ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga SKRIPSI

ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga

SKRIPSI UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK BIJI SIRSAK (ANNONA MURICATA LINN.) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO

LULUS MEGAWATI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA 2014

Skripsi

Uji aktivitas antikanker....

Lulus Megawati


SKRIPSI UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK BIJI SIRSAK (ANNONA MURICATA LINN.) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO

Oleh : LULUS MEGAWATI 051011256

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA ii Skripsi


Lulus Megawati


LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

Demi

perkembangan

ilmu

pengetahuan,

saya

menyetujui

skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul: UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK BIJI SIRSAK (ANNONA MURICATA LINN.) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Airlangga untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi skripsi/karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Surabaya, Agustus 2014

\

Lulus Megawati NIM: 051011256

iii

Skripsi


Lulus Megawati


LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini, Nama

: Lulus Megawati

NIM

: 051011256

Fakultas

: Farmasi

Menyatakan dengan sesungguhnya bahwa hasil tugas akhir yang saya tulis dengan judul: UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK DAUN SIRSAK (ANNONA MURICATA LINN.) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO Adalah benar merupakan hasil karya sendiri. Apabila di kemudian hari diketahui bahwa skripsi ini merupakan hasil plagiarisme, maka saya bersedia menerima sanksi berupa pembatalan kelulusan dan atau pencabutan gelar yang saya peroleh. Demikian surat pernyataan ini saya buat untuk dipergunakan sebagaimana mestinya. Surabaya, Agustus 2014

Lulus Megawati NIM: 051011256

iv

Skripsi


Lulus Megawati


Lembar Pengesahan UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK BIJI SIRSAK (ANNONA MURICATA LINN.) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO

SKRIPSI Dibuat Untuk Memenuhi Syarat Mencapai Gelar Sarjana Farmasi Pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga 2014 Oleh : LULUS MEGAWATI NIM : 051011256

Skripsi ini telah disetujui oleh : Pembimbing Utama

Pembimbing Serta

Drs. Herra Studiawan, Apt., MS

Lusiana Arifianti, S. Farm, M. Farm

NIP. 19570310 198601 1 001

NIP. 19810116 200604 2 002 v

Skripsi


Lulus Megawati


KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb Bismillahirahmanirrahim. Segala puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahmat dan karuniaNya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan sebaik-baiknya. Dengan selesainya skripsi yang berjudul “ UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK BIJI SIRSAK (ANNONA MURICATA LINN) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO “ ini, perkenankan saya mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1.

Rektor Universitas Airlangga Prof. Dr. H. Fasich, Apt, yang telah memberikan fasilitas selama mengikuti kuliah dan melakukan penelitian ini.

2.

Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Dr. Umi Athijah, Apt., MS., yang telah memberikan fasilitas selama mengikuti kuliah dan melakukan penelitian ini.

3.

Kepala Departemen Fitokimia dan Farmakognosi Prof. Dr. Sukardiman, Apt., MS., yang telah mengijinkan penggunaan fasilitas laboratorium selama melakukan penelitian ini.

4.

Drs. Herra Studiawan, Apt., MS., dan Lusiana Arifianti S. Farm., M. Farm., selaku dosen pembimbing skripsi yang senantiasa dengan tulus ikhlas dan penuh kesabaran untuk membimbing serta memberi dorongan baik moril maupun materiil kepada sya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan.

vi Skripsi


Lulus Megawati


5.

Prof. Dr. Sukardiman, Apt., MS., dan Dra. Rakhmawati, M. Si, selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang berguna bagi perbaikan skripsi ini.

6.

Papa, mama, Mas Maja, Mbak Indah dan Mas Aji yang telah memberikan doa, motivasi, semangat serta dukungan yang tak henti-hentinya diberikan selama ini sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik.

7.

Kamilia, Hani, Safira, Anis, Qowi, Ayek, dan Alfin yang selalu

memberikan

motivasi

dan

semangat

untuk

menyelesaikan skripsi ini. 8.

Teman-teman skripsi Sirsak dan Srikaya (Mili, Chiki, Mas Gede) atas suka duka dan kebersamaan kita selama ini.

9.

Para dosen yang telah mendidik dan mengajarkan ilmu pengetahuan sampai akhirnya saya dapat menyelesaikan pendidikan sarjana ini.

10. Laboran di Departemen Fitokimia dan Farmakognosi yang telah membantu kelancaran penyelesaian skripsi ini. 11. Teman-teman angkatan 2010 kelas D, yang telah bersamasama menyelesaikan pendidikan di farmasi

dan saling

mendukung untuk menyelesaikan skripsi. 12. Dan seluruh pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu-persatu yang telah membantu penyelesaian skripsi ini.

vii Skripsi


Lulus Megawati


Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih banyak kekurangan, untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan pembaca pada umumnya demi kemajuan di bidang farmasi. Wassalamu’alaikum Wr. Wb

Surabaya, Penulis

Agustus

2014

viii Skripsi


Lulus Megawati


RINGKASAN UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK BIJI SIRSAK (Annona muricata Linn.) TERHADAP BEBERAPA SEL KANKER MANUSIA SECARA IN VITRO Lulus Megawati Pengobatan antikanker dapat dilakukan dengan berbagai cara antara lain dengan pembedahan, radiasi dan kemoterapi. Pengobatan kemoterapi memiliki banyak efek samping yang dapat mengurangi kualitas hidup penderita kanker yang kemudian akan mengarah pada komplikasi penyakit. Hal tersebut dikarenakan obat kemoterapi bersifat tidak spesifik terhadap sel. Sirsak (Annona muricata Linn.) merupakan tanaman yang banyak dimanfaatkan untuk pengobatan. Senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman sirsak Annonaceous acetogenins telah lama diteliti dan terbukti bersifat antikanker. Annonaceous acetogenins adalah turunan dari rantai panjang (C35 atau C37) asam lemak yang berasal dari jalur poliketida, yang bersifat selektif terhadap sel-sel kanker dengan menghambat komplek I mitokondria yang terlibat dalam sintetis ATP. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antikanker pada ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap beberapa sel kanker manusia secara in vitro. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan potensi antikanker dari ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap beberapa sel kanker manusia secara in vitro. Penelitian diawali dengan melakukan skrining fitokimia untuk mengetahui kandungan senyawa dalam ekstrak etanol biji sirsak. Didapatkan hasil positif untuk senyawa golongan alkaloid, glikosida saponin, flavonoid dan polifenol. Kemudian dilanjutkan dengan menghitung IC50 dari ekstrak biji sirsak pada sel T47D, HeLa, WiDr, dan Raji dengan ix Skripsi


Lulus Megawati


metode MTT. Ekstrak biji sirsak dibuat tujuh seri konsentrasi dengan tiga kali replikasi. Dari data absorbansi diperoleh persentase sel hidup dengan perhitungan di Microsoft Excel. Dengan data konsentrasi dan persentase sel hidup didapatkan nilai IC50 menggunakan analisis probit dengan program SPSS. Diperoleh IC50 ekstrak biji sirsak pada sel T47D = 20,357 ± 1,584 µg/ml, sel HeLa = 8,906 ± 4,497 µg/ml, sel WiDr = 40,056 ± 3,122 µg/ml, dan sel Raji = 11,242 ± 4,528 µg/ml. Berdasarkan hasil di atas, ekstrak biji sirsak dapat dikatakan memiliki aktifitas sitotoksik karena nilai IC50 kurang dari 1000 µg/mL setelah 24 jam kontak dengan sel kanker. Dari hasil IC50 yang diperoleh ekstrak biji sirsak sebagai antikanker memiliki efektifitas kuat terhadap kultur sel HeLa (kanker serviks). Sehingga sangat prospektif dikembangkan lebih lanjut sebagai sediaan fitofarmaka obat sebagai antikanker serviks. Untuk lebih lanjut dapat dilakukan penelitian dengan uji in vivo.

x Skripsi


Lulus Megawati


ABSTRACT IN VITRO POTENTIAL ANTICANCER ACTIVITY FROM EXTRACT OF ANNONA MURICATA SEEDS AGAINST SOME OF HUMAN CANCER CELLS Lulus Megawati

Cancer is the process of body cells proliferation that are not controlled. Treatment of cancer such as surgery, radiotherapy and chemotherapy have side effects, so natural anticancer is needed. The soursoup (Annona muricata L.) is a traditional medicinal plant which is empirically by the people of Indonesia are used for anti-inflammatory and anti-tumor.The purpose of this study was to determine the cytotoxic effect of extract of soursoup (Annona muricata L.) seeds againsts T47D, HeLa, WiDr, and Raji Cancer cells. Cytotoxic test performed by the method of MTT assay. The parameters obtained from the cytotoxic test was IC50 values. IC50 is a value that produce inhibitory concentrations of cancer cells by 50%. The results showed that the extract of soursoup seeds has a cytotoxic activity with IC 50 values of 20.357 ± 1.584 μg/ml for T47D cell, 40.056 ± 3.122 μg/ml for WiDr cell, 8.906 ± 4.497 μg/ml for HeLa cell, and 11.242 ± 4.528 μg/ml for Raji cell.

Kerwords: Annona muricata L, cytotoxic, MTT method, T47D cell, WiDr cell, HeLa cell, Raji cell, In vitro

xi Skripsi


Lulus Megawati


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................... ii LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ................................... iii LEMBAR PERNYATAAN ......................................................................... iv LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... v KATA PENGANTAR ................................................................................. vi RINGKASAN ............................................................................................. vii ABSTRAK................................................................................................... xi DAFTAR ISI .............................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xvii DAFTAR TABEL ................................................................................... xviii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xix DAFTAR SINGKATAN ............................................................................ xx BAB I PENDAHULUAN ............................................................................. 1 1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 5 1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 5 1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 6 xii Skripsi


Lulus Megawati


BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 7 2.1 Tinjauan Tentang Annona muricata Linn ......................................... 7 2.1.1 Klasifikasi Ilmiah ..................................................................... 7 2.1.2 Sinonim .................................................................................... 7 2.1.3 Nama Daerah ............................................................................ 8 2.1.4 Deskripsi Tanaman ................................................................... 8 2.1.5 Tempat Tumbuh dan Penyebaran ........................................... 10 2.1.6 Kandungan Tanaman .............................................................. 11 2.1.7 Kegunaan Tanaman ................................................................ 11 2.2 Tinjauan Tentang Annonaceous acetogenin ................................... 11 2.3 Tinjauan Tentang Simplisia dan Ekstrak......................................... 14 2.3.1 Definisi Simplisia ................................................................... 14 2.3.2 Definisi Ekstrak ...................................................................... 14 2.3.3 Definisi Ekstraksi ................................................................... 14 2.3.4 Metode Ekstraksi .................................................................... 15 2.3.4.1 Maserasi ......................................................................... 15 2.3.4.2 Perkolasi ........................................................................ 15 2.3.4.3 Destilasi Uap .................................................................. 16 2.3.4.4 Soxhletasi ....................................................................... 16 2.4 Tinjauan Tentang Skrining Fitokimia ............................................. 17 2.5 Tinjauan Tentang Kanker ................................................................ 17 xiii Skripsi


Lulus Megawati


2.5.1 Definisi Kanker ...................................................................... 17 2.5.2 Epidemiologi, Etiologi dan Patofisiologi................................ 18 2.5.2.1 Kanker Payudara ............................................................ 18 2.5.2.2 Kanker Kolon ................................................................. 19 2.5.2.3 Kanker Serviks ............................................................... 19 2.5.2.4 Kanker Nasofaring ......................................................... 20 2.5.3 Macam-Macam Sel Kanker yang Digunakan ......................... 21 2.5.3.1 Sel Kanker Payudara (T47D) ......................................... 21 2.5.3.2 Sel Kanker Kolon (WiDr) .............................................. 21 2.5.3.3 Sel Kanker Serviks (HeLa) ............................................ 22 2.5.3.4 Sel Kanker Nasofaring (RaJi) ........................................ 22 2.6 Tinjauan Tentang Uji Sitotoksisitas Secara In Vitro ...................... 23 BAB III KERANGKA KONSEPTUAL ..................................................... 25 3.1 Alur Kerangka Konseptual Penelitian ............................................. 25 3.2 Uraian Kerangka Konseptual .......................................................... 26 3.3 Hipotesis ......................................................................................... 28 BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................. 29 4.1 Bahan, Alat dan Kultur Sel ............................................................ 29 4.1.1 Bahan Tanaman ...................................................................... 29 4.1.2 Bahan Kimia dan Bahan Lain ................................................. 29 4.1.3 Kultur Sel Kanker ................................................................... 29 xiv Skripsi


Lulus Megawati


4.1.4 Alat ......................................................................................... 30 4.2 Rancangan Penelitian ...................................................................... 30 4.2.1 Pembuatan Simplisia Biji Sirsak ............................................ 30 4.2.2 Pembuatan Ekstrak Biji Sirsak ............................................... 30 4.2.3 Pengujian Skrining Fitokimia ................................................. 31 4.2.3.1 Golongan Alkaloid ......................................................... 31 4.2.3.2 Golongan Glikosida Saponin ......................................... 32 4.2.3.3 Golongan Flavonoid ...................................................... 33 4.2.3.4 Golongan Tanin dan Polifenol ....................................... 35 4.2.3.5 Golongan Antrakuinon................................................... 35 4.2.4 Pengujian Sitotoksisitas Secara In Vitro ................................. 36 4.2.4.1 Pembuatan Media Kultur Lengkap ................................ 36 4.2.4.2 Penumbuhan Sel ............................................................ 37 4.2.4.3 Penggantian Media Sel .................................................. 37 4.2.4.4 Panen Sel ....................................................................... 38 4.2.4.5 Perhitungan Sel .............................................................. 39 4.2.4.6 Preparasi Sampel ............................................................ 40 4.2.4.7 Tahapan Pengujian ......................................................... 40 4.3 Analisis Data ................................................................................... 42 4.4 Kerangka Operasional ..................................................................... 43

xv Skripsi


Lulus Megawati


BAB V HASIL PENELITIAN ................................................................... 44 5.1 Hasil Ekstraksi Biji Sirsak .............................................................. 44 5.2 Hasil Skrining Fitokimia ................................................................. 44 5.2.1 Pemeriksaan Alkaloid ............................................................. 34 5.2.2 Pemeriksaan Glikosida Saponin ............................................. 35 5.2.3 Pemeriksaan Flavonoid........................................................... 37 5.2.4 Pemeriksaan Tanin Polifenol .................................................. 38 5.2.5 Pemeriksaan Antrakinon......................................................... 38 5.3 Hasil Pengujian Potensi Sitotoksisitas Ekstrak Biji Sirsak Secara In Vitro dengan Metode MTT ........................................................... 50 BAB VI PEMBAHASAN .......................................................................... 54 BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN ................................................... 62 7.1 Kesimpulan ..................................................................................... 62 7.2 Saran ............................................................................................... 62 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 63

xvi Skripsi


Lulus Megawati


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Annona muricata Linn .............................................................. 7 Gambar 2.2 Struktur Annonaceous acetogenin........................................... 12 Gambar 3.1 Skema Kerangka Konseptual .................................................. 25 Gambar 4.1 Skema Kerangka Operasional ................................................. 43 Gambar 5.1 Hasil uji KLT senyawa golongan alkaloid pada ekstrak biji sirsak ........................................................................................................... 45 Gambar 5.2 (a) Hasil uji KLT senyawa terpen / steroid bebas dan (b) senyawa sapogenin ekstrak etanol biji sirsak .............................................. 46 Gambar 5.3 Hasil uji KLT senyawa golongan flavonoid pada ekstrak biji sirsak ........................................................................................................... 47 Gambar 5.4 Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel T47D ..................................................................................................... 51 Gambar 5.5 Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel WiDr...................................................................................................... 52 Gambar 5.6 Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel HeLa ...................................................................................................... 52 Gambar 5.7 Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel Raji ........................................................................................................ 53 Gambar 5.8 Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel T47D, HeLa, WiDr, dan Raji ................................................................ 53 xvii Skripsi


Lulus Megawati


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel IV.1 Desain Plate .............................................................................. 42 Tabel V.1 Hasil skrining fitokimia ekstrak biji sirsak dengan reaksi warna dan pengendapan ........................................................................................ 48 Tabel V.2 Nilai IC50 ekstrak biji sirsak pada sel T47D, sel WiDr, sel HeLa, dan sel Raji ................................................................................................. 51

xviii Skripsi


Lulus Megawati


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1 Contoh Perhitungan Persentase Sel Hidup Pada Sel T47D ..... 69 Lampiran 2 Contoh Analisis Probit Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata Linn.) Pada Sel T47D Menggunakan Program SPSS 20.0 ......................... 71 Lampiran 3 Foto Sel Uji Sitotoksisitas ....................................................... 74

xix Skripsi


Lulus Megawati


DAFTAR SINGKATAN

ATP

: Adenosine Triphosphate

DMSO

: Dimethyl Sulfoxide

EBV

: Epstein Barr Virus

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FBS

: Fetal Bovine Serum

HPV

: Human Papiloma Virus

LAF

: Laminar Air Flow

MTT

: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) Difenil Tetrazolium Bromida

PBS

: Phosphat Buffer Saline

RPMI

: Rosewell Park Memorial Institute

SDS

: Sodium Duodecyl Sulphate

THF

: Tetrahydrofuran

THP

: Tetrahydropyran

WHO

: Word Health Organization

xx Skripsi


Lulus Megawati


BAB I PENDAHULUAN 1.1.

