kelompok kontrol positif turun setelah diberi glibenklamida (Tabel 2). Kelompok KA200 dan KA400 mempunyai kadar insulin yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol normal dan kontrol positif, namun tidak berbeda nyata. Hal ini menunjukkan kelompok tersebut tidak mengalami hipoinsulinemia atau dengan pemberian ekstrak kulit kayu surian dapat meningkatkan produksi insulin. Kondisi yang serupa juga ditunjukkan oleh Hasibuan et al. (2016) bahwa pemberian minuman fungsional campuran sirih merah dan kayu manis dengan dosis 1260 mg/Kg BB selama 14 hari dapat meningkatkan insulin darah tikus yang diinduksi streptozotosin sampai mendekati kadar normal. Kadar insulin pada kelompok ekstrak diduga sebagai akibat terjadinya peningkatan sekresi insulin untuk menurunkan kadar glukosa darah. Glukosa darah pada kelompok tersebut mengalami penurunan sebanyak 22.44%, sedangkan kelompok KA400 hanya 2.88% (Tabel 2). Peningkatan produksi insulin juga dapat berkaitan dengan regenerasi sel β pankreas. Prabowo (2012) menyatakan bahwa ekstrak etanol kulit kayu surian dapat membantu peningkatan regenerasi sel β pankreas yang telah dirusak oleh aloksan. Kelompok kontrol negatif mempunyai kadar insulin yang hampir sama dengan kelompok KA200 dan KA400, sementara kadar glukosa darahnya semakin tinggi. Hal ini diduga sel yang tersisa dari kerusakan oleh STZ melakukan upaya mencapai homeostasis glukosa darah dengan menghasilkan insulin secara maksimal karena adanya stimulan glukosa dengan konsentrasi tinggi yang diterima oleh reseptor di permukaan sel β pankreas. Fu et al. (2013) menjelaskan bahwa glukosa merupakan sinyal utama untuk sekresi insulin terjadi, selain asam lemak dan protein. Glukosa akan masuk ke sel β pankreas melalui GLUT2, kemudian mengalami glikolisis dan terbentuk ATP. Semakin banyak glukosa, ATP yang terbentuk semakin banyak karena enzim glikolisis pada sel ini adalah glukokinase yang tidak diinhibisi oleh produknya. ATP yang banyak tersebut membuat kanal K+ tertutup. Hal tersebut membuat terjadinya depolarisasi dan kanal Ca2+ terbuka. Ca2+ yang masuk ke sel memicu pembentukkan dan sekresi insulin. Kelompok perlakuan ekstrak mempunyai kadar insulin serum yang tinggi dan mengalami penurunan kadar glukosa darah. Kadar insulin yang tinggi diduga disebabkan oleh ekstrak yang memicu produksi insulin oleh sel β pankreas yang tersisa dan membantu regenerasi sel tersebut. Insulin yang dihasilkan dapat untuk meregulasi penurunan glukosa darah. Selain itu, mekanisme penurunan glukosa darah dari ekstrak juga dapat terjadi, yaitu peningkatan sekresi insulin, peningkatan uptake glukosa oleh sel, penghambatan α-glukosidase, sebagai fitoinsulin, atau mekanisme yang lain. Hal tersebut yang diduga memungkinkan perlakuan ekstrak mempunyai kadar insulin yang tinggi dan mempunyai penurunan kadar glukosa darah. Pengukuran kadar insulin dalam penelitian ini menggunakan teknik pengenceran bertingkat dalam pembuatan standarnya. Hal ini memungkinkan adanya galat pada hasil konsentrasi insulin tersebut, mengingat prinsip ELISA sandwich yang digunakan adalah pengikatan antigen dengan antibodi yang sebelumnya telah menempel pada sumur microplate.
17
Histopatologi Pankreas Jaringan pankreas diambil secara acak untuk melihat kondisi sel pankreas pascainduksi STZ dan pemberian ekstrak. Kondisi sel dapat dilihat dengan menggunakan pewarnaan hematoksilin eosin. Prinsip pewarnaan tersebut adalah hematoksilin teroksidasi menjadi hematin yang dapat mewarnai nukleus yang bersifat asam sedangkan eosin mewarnai elemen basa seperti sitoplasma, sel darah merah, otot, dan kolagen. Densitas elemen tersebut ditunjukkan dengan kepekatan warna yang terbentuk, dari merah muda sampai merah (Orchard dan Nation 2012). Pulau Langerhans pada kelompok normal mengandung sel α dan β, menunjukkan bahwa tidak ada kerusakan sel pankreas meski terjadi peningkatan aktivitas sel α ditunjukkan dengan dominasi sel α (Gambar 3a). Kondisi pulau Langerhans yang normal tersebut dapat menyekresikan insulin dengan normal untuk menjaga homeostasis kadar glukosa darah (Tabel 2, Tabel 3). Kelompok kontrol negatif mempunyai pulau Langerhans yang berukuran kecil, didominasi sel α dan hanya sedikit sel β (Gambar 3b). Hal ini menunjukkan bahwa induksi STZ dosis 40 mg/Kg BB dan tidak diberi pengobatan mengakibatkan kerusakan sel β pankreas dengan regenerasi sel yang lambat. Sel β pankreas yang tersisa dan hasil regenerasi dipicu untuk terus menyekresikan insulin hingga melebihi kadar normal (Tabel 3) tetapi belum dapat menurunkan kadar glukosa darah (Tabel 2). Ukuran pulau Langerhans yang kecil juga