A HLA antigének és biológiai jelentőségük. Dr. Kozma László
OVSZ Debreceni Regionális Vértranszfúziós Központ
A HLA ANTIGÉNEK centromer HLA DP
6. kromoszóma DQ DR B C
A
MHC II MHC III MHC I
B C
A
A HLA antigének öröklődése
a/b
a/c
c/d
a/c
a/d
b/d
Példaként egy tetszőleges haplotípus: HLA-A2, B12, Cw4, DR15, DQ2
Nómenklatúra és szuperantigének Szerológiai specifitás: (génlókusz + allél)
HLA-A 1 HLA-B 7 HLA-Cw 3
DNS alapú tipizálás:
HLA-DRB1*0104 HLA-DRB3*0203 HLA-DQB1*0304 (DQ7)
Szuperantigének: HLA-Bw 4, 6 HLA-DR 51, 52, 53
Az egyes HLA lokuszokon található allélek száma Lokusz HLA-A
Allélek DNS szinten 119
Szerológiai megfelelő 40
HLA-B
245
88
HLA-C
74
9
HLA-DRB1
201
48
HLA-DQB1
39
9
HLA-DPB1
84
(-)
HLA I. osztálybeli keresztreagáló csoportok (CREG) A1 CREG (1 C)
A 1,3,9,10,11,28,19
A2 CREG (2C)
A 2,9,28
B5 CREG (5C)
B 5,15,17,18,35,70
B7 CREG (7C)
B 7,13,27,22,40,41,42,47,48
B8 CREG (8C)
B 8,18,15,16
B12 CREG (12C)
B 12,21,13,40,41
MHC II. osztály antigénjeinek meghatározása kevert limfocita kultúrával (MLR) A vizsgálandó limfocitákat keverik homozigóta irradiált és/vagy mitomycin-C-vel kezelt leukocitákkal. 4-6 napos kultúrában az idegen II. osztály antigént felismerik a T sejtek. Bekövetkezik a transzformáció (DNS szintézis és megnagyobbodás: blastogenezis) és proliferáció (mitogenezis). Mérik a radioaktív timidin inkorporációját (tricium-jelzett: 3H). Citotoxikus T limfociták képződése: mismatch az I. és II. osztály antigénjeire. A citotoxikus hatás csak az I. osztályra korlátozott.
Veseátültetés és allograft rejekció Graft túlélés: egy éves 92-95%, 3-5 éves 70-90% A szervdonorok 1/3-a élő, 2/3-a cadaver (érrendszeri és daganatos betegségek, diabetes kizárva) Host-versus-graft reakció: túlélés xeno-allo-izo-autograft sorrendben. Számolni kell a minor histocompatibilitási antigénekkel, immun-memóriával a szekunder válasz kapcsán. Komplikációk: akut és krónikus rejekció, gyógyszer toxicitás (nefrotoxikus cyclosporin), fertőzések, vesefunkcióval összefüggő problémák, tumor incidencia nő (lymphoma, laphámcc.)
A rejekció típusai • Hiperakut rejekció: magas titerű preformált HLA I. osztály antitestek jelenlétében, percek alatt előáll. • Gyorsult (szekunder) rejekció: a második graft az elsővel részben azonos antigéneket hordoz. Szenzitizált T ly jelenlétében 2-5 nap alatt kialakul. • Akut rejekció: elsődleges T sejt aktiváció révén 1-3 hét múlva lép fel. • Krónikus rejekció: tisztázatlan okok miatt (antitestek, immunkomplexek, sejtes reakciók) hónapokkal, évekkel később jelentkezik.
Examples of selected immunosuppressive agents • AGENT • Corticosteroids, prednisone • Cyclosporin, FK-506 • Rapamycin • Azathioprine, 6-MP • Methotrexate • Cyclophosphamide, melphalan
• POSSIBLE ACTION • Anti-inflammatory, alter T cell and PMN traffic • Inhibiting IL-2 synthesis • Blocking IL-2-R signal • Purine metabolism • Folate metabolism • Alkylation of DNA, RNA and proteins
A graft túlélési idejének növelése • Donor szelekció: egypetéjű ikrek, HLA azonosság, egyezés a D/DR lókuszon, ABO kompatibilitás! • Recipiens előkezelése: fertőzésmentes és nem lehet magas vérnyomása. 1-5x 100-200 ml teljes vér transzfúziója a donortól ajánlott. • Immunszuppresszív terápia: az antigén által kiváltott T sejt proliferációt gátolják (cyclosporin A, FK-506 tacrolimus, rapamycin
A csontvelő transzplantáció megközelítése I. Autológ csontvelő: probléma a tárolás, hűtés. nincs GVHL II. Rokon donorok: monozigóta ikrek HLA identikus testvérek egy antigén különbséggel rendelkező szülő. III. Nem rokon donorok.
