Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Klinikai Orvostudományok, Szemészet program Iskolavezető: Tulassay Zsolt egyetemi tanár Programvezető és témavezető: Süveges Ildikó egyetemi tanár
A SEJTKÖZÖTTI ÁLLOMÁNY SZEREPE A SZARUHÁRTYA SEBGYÓGYULÁSÁBAN DOKTORI ÉRTEKEZÉS Dr. Resch Miklós Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Szemészeti Klinika Tömő utca
Budapest 2006.
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
TARTALOM 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE.................................................................................... 4 2. BEVEZETÉS............................................................................................................ 5 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...................................................................................... 6 3.1. A szaruhártya sejtközötti állománya..................................................................... 6 3.1.1. Alkotóelemek................................................................................................ 6 3.1.2. A sejtközötti állomány a szaruhártya degeneratív elváltozásaiban................... 7 3.1.3. Transzparencia és oedema ............................................................................. 8 3.2. Szemműtétek hatása a szaruhártyára.................................................................... 9 3.2.1. Szürkehályog műtétek hatása a szaruhártyára ................................................ 9 3.2.2. Refraktív műtétek hatása a szaruhártyára..................................................... 10 3.3. A szaruhártya ECM vizsgálati lehetőségei. ........................................................ 11 3.3.1. A szaruhártya felszínének vizsgálata (Cornea topográfia)............................. 11 3.3.2. A szaruhártya vastagságának mérése (Pachymetria)..................................... 12 3.3.3. A szaruhártya belső szerkezetének vizsgálata............................................... 12 4. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................... 15 4.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után............................................................................................................... 15 4.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon). .......................................................................... 15 4.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet). ....................... 16 5. MÓDSZEREK........................................................................................................ 17 5.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után................................................................................................................ 17 5.1.1. Esetbemutatás ............................................................................................. 17 5.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány......................................... 19 5.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon). .......................................................................... 20 5.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet). ....................... 25 6. EREDMÉNYEK..................................................................................................... 31 6.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után................................................................................................................ 31 6.1.1. Esetbemutatás ............................................................................................. 31 6.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány......................................... 32 6.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon). .......................................................................... 37 6.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet). ....................... 41 6.3.1. A sejtközötti állomány változásai................................................................. 41 6.3.2. Celluláris változások ................................................................................... 45 -2-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
7. MEGBESZÉLÉS .................................................................................................... 52 7.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után................................................................................................................ 52 7.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (klinikai vizsgálat humán anyagon). .......................................................................... 57 7.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet). ....................... 59 8. ÚJ EREDMÉNYEK ÉS KLINIKAI JELENTŐSÉGÜK.......................................... 65 9. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS ................................................................................. 66 10. IRODALOM......................................................................................................... 67 11. ÖSSZEFOGLALÓ ................................................................................................ 79 12. SUMMARY.......................................................................................................... 80 13. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE................................................................................ 81 13.1. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények ................................................ 81 13.4. Egyéb idézhető absztrakt ................................................................................. 83 13.5. Az értekezés témájában elhangzott előadások, poszterek ................................. 84 13.6. Egyéb előadások, poszterek............................................................................. 85 13.7. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai................................. 86
-3-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ANOVA – variancia analízis (analysis of variances) CCT – központi cornea vastagság (central corneal thickness) CST – központi stroma vastagság (central stromal thickness) DAPI – diamino phenylindrol dihydro chlorid Dcyl – keratometriás / corneális astigmia (cilindrikus dioptria) ECM – extracelluláris matrix = sejtközötti állomány GAG – glükózaminoglikán HE – Hematoxylin-eozin LASIK – Laser in situ keratomileusis KS – keratán szulfát OCT – optikai koherencia tomográfia (optical coherence tomography) PAS – perjódsav-Schiff (periodic acid Schiff) PCL – hátsó csarnok műlencse (posterior chamber lens) PCNA – proliferáló sejtmag antitest (proliferating cell nuclear antibody) PG – proteoglikán PMN – polymorphonukleáris granulocyta PRK – fotorefraktív keratectomia (photorefractive keratectomy) PVA – potenciális látóélesség (potential visual acuity) SAI – felszíni aszimmetria index (surface asymmetry index) SIA – sebészileg indukált astigmia (surgically induced astigmatism) Sim K – szimulált keratometriás értékek (simulated keratometric values) SRI – felszíni szabályosság index (surface regularity index) TUNEL – terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nickend labelling UBM – ultrahang biomikroszkóp
-4-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
2. BEVEZETÉS A szaruhártya átlátszóságának és a törőerő fenntartásának feltétele a sejtek és a sejtközötti állomány szabályos elrendeződése. A szaruhártya sebgyógyulása avasculáris, bradytrop, sejtszegény helyzetéből adódóan különbözik a szervezet többi szövetétől. A sebgyógyulás célja az átlátszóság helyreállítása. A transzparencia fenntartásában elengedhetetlen a szaruhártya relatív dehidrált állapota, amelyet az epithelium épsége, a sejtközötti állomány vízkötő képessége és az endothelium aktív pumpafunkciója biztosítanak. Amennyiben a szaruhártya átlátszó, víztartalma a sejtközötti állományhoz, vagy más néven extracelluláris mátrixhoz (ECM) kötött. A szaruhártya keratocytái biztosítják, hogy az ECM összetétele viszonylag állandó legyen, így a szaruhártya átlátszó maradjon. Az ECM fő alkotóelemei a szabályos elrendeződésű kollagén rostok és a köztük egyenlő távolságot biztosító proteoglikánok. A proteoglikánokat polipeptid lánchoz kapcsolódó glükózaminoglikánok (GAG) alkotják, amelyek diszacharid alegységekből épülnek fel. A szaruhártya GAG egyik legfontosabb diszacharid alkotóeleme a keratán szulfát (KS). Az ECM kollagén és proteoglikánok mellett többek között lipideket is tartalmaz. Az ECM összetétele megváltozhat degeneratív folyamatok során és a corneán végzet sebészeti beavatkozások hatására. A szaruhártya degeneratív folyamataiban a sejtközötti állomány összetétele megváltozik, amely a transzparencia csökkenésével jár. A 60 év feletti életkorban leggyakoribb cornea degeneráció az arcus lipoides (más néven arcus senilis vagy gerontoxon), mely esetén a lipid tartalom megemelkedik, a szaruhártya stromában az extracelluláris térben koleszterinből, foszfolipidből és trigliceridből felépülő depositumok jelennek meg. Az extracelluláris mátrix változása és benne idegen anyagok lerakódása a sebgyógyulást befolyásolja, amely szürkehályog műtét során készített cornea sebek esetében is nyomon követhető. Az ép szaruhártya sérülés, vagy refraktív beavatkozás (fotorefraktív keratektomia - PRK, Laser in situ keratomileusis - LASIK) hatására integritását átmenetileg elveszti, amely a sejtközötti állomány - esetenként klinikailag is észlelhető - biokémiai változását
-5-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
eredményezi. A sejtközötti állomány biokémiai változásai a dehidráció csökkenésével járnak, a szaruhártya víztartalma megnövekszik, amely a szaruhártya vastagságának növekedését és egyben borússágát vonja maga után.
3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1. A szaruhártya sejtközötti állománya 3.1.1. Alkotóelemek A szaruhártya többszörös funkciót lát el egyszerre a látásban. Átlátszósága és a megfelelő fénytörés elengedhetetlen az éles látás biztosításában. Ugyanakkor kellően ellenállónak kell lennie a külső fizikai, kémiai és biológiai behatásokkal szemben. A szaruhártya határoló rétegei, az epithelium és az endothelium kivételével kevés sejtet tartalmaz. A stroma térfogatának mindössze 10%-át képezik a sejtes elemek, míg 90%-át a sejtközötti állomány alkotja. A sejtközötti állomány alkotóelemeinek szabályos elrendeződése teszi lehetővé, hogy a fenti szerepeknek eleget tehessen. (7). A humán szaruhártya 78%-át víz alkotja (10) és 22%-a szárazanyag (113). A kollagén (elsősorban I. típus) mellett a szárazanyag 4-5 %-át a proteoglikánok képezik. A proteoglikánokat polypeptid lánchoz kovalens kötéssel kapcsolódó hosszú, glükózaminoglikánok (GAG) alkotják. A GAG-ot korábban mukopolyszacharidnak nevezték, később nevüket a szénhidrát oldalláncuk alapján kapták (105). Szabályos elrendeződésük révén a 30 nm (26) átmérőjű kollagén rostok közötti egyenlő távolságot (42-44 nm) tartják fent és biztosítják a transzparenciát (12,13,63,64,68,78,79). A GAG a szervezet egyes szöveteiben más-más összetevőkből áll, a szaruhártyában a keratán szulfát (KS) van jelen a legnagyobb arányban. A KS heteropoliszacharid, amely N-acetyl glükózamin, galaktózamin és szulfát csoportokból épül fel (1. ábra). Élettani körülmények között a KS a kollagén rostok között a nyúl és a humán szaruhártyában egyaránt előfordul lamelláris elrendeződésben (15). Eloszlására
-6-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
jellemző, hogy főleg a stroma hátsó részében fordul elő és mennyisége fokozatosan csökken az elülső stroma és a limbus felé (10,22). Az ép stroma anyagcseréje lassú (un. bradytrop), amelyet a más kötőszövetekhez képest kis sűrűségű keratocyták végeznek. A keratocyták az ép corneában nyugvó állapotban vannak, így az ECM összetétele is viszonylag állandó. A könnyfilm és az epithelium a külvilágtól, az endothelium a csarnokvíztől határolja el. A keratocyták biokémiai sajátosságát és fenotipusát ugyanakkor az ECM szabályozza, így a keratocyták és az ECM közöttt szoros kölcsönhatás áll fenn.
1. ábra. A glülózaminoglikán (GAG) kémiai szerkezete – sematikus ábra. A. Az extracelluláris mátrixban a kollagén molekulákkal (nyíl) proteoglikán komplexeket képeznek a proteoglikánok (zöld keretben). B. Az A. ábrán zöld keretben ábrázolt proteoglikán core proteinhez kapcsolódó GAG-okból épül fel (keratán- és kondroitin szulfát). C. A B. ábrán piros színnel jelzett oldalláncok kémiai szerkezete (a GAG fő típusai) a keratán szulfát és rokon molekulái. A kék oldalláncok felelősek a GAG negatív töltéséért (www.webanatomy.net alapján)
3.1.2. A sejtközötti állomány a szaruhártya degeneratív elváltozásaiban A szaruhártya degeneratív folyamataiban a sejtközötti állomány összetétele megváltozik, amely a transzparencia csökkenésével jár (114). A kóros összetétel vagy a fiziológiás körülmények között jelenlévő anyagok felszaporodásából, vagy új anyagok lerakódásából adódhat. A depositumok lehetnek a keratocyták kóros anyagcseréjének -7-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
termékei, vagy származhatnak a limbus érrendszeréből. Jelen munkában a lipidek lerakódásának következményeit vizsgáltuk. A lipid molekulák számos betegségben szaporodnak fel a szaruhártyában (4,109). A lerakódás lehet primér folyamat (110,117) vagy másodlagos elváltozás. Arcus lipoides. Az arcus lipoides elnevezés a szaruhártya azon degeneratív elváltozásait foglalja össze, amelyek során a limbushoz közel, de a limbust szabadon hagyva a cornea stroma és a Descemet-membrán határáról kiindulva az extracelluláris térben koleszterinből, foszfolipidből és trigliceridből felépülő depositumok (18) szaporodnak fel a stromában, amely szabad szemmel is látható gyűrű alakú sárgás-fehér homályok formájában jelentkezik. Az elváltozás a főleg időskorban jelentkezik, így arcus senilis és gerontoxon nevekkel is illetik, jóllehet pathológiai szempontból legpontosabb az arcus lipoides elnevezés (24), így e dolgozatban utóbbit használtuk. A 60 év feletti életkorban a leggyakoribb cornea degeneráció (17,75) és a két szemet általában együttesen érinti, bár a két oldal között az előrehaladottság stádiumában lehet különbség (94). Canton (11) 1863-ban már megemlíti, hogy ritkán csak az egyik szemen jelentkezik a szaruhártyában homály, elsősorban interstitialis keratitist követő fokozott ereződésből fakadó aszimmetriával magyarázta a féloldali arcus lipoides kialakulását. 3.1.3. Transzparencia és oedema A stromában található GAG többszörös anionos részei révén vizet köt meg (1. ábra), amely a szaruhártya ozmotikus elven működő ún. imbibációs nyomását tartja fenn. A szaruhártya hidratációját (3,5 g H2O / g szárazanyag) a szem belnyomása és az stroma imbibációs nyomása (kb. 55 Hgmm) szabályozza (26). A stroma víztartalmát azonban nagyban csökkenti az epithelium fizikai barrierként és az endothelium aktív pumpafunkciója révén (3). Kísérletes modellben a teljes epithelium eltávolítása után a szaruhártya a stroma vastagsága kétszeresére, míg az endothelium eltávolítása után ötszörösére növekszik (47,62). A szaruhártya víztartalmának növekedése a térfogat növekedéssel arányos. A szaruhártya térfogatnövekedése a vastagság növekedésben nyílvánul meg. A vastagság növekedése az interfibrilláris távolság egyenetlen növekedésével jár együtt, amely a szaruhártya transzparenciáját csökkenti (20,62,66). A vastagságváltozás mérésével -8-
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
következtethetünk a szaruhártya víztartalmára. A szaruhártya kötött víztartalma az ECM változásakor (főleg a szulfatáció növekedésekor) módosul, amely szaruhártya homályok kialakulásához vezet. Az ECM szabályosságának megbomlása és összetevőinek mennyiségi és biokémiai átalakulása lehet dystrophia és degeneráció következménye és létrejöhet a sérülésre adott válaszreakcióként a sebgyógyulás részjelenségeként is (20). A refraktív kezelések után jelentkező subepitheliális homályok kialakulásában a kóros ECM összetétel és elrendeződés játszik szerepet (22).
3.2. Szemműtétek hatása a szaruhártyára A szaruhártyán végzett sebészi beavatkozások egy része a szaruhártya kórfolyamat kezelése céljából indikált (pl. perforáló vagy lamelláris keratoplasztika, fototerápiás keratectomia), más része a szaruhártya fénytörésének megváltoztatását célozza (refraktív műtétek), harmadrészt a szem más betegségeinek (pl. szürkehályog) műtéte során a szaruhártya mint a behatolás helyszíne vesz részt (57,93). 3.2.1. Szürkehályog műtétek hatása a szaruhártyára A szürkehályog műtét történhet sclerocorneális vagy corneális behatolásból, a seb lehet önzáró, vagy zárhatjuk varrat(ok) segítségével. Minden szürkehályog műtét előidéz valamilyen fokú corneális eredetű astigmiát, ún. sebészileg indukált astigmia „Surgically induced astigmatism (SIA)” alakul ki. A SIA mértéke, tengelye és a posztoperatív változása számos tényező függvénye: a seb készítés módja (93), a seb hossza (57) és alakja (93), elhelyezése és távolsága a cornea centrumától, a helye (corneális vagy corneosclerális) és helyzete (superior, temporális, nasalis, superonasalis, stb.). A varratok legtöbb esetben a SIA növekedésével járnak (128). A legkisebb SIA-t a kis méretű superior elhelyezésű corneális seb készítés idéz elő (67). A SIA nagymértékben függ a sebgyógyulástól, amelyet az ECM mellett a sebkészítés határoz meg. A cornea degeneratív elváltozásaiban az ECM összetétele megváltozik, amely így a sebgyógyulásra is hatással van és ezáltal a sebészileg indukált astigmiát is befolyásolja (107). A SIA pathomechanizsmusának
pontos
ismeretével
-9-
megvalósítható
az
un.
refraktív
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
phakoemulzifikáció, amely során a sebkészítés helyének megválasztásával és a limbusban elhelyezett relaxációs bemetszésekkel a SIA minimalizálható (126) 3.2.2. Refraktív műtétek hatása a szaruhártyára A szaruhártya fénytörését kívánt módon változtatva a szem egészének törőereje emmetropiássá alakítható. A szaruhártya fénytörését változtató műtéteket refraktív bevatkozásoknak nevezzük, amelyre számos technikát fejlesztettek ki, és finomítása a jelenben is kiterjedt kutatás tárgya (16,21,65,85). Pontossága révén a szaruhártya alakjának megváltoztatására alkalmas módszerek közül az excimer lézerrel végzett fotorefraktív kezelések terjedtek el leginkább, hazánkban is már több mint tíz éve alkalmazzuk (90). A különböző fotorefraktív technikákban közös, hogy a szaruhártya stromából távolítunk el adott alakú és vastagságú szövetréteget (fotoabláció), így módosítva a szaruhártya egészének dioptria értékét. A szaruhártya stromához több módon férhetünk hozzá. Fotorefraktív keratectomia (PRK) során a fotoablációt az epithelium mechanikus eltávolítása előzi meg. LASIK esetében az epitheliumot egy elülső stroma lebennyel együtt felhajtjuk, majd a fotoabláció elvégzése után visszahajtjuk a helyére (97). A műtéti technika a sebgyógyulásban is eltérésekkel jár, a LASIK kisebb szöveti reakiót vált ki (23,69,86). A refraktív műtétek utáni sebgyógyulás első fázisa az epithelium regenerációja (6,101). Az epithelium proliferációja és migrációja során kezdetben egy rétegben fedi a szaruhártya felszínét. Az epithelium hiánya és a reepithelizáció számos olyan cytokin képződését váltja ki, amely a szaruhártya mélyebb rétegeiben, elsősorban a stroma elülső részében kaszkádszerű reakciót indít el. A reakció sejtszintű és ECM változásokat foglal magába. Az epithelium proliferációja jól követhető folyamat, míg a stroma sejtállománya in vivo nehezen monitorozható. Szövettani vizsgálatok bizonyították, hogy a fotoabláció területe alatt a stromaágyban a fotoabláció után megkevesbednek a keratocyták, ugyanakkor felszaporodnak a gyulladásos sejtek (95), elsősorban a polymorphonukleáris granulocyták (PMN). A keratocyták megkevesbedésének hátterében az apoptosis szerepe ismert (74,82-84), azonban annak pontos szabályozási mechanizmusai nem teljesen tisztázottak (133,134). A keratocyták később újra megjelennek az elülső stroma rétegben (29). - 10 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A sejtszintű változásokat az ECM változásai kisérik és egyben hatással vannak a további celluláris változásokra. Az ECM változásai a refraktív beavatkozások kései szövődményeként jelentkező homályképződéshez és a refrakció eredmény romlásához vezetnek (76).
3.3. A szaruhártya ECM vizsgálati lehetőségei. A sejtközötti állomány vizsgálatára közvetlen és közvetett módszerek állnak rendelkezésre. Közvetlen vizsgálat akkor lehetséges, amennyiben a szaruhártya szövete feldolgozható, morfológiai és biokémiai sajátosságai így megismerhetők. Az ECM közvetett vizsgálatát jelentik azon in vivo klinikai vizsgálómódszerek, amelyek segítségével tanulmányozható a szaruhártya görbülete, felszíne, vastagsága. 3.3.1. A szaruhártya felszínének vizsgálata (Cornea topográfia). A szemfelszín szabályosságának kisfokú változása rontja a látóélességet. A szaruhártya elülső felszínét a könnyfilm és az epithelium mellett a cornea stroma sejtközötti mátrixa határozza meg. A szaruhártya felszínének vizsgálatára a cornea topográfia pontos és reprodukálható vizsgálómódszer (40), melynek segítségével mérhető a szaruhártya görbületi sugara és a szaruhártya törőereje, kiszámítható a keratometriás astigmia, így segítségével megítélhető a SIA is. A szaruhártya felszínére jellemző további mutatók a felszín szabályosságára (surface regularity index – SRI) és szimmetriájára (surface asymmetry index – SAI) vonatkoznak. A potenciális látóélesség (potential visual acuity – PVA) a szemfelszín részletesebb leírásának lehetőségét nyújtja (27,91,132). Az SRI és SAI mutatók értéke nő, amennyiben a szaruhártya felszíne eltér az ideális síma felszíntől és a gömbfelszíntől. Az SRI a szaruhártya centrális részének optikai minőségét jellemzi; minél szabályosabb a felszín, annál alacsonyabb az SRI érték. Hasonlóképp, a SAI értéke annál alacsonyabb, minél szimmetrikusabb a teljes szaruhártya felszíne. A PVA a topográfiás értékekből kerül kiszámításra, és a decimális rendszerben mért visusérték formájában fejezzük ki (egészséges szem esetén 1,0); minél jobbak a topográfiás értékek, annál magasabb a PVA értéke.