dapat disebabkan oleh kerusakan sel akibat kondisi hiperglikemia. Hal ini sesuai dengan Brereton et al. (2014) bahwa pada kondisi hiperglikemia kronis terjadi penurunan sel penghasil insulin dan peningkatan aktivitas sel penghasil glukagon. Yogihashi et al. (2016) menjelaskan bahwa kerusakan sel β pankreas tersebut dapat disebabkan oleh stress oksidatif, stres retikulum endoplasma, dan defisit autofag. Stres oksidatif juga dapat ditimbulkan oleh autoooksidasi glukosa dan pada mitokondria pada kondisi hiperglikemia (Khangoli et al. 2016). Kelompok kontrol positif tidak mempunyai kelainan spesifik pada pulau Langerhansnya (Gambar 3c). Hal ini menunjukkan bahwa glibenklamida dapat meningkatkan sekresi insulin tetapi regenerasi sel pankreas yang terjadi tidak sampai pada kondisi normal pankreas. Brereton et al. (2014) menyatakan bahwa terapi glibenklamida dapat mencegah penurunan jumlah sel penghasil insulin dan perubahan sel penghasil glukagon, serta dapat mengembalikan perubahan histologis menjadi hampir sama dengan pankreas kelompok kontrol normal. Kadar insulin yang mendekati normal dan adanya penurunan kadar glukosa darah berkaitan dengan kondisi pulau Langerhans tersebut. Sel β pankreas yang tersisa dari perusakan STZ, hasil regenerasi, dan akibat glibenklamida dipicu untuk menyekresikan insulin (Tabel 3) sehingga kadar glukosa darah turun (Tabel 2) Kelompok KA200 mempunyai pulau Langerhans yang normal, ditunjukkan dengan ukuran dan komposisi sel yang sama dengan kelompok normal (Gambar 3d, 3a). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak dengan dosis 200 mg/Kg BB dapat memicu regenerasi dan mencegah kerusakan sel β pankreas. Sesuai dengan yang dinyatakan oleh Khangoli et al. (2016) bahwa senyawa fitokimia dapat berperan sebagai antidiabetes dengan agen protektif sel pankreas. Patel et al. (2012) juga menjelaskan bahwa senyawa fitokimia dapat bekerja sebagai antidiabetes melalui sifat insulin mimetik dan membantu proses regenerasi sel β pankreas, seperti asam gimnemik pada ekstrak alkohol Gymnema sylvestre yang
18
mempunyai kemampuan menstimulasi sekresi insulin melalui stimulasi proses regenerasi dan revitalisasi sel β pankreas. Ekstrak etanol kulit kayu surian dosis 150 mg/Kg BB menunjukkan adanya aktivitas antioksidan yang dapat menghambat kerusakan sel akibat induksi STZ (Prabowo 2012). Regenerasi dan pencegahan kerusakan sel β pankreas oleh ekstrak tersebut membuat sel β dapat menyekresikan insulin dan dengan adanya ekstrak dapat juga meningkatkan sekresi insulin sehingga kadar insulinnya lebih tinggi daripada normal (Tabel 3). Hal tersebut dapat menurunkan kadar glukosa darah (Tabel 2). Kondisi yang berbeda pada kelompok KA400 yaitu ukuran dan jumlah pulau Langerhans yang lebih kecil daripada kelompok KA200, dan didominasi sel β menunjukkan bahwa terjadi peningkatan aktivitas sel β (Gambar 4e). Ukuran kecil dan jumlah hanya beberapa menunjukkan terjadi kerusakan sel β dan pulau pankreas. Sekresi insulin yang dipicu secara terus menerus karena kadar glukosa darah yang tinggi ini juga dapat mengganggu produksi glukagon dan kinerja sel α. Hal tersebut diduga sebagai penyebab kelompok tersebut mempunyai pulau pankreas yang kecil dan didominasi sel β. Selain itu, Prabowo (2012) menyatakan bahwa pemberian ekstrak etanol kulit kayu dosis 300 mg/Kg BB pada tikus yang diinduksi aloksan menunjukkan masih terdapat nekrosis sel acinar dan haemoragi pankreas karena pengobatan yang belum optimal dan kemungkinan kerusakan oleh aktivitas prooksidasi.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak kulit kayu surian mengandung flavonoid, tanin, saponin, fenol hidrokuinon, dan glikosida. Ekstrak air kulit kayu surian dengan dosis 200 mg/Kg BB mempunyai aktivitas antihiperglikemik yang lebih baik daripada dosis 400 mg/Kg BB, yaitu dengan menekan penurunan bobot badan, menurunkan kadar glukosa darah sebesar 22.44%, dan kadar insulin yang tidak berbeda dengan kelompok normal. Tidak ada kelainan spesifik pada pulau Langerhans tikus kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB dan mempunyai kondisi normal, lebih baik daripada dosis 400 mg/Kg BB. Saran Pengukuran ulang kadar insulin perlu dilakukan. Pemberian perlakuan yang lebih lama perlu dilakukan untuk melihat efek jangka yang lebih panjang. Identifikasi senyawa secara kuantitatif, pemurnian ekstrak, dan optimasi dosis pemberian ekstrak juga perlu dilakukan. Pengujian viabilitas atau jumlah sel pulau Langerhans menggunakan imunohistokimia perlu dilakukan. Selain itu, perlu dilakukan kombinasi dengan ekstrak lain yang mempunyai aktivitas antihiperglikemia.
