ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
SKRIPSI PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI METABOLIT DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour.
ARMILA FATMA S.
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA
2016 i
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
SKRIPSI PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI METABOLIT DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour.
ARMILA FATMA S. 051211131172
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA DEPARTEMEN FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA SURABAYA
2016 ii
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul : PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI METABOLIT DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour. untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital
Library
Perpustakaan
Universitas
Airlangga
untuk
kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenar-benarnya.
Surabaya, Agustus 2016
Armila Fatma S. NIM : 051211131172
iii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
LEMBAR PERNYATAAN Saya yang bertanda tangan di bawah ini, Nama
: Armila Fatma S.
NIM
: 051211131172
Fakultas
: Farmasi
menyatakan dengan sesungguhnya bahwa hasil tugas akhir yang saya tulis dengan judul : PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI METABOLIT DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour. adalah benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri. Apabila di kemudian hari diketahui bahwa skripsi ini merupakan hasil plagiarisme, maka saya bersedia menerima sangsi berupa pembatalan kelulusan dan atau pencabutan gelar yang saya peroleh. Demikian surat pernyataan ini saya buat untuk dipergunakan sebagaimana mestinya. Surabaya, Agustus 2016
Armila fatma S. NIM : 051211131172
iv SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Lembar Pengesahan PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI METABOLIT DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour.
SKRIPSI Dibuat untuk memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga 2016 Oleh : ARMILA FATMA S. 051211131172 Skripsi ini telah disetujui oleh
v SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KATA PENGANTAR Segala puji syukur saya haturkan kepada Allah SWT atas berkah kemudahan dan segala bentuk pertolonganNya yang tiada terkira sehingga saya dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul PURIFIKASI SEKUNDER
DAN
KARAKTERISASI
METABOLIT
DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT
JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour. pada waktunya. Tugas akhir ini tidak dapat serta merta terselesaikan tanpa bantuan dan dukungan dari banyak pihak, oleh karena itu dengan setulus hati saya sampaikan terimakasih kepada :
1. Prof. Dr.rer.nat Gunawan Indrayanto, Apt. selaku pemimbing utama
yang
senantiasa
sabar
dalam
membimbing
dan
memberikan masukan serta dukungan, saran serta kritik.
2. Prof. Dr. Noor Erma N.S., MS., Apt selaku dosen pembimbing serta dan dosen wali yang tiada hentinya mencurahkan kasih sayang
dalam
bentuk
semangat,
doa,
dukungan,
serta
bimbingan. Terimakasih sudah menjadi ibu kedua bagi saya.
3.
Prof. Dr. Moh. Nasih, SE., MT., Ak., CMA. selaku Rektor Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan dan bantuan selama menempuh pendidikan program Sarjana Farmasi.
vi SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
4.
Dr. Hj. Umi Athijah, Apt., M.S selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan dan bantuan selama menempuh pendidikan program Sarjana Farmasi.
5.
Dr. Aty widyawaruyanti, MSi selaku ketua departemen farmakognosi
dan
fitokimia
yang
telah
memberikan
kesempatan dan bantuan selama mengerjakan penelitian.
6.
Prof. Dr. Bambang Prajogo EW.,MS. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan kritik serta mendorong penulis untuk belajar dan menggali lebih banyak ilmu.
7.
Dra. Rakhmawati, MSi. Selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan kritik serta mendorong penulis untuk belajar dan menggali lebih banyak ilmu.
8. Ibu terhebat di dunia, yang tiada henti mendoakan dan memotivasi saya setiap harinya. Semoga Tuhan memberikan kesehatan dan umur panjang. Terimakasih untuk selalu ada, Ibu.
9. Bapak tercinta yang senantiasa memotivasi dan mendoakan saya, terimakasih telah memperjuangkan saya dari kecil hingga detik ini tiada henti, terimakasih untuk setiap tetes peluh untuk saya dan adik. Semoga Tuhan senantiasa merahmati.
10. Mbak Risma Pratiwi dan Tia Purwa, peneliti “pendahulu” saya dalam riset endofit yang selalu menginsipirasi.
vii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
11. Teman-teman seperjuangan “Jamur Endofit” Izzatulaili, Aisa, Desy, Ni Putu Diah dan Bian atas dukungan, motivasi dan bantuannya selama ini.
12. Sahabat-sahabat terbaik saya, Annisa , Apriliana, Lourenzdita, Dwi fatmawati, Nyimas, Ika, Ayuning, dan Diah, Putri, Berthy, Dek Tia, Rizki, dan Fitri
atas semangat yang tak henti
dicurahkan selama ini.
13. Teman-teman seperjuangan di lab laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi. Terimakasih atas waktu berjuang bersama dan saling menyemangati.
14. Teman-teman
“Amoksilin
B12”
atas
semangat
dan
dukungannya selama ini. Terimaksih telah menjadi keluarga terbaik saya disini.
15. Pak Bakir, Mbak Nur, Pak Iwan, Pak Jarwo, Pak Kus, Mas Iwan yang selalu siap memberikan bantuan, bimbingan, serta kesabarannya.
16. Unit Layanan Penelitian (ULP) Fakultas Farmasi Universitas Airlangga atas bantuannya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu kefarmasian
dan
almamater
tercinta
Fakultas
Farmasi
Universitas Airlangga
Surabaya, Agustus 2016 Penulis
viii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
RINGKASAN PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI METABOLIT DARI FRAKSI 12 EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFIT Cladosporium oxysporum DARI Aglaia odorata Lour. Armila Fatma S. Cladosporium oxysporum, merupakan jamur endofit yg diisolasi dari Aglaia odorata, aktivitas antimikrobanya menunjukkan 6 dari 13 fraksi ekstrak menghambat S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 8739 dan C. albicans ATCC 10231. Fraksi ke 12 memiliki aktivitas antijamur terhadap C. albicans ATCC 10231, sehingga menarik untuk diteliti lebih lanjut. Tujuan penelitian ini melakukan purifikasi dan karakterisasi senyawa aktif yang terkandung dalam fraksi 12 ekstrak etil asetat jamur endofit C. oxysporum dari A. odorata Lour. Purifikasi dilakukan dengan kromatografi kolom, fase diam Sephadex LH-20 dan fase gerak metanol 100%, diperoleh tiga subfraksi yaitu 12.1, 12.2, dan 12.3 (Pratiwi, 2015). Dilakukan purifikasi lebih lanjut subfraksi 12.2 dengan KLT-preparatif, fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak diklorometana : etilasetat= 9:1, didapatkan 8 subfraksi. Hasil KLT subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 terdapat satu noda dominan untuk itu dilakukan uji kemurnian dengan KLT dua dimensi. Subfraksi 12.2.6 pada KLT masih terdapat beragam noda dengan annisaldehid-H2SO4 p, satu noda dominan pada Rf 0,43 yang aktif sinar UV254nm dengan λ mak 268 nm. Hasil kromatogram HPLC dengan kolom Phenomenex® RP-18 eluen metanol : air gradient menunjukkan satu puncak dominan pada tr 7,959 menit dengan λmak 261 nm. Serapan pada λ ini menunjukkan adanya gugus kromofor inti aromatis (Sampietro et al., 2009). Subfraksi 12.2.7 diperoleh padatan amorf, larut dalam etilasetat. Hasil uji kemurnian didapat satu noda warna merah-ungu dengan anisaldehid-H2SO4 p dan aktif UV254nm, berdasarkan KLT dapat dikatakan senyawa yang terkandung dari golongan terpenoid atau steroid dan murni secara KLT (Sherma, 2003). Karakterisasi noda hasil KLT-densitometer subfraksi 12.2.7 menunjukkan adanya
ix SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
puncak pada Rf 0,34 dan λ mak 273 nm, hal ini menjadi petunjuk adanya senyawa fenol (Skoog et al., 2007). Hasil kromatogram GC detektor FID, kolom HP-5 menunjukkan puncak dominan pada tr 27,868 menit. Analisis GC-MS dengan kolom HP-5 menunjukkan puncak dominan pada tr 23,30 menit dan dari spektrum MS yang dihasilkan identik dengan senyawa 4,4’-(1methylethylidene)bisphenol atau bisfenol A dengan kemiripan 88,31% data base mass bank dan 87% data base wiley7n.1. Kriteria kemiripan dengan database dapat dianggap signifikan bila > 80% (Odchimar et al., 2016). Eluen terpilih untuk KLT subfraksi 12.2.8 kloroform:metanol = 8:2, terdapat dua noda dengan Rf 0,7 dan 0,8 yang berwarna ungu dengan anisaldehid-H2SO4 p dan aktif terhadap UV254nm. Hasil analisis subfraksi 12.2.8 dengan HPLC menunjukkan puncak dominan pada tr 5,085 dan 6,089 menit. Dalam hal ini perlu dilakukan analisis dengan LC-MS-MS.
x SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
ABSTRACT
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION SECONDARY METABOLITES FROM FRACTION 12 OF ETHYL ACETATE EXTRACT ENDOPHYTIC FUNGI Cladosporium oxysporum ISOLATED FROM Aglaia odorata LOUR. Armila Fatma S. Endophytes are microbes which reside in living plant tissue without causing diseases to the host. Endophytes produce some substances that have biological activity. Cladosprium oxysporum is one of endophytic fungi isolated from Aglaia odorata Lour. It was proven that 6 from 13 of its ethyl acetate fraction had activity against Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, and Candida albicans ATCC 10231. Purification of secondary metabolites from subfraction 12.2.6, 12.2.7, and 12.2.8 using preparative chromatography with silica gel 60 F254 as stationary phase and dicloromethane : ethylacetate = 9:1 as mobile phase was conducted. Subfraction 12.2.6, 12.2.7, and 12.2.8 was shown UV 254 active compound and positive when sprayed by anisaldehyde-H2SO4 p reagent. All of them are classified as steroid or terpenoid group based on its TLC profile using anisaldehyde-H2SO4 p reagent. Subfraction 12.2.7 was analyzed using GC-MS, and resulted compound which identified as 4-4’-(1-methylethylidene)bisphenol. Keywords : Secondary metabolites, endophytic fungi, Cladosporium oxysporum, Aglaia odorata Lour, 4-4’-(1methylethylidene)bisphenol.
xi SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
DAFTAR ISI Halaman LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH……………………………………………………….. iii LEMBAR PERNYATAAN…………………………………...
iv
LEMBAR PENGESAHAN……………………………………
v
KATA PENGANTAR………………………………………… vi RINGKASAN ………………………………………………… ix ABSTRACT ………………………………………………….
xi
DAFTAR ISI………………………………………………….. xii DAFTAR TABEL…………………………………………….. xv DAFTAR GAMBAR…………………………………………. xvi DAFTAR SINGKATAN……………………………………... xxiii BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Permasalahan………………….
1
1.2 Rumusan Masalah……………………………...
6
1.3 Tujuan Penelitian……………………………....
6
1.4 Manfaat Penelitian……………………………..
6
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan tentang Tanaman Aglaia odorata L… 2.1.1 Klasifikasi Tanaman……………………..
7
2.1.2 Nama Daerah……………………………..
7
2.1.3 Morfologi tanaman……………………....
8
2.1.4 Penyebaran dan habitat………………….
8
2.1.5 Kandungan kimia………………………..
9
xii SKRIPSI
7
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
2.1.6 Kegunaan tanaman………………………
21
2.2 Tinjauan tentang Jamur………………………..
21
2.2.1 Definisi tentang Jamur Endofit………...
22
2.2.2 Tinjauan tentang Cladosporium oxsporum . 28 2.2.2.1 Klasifikasi C.oxysporum……… 28 2.2.2.2Ciri morfologi…………………
28
2.2.2.3 Habitat………………………..
29
2.2.2.4 Kandungan metabolit sekunder… 29 2.2.2.5 Tinjauan tentang ekstrak etilasetat jamur endofit Cladosporium oxysporum……………………… 30 2.3 Tinjauan tentang antibiotik……………………….. 38 2.4 Tinjauan tentang fraksinasi dan kromatografi…… 39 2.4.1 Fraksinasi…………………………………... 39 2.4.2 Kromatografi………………………………. 39 2.4.2.1 Kromatografi Lapis Tipis………..