Latar Belakang Masalah Kanker merupakan masalah kesehatan dari banyak negara di dunia

dan termasuk penyakit yang menjadi perhatian serius pada bidang kedokteran. Hal ini disebabkan oleh jumlah korban yang terus meningkat dari tahun ke tahun dan belum ditemukan cara yang efektif untuk pengobatannya (Sajuthi, 2001). Data WHO tahun 2010 menunjukkan bahwa kanker merupakan penyebab kematian nomor dua setelah penyakit kardiovaskuler. Sedangkan berdasarkan Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2007, kanker menempati urutan keenam penyebab kematian terbesar di Indonesia dengan kanker payudara 30% dan kanker leher rahim atau kanker serviks 24% mendominasi (Anonim, 2012) Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan mekanisme tidak normal dan tidak terkontrol yang mengatur kelangsungan hidup, proliferasi dan diferensiasi sel. Jika penyebaran dari kanker tidak terkontrol maka dapat menyebabkan kematian (Blecher, 2008). Unsur-unsur penyebab penyakit kanker dapat digolongkan ke dalam tiga kelompok besar, yaitu energi radiasi (sinar ultraviolet, sinar-x dan sinar-ϒ ), senyawa kimia dan virus. Diperkirakan 80% dari penyakit kanker pada manusia disebabkan oleh faktor lingkungan, khususnya zat kimia. Kontak dengan zat kimia dapat terjadi akibat pekerjaan seseorang (misalnya, benzena, asbes); makanan (misalnya, Aflatoksin B1 yang dihasilkan oleh jamur Aspergillus flavus yang kadang-kadang ditemukan sebagai kontaminan dalam kacang tanah serta bahan pangan lainnya); gaya hidup (misalnya, merokok); atau dengan cara lain (misalnya preparat terapeutik tertentu dapat bersifat karsinogenik) (Murray, 2003).

Skripsi

1


Lulus Megawati


2

Pengobatan kanker secara medis memerlukan biaya yang sangat tinggi (Djajanegara, 2008). Dalam beberapa dekade terakhir, praktisi medis setidaknya telah memiliki tiga metode pengobatan kanker, yakni tindakan bedah, radiasi dan kemoterapi. Sebanyak 1/3 penderita kanker diperkirakan dapat disembuhkan melalui modalitas terapi yang bersifat lokal (tindakan bedah dan radiasi), namun bagi 2/3 lainnya terutama yang penyakit kankernya telah mengalami mikrometastasis ke organ tubuh lain, diperlukan modalitas terapi yang bersifat sistemik (kemoterapi) (Halim et al., 2010). Kemoterapi adalah tindakan atau terapi pemberian senyawa kimia (obat kanker) untuk mengurangi, menghilangkan atau menghambat pertumbuhan parasit atau mikroba di tubuh pasien (hospes). Tujuan kemoterapi adalah untuk mengobati atau memperlambat pertumbuhan tumor atau mengurangi gejalanya (Lesnussa, 2010). Akan tetapi penggunaan kemoterapi pada penderita kanker tidak bersifat spesifik sehingga banyak menimbulkan efek samping mulai efek samping ringan (seperti mual, muntah, diare) sampai efek samping berat (myelosupresi, toksisitas ginjal, dll). Semua efek samping yang ditimbulkan ini dapat mengurangi kualitas hidup yang kemudian akan mengarah kepada komplikasi penyakit. Oleh karena itu, fakta-fakta ini menarik perhatian untuk mencari alternatif obat antikanker yang bersifat lebih poten dan selektif serta sedikitnya sifat toksisitas pada jaringan yang sehat. (Ibrahim dan Wahid, 2010; Castroa et al, 2010). Tumbuhan, telah lama kita ketahui merupakan sumber yang sangat penting dalam upaya mempertahankan kesehatan masyarakat. Catatan dari badan

kesehatan

dunia

(WHO),

80%

penduduk

dunia

masih

menggantungkan hidup sehat pada penggunaan obat tradisional yang berasal dari tumbuhan dan 25% dari obat-obat modern yang beredar di

Skripsi


Lulus Megawati


3

dunia berasal dari bahan aktif yang diisolasi dan dikembangkan dari tumbuhan sampai saat ini. Dan adanya gerakan back to nature atau gerakan hidup sehat dengan kembali ke alam sangat mendorong ke arah penggunaan tanaman sebagai bahan obat, kosmetik, pestisida, ataupun kebutuhan keluarga lainnya (Kardinan, 2003). Indonesia merupakan daerah beriklim tropis sehingga banyak tanaman yang tumbuh di negara ini. Kekayaan alam tumbuhan obat Indonesia terdiri atas 30.000 jenis tumbuhan dari total 40.000 jenis tumbuhan di dunia, dimana 940 jenis diantaranya merupakan tumbuhan berkhasiat obat, diantaranya bahkan dapat mengobati kanker, salah satunya adalah sirsak. Sirsak telah diteliti sejak tahun 1940an, semua bagian dari tanaman sirsak ini dapat digunakan untuk pengobatan. Biji dan daun sirsak secara empiris telah banyak digunakan sebagai antikanker (Evira, 2013). Kandungan fitokimia yang telah diteliti dari tanaman ini adalah acetogenins,

alkaloid,

quinolines,

isoquinolines,

tanin,

methanolic,

coumarin, procyanidins, flavonoid, Acetaldehyde, Amyl-caproate (Taylor, 2002). Senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman sirsak Annonaceous acetogenins telah lama diteliti dan terbukti bersifat antikanker, selain itu juga bersifat antiparasit, insektisida, anticacing, antibakteri, dan antivirus (Taylor, 2002). Berdasarkan Nasional Cancer Institute dan atau Nasional Institute of Health (NIH), annonaceous acetogenins dapat secara selektif menghambat pertumbuhan sel kanker dan juga menghambat pertumbuhan sel tumor yang resisten terhadap kemoterapi contohnya adriamycin (Taylor, 2002). Annonaceous acetogenins adalah turunan dari rantai panjang (C35 atau C37) asam lemak yang berasal dari jalur poliketida, yang bersifat selektif terhadap

Skripsi

sel-sel

kanker.

Annonaceous

acetogenins


menginduksi

Lulus Megawati


4

sitotoksisitas dengan menghambat komplek I mitokondria yang terlibat dalam sintetis ATP. Sel-sel kanker memiliki kebutuhan energi (ATP) yang lebih tinggi daripada sel normal, oleh karena itu inhibitor komplek I mitokondria memiliki potensi dalam terapi kanker. (Torres, 2012). Selain itu, berdasarkan beberapa penelitian yang dilakukan oleh Oberlies et al (1997) dan Liaw et al (2002), menyebutkan bahwa acetogenins sangat ampuh menghambat pertumbuhan sel kanker dan membunuh sel-sel kanker yang tahan terhadap obat multi drug resistant secara selektif. Acetogenins mampu menutup pompa antar-sel sehingga dapat membunuh tumor yang tahan terhadap obat. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antikanker pada ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap sel kanker payudara (T47D), kolon (WiDr), serviks (HeLa) dan nasofaring (Raji) secara in vitro. Pemilihan ekstrak etanol dalam penelitian bertujuan bahwa pelarut etanol diharapkan dapat menarik zat-zat berkhasiat yang terdapat dalam simplisia. Dalam penelitian sebelumnya, diketahui kandungan dalam ekstrak etanol daun sirsak terdiri dari kandungan bioaktif acetogenin, flavonoid, saponin, dan tannin (Alfrits et al, 2012). Acetogenin utama yaitu, asimicin, bullatacin, trilobacin, dan bullatalicin (McLaughlin et al, 1996). Berdasarkan data penelitian diharapkan akan diperoleh informasi mengenai aktivitas antikanker biji sirsak yang efektif dengan efek samping yang minimal, serta outcome yang positif untuk dikembangkan menjadi obat antikanker yang potensial dan selektif.

Skripsi


Lulus Megawati


1.2.

5

Rumusan Masalah Penelitian ini menentukan potensi ekstrak etanol biji sirsak terhadap

beberapa sel kanker manusia secara in vitro dengan beberapa rumusan permasalahan, antara lain : 1. Apakah ekstrak etanol biji sirsak memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara (T47D) ? 2. Apakah ekstrak etanol biji sirsak memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker kolon (WiDr) ? 3. Apakah ekstrak etanol biji sirsak memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker serviks (HeLa) ? 4. Apakah ekstrak etanol biji sirsak memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker nasofaring (Raji) ? 1.3.

Tujuan Penelitian Menentukan potensi antikanker dari ekstrak etanol biji sirsak

(Annona muricata Linn.) terhadap beberapa sel kanker manusia secara in vitro. 1.3.1. Tujuan Khusus 1. Menentukan IC50 dari ekstrak etanol biji sirsak terhadap sel kanker payudara (T47D). 2. Menentukan IC50 dari ekstrak etanol biji sirsak terhadap sel kanker kolon (WiDr). 3. Menentukan IC50 dari ekstrak etanol biji sirsak terhadap sel kanker serviks (HeLa). 4. Menentukan IC50 dari ekstrak etanol biji sirsak terhadap sel kanker nasofaring (Raji).

Skripsi


Lulus Megawati


1.4.

6

Manfaat penelitian Mendukung penelitian dan pengembangan obat Indonesia melalui

informasi ilmiah tentang aktivitas antikanker dari ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap sel kanker payudara (T47D), kolon (WiDr), serviks (HeLa), nasofaring (Raji) secara in vitro. Hasil penelitian diharapkan dapat bermanfaat untuk pengembangan lebih lanjut menjadi produk fitofarmaka.

Skripsi


Lulus Megawati


BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1.

Tinjauan tentang Annona muricata Linn.

2.1.1. Klasifikasi ilmiah

Gambar 2.1. Annona muricata Linn. (Haryoto, 1998) Kingdom

: Plantae

Divisi

: Spermatophyta

Subdivisi

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyldonae

Ordo

: Ranunculales

Famili

: Annonaceae

Genus

: Annona

Spesies

: Annona muricata Linn. (Haryoto, 1998)

2.1.2. Sinonim Annona bonplandiana H.B.K., Annona caeraensis Barb.Rodr., Annona macrocarpa auct., Annona macrocarpa Werckle, Annona muricata var.borinquensis Morales, Annona sericea Dunal, Guanabanus muricatus Gomez de la Maza (Wikipedia, 2011). 7 Skripsi


Lulus Megawati


8 2.1.3. Nama Daerah Sumatera : Deureuyan belanda (Aceh); tarutung olanda (Batak); durio ulondra (Nias); durian belanda, nangka belanda, nangka walanda (Melayu); durian batawi, duian batawi (Minangkabau); jambu landa (Lampung). Jawa: Nangkawalanda (Sunda); angka londa, nangkamanila, nangka sabrang, mulwa londa, surikaya welonda, srikaya welandi (Jawa); nangka buris, nangka englan, nangka moris (Madura). Bali : Srikaya jawa. Nusatenggara : Naka, nakat, annona (Flores). Sulawesi : Atis, mangka walanda (Sulawesi Utara); lange lo walanda (Gorontalo); sirikaya balanda (Makasar); sirikaya balanda (Bugis). Maluku : Anad walanda, tafena warata (Seram) ; anal wakano (Nusa laut); naka loanda (Buru); durian, naka wolada (Halmahera); naka walanda (Ternate); naka lada (Tidore). (Depkes RI, 2010) 2.1.4. Deskripsi Tanaman Pohon

: Pohon sirsak memiliki model Troll, ketinggian mencapai 8-10 meter, dan

diameter batang

10-30 cm (Radi, 1998). Tanaman sirsak (Annona muricata Linn.) termasuk tanaman tahunan. Daun

: Daun sirsak berwarna hijau muda sampai hijau tua memiliki panjang 6 -18 cm, lebar 3-7 cm, bertekstur

kasar,

berbentuk

bulat

telur,

ujungnya lancip pendek, daun bagian atas mengkilap hijau dan gundul pucat kusam di bagian bawah daun, berbentuk lateral saraf. Daun sirsak memiliki bau tajam menyengat dengan tangkai daun pendek sekitar 3-10 mm.

Skripsi


Lulus Megawati


9 (Radi, 1998). Daun yang berkualitas adalah daun sirsak dengan kandungan antioksidan yang tinggi terdapat pada daun yang tumbuh pada urutan ke-3 sampai urutan ke-5 dari pangkal batang daun dan dipetik pukul 5-6 pagi (Zuhud, 2011). Bunga

: Bunga pada tanaman sirsak berbentuk tunggal (flos simplex) yaitu satu bunga terdapat banyak putik sehingga dinamakan bunga berpistil majemuk.