19
DAFTAR PUSTAKA [ADA] American Diabetes Association. 2015. Diagnosis and classification of diabetes melitus. Diabetes Care. 38(1): 1-94. Adnyana IK, Setyawan F, Insanu M. 2013. From ethnopharmacology to clinical study of Orthosiphon stamineus Benth. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 5(3): 66-73. [AOAC] Association of Analytical Chemist. 2005. Official Methods of Analysis. Arlington (US): Association of Analytical Chemist. Artz JWM, Kramer K, Arndt SS, Ohl F. 2014. Sex differences in physiological acclimatization after transfer in wistar rats. Animals Journal. 4(1): 693711. doi:10.3390/ani4040693 Awomukwu DA, Nyananyo BL, Onukwube ND, Uka CJ, Okeke CU, Ikpeama AI. 2014. Comparative phytochemical constituents and pharmacognistic importance of the vegetative organs of some Phyllanthus species in south eastern nigerian. International Journal of Modern Botany. 4(2): 29-39. Doi: 10.5923/j.ijmb.20140402.01 Bouayed J, Bohn T. 2010. Exogenous antioxidants-double-edged swords in cellular redox state. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 3(4): 228237. Doi: 10.4161/oxim.3.4.12858. Brereton MF, Iberl M, Shimomura K, Zhang Q, Adriaenssens AE, Proks P, Spiliotis II, Dace W, Mattis KK, Ramracheya R. 2014. Reversible changes in pancreatic islet structure and function produced by elevated blood glucose. Nature Communications. 5(4639): 1-11. DOI: 10.1038/ncomms5639 [CDC] Centers for Disease Control and Prevention. 2014. National Diabetes Statistics Report: Estimates of Diabetes and Its Burden in the United States 2014. Atlanta (US): Department of Health and Human Services. Dirjen POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta(ID): Departemen Kesehatan RI. Du W, Peng SM, Liu ZH, Shi L, Tan LF, Zou XQ. 2012. Hipoglycemic effect of the water extract of pe-erh tea. Agricultural and Food chemistry. 1(60): 10126-10132. DOI: 10.1021/jf302426w El-Abhar HS, Schaalan M. 2014. Phytotherapy in diabetes: review on potential mechanistic pespectives. Morld Journal Diabetes. 5(2): 176-197. doi:10.4239/wjd.v5.i2.176 Funmilayo OO, Kamaldeen AS, Buhari ASM. 2012. Phytochmical screening and antimicrobial properties of a common brand of black tea (Camelia sinensis) marketed in Nigerian environment. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2(2): 259-263. Doi: 10.5681/apb.2012.040.
20
Fu Z, Gilbert ER, Liu D. 2013. Regulation of insulin synthesis and secretion and pancreatic beta-cell dysfunction in diabetes. Current Diabetes Review. 9(1): 25-33. Goud BJ, Dwarakanath V, Swamy BKC. 2015. Streptozotocin- a diabetogenic agent in animal models. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Research. 3(1): 253-269. Harborne JB. 2006. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Bandung (ID): Penerbit ITB. Hasibuan MS, Yasni S, Bintang M, Ranri AS. 2016. Antihyperglycemic activity of Piper crocatum leaves and Cinnamomum burmanii bark mixture extract in streptozotocin-induced diabetic rats. Journal of Matheematic Fundamental Science. 48(2): 178-191. Heijden R, Jacobs DI, Snoeijer W, Hallard D, Verpoorte R. 2004. The Charanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology. Current Medical Chemistry. 11(1): 607-628. Hsieh TJ, Tsai YH, Liao MC, Du YC, Lien PJ, Sun CC< Chang FR, Wu YC. 2012. Anti-diabetic properties of non-polar Toona sinensis Roem extract prepared by supercritical-CO2 fluid. Food and Chemical Toxicology. 50(2012): 779-789. doi: 10.1016/j.fct.2011.12.023 Hsu CY, Shih HY, Chia YC, Lee CH, Ashida H, Lai YK, Weng CF. 2014. Rutin potentiates insulin receptor kinase to enhance insulin-dependent glucose transporter 4 translocation. Molecular Nutrition and Food Research. 1-9. Doi: 10.1002/mnfr.201300691 Ichsan SA. 2011. Aktivitas ekstrak kulit kayu surian (Toona sinensis Merr.) sebagai antioksidan dan antidiabetes secara in vitro. [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. [IDF] International Diabetes Federation. 2015. Atlas diabetes. [Internet]. [diunduh 2016 Okt 10]. Tersedia pada http://www.idf.org Jiang W, Shi Y, Zhao D, Chen S, Yong J, Zhang J, Qing T, Sun X, Zhang P, Ding M, et al. 2007. In vitro derivation of fungtional insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Cell Research. 17(28): 333-344. Kardono LBS. 2003. Kajian kandungan kimia mahkota dewa (Phaleria marcocarpa). Di dalam Prosiding Pameran Produk Obat Tradisional dan Semminar Sehari Mahkota Dewa. Jakarta (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Farmasi dan Obat Tradisional Departemen Kesehatan. 7276. Kemenkes RI. 2014. Situasi dan analisis diabetes. [Internet]. [diunduh 2016 Jan 11]. Tersedia pada http://www.depkes.go.id Khangoli S, Majid FAA, Berwary NJA, Ahmad F, Aziz RBA. 2016. The mechanisms of inhibition of advanced glycation end products formation through polyphenols in hyprglycemic condition. Planta Medicine. 82: 3245. Doi: 10.1055/s-0035-1558086.