- 11 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Cornea topográfiás vizsgálatokkal refraktív beavatkozások és szaruhártya átültetés után jól követhető a sebgyógyulás folyamata (56,119,120) 3.3.2. A szaruhártya vastagságának mérése (Pachymetria). A szaruhártya vastagságának mérése közvetett adatot szolgáltat a cornea víztartalmáról és az ECM szerkezetéről. Alapvetően optikai és ultrahangos módszerekkel mérhető a szaruhártya vastagsága. A méréseket legtöbbször a szaruhártya középpontján végezzük (centrális cornea vastagság – central corneal thickness [CCT]). Optikai pachymetria tiszta törőközegek esetén végezhető, pontossága az ultrahangos pachymetriáéhoz hasonlatos (70). Az ultrahangos pachymetria elvégezhető kizárólag erre a célra kifejlesztett A-scan üzemű UH pachymeterrel (81), amely 10 vagy 20 MHz transzducerrel rendelkezik. A szaruhártya vastagsága ultrahang biomikroszkópiával (UBM) is mérhető 50-80 MHz transzducer alkalmazásával (52,123). Mindkét ultrahangos pachymetria kontakt módszer, továbbá az UBM vízelőtétet igényel, így intraoperatív felhasználása nem kivitelezhető. Az eltérő elven működő pachymeterek követéses vizsgálatra alkalmasnak bizonyultak, de szabadon nem helyettesíthetik egymást (116). Optikai elven (alacsony koherenciájú lézer interferometria) működik az optikai koherencia tomográf (OCT) is (30), amely non-kontakt módszerként intraoperatív vizsgálatok végzésére is alkalmas. Wirbelauer és munkatársai LASIK közben végeztek intraoperatív OCT vizsgálatokat (140-141), LASIK utáni posztopeatív vizsgálatokat Maldonado
munkacsoportja
végzett
(60).
Az
OCT
alkalmas
a
szaruhártya
hidratációjának in vivo megitélésére (46), továbbá a cornea transzparenciájának mérésére is (131). Optikai elvű vizsgálóeszköz a konfokális cornea mikroszkópia, amely az OCT és UBM-hez hasonlóan a vastagságmérésen túl a szaruhártya belső szerkezetéről is in vivo szolgáltat adatokat (48-50,76). 3.3.3. A szaruhártya belső szerkezetének vizsgálata A cornea strukturájának in vivo vizsgálatára alkalmasak a pachymetriával kapcsolatosan említett klinikai vizsgálómódszerek közül az UBM, az OCT és a
- 12 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
konfokális cornea mikroszkóp. Az UBM és az OCT keresztmetszeti képek készítésére alkalmas, míg a konfokális corneamikroszkóppal rétegfelvételek nyerhetők. A cornea szövete fixációtól függően számos vizsgálatnak vethető alá. A formalinos fixáció és paraffinos beágyazás mellett a transzmissziós elektron mikroszkópiához szükséges epoxy beágyazás és a fagyasztásos fixáció nyújtanak lehetőséget a celluláris és az ECM változások megfigyelésére. Immunhisztokémia segítségével nagy specificitással azonosíthatók az ECM alkotóelemei. Caterson (14) monoklonális egér ellenanyagot dolgozott ki, amelynek segítségével a keratán-szulfát (poliszacharid részéhez kapcsolódva) szelektíven kimutatható. A szaruhártya sejtjei és a sejtközötti
állomány
összefüggésének
vizsgálatára
a
sejtek
életfolyamatainak
nyomonkövetésére is alkalmas az immunhisztokémia. Így az epithelium és a keratocyták proliferációjának, a programozott sejthalál (apoptosis) (133-136) és a gyulladásos sejtek (95) azonosítása is lehetséges. Az immunhisztokémia előnye a pontos lokalizáció lehetősége, hátránya, hogy csak szemikvantitatív értékelést tesz lehetővé. A szaruhártya sebgyógyulásának és homeostasiának pontos szabályozási lépésének számos területe még ismeretlen. Az apoptosis (programozott sejthalál) szerepét felvetették (43,53,74). Az apoptosis szerepe más cornea betegségekben, így Fuchs dystrophiában is igazolódott (121). A szaruhártya ultrastrukturális változásainak tanulmányozásában a transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) is számos információt nyújt mind a celluláris, mind az ECM változásairól (9,34). Pontos mennyiségi meghatározásra biokémiai módszerek szolgálnak (105,106). Ebben komoly nehezítő körülmény a szaruhártya kis tömege (kb 40 mg), amely sok módszernél azt vonja maga után, hogy az adott anyag kimutathatóságához legalább tíz teljes cornea együttes feldolgozására van szükség (55). További hátránya, hogy nem lokalizálható, hogy az adott anyag a szaruhártya mely rétegében halmozódott fel. Zhang (142) az ún. electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) technikával fagyasztott metszeteken mennyiségi meghatározásokaz végzett. A celluláris és ECM összefügések vizsgálatára sejttenyészet vizsgálatok használatosak (12,42). Léteznek három dimenziós kontraktilis sejt-mátrix modellek is, amelyek a cellulárisextracelluláris kölcsönhatások pontosabb leírására szolgálnak (35).
- 13 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A PRK a pontos adagolhatósága révén elterjedt modellt kínál a szaruhártya felszínes sérüléseinek nyomonkövetésére. Leggyakrabban nyúl (19,38) és majom (39) szaruhártyája használatos modell. Vizsgálatainkban nyulak kezelését végeztük, ezért szükséges szót ejtenünk az ember és a nyúl szaruhártyája közötti különbségekről (98). A nyúl szem mérete kisebb az emberénél (kb. 19 mm hosszú), de a cornea dimenziói hasonlatosak vastagság és átmérő tekintetében. A limbus és a trabeculáris rendszer felépítése eltérő. A szaruhártya felépítésében az egyetlen jelentős különbség a Bowmanmembrán hiánya, amelynek a szaruhártya stabilitásában játszott szerepét újabb ultrastrukturális vizsgálatok alapján az emberi szaruhártyában is megkérdőjelezik (137). További különbség, hogy a teljes epithelium eltávolítás után mintegy 24 órán belül teljes hámregenerációt írnak le nyúl szemekben, míg emberben ez hosszabb időt igényel. A gyors epithelizációban az epitheliális ősejtek a cornea centrumában való jelenlétét feltételezik, amelyek emberi corneában csak a limbusban helyezkednek el (103). Az ECM összetételét illetően kifejezett eltérések az emberi és a nyúl cornea között nem igazolódtak, amely az állatmodell eredményeinek emberi szövetre való értelmezését elősegíti.
- 14 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
4. CÉLKITŰZÉSEK Célunk a sejtközötti állomány vizsgálata egészséges és degeneratív elváltozással rendelkező corneában iatrogén seb gyógyulása során egyrészt humán anyagon klinikai diagnosztikus
módszerekkel,
másrészt
állatkísérletes
anyagon
hisztopathológiai
módszerekkel. 4.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után A szaruhártya degeneráció (arcus lipoides) során a sejtközötti állományban lipid halmozódik fel. Célunk megvizsgálni a lipid lerakódásnak a cornea sebgyógyulására gyakorolt – klinikailag kimutatható – hatását. •
Az arcus lipoides ritka, féloldali ptosissal együtt járó formájában nyomon kívántuk követni, hogyan változnak a szaruhártya keratometriás értékei 9 mm hosszú corneosclerális seben keresztül végzett extracapsuláris szürkehályog műtét után.
•
A kazuisztika tapasztalataira alapozva prospektív klinikai vizsgálatban annak elemzését tűztük ki célul, hogy miként befolyásolja az arcus lipoides kapcsán megváltozott ECM a cornea topográfiás paramétereit corneális sebkészítéssel végzett phakoemulzifikáció esetén.
4.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (Klinikai vizsgálat humán anyagon) A LASIK-ot követő korai posztoperatív látóélesség hátterében feltételezett átmeneti cornea oedema a szaruhártya vastagságának növekedésével jár. •
A cornea oedema kialakulásának dinamikáját kívántuk részleteiben feltárni.
•
A szaruhártya vastagságának LASIK beavatkozás különböző fázisaiban végzett méréséből következtetni terveztünk az oedema mértékére.
- 15 -
Doktori értekezés
•
Dr. Resch Miklós
Megvizsgáltuk, változik-e a cornea vastagsága LASIK műtét kapcsán és azt követően a sebgyógyulás során, továbbá hogy mikor lép fel és meddig marad fenn az oedema a LASIK-lebenyben illetve a stromában.
4.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet) A cornea felszíni lézerkezelése a stroma ECM átrendeződését eredményezi a transzparencia és a látóélesség rovására. Célunk a stroma ECM fő alkotóelemének, a GAG-nak, különös tekintettel a KS-nak az eloszlását tanulmányozni PRK után az alábbi szempontok alapján: •
Hogyan változik meg a szaruhártyában a GAG és a keratán szulfát eloszlása nyúl kísérletes modellben PRK után?
•
A cornea stromát milyen mélységben érintik a változások?
•
A GAG és keratán szulfát változások összefüggésben állnak-e az epithelium regenerációjával, a gyulladásos sejtek jelenlétével, a keratocyták sűrűségével, proliferációjával és apoptosisával?
- 16 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
5. MÓDSZEREK 5.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után 5.1.1. Esetbemutatás A jelentős extracelluláris lipoid lerakódás sebgyógyulásra gyakorolt hatásának elemzését elsőként az arcus lipoides féloldali ptosissal együttjáró, ritka formájában mutatjuk be. TMS-2 (Tomey, Erlangen, Németország) cornea topográfia segítségével a corneális astigmia szimulált keratometriás (SimK) értékek vizsgálatát végeztük az extracapsuláris cataracta műtét után és varratszedés után. Az arcus lipoides és a ptosis lehetséges pathomechanikai kapcsolatát elemeztük. Panaszok. A jelentkezésekor 70 éves nőbeteg a területi szakrendelés beutalását követően 2000. márciusában kereste fel klinikánkat bal szemének ptosis ellenes műtéte céljából. A bal szemrése gyermekkora óta szűkebb volt (2A. ábra), a két szeme közötti különbséget körülbelül húsz évvel korábban vette észre, mely látáspanaszt nem okozott. Anamnesis. Anamnézisében más szembetegség nem szerepelt, azonban krónikus pancreatitis, cholecystitis, hypertonia és pneumonia miatt belgyógyászati kezelésben részesült. Laboratóriumi leleteiben emelkedett vérzsírszintet találtunk: koleszterin 7,3 mmol/l, HDL koleszterin 1,56 mmol/l, LDL koleszterin 5,11 mmol/l, triglicerid 0,96 mmol/l és emelkedett szérum lipáz (79 mmol/l) valamint gamma-GT (38 U/l) értékeket észleltünk. Felvételi status. Jelentkezésekor a bal szemrés 4 mm-rel keskenyebb volt a jobb oldalinál, amely normális volt (11 mm) (2B. ábra). A jobb szemen sem cornea erezettség, sem limbus menti homály nem volt észlelhető (2C. ábra). A bal szemen a szaruhártyában teljes vastagságban, körben, de felül kifejezettebb vajsárga körkörös lerakódás volt megfigyelhető, a limbusban 0,5-0,8 mm széles gyűrűt szabadon hagyva. A limbusban körben kisfokú ereződés látszott (2D. ábra). A corneális astigmia a jobb szemen 0,75 D, a bal szemen 1,75 D volt.
- 17 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A
B O.D.
C
O.S.
D
2. ábra. Féloldali ptosis és arcus lipoides A. 20 éves korban készült fotó. Bal oldali ptosis látható. A szaruhártya homály megjelenésének ideje nem ismert, a fotón mindkét cornea tisztának látszik. B. A beteg első megjelenésekor készült fotó. A ptosis a fiatalkori képhez képest keveset változott, az arcus lipoides a makroszkópos fotón is kivehető. C. Fotó a jobb szemről: a cornea tiszta, arcus lipoides nem látható. D. A bal szemről a varratszedést követően készült fotó: körben erezett limbus, a corneában vajsárga gyűrű alakú homály, a limbus áttetsző.
- 18 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
5.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány A fenti eset kapcsán észlelt jelentős corneális astigmia alapján prospektív klinikai vizsgálatot terveztünk az extracelluláris corneális lipidlerakódás sebgyógyulásra gyakorolt hatását tanulmányozandó. Vizsgálatban résztvevők: A Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikán egymást követő 40 beteg, 40 szeme került a vizsgálatba (1. táblázat). A szemeket az arcus lipoides körkörös kiterjedése alapján réslámpás vizsgálatot követően osztályoztuk a Blue Mountain Eye Study (17) szemikvantitatív módszerét követve (3. ábra): 0. csoport (n=6) arcus lipoides nem látható, 1. csoport (n=18) az arcus lipoides kiterjedése
≤180°, 2. csoport (n=16) az arcus lipoides kiterjedése >180°.
0: nincs arcus lipoides; 1: arcus lipoides ≤180º; 2: arcus lipoides >180º 3. ábra: Az arcus lipoides stádiumai a lipid circumferenciális lerakódása alapján
Csoport (az arcus lipoides kiterjedése)
Szemek
0
1
2
56,3+/-4,8*
70,1+/-12,0
71,9+/-7,4
Nem értékelhető
0
1
3
4
Preoperatív
6
17
13
36
1 nap
4
14
11
29
10 nap
4
11
5
20
1 hónap
4
14
9
27
3 hónap
3
11
6
20
Életkor (év)
száma
1. táblázat. A topográfiás tanulmányban résztvevők demográfiai adatai és az esetszámok a követési idő során. - 19 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Műtét: Minden beteg egyik szemén 4 ml 2% Lidocain (Egis, Budapest) és 1 ml Naropin (Ropivacain hydrochloratum 7,5mg/ml, Astra Zeneca AB, Södertalje, Svédország) retrobulbáris érzéstelenítésben ugyanazon operatőr XII óra poziciónál 3,2 mm-s tisztán corneális alagútseben keresztül szövődménymentes phakoemulzifikációt végzett 4,0 mm-re megnagyobbított seben keresztül történő hydrofób akril hátsó csarnok műlencse (PCL) tokzsákba történő beültetéssel. A corneasebet varrattal nem zártuk. Cornea
topográfia:
Cornea
topográfiát
(TMS-2,
Tomey,
Erlangen,
Németország) végeztünk a műtét előtti napon, a műtét utáni 1. és 10. napon, valamint 1 és 3 hónappal műtét után. Minden vizsgálatnál törekedtünk arra, hogy a felvétel pislogás után standard idővel (5 másodperc) történjen a könnyfilm dinamika hatásának minimalizálása érdekében. (27,91,132). Cornea topográfia előtt egy órával szemcseppet hasonló okból nem adtunk. Vizsgált paraméterek: keratometriás cylinder (Dcyl), felszíni szabályosság index (SRI), felszíni aszimmetria index (SAI), potenciális látóélesség (PVA). Statisztika. Az adatok statisztikai feldolgozása a Wilcoxon és a Mann-Whitney féle nem paraméteres tesztekkel történt az SPSS (version 10.0 for Windows; SPSS Inc., Chicago, USA) szoftver felhasználásával. A különbségeket szignifikánsnak tekintettük, ha p<0,05 (konfidencia intervallum 95%).
5.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (Klinikai vizsgálat humán anyagon) A szaruhártya oedema arányos a szaruhártya vastagságával. A szaruhártya vastagságának ultrahangos mérését a LASIK műtét során kialakuló hidratáció változások vizsgálatának céljából végeztük. Vizsgálatban résztvevők: Harminc, korábbi szembetegséget nem említő személy 30 szemén végeztünk vizsgálatokat írásos beleegyezésük után. Közülük 21 myopiás (28,9+/-8,6 év; -8,40+/-2,40 D) és 9 hypermetropiás (32,7+/-10,7 év; +5,06+/-0,87 D) - 20 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
fénytörésű volt. A vizsgálatban résztvevők demográfiai és klinikai adatait a 2. táblázat foglalja össze. A kontaktlencse viselők a vizsgálatot megelőző egy hétben nem hordták a kontaktlencséjüket. A humán vizsgálatok megfeleltek a Helsinki Deklarációban foglalt alapelveknek.
MYOPIA (n=21)
HYPERMETROPIA (n=9)
Átlag +/- SD
Min, Max
Átlag +/- SD
Min, Max
Életkor (év)
28,9+/-8,6
21; 51
32,7+/-10,7
25; 51
Szférikus D
-8,12+/-2,7
-12,5; -2,5
+5,1+/-0,9
+4,0; +6,25
Cylinder D
-1,08+/-1,35
-5,0; -2,5
+0,7+/-1,1
0; +3,0
-8,6+/-2,5
-12,5; -4,75
+5,4+/-0,9
4,0; +6,25
Szférikus ekvivalens
2. táblázat Az ultrahangos pachymetriás vizsgálatban résztvevők demográfiai és klinikai adatai Kezelés. Helyi érzéstelenítésben (2x 0,4% oxybucaine - Humacain 0,4%, Human Pharmaceuticals, Gödöllő) LASIK műtétet végeztünk a Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikán. Intraoperatív komplikáció nem lépet fel. A cornealebenyt 130 µm beállítással Moria CB Microkeratome (Moria SA, Antony, France) segítségével készítettük. A cornea lebeny nyelét XII óránál pozícionáltuk. Az argon fluorid (ArF) excimer lézer fotoablációt Zeiss Meditec MEL 70G-Scan excimer lézer készülékkel végeztük. A készülék aktív szemkövető rendszerrel (eye-tracker) volt ellátva, beállításai a következők voltak: repülőpont átmérője 1,8 mm, energiasűrűség 250 mJ/cm2, frekvencia 35 Hz. A fotoabláció során eltávolított stroma szövet területének átmérője és mélysége egyénenként változó volt: a dioptria függvényében a szoftver kiszámítja a fotoabláció legnagyobb mélységét (un. tervezett fotoablációs mélység). A műtét végén helyi széles spektrumú antibiotikumot (Tobramycin, Tobrex, Alcon) és szteroidot (0,5% Fluorometholone, Flucon, Alcon) cseppentettünk, majd lyukas kagylókötéssel ellátva otthonukba bocsátottuk a pácienseket. Mérések. A Humphrey (Model 850 San Leandro, CA, USA) 10 Mhz transzducerét fertőtlenítés (5% Povidon iodine – Betadine és steril 0,9% NaCl oldat)
- 21 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
után a cornea centrumára illesztve ultrahangos pachymetriát végeztünk a LASIK műtét előtt, annak egyes fázisait követően és a posztoperatív időszakban. Pachymetriával mértük a cornea vastagságát a centrumban az alábbi időpontokban: műtét előtt, lebenykészítés után, fotoabláció után, lebeny visszahajtása után 5 perccel, majd a posztoperatív 1. és 5. napon, és a kezelés után 1 és 6 hónappal (4. ábra). A lebeny felhajtott helyzetében a stromaágy központi vastagsága (CST) volt mérhető. Minden alkalommal a három egymást követő mérés során nyert adatokat dolgoztuk fel.
- 22 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A
B
C
D 4. ábra. Sematikus ábra az ultrahangos pachymetria segítségével mért központi szaruhártya vastagságról (CCT). A szaruhártya centrumában készített keresztmetszetet ábrázoltuk a LASIK egyes fázisaiban. A piros nyilak az ultrahangos pachmyetriával közvetlenül mérhető centrális vastagságokat jelzik. A lebeny felhajtott helyzetében a stromaágy központi vastagsága (CST) mérhető. A. Preoperativ CCT B. Lebenykészítés utáni CST C. Excimer lézerkezelés utáni CST. A kék nyilak az ArF eximer lézer sugarait szimbolizálják. D. CCT a lebeny visszahelyezést követően. A szaggatott vonal a lebeny határát jelzi.
