ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga SKRIPSI

ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga

SKRIPSI

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN MENGGUNAKAN KLT-DENSITOMETRI DAN VISUALIZER M. REZKI DWITYA

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA 2014

Skripsi

Pengembangan metode analisis.....

M.Rezki Dwitya


SKRIPSI

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN MENGGUNAKAN KLT-DENSITOMETRI DAN VISUALIZER M. REZKI DWITYA 050911289

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN KIMIA FARMASI SURABAYA 2014

Skripsi


M.Rezki Dwitya


LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

Demi

perkembangan

ilmu

pengetahuan,

saya

menyetujui

skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul : PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN MENGGUNAKAN KLT-DENSITOMETRI DAN VISUALIZER Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media yang lain yaitu

Digital

Library

Perpustakaan

Universitas

Airlangga

untuk

kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang – Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Surabaya, September 2014

M. Rezki Dwitya NIM. 050911289

Skripsi


M.Rezki Dwitya


LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini, Nama

: M. Rezki Dwitya

NIM

: 050911289

Fakultas

: Farmasi

menyatakan dengan sesungguhnya bahwa hasil tugas akhir yang saya tulis dengan judul: PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN MENGGUNAKAN KLT-DENSITOMETRI DAN VISUALIZER adalah benar – benar merupakan hasil karya sendiri. Apabila di kemudian hari diketahui bahwa skripsi ini menggunakan data fiktif atau merupakan hasil dari plagiarisme, maka saya bersedia menerima sanksi berupa pembatalan kelulusan dan atau pencabutan gelar yang saya peroleh. Demikian surat ini saya buat untuk dipergunakan sebagaimana mestinya.

Surabaya, September 2014

M. Rezki Dwitya NIM. 050911289

Skripsi


M.Rezki Dwitya


LEMBAR PENGESAHAN PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN MENGGUNAKAN KLT-DENSITOMETRI DAN VISUALIZER

SKRIPSI

Dibuat Untuk Memenuhi Syarat Mencapai Gelar Sarjana Farmasi Pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya 2014

Oleh :

M. REZKI DWITYA NIM : 0510911289

Skripsi ini telah disetujui oleh :

Pembimbing Utama

Pembimbing Serta

Dr. Idha Kusumawati, S.Si., M.Si., Apt.

Prof. Dr. Gunawan Indrayanto, Apt.

NIP. 197004081995122001

NIP. 194707031976031001

Skripsi


M.Rezki Dwitya


KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT. atas segala berkat dan rahmat-Nya, sehingga saya dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL. DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN DENGAN MENGGUNAKAN KLT – DENSITOMETRI DAN VISUALIZER” ini dengan baik. Dalam menyusun skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak baik moril maupun materiil. Oleh karena itu pada kesempatan ini perkenankanlah saya menyampaikan rasa terima kasih yang sedalamdalamnya kepada: 1. Ibu Dr. Idha Kusumawati, S.Si., M.Si., Apt. selaku pembimbing utama yang berkenan meluangkan waktunya untuk membimbing saya dengan penuh kesabaran dan keikhlasan, serta memberi semangat kepada saya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik. 2. Bapak Prof. Dr. Gunawan Indrayanto, Apt. selaku pembimbing serta yang berkenan meluangkan waktunya untuk membimbing saya dengan penuh kesabaran dan keikhlasan, serta memberi semangat kepada saya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik. 3. Bapak Drs. Abdul Rahman, M.Si., Apt. selaku penguji yang memberikan saran serta masukan yang membangun untuk skripsi yang saya kerjakan.

vii

Skripsi


M.Rezki Dwitya


4. Bapak Dr.rer.nat Mulja Hadi Santosa. selaku penguji yang memberikan saran serta masukan yang membangun untuk skripsi yang saya kerjakan. 5. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Dr. Umi Athiyah, MS., Apt yang telah memberikan kesempatan kepada saya untuk mengikuti pendidikan program sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. 6. Mama, papa, kakak, adik dan seluruh keluarga saya yang dengan penuh kesabaran selalu mendoakan, memberikan semangat serta dukungan dalam berbagai hal sehingga saya dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. 7. Whina Puti Rum Kirana Banse yang selalu mendukung, memberi saran dan memberi semangat, sehingga saya dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. 8. Teman-teman seperjuangan anak bimbing Bu Idha: Rizki, Subhan, Lendra, Imam, Vrian, Rohman, Faris, Mas Aji, Mas Tito, Mbak Icha. 9. Teman-teman angkatan 2009, 2010 dan semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu yang telah membantu baik langsung maupun tidak langsung dalam menyelesaikan skripsi ini.

viii

Skripsi


M.Rezki Dwitya


Akhir kata, skripsi ini saya persembahkan kepada Almamater Fakultas

Farmasi

Universitas

Airlangga

dengan

harapan

semoga

bermanfaat bagi kita semua.

Surabaya, September 2014 Penyusun,

M. Rezki Dwitya

ix

Skripsi


M.Rezki Dwitya


RINGKASAN

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS SENYAWA MARKER SPESIFIK PIPER RETROFRACTUM VAHL. DAN PIPER NIGRUM L. DALAM CAMPURAN DENGAN MENGGUNAKAN KLT – DENSITOMETRI DAN VISUALIZER

M. Rezki Dwitya

Kontrol kualitas obat herbal, dalam beberapa kasus, memungkinkan untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik, yang biasa disebut senyawa marker yang dapat digunakan untuk membantu pembuatan produk yang konsisten. Senyawa marker adalah senyawa atau golongan senyawa yang dapat digunakan untuk mengontrol konsistensi tiap batch produk jadi tanpa harus mengetahui adanya aktifitas atau tidak senyawa tersebut. Senyawa marker diklasifikasikan menjadi dua, yang pertama adalah senyawa marker aktif, yaitu senyawa atau golongan senyawa yang diketahui secara umum mempunyai kontribusi dalam aktifitas terapetik. Yang kedua adalah senyawa marker analisis yaitu senyawa atau golongan senyawa yang digunakan untuk tujuan analisis tanpa perlu mengetahui adanya kontribusi aktifitas terapetik atau tidak (Natural Health Product Directorate’s Canada, 2012). Untuk evaluasi gel polyherbal yang mengandung Terminalia arjuna, Centella asiatica dan Curcuma longa, dilakukan identifikasi senyawa marker setiap tanaman pada gel tersebut. Untuk Curcuma longa, digunakan standard reference curcumin sebagai senyawa marker, yang kita ketahui bahwa curcumin merupakan main component didalam tanaman tersebut (Patel et al., 2011). Prasaplai merupakan salah satu produk obat herbal tradisional di Thailand yang mengandung empat tanaman yang berada pada dua genus yang sama, yaitu Piper retrofractum Blume dan P. nigrum L., serta Zingiber cassumunar Roxb. dan Z. officinale Roscoe. Sehingga untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik tanaman yang berada pada genus yang sama, tidak bisa dilakukan mengunakan senyawa utama / senyawa

x

Skripsi


M.Rezki Dwitya


mayor nya. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dilakukan identifikasi tanaman Piper retrofractum Blume dan P. nigrum L. pada campuran nya berdasarkan senyawa marker karakteristik / senyawa marker spesifik menggunakan instrumen KLT-Densitometri dan Visualizer. Dengan demikian, tujuan dari penelitian ini adalah Mendapatkan metode analisis yang valid untuk penentuan senyawa marker pada formula campuran menggunakan KLT-Densitometri dan Visualizer. Konsentrasi sampel yang digunakan adalah 10.000 ppm dan jumlah larutan yang akan ditotolkan pada plat KLT adalah 35,0 µL. Sedangkan fase gerak yang terpilih adalah n-Heksan, kloroforom (0.5:3.5). Kondisi ini dapat menampakkan senyawa marker spesifik dari tiap tanaman dan memiliki pemisahan yang baik antara senyawa marker spesifik dan senyawa lainnya. Dari hasil eluasi dengan fase gerak terpilih tersebut, senyawa marker spesifik merica hitam memiliki resolusi 0,84, sedangkan senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki resolusi 3,60. Pada penelitian ini, ditentukan senyawa marker spesifik merica hitam berada pada Rf 0,09, sedangkan senyawa marker spesifik pada cabe jawa berada pada Rf 0,52. Dari hasil scanning profil spektra, diketahui panjang gelombang maksimum senyawa marker spesifik tanaman merica hitam dan cabe jawa berada pada 340 nm. Selanjutnya, untuk analisis kuantitatif akan dilakukan scanning senyawa marker spesifik masingmasing tanaman pada panjang gelombang tersebut. Validasi metode analisis merupakan persyaratan utama untuk membuktikan kehandalan dan kesesuaian suatu metode untuk digunakan (Renger, 2006). Pada penelitian ini, validasi yang dilakukan meliputi : Uji stabilitas, presisi, batas deteksi dan batas kuantifikasi, peak identity dan peak purity, linearitas dan akurasi. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan yaitu : Dengan menggunakan KLT-Densitometri, dapat diperoleh metode analisis yang valid untuk menentukan senyawa marker spesifik Piper retrofractum Vahl. dan Piper nigrum L. dengan nilai %KV pada tanaman merica hitam adalah 1,12 – 3,96%, untuk cabe jawa adalah 1,12 – 3,91%. Nilai r dari senyawa marker spesifik merica hitam adalah 0,99869 dan untuk senyawa marker speisifk cabe jawa adalah 0,99921. Kemudian %akurasi yang didapatkan untuk tanaman merica hitam adalah 103,87 – 110,80% sedangkan untuk tanaman cabe jawa adalah 102,92 – 106,50%.

xi

Skripsi


M.Rezki Dwitya


ABSTRACT

Analytical Method Development Specific Marker Compounds Piper retrofractum Vahl. and Piper nigrum L. in mixture using TLC - Densitometry and Visualizer

M. Rezki Dwitya

Piper retrofractum Vahl. and Piper nigrum L. are two plants that are in the same genus, which is often used in an herbal remedy. To detect or identify the plants that are in the same genus in a herbal medicine formula, required specific markers that could indicate the existence in a formula. This study aims to obtain a valid analytical method for the determination of specific markers in the mix formula using TLC - densitometry and Visualizer. Concentration of the sample used was 10,000 ppm and application volume injected on TLC plates was 35.0 μL. While the selected mobile phase is nHexane, Kloroforom (0.5: 3.5). Specific markers of Piper nigrum L. Rf values was found to be 0.09, and for specific markers of Piper retrofractum Vahl. was 0.52. The method was found to be precise, specific and accurate and can also be used for identitify both two plants of piper in the one mixture or formulation. Keywords: analytical method development, method validation, compound specific markers, identification, Piper retrofractum Vahl., Piper nigrum L, thin layer chromatography, densitometry.

xii

Skripsi


M.Rezki Dwitya


DAFTAR ISI

Halaman LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH LEMBAR PERNYATAAN BUKAN HASIL PLAGIARISME LEMBAR PENGESAHAN KATA PENGANTAR……………...………………............................ vii RINGKASAN........................................................................................ x ABSTRACT............................................................................................ xii DAFTAR ISI………………………………………………………...... xiii DAFTAR TABEL………………...…………………………………... xvii DAFTAR GAMBAR............................................................................. xviii BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah..................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah............................................................... 5 1.3 Tujuan Penelitian................................................................ 5 1.4 Manfaat Penelitian.............................................................. 5 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan tentang Tanaman Piper retrofractum Vahl ........... 6 2.1.1 Klasifikasi tanaman......................................................... 6 2.1.2 Penyebaran dan tempat tumbuh..................................... 7 2.1.3 Nama daerah.................................................................. 7 2.1.4 Kandungan tanaman........................................................ 8 2.2 Tinjauan tentang Tanaman Piper nigrum L......................... 9 2.2.1 Klasifikasi tanaman......................................................... 9 2.2.2 Penyebaran dan tempat tumbuh..................................... 10

xiii

Skripsi


M.Rezki Dwitya


2.2.3 Nama daerah.............................................................10 2.2.4 Kandungan tanaman........................................................ 12 2.2.4 Manfaat cabe jawa dan merica hitam............................ 12 2.3 Tinjauan Umum Kromatografi Lapis Tipis (KLT)................ 13 2.3.1 Definisi KLT................................................................. 13 2.3.2 Keuntungan metode KLT............................................... 13 2.3.3 Prinsip pemisahan pada KLT......................................... 14 2.3.4 Metode deteksi pada KLT............................................. 15 2.4 Tinjauan Umum Densitometri............................................... 17 2.5 Tinjauan Ekstraksi dengan Microwave................................. 17 2.6 Validasi Metode..................................................................... 18 2.6.1 Uji Stabilitas................................................................... 18 2.6.2 Presisi............................................................................ 18 2.6.3 Peak identity dan peak purity........................................ 19 2.6.4 Batas deteksi dan batas kuantitasi.................................. 19 2.6.5 Linearitas....................................................................... 20 2.6.6 Akurasi.......................................................................... 21 BAB III. KERANGKA KONSEPTUAL 3.1 Uraian Kerangka Konseptual............................................... 22 3.2 Kerangka Konseptual........................................................... 25 3.3 Hipotesis.............................................................................. 26 BAB IV. METODE PENELITIAN 4.1 Bahan dan Alat Penelitian..................................................... 27 4.1.1 Bahan tanaman.............................................................. 27 4.1.2 Bahan kimia dan bahan lain............................................ 27 4.1.3 Alat-alat........................................................................... 28

