HERTENTAMEN Eindtoets BIOCHEMIE (8RA00) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld 16-08-2013 09:00 – 12:00 (totaal 100 punten) 6 opgaven in totaal! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! 1 Peptiden en eiwitten (~30 minuten; 20 punten) U bent bezig met uw afstudeeronderzoek naar eiwitten in hersenen en isoleert onderstaand peptide. U begrijpt in eerste instantie de functie van dit peptide niet.
a.
Geef de 1-lettercode van de corresponderende volgorde. (4P)
aminozuren
in
het
peptide
in
de
b.
Geef drie verschillende non-covalente interacties die dit peptide aan kan gaan met andere eiwitten en geef bij ieder type non-covalente interactie een voorbeeld met welke functionele groep van dit peptide dit kan gebeuren. (3P)
c.
Om meer te weten te komen over de functie van het peptide behandeld u het met het enzyme trypsine. Welke chemische reactie treedt er op? Geef, om uw antwoord te verduidelijken, de producten die bij de reactie gevormd worden (denk daarbij aan de eindgroepen van het peptide!). (4P)
d.
De reactie onder 1c met trypsine is u uiteindelijk slechts gedeeltelijk gelukt; niet al uw peptide heeft gereageerd. Stel een scheidingstechniek voor om uw producten te scheiden van het nog aanwezige originele peptide en geef daarbij aan waarom u deze techniek wilt gebruiken. (3P)
e.
Het peptide blijkt met andere kopieën van zichzelf een anti-parallele betasheet te vormen. Schetst u schematisch het waterstofbruggenpatroon in een anti-parallele beta-sheet (u kunt volstaan met het tekenen van alleen de backbones). (3P)
f.
Teken een Ramachandran Plot en laat zien in welk gebied u de torsion angles (torsiehoeken) van de bindingen van bovenstaand peptide verwacht. Geeft u daarbij ook aan welke waarden er op de assen staan. (3P)
2 Knippen met eiwitten (~20 minuten; 15 punten) a.
Trypsine is een serine protease welke amide-bindingen hydrolyseert. Het actieve centrum van de protease bestaat uit een zogenaamde katalytische triade. Legt u aan de hand van het mechanisme van de katalytische reactie uit of trypsine in principe in plaats van amide-bindingen ook esterbindingen zou kunnen hydrolyseren. Gaat u daarbij op moleculair niveau in op de katalytische triade en de stabilisatie van de overgangstoestand. (6P)
b.
Bepaalde enzymen (zoals thrombine en factor Xa) hebben een hogere substraatselectiviteit dan het enzym trypsine (welke in opgave 1c werd gebruikt). Middels wat voor moleculair mechanisme bewerkstelligen deze specifiekere enzymen de hogere substraatselectiviteit / herkenning van hun substraat? Leg kort uit hoe dit werkt. (4P)
c.
De reactie behandeld in opgave 1c wordt nu doorgevoerd in aanwezigheid van een vaste concentratie competitieve inhibitor bij verschillende substraatconcentraties en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij deze verschillende substraatconcentraties bepaald. De resultaten hiervan worden uitgezet in een Lineweaver-Burk plot (zie figuur onder). Bereken/bepaal KM en Vmax voor dit enzym in aanwezigheid van het competitieve ligand. (U mag voor uw gemak afronden op een cijfer achter de komma.) (3P) 1.8
1/V0 (min./mol)
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
-0.8
d.
-0.6
-0.4
0.0 -0.2 0.0 -0.2
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
-1
1/[S] (M )
Hoe verandert de turnover number van het enzym als dezelfde reactie doorgevoerd wordt zonder competitieve ligand? Verklaar uw antwoord! (2P)
3 Eiwitten in het membraan (~20 minuten; 20 punten) Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit eiwitten en specifieke lipiden, voornamelijk fosfolipiden, glycolipiden en cholesterol. a.
De smelttemperatuur van een fosfolipidenmembraan wordt onder andere gereguleerd door de lengte van de vetzuurstaarten en het aantal dubbele bindingen in de vetzuurstaarten. Legt u uit op moleculair niveau hoe dit functioneert. (5P)
b.
Cholesterol heeft bij dieren een sleutelrol in het reguleren van de membraanfluïditeit. Legt u uit waar cholesterol precies voor zorgt en hoe dat op moleculaire schaal tot uiting komt. (5P)
c.
Het kalium (K+) ionkanaaleiwit en het natrium (Na+) ionkanaaleiwit hebben een soortgelijke structuur en zitten op dezelfde manier, met dezelfde oriëntatie, in het celmembraan. Echter, het Na+ kanaal laat natrium ionen de cel in gaan en het K+ kanaal laat kalium ionen de cel uit gaan. Verklaart u dit. (4P)
d.