- 23 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Közvetlenül nyerhető adatok (4. ábra): •
preoperatív központi cornea vastagság (CCT)
•
stromaágy központi vastagsága (CST) a lebenykészítés után
•
CST a fotoabláció után
•
CCT a lebeny visszahajtását követően
•
Posztoperatív CCT (1. nap, 5. nap, 1. hónap, 6. hónap)
Számítható adatok: A közvetlenül mért adatokból számítás útján (ún. szubtrakciós pachymetria (99)) segítségével további számított adatokhoz jutottunk: •
Számított lebenyvastagság = preoperatív CCT − a lebenykészítés utáni CST
•
Számított fotoablációs mélység = a lebenykészítés utáni CST − a fotoabláció utáni CST
•
Tervezett CCT = preoperatív CCT − tervezett fotoablációs mélység]
•
Oedema = tervezett és mért CCT különbsége az egyes mérési időpontokban. Statisztika. Az adatok statisztikai elemzését az SPSS (version 10.0 for Windows;
SPSS Inc., Chicago, USA) szoftver felhasználásával végeztük. A variancia analízis (ANOVA) a lebenyvastagság gyártó által megadott értéktől való eltérés kimutatására szolgált. Egymintás t-próba segítségével végeztük a tervezett és mért/számított értékek összehasonlítását. A tervezett és mért/számított értékek közötti összefüggést Pearsonféle korreláció analízissel vizsgáltuk. A különbséget 95%-os konfidencia intervallum mellett fogadtuk el szignifikánsnak (p<0,05).
- 24 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
5.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet) A szaruhártya ECM fő alkotóelemének, a KS eloszlásának vizsgálata céljából szövettani vizsgálatokat végeztünk nyúl modellben. Kezelés. Az állattartás és a kísérletek nemzetközi szabályainak (NIH, No. 85-23, 1985) és az Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Határozat az állatok alkalmazásáról a kutatásban (Resolution on the Use of Animals in Research) állásfoglalásának megfelelően, a Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszer Ellenőrző Állomás jóváhagyásával 37, átlagosan 2,5-3,5 kg tömegű pigmentált nyúl (Oryctolagus cunniculus) jobb szemét kezeltük excimer lézerrel. Intramuscularis (50 mg/tkg ketamine) és helyi érzéstelenítés (2x 0,4% oxybucaine - Humacain 0,4%, Human Pharmaceuticals, Gödöllő) után az epitheliumot mechanikusan távolítottuk el hokikés segítségével. A fotorefraktív keratectomiát Aesclepion Meditec MEL 70G-scan (Asclepion-Meditec GmbH, Jena, Németország) repülőpont-technikás 193 nm hullámhosszú argon fluorid (ArF) excimer lézerrel végeztük. A készülék aktív szemkövető rendszerrel (eye-tracker) volt ellátva, beállításai a következők voltak: repülőpont átmérője 1,8 mm, energiasűrűség 250 mJ/cm2, frekvencia 35 Hz. A -6,0 D-nak megfelelő fotoabláció során eltávolított stroma szövet területének átmérője 6,0 mm, tervezett centrális mélysége 82 µm volt. A műtét végén egy alkalommal antibiotikum (Neomycin) és indomethacin tartalmú szemcseppet adtunk, további posztoperatív kezelést nem alkalmaztunk. Szövet preparálás. Kilenc csoportban, csoportonként 4-5 nyúl túlaltatását végeztük el (70 mg/tkg ketamine, 40 mg/tkg suxamethonium i.m.). A túlaltatásra a műtét után 4 órával, valamint a posztoperatív 1., 4., 7., 14. és 28. napokon, továbbá 56 nap (2 hónap), 112 nap (3 hónap) és 208 nap (7 hónap) időpontokban került sor. Ezt követően mindkét szemet enukleáltunk (3. táblázat). A bulbusokat 4% formaldehidben fixáltuk és a szaruhártya kipreparálása után paraffinba ágyaztuk. A szaruhártya középső részéből 6 µm vastagságú metszeteket készítettünk Superfrost Plus tárgylemezre (Erie Scientific Company, Portsmouth, NH, USA). A bal, kezeletlen szemek képezték a kontroll csoportot. - 25 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Kezelési csoport (PRK után eltelt idő)
Szemek száma
Kizárt szemek száma*
Kezeletlen (kontroll)
37
3
4 óra
4
0
1 nap
4
0
4 nap
4
2
7 nap
5
1
14 nap
4
0
28 nap
4
0
56 nap (2 hónap)
4
0
112 nap (3 hónap)
4
0
208 nap (7 hónap)
4
0
3. táblázat. A PRK kezelt nyúl szemek adatai az egyes kezelési csoportokban és a kontroll csoportban. A csoportok felállítása a PRK és az enukleáció közötti idő alapján történt. *kizárás oka: mucopurulens keratoconjunctivitis Hisztológia. A metszeteken alcián-kék, hematoxylin-eozin (HE), Massontrikróm, perjódsav-Schiff (PAS), ezüst-impregnáció festéseket alkalmaztunk. A különböző festési eljárásokkal más-más paraméterek vizsgálatát végeztük el: A GAG kimutatására standard alcián-kék festést alkalmaztunk, amely azt kék színnel jelölte. Az epithelium sejtek, keratocyták, és gyulladásos sejtek azonosítása HE, Masson-trikróm és PAS festésekkel történt.
Festés
Gyártó
Kimutatás célja
Módja
anti-KS
Seikagaku
keratán szulfát
fluoreszcens immunhisztokémia
PCNA
DAKO
proliferáló sejt (epithelium)
immunhisztokémia és fluoreszcens immunhisztokémia
Ki67
DAKO
proliferáló sejt (keratocyta)
immunhisztokémia
Apoptag
Q-Biogene
apoptosis
immunhisztokémia
DAPI
Vector Laboratories
sejtmag
fluoreszcens immunhisztokémia
alcián-kék
SE Szemészeti Klinika
GAG
hisztológia
trikróm
SE Szemészeti Klinika
gyulladásos sejt
hisztológia
HE
SE Szemészeti Klinika
keratocyta
hisztológia
4. táblázat. Hisztológiai és immunhisztokémiai módszerek összefoglalása
Immunhisztokémia. Specifikus antitestek alkalmazásával az alábbi anyagokat és sejteket jelöltük (4. táblázat): - 26 -
Doktori értekezés
•
Dr. Resch Miklós
Keratán szulfát. A keratán szulfát kimutatása monoklonális, egérben termelt tisztított KS-ellenes antitest (Seikagaku Co., Tokio, Japan) 0,01 mg/ml koncentrációjú oldatával történt. A sejtmagvakat DAPI (diamino phenylindrol dihydro chlorid) festéssel jelöltük. Vectashield H-1000 (Vector Laboratories, Inc.
Burlingame,
CA
USA)
fedés
után
közvetlenül
fluoreszcens
mikroszkópiát (Nidek Ecclipse E600, Tokio, Japan) végeztünk. 200x-400x eredeti nagyítást használva digitális fotódokumentációt végeztünk. •
Sejt proliferáció. A sebgyógyulás során az epithelium és a keratocyták egyaránt proliferálnak. Az epithelium sejtek proliferációját a Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) antitesttel (DAKO, Glostrup, Denmark) jelöltük. Fluoreszcens
immunhisztokémia
során
a
kearatánszulfáthoz
hasonló
protokollt követtünk, nem fluoreszcens immunhisztokémia esetén másodlagos festést nem alkalmaztunk. A Ki67 ellenanyagot (DAKO, Glostrup, Denmark) elsősorban a keratocyták proliferációjának kimutatására használtuk (1:100 hígítás, chromogén: diaminobenzidint, háttérfestés: methyl zöld festés). •
Apoptosis. Proteináz K előkezelés után methanollal és hidrogén-peroxiddal blokkoltuk az endogén peroxidázt. 1:100 hígításban TUNEL-próbát (terminal deoxyribonucleotidyl
transferase-mediated
labelling,
Q-Biogene,
Apoptag,
dUTP-digoxigenin
nick-end
Strasbourg, France) végeztünk. Az
apoptotikus sejteket morfológiájuk és a TUNEL reakció pozitivitása alapján azonosítottuk. Mérések. A távolság adatokat a mikroszkóp által használt skála (okulár mikrométer) segítségével határoztuk meg a különféle festések után. •
Epithelium vastagság. HE metszeteken a cornea centrális részén öt, egymást nem átfedő sejtoszlopnak megfelelően mértük az epithelium vastagságát.
•
Centrális stroma vastagság (CST). A stroma vastagságát metszetenként (alcián kék és keratán szulfát fluoreszcens immunhisztokémia) 3 helyen mértük meg: a centrumban és 500 µm távolságra mindkét irányban a periféria felé (5. ábra). A hisztológiai előkészítés bizonyos mértékig megváltoztatja a szaruhártya
- 27 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
vastagságát (79), amelyet a szövettani metszeteken mérhető vastagságnál figyelembe vettünk. Minden szövet esetében azonos koncentrációjú fixáló oldat azonos ideig történő alkalmazásával törekedtünk az egyes metszeteken az azonos vastagságváltozás elérésére. •
Keratán szulfát réteg vastagság. Az elülső és hátsó stroma azon részének vastagságát, ahol KS volt kimutatható, a CST-nél leírtak szerinti helyeken mértük meg.
•
Az infiltráció mélysége. Az elülső stroma gyulladásos sejteket tartalmazó részének vastagságának CST %-os arányában.
- 28 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A
KS
CST 500 µm
500 µm
B 0,1 mm
45 %
0,1 mm
5. ábra. A szaruhártya stroma és KS-pozitivitású rétegek vastagságának mérési módszere. A. Sematikus ábra a szaruhártya keresztmetszetéről. Szürke színnel a stroma, zölddel a KS réteg, kékkel a keratocyták ábrázolódnak. A piros négyzet egy High Power Field (HPF = 100x100 µm) területét jelzi. B. Hisztológia 4 nappal a PRK után a regenerálódó epithelium és a stroma elülső 45%-át infiltráló gyulladásos sejtek láthatók. A piros négyzet a HPF jelölésére szolgál. (Masson trikróm, eredeti nagyítás 200x).
- 29 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Számítások •
Keratocyta sűrűség. A keratocyták számolása CST mérésénél használt két, perifériás mérési sík közé eső területre (kb. 500x1000 µm2) vonatkozott (5. ábra).
•
Apoptotikus sejtek sűrűsége. A TUNEL immunhisztokémiával azonosított apoptotikus sejtek sűrűségét öt, egymást nem átfedő 100x100 µm területű négyzetben (un. High Power Field = HPF) számláltuk.
•
Proliferáló
keratocyták
sűrűsége.
A
fentiekhez
hasonlóan
a
Ki67
immunhisztokémia segítségével jellemzett proliferáló sejtek sűrűségét a stromában HPF-re vonatkoztatva adtuk meg. •
Gyulladásos sejtek sűrűsége. A fentiekhez hasonlóan a gyulladásos sejtek sűrűségét HE metszeteken határoztuk meg HPF- re vonatkoztatva.
Statisztika. A statisztikai elemzést Statistica 6.0 program (Statsoft Inc, Tulsa, Okla) felhasználásával kétmintás t-próba segítségével végeztük. A kétmintás t-próba során a kontroll csoport értékeitől való eltérést vizsgáltuk. Ezalól kivételt képzett a CST. A csoportokban kapott CST eredmények statisztikai összehasonlítása a számított stroma vastagsággal történt, azaz a CST-ből kivontuk a fotoablációs mélységet (= CST-82 µm). A különbséget 95%-os konfidencia intervallum mellett fogadtuk el szignifikánsnak (p<0,05).
- 30 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
6. EREDMÉNYEK 6.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után 6.1.1. Esetbemutatás Kórlefolyás. A beteg első megjelenésekor (2000. március) látóélessége a jobb szemen 0,6 volt, melyen üveg nem javított, a bal szemen -3,0 szférikus dioptriával 0,4-re volt korrigálható. 2000. márciusában frontális szuszpenziót végeztünk szilikon szalaggal a ptosis miatt. Fél évvel később a bal szemen a romló látóélesség hátterében álló szürkehályog miatt extrakapszuláris hályogkivonásra került sor. A szürkehályog műtétet követően a látóélesség elmaradt a műtét előtti állapothoz képest, a szaruhártya nagyon lassan tisztult fel és nagyfokú asztigmia alakult ki. A posztoperatív első hónapban végzett cornea topográfia szimulált keratometriás értékei (Sim K = 52,0D x 80 / 37,0D x 170) igazolták a nagyfokú asztigmiát (6. ábra). Az asztigmia csökkentésének érdekében 2001. januárjában a tovafutó corneosclerális varratot eltávolítottuk, így valamivel kedvezőbb keratometriás értékeket kaptunk, de még így sem sikerült az asztigmiát 10 D alá szorítani (Sim K = 45,7D x 82 / 35,3D x 172) és a látóélességet 0,2 felé korrigálni. 2001. márciusára kisfokú, majd 2001. szeptemberére további javulást észleltünk a visusban és az asztigmia is csökkenést mutatott (Sim K: 46,73D x 44 / 41,86D x 134). 2001. novemberére a bal szemen –2,0 Dcyl 140º korrekcióval 0,5 látóélességet sikerült elérni. Ugyanekkorra a jobb szem visusa 0,5-re csökkent. 2003. áprilisára a corneális asztigmia 5 D alá csökkent (Sim K: 45,8D x 44 / 41,4D x 134. Kiegészítő vizsgálatok. Az arcus lipoides aszimmetriájára való tekintettel Doppler vizsgálat végzését kértük, amely szerint az arteria carotis egyik szakaszán sem igazolódott keringési akadály. Az arteria subclavia és vertebralis keringése is megtartott volt. Észlelésének közel két éve alatt rendszeresen Goldmann-féle applanációs tonometriával mértük a szemnyomást, mindkét szemen 16-19 Hgmm közötti értéket kaptunk, a két oldal közötti 2 Hgmm-nél nagyobb különbséget egy alkalommal sem találtunk.
- 31 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
6. ábra. Cornea topográfia féloldali arcus lipoidesben. A jobb szem szabályos topográfiai jellegzetességgel bír, míg a körkörös lipidlerakódásos bal cornea felszíne egyenetlen.
6.1.2. Prospektív klinikai cornea topográfiás tanulmány A preoperatív vizsgálatok során a 0-1 és 0-2 csoportok között nem tértek el egymástól a Dcyl, SRI és PVA paraméterek (Mann-Whitney U-test). Az egyes paramétereket külön-külön táblázatban (5-8. táblázatok) és a 7. ábrán foglaltuk össze. A 2. csoportban a corneális astigmia 1 nappal (3,1+/-1,9D) és 10 nappal (2,7+/-2,1D) a műtét után szignifikánsan eltért a műtét előtti (1,8+/-1,9D; p<0,05, Wilcoxon-teszt) és a kontroll csoport értékeitől (preop.: 1,3+/-0,7D; 1 nap: 1,2+/-0,4D; 10 nap:1,1+/-021D; p<0,05, Mann-Whitney-teszt) (5. táblázat). A posztoperatív 1-3 hónapban az arcus lipoides az SRI (6. táblázat), SAI (7. táblázat) és PVA (8. táblázat) paramétereket jelentősen nem befolyásolta.
- 32 -
Doktori értekezés
Cylinder (D) Mérés
Dr. Resch Miklós
Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) 0
1
2
Preoperatív
1,29+/-0,67
1,19+/-0,25
1,82+/-1,96
1 nap
1,22+/-0,39
1,70+/-0,31*#
3,10+/-1,90*#
10 nap
1,12+/-0,21
1,12+/-0,23
2,7+/-2,15*#
1 hónap
0,91+/-0,19
1,20+/-0,20
2,64+/-1,74*#
3 hónap
1,12+/-0,10
0,91+/-0,18
1,33+/-0,28
5. táblázat. A keratometriás astigmia az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). # szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test).
SRI Mérés
Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) 0
1
2
Preoperatív
0,83+/-0,27
0,70+/-0,33
0,62+/-0,31
1 nap
0,84+/-0,15
1,21+/-0,28*#
1,36+/-0,29*#
10 nap
0,71+/-0,24
0,68+/-0,22
1,01+/-0,13*#
1 hónap
1,11+/-0,17
0,81+/-0,23
0,76+/-0,17
3 hónap
0,39+/-0,14
0,56+/-0,29
0,45+/-0,14
6. táblázat. A felszíni szabályosság index (SRI) az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). # szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test).
- 33 -
Doktori értekezés
SAI Mérés
Dr. Resch Miklós
Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) 0
1
2
Preoperatív
1,02+/-0,32
0,52+/-0,18#
0,69+/-1,04#
1 nap
0,54+/-0,24
1,10+/-0,30*#
1,17+/-0,83*#
10 nap
0,63+/-0,03
0,43+/-0,08
1,01+/-0,66
1 hónap
0,63+/-0,12
0,53+/-0,11*
0,49+/-0,59
3 hónap
0,45+/-0,15
0,44+/-0,09
0,68+/-0,54
7. táblázat. A felszíni aszimmetria index (SAI) az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). #szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test).
PVA Mérés
Csoport (az arcus lipoides kiterjedése) 0
1
2
Preoperatív
0,71+/-0,07
0,87+/-0,67
0,83+/-0,31
1 nap
0,89+/-0,09
0,63+/-0,07#
0,61+/-0,25#
10 nap
0,70+/-0,06
0,73+/-0,06
0,59+/-0,28
1 hónap
0,64+/-0,07
0,77+/-0,05
0,73+/-0,29
3 hónap
1,06+/-0,08
0,90+/-0,04
0,80+/-0,25
8. táblázat. A potenciális látóélesség (PVA) az egyes csoportokban a követési idő során. *szignifikáns eltérés a preoperatív értéktől (p<0,05; Wilcoxon-Test). # szignifikáns eltérés a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05; Mann-Whitney Test).
- 34 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A corneális astigmia magasabb volt a preoperatív értéknél (Wilcoxon-test) az 1. csoportban az 1. napon (p=0,02) és a 2. csoportban az első napon (p<0,01), a 10. napon (p<0,01) és 1 hónapnál 1 (p=0,01). A csoportokat öszahasonlítva az 1. csoportban (p=0,03) és a 2. csoportban (p=0,01) a corneális astigmia magasabb volt a 0. csoportnál (Wilcoxon-teszt) a követési idő során végig (7A. ábra). Az első postoperatív hónapban kifejezetten nagyobb astigmia alakult ki phacoemulsificatio után. A felszíni szabályosság index gyengébb volt (magasabb SRI) az 1. csoportban (p=0,04) és a 2. csoportban (p=0,01) a 0. csoporthoz képest az 1. posztoperatív napon. Az SRI a 2. csoportban magasabb maradt a 10. napon is, míg a különbsége eltűnt az 1. csoportban a 10. napra. Minden csoportban az SRI fluktuációt mutatott a követési idő alatt, de a 3. hónapra stabilizálódott. (7B. ábra). A felszíni aszimmetria index (SAI) preoperatíve magasabb volt az 1. csoportban (p=0,05) és a 2. csoportban (p=0,04) a 0. csoporthoz hasonlítva (Mann-Whitney teszt). A többi topográfiás paraméter közül az SAI mutatta a legnagyobb fluktuációt. (7C. ábra). A potenciális látóélesség (PVA) az 1. és 2. csoportokban elmaradt a 0. csoporthoz képest, egyebekben a követési idő során a változás nem volt számottevő (7D. ábra).