39
2.4.2.2 KLT preparative…………...…….. 42 2.4.2.3 KLT dua arah……………………. 43 2.5 Tinjauan tentang karakterisasi…………………..
43
2.5.1 KLT-Densitometer………………………... 43 2.5.2 HPLC……………………………………..... 44 2.5.3 GC………………………………………….. 44 2.5.4 Mass Spectroscopy (MS)………………….. 44 BAB III. KERANGKA KONSEPTUAL…………………….. 46 BAB IV. METODE PENELITIAN 4.1 Tempat penelitian……………………………….. 50
xiii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
4.2 Sampel Penelitian................................................... 50 4.3 Pelarut dan pereaksi……………………………..
51
4.4 Alat………………………………………………
51
4.5 Pelaksanaan penelitian………………………….
51
4.5.1 Optimasi eluen……………………………
51
4.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif………
52
4.5.3 Uji kemurnian……………………………
52
4.5.4 Karakterisasi isolat……………………....
52
4.6 Skema kerja……………………………………..
53
BAB V. HASIL PENELITIAN 5.1 Fraksi terpilih untuk dimurnikan………………
54
5.2 KLT-preparatif untuk subfraksi 12.2………….
54
5.3 Uji kemurnian subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dengan KLT 2D………………………………………………
57
5.4 Karakterisasi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7……...
58
5.4.1 Karakterisasi dengan KLT-Densitometer subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7……………..
58
5.4.2 Karakterisasi subfraksi 12.2.6 dengan HPLC 59 5.4.2 Karakterisasi subfraksi 12.6.8 dengan HPLC 59 5.4.3 Karakterisasi subfraksi 12.2.7 dengan GC-FID …………………………………………….. 64 5.4.4 Karakterisasi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dengan GC-MSD…………………………………... 65 BAB VI. PEMBAHASAN………………………………………. 69 BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN……………………... 77 DAFTAR PUSTAKA…………………………………………… 78
xiv SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1
Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman
10
Aglaia odorata Lour. Tabel 2.2
Data aktivitas dari beberapa jamur endofit
26
Tabel 2.3
Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh jamur marga Cladopsorium yang hidup tidak sebagai endofit
32
Tabel 2.4
Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh jamur endofit dari marga Cladopsorium sebagai endofit
33
Tabel 5.1
Penimbangan subfraksi hasil KLT preparatif
56
Tabel 5.2
Rf dan panjang gelombang maksimum subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7
59
Tabel 5.3
Kondisi HPLC untuk analisis subfraksi 12.2.6 dan 12.2.8
59
Tabel 5.4
Program waktu gradien eluen HPLC untuk subfraksi 12.2.6 dan 12.2.8
60
xv SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1
Aglaia odorata Lour
7
Gambaran makroskopis dan mikroskopis Gambar 2.2.
konidiofor Cladosporium oxysporum
28
menggunakan SEM Hasil KLT fraksi 1-2 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum dengan Gambar 2.3(a)
fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak
31
EtOAc:CHCl3 (1:1) dengan penampak noda UV dan anisaldehid-H2SO4 p Hasil KLT fraksi 3-8 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum dengan Gambar 2.3 (b)
fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak EtOAc:n-heksan dengan penampak noda
31
UV dan anisaldehid-H2SO4 p. Fraksi 6 dan 7 digabung
Gambar 2.3 (c)
Hasil KLT fraksi 9-14 dari eksrak etilasetat jamur Cl. oxysporum dengan fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak CHCl3:MeOH:Air (65:35:1) dengan penampak noda UV dan anisaldehidH2SO4 p. Fraksi 10-11 dan 13-14 digabung
31
xvi SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Hasil KLT fraksi 15-16 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum Gambar 2.3 (d)
dengan fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak CHCl3:MeOH (65:35) dengan
31
penampak noda UV dan anisaldehidH2SO4 p
Gambar 3.1
Gambar 4.1
Kerangka konseptual penelitian
49
Skema kerja pelaksanaan penelitian fraksi no 12 ekstrak etilasetat jamur Cladosporiun oxysporum dari Aglaia odorata Lour.
53
Gambar 5.1
KLT fraksi 12.2 ekstrak etil asetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak adalah Diklorometana : EtOAc = 9:1. Penampak noda UV254 serta anisaldehid-asam sulfat. Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
54
Gambar 5.2
Hasil KLT 8 subfraksi KLT preparatif subfraksi 12.2 ekstrak etil asetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak Diklorometana : EtOAc= 9:1. Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
55
xvii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Gambar 5.3
Gambar 5.4
Hasil KLT Fraksi 12.2.8 ekstrak etil asetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak kloroform : metanol= 8:2. Penampak noda dengan sinar UV panjang gelombang 254nm (kiri) dan penampak noda anisaldehid-asam sulfat pekat (kanan). Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
Hasil KLT 2 Dimensi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak Diklorometana : EtOAc= 9:1. Penampak noda UV254 serta anisaldehidasam sulfat. Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
56
57
Hasil kromatogram subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dianalisa pada panjang gelombang Gambar 5.5
58
254nm.
Hasil spektra UV subfraksi 12.2.6 dengan Rf: 0,43 dan 12.2.7 dengan Rf: 0,34 Gambar 5.6
dianalisa
dengan
KLT-densitometer
dengan eluen diklorometana : etilasetat =
59
9:1.
xviii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Gambar 5.7 (A)
Hasil kromatogram HPLC fraksi 12.2.6 61
pada panjang gelombang 254nm Profil spectra UV puncak senyawa yang
Gambar 5.7 (B)
Gambar 5.7
memiliki
waktu
retensi
7,959
menit
dengan panjang gelombang maksimum 261 nm Hasil counter plot senyawa subfraksi 12.2.6 dengan waktu retensi 7,959 menit.
(C)
Gambar 5.8(D)
61
61
Hasil kromatogram HPLC subfraksi 12.2.8 62
pada panjang gelombang 254nm
Profil spectra UV senyawa yang memiliki Gambar 5.8 (E)
waktu retensi 5,085 menit dengan panjang gelombang maksimum 261 nm
62
Profil spectra UV senyawa yang memiliki Gambar 5.8 (F)
waktu retensi 6,089 menit dengan panjang gelombang maksimum 264 nm
62
xix SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Gambar 5.8 (G)
Gambar 5.8 (H)
Profil contour plot senyawa yang memiliki 63
waktu retensi 5,085 meni
Profil contour plot senyawa yang memiliki 63
waktu retensi 6,089 menit. Hasil kromatogram fraksi 12.2.7 yang dianalisis
dengan
GC-FID
dengan 0
kolom HP-5, suhu inlet 250 C, Split Gambar 5.9
ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan
64
50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium Gambar
5.10
Hasil
kromatogram
subfraksi 12.2.6 dianalisis dengan GCMS dengan kolom HP-5, suhu inlet Gambar 5.10
2500C, Split ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C
65
dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium.
xx SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Hasil spektrum mass senyawa pada Gambar 5.11
subfraksi 12.2.6 dengan waktu retensi 24,22 menit
65
Hasil kromatogram fraksi 12.2.7 yang dianalisis
dengan
GC-MS
dengan 0
kolom HP-5, suhu inlet 250 C, Split Gambar 5.15
ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan
66
50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium Hasil
spektrum
massa
senyawa
subfraksi 12.2.7 dengan tr: 23,30 menit yang dianalisis dengan GC-MS Agilent dengan kondisi: kolom HP-5, suhu Gambar 5.16
inlet 2500C, Split ratio 50:1, flow 1.0,
66
suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium. Hasil spektrum massa senyawa 4-4’-(1Gambar 5.17
methylethylidene)bisphenol
67
xxi SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Struktur Gambar 5.18
senyawa
4-4’-(167
methylethylidene)bisphenol
Hasil prediksi fragmentasi senyawa 4-4’Gambar 5.15
(1-methylethylidene)bisphenol
68
xxii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
DAFTAR SINGKATAN DCM
: Diklorometana
EtOAc
: Etilasetat
GC
: Gas chromatography
GC-MS
: Gas chromatography-Mass spectrometry
GC-MSD
: Gas chromatography -Mass selective detector
HPLC
: High Performance Liquid Chromatography
KLT
: Kromatografi Lapis Tipis
MeOH
: Metanol
Rf
: Retardation factor
tR
: Time retention
UV
: Ultraviolet
0
: Derajat selsius
nm
: Nanometer
λmax
: Panjang gelombang maksimum
C
xxiii SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat yang penting, khususnya di negara berkembang. Infeksi dapat
disebabkan oleh bakteri, jamur, virus, dan parasit
(Kementerian Kesehatan RI, 2015). Berdasarkan hasil penelitian, 100.000 kematian disebabkan oleh penyakit infeksi seperti infeksi pernapasan bawah, HIV/AIDS, diare, tuberkulosis (TB), malaria, measles, pertusis, tetanus, meningitis, sipilis, hepatitis B, dan berbagai penyakit tropik yang lain (Restinia, 2012). Salah satu obat untuk mengatasi masalah tersebut adalah antimikroba antara lain antibakteri, antijamur, antivirus, dan antiprotozoa. Antibiotik merupakan obat yang paling banyak digunakan pada infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Intensitas penggunaan antibiotik yang relatif tinggi menimbulkan berbagai permasalahan dan merupakan ancaman global bagi kesehatan terutama resistensi bakteri terhadap antibiotik. Pada awalnya resistensi hanya terjadi ditingkat rumah sakit, tetapi lambat laun juga berkembang di lingkungan masyarakat, khususnya Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli (Kementerian Kesehatan RI, 2011). Menurut kementerian kesehatan RI (2011), Beberapa kuman resisten antibiotik sudah banyak ditemukan di seluruh dunia, antara lain Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA),
1
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Vancomycin-Resistant
Enterococci
(VRE),
2
Penicillin-Resistant
Pneumococci, Klebsiella pneumoniae yang menghasilkan ExtendedSpectrum
Beta-Lactamase
Acinetobacter
baumannii
(ESBL), dan
Carbapenem-Resistant
Multiresistant
Mycobacterium
tuberculosis. Hal ini menunjukkan resistensi antibiotika dari bakteri merupakan suatu masalah kesehatan masyarakat yang bersifat global (Yenny, 2007). Akibat adanya resistensi ini, dibutuhkan penemuan antibiotika baru untuk mengatasi masalah infeksi yang terjadi (Restinia, 2012). Antibiotika merupakan senyawa organik dengan berat molekul kecil yang dihasilkan oleh mikroorganisme dan pada konsentrasi rendah mampu melawan organisme lain (Strobel dan Daisy, 2003). Jamur memberikan potensi yang sangat besar sebagai sumber penemuan bahan baku obat baru seperti berbagai jenis antibiotika (Schulz et al., 2002). Akhir-akhir ini jamur endofit mempunyai prospek sebagai sumber diperolehnya antibiotika baru. Menurut Brunner dan Petrini, dari 80 jenis jamur endofit yang diuji 75 % mampu menghasilkan antibiotika baru (Sugijanto, 2011; Strobel dan Daisy, 2003). Contohnya Pada alga coklat Sargassum spp ditemukan jamur endofit Bacillus subtilis. Endofit ini menghasilkan senyawa
lipopeptida yang menunjukkan aktivitas
antimikroba melawan Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis. Pada tanaman Kennedia nigricans ditemukan jamur endofit Streptomyces sp. Endofit ini menghasilkan antibiotik munumbisin yang aktif terhadap bakteri Gram positif seperti Bacillus anthracis dan M. tuberculosis. Pada daun pohon Grevillea
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
3
pteridifolia ditemukan jamur endofit Streptomycete. Endofit ini menghasilkan antibiotika spektrum luas kakadumisin yang aktif terhadap bakteri Gram positif (Susilowati et al, 2015; Strobel dan Daisy, 2003). Pada tahun 1996, penemuan Taxol® sebagai senyawa antikanker dari jamur endofit Pestalotiopsis microspora
yang
diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia, menjadikan jamur endofit sebagai pusat perhatian untuk sumber alternatif penemuan obat baru. Jamur endofit merupakan mikroba yang hidup di jaringan tumbuhan tanpa menyebabkan gejala apapun pada tanaman inangnya. Sebagian besar endofit mampu menghasilkan metabolit aktif dan beberapa darinya terbukti mempunyai manfaat sebagai obat. Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa senyawa yang dihasilkan jamur endofit mempunyai potensi aktivitas biologis yang besar dan beragam diantaranya sebagai antimikroba, antivirus, antiparasit dan antitumor (Astuti et al., 2014; Santiago et al., 2014). Selain itu jamur endofit
juga
mempunyai
aktivitas
sebagai
antioksidan,
imunomodulator, antituberkulosis dan insektisida (Hussain et al., 2014). Berbagai jenis senyawa kimia yang diproduksi oleh jamur endofit yaitu terpenoid, alkaloid, fenilpropanoid, senyawa aromatik, poliketid, dan peptida (Astuti et al., 2014). Senyawa yang dihasilkan oleh jamur endofit adakalanya sama dengan tanamana inangnya, misalnya Taxol® yang dihasilkan oleh jamur endofit Taxomycetes andreanae yang diisolasi dari Taxus brevifolia. Hal ini yang menjadi
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
4
dasar pemikiran bahwa untuk mendapatkan senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh jamur endofit utamanya dapat dilakukan isolasi dari tanaman obat (Sugijanto, 2011; Santiago et al, 2014). Menurut Strobel dan Daisy (2003) ada beberapa kriteria tumbuhan inang yang dapat diisolasi mikroba endofitnya, yaitu tumbuhan yang berasal dari lingkungan yang unik, mempunyai sejarah etnobotani, tumbuh di daerah endemik, dan tumbuh di daerah yang mempunyai banyak biodiversitas/ beriklim tropis. Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan, jamur endofit di tanaman tropis terdapat pada familia Arecaceae, Orchidaceae, Musaceae, Poaceae, Piperaceae, Crassulaceae, Meliaceae, Acanthaceae, Rubiaceae, dan Sterculiaceae (Arnold et al., 2001). Hampir semua tanaman yang memiliki jaringan pengangkutan diketahui mengandung bakteri dan atau jamur endofit (Tan dan Zou, 2001). Indonesia merupakan negara yang kaya akan tumbuhan obat, salah satunya Aglaia odorata Lour (pacar cina) familia Meliaceae. Aglaia odorata Lour (pacar cina) mempunyai berkas jaringan pengangkutan, hidup di iklim tropis,
dan
termasuk
dalam
familia
Meliaceae
sehingga
memungkinkan adanya mikroba endofit yang tumbuh dan hidup didalamnya. Aglaia odorata Lour (pacar cina) telah dipercaya masyarakat sebagai terapi stimulan jantung, panas, batuk, diare, inflamasi serta luka (Kinghorn et al., 2011). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Zhang et al., (2012), pada tanaman ini berhasil diisolasi 20 jenis senyawa yaitu dua senyawa kumarin-lignoid, satu
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
5
senyawa sterol, delapan senyawa triterpenoid, enam senyawa flavonoid, dua senyawa bisamid dan satu senyawa flavagline. Senyawa flavagline dan bisamida merupakan senyawa yang baru dilaporkan dari Aglaia odorata Lour. Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Sugijanto et al., (2003), berhasil mengisolasi jamur endofit dari Aglaia odorata Lour yang diperoleh dari Kebun Raya Purwodadi dan telah didapatkan 135 isolat jamur endofit. Beberapa diantaranya telah diidentifikasi sebagai Eurotium rubrum, Cladosporium oxysporum, dan Aspergillus penicilloides. Hasil pengujian aktivitas terhadap ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour menunjukkan 6 dari 13 fraksi-fraksi ekstrak yaitu fraksi 3, 4, 5, 6, 7 dan 10 yang diuji menghambat Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739 dan Candida albicans ATCC 10231 dan 2 dari 13 fraksi ekstrak yaitu fraksi 11 dan 12 yang diuji menghambat Candida albicans ATCC 10231 (Dorra, 2011). Berdasarkan adanya bukti penelitian aktivitas antimikroba dari metabolit sekunder yang ada di fraksi-fraksi aktif ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari tanaman Aglaia odorata Lour maka dilakukan penelitian lanjutan yaitu isolasi senyawa aktif dari fraksi 12 tersebut dengan melakukan pemurnian dan karakterisasi terhadap isolat yang diperoleh.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
6
1.2 Rumusan Masalah Rumusan masalah dari penelitian ini adalah: Termasuk Senyawa apakah metabolit sekunder yang terkandung dalam fraksi 12 dari ekstrak etil asetat jamur endofit Cl. oxysporum dari A. odorata Lour? 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah melakukan purifikasi dan karakterisasi senyawa aktif yang terkandung dalam fraksi 12 ekstrak etil asetat jamur endofit Cl. oxysporum dari A. odorata Lour. 1.4 Manfaat Penelitian Diharapkan mampu mengisolasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam fraksi 12 ekstrak etil asetat jamur endofit Cl. oxysporum dari Aglaia odorata Lour. Senyawa tersebut diharapkan mampu diidentifikasi lebih lanjut dan dijadikan pertimbangan untuk pengembangan antimikroba baru dalam mengatasi masalah infeksi.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Tentang Tanaman Aglaia odorata Lour.