Bagian

bunga

tersusun

secara

hemicylis,

yaitu

sebagian

terdapat

dalam

lingkaran yang lain spiral atau terpencar. Mahkota bunga berjumlah 6 sepalum yang terdiri atas 2 lingkaran, bentuknya hampir segi tiga, tebal dan kaku, berwarna kuning keputihputihan, dan setelah tua mekar, kemudian lepas dari dasar bunganya. Putik dan benang sari lebar dengan banyak karpel (bakal buah). Bunga keluar dari ketiak daun, cabang, ranting, atau pohon. bunga umumnya sempurna, tetapi terkadang hanya bunga jantan dan bunga betina saja dalam satu pohon. Bunga melakukan5 penyerbukan silang, karena umumnya tepung sari matang lebih dahulu sebelum putiknya (Radi, 1998). Buah

: Buah sirsak memiliki bentuk sejati berganda (agregat fruit) yaitu buah yang berasal dari satu

Skripsi


Lulus Megawati


10 bunga dengan banyak bakal buah tetapi membentuk satu buah. Buah memiliki duri sisik halus. Apabila sudah tua daging buah berwarna putih, lembek, dan berserat dengan banyak biji berwarna coklat kehitaman (Radi, 1998). Biji

: Biji buah sirsak berwarna coklat agak kehitaman

dan

keras,

berujung

tumpul,

permukaan halus mengkilat dengan ukuran panjang kira-kira 16,8 mm dan lebar 9,6 mm. jumlah biji dalam satu buah bervariasi, berkisar antara 20-70 butir biji normal, sedangkan yang tidak normal berwarna putih kecoklatan dan tidak berisi (Radi, 1998). 2.1.5. Tempat Tumbuh dan Penyebaran Tanaman sirsak dapat tumbuh di sembarang tempat, paling baik ditanam di daerah yang cukup berair. Di Indonesia sirsak dapat tumbuh dengan baik pada ketinggian 1000 m dari permukaan laut. Tanaman sirsak berasal dari amerika selatan, yaitu meksiko. Tanaman tersebut masuk Indonesia diduga dibawa oleh orang Belanda semasa zaman penjajahan. Bila dugaan ini benar, wajar nama sirsak lebih dikenal dengan istilah nangka belanda. Nama sirsak sendiri berasal dari bahasa Belanda Zuurzak, kurang lebih yang berarti kantung yang asam. Di Indonesia, penyebaran tanaman sirsak dapat dijumpai di daerah Jawa Barat, terutama Rajamendala dan Bandung Selatan, serta di Jawa Tengah, terutama Karang Anyar (Hendro. S, 2005).

Skripsi


Lulus Megawati


11 2.1.6. Kandungan Tanaman Tanaman sirsak mengandung saponin, flavonoid, tanin, kalsium, fosfor vitamin (A, B, C), Fitosterol, ca-oksalat, dan alkaloid murisine (Mangan, 2009). Daun, batang, kulit batang dan biji sirsak mengandung senyawasenyawa asetogenin, antara lain anokatalin, anoheksoin, anomonisin, dan anomontasin yang memiliki kerja antitumor dan toksisitas selektif sel-sel kanker (Latief, 2012). 2.1.7. Kegunaan Tanaman Kegunaan daun sirsak diketahui dapat menyembuhkan penyakit kanker, caranya dengan merebus 10 lembar daun sirsak yang berwarna hijau tua kedalam 3 gelas air dan direbus hingga airnya tinggal 1 gelas saja. Air rebusan diminumkan kepada penderitanya 2 kali sehari. Setelah diminum, badan pasien terasa panas, mirip dengan efek kemoterapi, bahkan lebih hebat lagi karena rebusan daun sirsak hanya membunuh sel-sel yang tumbuh abnormal dan membiarkan sel-sel yang tumbuh normal. Sedangkan kemoterapi masih ada efek membunuh juga sebagian sel-sel yang normal. Selain itu, tanaman sirsak juga dimanfaatkan untuk pengobatan demam, diare, anti kejang, anti jamur, anti parasit, anti mikroba, sakit pinggang, asam urat, gatal-gatal, bisul, flu, dan lain-lain (Mardiana, 2011). 2.2.

Tijauan Tentang Annonaceous acetogenin Annonaceous

acetogenin

hanya

ditemukan

pada

keluarga

Annonaceae. Annonaceous acetogenins telah diketahui memiliki khasiat antitumor,

antiparasit,

pestisidal,

antiprotozoal,

antihelmintic,

dan

antimicrobial. Annonaceous acetogenin merupakan suatu kelompok

Skripsi


Lulus Megawati


12 fitokimia yang mengandung poliketida. Kebanyakan acetogenin adalah derivat rantai panjang asam lemak (C32 atau C34) dan asam terminal carboxylic yang dikombinasi dengan 2 unit propanolol pada posisi C2 untuk membentuk methylsubstituted α,β-unsaturated-γ-25 lactone (Kojima, 2009). Salah satu struktur yang menarik adalah tetrahydrofuran (THF) atau tetrahydropyran (THP).

Gambar 2.2. Struktur Annonaceous acetogenin Dikutip dari : American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy Annonaceous acetogenin terdiri dari, annocatalin, annohexocin, annomonicin, annomontacin, annomuricatin A & B, annomuricin A thru E, annomutacin, annonacin, (multiple iso, cis, one, etc.), annonacinone, annopentocin A thru C, cis-annonacin, cis-corossolone, cohibin A thru D, corepoxylone, coronin, corossolin, corossolone, donhexocin, epomuricenin A

& B,

gigantetrocin,

gigantetrocin

A

& B,

gigantetrocinone,

gigantetronenin, goniothalamicin, isoannonacin, javoricin, montanacin, montecristin,

muracin

A

thru

G,

muricapentocin,

muricatalicin,

muricatalin, muri-catenol, muricatetrocin A & B muricatin D, muricatocin A thru C muricin H, muricin I, muricoreacin, murihexocin 3, murihexocin A thru C, murihexol, murisolin, robustocin, rolliniastatin 1 & 2, saba-delin, solamin, uvariamicin I & IV, xylomaticin (Mclaughin et al, 1999)

Skripsi


Lulus Megawati


13 Efek sitotoksik dan anti kanker dari acetogenins memiliki beberapa mekanisme yaitu, 1). Menghambat oksidase dari NADH di membran plasma pada sel kanker. Enzim ini hanya di ekspresi pada sel normal yang sehat. Dengan menghambat enzim ini ATP selular akan menurun. 2). Menghambat komplek I (NADH : ubiquimone oxidoreduktase) dalam sistem transport elektron di mitokondria, menghambat fosforilasi oksidasi dan menghasilkan kadar ATP yang rendah, sehingga menghambat pertumbuhan sel kanker. 3). Menghambat sel kanker yang multidrug resistant. Meningkatkan ekspresi dari pompa plasma membran, Pglycoprotein, adalah kontributor terhadap multidrug resistant. Pompa meningkatkan eliminasi dari kandungan anti kanker sebelum kandungan tersebut dapat berefek terhadap sel kanker. Dua tempat ATP berikatan pada intraselular

ditemukan

pada

P-glycoprotein,

dan

aktivitas

pompa

membutuhkan ATP. Acetogenin, lewat penurunan ATP, dapat menurunkan aktivitas atau mematikan pompa P-glycoprotein. 4).sel kanker pada fase S dari siklus selnya lebih rentan terhadap acetogenin annonacin. Annonacin mampu mengistirahatkan siklus sel pada fase G1 dan menghambat progresi fase S. Sebagai tambahan p53 dan p21 ditingkatkan oleh annonacin (Raintree Nutrition, 2004). Pada studi in vitro telah diketahui bahwa acetogenin yang di isolasi dari daun sirsak berguna melawan berbagai sel, yaitu human hepatoma hep G, prostate adenocarcinoma PC-3, pancreatic carcinoma PACA-2, murine leukemia L1210 dan P388 leukemia, human breast adenocarcinoma MDA-MB231 dan carcinoma MCF-7, human lung carcinoma A-549, dan human colon cancer HT-29.

Skripsi


Lulus Megawati


14 2.3.

Tinjauan Tentang Simplisia dan Ekstrak

2.3.1. Definisi Simplisia Simplisia adalah bahan alamiah yang digunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia nabati adalah simplisia berupa tumbuhan utuh, bagian tanaman atau eksudat tumbuhan (Depkes RI, 2000). 2.3.2. Definisi Ekstrak Esktrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Ekstrak cair adalah sediaan dari simplisia nabati yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet. Jika tidak dinyatakan lain pada masing-masing monografi, tiap ml ekstrak mengandung senyawa aktif dari 1 g simplisia yang memenuhi syarat (Depkes RI, 2000). 2.3.3. Definisi Ekstraksi Ekstraksi merupakan proses pemisahan dua zat atau lebih dengan menggunakan pelarut yang tidak saling campur. Berdasarkan fase yang terlibat, terdapat dua jenis ekstraksi, yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi padat-cair. Pemindahan komponen dari padatan ke pelarut pada ekstraksi padat-cair melalui tiga tahapan, yaitu difusi pelarut ke pori-pori padatan atau ke dinding sel, di dalam dinding sel terjadi pelarutan padatan oleh pelarut, dan tahapan terakhir adalah pemindahan larutan dari pori-pori

Skripsi


Lulus Megawati


15 menjadi larutan ekstrak. Ekstraksi padat-cair dipengaruhi oleh waktu ekstraksi, suhu yang digunakan, pengadukan, dan banyaknya pelarut yang digunakan (Harborne, 1987). 2.3.4. Metode Ekstraksi 2.3.4.1. Maserasi Maserasi

adalah

proses

pengekstrakan

simplisia

dengan

menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. (Depkes RI, 2000) Menurut Harborne (1987), metode maserasi digunakan untuk mengekstrak

jaringan

tanaman

yang

belum

diketahui

kandungan

senyawanya yang kemungkinan bersifat tidak tahan panas sehingga kerusakan komponen tersebut dapat dihindari. Kekurangan dari metode ini adalah waktu yang relatif lama dan membutuhkan banyak pelarut. Ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan prinsip kelarutan. Prinsip kelarutan adalah like dissolve like, yaitu (1) pelarut polar akan melarutkan senyawa polar, demikian juga sebaliknya pelarut nonpolar akan melarutkan senyawa nonpolar, (2) pelarut organik akan melarutkan senyawa organik. 2.3.4.2. Perkolasi Perkolasi dilakukan dengan cara dibasahkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok, menggunakan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari dimasukkan dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya 3 jam. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, ditambahkan cairan penyari. Perkolator ditutup dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dengan kecepatan 1 ml permenit, sehingga simplisia

Skripsi


Lulus Megawati


16 tetap terendam. Filtrat dipindahkan ke dalam bejana, ditutup dan dibiarkan selama 2 hari pada tempat terlindung dari cahaya. 2.3.4.3. Destilasi Uap Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dan ketel secara kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi destilat air bersama senyawa kandungan yang memisah sempurna atau memisah sebagian. (Depkes RI, 2000) 2.3.4.4. Soxhletasi Soxhletasi

adalah

salah

satu

model

ekstraksi

(pemisahan/pengambilan) yang menggunakan pelarut selalu baru dalam mengekstraknya sehingga terjadi ektraksi yang kontinyu dengan adanya jumlah pelarut konstan yang juga dibantu dengan pendingin balik (kondensor). Kondensor dialiri air dari bawah ke atas untuk menjaga kondensor tetap dingin. Tepat di bawah konedensor, serbuk bahan tanaman ditempatkan dalam keranjang soxhlet. Pelarut yang ada di labu di bawah keranjang soxhlet kemudian dipanaskan sampai menguap. Uap dari pelarut segera dikondensasikan kembali menjadi cairan, segera setelah masuk ke pipa kondenser. Kondensat pelarut jatuh ke atas keranjang soxhlet menjenuhkan serbuk bahan alam yang diekstraksi. Pelarut mengalir ke dalam keranjang soxhlet dan keluar melalui lubang di bawahnya menuju ke dalam labu. Pelarut sarat ekstrak yang jatuh dari keranjang soxhlet berwarna

Skripsi


Lulus Megawati


17 gelap, dan akan menjadi semakin jernih dimana bahan tanaman telah tercuci dan proses ekstraksi berakhir. 2.4.

Tinjauan Tentang Skrining Fitokimia Skrining

fitokimia

merupakan

bertujuan untuk mengetahui

penelitian

pendahuluan

yang

golongan senyawa kimia yang terkandung

dalam tanaman, yang biasanya mempunyai aktifitas biologis, secara tepat dan teliti (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto, 1978). Pendekatan secara penapisan fitokimia meliputi analisis kualitatif kandungan dalam tumbuhan atau bagian tumbuhan (akar, batang, daun, bunga, buah dan biji) terutama kandungan metabolit sekunder yang merupakan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, glikosida, terpenoid, saponin, tanin dan polifenol. 2.5.

Tinjauan Tentang Kanker

2.5.1. Definisi Kanker Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan mekanisme tidak normal dan tidak terkontrol yang mengatur kelangsungan hidup, proliferasi dan diferensiasi sel. Sel yang telah mengalami transformasi neoplastik biasanya mengekspresikan antigen permukaan sel yang dapat menunjukkan kelainan kromosom secara kualitatif atau kuantitatif. Sekelompok sel tumor dan sel induk tumor mempertahankan kemampuan untuk menjalani proliferasi berulang serta bermigrasi ke organ lain dalam tubuh, proses ini disebut metastasis. Keberadaan kumpulan sel ini ditandai dengan kelainan kromosom yang mencerminkan ketidakstabilan genetik. Ketidakstabilan genetik ini juga dapat memungkinkan mereka menjadi resisten terhadap kemoterapi dan radioterapi. Serangkaian proses metastasis

Skripsi

dan

infasif

yang

berhubungan


dengan

kanker

dapat

Lulus Megawati


18 mengakibatkan kematian, kecuali neoplasma dapat diberantas dengan pengobatan. (Katzung et al., 2009) 2.5.2. Epidemiologi, Etiologi dan Patofisiologi 2.5.2.1. Kanker Payudara Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang mempunyai prevalensi cukup tinggi. Kanker payudara dapat terjadi pada pria maupun wanita, hanya saja prevalensi pada wanita jauh lebih tinggi. Diperkirakan pada tahun 2006 di Amerika, terdapat 212.920 kasus baru kanker payudara pada wanita dan 1.720 kasus baru pada pria, dengan 40.970 kasus kematian pada wanita dan 460 kasus kematian pada pria (Anonim, 2006). Di Indonesia, kanker payudara menempati urutan ke dua setelah kanker leher rahim (Tjindarbumi, 1995). Kejadian kanker payudara di Indonesia sebesar 11% dari seluruh kejadian kanker (Siswono, 2003). Penyebab kanker payudara sangat beragam, tetapi ada sejumlah faktor risiko yang dihubungkan dengan perkembangan penyakit ini yaitu asap rokok, konsumsi alkohol, umur pada saat menstruasi pertama, umur saat melahirkan pertama, lemak pada makanan, dan sejarah keluarga tentang ada tidaknya anggota keluarga yang menderita penyakit ini (Macdonald dan Ford,1997). Hormon tampaknya juga memegang peranan penting dalam terjadinya kanker payudara. Estradiol dan atau progresteron dalam daur normal menstruasi meningkatkan resiko kanker payudara. Hal ini terjadi pada kanker payudara yang memiliki reseptor estrogen, dimana memang 50 % kasus kanker payudara merupakan kanker yang tergantung estrogen (Gibbs, 2000).