xiv

Skripsi


M.Rezki Dwitya


4.2 Metode Penelitian.................................................................. 28 4.2.1 Pembuatan serbuk simplisia........................................... 21 4.2.2 Penentuan kadar air serbuk simplisia............................. 21 4.2.3 Pembuatan formula campuran........................................ 21 4.2.4 Preparasi sampel............................................................ 21 4.2.5 Optimasi kondisi............................................................. 21 4.2.6 Penentuan senyawa marker spesifik................................21 4.2.7 Validasi metode............................................................. 21 4.2.7.1 Stabilitas................................................................. 12 4.2.7.2 Presisi...................................................................... 12 4.2.7.3 Peak purity dan peak identity................................... 12 4.2.7.4 Batas deteksi dan batas kuantitasi........................... 12 4.2.7.5 Linearitas................................................................. 12 4.2.7.6 Akurasi..................................................................... 12 4.3 Skema Metode Penelitian...................................................... 22 BAB V. Hasil Penelitian 5.1 Penentuan Kadar Air............................................................. 27 5.2 Optimasi Kondisi................................................................. 27 5.3 Penentuan Senyawa Marker Spesifik................................... 27 5.4 Hasil Validasi Metode.......................................................... 27 5.4.1 Uji Stabilitias................................................................. 21 5.4.2 Presisi............................................................................. 21 5.4.3 Peak purity dan peak identity........................................ 21 5.4.4 Batas deteksi dan batas kuantitasi................................. 21 5.4.5 Linearitas....................................................................... 21 5.4.6 Akurasi............................................................................ 21

xv

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB VI PEMBAHASAN...................................................................... 72 BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN............................................. 80 DAFTAR PUSTAKA............................................................................ 82

xvi

Skripsi


M.Rezki Dwitya


DAFTAR TABEL

Tabel

halaman

IV.1 Spesifikasi tanaman yang diperoleh……………………………….27 IV.2 Komposisi tanaman untuk pembuatan formula campuran………...29 IV.3 Preparasi pembuatan kurva kalibrasi masing-masing tanaman……33 V.1

% Kadar air pada serbuk simplisia merica hitam dan cabe jawa….36

V.2

Rf senyawa marker spesifik dari tiap tanaman…………………….39

V.3

Rasio area senyawa marker spesifik pada tiap formula campuran...43

V.4

%KV rasio area masing-masing senyawa marker spesifik pada tiap formula (n=3)………………………………………………....43

V.5

Peak purity senyawa marker spesifik merica hitam…………….....44

V.6

Peak purity senyawa marker spesifik cabe jawa…………………..44

V.7

Batas deteksi dan batas kuantitasi pada merica hitam………….….47

V.8

Batas deteksi dan batas kuantitasi pada cabe jawa………………...47

V.9

Linearitas senyawa marker spesifik merica hitam………….……...48

V.10 Linearitas senyawa marker spesifik cabe jawa…………………….49 V.11 Homogenity test konsentrasi terendah dan tertinggi yang digunakan untuk kurva kalibrasi pada sampel merica hitam………50 V.12 Homogenity test konsentrasi terendah dan tertinggi yang digunakan untuk kurva kalibrasi pada sampel cabe jawa………....51 V.13 Akurasi kadar merica hitam pada tiap formula ( n = 3 )…………..52 V.14 Akurasi kadar cabe jawa pada tiap formula ( n = 3 )………….......53

xvii

Skripsi


M.Rezki Dwitya


DAFTAR GAMBAR

Gambar

halaman

2.1 Piper retrofractum Vahl……………………………...........................6 2.1 Piper nigrum L………..……………………………...........................9 3.1 Skematik kerangka konseptual……………………………...............25 4.1 Skematik arah eluasi uji stabilitas pada plat KLT………..................31 4.2 Skematik peak purity..........................................................................32 4.3 Skematik metode penelitian………………………………………...35 5.1 Hasil visualisasi sampel merica hitam, formula campuran, cabe jawa pada 366 nm menggunakan CAMAG TLC – Visualizer…………...37 5.2 Kromatogram masing-masing tanaman dan formula campuran pada 366 nm………………………………………………………………38 5.3 Hasil visualisasi uji stabilitas dalam pelarut pada 366 nm………….40 5.4 Kromatogram uji stabilitas dalam pelarut pada 366 nm…….……...41 5.5 Hasil visualisasi uji stabilitas pada 366 nm selama 2 jam…………..42 5.6 Hasil visualisasi uji stabilitas pada 366 nm selama 3 jam…………..42 5.7 Peak identity senyawa marker spesifik merica hitam………………45 5.8 Peak identity senyawa marker spesifik cabe jawa.............................45 5.9 Kurva kalibrasi merica hitam…………………………………….....48 5.10 Kurva kalibrasi cabe jawa…………………………………………..49

xviii

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Dalam beberapa tahun terakhir, produk bahan alam semakin

sering digunakan sebagai produk obat-obatan, nutraceuticals dan juga kosmetik. Sekitar 80% dari populasi manusia di dunia, masih menggunakan tanaman obat dan obat tradisional lainnya untuk kebutuhan utama dalam menjaga kesehatan mereka. Berdasarkan definisi WHO, ada tiga macam pengobatan herbal: simplisia, ekstrak, dan produk jadi. Pengobatan herbal telah meningkat tajam sejalan dengan tren global dari masyarakat dunia yang “back to nature”. Produk herbal kini dijual dalam bentuk tablet, kapsul, serbuk, teh, ekstrak dan tanaman segar atau kering. Hal ini menyebabkan kekhawatiran karena semakin banyaknya orang yang mengkonsumsi obat herbal tanpa menggunakan resep. Selain itu, beberapa obat herbal juga dapat menyebabkan masalah kesehatan apabila pemakaiannya tidak tepat. Beberapa obat herbal juga dianggap tidak efektif dan dapat berinteraksi dengan obat lain (Sekhon, 2011). Obat herbal, baik single herbal maupun poly herbal, mengandung banyak senyawa dalam matriks yang kompleks dimana tidak ada senyawa aktif tunggal yang bertanggung jawab atas efektifitas obat secara keseluruhan (Ip et al., 2010). Kuantitas dan kualitas keamanan dan efektifitasnya jauh dari cukup untuk memenuhi kriteria yang dibutuhkan dalam penggunaannya secara luas. Alasan utamanya adalah kurangnya metodologi penelitian yang dapat diterima untuk evaluasi obat tradisional (Liang et al., 2004). Selalu ada kekhawatiran tentang komposisi yang tidak

1

Skripsi


M.Rezki Dwitya


2 konsisten dari obat-obatan herbal dan sering terjadi intoksikasi oleh adulterant dan / atau komponen beracun. Kontrol kualitas obat herbal bertujuan untuk memastikan konsistensi, keamanan dan efektifitasnya (Li et al., 2008). Ada kesulitan yang besar dalam menetapkan metode untuk kontrol kualitas yang disebabkan oleh kompleksitas dari obat herbal. Teknik untuk membuktikan keaslian bahan, tidak cukup kuat untuk mengidentifikasi semua bahan yang terkandung dalam produk. Berdasarkan hal tersebut, semakin banyak bermunculan “adulteration” dan obat dengan kualitas rendah (Yongyu et al., 2011). Obat herbal dengan kandungan senyawa multikomponen (multiple compund) berbeda dengan obat sintesis atau obat yang hanya terdiri dari satu komponen (single compund). Obat herbal memiliki banyak komponen kimia yang terkandung didalamnya, seperti komponen yang mempunyai aktivitas terapetik, komponen yang tidak mempunyai aktivitas, komponen kimia yang belum teridentifikasi, dsb. Sehingga untuk menerapkan current Good Manufacturing Practices (cGMP) pada obat herbal multikomponen lebih sulit (Lazarowych, 1998). Identifikasi dan uji kualitas bahan baku tanaman merupakan syarat penting yang harus dilakukan oleh industri ketika berurusan dengan obat herbal. Dan perlu diperhitungkan pula bahwa tanaman yang akan diuji memiliki komposisi yang kompleks dan tidak konsisten berdasarkan kandungan metabolit sekundernya. Oleh karena itu, batas analitis tidak setepat saat kita berurusan dengan senyawa kimia tunggal. Hal ini adalah fakta yang dapat diterima bahwa analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa kimia dari tanaman merupakan bagian penting dan dapat diandalkan dari

Skripsi


M.Rezki Dwitya


3 uji kontrol kualitas (Mukherjee et al., 2007). Evaluasi fitokimia adalah salah satu cara untuk menilai kualitas obat herbal, meliputi screening fitokimia, chemoprofiling, dan analisis senyawa marker menggunakan teknik analisis modern. Kromatografi lapis tipis (KLT) banyak digunakan sebagai metode analisis cepat dan sederhana untuk berbagai bahan kimia organik seperti obat-obatan, produk bahan alam dan biomolekul (Kim et al., 2010). Kontrol

kualitas

obat

herbal,

dalam

beberapa

kasus,

memungkinkan untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik, yang biasa disebut senyawa marker yang dapat digunakan untuk membantu pembuatan produk yang konsisten. Senyawa marker adalah senyawa atau golongan senyawa yang dapat digunakan untuk mengontrol konsistensi tiap batch produk jadi tanpa harus mengetahui adanya aktifitas atau tidak senyawa tersebut. Senyawa marker diklasifikasikan menjadi dua, yang pertama adalah senyawa marker aktif, yaitu senyawa atau golongan senyawa yang diketahui secara umum mempunyai kontribusi dalam aktifitas terapetik. Yang kedua adalah senyawa marker analisis yaitu senyawa atau golongan senyawa yang digunakan untuk tujuan analisis tanpa perlu mengetahui adanya kontribusi aktifitas terapetik atau tidak (Natural Health Product Directorate’s Canada, 2012). Karena hanya sejumlah kecil senyawa kimia yang terbukti memiliki aktifitas farmakologis yang jelas, sehingga senyawa kimia lainnya juga dapat digunakan sebagai marker. Senyawa marker dapat menjadi indikator kualitas obat herbal (Li et al., 2008). Pada jurnal yang di tulis oleh Li (2008), dikatakan bahwa terdapat delapan kategori senyawa yang bisa dikatakan senyawa marker dalam uji

Skripsi


M.Rezki Dwitya


4 kontrol kualitas obat herbal, yaitu therapeutic components, bioactive components, synergistic components, characteristic components, main components, correlative components, toxic components, and general components (Li et al., 2008). Pada penelitian Patel (2011) Untuk evaluasi gel polyherbal yang mengandung Terminalia arjuna, Centella asiatica dan Curcuma longa, dilakukan identifikasi senyawa marker setiap tanaman pada gel tersebut. Untuk Curcuma longa, digunakan standard reference curcumin sebagai senyawa marker, yang kita ketahui bahwa curcumin merupakan main component didalam tanaman tersebut (Patel et al., 2011). Prasaplai merupakan salah satu produk obat herbal tradisional di Thailand yang berkhasiat untuk mengurangi dysmenorrhea dan mengatur siklus mesntruasi. Obat ini mengandung sepuluh bahan tanaman mentah, yaitu Acorus calamus L., Allium sativum L., Citrus hystrix DC., Curcuma zedoaria Roscoe., Eleutherine palmifolia (L.) Merr., Nigella sativa L., Piper retrofractum Blume, P. nigrum L., Zingiber cassumunar Roxb. dan Z. officinale Roscoe (Gritsanapan and Tangyuenyongwatana, 2009). Dari formula tersebut, terkandung empat tanaman yang berada pada dua genus yang sama, yaitu Piper retrofractum Blume dan P. nigrum L., serta Zingiber cassumunar Roxb. dan Z. officinale Roscoe. Sehingga untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik tanaman yang berada pada genus yang sama, tidak bisa dilakukan mengunakan senyawa utama / senyawa mayor nya. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dilakukan identifikasi tanaman Piper retrofractum Blume dan P. nigrum L. pada campuran nya berdasarkan senyawa marker karakteristik / senyawa marker spesifik menggunakan instrumen KLT-Densitometri dan Visualizer. Keuntungan

Skripsi


M.Rezki Dwitya


5 menggunakan KLT untuk penentuan senyawa marker spesifik tanaman dalam obat herbal: lebih sederhana, fleksibel, lebih cepat, kepekaan tertentu dan preparasi sampel yang lebih sederhana (Liang et al., 2004).

1.2

Rumusan Masalah Apakah dapat dikembangan metode analisis yang valid untuk

penentuan senyawa marker pada formula campuran menggunakan KLTDensitometri dan Visualizer?

1.3

Tujuan Penelitian Mendapatkan metode analisis yang valid untuk penentuan

senyawa marker pada formula campuran menggunakan KLT-Densitometri dan Visualizer.

1.4

Manfaat Penelitian Untuk memberikan data ilmiah mengenai metode analisis yang

valid untuk penentuan senyawa marker pada formula campuran dan bisa dimanfaatkan oleh industri untuk uji kontrol kualitas produk herbal.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Tinjauan tentang Tanaman Piper retrofractum Vahl.