Gambar 2.1 Aglaia odorata Lour. (Setiawan, 2008) 2.1.1 Klasifikasi Tanaman Divisi
: Spermathophyta
Sub divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledonae
Sub Kelas
: Dialypetale
Bangsa
: Rutales
Suku
: Meliaceae
Marga
: Aglaia
Jenis : Aglaia odorata Lour
Sinonim
: Camunium sinense Rumph
(Setiawati et al., 2008) 2.1.2 Nama daerah Sumatra
: culan, pacar cina (Melayu)
Jawa
: culan, pacar culan
Borneo
: bunga maniran
7
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
8
2.1.3 Morfologi tanaman Tanaman perdu, tinggi 2 - 6 m, batang berkayu, bercabang banyak, tangkai berbintik-bintik hitam. Daun majemuk menyirip ganjil yang tumbuh berseling, anak daun 3 5. Anak daun bertangkai pendek, bentuk bundar telur sungsang, panjang 3 - 6 cm, lebar 1 - 3,5 cm, ujung runcing, pangkal meruncing, tepi rata, permukaan licin mengilap terutama daun muda. Bunga dalam malai rapat, panjangnya 5-16 cm, warna kuning, dan harum. Buah buni, bulat lonjong, warnanya merah,panjang 6-7 mm,dengan ruang 1-3, biji berjumlah 1-3 buah. Pacar cina sering ditanam di kebun dan pekarangan sebagai tanaman hias, atau tumbuh liar di ladang-ladang yang cukup mendapat sinar matahari. Di Indonesia tumbuhan ini dapat ditemui tumbuh di pulau Sumatera, Kalimantan, Jawa, Sulawesi, Bali dan Flores (Setiawati et a.l, 2008). 2.1.4 Penyebaran dan habitat Daerah penyebaran tumbuhan meliputi India, Cina bagian selatan, Laos, Asia Tenggara, Australia bagian utara dan kepulauan di Samudra Pasifik. Di Indonesia tumbuhan ini dapat ditemui tumbuh di pulau Sumatera, Kalimantan, Jawa, Sulawesi, Bali dan Flores. Pacar cina sering ditanam di kebun dan pekarangan sebagai tanaman hias, atau tumbuh liar di ladang-ladang yang cukup mendapat sinar matahari (Setiawati et al., 2008).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
9
2.1.5. Kandungan Kimia Kandungan senyawa berkhasiat yang terdapat dalam daun Aglaia senyawa
odorata
turunannya,
antara lain rokaglamida dan tiga yaitu
desmetil-rokaglamida,
metil
rokaglat dan rokaglaol (Setiawati et al., 2008). Penelitian terbaru yang telah dilakukan oleh Zhang et al., (2012) pada tanaman ini berhasil diisolasi 20 senyawa yaitu dua senyawa kumarin-lignoid, satu senyawa sterol, delapan senyawa triterpenoid, enam senyawa flavonoid, dua senyawa bisamid dan satu senyawa flavagline. Senyawa flavagline dan bisamida merupakan senyawa yang baru dilaporkan dari Aglaia odorata Lour.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
10
Tabel 2.1 Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman Aglaia odorata Lour. Golongan metabolit
Nama metabolit
Struktur molekul
Berat molekul
Acuan
8-(7’,8’,9’-propanetriolCoumarinolignoids
4’-methoxy-3’-Ophenylpropanoid)-7hydroxy-6-
Zhang et 404,11
al., (2012)
methoxycoumarin
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
11
Zhang et cleomiscosin A
386.35
al., (2012)
Zhang et -sitosterol Sterol
SKRIPSI
414,70
al., (2012)
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
12
Zhang et 456,70
asam betulinat
al., (2012)
Triterpenoid Zhang et 472,69 alphitol acid
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
al., (2012)
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
13
Zhang et asam ursolat
456,70
al., (2012)
Zhang et cabraleahydroxylactone
416,64
al., (2012)
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
14
Zhang et xanthocerasic acid
470,68
al., (2012)
20S,24S-dihydroxydammar-25-en-3-one
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
458,72
Zhang et al., (2012)
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
15
24R,25-dihydroxydammar-20-en-3-one
Dammar-20-ene3β,24(R),25-triol
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
Zhang et 458,72
al., (2012)
Zhang et 460,73
al., (2012)
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
16
Zhang et 312,31 Sideroxylin
al., (2012)
Flavonoid Zhang et 298,29 8-demethylsideroxylin
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
al., (2012)
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
17
2’-hydroxy-4,4’,6’trimethoxy-chalcone
(2R,3R)-(+)-4’,5,7trimethoxydihydroflavonol
Naringenin trimethyl ether
SKRIPSI
Zhang et 314,33
al., (2012)
Zhang et 330,33
al., (2012) Zhang et
330,33
al., (2012)
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
18
2,3-dihydro-5-hydroxy4’,7-dimethoxyflavon
Zhang et 300,31
al., (2012)
Zhang et Odorine
300,40
al., (2012)
Bisamide Zhang et 316,40
Odorinol
al., (2012)
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
19
Zhang et Flavagline
Rocaglaol
434.17
al., (2012)
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
20
4’-o- demethyldeacetylaglaxiflorin A
Peng et 655.2632
al., (2015)
Lignan
Peng et 3’-methoxy-Ndemethylrocaglamide
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
544.1947
al., (2015)
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
21
2.1.6 Kegunaan Tanaman Pacar cina telah dipercaya masyarakat sebagai terapi stimulan jantung, panas, batuk, diare, inflamasi serta luka (Kinghorn et al., 2011). Bagian tanaman pacar cina memiliki beberapa khasiat antara lain daun berkhasiat sebagai insektisida, penghambat makan (antifeedant), penghambat perkembangan serangga (growth regulator), mengatasi memar, bisul, darah haid banyak, bau badan dan diare. Bagian bunga berkhasiat untuk mengatasi perut kembung, sukar menelan,
batuk,
pusing
dan
mempercepat
persalinan
(Setiawati et al., 2008). 2.2 Tinjauan tentang jamur Jamur merupakan organisme eukariotik dan dianggap sebagai kelompok spesifik yang memiliki berbagai manfaat karena dapat digunakan untuk pengobatan, produksi makanan, kontrol polusi dan agrikultural (Moretti dan Sarocco, 2015). Jamur
tidak
mampu
melakukan
fotosintesis
untuk
memproduksi nutrisi, sehingga kebutuhan nutrisinya diperoleh dari lingkungan maupun organisme lain, oleh karena itu jamur disebut sebagai organisme heterotrof (Subandi, 2010). Jamur dapat bersifat saprofit dan parasit. Jamur saprofit mendapatkan sumber nutrisi dari benda mati sedangkan Jamur parasit memperoleh sumber nutrisi dari organisme hidup (Pratiwi, 2008). Pada jamur terdapat dua istilah kapang (mold) dan khamir (yeast). Kapang merupakan Jamur yang berfilamen dan
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
22
multiseluler. Khamir merupakan bentuk jamur yang berupa sel tunggal (Pratiwi, 2008). Jamur bereproduksi secara aseksual (pembelahan, pembentukan tunas atau spora) maupun seksual (pembelahan inti dari kedua induk). Berdasarkan ciri-ciri spora seksualnya jamur diklasifikasikan menjadi empat kelas utama yaitu Phycomycetes, Deuteromycetes
Ascomycetes, (Pratiwi,
2008).
Basidiomycetes, Untuk
tumbuh
dan Jamur
memerlukan kondisi kelembapan yang tinggi, persediaan bahan organik, dan oksigen yang cukup. Lingkungan yang hangat dan lembab dapat mempercepat pertumbuhannya (Pratiwi, 2008). 2.2.1 Jamur endofit Endofit
merupakan
bakteri
(termasuk
Actinomycetes) atau jamur yang siklus hidupnya berada secara intra dan/atau ekstra seluler dalam jaringan sehat dari tanaman inang, yang pada umumnya tidak menyebabkan gejala penyakit pada inangnya (Fouda et al., 2015). Bakteri dan/atau jamur endofit ditemukan hampir pada semua spesies tanaman yang mempunyai jaringan pembuluh (Tan dan Zou, 2001). Secara harfiah, kata endofit berarti "di dalam tanaman" (Endon = dalam, Phyton = tanaman). Penggunaan istilah tersebut mengandung arti yang sangat luas, misalnya bakteri, jamur, tanaman dan serangga pada tanaman, dan juga untuk alga. Namun jamur lebih banyak diteliti daripada bakteri karena memiliki ketahanan terhadap perubahan lingkungan yang lebih
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
23
baik dibandingkan bakteri dan waktu pertumbuhannya lebih lambat dibandingkan dengan bakteri sehingga faktor faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhannya lebih dapat dikendalikan (Pratiwi, 2015). Endofit dapat berupa bakteri, jamur , Aktinomycetes dan alga (Gond et al., 2011). Endofit lebih banyak diisolasi dari jamur (Strobel dan Daisy, 2003). Hal ini dikarenakan menurut Keller and Holly (1998) Jamur endofit memiliki ketahanan terhadap perubahan lingkungan yang lebih baik dibandingkan bakteri dan waktu pertumbuhannya lebih lambat dibandingkan dengan bakteri sehingga
faktor
faktor
yang
berpengaruh
terhadap
pertumbuhannya lebih dapat dikendalikan (Pratiwi, 2015). Jamur endofit dapat membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya (Arnold et al., 2001). Hubungan antara jamur endofit dengan tanaman inangnya bervariasi dari saprofit, parasit, hingga mutualistik (Strobel dan Daisy, 2003). Jamur endofit akan bersifat patogen apabila tanaman inang mengalami stres dan/atau usia tanaman inang sudah mulai tua (Tan dan Zou, 2001). Menurut Stroobel and Daisy, (2003) ada beberapa kriteria tumbuhan inang yang dapat diisolasi mikroba endofitnya yaitu, tumbuhan yang berasal dari lingkungan yang unik, mempunyai sejarah etnobotani, tumbuh di daerah endemik dan tumbuh di daerah yang kaya akan biodiversitas/ beriklim tropis. Hampir semua tanaman yang memiliki jaringan pengangkutan diketahui
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
24
mengandung bakteri dan atau jamur endofit. Pada umumnya jamur
endofit
bersifat
menguntungkan
bagi
tumbuhan
inangnya. Endofit mampu meningkatkan kelarutan dari mineral fosfat, memproduksi siderofores atau ammonia, serta mampu mensistesis beberapa faktor pertumbuhan bagi tumbuhan inang seperti auxin, ACC, dan IAA sehingga berperan penting dalam memperbaiki asupan nutrisi tumbuhan inang. Selain itu, endofit mampu meningkatkan pertahanan tumbuhan inang terhadap infeksi dengan membentuk antibiotik dan menstimulasi mekanisme pertahanan tumbuhan inangnya (Andreolli et al., 2015). Faktor genetik, perkembangan dan kondisi lingkungan tempat tumbuh endofit mempengaruhi profil dari metabolit sekunder yang dihasilkan (Roopa, 2015). Metabolit sekunder yang dihasilkan akan lebih aktif dan spesifik jika diisolasi dari mikroba yang hidup pada biotop yang spesifik. Mikroba endofit terutama yang hidup di lingkungan yang spesifik atau bahkan di lingkungan yang tidak umum sering digunakan sebagai sumber penemuan senyawa bioaktif baru (Prihatiningyas, 2005). Jamur endofit yang diisolasi dari daerah tropis lebih potensial sebagai sumber senyawa bioaktif jika dibandingkan dengan jamur endofit yang diisolasi dari daerah temperate (Strobel dan Daisy, 2003). Misalnya jamur endofit Thievalia polygonoperda yang diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Fibraurea chloroleuca) yang tumbuh di hutan Kalimantan memiliki daya antibakteri yang kuat (Prihatiningtias, 2005). Jamur endofit merupakan
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
25
sumber metabolit yang kaya dengan aktivitas biologis yang beragam.