Skripsi


Lulus Megawati


19 2.5.2.2. Kanker Kolon Kanker kolon adalah ketiga yang paling umum didiagnosis pada laki-laki dan perempuan di Asia Tenggara, dengan 68.811 kasus kanker baru dan 44.280 kematian diperkirakan telah terjadi pada tahun 2008. Indonesia menduduki peringkat ke empat tertinggi setelah Singapura, Brunei, dan Malaysia. Peningkatan tingkat kanker kolorektal dianggap mencerminkan perubahan dalam pola diet, obesitas, dan tingkat merokok, sering terlihat pada tingkat ekonomi negara. (Kimman et al., 2012) Kanker kolon stadium awal biasanya tidak mempunyai gejala. Gejala yang muncul pada stadium lebih lanjut yang mungkin terjadi adalah pendarahan pada rektum, pendarahan saat buang air besar, perubahan kebiasaan usus, kram pada perut bagian bawah. Faktor resiko dari kanker kolon adalah keturunan (kurang dari 10% kanker kolon disebabkan oleh keturunan mutasi gen), riwayat polip kolon, inflamasi usus, obesitas, kurang aktivitas fisik, konsumsi makanan berlemak, rokok dan konsumsi alkohol. (American Cancer Society, 2008) 2.5.2.3.

Kanker Serviks

Kanker serviks adalah kanker kedua yang paling banyak didiagnosis dan merupakan penyebab ketiga kematian akibat kanker pada wanita di Asia Tenggara, terhitung dari 11% jumlah kasus kanker baru dan 9% kasus kematian akibat kanker pada wanita pada tahun 2008. Seperti kanker payudara, kanker serviks berkembang pada usia wanita relatif muda (di bawah 50 tahun). Beban terhadap kanker serviks di negara-negara berkembang tampaknya disebabkan oleh kombinasi faktor kurang luasnya skrining dan fasilitas pengobatan, dan proporsi yang lebih besar dari persisten infeksi Human Papilloma Virus (HPV). (Kimman et al., 2012)

Skripsi


Lulus Megawati


20 Ada dua tipe kanker serviks : kanker sel squamosa dan adenokarsinoma. Kurang lebih 90% kanker serviks adalah kanker sel squamosa

pada

permukaan

eksoserviks.

Jenis

kedua

adalah

adenokarsinoma, yang berkembang dari mukosa yang memproduksi sel glandular dari endoserviks. Faktor resiko dari kanker serviks antara lain adalah infeksi Human Papilloma Virus (HPV), rokok, immunosuppression, infeksi bakteri klamidia, konsumsi makanan rendah sayur, penggunaan kontrasepsi oral, kehamilan di usia dini, kehamilan berulang dalam jangka waktu yang singkat, penggunaan dietilstilbestrol (hormon yang digunakan untuk mencegah keguguran), kemiskinan, dan riwayat keluarga dengan kanker serviks. Penderita dengan kanker serviks stadium awal biasanya tidak memiliki gejala kelainan sampai kanker menjadi infasif dan tumbuh berkembang di jaringan. Dalam hal ini gejala yang mungkin timbul adalah pendarahan tidak normal dari vagina (biasanya setelah berhubungan seksual) dan rasa sakit saat berhubungan seksual. (American Cancer Society, 2008) 2.5.2.4.

Kanker Nasofaring

Kanker nasofaring merupakan tumor ganas yang paling banyak dijumpai di antara tumor ganas THT di Indonesia, dimana karsinoma nasofaring termasuk dalam lima besar tumor ganas dengan frekwensi tertinggi, sedangkan didaerah kepala dan leher menduduki tempat pertama. Tumor ini berasal dari fossa Rosenmuller pada nasofaring yang merupakan daerah transisional dimana epitel kuboid berubah menjadi epitel skuamosa.

Skripsi


Lulus Megawati


21 Penderita karsinoma nasofaring lebih sering dijumpai pada pria disbanding pada wanita dengan rasio 2-3 : 1. Penyakit ini ditemukan terutama pada usia yang masih produktif ( 30-60 tahun ), dengan usia terbanyak adalah 40-50 tahun. Penanggulangan karsinoma nasofaring sampai saat ini masih merupakan suatu problem, hal ini karena etiologi yang masih belum pasti, gejala dini yang tidak khas serta letak nasofaring yang tersembunyi, sehingga diagnosis sering terlambat. Pada stadium dini, radioterapi masih merupakan pengobatan pilihan yang dapat diberikan secara tunggal dan memberikan angka kesembuhan yang cukup tinggi. Pada stadium lanjut, diperlukan terapi tambahan kemoterapi yang dikombinasikan dengan radioterapi. (Soetjipto, 1989) 2.5.3. Macam-Macam Sel Kanker yang Digunakan 2.5.3.1.

Sel Kanker Payudara (T47D) Sel T47D merupakan continous cell line yang diisolasi dari

jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun (Burdall et al., 2003). Sel T47D memiliki morfologi seperti sel epitel. (Abcam, 2007). Sel kanker payudara T47D mengekspresikan protein p53 yang termutasi (Schafer et al., 2000). Induksi estrogen dan eksogen mengakibatkan peningkatan proliferasinya (Verma et al., 1998). 2.5.3.2. Sel Kanker Kolon (WiDr) Sel WiDr merupakan sel kanker kolon manusia yang diisolasi dari kolon seorang wanita berusia 78 tahun. Sel WiDr merupakan turunan sel kanker kolon yang lain yakni sel HT - 29 (Chen et al., 1987). Sel ini sering digunakan dalam penelitian karena aman digunakan pada uji sitotoksisitas,

Skripsi


Lulus Megawati


22 mudah dalam pengkulturan dan perlakuan (Djajanegara, 2008). Sel WiDr memerlukan rentang waktu sekitar 15 jam untuk dapat menyelesaikan 1 daur sel. Salah satu karakteristik dari sel WiDr ini ialah ekspresi siklooksigenase -2 (COX-2) yang tinggi yang memicu proliferasi sel WiDr (Palozza et al., 2005). 2.5.3.3.

Sel Kanker Serviks (HeLa)

Sel HeLa merupakan continous cell lines yang tumbuh sebagai sel yang semi melekat. Sel HeLa diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim (serviks) manusia. Sel ini diisolasi sejak tahun 1951 dari rahim wanita pertama penderita kanker leher rahim, berasal dari Baltimore, USA yang bernama Henrietta Lack yang saat itu berusia 31 tahun (Padmi, 2008). Sel HeLa merupakan sel kanker leher rahim akibat infeksi Human Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan sel leher rahim normal (Goodwin et al., 2000). 2.5.3.4.

Sel Kanker Nasofaring (Raji)

Sel Raji adalah sel yang berasal dari kultur cell line lymphoblastoid yang diturunkan dari lymphoma Burkitt. Burkitt merupakan sejenis kanker yang terdapat pada sistem limpa khususnya pada limfosit B. Sel raji telah ditemukan sejak tahun 1963 yang diperoleh dari rahang kiri anak lelaki dari Afrika yang saat itu mempunyai limfoma Burkitt (www.abcam.com).

Skripsi


Lulus Megawati


23 2.6.

Tinjauan Tentang Uji Sitotoksisitas Secara In Vitro Uji in vitro kemo-resisten dan kemo-sensitivitas telah dikembangkan

untuk memberikan informasi tentang karakteristik keganasan individual pasien untuk memprediksi respon potensi kanker mereka terhadap obat spesifik. Metode uji in vitro memberikan beberapa keuntungan, antara lain dapat digunakan sebagai langkah awal dalam pengembangan suatu obat, merupakan metode yang cepat, hanya memerlukan sedikit senyawa yang digunakan dalam pengujian, secara drastis dapat mengurangi penggunaan hewan laboratorium dan untuk beberapa tujuan penggunaan kultur selprimer dari bermacam-macam organ target (hati, paru-paru, ginjal, kulit, SSP) dapat

memberikan informasi tentang potensi efeknya pada sel target

manusia secara langsung (Doyle dan Griffiths, 2000). Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro yang menggunakan kultur sel yang digunakan untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplasmatik dari suatu senyawa. Penggunaan uji sitotoksisitas pada suatu sel merupakan salah satu cara penetapan in vitro untuk mendapatkan obat - obat yang sitotoksik. Sistem ini merupakan uji kualitatif dengan cara menetapkan kematian sel. Akhir dari uji sitotoksik dapat memberikan informasi konsentrasi obat yang masih memungkinkan sel mampu bertahan hidup (Doyle and Griffiths, 2000). Uji sitotoksik digunakan untuk memprediksi keberadaan obat sitotoksik baru dari bahan alam yang berpotensi sebagai anti kanker. Adapun dasar dari percobaan ini antara lain, bahwa sistem penetapan aktivitas biologi akan menghasilkan kurva dosis respon dan kriteria respon yang seharusnya menunjukkan hubungan lurus dengan jumlah sel. Informasi yang didapat dari kurva seharusnya berhubungan dengan efek i n v i v o dari obat sitotoksik yang sama (Padmi, 2008).

Skripsi


Lulus Megawati


24 Metode uji sitotoksik yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah metode MTT, dimana prinsip kerjanya adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium MTT oleh sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk kristal formazan berwana ungu dan tidak larut air. Penambahan reagen stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka berarti jumlah sel hidup semakin banyak.

Skripsi


Lulus Megawati


BAB III KERANGKA KONSEPTUAL 3.1.

Alur Kerangka Konseptual Penelitian Data WHO tahun 2010 menunjukkan kanker merupakan penyebab kematian nomer dua setelah penyakit kardiovaskular. Dan menempati urutan keenam penyebab kematian terbesar di Indonesia

Kanker

Terapi Farmakologik

Terapi Non Farmakologik

Pengobatan Tradisional

Pengobatan Modern

Ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.)

-

Uji potensi aktivitas antikanker terhadap kultur sel kanker secara in vitro

Menyebabkan efek samping

Sel HeLa

Sel T47D

-

Sel WiDr

Konsumsi makanan sehat dan bergizi, konsumsi buah dan sayur, hindari rokok dan alkohol, olahraga teratur

Pembedahan Radiasi Kemoterapi

Sel Raji

Ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel kanker HeLa, T47D, WiDr, dan Raji secara in vitro.

banyak

Terdapat senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman sirsak Annonaceous acetogenins yang telah lama diteliti dan terbukti bersifat antikanker (Taylor, 2002).

Gambar 3.1. Skema Kerangka Konseptual 25 Skripsi


Lulus Megawati


3.2.

26

Uraian Kerangka Konseptual Penelitian Data Badan Kesehatan Dunia (WHO) tahun 2010 menunjukkan

kanker merupakan penyebab kematian nomor dua setelah penyakit kardiovaskuler. Sedangkan berdasarkan Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2007, kanker menempati urutan keenam penyebab kematian terbesar di Indonesia dengan kanker payudara 30% dan kanker leher rahim atau kanker serviks 24% mendominasi (Anonim, 2012). Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan mekanisme tidak normal dan tidak terkontrol yang mengatur kelangsungan hidup, proliferasi dan diferensiasi sel. Kanker dapat disebabkan oleh faktor eksternal (tembakau rokok, bahan kimia, radiasi, dan infeksi organisme) dan faktor internal (mutasi turunan, hormon, kondisi imun, dan mutasi yang terjadi dari metabolisme) (Blecher, 2008). Dalam beberapa dekade terakhir, praktisi medis setidaknya telah memiliki tiga metode pengobatan kanker, yakni tindakan bedah, radiasi dan kemoterapi.

Sebanyak

1/3

penderita

kanker

diperkirakan

dapat

disembuhkan melalui modalitas terapi yang bersifat lokal (tindakan bedah dan radiasi), namun bagi 2/3 lainnya terutama yang penyakit kankernya telah mengalami mikrometastasis ke organ tubuh lain, diperlukan modalitas terapi yang bersifat sistemik (kemoterapi) (Halim et al., 2010). Akan tetapi penggunaan kemoterapi pada penderita kanker tidak bersifat spesifik sehingga banyak menimbulkan efek samping, mulai dari efek samping ringan (seperti mual, muntah, diare) sampai efek samping berat (myelosupresi, toksisitas ginjal, dll). Semua efek samping yang ditimbulkan ini dapat mengurangsi kualitas hidup yang kemudian akan mengarah kepada komplikasi penyakit. Oleh karena itu, fakta-fakta ini menarik perhatian untuk mencari alternatif obat antikanker yang bersifat lebih poten dan

Skripsi


Lulus Megawati


27

selektif serta sedikitnya sifat toksisitas pada jaringan yang sehat (Ibrahim dan Wahid, 2010; Castroa et al, 2010). Tumbuhan, telah lama kita ketahui merupakan sumber yang sangat penting dalam upaya mempertahankan kesehatan masyarakat. Catatan dari badan

kesehatan

dunia

(WHO),

80%

penduduk

dunia

masih

menggantungkan hidup sehat pada penggunaan obat tradisional yang berasal dari tumbuhan dan 25% dari obat-obat modern yang beredar di dunia berasal dari bahan aktif yang diisolasi dan dikembangkan dari tumbuhan sampai saat ini. Dan adanya gerakan back to nature atau gerakan hidup sehat dengan kembali ke alam sangat mendorong ke arah penggunaan tanaman sebagai bahan obat, kosmetik, pestisida, ataupun kebutuhan keluarga lainnya (Kardinan, 2003). Salah satu tumbuhan yang sering digunakan secara tradisional sebagai obat antikanker adalah sirsak (Annona muricata Linn). Senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman sirsak Annonaceous acetogenins telah lama diteliti dan terbukti bersifat antikanker, selain itu juga bersifat antiparasit, insektisida, anticacing, antibakteri, dan antivirus (Taylor, 2002). Berdasarkan Nasional Cancer Institute dan atau Nasional Institute of Health (NIH), annonaceous acetogenins dapat secara selektif menghambat pertumbuhan sel kanker dan juga menghambat pertumbuhan sel tumor yang resisten terhadap kemoterapi contohnya adriamycin (Taylor, 2002). Annonaceous acetogenins adalah turunan dari rantai panjang (C35 atau C37) asam lemak yang berasal dari jalur poliketida, yang bersifat selektif terhadap sel-sel kanker. Annonaceous acetogenins menginduksi sitotoksisitas dengan menghambat komplek I mitokondria yang terlibat dalam sintetis ATP. Sel-sel kanker memiliki kebutuhan energi (ATP) yang lebih tinggi daripada sel normal, oleh karena itu inhibitor komplek I mitokondria memiliki potensi dalam terapi kanker. (Torres, 2012). Selain Skripsi


Lulus Megawati


28

itu, berdasarkan beberapa penelitian yang dilakukan oleh Oberlies et al (1997) dan Liaw et al (2002), menyebutkan bahwa acetogenins sangat ampuh menghambat pertumbuhan sel kanker dan membunuh sel-sel kanker yang tahan terhadap obat multi drug resistant secara selektif. Acetogenins mampu menutup pompa antar-sel sehingga dapat membunuh tumor yang tahan terhadap obat. Berdasarkan data di atas diketahui biji sirsak (Annona muricata Linn.) yang mengandung Annonaceus acetogenins memiliki aktivitas antikanker dengan mekanisme menghambat jalur metabolisme sel kanker. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antikanker ekstrak biji sirsak terhadap sel kanker payudara (T47D), kolon (WiDr), serviks (HeLa) dan nasofaring (Raji) secara in vitro 3.3.

Hipotesis Ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) mempunyai

aktivitas antikanker terhadap sel kanker HeLa, T47D, WiDr, dan Raji secara in vitro.

Skripsi


Lulus Megawati


BAB IV METODE PENELITIAN 4.1.