Bone Marrow Donor Worldwide 41 ország 56 donor regiszter 21 ország 38 köldökvér regiszter Összesen több mint 10 millió regisztrált donor ill. köldökvér egység
Magyar Csontvelődonor Regiszter 5000 regisztrált csontvelő donor
HLA and disease associations DISEASE
ALLÉL
PATIENTS%
CONTROL%
RR
Ankylosing Spondylitis
B 27
90
9
87,4
Reiter’s syndrome
B 27 B 27
79 52
9 9
37,0 10,4
Cw 6 DR 3
87 85
33 26
13,3 15,4
Celiac disease
DR 3
IDDM
DR 3/4
79 91
26 57
10,8 7,9
Acute anterior Uveitis
Psoriasis vulg. Dermatitis herpetiformis
MÓDSZEREINK I HLA-A,-B,-C antigének meghatározása szerológiailag
Terasaki-féle limfocitotoxicitási mikroteszt
A DNS alapú HLA tipizálás módszerei • Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) • Szekvencia specifikus oligonukleotid (SSO) hibridizáció • Módosított SSO: ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) HLA PCR-SSP (sequence-specific primer) tipizálás HLA SBT (sequence-based typing) módszer DNS mikrochipek alkalmazása
A HLA tipizálás PCR-SSP módszerének elve A sikeres amplifikáció előfeltétele a tökéletes egyezés a primer-templát hibridben a primer 3’ végén
TAGTCAGTTCAATCGGGAG ATCAGTCAAGTTAG
Teljes egyezés – van termék
TAGTCAGTTCAATCGGGAG ATCAGTCAAGTTA C
3’ mismatch nincs termék
A HLA PCR-SSP módszer kivitelezése
• DNS izolálás Generation Capture Column kittel • Specifikus amplifikáció PCR reakcióban • Kiértékelés
DNS IZOLÁLÁS GENERATION CAPTURE COLUMN KITTEL 300 µl perifériás vérből …
… 5-10 µg DNS
ESZKÖZEINK HLA-DR antigének meghatározása genetikailag
PCR készülék
HLA-DRB SSP Kit
DNS Purifikációs oldat
POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR) I HLA DRB-SSP Kit
PCR minta - HLA specifikus primer párok PCR: Ha a hozzáadott szekvencia a keresett allélnak megfelelő, a génszakaszok amplifikálódnak.
Specifikus amplifikáció PCR reakcióval • Előfeltétele: kielégítő mennyiségű és tisztaságú genomiális templát DNS • Megjegyzés: ne használjunk sem heparint, sem szerves oldószereket
A specifikus amplifikáció (PCR) paraméterei Kezdeti denaturálás 94 oC, 2 perc 10 ciklus: Denaturálás 94 oC, 10 mp Annealing & extension 65 oC, 60 mp
20 ciklus: Denaturálás 94 oC, 10 mp Annealing 61 oC, 50 mp Extension 72 oC, 30 mp
POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR) II
Festés Gélelektroforézis UV–szűrő lámpa
HLA-DR 16,13
HLA-DR genotipizálás PCR-SSP módszerrel
A specifikus amplifikációt befolyásoló tényezők • A PCR hőmérsékleti paraméterei (annealing temperature) • A genomiális templát DNS mennyisége • Mg2+ koncentráció
A HLA GENOTIPIZÁLÁS ELŐNYEI Szerológiai tipizálás feltételei • Ép target sejtek (dye exclusion) • Kielégítő mértékű felületi antigénsűrűség
DNS alapú • valamivel gyorsabb • nagyobb részletesség (humorális-sejtes immunválasz) • standardizálható • nem szükséges élő limfocita
HLA SBT rendszer (sequencing-based typing)
A DNS microarray hibridizáció alkalmazása a HLA rendszer vizsgálatában Alacsony- és nagy felbontású HLA tipizálás Guo Z, Hood L, Petersdorf EW: Rev.Immunogenet.1999.1.220. Haddock SH et al. Methods Mol. Biol. 2001.170.201.
HLA antigének és ligandok expressziójának mérése Gutgemann A. et al.: Arch. Dermatol. Res. 2001.293.283. Sturniolo T. et al.: Nat. Biotechnol. 1999.17.555.
DNS izolálás Generation Capture Column kittel • A minta tisztítása • A minta elúció • A DNS tartalom mérése
A minta tisztítása • Felvisszük a 300 μl teljes vért vagy sejtszuszpenziót az oszlopra – 5 percig áll. • Hozzáadunk 400 μl DNS „Purification” oldatot – 1 percig áll – RT. • Centrifugálás 30 mp, 4000 g. • Az előző két fázis ismétlése. • 200 μl DNS „Elúciós” oldat - inkubálás nélkül centrifugálás.
Minta elúció • • • • •
Vidd át az oszlopot tiszta csőbe. Adj hozzá 100 μl DNS elúciós puffert. Inkubáld 10 percig 99 oC-on. Centrifugáld: 30 mp, 8000 g. Tárolás: 3 hónapig 4 oC-on, hosszabb időre – 20 oC-on.
A DNS tartalom mérése
20 μl minta + 80 μl puffer: a minta DNS cc: 50-90 μg/ml A maradék kb 75 μl minta DNS tartalma: 3,75-6,75 μg A 24 PCR reakcióhoz kell kb 2,4 μg. A master mix-hez keverünk 48-27 μl templát DNS oldatot.
Költségszámítás • A Generation Capture Column kit 50 oszlopot tartalmaz. • Ára 22 950 Ft (Merck) • Ez 459 Ft/teszt, amennyiben sikerül a DR és DQ tipizáláshoz 2 x 2,4 μg és a méréshez szükséges 0,5 μg, azaz 5,3 μg előállítása. • Sejtszuszpenzió teljes vér helyett javítja a kitermelést.
POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR) II
Festés Gélelektroforézis UV–szűrő lámpa
HLA-DR 16,13