- 35 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
7. Ábra. A cornea topográfiás paraméterek posztoperatív változása az arcus lipoides különböző stádiumaiban. A. Keratometriás astigmia (Dcyl); B. Felszíni szabályosság index (SRI); C. Felszíni aszimmetria index (SAI); D. Potenciális látóélesség (PVA). A keratometriás astigmia preoperatíve nem különbözik az egyes csoportokban. A posztoperatív érték szignifikánsan eltér a preoperatívtól, amely a 2. csoportban csak 3 hónaponál tűnik el, míg az 1. csoportban 10 napnál. Az SRI lassabb stabilizációja megfigyelhető. Az SAI görbék preoperatíve eltértek a 0. csoporttól. A PVA görbék hasonlóak az egyes csoportokban. * szignifikáns különbség a preoperatív értéktől (p<0,05, Wilcoxon Test) # szignifikáns különbség a 0 fokozatú arcus lipoides csoporttól (p<0,05, Mann-Whitney Test)
- 36 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
6.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (Klinikai vizsgálat humán anyagon) A műtétek során sem intra-, sem posztoperatív komplikáció nem lépett fel. Az adatokat a 9. táblázat foglalja össze. A szaruhártya lebeny átlagos vastagságát 133,2+/26,4 µm-nek mértük (min. 77; max 202µm), amely nem tért el a beállított értéktől (130 µm, ANOVA, p= 0,293). A myopiás szemekben a tervezett és a számított fotoablációs mélység között nem volt szignifikáns különbség (egymintás t-próba p=0,018) (8. ábra), köztük lineáris korreláció volt kimutatható (Pearson, R=0,725, p=0,001), (9. ábra). A hypermetropiás kezelések során a kezelés geometriája miatt a centrális cornea vastagságban hasonló összefüggés nem mutatkozott (egymintás t-próba p<0,05). A stroma és a lebeny együttes vastagsága (CCT) a fotoabláció utáni méréstől (egymintás tpróba p<0,01) a posztoperatív 1. napig meghaladta a tervezett értéket (474,1+/-35,7µm) az egymintás t-próba (p<0,05) szerint. Cornea oedema. A vizenyő megítélésénél a myopiás szemeket vettük figyelembe, hiszen hypermetropia esetén a centrális szaruhártya vastagság nem tükrözi a fotoablációs terület változásait. A vastagság növekedése a vizenyő kialakulásával magyarázható, amely a fotoabláció után 55,4+/-48,1 µm-nek adódott (egymintás t-próba p<0,01). A lebeny visszahajtása után 5 perccel az oedema mértéke 98,3+/-49,7 µm-re nőtt (egymintás t-próba p<0,01), majd mérséklődött a posztoperatív 1. napra 29,8+/-30,4 µm (egymintás t-próba p=0,02). A szignifikáns (egymintás t-próba p=0,19) vastagság különbség (16,7+/-17,7 µm) csak 5 nappal a LASIK után tűnt el (8. ábra).
- 37 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós MYOPIA (n=21) Átlag +/- SD
Preoperativ CCT (µm)
Min, Max
HYPERMETROPIA (n=9) Átlag +/- SD
Min, Max
566+/-38,6
510, 640
570,2+/-27,6
535, 615
CST lebenykészítés után (µm)
439,6+/-38,5
398, 473
421,8+/-29,2
378, 455
CST fotabláció után (µm)
400,2+/-38,1*
322, 467
384,1+/-36,5*
322, 450
CCT a lebeny visszahajtása után (µm)
573,1+/-43,8*
510, 655
615,7+/-21,5*
585, 640
CCT posztoperatív 1. nap (µm)
501+/-46,6*
440, 584
582,7+/-21,9*
561, 613
CCT posztoperatív 5. nap (µm)
487,9+/-49,3*
439, 592
554,7+/-25,7*
527, 585
CCT posztoperatív 1. hónap (µm)
481,5+/-43,3
428, 570
553,1+/-26,3*
526, 588
CCT posztoperatív 6. hónap (µm)
480,7+/-42,6
432, 562
554,1+/-28,1*
518, 592
Számított lebenyvastagság (µm)
126,4+/-39,9
77, 202
148,3+/-19,1
130, 183
Tervezett fotoablációs mélység (µm)
94,7+/-13,5
68, 119
82,7+/-24,4
47, 110
Számított fotoablációs mélység (µm)
85,3+/-12,4
63, 109
16,1+/-5,1
9, 23
9. táblázat. Ultrahangos pachymetria eredményei a LASIK műtét egyes fázisaiban és a posztoperatív szakban. Tervezett lebenyvastagság 130µm. CCT –a mért központi cornea vastagság; CST – központi stroma vastagság (stromaágy) *szignifikáns különbség a tervezett és mért értékek között (egymintás t-próba, p<0,05).
- 38 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
8. ábra. A tervezett és mért központi szaruhártya vastagság (CCT) értékek a LASIK műtét során és a posztoperatív időszakban myopiás szemek esetén. Fekete oszlopok a mért és a tervezett értékek különbségét jelzik, amelyek intraoperatíve jelentekző cornea oedemával magyarázhatók. A tervezett CCT értéke (474,1+/-35,7µm) a lebeny visszahajtását követően változatlan, ehhez közelít a mért érték a posztoperatív időszakban. *szignifikáns különbség a tervezett és mért értékek között (egymintás t-próba, p<0,05)
- 39 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
14. ábra. A tervezett és számított (szubtrakciós pachymetria során meghatározott) központi fotoablációs mélység értékek közötti korreláció analízis myopiás szemekben. A folytonos vonal jelzi a lineáris korrelációnak megfelelően illesztett egyenest (Pearson, R=0,725, p=0,001), míg a szaggatott vonal a két változó teljes egyezését.
- 40 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
6.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet) Intraoperatív szövődményt nem észleltünk. Mucopurulens gyulladás miatt 3 kezelt szemet és a hozzájuk tartozó kontroll szemeket kizártunk a vizsgálatokból. Elsőként az ECM-re vonatkozó eredményeket, majd a celluláris változásokat részletezzük. 6.3.1. A sejtközötti állomány változásai Centrális stroma vastagság (CST). A kontroll szemek átlagos CST értéke 512+/-34 µm-nek adódott. Arra számítottunk, hogy a posztoperatív CST értékét a preoperatív CST-nél 82 µm-rel kevesebbnek mérjük. A posztoperatív 4 órában és az első posztoperatív napon a tervezettnél vastagabbnak mértük a stromát, amely az oedemával magarázható. A 4. naptól az oedema fokozatos csökkenésével a szaruhártya stroma is vékonyabbá vált. Hét nap után már a preoperatív vastagságnál vékonyabbnak mértük a stromát (478+/-41 µm). A preoperatív CCT értéket a 28. napnál érték el a vizsgált szemek (426+/-31 µm, p>0,05). Később ez stabilnak bizonyult (5. táblázat).
Kezelési csoport (PRK után eltelt idő) Kezeletlen (kontroll)
Hámosodás
Epithelium vastagság (µm)
CST (µm)
KS stromaréteg vastagsága Anterior (µm)
Posterior (µm) 50±14
teljes 4-5 rétegben
39,4±8,4
512±34
0
4 óra
hiányzik
0,0±0,0
520±56*
152±51*
46±21
1 nap
hiányzik
0,0±0,0
544±45*
200±35*
44±23
4 nap
teljes 1 rétegben
30,0±13,9
508±50*
180±46*
48±15
7 nap
teljes 3-4 rétegben
31,1±8,6
478±41*
118±52*
66±24
14 nap
teljes 4-5 rétegben
35,7±7,9
456±48*
2±10*
78±14*
28 nap
teljes 4-5 rétegben
32,0±11,9
426±31
23±8*
100±28*
56 nap (2 hónap)
teljes 4-5 rétegben
42,7±15,6
424±30
11±18*
76±20*
112 nap (3 hónap)
teljes 4-5 rétegben
32,6±11,7
428±45
6±8*
58±18
208 nap (7 hónap)
teljes 4-5 rétegben
33,1±8,2
420±28
0
50±21
10. táblázat. Eredmények összefoglalása I. A hámosodás és az extracelluláris változások. CST-centrális stroma vastagság; Anterior, posterior: a stroma elülső és hátsó részében azon rétegek vastagsága, amely KS-pozitivitást mutatott. * a kontrolltól szignifikáns eltérés (kétmintás t-próba, p<0,05)
- 41 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
GAG. A kontroll szemekben a GAG a stromában egyenletesen, homogén módon festődött alcián-kékkel. A kezelt szemekben az alcián-kék festés a GAG fokozott jelenlétét csak a stroma elülső harmadában igazolta a posztoperatív 7-28 napokon (10. ábra). A későbbi posztoperatív időpontokban a kontrolltól eltérést a GAG eloszlás terén nem tapasztaltunk. A hátsó stroma rétegekben GAG fokozódás nem volt kimutatható. A GAG átmeneti felhalmozódása PRK után egy fázisban zajlott le, a folyamat további részekre nem volt osztható.
50 µm
*
25 µm
A
B
C
10. ábra. GAG eloszlása. Alcián-kék festés után készült fotók. A GAG sötétkéken festődik. A. Posztoperatív 4. napon készült fotó. A stroma felszínt vékony, egyrétegű hám borítja. stroma lamellái között diffúz, egyenletes festődés (eredeti nagyítás 200x). B. 2 héttel PRK után az epithelium 2-3 rétegű. Az elülső stromában csillaggal jelzett GAG felhalmozódás (eredeti nagyítás 400x). C. 1 hónap után a hámréteg vastagabb, egyenletesebb. a lamelláris elrendeződés szabályosabb, az elülső stromában a 2. héthez képest vastagabb subepitheliális alcián-kék pozitivitást mutató réteg (eredeti nagyítás 200x). Keratán szulfát. A KS eloszlásának két, jellegzetes formáját tapasztaltuk a stromában: a. lamelláris elrendeződés és b. szemcsés, szabálytalan festődés. Kontroll szemekben kizárólag lamelláris festődést tapasztaltunk, a KS főleg a hátsó stromában volt jelen, az epitheliumban és az elülső stromában nem volt detektálható (11. ábra). A lamelláris festődés a kezelt corneákban is megfigyelhető volt. A PRK utáni 4 óra - 14 nap intervallumban a korábban nem festődő területen szemcsés festődés jelent meg. A - 42 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
szemcsés festődés a későbbi postoperatív időszakban lamelláris elrendeződésűvé alakult. A posztoperatív 4 órától az elülső stromában elhelyezkedő KS-pozitív rétegének vastagsága maximumát (200+/-35 µm) az 1. posztoperatív napra érte el (10. táblázat). A KS változása – szemben a GAG egyfázisú változásával – három fázisra volt tagolható, amelyet a 12. ábra diagrammja foglal össze: 1. fázis [4 óra – 14 nap (2 hét)]: Az első fázisban az excimer kezeléssel érintkező, elülső stromarétegekben észleltünk változást. Az elülső stromarétegek lamelláris szerkezete fellazult a korai posztoperatív időszakban, az interlamelláris térben szemcsés, habos elrendeződésű KS festődés jelent meg (11A-B. ábra). A 14. napon a szemcsés KS csak nyomokban volt fellelhető nagy nagyítással. 2. fázis [14 nap (2 hét) – 56 nap (2 hónap)]: A második fázisban a KS eloszlás változása az elülső és a hátsó stromában egyaránt jelentkezett. Az elülső stromában az 1. fázisra jellemző szemcsés KS-festődést fokozatosan felváltotta a hátsó stromára kontroll szemekben is jellemző lamelláris elrendeződésű KS eloszlás. A 7. naptól a hátsó stroma lamelláris elrendeződésű KS-festődéssel jelölt réteg vastagsága lassú növekedést mutatott (11C. ábra). A KS-pozitív hátsó stromaréteg a legvastagabbnak a posztoperatív 28. napon (100±28 µm) mértük (12. ábra). 3. fázis [56 nap (2 hónap) - 208 nap (7 hónap)]: A harmadik fázisban az elülső stroma lényegében nem mutatott változást, szemben a hátsó stroma lamellákkal. A hátsó stroma KS-pozitív réteg vastagsága a posztoperatív 3. hónapra (112 nap) nem tért el szignifikánsan a kontrolltól (kétmintás t-próba p=0,654, 10. táblázat). Az elülső stromában a 2. fázisban kialakuló lamelláris elrendeződésű KS rétegek kimutathatók a 112. napon is, a követési idő végén (208 nap) azonban ezek már nem detektálhatók.
- 43 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
11. ábra. KS immunhisztokémia. Fluoreszcens mikroszkóppal nyert fotók, zöld jelzi a monoklonális KS-ellenanyagot, kékkel a DAPI festéssel jelölt sejtmagok ábrázolódnak. A. Posztoperatív 4. napon készült fotó. A nyíl az egy rétegű hámosodás szélét jelzi. A nyílhegyek az elülső stroma töredezett keratocyta sejtmagvakra mutatnak. Jellegzetes az elülső stromában a habos-szemcsés szerkezetű degradálódott KS (eredeti nagyítás 200x). B. 2 héttel PRK után. 2-3 rétegű epithelium. A nyíl egy ép, aktiválódott keratocytára mutat, amelyet szemcsés KS vesz körül. Nyílheggyel jelzett egy töredezett, sötét udvarral körülvett keratocyta. Jellegzetes a KS lamelláris elrendeződése (eredeti nagyítás 400x). C. 1 hónappal PRK után a hátsó stromában felhalmozódott, lamelláris elrendeződésű KS, az endothelium sejtek felszíne pozitivitást mutat. *Descemetmembrán (eredeti nagyítás 200x). D. Posztoperatív 3. hónap: az 5 rétegű epithelium kissé szabálytalan. A hátsó stroma visszanyerte eredeti jellegét, az elülső stromában rétegesen lerakódott KS (eredeti nagyítás 200x). E. Kezeletlen (kontroll) bal szem corneája. Az elülső stromában KS nem mutatható ki, a hátsó stromában 45 µm vastagságú KS-pozitív réteg (eredeti nagyítás 200x).
- 44 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
12. ábra. Diagramm a KS-pozitív elülső és hátsó stromarétegek vastagságáról. A KS eloszlása három szakaszra bontható. * p<0,05 szignifikáns eltérés a kontrolltól (kétmintás t-próba) 6.3.2. Celluláris változások Epithelium Hámosodás és vastagság. A teljesen hámfosztott és fotorefraktív keratectomián átesett nyúl cornea átlagosan az 1-4. napra hámosodott be, ekkor 1-2 réteg borította a cornea elülső felszínét. Az epithelium vastagságának változását az 10. táblázat tartalmazza. A 7. napon már 2-3 rétegű epithelium képződött, amely a 28. napig proliferált, amikorra átlagosan 5 rétegűvé vastagodott. A 28. nap után az epithelium vastagsága lecsökkent 4-5 rétegre (10. táblázat). Az epithelium KS-festődést nem mutatott.
- 45 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Proliferáció. Proliferáló epithelium sejtet (PCNA pozitív) a 4-14. nap intervallumban azonosítottunk (13. ábra). A 4-7. napokon csaknem az összes epithelium sejt pozitivitást mutatott, a későbbi időszakban a basalis epithelium sejtek kisebb arányban, míg a felszínes epithelium sejtek egyáltalán nem festődtek.
13. ábra. Epithelium proliferáció kimutatása PCNA immunhisztokémia segítségével. A. 4 nappal PRK után az epithelium egy rétegben borítja a stromát. A proliferáló epitheliumsejtek magjai PCNA immunhisztokémiával sötét barnára festődnek (nyíl) (eredeti nyagítás 200x). B. Fluoreszcens immunhisztokémia a posztoperatív 4. napon: csak az epitheliumban volt kimutatható proliferáló sejt (vörös, eredeti nagyítás 200x).
- 46 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Keratocyták Keratocyta sűrűség. A kontroll csoportban átlagosan 62+/-20 keratocytát számláltunk, amelyekre az S-alakú, hosszúkásan elnyújtott forma volt jellemző, méretük egyforma volt, a stromát egyenletesen töltötték ki. A keratocyták sűrűsége lecsökkent PRK után 4 órával és 1 nappal (22+/-18), a posztoperatív 7. napnál (58+/-32) azonban nem tért el a kontrolltól. A keratocyta sűrűség 14. napnál (82+/-40) és 28. napnál (75+/24) meghaladta a kontroll értéket (11. táblázat). A hypocelluláris szakban (4 óra - 4. nap) az elülső stroma keratocyta magvainak egy része szabálytalanná, feltöredezetté vált (11B-C. ábrák - üres nyíl). A hypercelluláris szakban (14-28. nap) az elülső stroma keratocytáinak egy része megtartotta hosszúkás formáját és intenzív szemcsés elrendeződésű KS festődést mutatott (11B. ábra - nyíl). Néhány más keratocyta szögletes, kör, vagy szabálytalan alakúvá vált és a környezete nem festődött KS-tal (11B. ábra - üres nyíl).
Kezelési csoport (PRK Keratocyta sűrűség után eltelt idő)
Gyulladásos sejt / HPF
Stroma infiltráció mélysége (µm)
Ki67 pozitív keratocyta / HPF
TUNEL pozitív keratocyta / HPF 0
Kezeletlen (kontroll)
62±14
0
0
0
4 óra
34±25*
5
5±4
0
0
1 nap
22±24*
15
51±12
4
1
4 nap
32±28*
30
30±9
6
5
7 nap
58±21
12
22±12
7
2
14 nap
82±18*
8
19±11
6
5
28 nap
75±21*
0
0
0
0
56 nap (2 hónap)
52±18
0
0
0
0
112 nap (3 hónap)
51±15
0
0
0
0
208 nap (7 hónap)
53±16
0
0
0
0
11. táblázat. Eredmények összefoglalása II. Celluláris változások. * a kontrolltól szignifikáns eltérés (p<0,05 kétmintás t-próba)
- 47 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Keratocyta apoptosis és proliferáció. A kontroll szemekben sem apoptosis (TUNEL), sem proliferáció (Ki67) nem volt detektálható. A posztoperatív időszakban az 5 HPF területre vonatkoztatott proliferáló ás apoptotikus keratocyták sűrűségét a 11. táblázat foglalja össze. 4 órával PRK után sem Ki67, sem TUNEL immunhisztokémiával nem észleltünk poztitív sejtet. 1 nappal PRK után a stroma elülső harmadában 2 metszeten Ki67 pozitivitás (14A. ábra). és 1 metszeten TUNEL pozitivitás mutatkozott. A posztoperatív 4. és 7. napon az elülső stromában proliferáló és apoptotikus keratocyták egyaránt mutatkoztak (14B-C. ábra). Ki67 és TUNEL pozitív keratocyták a 14. napon még kimutathatóak voltak (14D. ábra), a későbbi posztoperatív időszakban azonban jelenlétük már nem volt igazolható immunhisztokémiával.
- 48 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A
B
C
D
10. ábra. A keratocyták proliferációjának és apoptosisának kimutatása Ki67 (A) és TUNEL (B-D) immunhisztokémiával. A. Az első posztoperatív napon Ki67 pozitív sejtek (nyilak) a hámfosztott cornea elülső stromában (eredeti nagyítás 200x). B. Posztoperatív 4. nap. Polymorphonukleáris (PMN) sejtek és apoptotikus sejtek (nyilak) a cornea stromában (eredeti nagyítás 200x). C. 7 nappal PRK után számos gyulladásos sejt kiséretében apoptotikus sejt (nyíl) azonosítható (eredeti nagyítás 400x). D. PRK után 14 nappal a többrétegű epithelium alatt aktiválódott keratocyták, gyulladásos sejtek és apoptotikus sejtek (nyilak) detektálhatók a stroma elülső harmadában (eredeti nagyítás 400x).
- 49 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Gyulladásos sejtek Gyulladásos sejtek sűrűsége és az infiltráció mélysége. A gyulladásos sejtek 4 órával PRK után a csupasz stroma felszínén voltak kimutathatók. Az első posztoperatív napon a stroma felszínes rétegeiben jelentek meg gyulladásos sejtek. A gyulladásos sejtek infiltrációja az elülső stromában az első posztoperatív napon jutott a legmélyebb rétegig (50%), a sejtek sűrűsége 4 nappal PRK után volt a legmagasabb (11. táblázat, 15. ábra). A 7. napon és a későbbi időszakban a gyulladásos sejtek jelenléte mérséklődött, majd a 14. nap után nem is volt kimutatható (16. ábra).