Bahan, Alat dan Kultur Sel

4.1.1. Bahan Tanaman Pada penelitian ini digunakan biji sirsak (Annona muricata Linn.) yang didapat dari Kecamatan Kepohbaru, Kabupaten Bojonegoro. Biji sirsak tersebut diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96%, kemudian pelarut diuapkan dengan rotavapour. 4.1.2. Bahan Kimia dan Bahan Lain Etanol 96% sebagai pelarut pengekstraksi, Media Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) Gibeo , Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma, Penisilin – sterptomisin Sigma, Amfoterizin B Sigma, Dimethyl sulfoxide (DMSO), tripsin-EDTA Sigma (tripsin 0,25%), Tripan Blue Sigma, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) difenil tetrazolium bromida (MTT) Sigma, Sodium Duodecyl Suphate (SDS) dan Phosphat Buffer Saline (PBS) Invitrogen. 4.1.3. Kultur Sel Kanker Sel kanker yang digunakan pada penelitian ini adalah sel kanker payudara (T47D), sel kanker kolon (WiDr), sel kanker serviks (HeLa), dan sel kanker nasofaring (Raji) yang didapat dari laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

29 Skripsi


Lulus Megawati


30 4.1.4. Alat Horizontal LAF (Laminar Air Flow) Mascotte Model LHS, Direct Reading Micro Balance SIMADZU Type LM-20, inkubator CO2 New Brunswick Type Galaxy 170R (37°C, 95% kelembaban udara dan 5% CO2), sentrifugator Hermle Type Z 206 A, hemasitometer Assistent, mikroskop inverted Olympus Type CKX41, 96-well plate Corning dan ELISA reader Robonik. 4.2.

Rancangan Penelitian

4.2.1. Pembuatan Simplisia Biji Sirsak Biji sirsak dicuci bersih terlebih dahulu. Lalu ditiriskan, kemudian ditumbuk hingga menjadi serbuk halus. Serbuk halus biji sirsak kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di tempat terbuka dengan suhu ruang hingga benar-benar kering. 4.2.2. Pembuatan Ekstrak Biji Sirsak Ditimbang 250 g serbuk simplisia biji sirsak dimasukkan ke dalam maserator. Tambahkan 500 ml pelarut (etanol 96%). Rendam selama 6 jam pertama sambil diaduk-aduk perlahan. Lalu diamkan hingga 18 jam. Pisahkan maserat dengan filtrasi. Ulangi proses penyarian diatas sebanyak 3 kali dengan jumlah dan jenis pelarut yang sama hingga pelarut jernih. Kumpulkan semua maserat, uapkan pelarut dengan penguap vakum atau penguap tekanan rendah (rotavapor) hingga didapatkan ekstrak kental.

Skripsi


Lulus Megawati


31 4.2.3. Pengujian Skrining fitokimia 4.2.3.1. Golongan Alkaloid 1. Reaksi Pengendapan Ekstrak yang setara dengan 20 gram bahan ditambahkan 10 ml HCl 2N kemudian dipanaskan di atas penangas air selama 2 – 3 menit. Setelah dingin ditambahkan NaCl untuk mengendapkan protein yang dapat memberikan reaksi positif palsu, lalu filtrat disaring, kemudian ditambahkan HCl 2N sampai 10 ml. Filtrat digunakan untuk petunjuk adanya alkaloid dengan penambahan pereaksi pengendapan. Pereaksi yang digunakan antara lain Meyer dan Wagner. Ekstrak mengandung alkaloid bila timbul endapan setelah ditambah dengan pereaksi tersebut. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) 2. Kromatografi Lapis Tipis Filtrat ditambah NH4OH 28% sampai alkalis, diekstraksi dengan 10 ml CHCl3. Fase CHCl3 ditambah dengan NaSO4 eksikatus, disaring, kemudian diuapkan sampai 1 ml. Ekstrak ditotolkan. Fase Diam

: Kiesel Gel GF 254

Fase gerak

: aseton : air : ammonia (40 : 7 : 3)

Penampak noda

: pereaksi Dragendorf

Positif bila terjadi noda merah jingga. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978)

Skripsi


Lulus Megawati


32 4.2.3.2. Golongan Glikosida Saponin 1. Uji Buih Uji buih saponin Ekstrak setara 2 gram bahan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian dikocok kuat - kuat dengan air suling 10 ml. Buih yang timbul diukur. Positif bila terjadi buih setinggi 3 cm di atas permukaan cairan, stabil selama 30 menit. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) 2. Reaksi Warna Ekstrak yang setara 10 gram bahan, diuapkan di atas penangas air sampai kering. Setelah dingin dikocok dengan 10 ml n-heksan. Kemudian didekantir dan filtrat dibuang. Diulang sampai n-heksan tidak berwarna. Residu ditambah 10 ml CHCl3, kemudian digojok selama 5 menit, didekantir dalam tabung reaksi yang berisi 100 mg NaSO4 anhidrat, saring. Filtrat dibagi 3 (A, B, C). (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) Uji Liebermann-Burchard A sebagai blanko, B ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat, kemudian dikocok pelan. Hasil positif bila terjadi perubahan warna hijau - biru untuk saponin steroid, merah - ungu untuk saponin triterpenoid dan kuning muda untuk saponin jenuh. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) Uji Salkowski A sebagai blanko, C ditambah 1-2 ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung reaksi. Hasil positif mengandung steroid tak jenuh bila terdapat cincin merah pada fase asam. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978)

Skripsi


Lulus Megawati


33 3. Identifikasi Sapogenin Ekstrak yang mengandung 10 gram bahan ditambah 5 ml HCl 2 N, dididihkan dan ditutup dengan corong berisi kapas basah selama 2 jam untuk menghidrolisis saponin. Setelah dingin, dinetralkan dengan ammonia, kemudian diekstraksi dengan 3 ml nheksana sebanyak tiga kali, lalu diuapkan sampai tinggal 0,5 ml, ditotolkan pada pelat KLT. Fase diam

: Kiesel Gel GF 254

Fase Gerak

: n-heksana – etil asetat (4 : 1)

Penampak noda

: Anisaldehida asam sulfat

Adanya sapogenin ditunjukkan dengan terjadinya warna merah ungu (ungu) 4. Identifikasi Terpen / Steroid bebas secara KLT Ekstrak yang mengandung 10 gram bahan ditambah dengan n-heksana, diaduk sampai larut, ditotolkan pada fase diam kemudian dieluasi dengan n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan (4 : 1). Penampak noda menggunakan anisaldehida asam sulfat. Langkah ini untuk identifikasi adanya steroid atau triterpenoid bebas. Positif bila terjadi noda warna merah-ungu setelah plat KLT dipanaskan di atas hot plate. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) 4.2.3.3. Golongan Flavonoid 1. Reaksi Warna Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan, dipanaskan di atas penangas air sampai kering. Diekstraksi berulang – ulang

Skripsi


Lulus Megawati


34 dengan n-heksan sampai cairan tidak berwarna. Residu ditambah 2 ml etanol 80%, disaring, filtrate dibagi 4 (A, B, C, D). Uji Bate – Smith & Metcalf A sebagai blanko, B ditambah 0,5 ml HCl pekat, kemudian dipanaskan selama 15 menit di atas penangas air. Positif bila terjadi warna merah terang atau ungu (leukoantosianin). (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) Uji Wilstater A sebagai blanko, C ditambah 0,5 ml HCl pekat dan 4 potong magnesium. Diamati warna yang terjadi, diencerkan dengan air suling kemudian ditambah 1 ml butanol. Diamati warna yang terjadi pada setiap lapisan. Perubahan warna merah jingga menunjukkan adanya flavon, merah pucat menunjukkan adanya flavonol dan merah tua menunjukkan adanya flavonon. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) 2. Kromatografi Lapis Tipis D ditotolkan pada fase diam. Fase diam

: Kiesel Gel GF 254

Fase gerak

: butanol : asam asetat glasial : air (4:1:5)

Penampak noda

: pereaksi sitrat borat atau CeSO4 atau uap ammonia

Adanya flavonoid ditunjukkan dengan adanya noda kuning terang, coklat lemah, kuning hijau, merah jingga. Bila disemprot dengan CeSO4 akan timbul warna oranye sampai coklat atau bila dialiri uap ammonia akan timbul warna kuning tidak permanen. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978)

Skripsi


Lulus Megawati


35 4.2.3.4. Golongan Tanin dan Polifenol Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan, diuapkan di atas penangas air sampai kering. Setelah dingin ditambah 20 ml air suling panas, dikocok sampai homogen kemudian ditambah 5 tetes NaCl 10 % untuk mengendapkan zat – zat

lain, kemudian

disaring. Filtrat dibagi menjadi 3 bagian (A, B, C). Uji Gelatin Filtrat A sebagai blanko, B ditambah larutan gelatin 1%, lalu ditambah NaCl 10%. Jika terdapat endapan menunjukkan adanya tanin. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978). Uji Ferri klorida Filtrat C ditambah pereaksi ferri klorida. Diamati terjadinya perubahan warna. Bila timbul warna biru – hitam, hijau – biru, hijau – hitam menunjukkan adanya polifenol. 4.2.3.5. Golongan Antrakuinon 1. Reaksi warna Uji Borntrager Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan, diuapkan sampai kering. Setelah dingin, ditambahkan 10 ml air suling, kemudian disaring, filtrat diekstraksi dengan toluena 5 ml dalam corong pisah dua kali. Fase toluena diambil kemudian dibagi dua (A, B). A sebagai blanko, B ditambah 5 ml ammonia, kemudian dikocok. Positif bila terjadi warna merah pada lapisan alkali. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) Uji Modifikasi Borntrager

Skripsi


Lulus Megawati


36 Ekstrak yang setara dengan 1 gram bahan, diuapkan di atas penangas air sampai kering. Setelah dingin ditambah 10 ml KOH0,5 N dan 1 ml H2O2 encer, dipanaskan di atas penangas air selama 10 menit kemudian disaring. Filtrat ditambah asam asetat glasial. Diekstraksi dengan toluena dua kali masing – masing 5 ml. Fase toluena diambil, dibagi dua (A, B). A sebagai blanko, B ditambah 2 – 5 ml larutan ammonia. Positif jika terjadi warna merah pada lapisan alkali. (Fong, 1990; Zaini dan Indrayanto 1978) 2. Kromatografi Lapis Tipis Fase diam

: Kiesel Gel GF 254

Fase gerak

: kloroform : etil asetat : asam asetat glasial (75 : 24 : 1)

Penampak noda

: larutan KOH 10% dalam metanol

Positif jika noda kuning, kuning - coklat, merah - ungu, hijau ungu (Harbone, 1987) 4.2.4. Pengujian Sitotoksisitas Secara In Vitro 4.2.4.1.

Pembuatan Media Kultur Lengkap Media Kultur Lengkap adalah media yang mengandung faktor pertumbuhan. Pembuatan media kultur lengkap dilakukan dengan cara mencairkan Fetal Bovine Serum (FBS), Penisilinstreptomisin, Amfoterizin B dan media Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) pada suhu kamar sebelum digunakan. Ambil 10 ml FBS, 1 ml Penisilin-streptomisin dan 0,5 ml Amfoterizin B kemudian tuang ke dalam botol duran 100 ml. Tambahkan Media

Skripsi


Lulus Megawati


37 RPMI ad 100 ml. Beri penandaan pada botol berupa nama media dan tanggal pembuatan media kultur lengkap. 4.2.4.2.

Penumbuhan Sel Sel apabila tidak digunakan dalam penelitian disimpan dalam tangki nitrogen cair untuk waktu penyimpanan yang lama, atau disimpan dalam suhu -80˚ C untuk peyimpanan selama 2-3 bulan. Sel ditumbuhkan kembali dalam media saat akan digunakan dalam uji in vitro. Penumbuhan sel dilakukan dengan cara menyiapkan alikuot media kultur yang sesuai untuk sel, yaitu 3 ml media kultur dalam conical tube steril. Ampul (cryo tube) yang berisi suspensi sel diambil dari tangki nitrogen cair dan dicairkan pada suhu kamar hingga tepat mencair. Suspensi sel diambil dengan mikropipet 1 ml (blue tip), dimasukkan tetes demi tetes ke dalam media kultur yang telah disiapkan. Menutup Conical tube dengan rapat, kemudian disentrifus pada 600 gram selama 5 menit. Pengerjaan kembali dilakukan di dalam LAF, conical tube dan tangan disemprot dengan alkohol 70%. Conical tube dibuka, lalu dituang supernatan media kultur ke dalam pembuangan. Media kultur baru ditambahkan sebanyak 4 ml, sel diresuspensi kembali hingga homogen. Suspensi sel kemudian di transfer ke dalam flask, ditambahkan lagi 5 ml media kultur baru. Kondisi sel diamati dengan mikroskop dan flask disimpan ke dalam inkubator CO2.

4.2.4.3.

Penggantian Media Sel Dalam pertumbuhannya, konsentrasi sel yang tinggi menyebabkan produksi asam laktat dan berkurangnya nutrisi untuk

Skripsi


Lulus Megawati


38 pertumbuhan

sel.

pertumbuhannya

Guna

optimum

mencapai

kondisi

sel

diperlukan

penggantian

yang media

pertumbuhan. Penggantian media pertumbuhan dilakukan dengan cara membuang media yang lama secara perlahan menggunakan mikropipet. Ditambahkan PBS sebanyak 3 ml ke dalam flask, lalu digoyang-goyangkan ke kanan dan ke kiri untuk mencuci sel. PBS dibuang dengan mikropipet. Media kultur sebanyak 5 ml di tuang ke dalam flask yang berisi sel, lalu dihomogenkan. Kondisi dan jumlah sel diamati secara kualitatif pada mikroskop inverted, diinkubasi semalam dan keadaan sel diamati keesokan harinya. Media kultur diganti bila sudah berwarna merah pucat. 4.2.4.4.

Panen Sel Kultur sel yang telah membentuk monolayer konfluen 80% mulai dapat digunakan untuk pengujian atau disubkultur. Proses pengambilan sel yang telah konfluen disebut panen sel. Poin utama dari panen sel adalah melepaskan ikatan antar sel dan ikatan sel dengan matrik tanpa merusak sel itu sendiri. Tahap awal panen sel adalah mengeluarkan sel dari inkubator CO2 dan memastikan sel telah 80% konfluen. Media dibuang dengan menggunakan mikropipet. Sel dicuci sebanyak dua kali dengan PBS (volume PBS adalah ± ½ volume media awal). Tripsin-EDTA (tripsin 0,25%) ditambahkan secara merata dan diinkubasi di dalam inkubator selama 3 menit. Keadaan sel diamati di mikroskop, diinkubasi kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Media sebanyak 3 ml ditambahkan untuk

Skripsi


Lulus Megawati


39 menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet. Kemudian dipindahkan ke dalam conical tube lalu disentrifuge. Conical tube dibuka lalu media dibuang menggunakan mikropipet. Media kultur baru ditambahkan ke dalam conical tube sebanyak 10 ml. 4.2.4.5.

Perhitungan Sel Perhitungan sel dapat dilakukan dengan hemositometer di bawah mikroskop. Mula-mula panenan sel diambil 50 µl di transfer ke dalam eppendorf dan ditambahkan 50 µl tripan blue. Dari campuran tersebut diambil 10 µl sel dengan mikropipet untuk dimasukkan ke dalam hemositometer. Sel dihitung di bawah mikroskop

inverted.