Gambar 2.1 Piper retrofractum Vahl. (Tropicalplantbook)

2.1.1

Klasifikasi tanaman Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Superdivision

: Spermatophyta

Division

: Magnoliophyta

Class

: Magnolipsida

Subclass

: Magnoliidae

6

Skripsi


M.Rezki Dwitya


7 Order

: Piperales

Family

: Piperaceae

Genus

: Piper L.

Species

: Piper retrofractum Vahl

(United States Department of Agriculture, 2014).

2.1.2

Penyebaran dan tempat tumbuh Cabe jawa memiliki beberapa nama daerah, yaitu: di Sumatera

disebut lada panjang, cabai jawa, cabai panjang. Di jawa, namanya cabean, cabe alas, cabe areuy, cabe jawa, cabe sula. Di Madura dinamai cabhi jhamo, cabhi ongghu, cabhi solah, sedangkan di Makassar dikenal dengan nama cabai. Tumbuh di tempat-tempat yang tanahnya tidak lembap dan berpasir seperti di dekat pantai, daerah datar sampai 600 meter di atas permukaan laut (dpl). Tanaman ini dapat tumbuh dan menghasilkan dengan baik di semua jenis lahan kering atau semua jenis tanah di pulau Jawa (Nuraini, 2003).

2.1.3

Nama daerah Madura

: cabhi jhamo, cabhi ongghu, cabhi solah

Jawa

: cabean, cabe alas, cae areuy

Sumatera

: cabai panjang

Makasar

: cabai

(Nuraini, 2003).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


8 2.1.4

Kandungan tanaman Senyawa kimia yang terkandung dalam cabe jawa antara lain

asam amino bebas, damar, minyak atsiri, beberapa jenis alkaloid seperti piperine, piperidin, piperatin, piperlonguminine, β-sitosterol, sylvatine, guineensine, piperlongumine, filfiline, sitosterol, methyl piperate, minyak atsiri (terpenoid), n-oktanol, linalool, terpinil asetat, sitronelil asetat, sitral, alkaloid, saponin, polifenol, dan resin (kavisin). Alkaloid utama yang terdapat di dalam buah cabe jawa adalah piperin (Isnawati et al., 2002). Cabe jawa merupakan salah satu tanaman yang diketahui memiliki efek stimulan terhadap sel-sel syaraf sehingga mampu meningkatkan stamina tubuh. Efek hormonal dari tanaman ini dikenal sebagai afrodisiaka. Berdasarkan penelitian secara ilmiah, cabe jawa digunakan sebagai afrodisiaka karena mempunyai efek androgenik, untuk anabolik, dan sebagai antivirus. Dari suatu tinjauan pustaka dikatakan bahwa secara umum kandungan kimia atau senyawa kimia yang berperan sebagai afrodisiak adalah turunan steroid, saponin, alkaloid, tannin dan senyawa lain yang dapat melancarkan peredaran darah. (Nuraini, 2003).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


9 2.2

Tinjauan tentang Tanaman Piper nigrum L.

Gambar 2.2 Piper nigrum L. (US Departemen of Agriculture)

2.2.1

Skripsi

Klasifikasi tanaman Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Superdivision

: Spermatophyta

Division

: Magnoliophyta

Class

: Magnolipsida

Subclass

: Magnoliidae


M.Rezki Dwitya


10 Order

: Piperales

Family

: Piperaceae

Genus

: Piper L.

Species

: Piper nigrum L.

(United States Department of Agriculture, 2014).

2.2.2

Nama daerah Sumatera

: Koro-koro,lada,lado ketek

Madura

: Sakang

Jawa

: Merica

Maluku

: Marissanmau,emrisan,maricang puwe

Sulawesi

: Malita lodawa

Bali

: Mica

(Nuraini, 2003).

2.2.3

Penyebaran dan tempat tumbuh Merica hitam

(Piper nigrum) berasal dari pantai barat Ghats,

Malabar, India. Lada dibawa oleh para pendatang Hindu ke Pulau Jawa antara tahun 100 SM dan 600 M. Daerah awal pemasukan tanaman lada di Indonesia tidak diketahui dengan jelas, namun diperkirakan bahwa tanaman lada pertama kali ditanam di daerah Karesidenan Banten (Wahid, 1996). Penyebaran tanaman lada dari daerah Banten mula-mula mengarah ke timur Pulau Jawa. Di daerah Banten, Jakarta, Cirebon, Jepara, Surakarta dan Yogyakarta, lada pada mulanya diusahakan dalam bentuk perkebunan sampai dengan abad ke-18. Bersamaan dengan itu pengusahaannya dalam

Skripsi


M.Rezki Dwitya


11 bentuk perkebunan rakyat dimulai di Sumatera (Aceh, Bengkulu, Bangka, Lampung,Sumatera Barat, Sumatera Timur, dan Jambi) serta ke Kalimantan (Pontianak,Banjarmasin, dan Pangkalan Bun di Kalimantan Tengah) (Wahid 1996). Daerah pengembangan lada saat ini adalah Lampung yang terkenal dengan lada hitamnya (Lampong black pepper), dan Bangka yang lebih dikenal dengan lada putihnya (Muntok white pepper). Selain itu, banyak pengembangan pertanaman lada baru di Kalimantan Barat, Kalimantan Tengah dan Kalimantan Timur, serta Sulawesi Selatan dan Sulawesi Tenggara (Manohara et al, 2005). Merica hitam Piperaceae

merupakan tanaman memanjat dari keluarga

yang dalam pertumbuhannya dipengaruhi

oleh faktor

lingkungan. Batang tanaman lada berbuku-buku dan berbentuk sulur. Sulur panjat tumbuh lebih baik dalam keadaan nisbi udara kurang cahaya (fototrof negatif) sedangkan sulur buah dalam keadaan cukup cahaya (fototrof positif). Intensitas cahaya yang dibutuhkan berkisar dari 50% sampai 75%. Lada dapat tumbuh dengan baik di daerah dengan ketinggian 0-500 m dpl. Curah hujan yang paling baik untuk tanaman lada adalah 2000 - 3000mm/tahun dengan hari hujan 110-170 hari,dan musim kemarau 2-3 bulan/tahun. Kelembapan nisbi udara yang sesuai dari 70% sampai 90% dengan kisaran suhu 25-350C. Tanaman lada dapat tumbuh pada semua jenis tanah, terutama tanah berpasir dan gembur dengan unsur hara yang cukup. Tingkat kemasaman tanah (pH) yang sesuai berkisar 5-6.5. Penggunaan tiang panjat hidup (tajar) dalam budi daya lada akan membantu mengurangi intensitas cahaya yang berlebihan dan akan membuat tanaman berumur lebih panjang karena tanaman tidak didorong

Skripsi


M.Rezki Dwitya


12 berproduksi lebih sementara input yang diberikan terbatas. Penanaman tanaman penutup tanah akan mengurangi cekaman kekeringan akibat kemarau dan menghambat penyebaran Phytophthora capsici selama musim hujan. Pembuatan saluran drainase yang cukup dan terasering yang disesuaikan dengan kondisi lahan diperlukan untuk menghindari genangan air selama musim hujan (Wahyuno, 2009).

2.2.4

Kandungan tanaman Senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman Piper nigrum

antara lain 1,8-Cineol, Acetophenone, Alpha-Pinene, Alpha-Terpineol, Ascorbic-Acid Borneol, Caff eic-Acid, Camphor, Carvone, Caryophyllene, Citral, Citronellal, Citronellol, Eugeno, Eugenol-Methyl-Ether, Gaba, Geranyl-Acetate,

Hyperoside,

Limonene,

Linalool,

Linalyl-Acetate,

Magnesium, Methyl-Eugenol, Myrcene, Myristicin, Niacin, P-Cymene, Perillaldehyde, Piperidine, Piperine, Quercetin, Quercitrin, Safrole, Stigmasterol, Thiamin, Tocopherol, Zinc (Anonim, 2009).

2.2.5

Manfaat cabe jawa dan merica hitam Buah, daun dan akar tanaman Cabe Jawa dapat digunakan untuk

pengobatan. Buah yang sudah tua dapat digunakan untuk pengobatan perut kembung, mulas, muntah-muntah, diaforetik, karminatif, merangsang nafsu makan, demam, influenza, migren, peluruh keringat, encok, infeksi pada hati, tekanan darah rendah, urat saraf lemah, sukar bersalin, dan sebagai afrodisiaka. Akar dapat digunakan untuk sakit gigi, luka, dan kejang, sedangkan daunnya untuk obat kumur. Di India, Afrika Utara, Afrika

Skripsi


M.Rezki Dwitya


13 Timur, dan Asia Tenggara, Cabe Jawa juga digunakan untuk bumbu masak.

2.3

Tinjauan Umum Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

2.3.1

Definisi KLT KLT adalah metode yang baik untuk memisahkan campuran

senyawa yang berbeda polaritas nya (Gabriela, 2010). KLT merupakan metode kromatografi cair dimana sampel diberikan berbentuk spot kecil atau garis pada plat penyerap pada kaca, plastik atau plat logam. Fase gerak migrasi melalui fase diam melalui lubang kapiler, kadang dibantu oleh gravitasi tekanan. Fase gerak pada metode KLT dapat terdiri dari pelarut tunggal atau campuran pelarut organik. Saat ini, telah banyak penyerap yang dapat digunakan antara lain silika gel, selulosa, alumina, poliamida, penukar ion dan ikatan kimia yang dilapisi pada kaca atau polyester atau lembaran aluminium (Fried dan Sherma, 1999). KLT juga dapat dikembangkan menjadi fingerprinting kromatografi yang digunakan untuk identifikasi (Gabriela, 2010; Wagner et al., 1996) dan kontrol kualitas ekstrak tanaman (Liang et al., 2004).

2.3.2

Keuntungan metode KLT Keuntungan menggunakan KLT sebagai penentuan senyawa

marker spesifik tanaman pada obat herbal : lebih sederhana, fleksibel, lebih cepat, kepekaan tertentu, dan preparasi sampel yang lebih sederhana (Liang et aL., 2004).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


14 2.3.3

Prinsip pemisahan pada KLT Pemisahan

senyawa

pada

kromatografi

dipengaruhi

oleh

kombinasi sifat kinetik dan termodinamik. Sifat termodinamik bertanggung jawab atas nilai retensi dan selektifitas. Sedangkan sifat kinetik menentukan pelebaran zona selama pemisahan (Spangenberg, 2011; Poole, 1992). Pada saat pemisahan campuran komponen, setiap senyawa terdistribusi dan berinteraksi pada kedua fase, yakni fase diam dan fase gerak. Interaksi komponen senyawa dengan kedua fase meliputi dua mekanisme yakni adsorpsi dan partisi (Spangenberg, 2011). Adsorpsi merupakan fenomena permukaan. Adsorpsi pada KLT terjadi pada permukaan partikel fase diam yang kontak dengan fase gerak. Dalam mekanisme adsorpsi dapat terjadi ikatan van der waal’s interaksi dipol-dipol dan interaksi ion komplek seperti ikatan hidrogen. Penerapan pemisahan pada kromatografi, mekanisme adsorpsi harus bersifar reversible dan hanya interaksi fisika. Sedangkan, pada kromatografi partisi, pemisahan tergantung pada kelarutan senyawa pada dua eluen yang tidak saling larut (Spangenberg, 2011). Parameter yang digunakan untuk menunjukkan letak noda adalah Rf, didapatkan dari rasio perbandingan :

Harga Rf mulai dari 0 (solut berada di titik penotolan) sampai 0,999 (solute berada digaris akhir fase gerak).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


15 2.3.4

Metode deteksi pada KLT ( Wall, 2005) 1. Teknik non-destructive a.Deteksi visible Deteksi ini digunakan untuk senyawa yang mempunyai warna, misalnya pewarna alami dan sintesis dan senyawa nitrofenol. b. Deteksi UV Dalam membantu metode deteksi ini, plat mengandung indikator senyawa inorganik fosforesensi atau indikator senyawa organik fluoresensi.