15. ábra. Hematoxylin-eosin festés 4 nappal a PRK után. Számos eosinophil sejt látható (nyíl, eredeti nagyítás 400x).
- 50 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
16. ábra. A gyulladásos sejtek sűrűsége és az infiltráció mélysége (diagramm) PRK kezelés után. A gyulladásos sejtek jelenléte nagyrészt a KS eloszlás 1. fázisának időszakában észlelhető (ld. 12. ábra) * p<0,05 szignifikáns eltérés a kontrolltól (kétmintás t-próba)
- 51 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
7. MEGBESZÉLÉS 7.1. Az arcus lipoides hatása a szaruhártya sebgyógyulására szürkehályog műtét után Az arcus lipoides nem tartozik a látóélességet veszélyeztető szaruhártya elváltozások közé, hiszen a lipid lerakódás megkíméli a cornea centrumát (4,44). Lipid keratopathia esetén (112,117) a cornea centruma is érintett lehet a látóélesség egyidejű romlásával. A lipid keratopathia lehet corneális érújdonképződés vagy krónikus gyulladás következménye, de előfordulhat primér elváltozásként is, amelynek hátterében a keratocyták anyagcsere zavarát feltételezik. Az arcus lipoides ugyanakkor rendkívül gyakori azon populáció szemeiben, akiknél szürkehályog műtétre kerül sor. Bármely technikával végzett phakoemulzifikáció indukál valamilyen mértékű keratometriás astigmiát (SIA), amely egészséges és arcus lipoidessel rendelkező corneában egyaránt igazolódott. A 9,0 mm hosszú corneosclerális sebkészítés utáni sebgyógyulást az arcus lipoides ritka, féloldali formáján tanulmányoztuk. A cataracta műtét után 12 D corneális astigmia alakult ki, amely 10 D-ra csökkent, majd varratszedés után tovább mérséklődött és mintegy két és fél évvel a műtét után normalizálódott 1,8 D-ra. Az arcus lipoides feltétlezhetően a corneális sebgyógyulás módosítása révén a posztoperatív corneális astigmia elhúzódó normalizálódását vonta maga után. A féloldali arcus lipoides patomechanizmusára vonatkozóan több, részben egymásba kapcsolódó feltételezés látott napvilágot. A kialakulásában szerepet játszó tényezőket a 17. ábra sematikusan foglalja össze. Az arcus lipoides különböző lipoidok: koleszterin, foszfolipidek és trigliceridek lerakódásának következménye, amelynek elsődleges hajlamosító tényezője a hyperlipoproteinaemia (elsősorban a IIa és IIb típusok), állatkísérletek során nyulak és kutyák tartós koleszterindús táplálását követően korábban és kifejezettebb formában jelentkezett arcus lipoides (4). A jelenleg ismert feltételezések szerint akkor jelentkezik a két szem között különbség a cornea depositumok mennyiségében, ha a két szem vérellátása eltér egymástól (az alacsonyabb perfúzió megvédi a szemet a lerakódástól), ha az érintett cornea terület a levegőből - 52 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
kevesebb oxigénhez jut, vagy ha az érintett oldalon a kapilláris permeabilitása megnövekszik.
Kapilláris permeabilitás
Gyulladás Erezett limbus
PTOSIS
Hypoxia Hőmérséklet Perfúzió
+
Ellenoldali carotis stenosis
Lipoid depositum
ARCUS lipoides
Serum lipid Hypotonia
Traumás iridodyalisis
Krónikus pancreatitis
Trabeculectomia
17. ábra. A féloldali arcus lipoides kialakulásában szerepet játszó feltételezett tényezők közötti összefüggések sémás ábrázolása. Perfúzió növekedés. Az ellenoldali arteria carotis interna szűkületére Smith (108) 1973-ban hívta fel a figyelmet: a carotis stenosis miatt a homolaterális szem keringése csökkent, így a kontralaterális szemhez képest kevesebb koleszterin rakódik le a cornea stromában. Szignifikáns carotis szűkület esetén gyakran amaurosis fugax fordul elő (94,115). A perfúzió különbség szerepét Innes (51) erősítette meg, egy Wilson-kóros páciensnél észlelt féloldali Kayser-Fleischer gyűrűt és ellenoldali arteria carotis interna stenosist. Bagla (2) ophthalmodynamometriás módszerrel igazolta a két szem keringése közötti eltérést. A relatíve magasabb perfúzió megjelenhet a szem hypotoniája miatt is, erre vonatkozóan Naumann (87-89) több esetet is ismertetett. Két cyclodialisissel járó tompa szemsérülést követő esetet mutatott be, továbbá két-két esetben a hypotonia okaként ismételt trabeculectomia illetve szürkehályogműtét szerepelt. Veltan (127) szekunder glaukomával járó Sturge-Weber szindróma miatt kezelt egy fiatal pácienst,
- 53 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
akinek az ellenoldali szemén kialakuló relatív hypotonia szolgáltatta a magyarázatot féloldali lipoid lerakódásra. Lokális hypoxia. A cornea felső része fiziológiás körülmények között a felső szemhéjak által fedett, így a cornea többi részéhez képest a levegőből kevesebb oxigénhez jut. A hypoxiás biokémiai környezet kedvez a lipoid depositumok felszaporodásának (4). Ezzel magyarázható az a megfigyelés, hogy 80 év felett a populáció 90%-át érintő arcus senilis általában itt jelenik meg először és itt lesz a legkifejezettebb. Kapilláris permeabilitás fokozódás. A serumban emelkedett szintű lipoprotein a corneába a kapillárisok falán keresztül jut át. Ha a kapillárisok permeabilitása megnő, az gyorsítja az arcus lipoides kialakulását (4). Green (37) fluoreszceinnel jelölt dextran molekulák mozgását vizsgálta cornea modellekben, amelyek során ezt a feltevést megerősítette. Azon a szemen, vagy a szaruhártya azon területén, ahol a kapillárisok áteresztőképessége megnő, ott fokozott lipoid depozícióval kell számolnunk. Naumann (88) krónikus iridocyclitis szerepét veti fel, Kaptein (54) krónikus recidíváló blebharitis és erysipelas szerepét feltételezi ép, szimmetrikus carotis keringés mellett. Emelkedett hőmérséklet. A cornea isothermiás vonalai horizontálisan nyújtott ellipsziseket alkotnak, a felső szemhéj által takart területen és a limbusban körben a legmagasabb a hőmérséklet, a centrum felé fokozatosan csökken (4). Az emelkedett hőmérséklet megjelenhet krónikus gyulladás (54), limbus erezettség miatt, de a veleszületett ptosis is melegebb környezetet tart fenn. A hőmérséklet emelkedése fokozza a kapilláris permeabilitást és a perfúziót egyaránt, így kettős módon is elősegíti a az arcus lipoides kialakulását. A fent ismertetett esetben az ellenoldali arteria carotis szűkület és a hypotonia kizárható volt, a betegnek krónikus gyulladásról nem volt tudomása és az elvégzett vizsgálatok során sem találtunk erre utaló jeleket. A beteg régóta zajló hasnyálmirigy gyulladása és hyperlipoproteinaemiája ismert volt. Esetünkben az etiológiát pontosan nem ismerjük, azt feltételezzük, hogy az azonos oldali szemhéjcsüngés által okozott magasabb hőmérséklet és a hypoxiás környezet magyarázza a nagyfokban aszimmetrikus arcus lipoides kialakulását. További magyarázatként szolgálhat a cornea extracelluláris
- 54 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
mátrix szabálytalansága is, melyet a szürkehályogműtétet követő nagyfokú asztigmiát okozó sebgyógyulás során tapasztaltunk. A féloldali arcus lipoides esetében észlelt nagyfokú corneális astigmia (SIA) alapján feltételeztük, hogy a szürkehályog műtét során a cornea szerkezete és rugalmassága oly mértékben megváltozik arcus lipoides esetén, amely befolyásolhatja a szaruhártya topográfiás jellemzőit. Prospektív tanulmányunkban a csoportok életkorbeli különbsége az arcus lipoides életkorral növekvő incidenciájával és kiterjedésével magyarázható. Moss és mtsai egy kohort vizsgálatban (75) az arcus lipoides előfordulását férfiakban 53,8%-nak, míg nőkben 48,5%-nak találták a 30-80 éves életkorban. Chua és mtsai (17) a Blue Mountains Eye Study részeként azt találták, hogy az arcus lipoides aránya prevalenciája egyenes arányban állt az életkorral és férfiakban gyakoribb. Az utóbbi tanulmány három fokozatú osztályozási módszerét használtuk fel tanulmányunkban. Eredményeink alapján a tisztán corneális behatolásból végzett phakoemulzifikáció hosszú távon nem okozott jelentős cornea topográfiás eltéréseket, a korai posztoperatív időszakra jellemző fokozott fluktuáció arra utal, hogy az arcus lipoides kisfokú szabálytalanságot eredményez a sebgyógyulásban. A keratometriás astigmia jelzi leginkább a cornea átmeneti instabilitását, amelyet magasabb fokú arcus lipoidesben tapasztaltunk. Számos tényező együttesen magyarázza eredményeinket. 1. A seb mérete. Az egyre kisebb méretű, tisztán corneális sebgyógyulás kisebb SIA-t eredményez, mint az extracapsuláris hályogkivonásnál alkalmazott hosszú, varratokkal zárt corneosclerális seb. Ezáltal az arcus lipoides hatása is nehezebben mutatható ki. Merriam (67) hatféle, méret és elhelyezés szempontjából különböző, cataracta műtét során alkalmazott sebkészítést összehasonlítva azt tapasztalta, hogy a 3 mm hosszú felső elhelyezésű, varrat nélkül hagyott corneaseb stabilizációja 10 nap alatt zajlik le, míg a tovafutó varrattal zárt, extracapsuláris műtét során készített seb 4,5 hónap alatt stabilizálódik. Egyetlen csomós varrat jelentősen növeli a keratometriás astigmiát (8). Barequet retrospektív tanulmánya szerint (5) a SIA 6 hét után mégy egyértelműen észlelhető és akár 12 hónappal a műtét után is kimutatható. A hosszú, tovafutó varrattal zárt corneosclerális heg nem csak magasabb SIA-t eredményez, de a SAI és az SRI mutatók is romlanak.
A három hónapos követési időben nyert - 55 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
eredményeink hasonlóak az Auckland Cataract Study (124) értékeihez, amely a posztoperatív 2 évben követte nyomon a topográfiás változásokat. A seb preoperatív keratometriás értékeinek ismeretében további un. relaxációs cornea bemetszéseket alkalmazva csökkenthető a SIA. A módszer refraktív phakoemulzifikáció néven terjedt el, első hazai eredményeiről Vámosi (126) számolt be. 2. A lipid lerakódás helye és a vizsgálómódszer. A cornea topográfia a szaruhártya elülső felszínéről származó képek feldolgozásának eredménye. Arcus lipodes esetén a lipid elsősorban a cornea stromában rakódik (4,117). A corneaseb gyógyulása elsősorban a stromában zajlik, így az nem mindig mutatkozik meg a szaruhártya topográfiában. A tényleges stroma folyamatok topográfiás és pachymetriás módszerek kombinálásával vizsgálhatók (71), amely a cornea elülső és hátsó felszínét egyaránt leképezi pachymetriával összekötve. 3. Könnyfilm. A könyfilmet befolyásolja minden sebészeti beavatkozás és a posztoperatív időszakban alkalmazott szemcseppek (92), így azok elfedhetik a szaruhártya valódi felszíni változásait, amelyek így nem mutatják az ECM eltéréseit. 4. Az arcus lipoides beosztása. Az arcus lipiodes fokozatbeosztása is korlátokat szab, hiszen az arcus lipoides leggyakrabban a felső szemhéj által fedett területen kezdődik, éppen ott, ahol a metszést készítettük. Így a nagyobb fokú arcus nem jelent fokozottabb kockázatot a szaruhártya stromális és felszínes remodelációjában. Összegezve azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a 4,0 mm-s felül készített tisztán corneális behatolás biztonságos megoldás arcus lipoides esetén, nem indukál nagyobb fokú corneális astigmiát, felszíni aszimmetrát és szabálytalanságot az egészséges szemekhez képest. A 3 hónapos eredményeket figyelembe véve, a sebgyógyulás független volt az arcus lipides kiterjedésétől, de a gyógyulás elhúzódóbbnak bizonyult. Előrehaladott arcus lipoidesben 4,0 mm-t meghaladó sebkészítés magas corneális astigmiát és nagyfokú felszíni szabálytalanságot eredményezhet, amely tükrözi a sejtközötti állomány sebgyógyulást módosító hatását.
- 56 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
7.2. A cornea oedema vizsgálata ultrahangos pachymetriával LASIK során (Klinikai vizsgálat humán anyagon) Az ultrahangos pachymetria jól reprodukálható mérésekre alkalmas módszer (70), amely intraoperatíve is alkalmazható (80,81). Az intraoperatív ultrahangos pachymetria rámutatott a LASIK lebeny készítése után gyorsan kialakuló szaruhártya oedemára. A szaruhártya oedema feltehetően a lebenyben és a stromaágyban is jelentkezik. A lebenyvastagság ultrahangos pachymetria segítségével csak közvetetten mérhető. A lebeny posztoperatív oedemájára vonatkozóan a OCT és konfokális mikroszkópos vizsgálatok szolgáltatnak eredményt. Utóbbi intraoperatíve nem végezhető. Az ultrahangos pachymetria intraoperatív alkalmazásának korlátait átléphetjük az elülső segmentum OCT-vel, amely non-kontakt módon folyamatosan képes információt szolgáltatni az intraoperatív oedema alakulásáról (141). Az elülső segment OCT jó reprodukálhatósági paraméterekkel rendelkezik (77) és összehasonlítható eredményt alkot az optikai pachymetria eredményeivel (130). Gyakran a mért lebenyvastagság eltér a tervezett értéktől, amelynek műtéttechnikai okai ismeretesek. Schumer (104) a Nidek mikrokeratomot vizsgálva a gyártó által megadott 130 µm -es hivatalos lebeny vastagságot 129 +/- 21,8 µm -nek találta, a 160 µm -es lebeny vastagságot azonban 10 µm-rel kevesebbnek mérte (150 +/- 29,6 µm). Yildirim a Hansatom mikrokeratommal végzett kísérleteket (125), a gyártó által megadott 180 µm -es lebeny vastagságot jóval alacsonyabbnak, 120,8 +/- 26,3 µm -nek találta. Durairaj szintén vékonyabbnak mérte az aktuális lebenyvastagságot a LASIK készülék gyártója által megadott értékhez képest, a fotoablációs mélységet viszont többnek mérte az ultrahangos pachymetria segítségével a matematikailag számítotthoz képest (25). Az ultrahangos pachymetria myopia esetén alkalmas a fotoablációs mélység és a stroma oedema nyomonkövetésére. Hypermetropiás kezeléseknél a kezelés érintetlenül hagyja a cornea centrumát (34), így a központi cornea vastagság mérése nem tükrözi az oedema pontos változását. Az új fejlesztésű pachymeterek már a cornea több pontján egyszerre képesek megmérni a szaruhártya vastagságot (111).
- 57 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Durairaj vetette fel a cornea hidratációjának szerepét LASIK kapcsán a cornea vastagságának intraoperatív változásában. A lebenykészítést követően átmeneti dehidrációt feltételez, amelyet gyors rehidráció és túlhidráció követ. Méréseinkkel a folyadékvesztéssel járó vastagságcsökkenést nem igazoltuk, hanem már a lebenykészítés utáni első mérésnél nagyobb cornea vastagságot, nagyobb fokú hidratációt észleltünk. A LASIK kapcsán észlelt stroma oedema kialakulása tehát rendkívül gyors volt, amely nem lehet celluláris hatás következménye. A gyors vastagság növekedés az epithelium integritásának megszűnésével magyarázható, amelyet követően a GAG magas imbibációs nyomása nagy mennyiségű többlet vizet képes megkötni. A GAG imbibációs nyomásának hatását fokozhatta a LASIK során a bulbus fixációjára alkalmazott szívógyűrű, amely kb. 60-80 Hgmm-re emeli átmenetileg az intraoculáris nyomást. Az oedema mértéke a tervezett fotoablációs mélységgel összemérhető nagyságrendben jelentkezett, így klinikailag a tervezett refrakciótól való eltérésre is lehet számítani. A fénytörési hiba alulkorrekciója elsősorban elhúzódó, vagy szövődményes lebenykészítés esetén jelent veszélyt, amikor hosszabb idő telik el a lebenykészítés és a fotoabláció elvégzése között. Az ultrahang pachymetriás eredményekből kitűnik, hogy a LASIK műtét másnapján a cornea oedema már jelentősen csökkent és az 5. posztoperatív nap körül teljesen megszűnik, majd a követési időben lényegében nem változik. Ez a tény összhangban van a LASIK műtétek után tapasztalt korai visus rehabilitációval. Eredményeink alapján az alkalmazott ultrahangos pachymetriát alkalmasnak és veszélytelennek találtuk LASIK műtétek során történő mérések végzésére, amelynek segítségével meghatározható a műtét során keletkező lebenyvastagság, myopiás szemekben indirekt módszerrel mérni tudjuk a fotoabláció mélységét, igazolható a postLASIK centrális cornea oedema ténye, valamint kimutatható és követhető a szaruhártya vastagság posztoperatív változása. Következtetésként levonható, hogy az ultrahangos pachymetriás méréseink alapján az ép humán szaruhártyán végzett LASIK beavatkozás a cornea sejtközötti állomány víztartalmának jelentős felszaporodásával jár. A vizenyő a lebenykészítés után intraoperatíve jelentkezik, kimutatható a fotoabláció és a lebeny viszahajtása után, és a szignifikáns oedema a posztoperatív 5. napra szűnik meg. Az intraoperatív oedema
- 58 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
megjelenése – főleg elhúzódó vagy szövődményes lebenykészítés esetén – a fotoabláció pontosságának romlását, így a dioptria alulkorrekcióját eredményezheti.
7.3. A GAG és a KS eloszlásának változása PRK után (állatkísérlet) A keratán szulfát az emberi és más emlősök különféle szöveteiben jelenlévő, szulfatált polilaktózamin szerkezetű molekula, amely immunhisztológiai módszerekkel kimutatható és számos altípusa ismert (106). Hassel (41) kiemeli a proteoglikánok jelenlétét szaruhártya hegekben és a transzparencia csökkenését a felhalmozódásukkal és szabálytalan eloszlásukkal magyarázza. A cornea stroma átlátszóságát a keratán szulfát tartalmú proteoglikánok imbibációs nyomása változtatja meg. Minél több szulfát oldallánccal rendelkezik a KS proteoglikán, annál több víz megkötésére képes, így az oedema mértéke az adott stromarészben nő, a szaruhártya vastagsága fokozódik (26). A szaruhártya különféle sejtjei, így a keratocyták és az endothel sejtek (100), képesek a KS termelésére, ezt bizonyítja, hogy a keratocytákban kimutatták KS proteoglikánok mRNS szintézisét (26). Fullwood (31) sejtkultúrában a vándorló endothel sejtek felszínén írt le fokozott KS expressziót. Mint az irodalmi áttekintésben említésre került, a proteoglikánok nevüket a GAG oldalláncok alapján kapták, egy proteoglikán többféle GAG-ot is tartalmazhat, így a core protein genomjának feltárása után új nomenklatura áll kifejlesztés alatt, amely ezekre a genetikai ismeretekre alapoz. Ezek alapján a cornea KS proteoglikánjai között három különböző molekulát különbözetnek meg: lumican, keratocan és mimecan. Ezek a GAG molekulák fiziológiás körülmények között nem szulfatált formában vannak jelen, így a cornea transzparens. Lumican knock-out egerekben végzett kísérletek alapján feltételezik (26), hogy a KS nem csak az interfibrilláris távolságot, de a kollagén rostok átmérőjét is befolyásolja. Amennyiben a KS mennyisége lecsökken a szaruhártya stromában, az interfibrilláris távolság csökken, ellenben a kollagénrostok átmérője megnövekszik.