Beberapa
peneliti
melaporkan
senyawa
yang
dihasilkan jamur endofit mempunyai potensi aktivitas biologis yang
sangat
besar
dan
beragam
diantaranya
sebagai
antimikroba, antivirus, antiparasit, antitumor, antioksidan, imunomodulator, antituberkulosis dan insektisida (Astuti et al., 2014; Hussain et al., 2014). Beberapa aktivitas dari jamur endofit disajikan dalam tabel berikut:
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
26
Tabel 2.2 Beberapa aktivitas dari jamur endofit Jamur endofit penghasil
Tanaman inang
Lewia infectoria
Tachia grandifolia
Nigrospora oryzae
Nyctanthes arbortristis
Penicillium chrysogenum
Asclepias sinaica
Nama metabolit
pyrrocidine C
Aktivitas terhadap
Acuan
Staphylococcus aureus
Casella et al.,2013
(Antibakteri)
-
-
Pseudomonas aeruginosa dan Shigella sp (Antibakteri)
Gond et al., 2012
Candida albicans dan Escherisia coli
Fouda et al., 2015
(Antibakteri)
Paraphaeosphaeri a nolinae
Pleosporales
Artemisia annua
Pinus strobus
paranolin
Dihydrobenzofu ran Xanthene
Botryosphaeria rhodina
SKRIPSI
Salacia oblonga
Taxol
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
Antikanker
Richardson et al., 2015
Microbotryum violaceum dan Bacillus subtilis
Richardson et al., 2015
Antikanker
ARMILA F.
Roopa et al., 2015
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
27
Bacillus subtilis Phoma sp
Cinnamomum mollissimum
4hydroximellein
(antibakteri)
Santiago et al., 2014
Antikanker MRSA
Bacillus subtilis
Sargassum spp
lipopeptides
Dan Staphylococcus epidermidis
Susilowati et al., 2015
(Antibakteri)
Streptomyces sp
Kennedia nigricans
munumbisin
Bacillus anthracis dan M. Tuberculosis
Strobel dan Daisy, 2003
(Antibakteri)
Streptomycete.
Pestalotiopsis microspora
Chaetomiu sp
SKRIPSI
Grevillea pteridifolia
kakadumisin
Terminalia morobensis
pestacin and isopestacin
Eugenia jambolana
Bakteri Gram positif (Antibakteri)
Strobel dan Daisy, 2003
Antioksidan
Fenolik
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
Yadav et al., 2014
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
28
2.2.2 Tinjauan tentang Cladosporium oxysporum
Gambar 2.2 Gambaran makroskopis dan mikroskopis konidiofor Cladosporium oxysporum menggunakan SEM (De Hoog, 2000). 2.2.2.1 Klasifikasi Cladosporium oxysporum Kingdom : Fungi Phylum
: Ascomycota
Kelas
: Ascomycetes
Ordo
: Mycosphaerellales
Famili
: Mycosphaerallaceae
Genus
: Cladosporium
Spesies : Cladosporium oxysporum Berk. & Curtis (De Hoog, 2000) 2.2.2.2 Ciri Morfologi Mikroorganisme endofit Cladosporium oxysporum memiliki ciri-ciri
miselium internal dan dangkal
atau
superfisial, hifa longgar bercabang, lebar 1-4 µm, septae yang tidak berkerut, subhialin berwarna hijau pucat lebih gelap pada
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
29
dasar konidiofora, tengah berwarna hijau zaitun kecoklatan, lembut, dinding sel kadang tipis kadang tebal, kadang tertutup senyawa seperti polisakarida, seringkali membentuk tali (Bensch et al., 2010; Bensch et al., 2012). 2.2.2.3 Habitat Cladosporium oxysporum diisolasi dari udara, tanah, pada bagian mati dari daun dan ranting herbal dan tanaman berkayu serta bahan organik lain, tersebar luas terutama di daerah subtropis (Bensch et al., 2012). Jamur ini diketahui bersifat saprofit dan parasit pada tanaman dan patogen pada manusia yang
menyebabkan
reaksi
alergi
serius
pada
saluran
pernapasan, infeksi pada kulit, mata dan kuku (Huyan et al., 2012; Tasic et al., 2007). 2.2.2.4
Kandungan
metabolit
sekunder
bioaktif
marga
Cladopsorium Sampai saat ini dilaporkan bahwa beberapa spesies dari marga Cladosporium yang hidup sebagai endofit mampu menghasilkan metabolit bioaktif seperti Aconitine, Bulgarein, Cladosporol, Huperzine A, Paclitaxol, 3-Phenyl-2-propenoic acid,
Bis(2-ethyl-hexyl)phthalate,
Sumiki’s
acid,
acetyl
Sumiki’s acid, Brefeldin A, Pandangolide 1a, pandangolide 1, Pandangolide 2 dan iso cladospolide B (Yang et al., 2012; Zhang et et al., 2007; Hua Qi et al., 2008; Assante et al., 2005; Jadulco et al., 2001; Raj et al., 2014; Gesner et al., 2005). Beberapa spesies dari marga Cladosporium yang hidup bebas
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
30
seperti C. fulvum, dan C. cladosporioides juga diketahui menghasilkan
mikotoksin
emodin
(2-methyl-4,5,7-
trihydroxyanthraquinone) yang dapat menyebabkan diare pada manusia. C. cladosporioides juga mengahasilkan toksin cladosporin (3,4-dihydro-6,8-dihydroxy-3-(6-methyltetrahydropyran-2-ylmethyl)
isocoumarin)
yang
bersifat
sitotoksik
(Ogórek, 2012). 2.2.3 Tinjauan Tentang Ekstrak Etilasetat Jamur Endofit Cladosporium Oxysporum Ekstrak
etilasetat
jamur
endofit
Cladosporium
oxysporum diperoleh dari filtrat ekstraksi jamur dengan pelarut etilasetat. Ekstrak etilasetat jamur endofit Cladosporium oxysporum
dipisahkan
dengan
kromatografi
kolom
menggunakan fase gerak gradien. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum diduga mengandung golongan senyawa steroid dan flavonoid yang bersifat sebagai antioksidan dan senyawa terpenoid yang aktif dalam melawan bakteri, jamur, virus dan protozoa (Putri, 2014; Winarti, 2005). Hasil pengujian aktivitas terhadap ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour menunjukkan bahwa 6 ( fraksi 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 dan 12) dari 13 fraksi-fraksi yang diuji menghambat Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739 dan Candida albicans ATCC 10231 (Dorra, 2011).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
A
B
C
31
D
Gambar 2.3 (a) Hasil KLT fraksi 1-2 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak EtOAc:CHCl3 (1:1) dengan penampak noda UV dan anisaldehid-H2SO4 p (b) Hasil KLT fraksi 3-8 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak EtOAc:n-heksan dengan penampak noda UV dan anisaldehid-H2SO4 p. Fraksi 6 dan 7 digabung (c) Hasil KLT fraksi 9-14 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak CHCl3:MeOH:Air (65:35:1) dengan penampak noda UV dan anisaldehid-H2SO4 p. Fraksi 10-11 dan 13-14 digabung (d) Hasil KLT fraksi 15-16 dari eksrak etilasetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60 F254nm; fase gerak CHCl3:MeOH (65:35) dengan penampak noda UV dan anisaldehid-H2SO4 p (Dorra, 2011).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
32
Tabel 2.3 Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh jamur marga Cladopsorium yang hidup tidak sebagai endofit Nama metabolit
Jamur penghasil
Berat Molekul
Emodin (2-methyl-4,5,7trihydroxyanthraquinone)
Cladosporium. fulvum
270.2369
dihydro-6,8-dihydroxy-3-(6methyltetrahydro-pyran-2ylmethyl)isocoumar
Cladosporium cladosporioides
SKRIPSI
Struktur molekul
292.327
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
Acuan
Ogórek,et al., 2012
Ogórek et al., 2012
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
33
Tabel 2.4 Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh jamur endofit dari marga Cladosporium sebagai endofit Nama metabolit
Tanaman Jamur endofit
inang
Asal inang
Berat Molekul
Struktur Molekul
Acuan
penghasil
Aconitine
SKRIPSI
Cladosporium cladosporioides
Aconitum leucostomum
Terrestrial
645.7370
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
Yang et al., 2012
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
34
Huperzine A
Cladosporium cladosporioide s LF70
Pandangolid e 1a
Cladosporium sp.
Cladosporium oxysporum
Paclitaxol
SKRIPSI
Terestrial
242.3162
Zhang et al.,2011
Niphates rowi
Sponge
244.2840
Gesner et al, 2005
Tidak disebutkan
Terestrial
853.9061
Raj et al., 2014
Huperzia serratia
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
35
Iso cladopsolide B
Cladosporium sp.
Niphates rowi
3-Phenyl-2propenoic acid
Cladosporium sp.
Tidak disebutkan
SKRIPSI
Sponge
sponge
228.2850
Gesner et al, 2005
148.05
Hua Qi et al., 2008
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
36
Sumiki’s acid
Cladosporium herbarum
Callyspongi a aerizusa
sponge
142.1094
Jadulco et al., 2001
acetyl Sumiki’s acid
Cladosporium herbarum
Callyspongi a aerizusa
sponge
184.1461
Jadulco et al., 2001
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
37
Brefeldin A
Pandangolid e2
SKRIPSI
Cladosporium sp.
Quercus variabilis
Terestrial
280.3593
Wang et al., 2006
Cladosporium herbarum
Callyspongi a aerizusa
Sponge
318.386
Jadulco et al,2001
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
38
2.3 Tinjauan antibiotik Antibiotik merupakan zat kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme (Aktinomycetes, fungi dan bakteri)
yang dapat
menghambat atau membasmi mikroorganisme lain (Goodman dan Gilman, 2011). Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba (penyebab infeksi pada manusia) ditentukan harus memiliki toksisitas selektif setinggi mungkin, artinya obat antimikroba harus bersifat sangat toksik untuk mikorba tetapi relatif tidak toksik untuk hospes. Berdasarkan spektrumnya antibiotika dibagi menjadi dua kelompok, yaitu spektrum luas (broad spectrum) seperti tetrasiklin dan kloramfenikol dan spektum sempit (narrow spectrum) seperti benzil penisilin dan streptomisin (Gunawan, 2012). Antibiotik memiliki cara kerja yang berbeda-beda dalam membunuh
atau
menghambat
pertumbuhan
mikroorganisme.
Berdasarkan mekanisme kerjanya antibiotika dibagi dalam lima kelompok, yaitu antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel bakteri, antibiotik yang bekerja dengan merusak membran sel mikroorganisme, antibiotik yang menghambat sintesis protein mikroorganisme dengan mempengaruhi subunit ribosom 30S dan 50S, antibiotik yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba, dan antibiotik yang menghambat enzim yang berperan dalam metabolisme folat (Amin, 2014).
38
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
39
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
2.4 Tinjauan fraksinasi dan kromatografi 2.4.1 Tinjauan tentang fraksinasi Fraksinasi
merupakan
suatu
proses
pemisahan
komponen dari ekstrak berdasarkan sifat kepolaran atau ukuran molekul (Sharker dan Nahar, 2012). 2.4.2 Tinjauan tentang kromatografi Kromatografi merupakan metode pemisahan yang berdasarkan distribusi senyawa antara dua fase pemisah yaitu fasa diam dan fasa gerak. Sampel dilarutkan dalam fase gerak yang berupa gas atau cair. Fase gerak mengelusi fase diam yang ditempatkan dalam suatu kolom maupun plat. Fase diam dapat berupa zat padat atau cair. Fase gerak dan fase diam dipilih sedemikian rupa sehingga sampel terdistribusi diantara kedua fase bergantung pada afinitas terhadap keduanya (Spangenberg et al., 2011; Skoog et al., 2007). 2.4.2.1 Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis merupakan bagian dari kromatografi cair dimana fase gerak berupa cairan dan fase diam berupa selapis lapisan tipis pada permukaan plat datar. Mekanisme pemisahan kromatografi lapis tipis yaitu adsorpsi. Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk menganalisa komponen
dalam
campuran,
mendeteksi
kontaminan,
mengetahui kesempurnaan reaksi dan memilih sistem eluen untuk kromatografi kolom (Skoog et al., 2007).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
40
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Prinsip dasar dari kromatografi lapis tipis adalah sejumlah tertentu solut ditotolkan pada fase diam yang berupa lapisan tipis sorbent sebagai zona awal eluasi untuk kemudian dikeringkan. Fase gerak yang berupa campuran pelarut organik murni dikembangkan dalam suatu chamber tertutup selanjutnya plat fase diam dieluasi dengan fase gerak yang telah
disiapkan
(Sherma
et
al.,
2003).
