HLA typeren en HLA antistoffen t.b.v. trombocytentransfusies

Regionale Themamiddag Bloedtransfusie

C. Voorter

27-03-2014

HLA typeren en HLA antistoffen t.b.v. trombocytentransfusies Christien Voorter Transplantatie-Immunologie, Laboratorium Weefseltypering c,[email protected]


C. Voorter

27-03-2014

HLA • Humaan Leucocyt Antigeen • Eiwitten op oppervlakte van de cel • Polymorf (veel verschillende soorten) • Rol bij immunologische reacties Afweer tegen lichaamsvreemde stoffen zoals virussen, bacterien

2


C. Voorter

27-03-2014

3

HLA systeem * Bloedgroepsysteem op witte bloedcellen, maar ook op vrijwel alle kernhoudende cellen en bloedplaatjes * Veel polymorfer dan rode bloedgroepen: ABO systeem 4 mogelijke combinaties HLA systeem meer dan 1 miljoen combinaties * ABO: natuurlijk aanwezige antistoffen HLA: antistoffen alleen na contact met vreemde HLA antigenen


C. Voorter

27-03-2014

4

HLA genen Chromosoom 6

DP

DQ

DR

B

B

B

A

A

klasse II

B

C

A

klasse I

A


C. Voorter

27-03-2014

5

HLA klasse I molecuul A/B/C C6 C15 beta-2microglobuline

HLA klasse I moleculen: expressie op alle kernhoudende cellen en trombocyten


C. Voorter

27-03-2014

6

HLA klasse II molecuul DRA/DQA/DPA

C6

DRB/DQB/DPB

C6

HLA klasse II moleculen: expressie op B-lymfocyten, macrofagen, dendritische cellen, endotheelcellen en geactiveerde T-cellen

7


C. Voorter

27-03-2014

Structuur HLA molecuul

8


C. Voorter

27-03-2014

Structuur HLA molecuul

9


C. Voorter

27-03-2014

10

viral protein virus cytotoxic HLA class I /viral peptide

recognition

CD8+ Tcell


C. Voorter

27-03-2014

11

HLA-A variatie Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa A a Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa  Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa  Aa Aa


C. Voorter

27-03-2014

12

HLA polymorfisme herkent verschillende peptides Virale eiwitten Virale peptide

HLA-A1 +

HLA-A2 +

HLA-A3 +

HLA-A11 -Response


C. Voorter

27-03-2014

Polymorfisme HLA Aantal allelen per locus January 2003 A 266

B 511

C 128

DRB 328

DQB1 53

DPB1 101

C 2133

DRB 1512

DQB1 509

DPB1 248

January 2014 A 2579

B 3285

13


C. Voorter

27-03-2014

Trombocyten transfusie

?

?

HLA-A, HLA-B

14


C. Voorter

27-03-2014

15


HLA identiek

HLA niet acceptabel

HLA acceptabel

HLA antistoffen?


C. Voorter

27-03-2014

HLA bepalingen tbv trombocytentransfusies HLA typeren: HLA overeenkomst donor en patiënt

HLA antistoffen: aan- en afwezigheid specificiteit

16


C. Voorter

27-03-2014

HLA typering

Serologie: bepaalt HLA moleculen op het cel oppervlak DNA typering: bepaalt HLA gen informatie

17


C. Voorter

27-03-2014

18

Serologische HLA typering Te typeren individu

lymphocytes

many different sera

anti-HLA antibodies


C. Voorter

27-03-2014

CDC: Complement Dependent Cytotoxicity

19


C. Voorter

27-03-2014

Serologische HLA typering

negatieve reactie

positieve reactie

20


C. Voorter

27-03-2014

21

Moleculaire HLA typering • lage resolutie

SSP = sequentie specifieke primer amplificatie SSO = sequentie specifieke oligo hybridisatie

• hoge resolutie SBT = sequence based typing (nucleotide volgorde)


C. Voorter

27-03-2014

22

PCR-SSP 5’

3’

PCR product

3’

5’

5’

3’

geen PCR product

3’

5’ 3’ mismatch + IC

M

-


C. Voorter

27-03-2014

23

PCR-SSO (Luminex technology)