Proses

fluoresensi

diakibatkan

gelombang

elektromagnetik yang memancarkan energi yang dibawa transisi elektron dari ground state yang eksitasi singlet state. Eksitasi elektron kembali pada ground state mengemisikan energi pada panjang gelombang visible. Fosforesensi memiliki perbedaan dengan fluoresensi, elektron kembali pada keadaan ground state melalui keadaan triplet. 2. Reaksi reversible a. Iodin Iodin merupakan reagent yang sangat berguna untuk mendeteksi keberadaan berbagai analit organik pada plat. b. Amonia Reagen amonia sering digunakan bersama reagen lain untuk meningkatkan deteksi noda, antara lain bromocresol green dan bromocresol blue.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


16 3. Reaksi non-reversible a. Fluoresen Metode ini digunakan untuk mendeteksi senyawa organik substansial, salah satu reagen yang sering digunakan adalah fluorescein digunakan untuk mendeteksi Lipid, purin, pyrimidin, barbiturate, senyawa tak jenuh, klorinasi hidrokarbon dan heterosiklik. b. Indikator pH Indikator ini hanya digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa asam dan basa. Reagen yang sering digunakan adalah sulfonthalein. 4. Teknik destructive a.Reaksi Charring Metode reaksi charring biasanya digunakan reagen yang sesuai kemudian diikuti dengan pemanasan pada temperatur tinggi untuk merusak beberapa senyawa organik. b. Aktivasi thermochemical Metode ini membutuhkan pemanasan pada suhu tinggi untuk merubah senyawa agar dapat berfluoresensi pada paparan lampu UV. 5. Derivatisasi Metode ini menggunakan reagen untuk mereaksikan analit agar noda pada plat dapat terlihat. Metode ini terbagi menjadi dua: analit direaksikan setelah dikromatografi dan direaksikan sebelum dikromatografi.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


17 2.4

Tinjauan Umum Densitometri Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang

berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit ditentukan adalah absorbs, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Perajah dari densitometri akan mengubah noda yang dibacanya menjadi kromatogram yang terdiri dari deretan puncak. Letak noda sesuai dengan jarak tempuh noda dan tinggi atau luas puncak sebanding dengan kadar analit pada noda yang bersangkutan (Mulya dan Suharman, 1995). Densitometer dioperasikan dengan sistem optis transmisi dan reflektan. Komponen – komponen yang berwarna yang tidak menyerap sinar ultraviolet dapat dianalisis dengan pantulan absorbs pada panjang gelombang sinar tampak (visible) menggunakan sistem optis reflektan dan transmisi. Komponen – komponen tidak berwarna akan menyerap ultraviolet, dapat dianalisis dengan mengukur absorbansi sinar ultraviolet yang direfleksikan (Touchstone dan Dobbins, 1983)

2.5

Tinjauan Ekstraksi dengan Microwave Apabila dibandingkan dengan ekstraksi sonikasi, ekstraksi dengan

microwave memiliki beberapa kelebihan: 1.

Mengurangi penggunaan pelarut

2.

Tingkat efisiensi yang lebih tinggi

3.

Mengurangi waktu ekstraksi

4.

Peningkatan kemampuan analisis seperti: %perolehan kembali dan keterulangan.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


18 2.6

Validasi Metode Pengembangan

metode

analisis

memerlukan

syarat

yang

menyatakan bahwa metode yang digunakan untuk analisis harus tervalidasi. Validasi analisis merupakan persyaratan utama untuk membuktikan kehandalan dan kesesuaian suatu metode untuk digunakan (Renger et al, 2006). Pada penelitian ini, validasi yang dilakukan meliputi : Uji stabilitas, presisi, peak identity dan peak purity, batas deteksi dan batas kuantitasi, linearitas dan akurasi.

2.6.1

Uji stabilitas Untuk memulai membuat prosedur analisis menggunakan KLT

tahap terpenting adalah mengecek kestabilan senyawa dalam setiap step prosedur (Renger et al., 2006). Stabilitas yang perlu diuji adalah stabilitas dalam pelarut dan dalam plat KLT. Parameter yang digunakan sebagai uji stabilitas dalam pelarut, apabila tidak ada perbedaan noda pada sampel larutan yang ditotolkan dengan penyimpanan dengan sampel yang baru dilarutkan dan segera ditotolkan. Sedangkan uji stabilitas plat, jika noda yang terbentuk dengan KLT bidimensional membentuk garis longitudinal (Riech et al., 2008).

2.6.2

Presisi Presisi dibagi menjadi tiga kategori: repeatability, intermediate

precision, dan reproducibility. Repeatability ditentukan ketika analisis dilakukan di satu laboratorium oleh satu analis, dengan peralatan kerja yang sama dan dilakukan dalam satu hari kerja. Intermediate precision diperoleh ketika analisis dilakukan dalam satu laboratorium yang sama

Skripsi


M.Rezki Dwitya


19 oleh analis yang berbeda selama beberapa hari atau minggu, dengan peralatan kerja yang berbeda. Reproducibility diperoleh dari hasil yang diukur dalam laboratorium yang berbeda dengan tujuan memverifikasi metode, apakah dapat memperoleh hasil yang sama dengan fasilitas yang berbeda. Kriteria penerimaan (nilai RSD) uji presisi adalah ≤ 2%. (Indrayanto dan Yuwono, 2005).

2.6.3

Peak identity dan peak purity Untuk mendeteksi interaksi dari senyawa lain, kemurnian puncak

analit harus ditentukan. Konsekuensi dari persyaratan ini adalah bahwa resolusi analit dari komponen lain harus lebih dari 1,5-2,0. Spektrum UVVis dari puncak dapat digunakan untuk menentukan kemurnian dari puncak tersebut, dalam hal ini koefisien korelasi “r” (istilah ini digunakan oleh software DAD System Manager Hitachi dan WinCATS dari CAMAG). Jika nilai r adalah 0.0000-0.8900 maka puncak tersebut tidak murni, dan apabila nilai r adalah 0.9000-0.9500 berarti peak tersebut terkontaminasi. Untuk menentukan identitas puncak, maka data seluruh puncak standar dan analit harus dibandingkan, nilai r atau Match Factor dapat dihitung dengan menggunakan perangkat lunak dari KCKT/KLT-Densitometer. (Indrayanto dan Yuwono, 2005).

2.6.4

Batas deteksi dan batas kuantitasi Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari

sebuah analit yang dapat dideteksi dalam kondisi analisis yang digunakan. Keberadaan analit dapat dilihat pada batas deteksi, namun konsentrasi batas deteksi tidak dapat diukur secara kuantitatif. Batas kuantifikasi adalah

Skripsi


M.Rezki Dwitya


20 konsentrasi terendah yang bisa ditentukan dengan akurasi yang diterima dan presisi dalam kondisi analisis. Umumnya, batas kuantifikasi dapat diperkirakan sebagai tiga kali lipat batas deteksi. Dengan menggunakan analisis regresi linear pada konsentrasi analit yang relatif rendah dan menghitung nilai Xp, batas deteksi dapat ditentukan sebagai ¼ dari Xp. Disarankan menggunakan 5-10 sampel pada konsentrasi analit yang relatif rendah untuk menentukan Xp dengan cara pengenceran sampai tidak ada respon terdeteksi dari analit tersebut. Dalam hal ini, persyaratan parameter linearitas (Vx0, r, nilai Xp, dll) dari garis regresi harus dipenuhi sebelum batas deteksi dapat diperkirakan dengan menggunakan nilai Xp. (Indrayanto dan Yuwono, 2005).

2.6.5

Linearitas Penentuan liniearitas dilakukan dengan menggunakan minimal

lima macam konsentrasi dimana kelima macam konsentrasi tersebut berkisar antara 80-120% dari kadar analit yang diperkirakan. Sebagai parameter adanya hubungan linear atau tidak digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linear, y = bx + a, harga r yang diharapkan lebih besar dari r tabel (Carr, 1990). Parameter yang perlu ditentukan adalah deviasi rata-rata dari garis regresi (Sy), standar deviadi fungsi (Sxo), dan koefisien variasi dari fungsi (Vxo). Persamaan yang mempunyai nilai Vxo paling kecil dapat dipilih untuk analisis selanjutnya. Harga Vxo sebaiknya tidak lebih dari 5%. Harga r lebih besar dari r tabel tidak menjamin bahwa kurva linear yang diperoleh mempunyai harga Vxo yang baik (Indrayanto dan Yuwono, 2005)

Skripsi


M.Rezki Dwitya


21 Persamaan-persamaan

tersebut

dapat

dihitung

dengan

menggunakan rumus :

∑ (Yi − Yi)

Sy =

2.6.6

2

keterangan : Yi = bx + a

n−2

Sxo =

Sy b

Vxo =

Sxo x 100% x

Akurasi ICH mendefinisikan akurasi prosedur analisis sebagai kedekatan

antara nilai sebenarnya yang diketahui dan nilai yang diperoleh. Akurasi juga dapat digambarkan sebagai sejauh mana hasil dari metode yang digunakan dengan nilai sebenarnya yang diketahui. Penilaian akurasi dapat dilakukan

dengan

beberapa

cara.

Salah

satunya

adalah

dengan

membandingkan hasil dari metode yang dibuat dengan hasil dari metode referensi yang sudah ditetapkan. Pendekatan ini mengasumsikan bahwa ketidakpastian dari metode referensi diketahui. Kedua, akurasi dapat dinilai dengan menganalisis sampel yang sudah diketahui konsentrasi nya (misalnya, sampel kontrol atau material referensi yang terjamin) dan membandingkan nilai yang terukur dengan nilai yang sebenarnya seperti yang terdapat pada material (Huber, 2007).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB III KERANGKA KONSEPTUAL

3.1

Uraian kerangka konseptual Piper nigrum L. dan Piper retrofractum Vahl. merupakan 2

tanaman yang berada pada genus yang sama yaitu Piperaceae. Spesies piper tersebar luas di wilayah tropis dan subtropis dunia, dan biasanya digunakan sebagai obat dengan berbagai macam cara. Tanaman dengan genus piper, terkenal dalam sistem pengobatan ayuverda di India. Kontrol

kualitas

obat

herbal,

dalam

beberapa

kasus,

memungkinkan untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik, yang biasa disebut senyawa marker yang dapat digunakan untuk membantu pembuatan produk yang konsisten. Senyawa marker adalah senyawa atau golongan senyawa yang dapat digunakan untuk mengontrol konsistensi tiap batch produk jadi tanpa harus mengetahui adanya aktifitas atau tidak senyawa tersebut. Senyawa marker diklasifikasikan menjadi dua, yang pertama adalah senyawa marker aktif, yaitu senyawa atau golongan senyawa yang diketahui secara umum mempunyai kontribusi dalam aktifitas terapetik. Yang kedua adalah senyawa marker analisis yaitu senyawa atau golongan senyawa yang digunakan untuk tujuan analisis tanpa perlu mengetahui adanya kontribusi aktifitas terapetik atau tidak (Natural Health Product Directorate’s Canada, 2012). Karena hanya sejumlah kecil senyawa kimia yang terbukti memiliki aktifitas farmakologis yang jelas, sehingga senyawa kimia lainnya juga dapat digunakan sebagai marker. Senyawa marker dapat menjadi indikator kualitas obat herbal.

22

Skripsi


M.Rezki Dwitya


23 Terdapat delapan kategori senyawa yang bisa dikatakan senyawa marker dalam uji kontrol kualitas obat herbal, yaitu therapeutic components, bioactive components, synergistic components, characteristic components, main components, correlative components, toxic components, and general components (Li et al., 2008). Pada penelitian Patel (2011) Untuk evaluasi gel polyherbal yang mengandung Terminalia arjuna, Centella asiatica dan Curcuma longa, dilakukan identifikasi senyawa marker setiap tanaman pada gel tersebut. Untuk Curcuma longa, digunakan standard reference curcumin sebagai senyawa marker, yang kita ketahui bahwa curcumin merupakan main component didalam tanaman tersebut (Patel et al., 2011). Piperin adalah salah satu senyawa mayor yang dimiliki oleh beberapa spesies tanaman yang berada pada genus Piperaceae dan merupakan senyawa amida pertama yang diisolasi dari spesies piper. Dari hasil studi farmakologi, dilaporkan bahwa piperin mempunyai aktivitas sebagai depresan sistem saraf pusat, anti piretik, analgesik, dan anti inflamasi (Parmar et al, 1997). Prasaplai merupakan salah satu produk obat herbal tradisional di Thailand yang berkhasiat untuk mengurangi dysmenorrhea dan mengatur siklus mesntruasi. Dari formula tersebut, terkandung empat tanaman yang berada pada dua genus yang sama, yaitu Piper retrofractum Blume dan P. nigrum L., serta Zingiber cassumunar Roxb. dan Z. officinale Roscoe. Sehingga untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik tanaman yang berada pada genus yang sama, tidak bisa dilakukan mengunakan senyawa utama / senyawa mayor nya.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


24 Oleh karena itu, peneliti melakukan identifikasi tanaman Piper retrofractum Vahl. dan Piper nigrum L. pada campuran nya berdasarkan senyawa marker karakteristik / senyawa marker spesifik menggunakan instrumen KLT-Densitometri dan Visualizer. Keuntungan menggunakan KLT untuk penentuan senyawa marker spesifik tanaman dalam obat herbal: lebih sederhana, fleksibel, lebih cepat, kepekaan tertentu dan preparasi sampel yang lebih sederhana (Liang et al., 2004). Pengembangan

metode

analisis

memerlukan

syarat

yang

menyatakan bahwa metode yang digunakan untuk analisis harus tervalidasi. Validasi analisis merupakan persyaratan utama untuk membuktikan kehandalan dan kesesuaian suatu metode untuk digunakan (Renger, 2006). Pada penelitian ini, validasi yang dilakukan meliputi : Uji stabilitas, presisi, peak identity dan peak purity, batas deteksi dan batas kuantitasi, linearitas dan akurasi.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


25

3.2 Kerangka Konseptual

Piper retrofractum Vahl. dan Piper nigrum L. merupakan 2 spesies tanaman yang berada pada genus yang sama.

Tanaman yang berada pada takson yang sama, mempunyai common compound yang sama. Sehingga diperlukan senyawa karakteristik untuk dilakukan identifikasi.

Kontrol kualitas obat herbal memungkinkan untuk melakukan identifikasi senyawa spesifik, yang biasa disebut senyawa marker yang dapat digunakan untuk membantu pembuatan produk yang konsisten. Senyawa marker aktif yaitu senyawa atau golongan senyawa yang diketahui secara umum mempunyai kontribusi dalam aktifitas terapetik.