- 59 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
A mindennapi refraktív sebészeti gyakorlatban a páciensek körében nagy változatosság figyelhető meg a subepitheliális homályok terén (96,129). Kísérleti modellünkben eredményeink homogénnek bizonyultak, amely a nyúl populációnk kisfokú genetikai változatosságával magyarázható. Az alcián-kék hisztológiai eredményekkel összhangban a KS mennyisége fokozott volt az első posztoperatív hónapban, de immunhisztológiai módszerrel már az első napon kimutatható volt. A kontroll szemeken a cornea stromában a hátulról előrefelé és a centrumtól a periféria felé csökkenő festődést találtunk Davies (22) humán szaruhártyák vizsgálataihoz hasonlóan. A leglátványosabb KS változásokat a stromában tapasztaltuk. A változásokat három fázisra osztottuk, Zieske (144) leírásához hasonlatosan, aki csak mechanikus hámfosztást végzett fotoabláció nélkül. Az első fázis a posztoperatív 4 órától a 14. napig terjedő időszakot foglalja magába, amelynek korai szakában (4 óra – 4 nap) intenzív habos-szemcsés jellegűen festődő massza jelent meg az elülső stromában. Ez az anyag nem lehetett újonnan szintetizált KS, hiszen a keratocyták ilyen gyors reakciója nem ismert (12,32,36), az epithelium sejtek ebben az időszakban hiányoztak és az endothelium sejtek sem aktiválódtak még. A pozitívan festődő KS a mechanikus vagy az excimer lézer hatására bekövetkező sérülés következtében keletkező degradációs terméknek felel meg. Az első fázis későbbi szakában (7-14 nap) a degradációs termékek fokozatosan eltűnnek az elülső stromából, amely a keratocyták metabolikus tevékenységének tulajdonítható, hiszen ebben az időszakban már a keratocyták aktiválódása és proliferációja kimutatható. A második fázis a posztoperatív 14-56 napokat (2 hét - 2 hónap) jelenti, ebben az időszakban már kimutathatóvá válik az újonnan szintetizált KS, elsősorban a hátsó stromában, később pedig az elülső stromában is. Az utolsó, harmadik fázis a 2-7 hónapokra (56-208 nap) jellemző, amikor a 2. fázisban keletkezett fokozott mennyiségű KS lerakódik az interlamelláris térben. Lee (59) csak 2 fázisra osztja a GAG felhalmozódást, az első fázisnak az első 24 órát, a másodiknak a 12 hét utáni időszakot tartja. Az első fázis egybeesik az apoptosis időszakával (138,139). Alkalikus foszfatáz reakcióval (143) és TUNEL-festéssel már néhány órával a PRK után apoptosis mutatható ki, amelyet a keratocyták aktivációja és myofibroblastos átalakulás követett. A KS-felhalmozódás
időszakában
a
keratocyták - 60 -
fokozott
anyagcseréjére
utaló
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
elektronmikroszkópos jelek is mutatkoztak (33,96). A keratocyta sűrűség növekedése mellett azok migrációja is ismert, amely fokozza a relatív hypercellularitást (112). Erie (28) vizsgálatai szerint az elülső stromában a keratocyta sűrűség nem regenerálódik teljesen, még 36 hónappal a PRK után is mintegy 25 %-kal kisebb. Moilannen (72) és más munkacsoportok (76) konfokális cornea mikroszkópos (confoscan) vizsgálatok során a stroma reflektivitásának fokozódását a keratocyta morfológiai változásainak és az ECM változásainak tulajdonították. A hyperreflektivitás a posztoperatív 2-3 hónapban maximális (112), amely időben közel egybeesik a KS fokozódásának időszakával. Anderson (1) megállapítása szerint a stroma lamelláinak regenerációja 16 hónappal a PRK után is kimutatható III, IV és VI típusú kollagén, továbbá fibronectin immunhisztokémiával.
Rawe (102) 45 héttel PRK után
transzmissziós elektronmikroszkóppal proteoglikánok eltéréseit írta le. Malley (61) majom szemeken végzett vizsgálatai szerint az újonnan szintetizált kollagén rétegek közül hiányzott a szulfatált KS. Vizsgálataink során 1 hónappal PRK után és később újonnan termelt KS volt kimutatható nyúl szemekben. Vizsgálati körülményeink az ismert rizikófaktoroktól mentesek voltak, így az ultraibolya sugárzás ismert hegesedést fokozó hatása kiküszöbölhető volt (82-84,86). A stroma elülső és hátsó lamellái között a KS eloszlás terén jelentős különbségeket észleltünk immunhisztokémiai vizsgálataink során. Az elülső és hátsó stroma eltérő tulajdonságai több fizikai és kémiai tulajdonságban is megmutatkoznak. Kolozsvári és mtsai (58) az optikai tulajdonságokat elemezve azt tapasztalták, hogy az elülső stroma lamellák 1,8-szor több UV elnyelésére képesek, mint a hátsó stromarétegek. A jelenséget a kollagén rostok eltérő átmérője és interfibrilláris távolsága magyarázza. A transzparens cornea a 400nm feletti hullámhosszú fény 99%-át átengedi (26), míg a rövidebb hullámhosszú (UV) fények terén jelentősebb abszorpciós képességel rendelkezik. Erre az elvre épül az excimer lézer hatásmechanizmusa is, amely 193nm hullámhosszúságú sugárzást alkalmaz. A cornea a látható fény 99%-át átengedi ugyan, de tökéletesen transzparens szaruhártya is 10% szóródást okoz. A cornea oedema leginkább a fény szóródását fokozza, nem a transzparenciát rontja, amely a látóélesség szempontjából legalább olyan zavaró. Az ECM bármilyen jellegű eltérése a normálistól mind a fény elnyelődését, mind szóródását fokozza, így a látóélességet korlátozza. A KS - 61 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
különösen az első fázisban az elülső stormában jelentkező szemcsés formája feltehetően nagyfokú transzparencia csökkenést és fényszóródást okoz, amely összefüggésben áll a PRK utáni 5-7 napban észlelt gyenge látóélességgel. A refraktív corneaműtétek további fizikai következménye, hogy a korai posztoperatív időszakban (1 hónap) a cornea polarizáló képessége átmenetileg megváltozik, így az idegrostréteg scanning lézer polarimetriás mérési eredményei torzulhatnak (45). Felmerül a kérdés, hogy miképp szaporodott fel a KS a hátsó stromában, hiszen azt közvetlen excimer lézer hatás nem érte. A korai posztoperatív időszakban nem is tapasztaltunk változást, csak a 28. naptól kezdődően. Ez a hosszú idő aktív KS termelődésre utal, amellyel egybecseng a fent említett keratocyta aktivációra utaló mRNS termelődés. Az elülső stroma korai hypocelluláris gyógyulási fázisában Hanna (39) leírta a hátsó stroma keratocytáinak és Fullwood (31) az endothelium sejteknek a változását. A későbbiekben az endothelium egyfajta nem azonosított, szemcsézett anyagot termelt, amely a Descemet-membrán elülső felszínére jutott át és ott felhalmozódott. Quantock (100) ezt később KS-ként értékelte, de pontos biokémiai szerkezete nem ismert. A fenti eredmények alapján feltételezzük, hogy a hátsó stromarétegek fokozott KS expressziója részben a keratocyták, részben az endothelium sejtek aktív KS- szintézisének a következménye. Az apoptosis a sejthalál egy kontrollált formája, amely során a sebgyógyulásban szükségtelen sejtek elpusztulnak. A feleslegessé vált keratocyták eltávolítása a cornea homeostatisának fenntartása érdekében nélkülözhetetlen. A keratocyták az ECM folyamatos karbantartása révén szabályozzák a cornea stroma összetételét és transzparenciáját. Az apoptosis és a proliferáció és a KS együttes immunhisztokémiai jelölése dinamikájában világított rá a sejtszintű és a sejtközötti állományra vonatkozó változások összefüggéseire. Mind az epithelium, mind a stroma sérülése cytokin mediátorokon
keresztül
(interleukin-1,
FAS-ligand)
aktiválja
az
apoptosist
(135,136,138,139). Az apoptosis mellett sérülés és PRK után is gyulladásos sejtek vándorolnak a stromába, amelyek tovább módosítják a sebgyógyulás folyamatát és az ECM összetételét chemotaktikus hatásuk révén. Jelenlétük 12-24 órával a sérülést követően észlelhető (74,139).
- 62 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
Az apoptosison át nem esett (un. reziduális) keratocyták myofibroblastos átlakulás, migráció és aktiváció jeleit mutatják, az ECM mellett növekedési faktorokat termelnek. Ezért van jelentősége elemezni az apoptotikus és a proliferáló keratocyták sűrűségét és eloszlását. Számos adat ismeretében (43,53,73) sem ismert az apoptosis pontos szabályozó mechanismusa. Mohan (74) 4, 24 és 72 órával PRK után mutatott ki apoptotikus keratocytákat nyúl corneában TUNEL-próbával, jóllehet a TEM felvételek egy részüknél necrosis utaltak. Helena (43) szerint a legerősebb TUNEL-reakció 4 órával a PRK után jelentkezik. Anyagunkban apoptosis 4 órával PRK után nem igazolódott. A PRK kezelés mérsékelt szintű apoptosist váltott ki és TUNEL-festéssel 114 napig volt kimutatható a beavatkozás után. Mohan és mtsai (74) Ki67 pozitív sejteket észleltek a seb elülső részében 4 órával, 1, 3 és 7 nappal PRK után. A mi anyagunkban ugyanazen módszerrel az 1, 4, 7 és 14. napokon sikerült kimutatni proliferáló keratocytát, de a korai időszakban nem. Ennek magyarázata abban lelhető, hogy 4 órával a PRK után a gyulladásos sejtek már aktiválódnak és Ki67 pozitív festéssel pozitív jeleket mutathatnak, így összetéveszthetők gyulladásos sejtekkel. Az eltérés oka a TUNEL vizsgálat eltérő módszeréből is eredhet, hiszen Mohan fluoreszcens mikroszkópiát végzett, szemben a mi általunk alkalmazott és ugyanúgy elfogadott nem fluoreszcens (118) módszerrel. A nyúl modell hisztológiai és immunhisztokémiai vizsgálata homogén, jól tanulmányozható, statisztikai számításokra alkalmas adatmennyiséget szolgáltató módszernek bizonyult. Kimutattuk, hogy nyúl corneában a felszíni excimer lézer kezelés a stroma mélyebb rétegeiben is a sejtközötti állomány változását eredményezi. A korai posztoperatív szakban az elülső stromában nagy mennyiségú KS degradációs termék halmozódott fel, amely később lamelláris elrendeződésűvé alakult a keratocyták aktivációjával egyidejűleg. A hátsó stromában a keratocyták proliferációja és a gyulladásos reakció lezajlása után szabályos elrendeződésű maradt a KS eloszlása, de mennyisége megnőtt. A corneális sebgyógyulás a klinikailag már nem látható elváltozások után is zajlik a sejtközötti állomány szintjén ezért a sebgyógyulás zavarára számítanunk kell a későbbi posztoperatív időszakban pl. más sérülés vagy műtét esetén. A cornea anyagcsere szempontjából a GAG és ezen belül a KS sokkal nagyobb jelentőséggel bír, mint ahogyan eddig azt gondoltuk. Eredményeink arra engednek - 63 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
következtetni, hogy a klinikailag már lezajlottnak látszó sebgyógyulás után a cornea anyagcseréje még nem tért vissza a normális kiindulási állapotához. A KS meghatározó a cornea transzparenciájára nézve, ezért változásai az átlátszóságot a KS anyagcseréjének teljes normalizálódásáig bármikor befolyásolhatják. Az eredmények emberi szaruhártyára vontakoztatását a bevezetőben részletezett különbségek figyelembe vételével lehetségesnek tartjuk. Tekintettel arra, hogy a visust a transzparencia és a refrakció együttesen határozzák meg, feltételezzük, hogy a KS a kollagén láncok interlamelláris távolságának szabályozásával (vízmegkötő képessége révén) a látóélességet és feltételezhetően a magasabb rendű aberrációkat és a kontrasztérzékenységet befolyásolja. Ez összhangban áll azzal a klinikai megfigyeléssel, hogy a refraktív sebészet alanyai gyakran elégedetlenek a teljes vagy annál jobb látóélesség mellett is.
- 64 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
8. ÚJ EREDMÉNYEK ÉS KLINIKAI JELENTŐSÉGÜK
1. A corneális behatolásból végzett phakoemulzifikáció hosszútávon biztonságos eljárás arcus lipoides esetén a felszíni szabályosság szempontjából, de a szemfelszínt jellemző cornea topográfiás paraméterek (SAI, SRI és PVA) terén elhúzódó normalizációra kell számítanunk. Előrehaladott arcus lipoidesben 4,0 mm-t meghaladó sebkészítés nem ajánlott a magas dioptria értékű posztoperatív astigmia lehetősége miatt.
2. A LASIK során végzett ultrahangos pachymetria alkalmazásával a cornea lebeny és a stroma ágy korai odemája már intraoperatíve kimutatható, amely csak a posztoperatív 5. napra szűnik meg. A fotoabláció már oedemás környezetben történik, amely a fotoablációs mélység csökkenését, így a tervezett myopiás dioptria alulkorrekcióját eredményezheti.
3. Nemzetközileg elsőként vizsgáltuk a cornea sejtközötti állomány fő alkotóelemének, a keratán szulfátnak az eloszlás változását PRK után nyúl szemben. Kimutattuk, hogy a felszíni excimer lézer kezelés a stroma mélyebb rétegeiben is a sejtközötti állomány változását eredményezi.
4. A stroma elülső részében PRK után 4 órával szabálytalan, habos szerkezetű keratán szulfát jelenik meg, amely 14 nap után lamellárissá alakul, majd felszívódik. A stroma hátsó részében a kontrollban is jelenlévő lamelláris keratán szulfát vastagsága az 1. posztoperatív hónapra éri el maximumát.
5. A PRK után 1-14 nappal a keratocyták apoptosisát és proliferációját igazoltuk, amely egybeesett a gyulladásos sejtek megjelenésével. Az ECM a sejtszintű változásoknál korábban már eltéréseket mutat és normalizálódása a celluláris reakciók után is tovább folytatódik.
- 65 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
9. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Legelőször köszönöm szüleimnek, akik biztosították a hátteret munkámhoz és mindig mellettem álltak. Feleségemnek és kislányomnak köszönöm, hogy szeretetükkel folyamatosan erővel töltöttek fel. Köszönöm Süveges
Ildikó
professzor
asszonynak,
hogy program-
és
témavezetőként a szemészet klinikai és tudományos alapjainak megismertetése mellett figyelmemet a szaruhártya sebgyógyulására irányította. Köszönöm Németh János professzor úr támogatását, aki klinika igazgatóként folyamatosan tudományos munkára ösztönzött és annak lehetőségét biztosította. Dr. Nagy Zoltán Zsoltnak köszönöm a kísérletek
megtervezésében
és
kivitelezésében
nyújtott
baráti
segítségét.
Az
immunhisztokémiai vizsgálatok elvégzéséért a Semmelweis Egyetem I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet munkatársai közül dr. Kovalszky Ilona, Prof.dr. Szende Béla és dr. Máthé Miklós elengedhetetlen munkájáért köszönetet mondok. Nélkülözhetetlen segítséget kaptam dr. Szentmáry Nóra részéről mind a kísérletek kivitelezésében, mind a dolgozat megírásában. Dr. Bausz Mária a szakmai felkészülésem vezetése mellett a topográfiás tanulmány elvégzésében támogatott. A klinika minden dolgozójának köszönöm a megértését és támogatását kiemelve: Burlovicsné Fekete Judit és Morcz Katalin, a Szemészeti Klinika (Tömő utca) excimer lézer központjának asszisztensei, Deutsch Róbert és Somfalvi Dániel, számítógépes rendszergazdák, Széles Éva fotós, Bob Bernard nyelvi lektor, Nagy Andorné Zsuzsa, a Tömő utcai Szemészeti Klinika könyvtárosa. A szövettani munkákban dr. Tóth Jeannette-nek, a szövettani laborban nyújtott segítségért a szövettani asszisztensnőknek Bozsó Idának és Csatai Istvánnénak tartozom hálával. A Semmelweis Egyetem Doktori Iskolája minden munkatárásának köszönettel tartozom segítőkészségükért. Támogató ösztöndöndíjak: 2001. Egészségügyi Tudományos Tanács (ETT 239/01) 2001. Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA T037452) 2003. Egészségügyi Tudományos Tanács (ETT 611/01) 2004. Magyar Állami Eötvös Ösztöndíj No. 63/2004. - 66 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
10. IRODALOM
1. Anderson JA, Binder PS, Rock ME, Vrabec MP. Human excimer laser keratectomy. Immunohistochemical analysis of healing. Arch Ophthalmol. 1996;114:54-60. 2. Bagla SK, Golden RL. Unilateral arcus corneae senilis and carotid occlusive disease. JAMA. 1975;233:450. 3. Baum JP, Maurice DM, McCarey BE. The active and passive transport of water across the corneal endothelium. Exp Eye Res. 1984;39:335-342. 4. Barchiesi BJ, Eckel RH, Ellis PP. The cornea and disorders of lipid metabolism. Surv Ophthalmol. 1991;36:1-22. 5. Barequet IS, Yu E, Vitale S, Cassard S, Azar DT, Stark WJ. Astigmatism outcomes of horizontal temporal versus nasal clear corneal incision cataract surgery. J Cataract Refract Surg. 2004;30:418-423. 6. Beuerman RW, McDonald MB, Shofner RS, Munnerlyn CR, Clapham TN, Salmeron B, Kaufman HE. Quantitative histological studies of primate corneas after excimer laser photorefractive keratectomy. Arch Ophthalmol. 1994;112:1103-1110. 7. Berman, ER. Biochemistry of the eye. 1991. Plenum press, New York, NY, USA 8. Black EH, Cohen KL, Tripoli NK. Corneal topography after cataract surgery using a clear corneal incision closed with one radial suture. Ophthalmic Surg Lasers. 1998;29:896-903. 9. Bleckmann H, Schnoy N, Kresse H. Electron microscopic and immunohistochemical examination of scarred human cornea re-treated by excimer laser. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002;240:271-278. 10. Borcherding MS, Blacik LJ, Sittig RA, Bizzell JW, Breen M, Weinstein HG. Proteoglycans and collagen fibre organization in human corneoscleral tissue. Exp Eye Res. 1975;21:59-70. 11. Canton E. On The Arcus Senilis, or Fatty degeneration of the Cornea. Piccadilly, Robert Hardwicke, 1863, 2-3. (cit. Kaptein EM. Unilateral corneal arcus without carotid artery stenosis. JAMA. 1977;238:303.)