Fase
gerak
menyebabkan solut bermigrasi sepanjang lintasan pada fase diam melalui suatu gaya kapilaritas (Skoog et al., 2007). Pada akhir dari eluasi, didapat suatu jarak yang ditempuh noda solut, solut yang bergerak dengan pelan berarti memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase diam sedangkan solut yang bergerak dengan cepat dapat diartikan memiliki afinitas yang rendah terhadap fase diam atau kelarutan yang lebih tinggi terhadap fase gerak (Gritter et al., 1991). Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 9-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika gel, aluminium oxida, kieselguhr, magnesium oxida, dan magnesium silicate, sementara mekanisme pemisahan yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi (Spangenberg et al., 2011).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
41
Sistem fase gerak yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak: - Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif. - Fase gerak harus mempunyai toksisitas rendah dan bersifat inert - Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2 - 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. - Pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan. - Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masingmasing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam. Reprodusibilitas diperoleh bila volume sampel yang
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
42
ditotolkan paling sedikit 0,5 µl, jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 µl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Sampel setelah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel. Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai
ketinggian
Penjenuhan
lempeng
yang
telah
ditentukan).
fase gerak dilakukan dengan cara melapisi
bejana dengan kertas saring, fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan fase gerak telah jenuh (Spangenberg et al., 2011). 2.4.2.2 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLT preparatif hampir selalu digunakan sebagai langkah pemurnian akhir dalam prosedur isolasi. Ketebalan penjerap yang sering dipakai adalah 0,5-2 mm, ukuran plat yang digunakan untuk KLT preparatif biasanya 20x20 cm atau 20x40 cm. Penjerap yang paling umum digunakan untuk KLT preparatif adalah silika gel. Sebagai acuan, KLT preparatif sebaiknya untuk memisahkan campuran senyawa
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
43
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
yang terdiri dari tidak lebih dari tiga senyawa. Jumlah sampel yang dapat dipisahkan adalah 10-1000 mg (Sherma et al., 2003). 2.4.2.3 Kromatografi Lapis Tipis dua arah KLT dua arah atau KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponenkomponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karena nilai Rf juga hampir sama. Selain itu dua sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan
pada
suatu
campuran
tertentu
sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama. KLT dua arah dilakukan dengan melakukan penotolan sampel pada lempeng kemudian dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu
sisi
kemudian lempeng diangkat,
o
dikeringkan, diputar 90 C dan diletakkan kedalam bejana kromatografi yang berisi sistem fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah lempeng kemudian dilakukan kromatografi lagi (Gandjar dan Rohman, 2012). 2.5 Tinjauan tentang karakterisasi 2.5.1 KLT-Densitometer Densitometer merupakan alat untuk mengukur sinar balik yang dipantulkan atau yang dipancarkan oleh lempeng
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
44
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KLT yang mengandung analit (Gandjar dan Rohman, 2012). Hasil pengukuran dari densitometer berupa kromatogram dengan data area sebagai sumbu Y dan Rf sebagai sumbu X. 2.5.2 HPLC HPLC merupakan metode pemisahan senyawa kimia oleh perbedaan kecepatan elusi (Gandjar dan Rohman, 2012). HPLC dapat digunakan untuk pemisahan, pemurnian dan identifikasi senyawa kimia dengan mendasarkan pada waktu retensi senyawa kimia tersebut (Gandjar dan Rohman, 2012). Detektor yang sering digunakan pada HPLC adalah detektor PDA. Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis yang mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda (antara 190-400 nm) dalam sekali proses ((Gandjar dan Rohman, 2012). 2.5.3 GC GC merupakan metode pemisahan senyawa organik yang mudah menguap (Fowlis, 1998). Gas kromatografi merupakan salah satu teknik kromatografi yang menggunakan prinsip
pemisahan
campuran
berdasarkan
perbedaan
kecepatan migrasi komponen-komponen penyusunnya. Gas kromatografi biasa digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa yang terdapat pada campuran gas (Fowlis, 1998). 2.5.4 Speketroskopi Masa (MS) Spektroskopi masa (Mass Spectroscopy) adalah salah satu teknik analisis yang berguna untuk mengidentifikasi
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
45
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
senyawa yang belum diketahui identitasnya dan juga berguna untuk elusidasi struktur. Prinsip dari spektroskopi masa adalah melihat pola fragmentasi dari sampel yang telah diubah menjadi bentuk ion melalui suatu proses ionisasi. Teknik ini merupakan teknik yang sensitif, spectra yang bagus tetap dapat dihasilkan meski dengan ukuran sampel yang kecil (beberapa mikrogram). Teknik ini terbagi menjadi ESI-MS,
SKRIPSI
LC-MS,
dan
HR-MS
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
(Kjer,
2009)
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB III KERANGKA KONSEPTUAL Endofit merupakan bakteri (termasuk Actinomycetes) atau jamur yang siklus hidupnya berada secara intra dan/atau ekstra seluler dalam jaringan sehat dari tanaman inang, yang pada umumnya tidak menyebabkan gejala penyakit pada inangnya (Fouda et al., 2015). Bakteri dan/atau jamur endofit ditemukan hampir pada semua spesies tanaman yang mempunyai jaringan pembuluh (Tan dan Zou, 2001). Endofit lebih banyak diisolasi dari jamur (Strobel dan Daisy, 2003). Hal ini dikarenakan menurut Keller and Holly (1998) jamur endofit memiliki ketahanan terhadap perubahan lingkungan yang lebih baik dibandingkan bakteri dan waktu pertumbuhannya lebih lambat dibandingkan dengan bakteri sehingga faktor faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhannya lebih dapat dikendalikan (Pratiwi, 2015). Sebagian besar endofit mampu menghasilkan metabolit aktif dan beberapa darinya terbukti mempunyai manfaat sebagai obat (Astuti et al., 2014). Jamur endofit dapat membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya (Arnold et al., 2001). Hubungan antara jamur endofit dengan tanaman inangnya bervariasi dari saprofit, parasit, hingga mutualistik (Strobel dan Daisy, 2003). Jamur endofit akan bersifat patogen apabila tanaman inang mengalami stres dan/atau usia tanaman inang sudah mulai tua (Tan dan Zou, 2001). Metabolit sekunder yang dihasilkan jamur endofit meliputi berbagai golongan senyawa kimia seperti isoprenoid, poliketida,
46
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
47
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
turunan asam amino, terpenoid, steroid, xanton, fenol, isokumarin, benzopiranon, tetralon, sitokalasin, eniatin, alkaloid, fenilpropanoid, senyawa aromatik, dan peptida (Schulz et al., 2002; Astuti et al., 2014). Beberapa peneliti melaporkan senyawa yang dihasilkan jamur endofit mempunyai potensi aktivitas biologis yang sangat besar dan beragam diantaranya sebagai antimikroba, antivirus, antiparasit, antitumor,
antioksidan,
imunomodulator,
antituberkulosis
dan
insektisida (Astuti et al., 2014; Hussain et al., 2014). Aglaia odorata Lour merupakan salah satu diantara beragam tanaman berkhasiat obat yang digunakan masyarakat Indonesia. Bagian tanaman pacar cina memiliki beberapa khasiat antara lain daun
berkhasiat
(antifeedant),
sebagai
penghambat
insektisida,
penghambat
makan
serangga
(growth
perkembangan
regulator), mengatasi memar, bisul, darah haid banyak, bau badan dan diare. Bagian bunga berkhasiat untuk mengatasi perut kembung, sukar menelan, batuk, pusing dan mempercepat persalinan (Setiawati et al., 2008). Selain itu, ekstrak Aglaia odorata Lour mempunyai khasiat sebagai antimiroba, insektisida, dan sebagai wangi-wangian (Kinghorn et al., 2011). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Zhang et al., (2012), pada tanaman ini berhasil diisolasi 20 jenis senyawa yaitu dua senyawa kumarin-lignoid, satu senyawa sterol, delapan senyawa triterpenoid, enam senyawa flavonoid, dua senyawa bisamid dan satu senyawa flavagline. Senyawa flavagline dan bisamida merupakan senyawa yang baru dilaporkan dari Aglaia odorata Lour.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
48
Kriteria tumbuhan inang untuk dapat diisolasi mikroba endofitnya yaitu Berasal dari lingkungan unik, sejarah etnobotani, tumbuh di daerah endemik, dan tumbuh di daerah biodiversitas tinggi/ daerah beriklim tropis, memiliki berkas pengangkutan (Stroobel dan Daisy, 2003). Cladosporium oxysporum merupakan salah satu dari 135 jamur endofit yang berhasil diisolasi dari Aglaia odorata Lour yang diperoleh dari Kebun Raya Purwodadi (Sugijanto et al, 2003). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum diduga mengandung golongan senyawa steroid atau
flavonoid yang bersifat sebagai
antioksidan dan senyawa terpenoid yang aktif dalam melawan bakteri, jamur, virus dan protozoa.(Putri, 2014; Laksmi, 2014). Senyawa antimikroba dari Cladosporium sp yaitu Brefeldin A, Sumiki’s acid, acetyl Sumiki’s acid, iso cladospolide B, 3-Phenyl-2propenoic acid, Aconitine (Yang et al., 2012; Wang et al., 2007; Jadulco et al., 2001; Gesner et al., 2005). Hasil pengujian aktivitas terhadap ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour menunjukkan bahwa 6 dari 13 fraksi-fraksi yang diuji menghambat Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739 dan Candida albicans ATCC 10231 (Dorra, 2011). Penelitian ini merupakan kelanjutan dari penelitian terdahulu yang bertujuan untuk isolasi dan karakterisasi untuk mendapatkan senyawa metabolit sekunder yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antimikroba dari fraksi aktif tersebut. Kerangka konseptual penelitian disajikan dalam gambar 3.1
48 SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
49
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Endofit merupakan bakteri (termasuk Actinomycetes) atau jamur yang hidup secara intra dan/atau ekstra seluler dalam jaringan sehat dari tanaman inang, pada umumnya tidak menyebabkan gejala penyakit pada tanaman inangnya (Fouda et al., 2015).
Kriteria tumbuhan inang untuk dapat
diisolasi
mikroba
endofitnyaBerasal lingkungan
unik,
dari Sejarah
etnobotani, Tumbuh di daerah endemik, dan Tumbuh di daerah biodiversitas tinggi/
Beberapa penelitian telah melaporkan
tropis,
bahwa senyawa yang dihasilkan jamur endofit
pengangkutan
mempunyai potensi aktivitas biologis yang sangat
Daisy, 2003).
besar
dan
beragam
diantaranya
beriklim
Memiliki (Strobel
berkas dan
sebagai
:Antimikroba, Antivirus, Antiparasi, Antitumor, Antioksidan, Imunomodulator, Antituberkulosis, Insektisida (Astuti et al., 2014; Hussain et al., 2014).
Ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum mengandung golongan senyawa steroid atau flavonoid yang bersifat sebagai antioksidan dan senyawa terpenoid yang aktif dalam melawan bakteri, jamur, virus dan protozoa (Putri, 2014; Laksmi, 2014).
Tanaman pacar cina memiliki khasiat : daun sebagai insektisida, penghambat makan (antifeedant), penghambat perkembangan serangga (growth regulator), mengatasi memar, bisul, darah haid banyak, bau badan dan diare. Bagian bunga untuk mengatasi perut kembung, sukar menelan, batuk, pusing, dan mempercepat persalinan. Ekstrak pacar cina berkhasiat sebagai bakterisida, insektisida, dan angiwangian. (Kinghorn et al., 2011; Setiawati et al., 2008).
Senyawa antimikroba dari Cladosporium sp : Brefeldin A -> Quercus variabilis Sumiki’s acid -> Callyspongia aerizusa iso cladospolide B -> Niphates rowi (Wang et al., 2007; Jadulco et al., 2001; Gesner et al., 2005). Aktivitas ekstrak EtOAc jamur endofit Cl. oxysporum dari A. odorata Lour 6 dari 13 fraksi-fraksi yang diuji menghambat S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 8739 dan C. albicans ATCC 10231 (Dorra, 2011).
Isolasi dan karakterisasi senyawa metabolit sekunder dari fraksi 12 jamur
49 dari tanaman Aglaia odorata Lour. Cladosporium oxysporum Gambar 3.1 Skema kerangka konseptual penelitian SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Tempat penelitian Penelitian Bioteknologi
dilakukan
Departemen
di Kimia
Laboratorium
Mikrobiologi-
Farmasi
Laboratorium
dan
Fitokimia Departemen Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. 4.2 Sampel Penelitian Sampel yang digunakan adalah fraksi 12 ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum yang diisolasi dari tanaman inang Aglaia odorata Lour yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya (Sugijanto et al.,2006). Determinasi C.oxysporum dilakukan oleh Arnulf Diesel di Institut fur Pharmazeutische Biologie, HeinrichHeine-Universitat Dusseldof, Jerman. Jamur ditumbuhkan pada media padat (malt extract agar) dan diinokulasi pada media tersebut selama 7 hari kemudian dipindahkan ke media cair malt extract dan diinkubasi selama 28-30 hari. Setelah dipanen jamur di ekstraksi menggunakan pelarut etil asetat. Ekstrak etil asetat difraksinasi menggunakan kolom silica gel dan menghasilkan 13 fraksi untuk dilakukan uji aktivitas antimikroba, hasil akhir didapatkan bahwa 6 dari 13 fraksi mempunyai aktivitas antimkroba terhadap Escherichia coli ATCC 8739, Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Dorra, 2011).
50 SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
51
4.3 Pelarut dan Pereaksi Pelarut yang digunakan yaitu metanol p.a (J.T Baker), etil asetat p.a (J.T Baker), kloroform p.a (Merck), n-hekasan p.a (J.T Baker), dan diklorometana p.a (J.T Baker). KLT menggunakan plat KLT silica gel 60 F254 Alumunium sheets 20x20 cm (Merck). Deteksi noda dilakukan dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm dan pereaksi penampak noda anisaldehid-asam sulfat pekat. 4.4 Alat-alat Alat yang digunakan yaitu timbangan analitik, chamber kromatografi CAMAG, lampu UV, ultrasonik, UFHPLC Shimadzu 20D, spektroskopi masa, kolom kromatografi ukuran diameter 2 cm dan panjang 50 cm, dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium. 4.5 Pelaksanaan Penelitian 4.5.1 Optimasi Eluen Fraksi 12 ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum yang diisolasi dari tanaman inang Aglaia odorata Lour dilarutkan dengan etil asetat q.s dan diultrasonik selama 5 menit. Fraksi 12 dianalisis menggunakan KLT Silica gel 60 F254 dengan berbagai macam eluen dan perbandingan yang mampu memberikan pemisahan yang paling baik. Penampak noda yang digunakan adalah sinar UV 254nm dan 366nm dan anisaldehid- Asam sulfat pekat.
