HLA typeringen: nieuwe DNA technieken
Wendy T.N. Swelsen Afdeling Immunogenetica, HLA diagnostiek
|1
Structuur presentatie • DNA typeerstraat • Nieuwe techniek: Next Generation Sequencing (NGS)
|2
Afdeling Immunogenetica, HLA • Hematopoïetische stamceltransplantatie • Solid organ transplantatie • Transfusie problematiek • Ziekte associaties • Populatie studies / research doeleinden
|3
HLA complex
1 2
HLA klasse I HLA-A HLA-B HLA-C HLA klasse II HLA-DR HLA-DQ HLA-DP
|4
HLA typeren • Serologische technieken detectie HLA antigenen • DNA technieken detectie HLA allelen
PCR-SSP
spoedbepalingen (orgaandonatie, refractaire patiënten)
PCR-SSO lage resolutie HLA typeringen (bijv. A*01) PCR-SBT hoge resolutie HLA typeringen (bijv. A*01:01)
typeerstraat
|5
Toename aantal HLA allelen
|6
Efficiënt HLA typeren in ‘typeerstraat’ DNA isolatie/kwantificeer Experimate Chemagen
Pre-PCR pipetteer robot
Hybridisatie robot
Xiril
HLA Luminexhybridiseer GenProbe
en Trinean unit
2D barcode opslag
Middleware software CLIS
ABI-3130xl sequencer
Post- PCR pipetteerrobot Xiril
Elektronisch te versturen uitslagen
|7
Sample track and trace 2D barcode gelabelde tubes en 96 wells platen
|8
DNA isolatie robot • Import werklijst van CLIS • DNA isolatie • Bloed • Wangslijm
• Kwantificering • Normalisatie • Export resultaten naar CLIS
|9
Pre-PCR robot • Import werklijst CLIS • Verschillende set-ups tegelijkertijd • Pipetteren bij 4°C en KT • Export werklijst naar • hybridiseer station (PCR-SSO) • post-PCR robot (PCR-SBT)
Pre-PCR robot 4x96 reacties / run | 10
Luminex-hybridiseer station (PCR-SSO) • Import werklijst • Hybridisatie gelabelde PCR producten aan beads • Meting in Luminex apparaat
Hybridiseer station 5x96 testen / run | 11
Post-PCR robot (PCR-SBT) • Import werklijst • Zuivering PCR producten • Set-up sequentie reacties • Zuivering sequentie producten • Export sample file naar sequencer
Post-PCR robot 4x96 sequentie reacties / run
| 12
Efficiënt HLA typeren in ‘typeerstraat’ DNA isolatie/kwantificeer Experimate Chemagen
Pre-PCR pipetteer robot
Hybridisatie robot
Xiril
HLA Luminexhybridiseer GenProbe
en Trinean unit
2D barcode opslag
Middleware software CLIS
ABI-3130xl sequencer
Post- PCR pipetteerrobot Xiril
Elektronisch te versturen uitslagen
| 13
Voordelen HLA typeerstraat • Continu kwaliteitsniveau • Geen monsterverwisseling • Geen schrijffouten • Geen pipetteerfouten • Minder hands-on time
| 14
Nieuwe technieken
Nieuwe technieken • Registry typing SSO SBT sanger, batch-wise • Kostenbesparing • Intermediate resolutie typeer niveau • Patiënt en stamceldonor typering SBT sanger SBT next-generation sequencing | 16
Next generation sequencing Methode om heel veel verschillende genen tegelijkertijd te sequencen, waarbij materialen van verschillende patiënten gepooled kunnen worden.
| 17
NGS: oplossing HLA typeer probleem? Toename aantal HLA allelen meer ambiguïteiten
| 18
Genomische organisatie HLA Chromosoom 6
DPB1
DPB1
DQB1 DRB1
DQB1 DRB1
B C A
B C A
HLA-A gen 1
2
3
4 5
HLA-A gen 67 8
1
2
3
4 5
67 8
| 19
Ambiguïteiten bij Sanger sequencing (1) Allel combinatie 1 Allel combinatie 2
A*01:01:01:01 & A*11:01:01 A*01:19 & A*11*19
Geen phasing vervolgonderzoek nodig | 20
Ambiguïteiten bij Sanger sequencing (2)
Typering DRB1*03:01 + DRB1*12:01 / *12:10
Niet gekarakteriseerde DRB1 regio exon 1 | 21
Karakteristieken NGS (1) Clonale amplificatie • Emulsie PCR
• Bridge PCR
Voordeel: direct allel-specifieke typering (geen phase ambiguïteiten) | 22
Karakteristieken NGS (2) Uitgebreide parallelle sequencing
Voordeel: sequencen additionele exonen en intronen | 23
Vier NGS platforms
Roche 454 GS FLX, GS Junior
Life technologies IonTorrent PGM
Illumina’s Miseq
Pac Biosciences SMRT
| 24
Hoge resolutie HLA typering & NGS • HLA typering in 1 run • Analyse van grote genomische regio’s • Gelijktijdige analyse van veel monsters • Kostenbesparing indien voldoende schaalgrootte
| 25
Acknowledgements Afdeling Immunogenetica • Masja de Haas • Junior Lardy • Peter van Eede • Miranda van de Weerd Moleculair platform • Ellen van der Schoot • Richard van Hien
| 26
Deze dia alléén voor grote grafische uitingen gebruiken (vergeet niet deze textbox te verwijderen)