Piperin merupakan senyawa marker aktif. Yang merupakan common compound dari tanaman yang berada pada genus piperaceae dan dianggap sebagai senyawa marker aktif.

Senyawa marker analisis yaitu senyawa atau golongan senyawa yang digunakan untuk tujuan analisis tanpa perlu mengetahui adanya kontribusi aktifitas terapetik atau tidak.

Identifikasi tanaman Piper retrofractum Vahl. dan P. nigrum L. pada campuran nya berdasarkan senyawa marker karakteristik / senyawa marker spesifik

Pengembangan metode analisis memerlukan syarat yang menyatakan bahwa metode yang digunakan untuk analisis harus tervalidasi. Validasi analisis merupakan persyaratan utama untuk membuktikan kehandalan dan kesesuaian suatu metode untuk digunakan. 22

Dapat dikembangan metode analisis yang valid untuk penentuan senyawa marker pada formula campuran menggunakan KLT-Densitometri dan Visualizer.

Gambar 3.1 Skematik kerangka konseptual

Skripsi


M.Rezki Dwitya


26

3.3

Hipotesis Dapat dikembangan metode analisis yang valid untuk penentuan

senyawa marker pada formula campuran menggunakan KLT-Densitometri dan Visualizer.

22

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1

Bahan dan Alat Penelitian

4.1.1

Bahan Tanaman Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah dari

tanaman cabe jawa dan merica hitam. Kedua tanaman tersebut diperoleh dan diidentifikasi dari Balai penelitian tanaman rempah dan obat (Balittro) Bogor. Tabel IV.1 Spesifikasi buah tanaman yang diperoleh Tanaman

Umur saat panen

Musim panen

Cara pengeringan

Cabe jawa

4 bulan

Kemarau

Menggunakan Oven 500 C

Merica hitam

6 bulan

Kemarau

Menggunakan Oven 500 C

4.1.2

Bahan kimia dan bahan lain Bahan kimia yang digunakan untuk penelitian ini adalah n-Heksan

p.a (merck), kloroform p.a (malinckorf), Plate TLC Silica Gel GF 254 merck.

27

Skripsi


M.Rezki Dwitya


28 4.1.3

Alat-alat Moisture Analyzer HB43-S Mettler Toledo, Microwave Sharp

R230-R(S), Ayakan No. 13 mm; 2-μm pore; PTFE syringe filter, Linomat 5, Automatic Development Chamber 2, Camag TLC Visualizer, Camag TLC scanner 3, software WinCATS versi 1436336, software VMA solution versi 1.2.0b.

4.2

Metode Penelitian

4.2.1

Pembuatan serbuk simplisia Buah cabe jawa dan merica hitam dalam kondisi kering. Kedua

buah tanaman tersebut kemudian dibuat menjadi serbuk simplisia menggunakan blender. Setelah itu diayak menggunakan ayakan No. 100.

4.2.2

Penentuan kadar air serbuk simplisia Pengukuran kandungan air yang berada di dalam serbuk simplisia

tanaman cabe jawa dan merica hitam. Dengan menimbang 500,0 mg masing-masing serbuk simplisia, kemudian pengukuran menggunakan alat Moisture Analyzer. Simplisia dinilai cukup aman bila mempunyai kadar air kurang dari 10% (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1985).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


29 4.2.3

Pembuatan Formula Campuran

Tabel IV.2 Komposisi tanaman untuk pembuatan formula campuran BAHAN TANAMAN

F1

F2

F3

Merica Hitam

75%

50%

25%

Cabe Jawa

25%

50%

75%

Membuat 3 formula campuran sebanyak 100,0 gram tiap formulanya. Serbuk simplisia buah cabe jawa dan merica hitam ditimbang sesuai dengan komposisi dari tiap formula campurannya. (Komposisi tanaman untuk pembuatan formula campuran dilihat pada tabel IV.1). Setelah itu, diaduk dan diayak menggunakan ayakan No. 100.

4.2.4

Preparasi Sampel Serbuk sampel formula campuran ditimbang 50,0 mg, dimasukkan

kedalam labu ukur 5 mL, lalu ditambahkan n-Heksan p.a 3,0 mL, diekstraksi menggunakan Microwave. Kemudian dalam labu ukur tersebut ditambahkan n-Heksan ad 5 mL atau sampai garis tanda. Tiap sampel disaring dengan menggunakan 13 mm, 2-μm pore, PTFE syringe filter.

4.2.5

Optimasi kondisi Pada tahap ini dilakukan penentuan fase gerak, penentuan

konsentrasi sampel, penentuan jumlah larutan sampel yang ditotolkan dan penentuan panjang gelombang pada analisis menggunakan densitometri. Larutan sampel ditotolkan menggunakan Linomat-5 pada plat KLT silika gel 60 F254. Setelah totolan kering plat dieluasi menggunakan ADC-2.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


30 Noda yang diperoleh diamati di TLC Scanner-3 pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Fase gerak yang terpilih adalah fase gerak yang dapat memisahkan peak terpilih dengan peak lain, dengan pemisahan paling baik berdasarkan nilai resolusi > 0,8 serta panjang gelombang sinar UV yang dapat menampakkan senyawa marker spesifik dari masing-masing tanaman.

4.2.6 Penentuan senyawa marker spesifik Penentuan senyawa marker spesifik dengan memilih salah satu senyawa pada masing-masing tanaman, yang hanya dimiliki tanaman itu saja. Senyawa yang terpilih harus memiliki resolusi > 0,8 dan memiliki peak purity ≥ 0,9900. Sehingga dengan adanya senyawa marker spesifik didalam formula campuran, dapat menandakan keberadaan tanaman tersebut

4.2.7

Validasi metode

4.2.7.1 Stabilitas Pertama stabilitas dalam pelarut, sampel pertama adalah formula campuran yang dilarutkan pada 8 jam sebelum penotolan, sampel kedua adalah formula campuran yang dilarutkan satu jam sebelum penotolan, sampel ketiga adalah formula campuran yang dilarutkan segera sebelum penotolan. Ketiga larutan sampel tersebut kemudian ditotolkan sebesar 35,0 µL menggunakan Linomat-5 pada satu plat KLT yang sama. Selanjutnya, dieluasi menggunakan fase gerak terpilih pada ADC-2, noda hasil pemisahan dilihat menggunakan Camag TLC Visualizer.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


31 Kedua,

stabilitas

dalam

plat.

Larutan

sampel

ditotolkan

menggunakan Linomat-5 sebesar 35,0 µL pada plat KLT 10x10 cm sebanyak satu kali disalah satu sudut. Kemudian dieluasi menggunakan fase gerak yang terpilih pada ADC-2. Kemudian dilakukan eluasi kedua pada sisi yang tegak lurus pada sisi yang kedua setelah 2 jam dan 3 jam. Setelah eluasi, divisualisasikan menggunakan Camag TLC Visualizer.

Gambar 4.1 Skematik arah eluasi uji stabilitas pada plat KLT

4.2.7.2 Presisi Ketiga sampel formula campuran ditotolkan menggunakan Linomat-5 sebanyak 35,0 µl pada plat KLT silika gel 60 F254 10x10 cm. Masing-masing sampel dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Selanjutnya, dieluasi menggunakan fase gerak terpilih dalam ADC-2, kemudian dilakukan analisis menggunakan Camag TLC Scanner-3 dan software WinCATS. Hal ini dilakukan 3 kali di 3 hari yang berbeda dengan komposisi eluen yang sama. Lalu nilai rasio area dari peak senyawa marker spesifik akan dibandingkan dengan peak yang sama tiap replikasinya sehingga diperoleh variabilitas interday dan intraday.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


32 4.2.7.3 Peak purity dan peak identity Pada tahap ini dilakukan scanning spektra pada masing – masing peak senyawa marker spesifik pada tiap tanaman. Untuk peak identity dilakukan dengan mengkorelasikan peak yang digunakan untuk standard dengan peak yang sama pada track yang berbeda. Sedangkan peak purity dilakukan dengan mengkorelasikan spektra pada awal peak dengan maksimum peak (r s,m) dan spektra pada maksimum peak dengan spektra pada akhir peak (r m,e). Peak identity dan peak purity diterima apabila memiliki nilai correlation limit > 0,9900.

Gambar 4.2 Skematik peak purity (Indrayanto dan Yuwono, 2005).

4.2.7.4 Batas deteksi dan batas kuantitasi Untuk menentukan batas deteksi dan batas kuantitasi, masingmasing larutan sampel tanaman tunggal ditotolkan sampai di konsentrasi senyawa marker spesifik tidak tampak. Kemudian diambil 5 tingkat konsentrasi yang akan dilakukan perhitungan regresi linear dengan menggunakan software VMA Solution. Sehingga akan diketahui batas deteksi dan batas kuantifikasi dari masing – masing larutan sampel tanaman tunggal.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


33 4.2.7.5 Linearitas Tabel IV.3 Preparasi pembuatan kurva kalibrasi masing-masing tanaman Konsentrasi

2.500 ppm 5.000 ppm 10.000 ppm 12.500 ppm

Berat serbuk 12,5 mg

Volume larutan yang ditotolkan

Area senyawa marker spesifik

35,0 µL

25,0 mg

35,0 µL

50,0 mg

35,0 µL

62,5 mg

35,0 µL

Serbuk simplisia merica hitam dan cabe jawa ditimbang sebanyak 5 kali dengan berat serbuk yang sesuai pada tabel 4.3. Kemudian masing – masing serbuk yang sudah ditimbang dimasukkan kedalam labu ukur 5 mL, lalu ditambahkan n-Heksan p.a 3,0 mL, diekstraksi menggunakan Microwave. Kemudian dalam labu ukur tersebut ditambahkan n-Heksan ad 5 mL atau sampai garis tanda. Tiap sampel disaring dengan menggunakan 13 mm, 2-μm pore, PTFE syringe filter. Langkah berikutnya adalah menotolkan 5 tingkat konsentrasi larutan sampel tersebut pada plat KLT. Kemudian dianalisis menggunakan densitometri pada lambda maksimum masing-masing senyawa marker spesifik. Setelah itu dilakukan perhitungan regresi linear antara area senyawa marker spesifik dengan berat serbuk simplisia.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


34 4.2.7.6 Akurasi Tiap formula campuran dilakukan penimbangan sebanyak 3 kali seberat 50,0 mg. Kemudian masing-masing dimasukkan kedalam labu ukur 5 mL, lalu ditambahkan n-Heksan p.a 3,0 mL, diekstraksi menggunakan Microwave. Kemudian dalam labu ukur tersebut ditambahkan n-Heksan ad 5 mL atau sampai garis tanda. Tiap sampel disaring dengan menggunakan 13 mm, 2-μm pore, PTFE syringe filter. Langkah berikutnya adalah menotolkan tiap larutan sampel formula campuran yang telah dibuat sebanyak 35,0 µL dengan menggunakan Camag-Linomat 5 bersamaan dengan 4 tingkat konsentrasi larutan sampel tanaman tunggal yang digunakan sebagai kurva kalibrasi pada plat KLT ukuran 20 x 10 cm. Kemudian dieluasikan dengan heksan:kloroform (0,5:3,5) menggunakan Camag ADC-2. Lalu setelah eluasi, plat dianalisis menggunakan densitometri pada lambda maksimum dari masing-masing senyawa marker spesifik. Area dari senyawa marker spesifik tiap tanaman pada masing-masing formula akan dimasukkan kedalam persamaan regresi yang didapat dari perhitungan regresi linear antara area senyawa marker spesifik pada tanaman tunggal dengan berat penimbangan

masing-masing

tingkat

konsentrasinya.

Selanjutnya

dilakukan perbandingan antara berat sebenarnya masing-masing tanaman pada tiap formula dengan berat yang diperoleh dari hasil analisis menggunakan densitometri.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


35 4.3 Skema Metode Penelitian Pembuatan serbuk simplisia masing – masing tanaman

Penentuan kadar air serbuk simplisia masing – masing tanaman

Pembuatan formula campuran F1 : MH 25% CJ 75%

Preparasi sampel F2 : MH 50% CJ 50% Optimasi Kondisi F3 : MH 75% CJ 25% Penentuan senyawa marker spesifik

Validasi Metode Stabilitas, Presisi, Peak identity dan purity, batas deteksi dan kuantitasi, linearitas, akurasi

Gambar 4.3 Skematik metode penelitian

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB V HASIL PENELITIAN

5.1

Penentuan Kadar Air Sebelum serbuk simplisia masing-masing tanaman dibuat formula

campuran, perlu dilakukan uji kadar air. Penentuan kadar air menggunakan Moisture Analizer. Dari hasil pengamatan ditentukan kadar air pada serbuk simplisia pada masing – masing tanaman :

Tabel V.1 % Kadar air pada serbuk simplisia merica hitam dan cabe jawa. TANAMAN KADAR AIR Serbuk simplisia merica hitam 7,24 ± 0,28 % Serbuk simplisia cabe jawa 8,18 ± 0,26 % Pada tabel V.1 diketahui bahwa kadar air serbuk simplisia merica hitam dan serbuk simplisia cabe jawa memenuhi persyaratan FHI kurang dari 10%. Setiap penimbangan yang dilakukan, serbuk tanaman tunggal maupun formula campuran harus dilakukan perhitungan berat kering dari berat serbuk yang ditimbang untuk menjamin kuantitasi yang hasil didapatkan.