51 SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
52
4.5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif Fraksi 12 ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum yang diisolasi dari tanaman inang Aglaia odorata Lour dilarutkan dengan etil asetat q.s dan diultrasonik selama 5 menit. Menotolkan fraksi yang terpilih pada plat KLT silica gel 60 F254 kemudian dilakukan eluasi. Setelah eluasi selesai noda dianalisis dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm dan penampak noda anisaldehid-asam sulfat pekat. Noda yang sudah dianalisi kemudian dikerok. 4.5.3 Uji kemurnian Uji kemurnian menggunakan KLT 2 dimensi. Menotolkan fraksi yang terpilih pada plat KLT Silica gel F254 dengan ukuran 5cm X 5cm dan mengeluasi menggunakan eluen terpilih kemudian dianalisis menggunakan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm dan penampak noda anisaldehid- asam sulfat pekat. 4.5.4 Karakterisasi isolat Karakterisasi isolat dilakukan dengan menggunakan KLT-densitometri, HPLC, GC, Mass Spectroscopy (MS) dan Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Prinsip dari KLTdensitometri, HPLC dan GC adalah partisi sampel pada fase gerak dan fase diam berdasarkan polaritasnya, sedangkan prinsip dari Mass Spectroscopy adalah melihat pola fragmentasi dari sampel yang telah diubah menjadi bentuk ion melalui suatu proses ionisasi.
52 SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
53
4.6 Skema kerja Fraksi no. 12 ekstrak etil asetat jamur Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour.
Gambar 4.1 Skema kerja pelaksanaan penelitian fraksi no 12 ekstrak etilasetat 53 jamur Cladosporiun oxysporum dari Aglaia odorata Lour. SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
54 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB V HASIL PENELITIAN 5.1 Fraksi terpilih untuk dimurnikan Fraksi jamur endofit yang aktif dipilih fraksi 12.2 dengan berat 52,3 mg untuk dimurnikan lebih lanjut. Profil KLT dari subfraksi 12.2
ekstrak etiasetat jamur endofit Cladopsorium
oxysporum dari Aglaia odorata L adalah sebagai berikut :
Gambar 5.1 KLT fraksi 12.2 ekstrak etil asetat jamur Cladosporium oxysporum dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak adalah Diklorometana : EtOAc = 9:1. Penampak noda UV254 (kiri) serta anisaldehid-asam sulfat pekat (kanan). Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi. 5.2 Kromatografi lapis tipis preparatif untuk fraksi 12.2 Fraksi 12.2 dipilih untuk dimurnikan berdasarkan pertimbangan pertimbangan profil KLT yang menarik dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat pekat dengan RF 0,34 mempunyai
54 SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
55 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
warna merah-ungu dan noda dengan Rf 0,43 aktif kuat terhadap sinar UV254nm. Proses kromatografi lapis tipis preparatif menggunakan fase diam silica gel60 dan fase gerak diklorometana : EtOAc = 9:1. Hasil kromatografi lapis tipis preparatif adalah 8 subfraksi, selanjutnya dilakukan uji kemurnian untuk subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dan optimasi eluen untuk subfraksi 12.2.8. Fase gerak terpilih untuk subfraksi 12.2.8 adalah kloroform : methanol = 8:2.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
1 : subfraksi 12.2.1 2: subfraksi 12.2.2 3: subfraksi 12.2.3 4 : subfraksi 12.2.4 5 : subfraksi 12.2.5 6 : subfraksi 12.2.6 7 : subfraksi 12.2.7 8 : subraksi 12.2.8 Gambar 5.2 Hasil KLT 8 subfraksi hasil KLT preparatif subfraksi 12.2 ekstrak etilasetat jamur C. oxysporum dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak diklorometana : EtOAc= 9:1. Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi. Keterangan :
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
56 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Hasil penimbangan subfraksi : Tabel 5.1 Penimbangan subfraksi hasil KLT preparative Rf dengan penampak No. Fraksi
Berat zat (mg)
Rf dengan UV254nm
noda AnisaldehidH2SO4 p
12.2.1
1,8
0,86
0,86
12.2.2
1,0
-
-
12.2.3
2,4
0,95
-
12.2.4
3,5
0,45
-
12.2.5
4,6
-
-
12.2.6
6,3
0,43
-
12.2.7
13,7
-
0,34
12.2.8
9,1
-
-
Gambar 5.3 Hasil KLT Fraksi 12.2.8 ekstrak etil asetat jamur C. oxysporum dengan fase diam silica gel 60 F254; fase gerak kloroform : metanol= 8:2. Penampak noda dengan sinar UV panjang gelombang 254nm (kiri) dan penampak noda anisaldehid-asam sulfat pekat (kanan). Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
57 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
5.3 Uji kemurnian subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dengan KLT 2 Dimensi Berdasarkan hasil KLT dengan fase diam silica gel 60G dan fase gerak Diklorometana:EtOAc= 9:1, subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 menunjukkan satu noda untuk memastikan bahwa noda sudah murni maka dilakukan uji kemurnian dengan KLT 2 Dimensi. KLT 2 Dimensi
menggunakan
ukuran
plat
5x5
cm,
fase
gerak
Diklorometana : EtOAc= 9:1 dan fase diam silica gel 60 G.
12.2.6
12.2.6
12.2.7 12.2.7 Gambar 5.4 Hasil KLT 2 Dimensi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dengan fase diam silica gel 60F254; fase gerak diklorometana : EtOAc= 9:1. Penampak noda UV254 (kiri) serta anisaldehid-asam sulfat (kanan). Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
58 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
5.4 Karakterisasi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 Berdasarkan hasil KLT 2 Dimensi subfraksi 12.2.6 menunjukkan satu noda yang aktif terhadap UV254nm tetapi dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat pekat masih terdapat jumlah noda yang banyak dan subfraksi 12.2.7 menunjukkan satu noda yang aktif terhadap penampak noda anisaldehid-asam sulfat dan UV254nm. Karakteristik kimia dari senyawa yang terkandung dalam subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dilakukan dengan KLT- Densitometer, HPLC dan GC. 5.4.1
Karakterisasi
dengan
KLT-densitometer
subfraksi
12.2.6 dan 12.2.7 dengan CAMAG TLC SCANNER 3
12.2.6
12.2.7
Gambar 5.5 Hasil kromatogram subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dianalisa pada panjang gelombang 254nm. Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
59 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
12.2.6
12.2.7
Gambar 5.6 Hasil spektra UV subfraksi 12.2.6 dengan Rf: 0,43 dan 12.2.7 dengan Rf: 0,34 dianalisa dengan KLT-densitometer dengan eluen dcm : EtOAc = 9:1. Keterangan angka menunjukkan nomor fraksi. Tabel 5.2 Rf dan panjang gelombang maksimum subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7
5.4.2
Fraksi
Rf
λmak (nm)
12.2.6
0,43
268
12.2.7
0,34
273
Karakterisasi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.8 dengan HPLC
Tabel 5.3 Kondisi HPLC untuk analisis subfraksi 12.2.6 dan 12.2.8
SKRIPSI
Merk HPLC
UFLC Shimadzu 20 AD
Kolom
Phenomenex RP-18, ukuran pori 100 Å
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
60 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Suhu kolom
300C
Konsentrasi sampel
25.000 ppm
Time program
45.00 menit
Pump Mode
Low pressure gradient
Total flow
1,000 ml/min
Pressure limit
Max 350
Detector
PDA
Tabel 5.4 Program waktu gradien eluen HPLC untuk subfraksi 12.2.6 dan12.2.8 Waktu (menit)
Eluen
Komposisi (%)
0.01
Metanol:Air
30:70
22.00
Metanol:Air
50:50
30.00
Metanol:Air
80:20
36.00
Metanol:Air
99.9:0.1
37.00
Metanol
100
45.00
Metanol
100
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
61 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
A
B
C Gambar 5.7 (A) Hasil kromatogram HPLC fraksi 12.2.6 pada panjang gelombang 254nm (B) Profil spectra UV puncak senyawa yang memiliki waktu retensi 7,959 menit dengan panjang gelombang maksimum 261 nm (C) Hasil counter plot senyawa subfraksi 12.2.6 dengan waktu retensi 7,959 menit.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
62 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
D
E
F Gambar 5.8 (D) Hasil kromatogram HPLC subfraksi 12.2.8 pada panjang gelombang 254nm (E) Profil spectra UV senyawa yang memiliki waktu retensi 5,085 menit dengan panjang gelombang maksimum 261 nm (F) Profil spektra UV senyawa yang memiliki waktu retensi 6,089 menit dengan panjang gelombang maksimum 264 nm
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
63 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Contour plot senyawa dengan tr: 5,085 menit
G
Contour plot senyawa dengan tr: 6,089 menit
H Gambar 5.8 (G) Profil contour plot senyawa yang memiliki waktu retensi 5,085 menit (H) Profil contour plot senyawa yang memiliki waktu retensi 6,089 menit.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
64 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
5.4.3
Karakterisasi subfraksi 12.2.7 dengan GC-FID dengan Agilent Technologies 6890N Analisis menggunakan kromatografi gas dilakukan dengan
kondisi sebagai berikut: kolom HP-5 dengan panjang kolom 30 meter, suhu inlet 2500C, Split ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit.
Gambar 5.9 Hasil kromatogram fraksi 12.2.7 yang dianalisis dengan GC-FID dengan kolom HP-5, suhu inlet 2500C, Split ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
65 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
5.4.4 Karakterisasi subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 dengan GCMSD Agilent 6973 series
Gambar 5.10 Hasil kromatogram subfraksi 12.2.6 dianalisis dengan GC-MSD dengan kolom HP-5, suhu inlet 2500C, Splitless, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium.
Gambar 5.11 Hasil spektrum massa senyawa pada subfraksi 12.2.6 dengan waktu retensi 24,22 menit
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
66 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Gambar 5.15
Hasil kromatogram fraksi 12.2.7 yang dianalisis
dengan GC-MS dengan kolom HP-5, suhu inlet 2500C, Split ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium.