C. Voorter

27-03-2014

Assays

HLA ANTISTOF BEPALING LUMINEX SINGLE ANTIGENS

HLA TYPERING PCR-SSO

24


C. Voorter

27-03-2014

PCR-SSO (Luminex) DNA

bio PE

BEAD 2

probe 2

rode laser: identificatie bead (probe) groene laser: detectie DNA binding

25


C. Voorter

27-03-2014

Sequence based typing

26


C. Voorter

27-03-2014

27

Resolutie van HLA typering en naamgeving serologisch

A24

molecuul

DNA lage resolutie

A*24

allelgroep

DNA intermediair

A*24 AMJ

allelgroepcluster

A*24 CGMH DNA hoge resolutie

A*24:02:01:02 N

alleldefinitie


C. Voorter

27-03-2014

28

Nomenclatuur typering op DNA proteïn

geeft verschillen aan in niet-coderend gebied (intron)

HLA – A * 24 : 02 : 01 : 02 N gen allel groep

synonieme substitutie in het coderend gebied

geeft verandering in expressie aan

L = lage expressie N = nul allel


C. Voorter

27-03-2014

29

HLA antistoffen Vorming na contact met vreemde HLA antigenen: - zwangerschap - bloedtransfusie - transplantatie

Vastgesteld mbv verschillende technieken: - Elisa - CDC - flow cytometrie (Luminex)


C. Voorter

27-03-2014

30

HLA antistoffen Aanwezigheid: er zijn wel of geen antistoffen aanwezig Elisa

Specificiteit:

antistoffen herkennen een bepaald antigen, bv A1, B12, DR13 etc %PRA kan worden doorgegeven CDC screening Luminex Single Antigens


C. Voorter

ELISA

27-03-2014

31


C. Voorter

27-03-2014

32

Luminex Single Antigen assay recipient blood serum

+

+

Anti-IgG-PE


C. Voorter

27-03-2014

Luminex Single Antigen assay Commercial assays including the use of single antigen beads (Luminex) although the conformation of these molecules may be different than that of membrane bound HLA molecules.

HLA-A1

HLA-A2

HLA-A3

HLA-B7

33


C. Voorter

27-03-2014

Specificity HLA antibodies

> 4000

34


C. Voorter

27-03-2014

35


HLA identiek

HLA niet acceptabel

HLA acceptabel

HLA antistoffen?


C. Voorter

27-03-2014

36


HLA identiek

HLA niet acceptabel A2, 24, 33, 34, 68, 69 HLA acceptabel A1, 3, 11, etc

HLA antistoffen A2, 24, 33, 34, 68, 69


C. Voorter

27-03-2014

37

Transplantatie Immunologie Laboratorium Weefseltypering Niertransplantaties

Stamcel transplantaties

HLA typeren

Autoloog/familie/ongerelateerd (MUD)

* Ontvangers en evt hun familieleden

HLA typeren

* Donoren (postmortale en levende)

HLA antistofbepalingen


Searchen en bepalen matchingsgraad donoren

Kruisproeven

Chimerismebepaling na transplantatie

Adviezen t.a.v. transplantatiemogelijkheden

Associaties HLA met ziekte

Trombocytensupport

• • • •

HLA typeren

Coeliakie Bechterev (ankylosing spondylitis) HIV-medicatie (abacavir) Etc


Onderzoek


C. Voorter

27-03-2014

38

Transplantation Immunology Tissue Typing Laboratory Prof. Dr. Marcel G.J. Tilanus Office - Diana van Bakel • •

Molecular Immunology - Dr. Christien Voorter - Lisette Groeneveld • • • • • • • • • •

Kevin Gerritsen Timo Olieslagers Veerle Crijns Fausto Palusci Maud Limpens Christel Meertens Stefan Molenbroeck Sophie Onclin Veronique Vastmans Kim Beekers

Bio-informatics - Dr. Mathijs Groeneweg

Mieke Haemers Audrey van den Berg

Cellular immunology - Dr. Lotte Wieten • Ilse Houba • Fabienne Jeukens

Serology -

Dr. Joris Vanderlocht Dr. Jennifer Schellekens Sandra Piederiet Coline van Groesen • • • • • •

Thomas Habets Marjolijn van Tuijl Els Bielen Jacqueline Frijns Annette Rombach Esther Schaepkens

HLA typeren en HLA antistoffen t.b.v. trombocytentransfusies

Recommend Documents