21
King AJF. 2012. The use of animal models in diabetes research. British Journal of Pharmacology. 166: 877-894. Doi:10.1111/j.1476-5381.2012.01911.x Lee S, Nam H, Kim J, Cho H, Jang Y, Lee E, Choi E, Jin D, Moon H. 2012. Body weight changes of laboratory animals during transportation. AsianAustralas Journal Animal Sciences. 25: 286-290. Malewska T. 2014. Biological and phytochemical analysis of chungtia medicinal plants of Nagaland, india [tesis]. Sydney (AU): Macquarie University. Monisa FS. 2016. Jenis tanin, total tanin, dan aktivitas penghambatan αglukosidase dari ekstrak daun dan kulit batang surian (Toona sinensis Merr.) [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Mujib A, Ilah A, Aslam J, Fatima S, Siddiqui ZH, Maqsood M. 2012. Catharanthus roseus alkaloids: application of biotechnology for improving yield. Plant Growth Regulation. 68:111-127. Doi: 10.1007/s10725-0129704-4 Orchard G, Nation B. 2012. Hystopathology. New York (US): Oxford University Pers. Owiredu WKBA, Amgatcher G, Amidu N. 2009. Precision and accuracy of three blood glucose meters: accu-check advantage, one touch horizon, and sensocard. Journal of Medical Science. 9(4): 185-193. Patel D, Prasad S, Kumar R, Hemalatha S. 2012. An overview on antidiabetic medical plants having insulin mimetic proprerty. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2: 320-330. Doi: 10.1016/S2221-1691 Podolak I, Galanty A, Sobolewska D. 2010. Saponins as cytotoxic agents: a review. Phytochem Rev. 9(1): 425-474. Doi 10.1007/s11101-010-9183-z Poetra GT. 2015. Kadar biomarker darah tikus obesitas yang diberi ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Prabowo AF. 2012. Potensi antidiabetes ekstrak kulit kayu suren (Toona sinensis) pada tikus Sprague-dawley yang diinduksi aloksan. [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Prasad CN, Anjana T, Banerji A, Gopalakrishnapillai A. 2010. Gallic acid induces GLUT4 translocation and glucose uptake activity in 3T3-L1 cells. FEBS Lett. 584: 531-586. Prochazkova D, Bousova I, Wilhelmova N. 2011. Antioxidant and prooxidant properties of flavonoids. Fitoterapia. 8(2):513-523. doi:10.1016/j.fitote. 2011.01.018 Putranto HD, Ginting SM, Nurmeliasari, Yumiati Y. 2014. Skrining senyawa metabolit steroid sebagai hormone reproduksi ternak pada tanaman katuk dan jantung pisang. Jurrnal Peternakan Indonesia. 16(1): 20-25. Qayee-Bio. 2016. Rat insulin ELISA kit instruction. Shanghai (CN): Qayee-Bio
22
Ratnayani K, Adhi NMA, Gitadewi IG. 2008. Penentuan kadar glukosa dan fruktosa pada madu randu dan madu kelengkeng dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi. Jurnal Kimia. 2(2):77-86. Rivai H, Nurdin H, Suyani H, Bakhtiar A. 2011. Pengaruh cara pengeringan terhadap mutu herba meniran (Phyllanthus niruri linn.). Majalah Farmasi Indonesia. 22(1): 73-76. Rostagno MA, Prado JM. 2013. Natural Products Extraction: Principles and Applications. Cambridge (UK): Royal Science of Chemistry Publishing. Sari RK, Syafii W, Achmadi SS, Hanafi M. 2011. Aktivitas antioksidan dan toksisitas ekstrak etanol surian (Toona sinensis). Jurnal Ilmu dan Teknologi Hasil Hutan. 4(2): 46-52. Sarkar A, Tiwari A, Parminder SB, Mitra M. 2011. Pharmacologocal and pharmaceutical profile of gliclazide: a review. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 1(9): 11-19. Saryana RV, Suryanto E, Sangi MS. 2014. Perbandingan aktivitas antioksidan dari tongkol jagung (Zea mays) segar dan kering dengan metode refluks. Jurnal MIPA UNSRAT Online. 3(2): 92-96. Sjostron E. 2007. Wood Chemistry: Fundamentals and Applications. London (UK): Academic Press. Sola D, Rossi L, Schianca GPC, Maffioli P, Bigliocca M, Mell R, Corliano F, Fra GP, Bartoli E, Derosa G. 2015. Sulfonylureas and their use in clinical practice. Arch Med Sci. 11(4):840-848. DOI: 10.5114/aoms.2015.53304. Suckow MA, Weisbroth SH, Franklin CL. 2006 The Laboratory Rat. London (UK): Elsevier. Suhermanto. 2013. Profil flavonoid, tannin, dan alkaloid dari ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Sukandar EY, Hidriyanny I, Garmana AN. 2008. Pengaruh kombinasi ekstrak umbi lapis bawang putih dan ekstak rimpang kunyit terhadap janin mencit Swiss Webster. Jurnal Kesehatan Masyarakat. 8(1):36-44. Wang KJ, Yang R, Zhang YJ. 2007. Phenolic antioxidant (fresh young leaves and shoots of Toona sinensis. Food Chemistry. 100(1): 305-371. Wilson K, Walker J. 2010. Principle and Technique of Biochemistry and Molecular Biolog Seventh Edition. New York (US): Cambridge University Press. Wolfensohn S, Lloyd M. 2013. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare Eight Edition. Oxford (UK): Blackwell Science Ltd. Wu KK, Huan Y. 2008. Streptozotosin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols in Pharmacology. 40: 5.47.1-5.47.14. doi: 10.1002/0471141755.ph0547s40
23
Yang Y, Zhang Z, Li S, Ye X, Li X, He K. 2014. Sinergy effect of herb extract: pharmacokinetics and pharmacodynamics basis. Fitoterapia. 92: 133-147. Doi: 10.1016/j.fitote.2013.10.010 Yogihashi S, Inaba W, Mizukami H. 2016. Dynamic pathology of islet endocrine cells in type 2 diabetes: b-cell growth, death, regeneration and their clinical implications. Journal of Diabetes Investigation. 7: 155-165.