Gambar 5.16 Hasil spektrum massa senyawa subfraksi 12.2.7 dengan tr: 23,30 menit yang dianalisis dengan GC-MS Agilent dengan kondisi: kolom HP-5, suhu inlet 2500C, Split ratio 50:1, flow 1.0, suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit dan fase gerak gas helium.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
67 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Gambar
5.17
Hasil
spektrum
massa
senyawa
4-4’-(1-
methylethylidene)bisphenol
Gambar 5.18 Struktur senyawa 4-4’-(1-methylethylidene)bisphenol
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
68 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
Gambar 5.19 Hasil prediksi fragmentasi senyawa 4-4’-(1methylethylidene)bisphen
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
69 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB VI PEMBAHASAN Proses pemurnian awal dari fraksi 12 menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Sephadex LH-20 dengan fase gerak metanol 100% , diperoleh 3 subfraksi yaitu subfraksi 12.1, 12.2 dan 12.3 (Pratiwi, 2015). Subfraksi 12.2 merupakan subfraksi yang
terpilih
untuk
dimurnikan
lebih
lanjut
berdasarkan
pertimbangan karakter noda yang menarik dan keterpisahan antar noda sudah baik. Metode pemurnian dilakukan dengan kromatografi lapis tipis preparatif. Metode pemurnian ini terpilih karena jumlah sampel sedikit yaitu 53,2 mg sehingga tidak memungkinkan dipisahkan dengan kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan dalam KLT-preparatif adalah silika gel 60 dan fase gerak terpilih yaitu diklorometana : etilasetat = 9:1. Hasil kromatografi preparatif subfraksi 12.2 sebanyak 8 subfraksi. Dari 8 subfraksi dilakukan KLT. Hasil KLT (Gambar 5.2) terdapat tiga subfraksi yang dapat dilakukan analisis lebih lanjut yaitu fraksi 12.2.6, 12.2.7 dan 12.2.8. Pada subfraksi 12.2.6 dan 12.2.7 menunjukkan satu noda sehingga dipilih untuk dilakukan uji kemurnian. Subfraksi 12.2.8 belum menunjukkan keterpisahan noda yang baik namun memiliki berat yang cukup besar yaitu 9,1 mg sehingga dilakukan optimasi fase gerak (eluen). Proses optimasi fase gerak (eluen) dilakukan
untuk mendapatkan eluen yang dapat
memisahkan noda dengan baik dan fase gerak terpilih nantinya akan 69 SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
70 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
digunakan sebagai fase gerak dalam KLT subfraksi 12.2.8 untuk pemurnian lebih lanjut. Optimasi eluen dilakukan dengan mencoba beberapa komposisi eluen. Fase gerak terpilih untuk subfraksi 12.2.8 adalah kloroform : metanol 8:2 (Gambar 5.3). Subfraksi 12.2.6 memiliki berat 6,3 mg dan berdasarkan hasil KLT didapatkan noda tunggal dengan Rf 0,43 yang terlihat dengan UV254 dan terlihat dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat dengan warna coklat lemah, warna yang timbul dapat demikian kemungkinan dapat disebabkan oleh kurang meratanya penampak noda yang disemprotkan atau noda kurang aktif terhadap penampak noda anisaldehid-asam sulfat pekat. Proses analisis selanjutnya dilakukan uji kemurnian dengan KLT 2D dengan fase gerak diklorometana : etilasetat = 9:1. Hasil uji kemurnian (Gambar 5.4) noda pada subfraksi 12.2.6 belum murni tetapi terdapat satu noda dominan yang aktif kuat terhadap sinar UV254. Subfraksi 12.2.6 diketahui larut dalam metanol sehingga analisis lebih lanjut dapat dilakukan dengan KLT-densitometer dan HPLC sistem reverse phase. Profil kromatogram KLT-densitometer subfraksi 12.2.6 menunjukkan terdapat satu puncak dominan pada Rf 0,43 (Gambar 5.5). Diamati spektrum UV pada Rf tersebut menunjukkan adanya serapan pada λmak 268 nm (Gambar 5.6). Serapan pada panjang gelombang ini dapat menjadi petunjuk adanya gugus kromofor benzene atau inti aromatis (202nm - 275nm) (Sampietro et al., 2009).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
71
Profil kromatogram HPLC subfraksi 12.2.6 dapat dilihat pada Gambar 5.7(A). Eluasi dilakukan secara gradien dengan eluen metanol dan air. Eluasi gradien baik digunakan untuk kondisi pemisahan dengan sampel yang komplek seperti bahan alam yang memiliki derajat polaritas yang beragam (Sarker et al., 2006). Eluasi gradien dimulai dengan komposisi metanol : air (30:70) hingga menit ke 45 komposisi eluen menjadi metanol 100%. Detektor yang digunakan adalah detektor PDA yang dapat mendeteksi senyawa organik pada rentang panjang gelombang 200-600 nm, detektor PDA dapat mendeteksi absorbansi UV/Vis pada beberapa panjang gelombang sekaligus (Sarker et al., 2006). Kromatogram
HPLC
subfraksi
12.2.6
pada
panjang
gelombang 254 nm menunjukkan ada satu puncak dominan pada waktu retensi 7,959 menit dengan % kemurnian 84,98% (Gambar 5.7(A)). Diamati spektrum UV pada puncak tersebut (Gambar 5.7(B)) menampilkan adanya serapan pada panjang gelombang maksimum 261 nm dengan intensitas 300 mAU. Serapan pada panjang gelombang ini dapat menjadi petunjuk adanya gugus kromofor benzene atau inti aromatis (202nm - 275nm) (Sampietro et al., 2009). Berdasarkan gambaran contour plot terhadap subfraksi 12.2.6 (Gambar 5.7(C)) dapat dilihat bahwa puncak yang terdeteksi pada waktu retensi 7,959 menit memiliki intensitas berwarna biru yang berarti cukup murni. Berdasarkan gambaran contour plot dikatakan bahwa dalam satu puncak pada waktu retensi ke 7,959
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
72
menit hanya terdapat satu senyawa, untuk memastikan senyawa yang terkandung dalam subfraksi 12.2.6 maka dilakukan analisis lebih lanjut menggunakan GC-MS. Hasil kromatogram GC-MS subfraksi 12.2.6 menunjukkan adanya puncak pada waktu retensi 24,22 menit (Gambar 5.10). MS merupakan detektor yang dapat mendeteksi molekul-molekul gas bermuatan, berdasarkan massa atau beratnya (Pavia et al., 2009). Spektrum massa merupakan gambaran antara limpahan relative lawan perbandingan massa/muatan. Spektrum massa senyawa pada subfraksi 12.2.6 dengan waktu retensi 24,22 menit dapat dilihat pada Gambar 5.11. Selanjutnya akan dilakukan elusidasi struktur terhadap subfraksi 12.2.6. Subfraksi 12.2.7 memiliki berat 13,7 mg dan berdasarkan hasil KLT didapatkan noda tunggal yang terlihat dengan UV254 dan terlihat dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat dengan warna merah-ungu. Senyawa yang menghasilkan noda warna keungunan
dengan
menunjukkan bahwa
penampak senyawa
noda
tersebut
anisaldehide-H2SO4 merupakan
golongan
terpenoid atau steroid (Sherma, 2003). Proses analisis selanjutnya dilakukan uji kemurnian dengan KLT dua dimensi dengan fase gerak diklorometana : etilasetat = 9:1. Dari hasil uji kemurnian (Gambar 5.4) noda pada fraksi 12.2.7 sudah murni atau hanya terdapat satu noda. Subfraksi 12.2.7 diketahui larut dalam etilasetat sehingga analisis selanjutnya dapat dilakukan dengan KLT-densitometer dan GC.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
73
Profil kromatogram KLT-densitometer subfraksi 12.2.7 menunjukkan terdapat satu puncak dominan pada Rf 0,34 (Gambar 5.5). Diamati spektrum UV pada Rf tersebut menunjukkan adanya serapan pada panjang gelombang maksimum 273 nm (Gambar 5.6). Serapan UV pada panjang gelombang sekitar 270 nm dapat menjadi petunjuk adanya senyawa fenol (Skoog et al., 2007). Profil kromatogram GC subfraksi 12.2.7 dapat dilihat pada Gambar 5.9. Pemograman suhu dilakukan secara pemisahan suhu terprogram atau suhu yang berubah secara terkendali yaitu dengan suhu dimulai dari 1000C hingga 2500C dengan kenaikan 50C per menit selama 30 menit. Pemisahan dengan suhu terprogram mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran yang mempunyai titik didih pada kisaran yang luas seperti sampel bahan alam (Skoog, 2013). Detektor yang digunakan adalah detektor FID yang dapat mendeteksi adanya atom karbon pada senyawa organik sehingga detektor ini dapat digunkana oleh hampir semua senyawa organik (Skoog, 2013). Kromatogram GC subfraksi 12.2.7 menunjukkan ada 1 puncak dominan pada waktu retensi 27,868 menit (Gambar 5.9). Memastikan senyawa yang terkandung dalam subfraksi 12.2.7 maka dilakukan analisis lebih lanjut menggunakan GC-MS. Kromatogram GC-MS subfraksi 12.2.7 menunjukkan ada 1 puncak dominan pada waktu retensi 23,30 menit (Gambar 5.15). MS merupakan detektor yang dapat mendeteksi molekul-molekul
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
74
gas bermuatan, berdasarkan massa atau beratnya (Pavia et al., 2009). Spektrum massa merupakan gambaran antara limpahan relative lawan perbandingan massa/muatan. Spektrum massa senyawa dalam subfraksi 12.2.7 dengan waktu retensi 23,30 menit dapat dilihat pada Gambar 5.16 dengan [M]+ m/z 228 menunjukkan tipe fragmentasi pada C kwartener dengan pola fragmentasi m/z 213 [M-15], 119 [M109], 91 [M-137], 77 [M-151], dan 65 [M-163].
Selanjutnya
dilakukan elusidasi struktur dari data spektrum massa tersebut menggunakan mass bank (www.massbank.jp) dan diidentifikasi identik dengan senyawa 4-4’-(1-methylethylidene)bisphenol dengan skor kemiripan 88,31%. Kriteria kemiripan dengan database dapat dianggap sama apabila > 80% (Odchimar et al., 2016). Struktur dan pola
fragmentasi
senyawa
4-4’-(1-methylethylidene)bisphenol
berturut-turut dapat dilihat pada Gambar 5.18 dan Gambar 5.19. Senyawa 4-4’-(1-methylethylidene)bisphenol atau Bisphenol A merupakan senyawa kimia penting yang terdiri dari dua gugus fenol dan utamanya digunakan pada industri untuk pembuatan plastic polikarbonat dan epoksi resin, selain itu bisfenol A dapat meenyebabkan gangguan pada endokrin (Chhaya dan Gupte, 2013; Fujiwara et al., 2016)). Senyawa bisphenol-sesquiterpen telah diisolasi dari jamur Kionochaeta ramifera BCC 7585. Senyawa bisphenol-sesquiterpen yang diisolasi adalah ramiferin dan menunjukkan aktivitas antimalarial dan antituberkulosis (Bunyapaiboonsri et al., 2008).
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
75
Adanya bukti penelitian diatas memungkinkan bahwa senyawa 4-4’(1-methylethylidene)bisphenol atau Bisphenol A merupakan salah satu senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktifitas antijamur yang diberikan oleh fraksi 12 ekstrak etilasetat jamur endofit dari Aglaia odorata Lour. Subfraksi 12.2.8 memiliki berat 9,1 mg dan berdasarkan hasil KLT didapatkan noda pada subfraksi ini belum dapat terpisah (Gambar 5.2) oleh karena itu dilakukan optimasi eluen untuk mendapatkan eluen yang dapat memisahkan noda dengan baik. Optimasi eluen dilakukan dengan mencoba berbagai macam eluen. Eluen terpilih yaitu kloroform : methanol = 8:2. Profil KLT subfraksi 12.2.8 dengan eluen kloroform : methanol= 8:2 menunjukkan adanya dua noda dengan Rf masing-masing 0,7 dan 0,8 yang aktif terhdap sinar UV254nm dan penampak noda anisaldehide-H2SO4 pekat dengan warna ungu Gambar 5.3. Senyawa yang menghasilkan noda warna keungunan dengan penampak noda anisaldehide-H2SO4 pekat menunjukkan bahwa
senyawa
tersebut
merupakan
golongan
terpenoid atau steroid (Sherma, 2003). Subfraksi 12.2.8 larut dalam metanol. Memastikan noda yang terdapat pada subfraksi 12.2.8 murni maka dilakukan anlisis dengan HPLC dan GC. Kromatogram HPLC subfraksi 12.2.8 pada λ254 nm menunjukkan ada dua puncak dominan pada waktu retensi 5,085 menit dengan % kemurnian 22,11% dan 6,089 menit dengan % kemurnian 76,79% (Gambar 5.8(D)). Spektrum UV pada puncak
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
76
tersebut menampilkan adanya serapan pada λmak 261 nm pada tr 5,085 menit (Gambar 5.8(F)) dan λmak 264 nm pada tr 6,089 menit (Gambar 5.8(G)). Serapan pada λ ini dapat menjadi petunjuk adanya gugus kromofor inti aromatis (202nm - 275nm) (Sampietro et al., 2009). Berdasarkan gambaran contour plot terhadap subfraksi 12.2.8 (Gambar 5.7(C)) dapat dilihat bahwa puncak yang terdeteksi pada waktu retensi 5,085 menit dan 6,089 menit memiliki intensitas berwarna merah yang berarti cukup tinggi, berdasarkan gambaran contour plot dikatakan bahwa dalam satu puncak pada waktu retensi ke 5,085 dan 6,089 menit hanya terdapat satu senyawa. Kromatogram GC dengan detektor FID subfraksi 12.2.8 tidak menunjukkan adanya puncak yang dominan, namun terdapat puncak kecil-kecil yang sangat banyak. Hal ini dikarenakan senyawa pada subfraksi 12.2.8 tidak tahan terhadap suhu tinggi sehingga senyawa pada subfraksi 12.2.8 terurai ketika di analisis dengan GC, maka perlu dilakukan pemurnian kembali dengan HPLC-preparatif atau LC-MS-MS karena jumlah sampel subfraksi 12.2.8 cukup kecil.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
77
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN 7.1 Kesimpulan 1.
Subfraksi 12.2.7 hasil pemisahan fraksi 12.2 ekstrak etil asetat jamur Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour berdasarkan hasil spektrum MS dihasilkan identik dengan senyawa 4,4’-(1-methylethylidene)bisphenol atau bisfenol A dengan kemiripan 88,31% data base mass bank dan 87% data base wiley7n.1.
2.
Subfraksi 12.2.6 dan 12.2.8 hasil pemisahan fraksi 12.2 ekstrak etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari tanaman Aglaia odorata Lour. berdasarkan pereaksi warna anisaldehid-H2SO4, mengandung senyawa golongan terpenoid atau steroid yang bersifat aktif UV254.
7.2 Saran Melakukan pemurnian lebih lanjut terhadap subfraksi 12.2.8 dengan LC-MS-MS atau HPLC-preparatif.
77
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
78
DAFTAR PUSTAKA Amin, Lukman Zulkifli. 2014. Pemilihan Antibiotik yang Rasional. Medical Review Medicinus Vol. 27, No.3 Andreolli Marco
, Silvia
Lampisa, Giacomo
Zapparoli, Elisa
Angelini, Giovanni Vallini, 2015. Diversity of bacterial endophytes in 3 and 15 year-old grapevines of Vitis vinifera cv. Corvina
and
their
potential
for
plant
growth
promotion and phytopathogen control. Microbiological Research
183
(2016)
42–52.
DOI:
10.1016/j.micres.2015.11.009 Arnold Elizabeth, Zuleyka Maynard, Gregory Gilbert, 2001. Fungal endophytes in dicotyledonous neotropical tress: patterns of abundance and diversity. Mycological Society 105 (12): 1502-1507. DOI: 10.1017/S0953756201004965 Assante
Gemma,
Adriana
Bava,
Gianluca
Nasini,
2005.
Enhancement of a pentacyclic tyrosine kinase inhibitor production
in
Cladosporium
cf.
cladosporioides
by
Cladosporol. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 69: 718– 721. DOI 10.1007/s00253-005-0054-2 Bensch, K., Groenewald, J. Z., Dijksterhuis, J., dkk., 2010. Species and
Ecological
diversity
within
the
Cladosporium
78
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
79
cladosporioides complex (Davidiellaceae, Capnodiales). Study in Mycology, Bunyapaiboonsri T, Veeranondha S, Boonruangprapa T, Somrithipol S, 2009. Ramiferin, a bisphenol-sesquiterpene from the fungus Kionochaeta ramifera BCC 7585. Phytochemistry Letters, p 204–206 Carolina santiago1, Lin Sun2, Murray Herbert Gibson Munro2, jacinta Santhanam1, 2014. Polyketide and benzopyran compounds of an
endophytic
fungus
isolated
from
Cinnamomum
mollissimum: biological activity and structure. Asian Pac J Trop Biomed, 4(8), p 627-632. Casella hiago M., Véronique Eparvier, Hugues Mandavid, Audrey Bendelac, Guillaume Odonne, Laura Dayan, Christophe Duplais,
Laila
S.