- 67 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
12. Carlson EC, Wang IJ, Liu CY, Brannan P, Kao CW, Kao WW. Altered KSPG expression by keratocytes following corneal injury. Mol Vis. 2003;9:615-623. 13. Carlson EC, Liu CY, Chikama T, Hayashi Y, Kao CW, Birk DE, Funderburgh JL, Jester JV, Kao WW. Keratocan, a cornea-specific keratan sulfate proteoglycan, is regulated by lumican. J Biol Chem. 2005;280:25541-25547. 14. Caterson B, Christner JE, Baker JR. Identification of a monoclonal antibody that specifi cally recognizes corneal and skeletal keratan sulfate. Monoclonal antibodies to cartilage proteoglycan. J Biol Chem. 1983;258:8848-8854. 15. Castoro JA, Bettelheim AA, Bettelheim FA. Water concentration gradients across bovine cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1988;29:963-968. 16. Cennamo G, Rosa N, Breve MA, di Grazia M. Technical improvements in photorefractive keratectomy for correction of high myopia. J Refract Surg. 2003;19:438-442. 17. Chua BE, Mitchell P, Wang JJ, Rochtchina E. Corneal arcus and hyperlipidemia: findings from an older population. Am J Ophthalmol. 2004;137:363-365. 18. Cogan DG, Kuwabara Y. Arcus senilis. Its pathology and histochemistry. Arch Ophthalmol. 1959;61:553-560. 19. Connon CJ, Meek KM, Newton RH, Kenney MC, Alba SA, Karageozian H. Hyaluronidase treatment, collagen fibril packing, and normal transparency in rabbit corneas. J Refract Surg. 2000;16:448-455. 20. Connon CJ, Meek KM. The structure and swelling of corneal scar tissue in penetrating full-thickness wounds. Cornea. 2004;23:165-171. 21. Dausch D, Dausch S, Schroder E. Wavefront-supported photorefractive keratectomy: 12-month follow-up. J Refract Surg. 2003;19:405-411. 22. Davies Y, Fullwood NJ, Marcyniuk B, Bonshek R, Tullo A, Nieduszynski IA. Keratan sulphate in the trabecular meshwork and cornea. Curr Eye Res. 1997;16:677-686. 23. Dawson DG, Kramer TR, Grossniklaus HE, Waring GO, Edelhauser HF. Histologic, Ultrastructural, and Immunofluorescent Evaluation of Human LaserAssisted In Situ Keratomileusis Corneal Wounds. Arch Ophthalmol. 2005;123:741-756. 24. Duke-Elder S. Diseases of the outer eye. Corneal degenerations, dystrophies and pigmentation. In: System of Ophthalmology (Vol VIII) Mosby, St Louis, USA 1965; 863-991. - 68 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
25. Durairaj VD, Balentine J, Kouyoumdjian G, Tooze JA, Young D, Spivack L, Taravella MJ. The predictability of corneal flap thickness and tissue laser ablation in laser in situ keratomileusis. Ophthalmology 2000;107:2140-2143. 26. Edelhauser HF, Ubles JL. The Cornea and the Sclera. In: Adler’s Physiology of the Eye. Ed. Kaufman PL, Alm A. 10th Edition 2003; 47-116. 27. Erdélyi B, Csákány B, Németh J. Spontaneous alterations of the corneal topographic pattern. J Cataract Refract Surg. 2005;31:973-978. 28. Erie JC, Patel SV, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. Keratocyte density in the human cornea after photorefractive keratectomy. Arch Ophthalmol. 2003;121:770-776. 29. Erie JC, Nau CB, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. Long–Term Keratocyte Deficits in the Corneal Stroma After LASIK and PRK Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 46: E-Abstract 4355. 30. Fishman GR, Pons ME, Seedor JA, Liebmann JM, Ritch R. Assessment of central corneal thickness using optical coherence tomography. J Cataract Refract Surg. 2005;31:707-711. 31. Fullwood NJ, Davies Y, Nieduszynski IA, Marcyniuk B, Ridgway AE, Quantock AJ. Cell surface-associated keratan sulfate on normal and migrating corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996;37:1256-1270. 32. Funderburgh JL. Keratan sulfate biosynthesis. IUBMB Life. 2002;54:187-194. 33. Füst Á, Rátkay I, Süveges I, Bor Zs, Nagy ZZ. Excimer lézerkezelés hatása a nyúl corneájára – elektronmikroszkópos tanulmány. Szemészet 1994;131:85-88. 34. Füst Á, Németh J, Süveges I, Nagy ZZ, Bereczki Á. Excimer laser treatment of hyperopia. Acta Ophthalmol Scand. 1998;76:686-691. 35. Garrett Q, Khaw PT, Blalock TD, Schultz GS, Grotendorst GR, Daniels JT. Involvement of CTGF in TGF-ß1–Stimulation of Myofibroblast Differentiation and Collagen Matrix Contraction in the Presence of Mechanical Stress. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004 45: 1109-1116. 36. Girard MT, Matsubara M, Kublin C, Tessier MJ, Cintron C, Fini ME. Stromal fibroblasts synthesize collagenase and stromelysin during long-term tissue remodeling. J Cell Sci. 1993;104:1001-1011.
- 69 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
37. Green K, DeBarge LR, Cheeks L, Philips CI. Centripetal movement of Fluorescein dextrans in the cornea: relevance to arcus. Acta Ophthalmol. 1987;65: 538-544. 38. Hanna KD, Pouliquen Y, Waring GO III, Savoldelli M, Cotter J, Morton K, Menasche M. Corneal stromal wound healing in rabbits after 193-nm excimer laser surface ablation. Arch Ophthalmol.1989;107:895-901. 39. Hanna KD, Pouliquen YM, Waring GO III, Savoldelli M, Fantes F, Thompson KP. Corneal wound healing in monkeys after repeated excimer laser photorefractive keratectomy. Arch Ophthalmol. 1992;110:1286-1291 40. Hannush SB, Crawford SL, Waring GO 3rd, Gemmill MC, Lynn MJ, Nizam A. Reproducibility of normal corneal power measurements with a keratometer, photokeratoscope, and video imaging system. Arch Ophthalmol. 1990;108:539544. 41. Hassell JR, Cintron C, Kublin C, Newsome DA. Proteoglycan changes during restoration of transparency in corneal scars. Arch Biochem Biophys. 1983;222:362-369. 42. Hassell JR, Schrecengost PK, Rada JA, SundarRaj N, Sossi G, Thoft RA. Biosynthesis of stromal matrix proteoglycans and basement membrane components by human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1992;33:547-557. 43. Helena MC, Baerveldt F, Kim WJ et al. Keratocyte apoptosis after corneal surgery. Investigative Ophthalmology and Visual Science 1998;39:276-283. 44. Hinzpeter EN, Naumann GOH. Cornea and Sclera. In: Pathology of the Eye. Springer, Eds. Naumann GOH, Apple DJ. New York-Berlin-Heidelberg-Tokyo 1986, 327-412. 45. Holló G, Nagy ZZ, Vargha P, Süveges I. Influence of post-LASIK corneal healing on scanning laser polarimetric measurement of the retinal nerve fibre layer thickness. Br J Ophthalmol. 2002;86:627-631. 46. Hosseini K, Kholodnykh AI, Petrova IY, Esenaliev RO, Hendrikse F, Motamedi M. Monitoring of rabbit cornea response to dehydration stress by optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:2555-2562. 47. Huang Y, Meek KM. Swelling studies on the cornea and sclera: the effects of pH and ionic strength. Biophys J. 1999;77:1655-1665. 48. Imre L. Első hazai tapasztalatok konfokális corneamikroszkópiával. Szemészet 1999; 136: 97-102. - 70 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
49. Imre L, Nagymihaly A. Reliability and reproducibility of corneal endothelial image analysis by in vivo confocal microscopy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001;239:356-360. 50. Imre L, Resch M, Nagymihaly A. Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik [In vivo confocal corneal microscopy after keratoplasty] Ophthalmologe. 2005;102:140-146. 51. Innes JR, Strachan IM, Triger DR. Unilateral Kayser-Fleischer ring. Br J Ophthalmol. 1986;70:469-470. 52. Javaloy J, Vidal MT, Villada JR, Artola A, Alio JL. Comparison of four corneal pachymetry techniques in corneal refractive surgery. J Refract Surg. 2004;20:2934. 53. Jianping G, Gelber-Schwab TA, Addeo JV et al. Apoptosis in the rabbit cornea after photorefractive keratectomy. Cornea 1997;16:200-208. 54. Kaptein E.M.: Unilateral corneal arcus without carotid artery stenosis.JAMA. 1977;238:303. 55. Kato T, Nakayasu K, Ikegami K, Obara T, Kanayama T, Kanai A. Analysis of glycosaminoglycans in rabbit cornea after excimer laser keratectomy. Br J Ophthalmol. 1999;83:609-612. 56. Kerényi Á, Németh J, Füst Á, Bereczki Á, Süveges I. A szaruhártya felszín változása myopia ellenes fotorefraktív keratectomia hatására. Szemészet 1995;132:211-214 57. Kohnen T, Dick B, Jacobi KW. Comparison of the induced astigmatism after temporal clear corneal tunnel incisions of different sizes. J Cataract Refract Surg. 1995;21:417-424. 58. Kolozsvári L, Nógrádi A, Hopp B, Bor Z. UV absorbance of the human cornea in the 240- to 400-nm range. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:2165-2168. 59. Lee Y.C., Wang I.J., Hu F.R., Kao W.W.: Immunohistochemical study of subepithelial haze after phototherapeutic keratectomy. J Refract Surg. 2001;17:334-41. 60. Maldonado MJ, Ruiz-Oblitas L, Munuera JM, Aliseda D, Garcia-Layana A, Moreno-Montanes J. Optical coherence tomography evaluation of the corneal cap and stromal bed features after laser in situ keratomileusis for high myopia and astigmatism. Ophthalmology. 2000;107:81-87.
- 71 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
61. Malley DS, Steinert RF, Puliafi to CA, Dobi ET. Immunofluorescence study of corneal wound healing after excimer laser anterior keratectomy in the monkey eye. Arch Ophthalmol. 1990;108:1316-1322. 62. Maurice DM, Giardini AA. Swelling of the cornea in vivo after the destruction of its limiting layers. Br J Ophthalmol. 1951;35:791-797. 63. Maurice DM. The structure and transparency of the cornea. J Physiol. 1957;136:263-286. 64. Maurice DM. The transparency of the corneal stroma. Vision Res. 1970;10:107108. 65. McDonald MB, Deitz MR, Frantz JM, Kraff MC, Krueger RR, Salz JJ, Kraff CR, Maguen E, Matta CS, Nesburn AB, Piebenga LW. Photorefractive keratectomy for low-to-moderate myopia and astigmatism with a small-beam, tracker-directed excimer laser. Ophthalmology. 1999;106:1481-1488. 66. Meek KM, Leonard DW, Connon CJ, Dennis S, Khan S. Transparency, swelling and scarring in the corneal stroma. Eye. 2003;17:927-936. 67. Merriam JC, Zheng L, Merriam JE, Zaider M, Lindstrom B. The effect of incisions for cataract on corneal curvature. Ophthalmology. 2003;110:18071813. 68. Michelacci YM. Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix. Braz J Med Biol Res. 2003;36:1037-1046. 69. Miyamoto T, Saika S, Yamanaka A et al. Wound healing in rabbit corneas after photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg 2003;29:153-158. 70. Módis L, Langenbucher A, Seitz B. Corneal Thickness Measurements With Contact and Noncontact Specular Microscopic and Ultrasonic Pachymetry. Am J Ophthalmol 2001;132:517-521. 71. Módis L Jr, Langenbucher A, Seitz B. Evaluation of Normal Corneas Using the Scanning- Slit Topography/Pachymetry System. Cornea. 2004;23:689-694. 72. Moilanen JA, Vesaluoma MH, Muller LJ, Tervo TM. Long-term corneal morphology after PRK by in vivo confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:1064-1069. 73. Mohan RR, Liang Q, Kim WJ et al. Apoptosis in the cornea: further characterization of FAS/FAS ligand system. Experimental Eye Research 1997;65:575-589. - 72 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
74. Mohan RR, Hutcheon A, Choi R et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research 2003;76: 71-87. 75. Moss SE, Klein R, Klein BE. Arcus senilis and mortality in a population with diabetes. Am J Ophthalmol. 2000;129:676-678. 76. Möller-Pedersen T, Cavanagh HD, Petroll WM, Jester JV. Stromal wound healing explains refractive instability and haze development after photorefractive keratectomy: a 1-year confocal microscopic study. Ophthalmology. 2000;107:1235-1245. 77. Muscat S, McKay N, Parks S, Kemp E, Keating D. Repeatability and reproducibility of corneal thickness measurements by optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:1791-1795. 78. Müller LJ, Pels E, Vrensen GF. The specific architecture of the anterior stroma accounts for maintenance of corneal curvature. Br J Ophthalmol. 2001;85:437443. 79. Müller LJ, Pels E, Schurmans LR, Vrensen GF. A new three-dimensional model of the organization of proteoglycans and collagen fibrils in the human corneal stroma. Exp Eye Res. 2004;78:493-501. 80. Nagy ZZ, Németh J, Füst Á, Bereczki Á: Excimer lézerkezelések közbeni ultrahangos pachymetria. Szemészet 1995;132:171-174. 81. Nagy ZZ, Süveges I, Németh J: Intraoperative pachymetry during excimer laser photorefractive keratectomy. Acta Chirurg Hung 1996;35:217-223. 82. Nagy ZZ, Hiscott P, Seitz B et al. Morhological response to UV-B irradiation after excimer-laser photorefractive keratectomy. German J Ophthalmol 1996;5:352-361. 83. Nagy ZZ, Hiscott P, Seitz B, Schlötzer-Schrehardt U, Simon M Jr, Süveges I, Naumann GOH. Ultraviolet-B enhances corneal stromal response to 193-nm excimer laser treatment. Ophthalmology. 1997;104:375-380. 84. Nagy ZZ, Hiscott P, Seitz B, Schlötzer-Schrehardt U, Süveges I, Naumann GOH. Clinical and morphological response to UV-B irradiation after excimer laser photorefractive keratectomy. Surv Ophthalmol. 1997;42 Suppl 1:S64-76. 85. Nagy ZZ, Palagyi-Deak I, Kelemen E, Kovacs A. Wavefront-guided photorefractive keratectomy for myopia and myopic astigmatism. J Refract Surg. 2002;18:S615-S619. - 73 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
86. Nagy ZZ, Tóth J, Nagymihály A, Süveges I. The role of ultraviolet-B in corneal healing following excimer laser in situ keratomileusis. Pathol Oncol Res. 2002;8:41-46. 87. Naumann GOH, Küchle M. Unilateral Arcus Lipoides Corneae With Traumatic Cyclodialysis in Two Patients. Arch Ophthalmol 1989;107:1121-1122. 88. Naumann GOH, Küchle M. Unilateraler hemiarcus lipoides corneae inferior. Klin Monatsbl Augenheilkd. 1990;197:335-337. 89. Naumann GOH, Küchle M. Unilateral corneal arcus lipoides. Lancet. 1993;342:1185. 90. Németh J, Süveges I, Nagy ZZ, Füst Á: Excimer lézeres photorefraktív keratectomia eredményei myopiás szemekben. Szemészet 1994;131:73-76. 91. Németh J, Erdélyi B, Csákány B. Corneal topography changes after a 15 second pause in blinking. J Cataract Refract Surg. 2001;27:589-592. 92. Németh J, Erdélyi B, Csákány B et al. High-speed videotopographic measurement of tear film build-up time. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:1783-1790. 93. Nielsen PJ. Prospective evaluation of surgically induced astigmatism and astigmatic keratotomy effects of various self-sealing small incisions. J Cataract Refract Surg. 1995;21:43-48. 94. Offen ML. Unilateral arcus senilis. N Engl J Med. 1973;289:161. 95. O’Brien TP, Li Q, Ashraf MF et al. (1998) Inflammatory response in the early stages of wound healing after excimer laser keratectomy. Arch Ophthalmol 116: 1470-1474. 96. Park CK, Kim JH. Comparison of wound healing after photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis in rabbits. J Cataract Refract Surg. 1999;25:842-850. 97. Pérez-Santonja JJ, Bellot J, Claramonte P et al. Laser in situ keratomileusis to correct high myopia, J Cataract Refract Surg 1997;23:372–385. 98. Prince JH. Cornea, trabecular region and sclera. The rabbit in eye research. Ed: Prince JH. Thomas Books, Springfield, Illinois, USA 1964. 87-139. 99. Probst LE, Machat JJ: Mathematics of laser in situ keratomileusis for high myopia. J Cat Refract Surg 1998;24:190-195. - 74 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
100. Quantock AJ, Bairaktaris G, Fullwood NJ, Ito M, Suzuki T, Kinoshita S. Endothelial cell surface-associated keratan sulfate after excimer laser photoablation of the anterior rabbit cornea. J Refract Surg. 1999;15:349-356. 101. Ratkay-Traub I, Hopp B, Bor Z, Dux L, Becker DL, Krenacs T. Regeneration of rabbit cornea following excimer laser photorefractive keratectomy: a study on gap junctions, epithelial junctions and epidermal growth factor receptor expression in correlation with cell proliferation. Exp Eye Res. 2001;73:291-302. 102. Rawe IM, Zabel RW, Tuft SJ, Chen V, Meek KM. A morphological study of rabbit corneas after laser keratectomy. Eye.1992;6:637-642. 103. Schlötzer-Schrehardt U, Kruse FE. Identification and characterization of limbal stem cells. Exp Eye Res. 2005;81:247-264. 104. Schumer DJ, Bains HS: The Nidek MK-2000 microkeratome system. J Refract Surg 2001; 17:S250-251. 105. Scott JE, Haigh M. Identification of specific binding sites for keratan sulphate proteoglycans and chondroitin-dermatan sulphate proteoglycans on collagen fibrils in cornea by the use of cupromeronic blue in 'critical-electrolyteconcentration' techniques. Biochem J. 1988;253:607-610. 106. Scott JE, Bosworth TR. A comparative biochemical and ultrastructural study of proteoglycan-collagen interactions in corneal stroma. Functional and metabolic implications. Biochem J. 1990;270:491-497. 107. Seitz B, Behrens A, Langenbucher A. Corneal topography. Curr Opin Ophthalmol. 1997;8:8-24. 108. Smith JL, Susac JO. Unilateral arcus senilis: sign of occlusive disease of the carotid artery. JAMA. 1973;226:676. 109. Sohajda Z, Módis L, Gyémánt Gy, Berta A. Xanthoma corneae – esetismertetés. Szemészet 2003;140:263-266. 110. Sohajda Z, Gyémant G, Berta A, Módis L. Untersuchungen der Tränenflüssigkeit im Falle einer primären peripheren Lipidkeratopathie [Tear examinations in primary peripheral lipid keratopathy] Klin Monatsbl Augenheilkd. 2004;221:781-784. 111. Sohajda Z, Papp J, Berta A, Módis L: Két új fejlesztésű pachyméter összehasonlító vizsgálata. Szemészet 2005; 142: 227-230.