5.2

Optimasi Kondisi Konsentrasi sampel yang digunakan adalah 10.000 ppm dan

jumlah larutan yang akan ditotolkan pada plat KLT adalah 35,0 µL. Sedangkan fase gerak yang terpilih adalah n-Heksan, kloroforom (0.5:3.5). Kondisi ini dapat menampakkan senyawa marker spesifik dari tiap tanaman

36

Skripsi


M.Rezki Dwitya


37 dan memiliki pemisahan yang baik antara senyawa marker spesifik dan senyawa lainnya. Dari hasil eluasi dengan fase gerak terpilih tersebut, senyawa marker spesifik merica hitam memiliki resolusi 0,84, sedangkan senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki resolusi 3,6. Persyaratan nilai resolusi yang diterima adalah > 0,8. Kemudian dari hasil scanning, masingmasing peak senyawa marker spesifik mempunyai nilai peak purity ≥ 0,9900.

5.3

Penentuan Senyawa Marker Spesifik

Gambar 5.1 Hasil visualisasi sampel merica hitam, formula campuran dan cabe jawa pada 366 nm menggunakan Camag TLC – Visualizer. a) cabe jawa, b) formula campuran, c) merica hitam.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


38

Gambar 5.2 Kromatogram masing-masing tanaman dan formula campuran pada 366 nm. 1) peak marker merica hitam, 2) peak marker cabe jawa.

Penentuan senyawa marker spesifik dilakukan dengan memilih satu senyawa dari tiap tanaman tunggal merica hitam dan cabe jawa, yang hanya dimiliki oleh salah satu tanaman itu saja. Sehingga dengan adanya senyawa tersebut, bisa menandakan keberadaan tanaman tunggal di formula campuran. Terlihat pada gambar 5.1, di Rf 0,09 sampel tanaman tunggal merica hitam sama-sama noda dengan warna yang sama, sedangkan noda tersebut tidak tampak pada sampel cabe jawa. Pada gambar 5.2 juga membuktikan bahwa pada kromatogram sampel merica hitam dan formula campuran sama-sama terdapat peak pada Rf 0,09 dan peak tersebut tidak tampak di kromatogram sampel cabe jawa. Maka dapat disimpulkan bahwa senyawa marker spesifik merica hitam terdapat pada Rf 0,09. Sedangkan untuk senyawa marker spesifik cabe jawa, terlihat pada gambar 5.1, pada Rf 0,52 baik sampel cabe jawa dan formula

Skripsi


M.Rezki Dwitya


39 campuran terdapat noda dengan warna yang sama tetapi noda tersebut tidak tampak di sampel merica hitam. Pada gambar 5.2 juga membuktikan bahwa pada kromatogram sampel cabe jawa dan formula campuran sama-sama terdapat peak pada Rf 0,52 dan peak tersebut tidak tampak di kromatogram sampel merica hitam. Maka dapat disimpulkan bahwa senyawa marker spesifik merica hitam terdapat pada Rf 0,52.

Tabel V.2 Rf senyawa marker spesifik dari tiap tanaman TANAMAN Rf Merica Hitam 0,09 Cabe Jawa 0,52 5.4

Hasil Validasi Metode

5.4.1

Uji stabilitas Pertama uji stabilitas pada pelarut. Untuk menguji ekstrak formula

campuran dalam pelarut Heksan p.a, dilakukan 3 sampel : sampel recenter paratus (rp), sampel dengan waktu kontak 1 jam dan sampel dengan waktu kontak 8 jam.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


40

Gambar 5.3 Hasil visualisasi uji stabilitas dalam pelarut pada 366 nm; a. Sampel rp; b. Sampel dengan kontak pelarut dan serbuk simplisia formula campuran selama 1 jam; c. Sampel dengan kontak pelarut dan serbuk simplisia formula campuran selama 8 jam.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


41

Gambar 5.4 Kromatogram uji stabilitas dalam pelartu pada 366 nm.

Dari gambar 5.3 tersebut menunjukkan tidak adanya perbedaan noda dari ketiga sampel dan pada gambar 5.4 juga menunjukkan tidak terdapat perbedaan kromatogram dari ketiga sampel. Hal tersebut menunjukkan sampel dapat stabil dalam penyimpanan suhu ruangan (250 C) selama 8 jam. Selanjutnya uji stabilitas dalam plat KLT, untuk menguji stabilitas serbuk simplisia dalam pelarut Heksan p.a, dilakukan menggunakan 2 sampel (sampel kontak dengan plat 2 jam dan 3 jam).

Skripsi


M.Rezki Dwitya


42

Gambar 5.5 Hasil visualisasi uji

Gambar 5.6 Hasil visualisasi uji

stabilitas pada 366 nm selama 2 jam

stabilitas pada 366 nm selama 3 jam

Pada gambar 5.5 menunjukkan sampel stabil selama 2 jam, hal tersebut ditunjukkan dengan noda yang terbentuk berupa garis longitudinal. Sedangkan pada gambar 5.6 menunjukkan bahwa terdapat noda diluar garis longitudinal (degradan). Dari gambar tersebut dapat disimpulkan bahwa serbuk simplisia formula campuran stabil dalam plat KLT selama 2 jam.

5.4.2

Presisi Pada uji validasi presisi, dilakukan 3 kali replikasi tiap formula

dan dilakukan selama 3 hari. Kemudian area senyawa marker spesifik cabe jawa akan dibagi dengan area senyawa marker spesifik merica hitam pada tiap formulanya, sehingga didapatkan nilai rasio area dari senyawa marker spesifik cabe jawa. Begitu juga sebaliknya untuk area senyawa marker merica hitam, dibagi dengan area senyawa marker cabe jawa tiap formulanya sehingga akan didapatkan nilai rasio area dari senyawa marker

Skripsi


M.Rezki Dwitya


43 spesifik merica hitam. Kemudian dihitung %KV dari rasio area pada masing-masing intraday dan interday.

Tabel V.3 Rasio area senyawa marker spesifik pada tiap formula campuran MH F1 MH F2 MH F3 CJ F1 CJ F2 CJ F3 4,40 2,15 1,03 0,23 0,46 0,97 Intraday 1 4,63 2,15 1,00 0,21 0,46 1,00 4,29 2,22 1,05 0,23 0,45 0,95 4,57 2,13 1,04 0,22 0,47 0,96 Intraday 2 4,69 2,07 1,03 0,21 0,48 0,98 4,54 2,10 1,01 0,22 0,47 0,99 4,63 2,20 0,98 0,21 0,45 1,02 Intraday 3 4,61 2,18 0,97 0,22 0,46 1,03 4,75 2,23 1,00 0,21 0,45 1,00 Tabel V.4 %KV rasio area masing-masing senyawa marker spesifik pada tiap formula (n=3) MH F1 MH F2 MH F3 CJ F1 CJ F2 CJ F3 Intraday 1 3,96 % 1,92 % 2,27 % 2,27 % 1,89 % 3,91 % Intraday 2 1,70 % 1,53 % 1,43 % 1,68 % 1,53 % 1,44 % Intraday 3 1,32 % 1,12 % 1,52 % 1,31 % 1,12 % 1,51 % Interday 3,13 % 2,47 % 2,61 % 2,62 % 2,49 % 3,22 % Pada tabel V.4 menunjukkan bahwa KV area senyawa marker spesifik kedua tanamanan, baik intraday dan interday ≤ dari 5%.

5.4.3

Peak purity dan peak identity Pada tahap ini dilakukan scanning pada masing-masing peak

senyawa marker spesifik. Peak discan dengan menggunakan lambda 200 nm – 500 nm.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


44 Tabel V.5 Peak purity senyawa marker spesifik merica hitam

Tabel V.6 Peak purity senyawa marker spesifik cabe jawa

Skripsi


M.Rezki Dwitya


45

Gambar 5.7 Peak identity senyawa marker spesifik merica hitam

Gambar 5.8 Peak identity senyawa marker spesifik cabe jawa

Skripsi


M.Rezki Dwitya


46 Pada tabel V.4, menunjukkan bahwa peak purity dari peak senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki nilai correlation limit ≥ 0,9900 dan panjang gelombang maksimum senyawa tersebut berada disekitar 340 nm. Pada gambar 5.7 dilakukan overlay profil spektra antara peak senyawa marker spesisik cabe jawa pada formula dengan senyawa marker spesifik cabe jawa pada serbuk simplisianya. Nilai correlation limit dari overlay kedua profil spektra tersebut adalah ≥ 0,9900. Sedangkan pada tabel V.5 menunjukkan bahwa peak purity dari peak senyawa marker spesifik merica hitam memiliki nilai correlation limit ≥ 0,9900 dan panjang gelombang maksimum senyawa tersebut berada disekitar 340 nm. Terlihat pada gambar 5.8 dilakukan overlay profil spektra antara peak senyawa marker spesisik merica hitam pada formula dengan senyawa marker spesifik merica hitam pada serbuk simplisianya. Nilai correlation limit dari overlay kedua profil spektra tersebut adalah ≥ 0,9900.

5.4.4

Batas deteksi dan batas kuantitasi Untuk mengetahui batas deteksi dan batas kuantitasi dari masing-

masing senyawa marker tiap tanaman, dilakukan perhitungan regresi linear dari 5 level konsentrasi sampel yang ditotolkan yang masih menampakkan noda senyawa marker spesifik. Kemudian akan dilakukan perhitungan regresi linear antara berat sampel dengan area yang didapatkan menggunakan software VMA Solution.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


47 Tabel V.7 Batas deteksi dan batas kuantitasi pada merica hitam Konsentrasi sampel Volume totolan Berat sampel Area 186 ppm 35,0 µL 0,93 mg 356,56 462 ppm 35,0 µL 2,31 mg 837,15 928 ppm 35,0 µL 4,64 mg 1770,68 1392 ppm 35,0 µL 6,96 mg 2497,56 1856 ppm 35,0 µL 9,28 mg 3302,8 r 0,9992 sdv 0,15 Vx0 3,19 % Batas deteksi 0,92 mg Batas kuantitasi 2,76 mg Dari tabel V.7 terlihat bahwa senyawa marker spesifik merica hitam memiliki batas deteksi pada 0,92 mg dan batas kuantitasi pada 2,76 mg.

Tabel V.8 Batas deteksi dan batas kuantitasi pada cabe jawa Konsentrasi sampel Volume totolan Berat sampel Area 460 ppm 35,0 µL 2,30 mg 240,56 918 ppm 35,0 µL 4,59 mg 480,91 1378 ppm 35,0 µL 6,89 mg 650,23 1836 ppm 35,0 µL 9,18 mg 877,45 2296 ppm 35,0 µL 11,48 mg 1072,73 r 0,9989 sdv 0,19 Vx0 2,85 % Batas deteksi 1,29 mg Batas kuantitasi 3,86 mg Dari tabel V.8 terlihat bahwa senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki batas deteksi pada 1,29 mg dan batas kuantifikasi pada 3,86 mg.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


48 5.4.5 Linearitas Pada tahap ini dilakukan uji linearitas untuk 4 tingkat konsentrasi masing-masing tanaman tunggal yang digunakan sebagai kurva kalibrasi pada penentuan kadar tiap tanaman tunggal dalam formula campuran.

Tabel V.9 Linearitas senyawa marker spesifik merica hitam. Konsentrasi sampel Volume totolan Kadar sampel Area 2318 ppm 35,0 µL 11,59 mg 3820,25 4638 ppm 35,0 µL 23,19 mg 5197,40 9276 ppm 35,0 µL 46,38 mg 7304,12 11594 ppm 35,0 µL 57,97 mg 8432,00 Pers. regresi Y = 2789,6 + 97,717 * X r 0,9987 sdv 1,27 Vx0 3,68 %

Gambar 5.9 Kurva kalibrasi merica hitam

Skripsi


M.Rezki Dwitya


49 Tabel V.10 Linearitas senyawa marker spesifik cabe jawa Konsentrasi Volume totolan Kadar sampel Area sampel 2296 ppm 35,0 µL 11,48 mg 1145,3 4590 ppm 35,0 µL 22,95 mg 2264,25 9182 ppm 35,0 µL 45,91 mg 4495,83 11476 ppm 35,0 µL 57,38 mg 5402,23 Pers. regresi Y = 103,07 + 93,634 * X r 0,9993 sdv 0,93 Vx0 2,72 %

Gambar 5.10 Kurva kalibrasi cabe jawa

Pada merica hitam, 4 tingkat konsentrasi yang digunakan adalah 12,5 mg; 25,0 mg; 50,0 mg dan 62,5 mg. Dari perhitungan regresi linear, pada 4 tingkat konsentrasi tersebut didapatkan persamaan regresi Y = 2789,6 + 97,717 * X , dengan nilai r = 0,9987 , sdv = 1,27 dan Vx0 = 3,68 %. Dari hasil yang didapat menunjukkan bahwa rentang konsentrasi yang digunakan sebagai kurva kalibrasi untuk merica hitam memenuhi syarat. Sedangkan pada cabe jawa, 4 tingkat konsentrasi yang digunakan adalah 12,5 mg; 25,0 mg; 50,0 mg dan 62,5 mg. Dari perhitungan regresi

Skripsi


M.Rezki Dwitya


50 linear didapatkan persamaan regresi Y = 103,07 + 93,634 * X

, dengan

nilai r = 0,9993 , sdv = 0,93 , dan Vx0 = 2,72 %. Dari hasil yang didapat menunjukkan bahwa rentang konsentrasi yang digunakan sebagai kurva kalibrasi untuk cabe jawa memenuhi syarat. Selanjutnya dilakukan homogenity test pada konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi konsentrasi yang digunakan pada tiap tanaman, masing masing dilakukan 4 kali replikasi. Kemudian data area yang didapatkan diolah menggunakan software VMA Solution.