Sisa

sel

pada

conical

dilakukan

cryopreservation, atau dilakukan sub kultur. Untuk sel yang akan ditanam (untuk perlakuan) dilakukan transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain, ditambahkan media kultur sesuai dengan konsentrasi yang dikehendaki. Berikut cara perhitungan sel, a.

Sel dihitung pada 4 kamar hemasitometer. Sel yang biru (mati) dan sel yang berada dibatas luar sebelah atas dan sebelah kanan tidak ikut dihitung.

b.

Dilakukan perhitungan jumlah sel per mL dengan rumus berikut, Jumlah sel terhitung / mL =

∑ sel kamar A + ∑ sel kamar B + ∑ sel kamar C + ∑ sel kamar D x 104 4

Skripsi


Lulus Megawati


40 c.

Dihitung jumlah total sel yang digunakan, semisal untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 5x103 / sumuran x 100 sumuran (dilebihkan) = 5 x 10 5 Volume panenan sel yang diperlukan dihitung pula, Volume panenan sel yang ditransfer = Jumlah total sel yang diperlukan Jumlah sel terhitung / mL

d.

Volume panenan sel yang ditransfer diambil kemudian ditambahkan media kultur hingga total volume yang diperlukan. Volume yang diperlukan untuk menanam sel ialah tiap sumuran diisi 100 μl media kultur berisi sel, maka 100 μl x 100 sumuran = 10 mL.

4.2.4.6.

Preparasi Sampel Ditimbang sampel ekstrak sebanyak 10,0 mg di dalam eppendorf selanjutnya ditambahkan 50 μl DMSO dan coba larutkan dengan bantuan vortex. Jika belum larut, dapat ditambahkan 50 μl DMSO lagi dan larutkan kembali. Kemudian dibuat seri kadar sampel dengan pengenceran stok dalam DMSO menggunakan media kultur sebanyak 7 seri konsentrasi 250, 150, 100, 50, 10, 2, 0,4 µg/mL (ppm), dan setiap perlakuan dibuat triplo (tiga replikasi).

4.2.4.7.

Tahapan Pengujian Sel yang telah konfluen 80% dipanen. Ditransfer beberapa

sel untuk dilakukan perhitungan jumlah sel yang dibutuhkan, dimana

Skripsi


Lulus Megawati


41 tiap sumuran dibutuhkan 5 x 103 sel. Sel diinkubasi dalam incubator selama semalaman, keesokan harinya dilakukan dokumentasi. Apabila keadaan sel sudah normal kembali, ditambahkan seri kadar konsentrasi yang telah dibuat. Sel diiinkubasi kembali dengan inkubator

semalaman.

Menjelang

akhir

inkubasi

dilakukan

dokumentasi. Kemudian ditambahkan reagen MTT ke dalam masingmasing sumuran sejumlah 100μl / sumuran. Diinkubasi dalam inkubator selama 2-4 jam, diamati dengan mikroskop. Apabila sudah terbentuk kristal formazan, dilakukan dokumentasi dan ditambahkan SDS stopper dalam masing-masing sumuran sebanyak 100μl. Plate dibungkus menggunakan aluminium foil, diinkubasi di tempat gelap pada suhu kamar selama semalam. Keesokan harinya diamati absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ 595 nm. Pada percobaan diperoleh absorbansi 3 macam kontrol dan senyawa uji meliputi : a. Kontrol sel berisi media kultur + sel, tanpa bahan uji (sebagai kontrol positif) b. Kontrol media berisi media kultur, tanpa sel (sebagai kontrol negatif) c.

Kontrol pelarut berisi media kultur + sel + DMSO dengan konsentrasi terbesar pada seri konsentrasi (% DMSO terbesar dilihat dari konsentrasi DMSO dalam seri konsentrasi sampel yang paling pekat)

d.

Skripsi

Senyawa uji berisi media kultur + sel + senyawa uji


Lulus Megawati


42 1 A

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Seri

B

konsentrasi

C

1-7

D

Sampel

E

(ekstrak

F

etanol biji sirsak)

G H

Kontrol sel

Kontrol

Kontrol

DMSO

Media

Tabel IV.1. Desain Plate 4.3.

Analisis Data Berdasarkan nilai absorbansi yang diperoleh dilakukan penentuan persentase sel hidup menggunakan rumus : Persentase sel hidup = (Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media) x 100% (Absorbansi kontrol sel – Absorbansi kontrol media) Selanjutnya, bersama dengan data seri kadar konsentrasi ditentukan nilai IC50 menggunakan analisis probit dengan program software SPSS

Skripsi


Lulus Megawati


Skripsi


Lulus Megawati


4.4.

43

Kerangka Operasional

Biji sirsak segar

Dicuci Ditiriskan Dihaluskan Dikeringkan (diangin-anginkan)

Serbuk simplisia biji sirsak Ekstraksi dengan etanol 96 % secara maserasi

(re-maserasi 4x)

Ekstrak cair biji sirsak Eluen diuapkan (Rotavapor) Ekstrak kental biji sirsak

Dikeringkan (diangin-anginkan)

Skrining Fitokimia

Golongan senyawa : alkaloid, glikosida saponin, senyawa flavonoid, tanin dan polifenol, glikosida antrakuinon.

Uji Sitotoksik sel kanker T47D, WiDr, HeLa, dan Raji dengan metode MTT secara in vitro

Ditentukan nilai IC50 terhadap masing-masing sel kanker.

Gambar 4.1. Skema kerangka operasional Skripsi


Lulus Megawati


BAB V HASIL PENELITIAN 5.1.

Hasil Ekstraksi Biji Sirsak Dilakukan pembuatan ekstrak biji sirsak dari 250 gram simplisia biji

sirsak kemudian dimaserasi dengan 500 ml etanol diulang sebanyak 3 kali. Kemudian pelarut diuapkan dengan rotavapor hingga diperoleh 13, 546 gram. 5.2.

Hasil Skrining Fitokimia Dari skrining fitokimia ekstrak etanol biji dari tanaman Annona

mmuricata Linn. diperoleh hasil sebagai berikut : 5.2.1. Golongan Alkaloid 1. Reaksi Pengendapan Didapatkan hasil positif untuk untuk ekstrak etanol biji sirsak. Hasil positif ditunjukkan dengan timbulnya endapan setelah ditambah dengan pereaksi Mayer dan Wagner. 2. Kromatografi Lapis Tipis Didapatkan hasil positif setelah plat KLT disemprot dengan pereaksi Dragendorf tampak noda berwarna merah jingga.

44 Skripsi


Lulus Megawati


45

Gambar 5.1. Hasil uji KLT senyawa golongan alkaloid pada ekstrak biji sirsak Keterangan : Fase gerak : aseton : air : amonia (8 : 1,4 : 0,6) Penampak noda : pereaksi Dragendorf 5.2.2. Golongan Glikosida Saponin 1. Uji Buih Pada uji buih didapatkan hasil positif untuk ekstrak etanol biji sirsak, buih terjadi setinggi 1 cm dan stabil selama 30 menit. 2. Reaksi Warna Pada

uji

Liebermann-Burchard

didapatkan

hasil

negatif.

Sedangkan pada uji Salkowski didapatkan hasil positif, yaitu adanya cincin warna merah setelah penambahan asam sulfat pekat.

Skripsi


Lulus Megawati


46 3. Kromatografi Lapis Tipis Identifikasi sapogenin secara KLT memberikan hasil positif untuk ekstrak etanol biji sirsak. Setelah disemprot dengan anisaldehid asam sulfat terjadi noda warna merah ungu. Pada identifikasi terpen / steroid bebas secara KLT juga didapatkan hasil positif. Setelah disemprot dengan anisaldehid asam sulfat terjadi noda warna merah ungu.

(a)

(b)

Gambar 5.2. (a) Hasil uji KLT senyawa terpen / steroid bebas dan (b) senyawa sapogenin ekstrak etanol biji sirsak Keterangan : Fase gerak : n-heksan : etil asetat (4 : 1) Penampak noda : anisaldehid asam sulfat

Skripsi


Lulus Megawati


47 5.2.3. Golongan Flavonoid 1. Reaksi Warna Pada uji Bate – Smith & Metcalf didapatkan hasil negatif. Setelah penambahan asam klorida pekat yang kemudian dipanaskan tidak terjadi warna merah terang melainkan warna coklat - hitam. Pada uji Wilstater pun demikian, tidak terjadi warna merah – jingga, merah pucat sampai merah tua. 2. Kromatografi Lapis Tipis Identifikasi flavonoid dengan KLT didapatkan hasil positif untuk ekstrak etanol biji sirsak. Setelah diberi uap ammonia terjadi warna kuning intensif dan warna kuning memudar bersamaan dengan menguapnya ammonia.

Gambar 5.3. Hasil uji KLT senyawa golongan flavonoid pada ekstrak biji sirsak Keterangan : Fase gerak : butanol : asam asetat glasial : air (4 : 1 : 5) Penampak noda : uap ammonia

Skripsi


Lulus Megawati


48 5.2.4. Golongan Tanin dan Polifenol Dengan penambahan FeCl3 terjadi warna hitam kehijauan untuk ekstrak etanol biji sirsak. Namun dengan penambahan gelatin dan NaCl tidak terjadi endapan warna putih. 5.2.5. Golongan Antrakuinon 1. Reaksi warna Dengan uji Borntrager dan modifikasi Borntrager untuk ekstrak etanol biji sirsak didapatkan hasil negatif. Tidak terjadi warna merah pada lapisan alkali. 2. Kromatografi Lapis Tipis Setelah plat disemprot dengan KOH 10% dalam metanol tidak terjadi warna kuning, kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu.

Tabel V.1. Hasil skrining fitokimia ekstrak biji sirsak dengan reaksi warna dan pengendapan No.

Golongan

Nama Reaksi

Hasil

Keterangan

Mayer

Terjadi endapan

(+) alkaloid

Wagner

Terjadi endapan

(+) alkaloid

Uji KLT

(+) noda warna

(+) alkaloid

Dragendorf

jingga (Rf: 0,67)

Uji Buih

Terjadi buih

(+) saponin

Liebermann-

Tidak terjadi warna

(-) saponin steroid,

Senyawa 1.

2.

Alkaloid

Glikosida Saponin

Skripsi


Lulus Megawati


49 Burchard

Salkowski

hijau biru, merah

saponin

ungu atau kuning

triterpenoid,

muda

saponin jenuh

Terjadi cincin merah

(+)

steroid

tak

jenuh KLT penampak

(+) noda merah

(+)

terpenoid/

noda

ungu (Rf: 0,37)

steroid bebas

Bate-Smith &

Tidak terjadi warna

(-) leukoantosianin

Metcalf

merah terang

Wilstater

Tidak terjadi warna

(-)

merah jingga, merah

flavonol, flavanon

anisaldehid asam sulfat 3.

Flavonoid

flavon,

pucat, merah tua KLT Butanol,

(+) noda kuning

as. asetat

intensif (Rf: 0,51)

(+) flavonoid

glasial, air 4.

Tanin

dan

Gelatin – NaCl

Polifenol

Tidak terjadi

(-) tanin

endapan FeCl3

Terjadi warna hijau

(+) polifenol

- hitam

Skripsi


Lulus Megawati


50 5.

Antrakuinon

Borntrager

Tidak terjadi warna

(-) antrakuinon

merah muda pada

bebas

lapisan alkali Modifikasi

Tidak terjadi warna

(-) antrakuinon

Borntrager

merah muda pada

bebas dan

lapisan alkali

glikosida antrakuinon

5.3.

Hasil Pengujian Potensi Sitotoksisitas Ekstrak Biji Sirsak Secara In Vitro dengan Metode MTT Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam kuning

tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) larut dalam phosphate buffer saline dan memberikan warna kuning. Pada sel hidup, di dalam mitokondria sel, MTT akan bereaksi dengan hydrogen yang berasal dari enzim dehidrogenase yang dapat mengakibatkan pecahnya cincin tetrazolium menjadi formazan yang merupakan zat berwarna ungu dan tidak larut air.

Intensitas

warna

tersebut ditetapkan secara

spektrofotometri dengan menggunakan alat ELISA reader. Sejumlah sel yang telah dihitung dengan hemasitometer ditransfer kedalam conical tube kemudian ditanam dalam 96-well plate dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, media diambil, dicuci PBS kemudian ditambahkan sampel, diinkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan PBS. Kemudian kedalam masing-masing sumuran ditambahkan MTT. Setelah 4 jam, ditambahkan larutan SDS sebagai reagen stopper, 20 jam kemudian

Skripsi


Lulus Megawati


51 absorbansi dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Berdasarkan data absorbansi selanjutnya dilakukan penentuan persentase sel hidup menggunakan Microsoft Excel. Dari data konsentrasi dan persentase sel hidup didapatkan nilai IC50 menggunakan analisis probit dengan program SPSS 20.0 yang tertera pada tabel sebagai berikut : Tabel V.2. Nilai IC50 ekstrak biji sirsak pada sel T47D, sel WiDr, sel HeLa, dan sel Raji Sampel

Harga IC50 (µg/mL)

Ekstrak Biji

% Sel Hidup

Sirsak

-50

Sel T47D

Sel WiDr

Sel HeLa

Sel Raji

20,357 ± 1,584

40,056 ± 3,122

8,906 ± 4,497

11,242 ± 4,528

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

50

100

150

200

250

300

Konsentrasi Ekstrak Biji Sirsak (µg/mL) Gambar 5.4. Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel T47D

Skripsi


Lulus Megawati


52

120 100 % Sel Hidup

80 60 40 20 0

-50

-20

0

50

100

150

200

250

300

Konsentrasi Ekstrak Biji Sirsak (µg/mL)

Gambar 5.5. Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel WiDr 100

% Sel Hidup

80 60 40 20 0 -50

0 -20

50

100

150

200

250

300


Gambar 5.6. Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel HeLa Skripsi


Lulus Megawati


53

140 120 % Sel Hidup

100 80 60 40 20 0

-20

0

20

40

60

80

100

Konsentrasi Ekstrak Biji Sirsak (µg/mL) Gambar 5.7. Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel Raji 120

% Sel Hidup

100 HeLa t47d WiDr Raji

80 60 40 20 0 -20

0

50

100

150

200

250

300


Gambar 5.8. Kurva % sel hidup dan konsentrasi ekstrak biji sirsak terhadap sel T47D, HeLa, WiDr, dan Raji