- 75 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
112. Spraul CW, Grossniklaus HE, Lang GK. Primäre Lipidkeratopathie [Primary lipid keratopathy] Klin Monatsbl Augenheilkd. 2002;219:889-891. 113. Stanifer RM, Snyder RK, Kretzer FL. Cornea. In: Anderson RE. Biochemistry of the eye. American Academy of Ophthalmology 1983. pp. 23-48. 114. Sugar J. Metabolic disorders of the cornea. In Kaufmann H (ed.). The cornea. New York, Livingstone, 1988;371-376. 115. Sugimura G.: Unilateral corneal arcus. Arch Ophthalmol. 1990;108:780-781. 116. Suzuki S, Oshika T, Oki K, Sakabe I, Iwase A, Amano S, Araie M. Corneal thickness measurements: scanning-slit corneal topography and noncontact specular microscopy versus ultrasonic pachymetry. J Cataract Refract Surg. 2003;29:1313-1318. 117. Süveges I. Primäre Lipidkeratopathie der Hornhaut (Xanthoma corneae). Klin Monatsbl Augenheilkd. 1983;183:407-8. 118. Szende B, Romics I, Minik K et al. Repeated biopsies in evaluation of therapeutic effects in prostate carcinoma. The Prostate 2001;49: 93-100. 119. Szentmáry N, Langenbucher A, Hafner A, Seitz B. Impact of phototherapeutic keratectomy on the outcome of subsequent penetrating keratoplasty in patients with stromal corneal dystrophies. Am J Ophthalmol. 2004;137:301-307. 120. Szentmáry N, Seitz B, Langenbucher A, Naumann GOH. Repeat keratoplasty for correction of high or irregular postkeratoplasty astigmatism in clear corneal grafts. Am J Ophthalmol. 2005;139:826-830. 121. Szentmáry N, Szende B, Süveges I. Epithelial cell, keratocyte, and endothelial cell apoptosis in Fuchs' dystrophy and in pseudophakic bullous keratopathy. Eur J Ophthalmol. 2005;15:17-22. 122. Szerényi KD, Wang X, Gabrielian K, McDonnell PJ. Keratocyte loss and repopulation of anterior corneal stroma after de-epithelialization. Arch Ophthalmol. 1994;112:973-976. 123. Tam ES, Rootman DS. Comparison of central corneal thickness measurements by specular microscopy, ultrasound pachymetry, and ultrasound biomicroscopy. J Cataract Refract Surg. 2003;29:1179-1184. 124. Thompson AM, Sachdev N, Wong T, Riley AF, Grupcheva CN, McGhee CN. The Auckland Cataract Study: 2 year postoperative assessment of aspects of clinical, visual, corneal topographic and satisfaction outcomes. Br J Ophthalmol. 2004;88:1042-1048. - 76 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
125. Yildirim R, Aras C, Ozdamar A, Bahcecioglu H, Ozkan S: Reproducibility of corneal flap thickness in laser in situ keratomileusis using the Hansatome microkeratome. J Cataract Refract Surg 2000;26:1729-1732. 126. Vámosi P, Németh G, Berta A. Első phacoemulsificatióban. Szemészet 2002; 139: 29-34.
lépéseink
a
refractiv
127. Veltan IM, Budde WM, Naumann GOH. Unilateral arcus lipoides cornae with contralateral Sturge-Weber syndrome.Br J Ophthalmol. 2000;84:1433. 128. Vogt G, Hatvani I. A szaruhártya-görbület változása különböző méretű, varrattal zárt és varrat nélküli scleralis alagútsebek esetében fakoemulzifikáció után. Szemészet 1998; 135, 9-13. 129. Wachtlin J, Langenbeck K, Schrunder S, Zhang EP, Hoffmann F. Immunohistology of corneal wound healing after photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis. J Refract Surg. 1999;15:451-458. 130. Wang J, Fonn D, Simpson TL, Jones L. Relation between optical coherence tomography and optical pachymetry measurements of corneal swelling induced by hypoxia. Am J Ophthalmol. 2002;134:93-98. 131. Wang J, Simpson TL, Fonn D. Objective measurements of corneal lightbackscatter during corneal swelling, by optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:3493-3498. 132. Wilson SE, Klyce SD. Quantitative descriptors of corneal topography. A clinical study. Arch Ophthalmol. 1991;109:349-353. 133. Wilson SE, Li Q, Weng J et al. The FAS-FAS ligand system and other modulators of apoptosis in the cornea. Investigative Ophthalmology and Visual Science 1996;37:1582-1592. 134. Wilson SE, He YY, Jian W et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research 1996;62:325-337. 135. Wilson SE. Everett Kinsey Lecture. Keratocyte apoptosis in refractive surgery. Contact Lens Association of Ophthalmologists J. 1998;24: 181-185. 136. Wilson SE, Kim WJ. Keratocyte apoptosis: implications on corneal wound healing, tissue organization, and disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science 1998;39: 220-226.
- 77 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
137. Wilson SE, Hong JW. Bowman's layer structure and function: critical or dispensable to corneal function? A hypothesis. Cornea. 2000;19:417-420. 138. Wilson SE, Mohan RR, Hong JW, Lee JS, Choi R, Mohan RR. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Arch Ophthalmol. 2001;119:889-896. 139. Wilson SE, Mohan Rahul R., Mohan Rajiv R et al.The corneal wound healing response:Cytokine-mediated interaction of the epithelium,stroma and inflammatory cells. Progress in retinal and eye research 2001;20:625-637. 140. Wirbelauer C, Pham DT. Monitoring corneal structures with slitlamp-adapted optical coherence tomography in laser in situ keratomileusis.J Cataract Refract Surg. 2004;30:1851-1860. 141. Wirbelauer C, Pham DT. Continuous monitoring of corneal thickness changes during LASIK with online optical coherence pachymetry. J Cataract Refract Surg. 2004;30:2559-2568. 142. Zhang Y, Conrad AH, Tasheva ES, An K, Corpuz LM, Kariya Y, Suzuki K, Conrad GW. Detection and quantification of sulfated disaccharides from keratan sulfate and chondroitin/dermatan sulfate during chick corneal development by ESI-MS/MS. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:1604-1614. 143. Zieske JD, Guimaraes SR, Hutcheon AE. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Exp Eye Res. 2001;72:33-39. 144. Zieske JD. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 2001;12:237-241.
- 78 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
11. ÖSSZEFOGLALÓ A szaruhártya 90%-át alkotó stroma avasculáris, hypocelluláris szövet, amelynek sebgyógyulása a cornea transzparenciájának csökkenésével és a látóélesség romlásával jár. A sebgyógyulásban a sejtközötti állomány (extracelluláris mátrix) szabályos elrendeződésének megbomlása lép fel. A leggyakoribb degeneratív szaruhártya degeneráció, az arcus lipoides során a stromába extracellulárisan lerakódott lipid hatását a phakoemulzifikációhoz készített corneális seb gyógyulása során tanulmányoztuk egy prospektív cornea topográfiás tanulmány
és
egy
kazuisztika
kereteiben.
A
corneális
behatolásból végzett
phakoemulzifikáció hosszútávon biztonságos eljárásnak mutatkozott arcus lipoides esetén a cornea topográfia szempontjából, de a szemfelszínt jellemző paraméterek terén elhúzódó normalizációra kell számítanunk. Előrehaladott arcus lipoidesben 4,0 mm-t meghaladó sebkészítés magas corneális astigmiát és nagyfokú felszíni szabálytalanságot eredményezhet. Az ép szaruhártya sejtközötti állományának szerepét refraktív beavatkozások után vizsgáltuk. Egészséges humán szemeken végzett laser in situ keratomileusis (LASIK) kapcsán végzett ultrahangos pachymetriai vizsgálatainkkal az intraoperatív szaruhártya oedema tényére és posztoperatív változására mutattunk rá. A szubtrakciós pachymetria elvével a lebenykészítés után közvetlenül kialakuló lebeny és stroma oedema a posztoperatív 5. napig volt jelentős. Egészséges nyúl szaruhártyán végzett fotorefraktív keratectomia után immunhisztokémiai módszerrel a glükózaminoglikán és a keratán szulfát változásait igazoltuk. Kimutattuk, hogy a felszíni excimer lézerkezelés után az extracelluláris mátrix változása az apoptosis, a sejtproliferáció és a gyulladás formájában jelentkező celluláris folyamatok lezajlása után is tovább folytatódik és a mélyebb stromarétegek sejtközötti állományát is érinti.
- 79 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
12. SUMMARY The wound healing of the avascular and hypocellular corneal stroma, composing 90% of the cornea leads to the decrease in corneal transparency and visual acuity. Corneal wound healing is associated with the irregular arrangement of the extracellular matrix. The effect of stromal extracellular lipid deposition on corneal wound healing was examined by corneal topography in a prospective study and a case report of eyes with arcus lipoides corneae undergone cataract extraction. Clear corneal incision phacoemulsification was found safe in eyes with arcus lipoides in corneal topographical aspects, however delayed normalisation of the corneal surface can be expected. In higher grade arcus lipoiedes incision greated than 4.0 mm can result in high corneal astigmatism and surface irregularity. The role of the extracellular matrix in healthy corneas was investigated after different refarctive surgical interventions. The fact and postoperative time course of intraoperative corneal edema was shown by ultrasound pachymetry in Laser in situ keratomileusis (LASIK) performed in healthy human eyes. The flap and stromal edema appeared intraoperatively and remained significant until postoperative day 5 by subtraction pachymetry. Immunohistochemical analysis of glycosaminoglycan and keratan sulfate changes was performed in healthy rabbit corneal buttons undergone myopic photorefractive keratectomy. Our experiments provided evidence, that the superficial excimer laser treatment results in a prolonged and deeper involvement of the stromal extracellular matrix compared to the cellular changes in form of apoptosis, proliferation and inflammatory response.
- 80 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
13. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 13.1. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1.
Resch M, Nagy ZZ. Unilateraler Ptosis im Hintergrund der unilateralen Arcus lipoides – Kasuistik [Unilateral ptosis in the background of unilateral corneal arcus lipoides - case report] Klin Monatsbl Augenheilkd. 2004;221:785-787. IF: 0,478
2.
Resch M, Bausz M, Nagy ZZ, Süveges I. Corneal topography parameters after superior clear corneal incision cataract surgery in arcus lipoides. Eur J Ophthalmol 2006;16:24-29. IF: 0,534
3.
Resch M, Ispán O, Kelemen E: Intraoperatív és posztoperatív pachymetria LASIK műtétek kapcsán. Szemészet 2002;139:105-108.
4.
Nagy ZZ, Resch M, Süveges I: Ultrasound evaluation of flap thickness, ablation depth, and corneal edema after laser in situ keratomileusis. J Refract Surg. 2004;20:279-281. IF: 2,399
5.
Resch M, Nagy ZZ, Szentmáry N, Máthé M, Kovalszky I, Süveges I. Spatial distribution of keratan sulfate in the rabbit cornea following photorefractive keratectomy (PRK) J Refr Surg. 2005;21:485-493. IF: 2,399
6.
Resch M, Nagy ZZ, Szentmáry N, Máthé M, Kovalszky I, Süveges I: A glükózaminoglikánok és a keratán szulfát eloszlása és szerepe a nyúl cornea sebgyógyulásában fotorefraktív keratectomia (PRK) után. Szemészet 2004;141:393399.
7.
Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Proliferation and apoptosis in the corneal stroma in long-term follow-up after photorefractive keratectomy. Pathology Res Pract. 2005;201:399-404. IF: 0,681
8.
Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Apoptosis a corneában fotorefraktív keratectomia után. Szemészet 2003;140:169-172.
- 81 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
13.2. Egyéb közlemények 1. Nagy ZZ, Resch M, Czumbel N, Kovács A, Kelemen E, Süveges I: A lézer in situ keratomileusis (LASIK) műtétek során szerzett tapasztalataink. Orv Hetil 2002;143:929-936. 2. Csákány B, Resch M: Endogén uveitisek etiológiája. Allergológia és Klinikai Immunológia 2002;5:106-109. 3. Nagy ZZ, Resch M, Popper Mónika: A fotorefraktív keratectomia szerepe a radiális keratotomia utáni reziduális/regresszív myopia és a lézeres thermokeratoplastica utáni reziduális hypermetropia kezelésében. Szemészet 2002;139:243-248. 4. Popper M, Resch M, Süveges I: LASIK módszer és a topográfián alapuló egyéni kezelési terv a perforáló keratoplasztika után fellépő magas dioptriaértékű irreguláris astigmia sebészi kezelésében. Szemészet 2003;140:21-25. 5. Resch M, Popper M: A pásztázó és repülőpont-technikával végzett fotorefraktív keratectomia (PRK) eredményei hypermetropiában Orv Hetil. 2003;144:27-33. 6. Resch M, Czumbel N, Kovács A, Nagy ZZ: Tapasztalataink a rövidlátás laser in situ mileusis (LASIK) kezelésével. Szemészet 2003;140:163-168. 7. Resch M, Szentmáry N, Nagy ZZ, Czumbel N: A repülőpont-technikával végzett fotorefraktív keratectomia és a lézer in situ keratomileusis módszerek összehasonlítása a hypermetropia kezelésében. Orv. Hetil. 2004; 145:573-578. 8. Imre L, Tóth J, Megyesi M, Lukáts O, Resch M. Az Acanthamoeba-keratitis in vivo diagnosztikája konfokális korneamikroszkópiával. Szemészet 2004;141:359363. 9. Imre L, Resch M, Nagymihály A. Konfokale In-vivo-Hornhautmikroskopie nach Keratoplastik [In vivo confocal corneal microscopy after keratoplasty.] Der Ophthalmologe 2005;102:140-146. IF: 0,508 10. Resch M, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE, Seitz B.. Adhesion structures of amniotic membranes integrated into human corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47:1853–1861. IF: 3,577 11. Seitz B, Resch M, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE. Histopathology and Ultrastructure of Human Corneas After Amniotic Membrane Transplantation. Arch Ophthalmol 2006 (nyomtatás alatt) IF: 2,926
- 82 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
13.3. Idézhető absztraktok az értekezés témájában 1. Resch M, Szentmáry N, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Histological examination on rabbit corneas following photorefractive keratectomy (PRK). Der Ophthalmologe 2002;S213 P197. 2. Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Apoptosis In The Cornea Following Photorefractive Keratectomy. Der Ophthalmologe 2002;S194 P133. 3. Resch M., Szentmáry N., Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Nyúl cornea szövettani vizsgálata fotorefraktív keratectomia (PRK) után. Szemészet 2002;139, Suppl. II. 39-40. 4. Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Apoptosis a corneában fotorefraktív keratectomia után. Szemészet 2002;139:Suppl. II. 40. 5. Resch M, Nagy ZZ, Süveges I: Féloldali ptosis féloldali arcus lipoides hátterében –esetismertetés. Szemészet 2003;140:Suppl I. 75-76. 13.4. Egyéb idézhető absztrakt 1. Imre L, Resch M, Nagymihály A: Langzeitige Beobachtungen an Patienten nach perforierender Keratoplastik mit in vivo konfokaler Hornhautmikroskopie. Long-term follow up of Penetrating Keratoplasty Patients with in vivo Confocal Corneal Microscopy. Der Ophthalmologe 2003;100:S26 2. Imre L, Resch M, Nagymihály A, Süveges I: Tiszta transzplantátumokban észlelhető in vivo mikroszkópos eltérések keratoplastika után 22 és 72 hónappal. Szemészet 2003;140: Suppl I. 71-72. 3. Resch M, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE, Seitz B.. Adhesion structures in human corneas after amniotic membrane transplantation (AMT) – IOVS 2005. E-abstract 4981 4. Resch M, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Kruse FE, Seitz B, Süveges I. Az amnionmembrán beépülése a szaruhártyába. Szemészet 2005;142: Suppl I 49. 5. Bausz M, Sényi K, Túri É, Maka E, Resch M. Szemnyomás értékek késő posztoperatív periódusban veleszületett szürkehályog műtéte után. Szemészet 2005;142: 104-105.
- 83 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
13.5. Az értekezés témájában elhangzott előadások, poszterek 1.
Resch M, Nagy ZZ: Intraoperatív és posztoperatív ultrahangos pachymetria LASIK kapcsán. (V. Ametropia Kongresszus, 2002. Szeged)
2.
Resch M, Szentmáry N, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Nyúl cornea szövettani vizsgálata fotorefraktív keratectomia (PRK) után (poszter és előadás – díj: a legjobb 35 év alatti előadó a szekcióban) (MSZT 2002. Miskolc)
3.
Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Apoptosis a corneában fotorefraktív keratectomia után - poszter és előadás (MSZT, 2002. Miskolc)
4.
Resch M, Szentmáry N, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Histological examination on rabbit corneas following photorefractive keratectomy (PRK) - poster (DOG 2002. Berlin)
5.
Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Apoptosis in the cornea following photorefractive keratectomy - poster (DOG 2002. Berlin)
6.
Resch M, Nagy ZZ: Féloldali ptosis féloldali arcus lipoides hátterében – esetismertetés (MSZT, 2003. Budapest)
7.
Szentmáry N, Resch M, Nagy ZZ, Szende B, Süveges I: Apoptosis cornea folyamatokban (MSZT 2004. Budapest)
8.
Resch M, Nagy ZZ, Szabó V, Süveges I: A szaruhártya sebgyógyulásának pathológiája I. (MSZT 2004. Budapest)
9.
Szabó V, Nagy ZZ, Resch M, Süveges I: A szaruhártya sebgyógyulásának pathológiája excimer lézerkezelés után (MSZT 2004. Budapest)
10. Resch M, Nagy ZZ, Szentmáry N, Süveges I: Ultrasound Pachymetric Evaluation of corneal stroma and flap edema in myopic LASIK. (SOE 2003, Madrid) –poszter 11. Resch M, Nagy ZZ, Szentmáry N, Máthé M, Kovalszky I, Süveges I. Der Zusammenhang von post-PRK Entzündung und Keratansulfat-Verteilung in der Hornhaut von Käninchen [Correlation of post-PRK inflammation and keratan sulfate distribution in the rabbit cornea] (DOG 2004. Berlin)
- 84 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
13.6. Egyéb előadások, poszterek 1.
Bausz M, Sényi K, Túri É, Resch M, Süveges I: Cataracta secundaria gyakorisága csecsemő és gyermekkori cataracta műtétek után (SHIOL, 2003. Keszthely)
2.
Nagy ZZ, Resch M: Az antioxidáns kezelés jelentősége refraktív kezelések után (Csapó-Ruttner Emlékülés 2003. Nagykőrös)
3.
Videorefraktíva – 4 műtét kommentálása (MSZT 2003. Budapest)
4.
Imre L, Resch M, Nagymihály A, Süveges I: Tiszta transzplantátumokban észlelhető in vivo mikroszkópos eltérések keratoplastika után 22 és 72 hónappal (MSZT 2003. Budapest)
5.
Bausz M, Resch M, Süveges I: Secondary Procedures in congenital cataract (Odessa 2003) –előadás
6.
Nagy ZZ, Resch M, Ispán O., Süveges I: Results of wavefront-guided PRK and LASEK Treatments (Madrid, SOE 2003)-előadás
7.
Szentmáry N, Nagy ZZ, Resch M, Süveges I: Phototherapeutic Keratectomy in Haab-Dimmer Dystrophy (Madrid, SOE 2003)
8.
Imre L, Resch M, Nagymihály A: Long-term follow up of Penetrating Keratplasty Patients with in vivo Confocal Corneal Microscopy (DOG 2003. Berlin)
9.
Bausz M, Resch M, Süveges I: Secondary Procedures in congenital cataract (ESCRS 2003. München)
10. Resch M, Kálmán Zs, Süveges I: A korai posztoperatív szemnyomás emelkedés kezelése Cosopt szemcseppel (SHIOL 2004. Keszthely) 11. Csidey M, Resch M, Bausz M: Kockázat vizsgálat a szürkehályog LOCS III. beosztása szerint (SHIOL 2004. Keszthely) – poszter 12. Nagy ZZ, Szabó V, Resch M, Süveges I: A kis sugárátmérőjű, nagy frekvenciás repülő pont technikás laser készülék eredményei myopiás szemekben. (SHIOL 2004. Keszthely) 13. Bausz M, Resch M, Sényi K, Túri É, Süveges I. Intraocular pressure after congenital cataract surgery – impact of PCL (ESCRS 2004. Párizs)
- 85 -
Doktori értekezés
Dr. Resch Miklós
14. Nagy ZZ, Szabo V, Szentmary N, Resch M. Comparison of Hyperopic Refractive Treatments With Different Types of Excimer Lasers and Different Surgical Techniques (AAO-SOE Joint Meeting 2004. New Orleans, USA) 15. Seitz B, Resch MD, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE. Patterns of amniotic membrane (AM) integration in human corneas – histology and ultrastructure. (World Cornea Congress, 2005. Washington DC, USA) 16. Resch M, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE, Seitz B.. Adhesion structures in human corneas after amniotic membrane transplantation (AMT) – ARVO Annual Meeting 2005. Fort Lauderdale, FL, USA) 17. Knézy K, Serfőző Cs, Resch M, Bausz M. Finom látásfunkció vizsgálata PCL implantáció után (SHIOL, 2005. Keszthely) 18. Resch M, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Kruse FE, Seitz B, Süveges I. Az amnionmembrán beépülése a szaruhártyába. (MSZT 2005, Szeged) 19. Bausz M, Sényi K, Túri É, Maka E, Resch M. Szemnyomás értékek késő posztoperatív periódusban veleszületett szürkehályog műtéte után. (MSZT 2005, Szeged) 20. Bausz M, Fodor E, Resch M, Kristóf K: Az elülső csarnok bakteriális kontaminációja phakoemulsificatio után. (SHIOL 2006, Keszthely) 21. Serfőző Cs, Resch M, Bausz M: VF-14 és CATQUEST kérdőívek cognitív validálása a betegelégedettségi kérdőívek (VF-14, CATQUEST) összehasonlítása. (SHIOL 2006, Keszthely) 22. Nagymihály A, Knézy K, Resch M, Bausz M: A kontrasztérzékenység és a színlátás összehasonlítása Acrysof SA60AT és Acrysof SN60AT (Natural) típusú hátsó csarnoki műlencsék beültetését követően. (SHIOL 2006, Keszthely)
13.7. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai
- 86 -