Tabel V.11 Homogenity test konsentrasi terendah dan tertinggi yang digunakan untuk kurva kalibrasi pada sampel merica hitam. Konsentrasi 2318 ppm 2318 ppm 2318 ppm 2318 ppm Rata – rata

Skripsi

Area Konsentrasi 3876,57 11594 mg 3921,64 11594 mg 3912,45 11594 mg 3882,36 11594 mg = 3898,25 Rata – rata = Testing value (TV) = 4,6065 F = 9,2766


Area 8445,23 8479,92 8391,34 8499,85 8454,08

M.Rezki Dwitya


51 Tabel V.12 Homogenity test konsentrasi terendah dan tertinggi yang digunakan untuk kurva kalibrasi pada sampel cabe jawa. Konsentrasi Area Konsentrasi Area 2296 ppm 1123,45 11476 ppm 5463,23 2296 ppm 1178,96 11476 ppm 5432,64 2296 ppm 1099,45 11476 ppm 5545,13 2296 ppm 1075,34 11476 ppm 5342,56 Rata – rata = 1119,3 Rata – rata = 5445,89 Testing value (TV) = 3,5578 F = 9,2766 Dari hasil pengolahan data dengan software VMA Solution, diketahui hasil homogenity test pada sampel tanaman tunggal cabe jawa dan merica hitam memenuhi syarat, karena nilai testing value (TV) ≤ F.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


52

5.4.6 Akurasi Tahap ini dilakukan untuk mengetahui keakuratan metode yang digunakan dengan cara menghitung persentase perbandingan antara kadar tanaman tunggal sebenarnya yang terdapat di tiap formula dengan kadar yang diperoleh. Kadar yang diperoleh didapat dengan memasukkan area dari tiap senyawa marker spesifik tanaman tunggal kedalam persamaan regresi dari kurva kalibrasi masing-masing tanaman yang sesuai.

Tabel V.13 Akurasi kadar merica hitam pada tiap formula ( n = 3 )

F1

Konsentrasi

Berat Sebenarnya

6956 ppm

34,78 mg

Area Senyawa Marker 6256,53 6398,34 6304,86

Rata – rata

F2

4638 ppm

23,19 mg

F3

11,59 mg

Rata – rata

Skripsi

35,48 mg 36,93 mg 35,97 mg 36,13 ± 0,74 mg

5298,74 5264,55 5338,19

Rata – rata 2318 ppm

Berat Diperoleh

25,68 mg 25,33 mg 26,08 mg 25,69 ± 0,38 mg

3968,25 4025,33 3945,73

12,06 mg 12,65 mg 11,83 mg 12,18 ± 0,42 mg


% Akurasi 102,01 % 106,18 % 103,43 % 103,87 ± 2,12 % 110,73 % 109,22 % 112,47 % 110,80 ± 1,62 % 104,07 % 109,11 % 102,08 % 105,09 ± 3,62 %

M.Rezki Dwitya


53

F1

F2

F3

Tabel V.14 Akurasi kadar cabe jawa pada tiap formula ( n = 3 ) Area Berat Berat Konsentrasi Senyawa Sebenarnya Diperoleh % Akurasi Marker 1221,24 11,94 mg 104,02 % 2296 ppm 1167,4 11,37 mg 99,01 % 11,48 mg 1239,67 12,14 mg 105,74 % 11,81 ± 0,40 102,92 ± 3,49 Rata – rata mg % 2452,42 25,09 mg 109,33 % 4590 ppm 2341,45 23,90 mg 104,16 % 22,95 mg 2384,64 24,37 mg 106,17 % 24,45 ± 0,60 106,55 ± 2,60 Rata – rata mg % 3592,98 37,27 mg 108,25 % 6886 ppm 3423,22 35,46 mg 102,99 % 34,43 mg 3494,56 36,22 mg 105,20 % 36,31 ± 0,91 105,48 ± 2,64 Rata – rata mg % Dari tabel V.13 dan V.14, dapat disimpulkan bahwa metode yang

digunakan valid karena % akurasi perbandingan berat tanaman tunggal sebenarnya yang terdapat didalam formula campuran dengan berat yang diperoleh berkisar 80-120%.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB VI PEMBAHASAN

Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan metode yang valid yang dapat menentukan senyawa marker spesifik dari tanaman yang berada pada genus yang sama menggunakan KLT – Densitometri dan Visualizer. Bahan tanaman yang digunakan adalah Piper retrofractum Vahl.(Cabe Jawa) dan Piper nigrum L. (Merica Hitam) yang sama-sama berada pada genus Piperaceae. Cabe jawa dan merica hitam yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dan diidentifikasi dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balittro) Bogor. Simplisia yang digunakan adalah buah dari masingmasing tanaman. Simplisia merica hitam yang diperoleh berumur 4 bulan saat panen, dipanen saat musim kemarau, kemudian dilakukan pengeringan pada simplisia tersebut dengan menggunakan oven pada suhu 500 C. Sedangkan untuk simplisia cabe jawa, diperoleh berumur 6 bulan saat panen, dipanen saat musim kemarau, kemudian dilakukan pengeringan pada simplisia tersebut dengan menggunakan oven pada suhu 500 C. Setelah itu simplisia buah dari masing-masing tanaman dilakukan pengecilan ukuran partikel dengan cara diblender, kemudian diayak menggunakan ayakan no. 100, untuk menghomogenisasikan ukuran partikel pada serbuk simplisia tersebut sehingga kemampuan ekstraksi serbuk simplisia dengan pelarut diharapkan sama.

54

Skripsi


M.Rezki Dwitya


55 Langkah berikutnya adalah uji kadar air masing-masing serbuk simplisia tanaman merica hitam dan cabe jawa. Pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan Moisture Analizer, sehingga dapat ditentukan kadar air dalam serbuk simplisia merica hitam adalah 7,24 ± 0,28 % dan kadar air dalam serbuk simplisia cabe jawa adalah 8,18 ± 0,26 %. Setelah itu dibuat formula campuran dari kedua serbuk simplisia tanaman tersebut sebanyak 3 macam formula. Komposisi masing-masing tanaman dari formula 1 adalah 75% merica hitam dan 25% cabe jawa, formula 2 adalah 50% merica hitam dan 50%

cabe jawa, sedangkan

formula 3 adalah 25% merica hitam dan 75% cabe jawa. Masing – masing formula dibuat sebanyak 100,0 gram, dengan penimbangan masing-masing serbuk simplisia tanaman sesuai dengan komposisinya. Kemudian setelah dicampurkan, kedua serbuk tersebuk diaduk dan diayak untuk memastikan homogenisasi formula campuran tersebut. Preparasi sampel untuk analisis kuantitatif pada penelitian ini, masing – masing formula ditimbang sebanyak 50,0 mg kemudian dimasukkan labu ukur 5 mL. Setelah itu pada labu ukur ditambahkan pelarut n-Heksan p.a sebanyak 3,0 mL. Kemudian diekstraksi dengan menggunakan microwave, setelah pada labu ukur ditambahkan n-Heksan p.a ad 5 mL atau garis tanda. Tahap berikutnya adalah optimasi kondisi pada KLT, pada tahap ini ditujukan untuk mendapatkan fase gerak yang sesuai, konsentrasi larutan sampel, jumlah larutan sampel yang akan ditotolkan, dan penentuan

Skripsi


M.Rezki Dwitya


56 panjang gelombang maksimum dari kedua senyawa marker spesifik tanaman. Pada pemilihan fase gerak, fase gerak yang akan dipilih harus dapat memisahkan senyawa marker spesifik dari tiap tanaman dengan senyawa lainnya dengan pemisahan yang paling baik. Pada tahap ini, fase gerak yang terpilih adalah perbandingan heksan p.a : kloroform p.a (0,5:3,5). Eluen yang terpilih ini memiliki polaritas sekitar 4,25. Dari hasil eluasi dengan fase gerak tersebut, didapatkan nilai resolusi dari senyawa marker spesifik merica hitam adalah 0.84 dan resolusi dari senyawa marker spesifik cabe jawa adalah 3,60. Nilai resolusi dari kedua senyawa marker spesifik memenuhi persyaratan > 0,8. Penentuan senyawa marker spesifik dilakukan dengan memilih satu senyawa yang hanya terdapat pada masing-masing tanaman. Sehingga dengan adanya senyawa tersebut, bisa menandakan keberadaan tanaman tersebut didalam formula campuran. Pada penelitian ini, ditentukan senyawa marker spesifik merica hitam berada pada Rf 0,09, sedangkan senyawa marker spesifik pada cabe jawa berada pada Rf 0,52. Pada pemilihan panjang gelombang UV yang akan digunakan untuk analisis kuantitatif KLT-Densitometri adalah panjang gelombang maksimum dari senyawa marker spesifik masing-masing tanaman. Pada penelitian pendahuluan dilakukan scanning pada panjang gelombang, yaitu 366 nm. Dari hasil scanning dengan panjang gelombang tersebut, peak dari senyawa marker spesifik tiap tanaman akan discan spektra untuk mengetahui profil spektra dari peak tersebut. Dari hasil scanning profil spektra, diketahui panjang gelombang maksimum senyawa marker spesifik tanaman merica hitam dan cabe jawa berada pada 340 nm. Selanjutnya,

Skripsi


M.Rezki Dwitya


57 untuk analisis kuantitatif akan dilakukan scanning senyawa marker spesifik masing-masing tanaman pada panjang gelombang tersebut. Pengembangan

metode

analisis

memerlukan

syarat

yang

menyatakan bahwa metode yang digunakan untuk analisis harus tervalidasi. Validasi metode analisis merupakan persyaratan utama untuk membuktikan kehandalan dan kesesuaian suatu metode untuk digunakan (Renger, 2006). Pada penelitian ini, validasi yang dilakukan meliputi : Uji stabilitas, presisi, batas deteksi dan batas kuantifikasi, peak identity dan peak purity, linearitas dan akurasi. Tahap terpenting dalam membuat prosedur analisis menggunakan KLT adalah mengecek kestabilan senyawa dalam setiap tahap prosedur. Pertama dilakukan uji stabilitas dalam pelarut. Dilakukan 3 sampel untuk menguji stabilitas formula campuran dalam pelarut heksan p.a : recentus paratus, kontak dengan pelarut selama 1 jam dan kontak dengan pelarut selama 8 jam. Dari gambar 5.3 dan 5.4 terlihat bahwa tidak ada perbedaan noda maupun profil kromatogram dari ketiga sampel tersebut. Hal tersebut menunjukkan sampel dapat stabil dalam penyimpanan suhu ruangan (250 C) selama 8 jam. Kemudian selanjutnya dilakukan uji stabilitas pada plat KLT. Pada gambar 5.5 menunjukkan sampel stabil selama 2 jam, hal tersebut ditunjukkan dengan noda yang terbentuk berupa garis longitudinal. Sedangkan pada gambar 5.6 menunjukkan bahwa terdapat noda diluar garis longitudinal (degradan). Dari kedua gambar tersebut dapat disimpulkan bahwa ekstrak formula campuran stabil dalam plat KLT selama 2 jam. Presisi yang dilakukan adalah presisi intermediate. Presisi ini dilakukan pada 3 hari yang berbeda, oleh analis yang sama, dan dengan

Skripsi


M.Rezki Dwitya


58 peralatan yang sama. Pada tahap ini diperlukan nilai rasio area dari masingmasing peak senyawa marker spesifik, kemudian rasio area tersebut akan dibandingkan antar replikasinya pada intraday dan interday. Rasio area diperoleh dengan cara membagi area dari senyawa marker spesifik dengan area peak lain yang stabil. Pada intraday 1, senyawa marker spesifik merica hitam memiliki %KV sebesar 3,96% pada formula 1, 1,92% pada formula 2, dan 2,27% pada formula 3. Sedangkan senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki %KV sebesar 2,27% pada formula 1, 1,89% pada formula 2, dan 3,91% pada formula 3. Pada intraday 2, senyawa marker spesifik merica hitam memiliki %KV sebesar 1,70% pada formula 1, 1,53% pada formula 2, dan 1,43% pada formula 3. Sedangkan senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki %KV sebesar 1,68% pada formula 1, 1,53% pada formula 2, dan 1,44% pada formula 3. Pada intraday 3, senyawa marker spesifik merica hitam memiliki %KV sebesar 1,32% pada formula 1, 1,12% pada formula 2, dan 1,52% pada formula 3. Sedangkan senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki %KV sebesar 1,31% pada formula 1, 1,12% pada formula 2, dan 1,51% pada formula 3. Sedangkan untuk interday, senyawa marker spesifik merica hitam memiliki %KV sebesar 3,13% pada formula 1, 2,47% pada formula 2, dan 2,61% pada formula 3. Sedangkan senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki %KV sebesar 2,62% pada formula 1, 2,49% pada formula 2, dan 3,22% pada formula 3. Berdasarkan seluruh data %KV yang didapatkan,