24
LAMPIRAN
25
Lampiran 1 Gambaran umum penelitian
Adaptasi tikus Sprague Dawley
Kulit kayu surian
Preparasi sampel
Pengukuran kadar glukosa darah hari ke-0
Simplisia kulit kayu surian
Penginjeksian streptozotosin secara intraperitoneal
Pengukuran kadar glukosa darah hari ke-2
Ekstraksi
Ekstrak air kulit kayu surian
Pencekokan tikus sesuai kelompok perlakuan Pengukuran kadar glukosa darah hari ke-
9 Pengukuran kadar glukosa darah hari ke16 Pengukuran kadar insulin serum
Pengamatan preparat histopatologi pankreas tikus
Analisis statistika
26
Lampiran 2 Kadar air simplisia Ulangan Bobot cawan Bobot simplisia Bobot kering Kadar air (%) kosong (g) (g) (g) 1 29.9348 2.0009 31.7422 9.67 2 30.4796 2.0010 32.2850 9.77 3 36.6341 2.0015 38.4415 9.69 a Rata-rata 9.71±0.05 Contoh perhitungan ( obot cawan kosong obot simplisia) ( obot kering) adar air x 00 obot simplisia (
2.0009) ( 2.0009
)
x 00
= 9.67% Lampiran 3 Rendemen ekstrak air kulit kayu surian Ulangan Bobot simplisia (g) Bobot ekstrak (g) 1 2 3 4
50.0036 50.0032 150.0085 60.0004 Rata-rata a Contoh perhitungan
3.1438 1.3089 12.6817 3.4209
Rendemen terkoreksi (%) 6.96 2.90 9.36 6.31 6.38±2.41
obot ekstrak ) x 00 obot simplisia x ( adar air) . 4 8 ( ) x 00 50.00 6x( 0.97 ) = 6.96%
Rendemen terkoreksi (
27
Lampiran 4 Senyawa fitokimia ekstrak air kulit kayu surian Senyawa yang diuji
Hasil
Alkaloid
Gambar KA
Kontrol Positif Daun tapak dara
Wagner
-
Meyer
-
Dragendorf
Daun meniran
Flavonoid
+
Teh Tanin
+
Kayu manis Fenol Hidrokuinon
+
Daun katuk Steroid
-
Kunyit Triterpenoid
-
28
Daun kumis kucing
+
Saponin
Madu
+
Glikosida
Lampiran 5 Bobot badan tikus Kelompok
Bobot badan (g)
Ulangan H-8
NORMAL
KN
KP
KA200
KA400
H-1
H+2
H+9
H+16
1
177
187
182
185
183
2
217
218
208
217
222
3
202
223
205
206
213
Rata-rata
198.67
209.3333
198.3333
202.6667
206
SD
20.21
19.50214
14.22439
16.25833
20.42058
1
229
245
206
190
176
2
235
227
215
188
172
3
242
266
263
248
221
Rata-rata
235.3333
246
228
208.6667
189.6667
SD
6.506407
19.51922
30.64311
34.07834
27.20907
1
183
193
166
157
147
2
200
210
199
192
199
3
208
195
189
199
189
Rata-rata
197
199.3333
184.6667
182.6667
178.3333
SD
12.76715
9.291573
16.92139
22.50185
27.59227
1
218
241
206
192
189
2
245
271
241
220
209
3
238
270
277
232
215
Rata-rata
233.6667
260.6667
241.3333
214.6667
204.3333
SD
14.0119
17.03917
35.50117
20.52641
13.61372
1
264
267
245
238
221
2
219
214
198
181
168
3
231
257
259
236
232
Rata-rata
238
246
234
218.3333
207
SD
23.30236
28.16026
31.95309
32.34708
34.21988
Lampiran 6 Perubahan bobot badan tikus Perubahan bobot badan (%)a Kelompok H-8 – H-1 H0 – H2 H2 – H9 N 5.37 -5.25 2.18 KP 1.18 -7.36 -1.08 KN 4.53 -7.32 -8.48*
H2 – H16 3.87 -3.43 -16.81*
29
KA200 KA400 a
11.55 3.36
-7.42 -4.88
-11.05 -6.69
-15.33 -11.54*
Nilai ditunjukkan dengan % perubahan, tanda (-) menunjukkan penurunan. Angka yang diikuti tanda (*) menunjukkan perubahan signifikan pada taraf nyata 95% (p<0.05). N: kelompok normal; KP: kelompok kontrol positif; KN: kelompok kontrol negatif; KA200: kelompok ekstrak dosis 200 mg/Kg BB; KA400: kelompok ekstrak dosis 400 mg/Kg BB.