Espindola,
Didier
Stien,
2013.
Antimicrobial and cytotoxic secondary metabolites from tropical leaf endophytes: Isolation of antibacterial agent pyrrocidine C from Lewia infectoria SNB-GTC2402. Phytochemistry
96
(2013)
370–377.
DOI:
10.1016/j.phytochem.2013.10.004 Chhaya, Urvish dan Gupte, Akshaya 2013. Possible role of laccase from Fusarium incarnatum UC-14 in bioremediation of Bisphenol A using reverse micelles system. Journal of Hazardous Materials 254–255
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
80
De Hoog, G.,S., 2000. Atlas Of Clinical Fungi. Ed. 2:589 Diakses di www.clinicalfungi.org pada tanggal 20 Januari 2016 Dorra, B. L., 2011. Skripsi : Aktivitas Antimikroba Fraksi dari Ekstrak Etil Asetat Jamur Endofit Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour. Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Departemen Farmakognosi dan Fitokimia. Erma, N., Zaini, N. C., Indrayanto, G., 2003. Isolasi dan Determinasi Jamur Endofit dari Aglaia eusideroxylon, Aglaia odorata, dan Alyxia reinwardtii. Laporan Penelitian DIKS, Surabaya : Universitas Airlangga. Fouda Amr Hamza, Saad El-Din Hassan, Ahmed Mohamed Eid, Emad El-Din Ewais, 2015. Biotechnological applications of fungal endophytes associated with medicinal plant Asclepias sinaica (Bioss.). Annals of Agricultural Science. DOI: 10.1016/j.aoas.2015.04.001 Fowlis, Ian A.,1998. Gas Chromatography Analytical Chemistry by Open Learning. John Wiley & Sons Ltd: Chichester. Diakses
di
https://books.google.co.id/books?id=wVkz6Lei2dYC&pg=P A35&lpg=PA35&dq=fowlis,+1998&source=bl&ots=GSdm B32bg5&sig=VKXNHXDQvufpShbJF2rPm49iQAg&hl=en &sa=X&ved=0ahUKEwii0rSh5I7OAhUKso8KHYX8AusQ
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
81
6AEIHzAB#v=onepage&q=fowlis%2C%201998&f=false pada tanggal 25 juli 2016 Gandjar, I. G., Rohman, A., 2012. Analisis Obat Secara Spektrofotometri
Dan
Kromatografi.
Yogyakarta:
Pustaka Pelajar. Hal 378. Gesner R, Cohen N, Ilan M, Yarden O, Carneli S. 2005. Pandangolide 1a, a Metabolite of the Sponge-Associated Fungus Cladopsorium sp., and the Absolute Stereochemistry of Pandangolide 1 and iso-Cladopsolide B. J. Nat. Prod. 68: 1350-1353 Goodman dan Gilman. 2011. The Pharmacological Basis of Therapetuic. New York: The McGraw-Hill Companies, Inc Gritter Roy J, James M. Bobbitt, Arthur E. Schwarting. 1991. Introduction to Chromatography. USA: Holden-Day, inc Gunawan, Sulistia G., 2008. Farmakologi dan Terapi. Edisi 5. Departemen
Farmakologi
dan
Terapeutik
Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia, hal. 585. Heng
Zhanga, Zhi-Jun Songb, Wei-Quan Chena, Xin-Zhou Wuc, Han-Hong Xua, Chemical constituents from Aglaia odorata Lour. 2012. Biochemical Systematics and Ecology 41 (2012) 35–40.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
82
Hidayat Hussain, Christine Kliche-spory, Ahmed Al-Harrasi, Ghulam Abbas, Ivan Robert Green, Barbara Schulz, Karsten Krohn, Afzal Shah, 2014. Antimicrobial constituents from three endophytic fungi. Asian Pac J Trop Med, 7(suppl 1): S224-S227. Hostettmann Kurt, Hostettmann Maryse, Andrew Marston. 1985. Preparative Chromatography Techniques. New York: Springer-Verlag Berlin Heidelberg Huyan X.-H., Y.-P. Yang, Y.-M. Fan, W.-M. Huang, W. Li and Y. Zhou, 2012. Cutaneous and Systemic Pathogenicity of a Clinical Isolate of Cladosporium sphaerospermum in a Murine Model. J. Comp. Path. 2012, Vol. 147, 354e359. DOI: 10.1016/j.jcpa.2012.01.023 Jadulco R, Proksch P, Wray V, Sudarsono, Berg A, Grafe U. 2001. New Macrolides and Furan Carboxylic Acid Derivatives from the Sponge-Derrived Fungus Cladopsorium herbarum. J. Nat. Prod. 64: 527-530 p. 61. Johnson Edward L dan Stevenson Robert. 1991. Basic Liquid Chromatography. Varian Sassociates, inc Kinghorn Douglas, falk H, J. Kobayashi, 2011. Progress In the Chemistry of Organic Natural Products, Volume 94. New york: Springer p 4-5
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
83
Kjer, Julia. 2009. Disertation: New Natural Products from Endophytic Fungi from Mangrove Plants – Structure Elucidation and Biological Screening. MathematischNaturwissenschaftlichen
Fakultät
der
Heinrich-Heine-
Universität Düsseldorf Kumar V, Ahamad T, Nishat N, 2008. Some O,O’,O’’,O’’’-di/tetra aryldithioimidophonate transition metal complexes derived from catechol and bisphenol-A as antibacterial and antifungal
agents.
European
Journal
of
Medicinal
Chemistry 44 785-793 Laksmi, ni kadek lintia. 2014. Isolasi: Purifikasi dan Karakterisasi Metabolit dari fraksi no. 150-200 dan 2110-13 ektrask etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari aglaia
odorata
lour.
Fakultas
Farmasi
Universitas
Airlangga Departemen Farmakognosi dan Fitokimia. Madlan,
Eva.
2013.
Elucidation
Extraction,
of
Saponins
Isolation from
and
Herniaria
Structure incana.
Department of Chemistry Norwegian University of Science and Technology. Menteri Kesehatan RI. 2015. Peraturan Menteri Kesehatan Kepublik Indonesia
SKRIPSI
Nomor
8
Tahun
2015
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
Tentang
Program
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
84
Pengendalian Resistensi Antimikroba
Di Rumah Sakit.
Menteri Kesehatan RI. Ogórek Rafał, Agnieszka Lejman, Wojciech Pusz, Anna Miłuch, Paulina Miodyńska, 2012. Characteristics and taxonomy of Cladosporium fungi. Mikologia Lekarska 2012, 19 (2): 8085 Pavia, Donald L., Gary M. Lampman, George S. Kritz, Randall G. Engel. 2006. Introduction to Spectroscopy 4th Ed. Thomson Brooks/Cole. pp. 418-420. Pratiwi, Risma. 2015. Skripsi: Isolasi Metabolit Sekunder dari Fraksi 3 dan Fraksi 12 Ekstrak Etil Asetat Jamur Endofit Cladosporium oxysporum dari Aglaia odorata Lour. Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Departemen Farmakognosi dan Fitokimia. Pratiwi, sylvia utami tunjung. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga. Hal 38-42 Prihatiningtias, W., 2005. Senyawa bioaktif Fungi Endofit Akar kuning (Fibraurea chloroleuca Miers) sebagai senyawa antimikroba. Tesis. Sekolah Pascasarjana UGM. Puji Astuti1, Wahyono1, Octavian Ashido Nababan2, 2014. Antimicrobial and cytotoxic activities of endophytic fungi
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
85
isolated from Piper crocatum Ruiz & Pav. Asian Pac J Trop Biomed, 4(suppl 2): S592-S596. Putri, gusti ayu anom suartha. 2014. Skripsi: Purifikasi dan Karakterisasi Metabolit dari fraksi no. 101-149 dan 210213 ektrask etil asetat jamur endofit Cladosporium oxysporum dari aglaia odorata lour. Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Departemen Farmakognosi dan Fitokimia. Qi Shu-Hua, Ying Xu, Hai-Rong Xiong, Pei-Yuan Qian, Si Zhang, 2008. Antifouling and antibacterial compounds from a marine fungus Cladosporium sp. F14. World J Microbiol Biotechnol (2009) 25:399–406 DOI 10.1007/s11274-0089904-2 Raj K. Gokul, R. Manikandan, C. Arulvasu, M. Pandi, 2014. Antiproliferative
effect
of
fungal
taxol
extracted
from
Cladosporium oxysporum against human pathogenic bacteria and human colon cancer cell line HCT 15. Molecular and Biomolecular Spectroscopy 138 (2015) 667–674. DOI 10.1016/j.saa.2014.11.036 Restinia, Mita. 2012. Tesis : Evaluasi Klinik Penggunaan Antibiotik pada Pasien Infeksi Di Hospital Universiti Sains Malaysia Kelantan. Universitas Andalas.
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
86
Roopa G., M.C. Madhusudhan, K.C.R. Sunil, N. Lisa, R. Calvin, R. Poornima, N. Zeinab, K.R. Kini, H.S. Prakash, N. Geetha, 2015. Identification of Taxol-producing endophytic fungi Salacia oblonga isolated from through genomic mining Journal
approach.
of
Genetic
Engineering
and
Biotechnology. DOI: 10.1016/j.jgeb.2015.09.002 Sarker, S. D., Latif, Z., Gray, A. I., 2006. Methods in Biotechnology : Natural Products Isolation 2 nd. Humana Press Inc., p. 19-21. Sarrocco S dan Moretti A, 2015. Fungi. Encyclopedia of food and health 162-168.
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-
384947-2.00341-X Diakses pada 5 Desember 2015 Schulz Barbara, Christine Boyle, Siegfried Draeger, Anne-Katrin Rommert, 2002. Endophytic Fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycological Society
106
(9):
996-1004.
DOI:
10.1017/
S0953756202006342 Setiawan Dalimartha, 2008. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid I. Jakarta: Tribus Agriwidya hal 96 Setiawati, W., Murtiningsih, R., Gunaeni, N., Rubiati, T., 2008. Tumbuhan
Bahan
Pembuatannya
Pestisida
untuk
Nabati
Pengendalian
dan
Cara
Organisme
Pengganggu Tumbuhan (OPT). Balai Penelitian Tanaman
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
87
Sayuran Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, hal. 136138. Sherma Joseph dan Bernard Fried. 2003. Handbook of Thin-Layer Chromatography Third Edition, Revised and Expanded. New york: Marcel Dekker, Inc Sitorus, M. 2009. Spektroskopi ( Elusidasi Struktur Molekul Organik). Graha Ilmu. Yogyakarta. Hal 78. Skoog Douglas A., F James Holler, Stanley R. Crouch, 2007. Principles of Instrumental Analysis sixth edition. Thomson Brooks/Cole, a part of The Thomson Corporation. p 389 Spangenberg Bernd, Colin F. Poole, Christel Weins. 2011. Quantitative Thin-Layer Chromatography A Practical Survey. New york: Springer-Verlag Berlin Heidelberg Strobel, G., Daisy, B., 2003. Bioprospecting For Microbial Endophyte and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Review, Vol. 67 No. 4, pp. 491 – 502. Subandi. 2010. Mikrobiologi. Bandung: PT. Remaja rosdakarya. Sugijanto NE, 2011. Produksi bahan bioaktif berkhasiat obat menggunakan jamur endofit. Pidato disampaikan pada Pengukuhan Jabatan Guru Besar dalam Bidang Ilmu Kimia
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
88
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga di Surabaya pada hari Sabtu, tanggal 22 Oktober 2011 Susilowati Ragil, Agus Sabdono, Ita Widowati, 2015. Isolation and Characterization of Bacteria Associated with Brown Algae Sargassum spp. from Panjang Island and Their Antibacterial Activities. Procedia Environmental Sciences 23 ( 2015 ) 240 – 246. DOI: 10.1016/j.proenv.2015.01.036 Tan, R. X., dan Zou, W. X., 2001. Endophytes : A Rich Source of Functional Metabolites. Nat. Prod. Rep., pp 448 – 459. Tasic S, Miladinovic Tasic N. Cladosporium spp. – cause of opportunisic mycoses. ACTA Fac Med Naiss. 2007; 24:1519.
twelfth
edition.
New
york:
The
McGraw-Hill
Companies, Inc Wang FW, Jiao RH, Cheng AB, Tan SH, Song YC, 2007. Antimicrobial potentials of endophytic fungi residuing in Quercus
variabilis
and
Brefeldin
A
obtained
from
Cladosporium sp. World J Microbial Biotechnol 23: 79-83 Yadav Manila, Amita Yadav, Jaya Parkash Yadav, 2014. In vitro antioxidant activity and total phenolic content of endophytic fungi isolated from Eugenia jambolana Lam. Asian Pac J Trop
Med
2014;
7(Suppl
1):
S256-S261.
DOI:
10.1016/S1995-7645(14)60242-X
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.
ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
89
Yang K, Liang J, Li Q, Kong X, Chen R, Jin Y. 2012. Cladosporium cladosporoides
XJ-AC03,
an
aconitine-producing
endophytic fungus isolated from Aconitum leucostomum. World J Microbial Biotechnol. DOI 10.1007/s11274-0121246-4 Yenny dan Elly Herwana. 2007. Resistensi dari bakteri enterik: Aspek global terhadap antimikroba. Universa medicina, Vol. 26, hal 46-56. Zhang ZB, Zeng QG, Yan RM, Wang Y, Zou ZR, Zhu D, 2011. Endophytic fungus Cladopsorium cladosporoides MD2. Current Microbiology 59: 227-232
SKRIPSI
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI
ARMILA F.