Skripsi


Lulus Megawati


BAB VI PEMBAHASAN

Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan mekanisme tidak normal dan tidak terkontrol yang mengatur kelangsungan hidup, proliferasi dan diferensiasi sel. Jika penyebaran dari kanker tidak terkontrol maka dapat menyebabkan kematian (Blecher, 2008). Unsurunsur penyebab penyakit kanker dapat digolongkan ke dalam tiga kelompok besar, yaitu energi radiasi (sinar ultraviolet, sinar-x dan sinar-ϒ ), senyawa kimia dan virus. Diperkirakan 80% dari penyakit kanker pada manusia disebabkan oleh faktor lingkungan, khususnya zat kimia. Kontak dengan zat kimia dapat terjadi akibat pekerjaan seseorang (misalnya, benzena, asbes); makanan (misalnya, Aflatoksin B1 yang dihasilkan oleh jamur Aspergillus flavus yang kadang-kadang ditemukan sebagai kontaminan dalam kacang tanah serta bahan pangan lainnya); gaya hidup (misalnya, merokok); atau dengan cara lain (misalnya preparat terapeutik tertentu dapat bersifat karsinogenik) (Murray, 2003). Dalam beberapa dekade terakhir, praktisi medis setidaknya telah memiliki tiga metode pengobatan kanker, yakni tindakan bedah, radiasi dan kemoterapi. Kemoterapi adalah tindakan atau terapi pemberian

senyawa

kimia

(obat

kanker)

untuk

mengurangi,

menghilangkan atau menghambat pertumbuhan parasit atau mikroba di tubuh pasien (hospes). Tujuan kemoterapi adalah untuk mengobati atau memperlambat pertumbuhan tumor atau mengurangi gejalanya (Lesnussa, 2010). Akan tetapi penggunaan kemoterapi pada penderita kanker tidak bersifat spesifik sehingga banyak menimbulkan efek 54 Skripsi


Lulus Megawati


55 samping mulai efek samping ringan (seperti mual, muntah, diare) sampai efek samping berat (myelosupresi, toksisitas ginjal, dll). Semua efek samping yang ditimbulkan ini dapat mengurangi kualitas hidup yang kemudian akan mengarah kepada komplikasi penyakit. Oleh karena itu, fakta-fakta ini menarik perhatian untuk mencari alternatif obat antikanker yang bersifat lebih poten dan selektif serta sedikitnya sifat toksisitas pada jaringan yang sehat. (Ibrahim dan Wahid, 2010; Castroa et al, 2010). Sirsak telah diteliti sejak tahun 1940an, semua bagian dari tanaman sirsak ini dapat digunakan untuk pengobatan. Biji dan daun sirsak secara empiris telah banyak digunakan sebagai antikanker (Evira, 2013). Kandungan fitokimia yang telah diteliti dari tanaman ini adalah acetogenins, alkaloid, quinolines, isoquinolines, tanin, methanolic, coumarin, procyanidins, flavonoid, Acetaldehyde, Amyl-caproate (Taylor, 2002). Senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman sirsak Annonaceous acetogenins telah lama diteliti dan terbukti bersifat antikanker, selain itu juga bersifat antiparasit, insektisida, anticacing, antibakteri, dan antivirus (Taylor, 2002). Berdasarkan Nasional Cancer Institute dan atau Nasional Institute of Health (NIH), annonaceous acetogenins dapat secara selektif menghambat pertumbuhan sel kanker dan juga menghambat pertumbuhan sel tumor yang resisten terhadap kemoterapi (Taylor, 2002). Annonaceous acetogenins menginduksi sitotoksisitas dengan menghambat komplek I mitokondria yang terlibat dalam sintetis ATP (Torres, 2012). Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antikanker pada ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap beberapa sel kanker manusia secara in vitro. Aktifitas antikanker dapat diketahui

Skripsi


Lulus Megawati


56 melalui pengujian dengan metode MTT yang kemudian menggunakan analisis probit didapatkan harga IC50. Penelitian ini diawali dengan pembuatan ekstrak etanol biji sirsak. Simplisia yang telah kering dimaserasi dengan menggunakan etanol 96 % kemudian pelarut diuapkan dengan menggunakan rotavapour. Penggunaan etanol pada penelitian ini karena etanol merupakan pelarut yang dapat menarik hampir semua senyawa yang terkandung di dalam tanaman. Sebelum melakukan uji aktivitas , dilakukan terlebih dahulu skrining fitokimia yang bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa apa saja yang terkandung dalam sampel. Skrining yang dilakukan pada penelitian ini berguna sebagai data pendukung dari hasil penelitian. Berdasarkan hasil skrining fitokimia ekstrak etanol biji sirsak didapatkan hasil positif untuk senyawa golongan alkaloid, glikosida saponin, flavonoid dan polifenol. Untuk membuat larutan uji, ekstrak biji sirsak dilarutkan dengan DMSO. Ekstrak biji sirsak diencerkan dengan media kultur lengkap sehingga didapatkan tujuh konsentrasi yang berbeda. Pelaksanaan penelitian ini dilakukan dalam Laminar Air Flow dengan menggunakan teknik aseptis. Sterilitas merupakan hal yang sangat penting

untuk

diperhatikan

karena

kontaminasi

kultur

akan

mengganggu pertumbuhan sel yang dapat mengakibatkan kematian sel. Sel kanker yang digunakan pada penelitian ini adalah sel kanker payudara (T47D), sel kanker kolon (WiDr), sel kanker serviks (HeLa), dan sel kanker nasofaring (Raji) yang didapat dari laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. Tahapan pertama adalah thawing. Cryotube berisi sel yang berada dalam tabung nitrogen

Skripsi


Lulus Megawati


57 cair dikeluarkan, kemudian sel dicairkan dengan menggunakan tangan hingga tepat mencair. Selanjutnya sel dipindahkan ke dalam tabung conical yang telah berisi media pertumbuhan yang sesuai. Sebelum dipindahkan ke wadah pertumbuhan sel, conical diusap dengan alkohol 70 %, tangan juga disemprot untuk mencegah kontaminasi. Tahapan kedua adalah inisiasi sel. Inisiasi merupakan proses pembiakan sel. Setelah thawing selesai dilakukan, suspensi sel dalam media pertumbuhan diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37˚ C dengan komposisi udara 5% CO2. Pertumbuhan sel dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain nutrisi, pH, suhu dan komposisi udara. Nutrisi diperoleh dari media pertumbuhan yang digunakan. Oleh karena itu agar sel dapat tumbuh dengan nutrisi yang cukup, maka perlu dilakukan penggantian media. Indikatornya adalah pada saat media berubah warna menjadi kuning. Perubahan ini akibat terjadinya penurunan pH media akibat produksi CO2 oleh sel. Proses dari penggantian media, yaitu pertama menghisap media lama secara perlahan dengan mikropipet kemudian sel dibilas dengan PBS lalu PBS dibuang. Setelah dibilas, media kultur lengkap dituangkan ke dalam flask dan dihomogenkan, lalu diamati kondisi dan jumlah sel pada mikroskop inverted. Flask diinkubasi kembali di dalam inkubator CO2. Media yang digunakan untuk sel kanker dalam penelitian ini adalah media RPMI, media RPMI ini dicampur dengan NaHCO 3, HCl, fungizone, Penisillin-streptomisin 1% dan FBS 10%. Penisillinstreptomisin berfungsi untuk mencegah kontaminasi mikroorganisme apabila terjadi kontaminasi pada saat pengerjaan. HCl dan NaHCO 3 digunakan sebagai dapar media pertumbuhan. FBS 10% berfungsi sebagai suplemen perangsang pertumbuhan sel.

Skripsi


Lulus Megawati


58 Tahap berikutnya dilakukan proses panen sel, pertama yang dilakukan mengambil flask yang berisi sel di dalam inkubator CO2. Mengamati sel, panen sel dilakukan setelah sel 80 % konfluen. Kemudian membuang media dengan mikropipet, mencuci sel 2 kali dengan PBS, menambahkan tripsin-EDTA 1 kali untuk melepaskan sel dari flask, setelah itu diinkubasi di inkubator selama 3 menit. Setelah sel lepas, ditambahkan media untuk menginaktifkan tripsin. Transfer sel ke dalam conical steril baru. Tahap selanjutnya, perhitungan sel. Mengambil 50 µL panenan sel dan ditransfer ke dalam appendorf lalu ditambahkan 50 µL tripan biru. Dari campuran tersebut diambil 10 µL kemudian dipipetkan ke hemasitometer. Menghitung sel dibawah mikroskop inverted. Dihitung sel pada 4 kamar hemasitometer, sebelum diletakkan pada hemasitometer diberi tripan biru agar dapat terlihat sel yang mati dan hidup. Sel yang berwarna biru merupakan sel yang mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah atas dan di sebelah kanan tidak dihitung. Sel di batas kiri dan batas bawah ikut dihitung. Setelah dilakukan perhitungan jumlah sel, dilakukan proses penanaman sel sejumlah kepadatan sel yang dilakukan. Dalam penelitian ini kepadatan sel yang digunakan sebesar 10 4 untuk tiap sumuran. Hal ini dilakukan berdasarkan penelitian sebelumnya. Sel yang sudah ditanam diinkubasi di inkubator CO2 selama 24 jam agar sel bisa menyesuaikan diri dengan media yang baru sebelum keesokan harinya dilakukan penambahan sampel. Pada penelitian ini, pertama dilakukan penambahan sampel ekstrak biji sirsak dengan tujuh konsentrasi yang berbeda dengan tiga kali replikasi. Dilakukan juga penambahan kontrol pelarut, kontrol sel dan kontrol media. Kemudian

Skripsi


Lulus Megawati


59 dilakukan inkubasi selama 24 jam di inkubator CO 2 dan penambahan reaksi MTT. Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh sistem reduktase. Pada sel yang hidup di dalam mitokondria sel, MTT akan bereaksi dengan hidrogen yang berasal dari enzim dehidrogenase yang dapat mengakibatkan pecahnya cincin tetrazolium dapat membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut di dalam air. Setelah kristal formazan terbentuk tambahkan reagen stopper, ragen ini akan melarutkan kristal berwarna itu yang kemudian dapat diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka jumlah sel yang hidup semakin banyak. Berdasarkan data absorbansi yang diperoleh, terjadi penurunan % sel hidup seiring meningkatnya konsentrasi. Selanjutnya bersamaan dengan data seri kadar ditentukan nilai IC50 dengan menggunakan analisis probit. Harga IC50 yang didapatkan adalah sebagai berikut, IC50 pada sel T47D = 20,357 ± 1,584 µg/mL, sel WiDr = 40,056 ± 3,122 µg/mL, sel HeLa = 8,906 ± 4,497 µg/mL, sel Raji = 11,242 ± 4,528 µg/mL. Merujuk pada jurnal Meiyanto et al, 2008, disebutkan bahwa ekstrak dapat dikatakan memiliki aktifitas sitotoksik jika nilai IC50 kurang dari 1000 µg/mL setelah 24 jam kontak dengan sel kanker. Sehingga dari hasil IC50 yang diperoleh diketahui bahwa ekstrak etanol biji sirsak dapat digunakan sebagai pilihan terapi antikanker. Aktivitas ini dapat disebabkan kandungan kimia yang spesifik dari familia Annonaceae yaitu annonaceous acetogenin. Annonaceous acetogenin bekerja menghambat dan membunuh sel kanker secara selektif, karena

Skripsi


Lulus Megawati


60 mampu mendeteksi dan membedakan sel normal dan sel kanker. Asetogenin menyerang sel secara selektif , artinya hanya sel yang diidentifikasi sebagai sel kanker saja yang diserang, sementara sel normal tidak diserang. Mekanisme ini sangat berbeda dengan cara kerja obat – obatan kemoterapi yang menyerang sel kanker dan juga sel normal. Akibatnya sel normal ikut rusak dan matiyang berakibat pada timbulnya berbagai macam efek samping. Cara asetogenin dalam membedakan sel kanker dan sel normal adalah berdasarkan dari kebutuhan sel akan ATP (Adenosine Trifosfate). Karena sel kanker bergerak, tumbuh dan berduplikasi lebih cepat dan aktif dibandingkan sel normal, maka sel kanker membutuhkan energi ATP dalam jumlah yang lebih banyak. Asetogenin mendeteksi kebutuhan ATP yang lebih tinggi sebagai sel kanker. Selanjutnya acetogenin masuk ke dalam sel kanker dan menempel pada dinding sebelah dalam mitokondria, yaitu organ di dalam sel yang berfungsi sebagai tempat memproduksi energi ATP bagi sel. Selanjutnya asetogenin memblok produksi energi ATP di dalam mitokondria sel kanker. Akibatnya suplai energi untuk sel kanker akan terputus, sel kanker menjadi lemah dan akhirnya mati (Alali et al., 1999). Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa ekstrak biji sirsak memiliki potensi sitotoksik terhadap semua sel uji (T47D, HeLa, WiDr, Raji), meskipun memiliki harga IC50 lebih tinggi disbanding obat antikanker doxorubicin (hasil tidak dipublikasikan). Kemampuan ekstrak biji sirsak menghambat pertumbuhan paling kuat terhadap sel kanker serviks (HeLa) dengan IC50 sebesar (8,906 ± 4,497 μg/ml). Kondisi ini didukung oleh penelitian sebelumnya yang menyebutkan efek sitotoksik biji sirsak terhadap kanker ovarian Ehrlich’s Ascites

Skripsi


Lulus Megawati


61 Carsinoma (EAC) yang diinokulasikan ke dalam tikus (Ukwubile, 2012). Dengan demikian, ekstrak ini dapat dikembangkan sebagai pengobatan antikanker, utamanya untuk kanker serviks. Namun perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme ekstrak etanol biji sirsak dalam menghambat pertumbuhan sel HeLa, sehingga penggunaannya dapat tepat pada siklus proliferasi yang sesuai pada sel kanker tersebut.

Skripsi


Lulus Megawati


BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN

7.1.

Kesimpulan 1.

Ekstrak biji sirsak memiliki potensi antikanker terhadap beberapa sel kanker manusia secara in vitro.

2.

Harga IC50 ekstrak biji sirsak terhadap beberapa sel kanker manusia secara in vitro :

7.2.

sel T47D

= 20, 357 ± 1,584 µg/mL

sel HeLa

= 8,906 ± 4,497 µg/mL

sel WiDr

= 40,056 ± 3,122 µg/mL, dan

sel Raji

= 11,242 ± 4,528 µg/mL

Saran 1.

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme ekstrak etanol biji sirsak (Annona muricata Linn.) dalam menghambat

pertumbuhan

sel

kanker

sehingga

penggunaannya dapat tepat pada siklus proliferasi yang sesuai pada sel kanker tersebut. 2.

Dapat dilakukan penelitian lanjutan dengan uji secara in vivo.