30
Lampiran 7 Konsumsi pakan tikus Konsumsi pakan (gram) N
M0
KA200
KA400
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
H-8
10
16
14
11
11
1
1
12
20
13
14
20
15
2
20
H-7
10
14
15
7
13
16
20
13
20
14
13
20
16
18
20
H-6
7
17
14
3
9
20
20
12
20
12
15
20
15
20
20
H-5
8
15
14
9
15
9
2
11
20
14
16
20
17
12
20
H-4
12
13
16
17
16
15
12
12
20
12
15
20
16
10
20
H-3
10
18
12
7
15
14
15
8
20
14
16
20
18
7
20
H-2
11
17
16
9
15
13
20
15
20
17
17
20
17
13
20
H-1
7
16
13
10
14
15
14
17
20
11
16
20
11
11
20
13.1
11.83
15.17
16.21
15.75
H1
15
20
20
15
19
12
11
14
16
13
20
15
20
9
8
H3
7
16
9
8
16
19
20
3
17
11
14
15
9
6
20
H4
7
17
16
0
13
19
20
11
15
14
15
20
17
5
20
H5
6
19
13
8
12
20
16
16
18
18
20
16
4
13
10
H6
10
20
13
11
3
20
16
20
16
20
6
18
20
15
14
H7
15
17
13
8
11
19
18
20
20
3
20
16
20
17
20
H8
8
16
14
8
13
18
20
20
20
14
13
20
20
16
20
Rata-rata
M2
KN
1
Rata-rata
M1
KP
13.11
12.56
17
15.17
14.78
H10
11
20
20
16
20
20
20
20
20
20
20
20
20
17
20
H11
9
12
15
4
13
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
H12
8
18
15
11
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
H13
10
15
14
12
19
7
20
20
20
20
20
20
20
20
20
H14
7
18
11
15
13
20
20
20
20
15
20
20
20
20
20
H15
6
14
12
13
16
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
Rata-rata
13.06
15.5
20
19.72
19.83
31
Lampiran 8 Glukosa darah tikus Kelom pok
Kadar glukosa darah (mg/dL) Ulang an
H0
H2
H9
H16
1
89
92
108
146
2
69
105
93
143
68
67
83
97
75.33 ± 11.85
88..00 ± 19.31
94.67 ± 12.58
128.67 ± 27.46
1
87
354
431
354
2
72
167
137
125
70
450
117
185
76.33 ± 9.29
323.67 ± 143.91
228.33 ± 175.80
221.33 ± 118.75
1
77
248
308
347
2
86
375
428
486
76
338
348
374
79.67 ± 5.51
320.33 ± 65.32
361.33 ± 61.10
402.33 ± 73.70
1
89
278
157
207
2
77
215
431
257
77
318
359
165
81.00 ± 6.93
270.33 ± 51.93
315.67 ± 142.05
209.67± 46.06
1
81
308
549
238
2
72
359
386
333
85
269
152
338
79.33 ± 6.59
312.00 ± 45.13
362.33 ± 199.55
303.00 ± 56.35
N
3 Rata-rata ± SD
KP 3 Rata-rata ± SD
KN 3 Rata-rata ± SD
KA200 3 Rata-rata ± SD
KA400 3 Rata-rata ± SD
Lampiran 9 Perubahan kadar glukosa darah tikus Kelompok N KP KN KA200 KA400 a
Perubahan kadar glukosa darah (%)a H0-H2 H2-H9 H2-H16 16.81 7.58 46.21* * 324.02 -29.45 -31.62 302.09* 12.18 25.60 233.75* 16.77 -22.44 293.28* 16.13 -2.88
Nilai ditampilkan dalam % penurunan rata-rata glukosa darah (n=3) ± SD, angka yang diikuti tanda (*) menunjukkan perubahan signifikan pada taraf nyata 95% (p<0.05) dengan nilai negatif () menunjukkan perubahan negatif aatau penurunan dan nilai positif menunjukkan perubahan positif atau kenaikan.
32
Lampiran 10 Absorbansi standar pada panjang gelombang 450 nm Standar (µIU/mL) Absobansi terukur Absorbansi terkoreksi 0 0.053 -0.015 12.5 0.0705 0.0025 25 0.1095 0.0415 50 0.2185 0.1505 100 0.389 0.321 200 0.705 0.637 Intersep -0.0267 Slope 0.0033 Koefisien determinasi 0.9974 Lampiran 11 Standar insulin pada panjang gelombang 450 nm 0.7 y = 0.0033x - 0.0267 R² = 0.9974
0.6
Absorbansi
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1
50
100
150
Standar (µIU/mL)
200
250
33
Lampiran 12 Kadar insulin tikus Kelompok
KA200
Ulangan 1 2 3
KA400
1 2 3
N
1 2 3
KP
1 2 3
KN
1 2 3
Absoransi terkoreksi 0.128 0.097 0.112 Rata-rata SD 0.17 0.073 0.105 Rata-rata SD 0.098 0.067 0.078 Rata-rata SD 0.098 0.0575 0.0805 Rata-rata SD 0.1565 0.0945 0.09 Rata-rata SD
[Insulin] (mIU/mL) 0.2344 0.1874 0.2101 0.2106 0.0235 0.2980 0.1511 0.1995 0.2162 0.0749 0.1889 0.1419 0.1586 0.1632 0.0238 0.1889 0.1276 0.1624 0.1596 0.0307 0.2776 0.1836 0.1768 0.2127 0.0563
Contoh perhitungan (KA200) adar insulin (
mIU Absorbansi intersep) mIU ) ( ) IU mL x FPx mL slope 000 IU 0. 28 0.0267) ) 0.00
=(
IU mLx 5 x
mIU 000 IU
0.2 44 mIU mL
Lampiran 13 Hasil analisis statistika glukosa darah (ANOVA) NORMAL Duncan HARI PERLAKUAN
N
Subset 1
2
H0
3
75.33
H2
3
88.00
H9
3
94.67
H16
3
Sig.