Skripsi


M.Rezki Dwitya


59 dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan pada penelitian ini mampu memberikan hasil yang valid. Tahap berikutnya adalah melakukan scanning peak pada masingmasing peak senyawa marker spesifik tiap tanaman. Scanning dilakukan pada panjang gelombang 200-500 nm. Tujuan dari tahap ini adalah untuk mendapatkan nilai kemurnian dari peak dan untuk mengetahui apakah peak senyawa marker spesifik pada tanaman tunggal jika dibandingkan dengan peak senyawa senyawa marker spesifik pada formula campuran memiliki profil spektra yang identik. Pada tabel V.4, menunjukkan bahwa peak purity dari peak senyawa marker spesifik cabe jawa memiliki nilai correlation limit ≥ 0,9900 dan panjang gelombang maksimum senyawa tersebut berada disekitar 340 nm. Pada gambar 5.7 dilakukan overlay profil spektra antara peak senyawa marker spesisik cabe jawa pada formula dengan senyawa marker spesifik cabe jawa pada serbuk simplisianya. Nilai correlation limit dari overlay kedua profil spektra tersebut adalah ≥ 0,9900. Sedangkan pada tabel V.5 menunjukkan bahwa peak purity dari peak senyawa marker spesifik merica hitam memiliki nilai correlation limit ≥ 0,9900 dan panjang gelombang maksimum senyawa tersebut berada disekitar 340 nm. Terlihat pada gambar 5.8 dilakukan overlay profil spektra antara peak senyawa marker spesisik merica hitam pada formula dengan senyawa marker spesifik merica hitam pada serbuk simplisianya. Nilai correlation limit dari overlay kedua profil spektra tersebut adalah ≥ 0,9900.

Selanjutnya penentuan batas deteksi dan batas kuantifikasi dari senyawa marker spesisik tiap tanaman. Pada penentuan batas deteksi dan

Skripsi


M.Rezki Dwitya


60 batas kuantifikasi untuk senyawa marker spesifik merica hitam dilakukan penotolan dari konsentrasi 9,28 mg sampai konsentrasi dimana senyawa marker spesifik tersebut tidak tampak. Setelah itu akan dilakukan perhitungan regresi linear antara konsentrasi sampel yang tertotol dengan area senyawa marker yang didapatkan. Konsentrasi yang digunakan untuk perhitungan regresi linear adalah 9,28 mg; 6,96 mg; 4,64 mg; 2,32 mg dan 0,93 mg. Untuk senyawa marker spesifik cabe jawa, dilakukan penotolan dari konsentrasi 11,48 mg sampai konsentrasi dimana senyawa marker spesifik tersebut tidak tampak. Setelah itu akan dilakukan perhitungan regresi linear antara konsentrasi sampel yang tertotol dengan area senyawa marker yang didapatkan. Konsentrasi yang digunakan untuk perhitungan regresi linear adalah 11,48 mg; 9,18 mg; 6,89 mg; 4,59 mg dan 2,30 mg. Tahap berikutnya adalah uji linearitas. Rentang berat sampel pada senyawa marker spesifik merica hitam yang digunakan sebagai kurva kalibrasi adalah 11,59 mg; 23,19 mg; 57,97 mg dan 69,57 mg. Dari perhitungan regresi linear 4 level konsentrasi tersebut, didapatkan persamaan regresi Y = 3167,2 + 90,164 * X , nilai r = 0.99869 , sdv = 1,73 dan Vx0 = 4,27%. Sedangkan rentang berat sampel pada senyawa marker spesifik cabe jawa yang digunakan adalah 11,48 mg; 22,95 mg; 45,91 mg dan 57,38 mg. Dari perhitungan regresi linear 4 level konsentrasi tersebut, didapatkan persamaan regresi Y = 155,32 + 37,088 * X, nilai r = 0,99921 , sdv = 1,02 dan Vx0 = 2,97 %. Kemudian dilakukan homogenity test untuk konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi yang digunakan sebagai kurva kalibrasi, dari hasil

Skripsi


M.Rezki Dwitya


61 yang didapat dari software VMA Solution dapat diketahui bahwa memenuhi persyaratan karena nilai testing value (TV) ≤ F. Selanjutnya pada tabel V.12 dan V.13 menunjukkan hasil perbandingan berat sebenarnya dari masing-masing tanaman yang terdapat ditiap formula dengan berat yang diperoleh dari metode yang digunakan. Berat yang diperoleh didapatkan dengan cara memasukkan area kedalam persamaan regresi dari linearitas masing-masing tanaman tunggal. Kemudian berat yang diperoleh akan dibandingkan dengan berat yang sebenarnya sehingga akan didapatkan % akurasi. Dari hasil perhitungan didapatkan rata – rata % akurasi senyawa marker spesifik pada merica hitam pada formula 1 sebesar 103,87 ± 2,12 %, formula 2 sebesar 110,80 ± 1,62 %, dan formula 3 sebesar 105,09 ± 3,62 %. Sedangkan %Akurasi senyawa marker spesifik cabe jawa pada formula 1 sebesar 102,92 ± 3,49 %, formula 2 sebesar 106,5 ± 2,60 %, dan formula 3 sebesar 105,48 ± 2,64 %. Dari hasil validasi metode yang sudah didapatkan, hasil yang didapat keseluruhan memenuhi syarat. Sehingga bisa disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan valid. Hasil dari penelitian ini hanya berlaku untuk bahan tanaman yang berada di ballitro dengan spesifikasi tanaman yang telah disebutkan pada poin sebelumnya.

Skripsi


M.Rezki Dwitya


BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan Berdasarkan

penelitian

yang

telah

dilakukan,

diperoleh

kesimpulan yaitu : Dengan menggunakan KLT-Densitometri, dapat diperoleh metode analisis yang valid untuk menentukan senyawa marker spesifik Piper retrofractum Vahl. dan Piper nigrum L. dengan nilai %KV pada tanaman merica hitam adalah 1,12 – 3,96%, untuk cabe jawa adalah 1,12 – 3,91%. Nilai r dari senyawa marker spesifik merica hitam adalah 0,99869 dan untuk senyawa marker speisifk cabe jawa adalah 0,99921. Kemudian %akurasi yang didapatkan untuk tanaman merica hitam adalah 103,87 – 110,80% sedangkan untuk tanaman cabe jawa adalah 102,92 – 106,50%.

7.2 Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, terdapat saran sebagai berikut: Dilakukan isolasi dan elusidasi struktur senyawa marker spesifik masing – masing tanaman sehingga akan diketahui nama dan rumus molekul yang sebenarnya dari senyawa tersebut.

62

Skripsi


M.Rezki Dwitya


DAFTAR PUSTAKA Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1985. Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995. Farmakope Indonesia, Edisi IV, Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Dhingra, Neelima., Gaba, Mokia., 2010. Microwave Chemistry: General Features and Applications. Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research. Association of Pharmaceutical Teachers of India. Fried, B. and Sherma, J., 1999. Thin layer Chromatography Fourth Edition, Revised and Expanded. New York: Marcel Dekker, Inc. Gabriela, 2010. Plant Extracts: TLC Analysis, in : Caze, J. Encylopedia of Chromatography, Ed. 3rd, New York: Taylor and Francis grup, pp. 1821-1823. Gritsanapan, Wandee., Tangyuenyongwatana, Prasan., 2009. An appropriate solvent for the preparation of Prasaplai extract. Songklanakarin Journal of Science and Technology. Harmita, 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I No. 3, hal. 121-123. Huber, L., 2007. Validation of Analytical Methods and Procedures. Diakses dari http://www.labcompliance.com/tutorial/methods/default.aspx, pada tanggal 27 Januari 2014. Indrayanto, G. dan Yuwono, M., 2005. Validation of Chromatographic Methods of Analysis. Profiles of Drug Subtances, Excipients And Related Methodology, Volume 32. Ip, S.P., et al., 2010. Quality Assurance for Chinese Herbal Formulae: Standardization of IBS-20, a 20-herb preparation. License BioMed Central Ltd.

63

Skripsi


M.Rezki Dwitya


64 Isnawati A, Endreswari S, Pudjiastuti, Murhandini. Efek mutagen ekstrak etanol buah cabe jawa (Piper retrofractum Vahl.). Jurnal Bahan Alam Indonesia 2002;1(2):63-67. Kim, H.J., Jee, E.H., Ahn, K.S., Choi, H.S., Jang, Y.P., 2010. Identification of Marker Compounds in Herbal Drugs on TLC with DART-MS. Arch Pharm Res Vol. 33, No. 9, p. 1355-1359. Li, Songlin., Han, Quanbin., Qiao, Chunfeng., Song, Jingzheng., Cheng, Chuen, Lung., Xu, Hongxi., 2008. Chemichal Marker for The Quality Control of Herbal Medicines: An Overview. China: License BioMed Central Ltd. Liang, Yi-Zeng., Xie., and Chan, K., 2004. Quality Control of Herbal Medicines. Journal of Chromatography B, 812 (2004) 53-70 Lazarowich., Natalie J., and Pekos, P., 1998. Use of Fingerprinting and Marker Compounds for Identification and Standardization of Botanical Drugs: Strategies for Applying Pharmaceutical HPLC Analysis to Herbal Products. Drug Information Journal, Vol. 32, pp. 497-512, 1998. USA. Manohara, D., Wahyuno, D., Noveriza, R., 2005. Penyakit Busuk Pangkal Batang Lada dan Strategi Pengendaliannya. Perkembangan Teknologi Tanaman Rempah dan Obat. 17:41-51. Mukherjee, K.P., Rai, Sujay., Bhattacharya, Sauvik., Wahile, Atul., Saha, Bishnu, Pada., 2008. Marker Analysis of Polyherbal Formulation, Triphala – A Well known Indian Traditional Medicine. Indian Journal of Traditional Knowledge, Vol. 7(3), p.379-383. Mulja, M dan Suharman., 1995. Analisis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press. Natural Health Products Directorate., 2012. Draft: Quality of Natural Health Products Guide. Nuraini, A., 2003. Mengenal etnobotani beberapa tanaman yang berkhasiat sebagai aprodisiaka. InfoPOM, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, IV(10):1-4. Parmar, V.S., Jain, S.C., Bisht, K.S., 1997. Phytochemistry of the Genus Piper. Phytochemistry, Vol. 46 Issue 4. p. 597-673 Patel, N.A., Patel, Megha., Patel, R.P., 2011. Formulation and Evaluation of Polyherbal Gel for Wound Healing. International Research Journal of Pharmaceuticals, Vol. 01, Issue 01. Rashmin, Patel., Mrunali, Patel., Nitin, Dubey., Nidhi, Dubey., Bharat, Patel., 2012. HPTLC Method Development and Validation:

Skripsi


M.Rezki Dwitya


65 Strategy to Minimize Methodological Failures. Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 20, No. 4, p.794-804. Riech, E., Schibli, A., Debatt, A., 2008. Validation of High-Performance Thin-Layer Chromatographic Methods for the Identification of Botanicals in a cGMP Environment. J AOAC Int. Vol. 91(1). p.13-20. Sekhon, Bhupinder, Singh., Choudhary, Neeraj., 2011. An Overview of Advances in The Standardization of Herbal Drugs. J Pharm Educ Res Vol. 2, Issue No. 2. Spagenberg, B., Poole, C.F., Weins, C., 2011. Quantitative Thin-Layer Chromatography: A Practical Survey. New York: Springer. Touchestone, J.C., and Dobbins, M.F., 1983. Practice of Thin Layer Chromatography. 2nd Ed., New York: John Wiley and Sons. United States Department Of Agriculture, 2014. Classification for Kingdom Plantae Down to Species Piper nigrum L. Diakses dari http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=PINI3, pada tanggal 12 Januari 2014. United States Department Of Agriculture, 2014. Classification for Kingdom Plantae Down to Species Piper retrofractum Vahl. Diakses dari http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile &symbol=PIRE9&display=31, pada tanggal 12 Januari 2014. United States Pharmacopoeial Convention Inc., 2006. United States Pharmacopoeia 29th ed. Washington D.C: American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. Wahid, P., 1996. Sejarah Perkembangan dan Daerah Perkembangannya. Monograf Tanaman Lada. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Wahyuno, D. 2009. Pengendalian Terpadu Busuk Pangkal Batang Lada. Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik. Perspektif Vol.8 No.1/Juni 2009. Hal. 17-29. Wall, E.P., 2005. Thin-layer Chromatography A Modern Practical Approach. UK: The Royal Society of Chemistry. Yongyu, Zhang., Shujun, Sun., Jianye, Dai., Wenyu, Wang., Huijuan, Cao., Jianbing, Wu., Xiaojun, Gou., 2011. Quality Control Method for Herbal Medicine – Chemical Fingerprint Analysis. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. China: InTech.

Skripsi


M.Rezki Dwitya

ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga SKRIPSI

Recommend Documents