62

Skripsi


Lulus Megawati


DAFTAR PUSTAKA

Abcam, 2007, T47D (Human ductal breast epithelial tumor cell line) http://www. abcam.com/index.html?datasheet=14899, Diakses tanggal 15 Desember 2013 Alali FQ, Liu XX, Mclaughin JL, 1999. Annonaceous acetogenins: recent progress. Journal of Natural Product. Vol 62(3), pp. 504-40 Alfrits Komansilan, Abdul L. Abadi, Bagyo Yanuwiadi, and David A. Kaligis. Isolation and identification of biolarvicide from soursop (Annona muricata Linn). International Journal of Engineering & Technology IJET – IJENS. Vol: 12 No: 03. 2012 Anggrianti, Padmi. 2008. Uji Sitotoksik Ekastrak Etanol 70% Buah Kemukus (Piper cubeba L.) Terhadap Sel HeLa. Fakultas Farmasi UNMUH Surakarta Anonim,

2012d. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. http://depkes.go.id/index.php?vw=2&id=1937, diakses tanggal 15 Desember 2013

Blecher E, Graves KC, Desantis C, Edward B, Ferlay J, Forman D, et al. Global Cancer Fact and Figures. American Cancer Society. Edisi 2.Atalanta.2008 Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown, R.J.M., dan Speirs, V., 2003, Bereast Cancer Cell Line, Breast Cancer Res., 5(2): 89-95. Castroa, A. J. A., Villarreal, M. L., Olivod, L. A. S., Sancheze, M. G., Dominguezf, F., Carrancab, A. G. 2010. Mexican medicinal plants used for cancer treatment: Pharmacological, phytochemical and ethnobotanical studies. Journal of Ethnopharmacology 133 (2011) 945–972 Chen, T.R., Drabkowski, D., Hay, R.J., Macy, M. and Peterson, W. Jr., 1987, WiDr is a Derivative of Another Colon Adenocarcinoma Cell Line, HT-29, Cancer Genet Cytogenet., 27(1):125-34. 63 Skripsi


Lulus Megawati


64 Departemen Kesehatan RI, 1989. Materia Medika Indonesia, Jilid V, Jakarta: Departemen Kesehatan RI, hal. 45. Departemen Kesehatan RI, 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I, Jakarta: Departemen Kesehatan RI Djajanegara, Ira. 2008 Uji Sitotoksisitas Ekstrak Ethanol 70 % Herba Ceplukan (Physalis angulata Linn.) Terhadap Sel WiDr Secara In Vitro Doyle, A., dan Griffiths, J. B. 2000. Cell and Tissue Culture for Medical Research. John Willey and Sons Ltd. : New York. Evira, Desty, 2013. The Miracle of Fruits, Jakarta: Gramedia Pustaka. Hal. 269. Fong, H. H. S., Tin-Wa, Maung and Fransworth, N. R., 1990. Phytochemical Screening. Chicago: Departement of Pharmacognosy of Illions Ascriptove Medical Center, page 32 – 69 Gibbs, J.B., 2000, Anticancer drug targets: growth factors and growth factor signalling, J. Clin Invest, 105, 9-13 Goodwin, E.C., DiMaio, D., 2000, Repression of human papillomavirus oncogenes in Hela cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways, Biochemistry, Vol.97, no.23. Labwork Study Guideand Lecture Notes, 2000, Henrietta Lacks, www.micro.msb.le.ac.uk/Labwork/Lack 1.htm. Harborne, J.B., (1987), Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerjemah: Padmawinata K. Soediro I. Bandung: ITB, Terjemahan dari: Phytocemical Methods. ITB. Bandung Haryoto, Sirup Sirsak, Yogyakarta: Kanisius, 1998. Ibrahim S, dan Wahid S (2010). Immunotheraphy on Breast Cancer: The Update. The Indonesian Journal of Medical Science, Vol.2, No.1, 54-60. Skripsi


Lulus Megawati


65 Kardinan, Agus.2003.Tanaman Pengusir dan Pembasmi Nyamuk. Jakarta: AgroMedia Pustaka. Halaman 18 – 31. Katzung BG, Masters SB, dan Trevor AJ (2009). Basic and Clinical Pharmacology, 11th Edition. San Francisco: The McGraw-Hill Companies, Inc. Kimman M, Norman R, Jan S, Kingston D, dan Woodward M (2012). The Burden of Cancer in Member Countries of the Association of Southeast Asian Nations (ASEAN). Asian Pasific Journal of Cancer Prevention, Vol.13, 411-420. Kojima N, Tanaka T. Medicinal Chemistry of Annonaceous Acetogenins: Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Analogues. Molecules. 2009 Lesnussa, Y.A. (2010), Aplikasi Kendali Optimum Dalam Penentuan Interval Waktu dan Dosis Optimal Pada Kemoterapi Kanker, Tesis Jurusan Matematika, FMIPA ITS, Surabaya. Levrero, M., Laurenzi, V. De, Constanzo, A., Sabatini, S., Gong, J., Wang, J.Y.J. and Melino, G., 2000, The p53/p63/p73 Family of Transcription Factors: Overlapping and Distinct Functions, Journal of Cell Science, 113:1661-1670. Lisdawati, Vivi, dkk. 2007. Isolasi dan Elusidasi Struktur Senyawa Lignan dan Asam Lemak dari Ekstrak Daging Buah Phaleria Macrocarp. Bul. Penel. Kesehatan 35, 3: 115 – 124. Liu, H.C., Chen, G.G., Vlantis, A.C., Leung, B.C.S., Tong, M.C.E. and van Hasselt, C.A., 2006, 5-Fluorouracil Mediates Apoptosis and G1/S Arrest in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma via a p53Independent Pathway, The Cancer Journal, 12(6):482-493. Latief, Abdul., 2012. Obat Tradisional, Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran ECG, hal. 245i Macdonald, F., Ford C.H.J., 1997. Molecular Biology of Cancer. Bio Scientific Publisher, Oxford, United Kingdom.

Skripsi


Lulus Megawati


66 Mangan, Yelia, 2009, Solusi Sehat Mencegah dan Mengatasi Kanker, Jakarta : Agromedia Pustaka, hal. 22 - 24 Mclaughlin, Benson GB, Foysthe JW. 1996. Paw-paw and Cancer Annonaceous Acetogenin from Discovery to Comercial Products,Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Purdue University, 71(7):1311–1321 Meiyanto, E., Susidarti, RA., Handayani, S., Rahmi, F. 2008. Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) mampu menghambat Proliferasi dan memacu apoptosis sel MCF-7, Majalah Farmasi Indonesia 19 (1), 12-19 Murray, Robert K, 2003, Harper’s Biochemistry: 25/E. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran ECG, hal. 779-780 Noguchi, P., Wallace, R., Johnson, J., Early, E.M., O’Brien, S. and Ferrone, S., 1979, Characterization of the WiDr: a Human Colon Carcinoma Cell Line, In Vitro, 15(6):401-408. Radi Juhaeni, ir.1998, Sirsak, Budidaya dan Pemanfaatanya. Kanisius Yogyakarta. Ramanthan, R., Than, C. H. dan Das, N. P. 1992. Cytotoxic Effect of Plant Polyphenols and Fat Soluble Vitamins on Malignant Human Cultured Cells . Cancer Letters 62: 217 – 224. Raintree Nutrition. Monograph Graviola Annona Muricata. Carson city. 2004 Raintree Tropical Plant Database. Graviola. www.graviola.org. 2005 diakses tanggal 15 Desember 2013 Rustanti, E. 2007. Pengaruh Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata, L) dan Biji Mimba (Azadirachta indica, A, Juss) Sebagai Insektisida Nabati Untuk Mengendalikan Hama Tugau Pada Tanaman Jarak

Skripsi


Lulus Megawati


67 Pagar (Jatropa Curcas). Laporan tidak diterbitkan Malang: Kimia UIN Malang. Sajuthi, D. 2001. Ekstraksi, Fraksinasi, Karakterisasi dan Uji Hayati In Vitro Senyawa Bioaktif Daun Dewa (Gynura pseudochina (Linn.) DC.) Sebagai Antikanker, Tahap II. Buletin Kimia 1 : 75 -79. Schafer, J.M., Lee, E.S., O’Regan, R.M., Yao, K., dan Jordan, V.C., 2000, Rapid Development of Tamoxifen-stimulated Mutant p53 Breast Tumors (T47D) in Athymic Mice, Clinical Cancer Research, 6, 4373-438 Siswono, 2002. Peran Radioterapi pada Pengobatan Kanker. KOMPAS 6 Januari 2002. Available from : http://www.gizi.net/cgibin/berita/fullnews.cgi?newsid1010376116,48600, Diakses tanggal 15 Desember 2013 Siswono, 2005. Penderita Kanker Terus Meningkat, Indonesia Kekurangan Dokter Bedah Onkologi. Indonesian Nutrition Network. Available from : http://www.gizi.net/cgibin/berita/fullnews.cgi?newsid1111986431,81378, Diakses tanggal 15 Desember 2013 Sunarjono, Hendro, 2005. Sirsak & Srikaya, Budi Daya Untuk Menghasilkan Buah Prima, Jakarta: Penebar Swadaya Syarif Ibrahim, Syarifuddin Wahid. 2010. Immunotheraphy on breast cancer : The update. The Indonesian Journal of Medical Science 2 (1): 54 – 60 http://med.unhas.ac.id/jurnal/2011_vol2_no1/TP-2.pdf Diakses tanggal 15 Desember 2013 Taylor L. Technical Data Report for Graviola Annona Muricata. Herbal secret of the Rainforest. Edisi ke 2. Tahun 2002 Tjindarbumi, 1995. Diagnosis dan Pencegahan Kanker Payudara, Kursus Singkat Deteksi Dini dan Pencegahan Kanker. 6-8 November. FKC.II-POI. Jakarta.

Skripsi


Lulus Megawati


68 Torres, María P., Rachagani, Satyanarayana., Purohit, Vinee., Pandey, Poomy., Joshi, Suhasini., Moore, Erik D., Johansson, Sonny L., Singh, Pankaj K., Ganti, Apar K., Batra, Surinder K. 2012. Graviola: A novel promising natural-derived drug that inhibits tumorigenicity and metastasis of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo through altering cell metabolism. Cancer Letters 323 (2012) 29–40 Ukwubile CA, 2012. Phytochemical Screening and Anti-Ovarian Cancer Properties of Annonamuricata Linn. (Annonaceae) Seed Ethanol Extract. International Journal of Pharmaceutical Frontier Research. Vol 1(3): 9-17 Verma, S.P., Goldin, B.R., and Lin, P.S., 1998, The Inhibition of the Estrogenic Effects of Pesticides dan Enviromental Chemicals by Curcumin and Isoflavonoids, Envir. Health Presp, 106 (12), 807812. Wagner, H.S., Bladt, and Zgainski, E. M., 1984. Plant Drug Analysis (A thin Layer Chromatography Atlas). Springer – verlag. Berlin: Heidelberg World Health Organisation. 2007. http://www.who.int/cancer/en/. Diakses tanggal 15 Desember 2013 Yasril. 2010. Uji Toksisitas Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap Larva Aedes Aegypti. http:www.digilib.ui.ac.id//opac/themes/libri2/detail.jsp?id=73033 &lokasi=local. Diakses tanggal 15 Desember 2013 Zaini, N. C. dan Indrayanto, G., 1978. Cara – cara Skrining Fitokimia. Surabaya: Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, hal 1 – 14 Zuhud, E., 2011. Kanker Lenyap Berkat Sirsak. Agromedia Pustaka, Jakarta.

Skripsi


Lulus Megawati


Lampiran 1 Contoh Perhitungan Persentase Sel Hidup Pada Sel T47D kontrol

absorbansi

rata-rata

sel T47D

kontrol

absorbansi

media 0.809

T47D

0.795

0.097

0.800

0.097

0.797

0.097

0.096

Absorbansi 1 2 3 0.114 0.128 0.126

1 2.418

150.975

0.117

0.114

0.115

2.845

2.418

100.650

0.115

0.112

0.113

*2.560

50.325

0.495

0.455

0.443

10.065

0.724

0.760

2.013

0.725

0.403

0.737

Konsentrasi (µg/ml) 251.625

rata-rata

% SelHidup 2 3 4.410 4.125

ratarata 3.651

1.077

2.560

2.608

0.217

2.134

2.276

**2.323

0.217

56.615

50.925

49.218

52.252

3.873

0.753

89.189

94.310

93.314

92.271

2.715

0.704

0.728

89.331

86.344

89.758

88.478

1.860

0.740

0.725

91.038

91.465

89.331

90.612

1.129

69 Skripsi


Lulus Megawati

SD


(*) Persentase sel hidup = (Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media) (Absorbansi kontrol sel – Absorbansi kontrol media) 0.115

–

0.097

0.800

–

0.097

(**) Rata – rata persentase sel hidup

X 100

=

X 100 %

% = 2.560

2.560 + 2.134 + 2.276 3

=

2.323

70 Skripsi


Lulus Megawati


Lampiran 2 Contoh Analisis Probit Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata Linn.) Pada Sel T47D Menggunakan Program SPSS 20.0 Cell Counts and Residuals Konsentrasi

Number

PROBIT

Number of

Observed

Expected

Subjects

Responses

Responses

Residual Probability

1

2.401

100

4

7.295

-3.644

.073

2

2.179

100

3

12.328

-9.720

.123

3

2.003

100

2

17.768

-15.445

.178

4

1.702

100

52

30.034

22.218

.300

5

1.003

100

92

65.811

26.460

.658

6

.304

100

88

90.956

-2.478

.910

7

-.395

100

91

98.834

-8.222

.988

Confidence Limits 95% Confidence Limits for Konsentrasi

95% Confidence Limits for log(Konsentrasi)b

Probability

Estimate

Lower

Upper Bound

Estimate

Bound

PROBIT

a

Lower

Upper

Bound

Bound

.010

1137.032

153.735

5468151609.313

3.056

2.187

9.738

.020

709.665

112.870

533585846.540

2.851

2.053

8.727

.030

526.218

92.112

122775272.135

2.721

1.964

8.089

.040

420.200

78.670

40851561.348

2.623

1.896

7.611

.050

349.927

68.933

16754376.575

2.544

1.838

7.224

71 Skripsi


Lulus Megawati


.060

299.452

61.402

7871646.336

2.476

1.788

6.896

.070

261.224

55.320

4070669.471

2.417

1.743

6.610

.080

231.155

50.254

2261379.238

2.364

1.701

6.354

.090

206.825

45.938

1328220.046

2.316

1.662

6.123

.100

186.698

42.193

815767.909

2.271

1.625

5.912

.150

122.197

28.754

111864.711

2.087

1.459

5.049

.200

87.248

20.114

24307.201

1.941

1.304

4.386

.250

65.350

13.954

6960.581

1.815

1.145

3.843

.300

50.411

9.373

2427.265

1.703

.972

3.385

.350

39.635

5.973

992.482

1.598

.776

2.997

.400

31.548

3.548

466.302

1.499

.550

2.669

.450

25.298

1.941

247.965

1.403

.288

2.394

.500

20.357

.973

146.769

1.309

-.012

2.167

.550

16.381

.447

94.803

1.214

-.350

1.977

.600

13.135

.188

65.462

1.118

-.725

1.816

.650

10.455

.073

47.411

1.019

-1.139

1.676

.700

8.220

.025

35.432

.915

-1.597

1.549

.750

6.341

.008

26.936

.802

-2.108

1.430

.800

4.750

.002

20.545

.677

-2.693

1.313

.850

3.391

.000

15.462

.530

-3.387

1.189

.900

2.220

.000

11.163

.346

-4.275

1.048

.910

2.004

.000

10.359

.302

-4.491

1.015

.920

1.793

.000

9.563

.254

-4.727

.981

.930

1.586

.000

8.772

.200

-4.986

.943

.940

1.384

.000

7.978

.141

-5.277

.902

.950

1.184

.000

7.173

.073

-5.609

.856

72 Skripsi


Lulus Megawati


.960

.986

.000

6.345

-.006

-6.000

.802

.970

.787

.000

5.472

-.104

-6.482

.738

.980

.584

.000

4.512

-.234

-7.125

.654

.990

.364

.000

3.353

-.438

-8.141

.525

a. A heterogeneity factor is used. b. Logarithm base = 10.

73 Skripsi


Lulus Megawati


Lampiran 3 Foto Sel Uji Sitotoksisitas Kontrol Sel

Ekstrak

Sel T47D

Sel HeLa

Sel WiDr

Sel Raji

74 Skripsi


Lulus Megawati

ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga SKRIPSI

Recommend Documents