94.67 128.67
.263
.058
34
POSITIF Duncan HARI PERLAKUAN
N
Subset 1
H0
3
76.33
H16
3
221.33
H9
3
228.33
H2
3
323.67
Sig.
.057 NEGATIF
Duncan HARI PERLAKUAN
N
Subset for alpha = 0.05 1
2
H0
3
79.67
H2
3
320.33
H9
3
361.33
H16
3
402.33
Sig.
1.000
.135
KA200 Duncan HARI PERLAKUAN
N
Subset for alpha = 0.05 1
2
H0
3
81.00
H16
3
209.67
H2
3
270.33
H9
3
315.67
Sig.
209.67
.082
.154
KA400 Duncan HARI PERLAKUAN
N
Subset 1
2
H0
3
H16
3
303.00
H2
3
312.00
H9
3
362.33
Sig.
79.33
1.000
.530
35
Lampiran 14 Hasil analisis statistika kadar insulin (ANOVA) Analisis Sidik Ragam INSULIN Jumlah kuadrat
db
Rata-rata
F
Sig (p)
kuadrat Between Groups
.010
4
.002
Within Groups
.022
10
.002
Total
.031
14
1.120
.400
Lampiran 15 Hasil analisis perubahan glukosa darah (uji t berpasangan) Kelompok Normal Uji t berpasangan Paired Differences
t
Rata-
Standar
Rata-
Selang kepercayaaan
rata
deviasi
rata
95%
standar
Batas bawah Batas atas
Derajat Sig. (2bebas
tailed)
error H0 - H2
-12.667
20.306
11.724
-63.110
37.776 -1.080
2
.393
H2 - H9
-6.667
16.166
9.333
-46.825
33.491
-.714
2
.549
H9 - H16
-34.000
18.330
10.583
-79.535
11.535 -3.213
2
.085
H2 - H16 -40.667 12.220 Kelompok Kontrol Positif
7.055
-71.023
-10.310 -5.764
2
.029
Uji t berpasangan Perbedaan berpasangan
t
Rata-
Standar
Rata-
Selang kepercayaan
rata
deviasi
rata
95%
Derajat
Sig.
bebas
(2tailed)
standar Batas bawah Batas atas error H0 - H2
-247.333
H2 - H9
95.333
H9 - H16
7.000
143.514
82.858
-603.842
109.176 -2.985
2
.096
212.665 122.782
-432.955
623.622
.776
2
.519
72.629
41.932
-173.421
187.421
.167
2
.883
H2 - H16 102.333 142.430 Kontrol Negatif
82.232
-251.483
456.149
1.244
2
.339
Uji t berpasangan Perbedaan berpasangan
t
Rata-
Standar
Rata-rata
Selang kepercayaan 95%
rata
deviasi
standar
Batas bawah Batas atas
Deraja
Sig.
t bebas
(2tailed)
error H0 - H2
-240.667
61.825
35.695
-394.249
-87.085
-6.742
2
.021
H2 - H9
-41.000
27.074
15.631
-108.255
26.255
-2.623
2
.120
H9 - H16
-41.000
16.093
9.292
-80.978
-1.022
-4.413
2
.048
H2 - H16
-82.000
40.286
23.259
-182.077
18.077
-3.525
2
.072
36
KA200 Uji t berpasangan Perbedaan berpasangan Ratarata
t
Derajat
Sig.
bebas
(2-
Standar Rata-rata Selang kepercayaan 95% deviasi
standar
Batas bawah
tailed
Batas atas
)
error H0 - H2
-189.333
51.501
29.734
-317.268
-61.398 -6.368
2
.024
H2 - H9
-45.333 168.542
97.308
-464.014
373.348
-.466
2
.687
H9 - H16
106.000 135.470
78.213
-230.525
442.525
1.355
2
.308
56.528
-182.555
303.888
1.073
2
.395
H2 - H16 60.667 KA400
97.910
Uji t berpasangan Perbedaan berpasangan Rata-rata Standar
Rata-rata
deviasi
t
db
(2-
Selang kepercayaan 95%
standar error Batas bawah
tailed)
Batas atas
H0 - H2
-232.667
51.733
29.868
-361.179
H2 - H9
-50.333
180.137
104.002
-497.818
397.152
H9 - H16
59.333
248.561
143.506
-558.125
H2 - H16
9.000
71.042
41.016
-167.479
Sig.
-104.154 -7.790
2
.016
-.484
2
.676
676.792
.413
2
.719
185.479
.219
2
.847
Lampiran 16 Hasil analisis statistika perubahan bobot badan Kelompok normal Uji t berpasangan Pnerbedaan berpasang Ratarata h_8 - h0
Standar
Rata-rata
t
Sig. (2tailed)
Selang kepercayaan 95%
deviasi standar error Batas bawah
-10.667 10.017
db
Batas atas
5.783
-35.549
14.216 -1.844
2
.206
h0 - h2
11.000
6.557
3.786
-5.290
27.290 2.905
2
.101
h2 - h9
-4.333
4.163
2.404
-14.676
6.009 -1.803
2
.213
h9 - h16
-3.333
4.726
2.728
-15.073
8.406 -1.222
2
.346
h2 - h16
-7.667
6.506
3.756
-23.829
8.496 -2.041
2
.178
Kontrol negatif Uji t berpasangan Beda berpasangan
t
Rata-
Std.
Rata-rata
Selang kepercayaan 95%
rata
Deviasi
Std. Error
Batas bawah
db
Sig. (2tailed)
Batas atas
h_8 - h0
-10.667
16.653
9.615
-52.036
30.702 -1.109
2
.383
h0 - h2
18.000
18.735
10.817
-28.540
64.540
1.664
2
.238
h2 - h9
19.333
6.658
3.844
2.793
35.874
5.029
2
.037
h9 - h16
19.000
7.000
4.041
1.611
36.389
4.701
2
.042
h2 - h16
38.333
7.234
4.177
20.363
56.304
9.178
2
.012
37
Kontrol positif Uji t berpasangan Beda berpasangan
t
Rata-
Std.
Rata-rata
rata
Deviasi
Std. Error
Batas bawah
db
Sig. (2tailed)
Selang kepercayaan 95% Batas atas
h_8 - h0
-2.333
13.279
7.667
-35.320
30.654 -.304
2
.790
h0 - h2
14.667
10.970
6.333
-12.583
41.917 2.316
2
.147
h2 - h9
2.000
10.440
6.028
-23.935
27.935
.332
2
.772
h9 - h16
4.333
9.815
5.667
-20.048
28.715
.765
2
.524
h2 - h16
6.333
10.970
6.333
-20.917
33.583 1.000
2
.423
KA200 Uji t berpasangan Beda berpasangan
t
db
Sig.
Rata-
Std.
Rata-rata Selang kepercayaan 95%
(2-
rata
Deviasi
Std. Error Batas bawah Batas atas
tailed)
h_8 - h0
-27.000
4.583
2.646
-38.384
-15.616
-10.205
2
.009
h0 - h2
19.333
22.942
13.246
-37.658
76.324
1.460
2
.282
h2 - h9
26.667
16.258
9.387
-13.721
67.055
2.841
2
.105
h9 - h16
10.333
7.024
4.055
-7.115
27.781
2.548
2
.126
h2 - h16
37.000
22.913
13.229
-19.919
93.919
2.797
2
.108
KA400 Uji t berpasangan Beda berpasangan Rata-
Std.
rata
Deviasi
Rata-rata
t
Selang kepercayaan 95%
Std. Error Batas bawah
d
Sig. (2-
b
tailed)
Batas atas
h_8 - h0
-8.000
16.093
9.292
-47.978
31.978
-.861 2
.480
h0 - h2
12.000
12.490
7.211
-19.027
43.027
1.664 2
.238
h2 - h9
15.667
8.083
4.667
-4.412
35.746
3.357 2
.078
h9 - h16
11.333
6.658
3.844
-5.207
27.874
2.948 2
.098
h2 - h16
27.000
3.000
1.732
19.548
34.452 15.588 2
.004
38
RIWAYAT HIDUP Enni Prasetyoningtias lahir di Purworejo, Jawa Tengah 26 Januari 1994 sebagai anak keempat dari empat bersaudara dari pasangan Jumono dan Istiarti. Penulis lulus dari SMA Negeri 1 Purworejo pada tahun 2012 dan melanjutkan studi di Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor di tahun yang sama melalui jalur SNMPTN Undangan. Penulis melaksanakan studi di IPB sebagai penerima beasiswa Bidik Misi DIKTI. Selama masa perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten di beberapa praktikum, yaitu Instrumentasi Bioanalisis (Semester Ganjil 2015/2016), Pengantar Penelitian Biokimia, Biokimia Klinis (Semester Genap 2015/2016), Biokimia Pertanian dan Lingkungan (Semester Ganjil 2016/2017). Penulis juga aktif di beberapa organisasi, diantaranya adalah sebagai bendahara umum UKM Karate IPB tahun kepengurusan 2012/2013, sekretaris 2 Keluarga Mahasiswa Purworejo di IPB (Gamapuri) tahun 2012/2013, kepala divisi Biro Fundraising Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) tahun 2013/2014, bendahara umum CREBs 2014/2015, dan sekretaris 2 Gamapuri tahun 2014/2015. Kepanitian yang pernah diikuti penulis diantaranya adalah sebagai divisi acara IPB Karate Cup Se-Jawa Bali, divisi sponsorship Seminar Kesehatan 2014 dan Lomba Karya Ilmiah Populer 2014. Penulis mengikuti kegiatan PKM-K yang didanai DI TI tahun 20 berjudul “Si Cassano: Olahan Singkong dan Sayuran Lokal sebagai Alternatif Diversifikasi Pangan yang Praktis, Murah, dan ergizi” dan P M-M didanai DI TI tahun 20 4 berjudul “Green Art Education Pendidikan dan Pelatihan Karya Seni Terapan Berbahan Dasar Limbah kepada Siswa SMP N Damaga”. Penulis pernah melakukan praktik lapang di alai Penelitian Tanaman Industri dan Penyegar (Balittri) pada bulan Juli sampai Agustus 2015 dengan judul Aktivitas Insektisida dan Antifeedant Ekstrak Etanol Daun Kipahit (Tithonia diversifolia) terhadap Helopeltis antonii.