De biosynthese van ATP (adenosine trifosfaat) gebeurt met behulp van het eiwit ATP synthetase. Leg uit hoe dit enzym ATP synthetiseert. Legt u daarbij onder andere kort uit: - wat voor type eiwit is ATP synthetase (in welk compartiment bevindt het zich in de cel en waar is het in dit compartiment gelokaliseerd) - het reactiemechanisme van de ATP synthese (geef de reactievergelijking en beschrijf hoe deze reactie in het enzym afloopt) - wat de drijvende kracht achter de ATP synthese is. (6P)
4 We beginnen met DNA (~15 minuten; 15 punten) a.
Teken een RNA basepaar naar keuze. U kunt volstaan met alleen de basen, maar geeft u wel het waterstofbruggenpatroon tussen de basen. (5P)
De accuraatheid van de PCR amplificatie kan gecontroleerd worden door het veranderen van de temperatuur waarbij u de primers aan het DNA laat hybridiseren. b.
Hoe beïnvloedt de verandering van deze hybridisatietemperatuur de DNA amplificatie? (2P)
c.
Veronderstel dat u een humaan gen heeft gevonden en nu wilt kijken of dit gen ook voorkomt in gistcellen. In hoeverre kunt u dan gebruik maken van bovenstaand (4b) fenomeen om hierover uitsluitsel te krijgen? Legt u uw antwoord uit. (2P)
d.
U heeft buisjes met een reagensoplossing met daarin de DNA polymerase, Mg2+, dATP, dGTP, dCTP en TTP. Hieraan voegt u onderstaande DNA moleculen toe. Welke van deze leidt(en) tot DNA synthese: (2P) i enkelstrengs lineair DNA van 1000 nucleotiden lang en een vrij 3’-OH uiteinde ii enkelstrengs lineair DNA van 1000 nucleotiden lang in het midden gehybridiseerd met een enkelstrengs lineair RNA van 100 nucleotiden lang en een vrij 3’-OH uiteinde iii enkelstrengs circulair DNA van 1000 nucleotiden lang iv enkelstrengs circulair DNA van 1000 nucleotiden lang gehybridiseerd met een enkelstrengs lineair DNA van 500 nucleotiden lang en een vrij 3’-OH uiteinde
e.
U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties amplificeren met behulp van PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welk paar u hiervoor nodig heeft. (4P) 5’-TTGGACACCTTCG------------------------GTATGCCCTAACT-3’ 3’-AACCTGTGGAAGC------------------------CATACGGGATTGA-5’
1) 2) 3) 4)
5’-AACCTGTGGAAGC-3’ 5’-GCTTCCACAGGTT-3’ 5’-CGAAGGTGTCCAA-3’ 5’-TTGGACACCTTCG-3’
5) 6) 7) 8)
5’-AGTTAGGGCATAC-3’ 5’-GTATGCCCTAACT-3’ 5’-CATACGGGATTGA-3’ 5’-TCAATCCCGTATG-3’
5 Via RNA (~20 minuten; 15 punten) a.
De complete structuur van de RNA polymerase en de DNA polymerase zijn erg verschillend, echter hun actieve sites vertonen veel overeenkomsten. Zijn deze twee enzymen dus convergent of divergent geëvolueerd? (2P)
b.
De RNA polymerase maakt gebruik van de sigma () factor om de transcriptie te initiëren. De sigma factor herkent een specifieke sequentie op het DNA. Hoe het deze sequentie? (2P)
c.
Wat is het verschil tussen mRNA, rRNA en tRNA. Met andere woorden, waarvoor zijn deze RNAs nodig en hoe verschillen ze in structuur. (6P)
d.
Suggereer een scheidingstechniek om mRNA te scheiden van de andere typen RNA die voorkomen in een eukaryotische cel. Legt u in uw antwoord deze scheidingstechniek kort uit. (3P)
e.
mRNA splicing leidt tot een meer divers proteoom. Legt u dit uit. (2P)
6 Naar het eiwit (~20 minuten;15 punten)
a.
Welk(e) eiwitpolymeer(en) worden gecodeerd door de mRNA sequentie poly(C)? En welk(e) eiwitpolymeer(en) door de mRNA sequentie poly(GAG)? Let op, reading frame niet bekend! (4P)
b.
Sommige aminozuren worden gecodeerd door slechts 1 triplet codon. Andere aminozuren door meerdere triplet codons. Waarom is dat uw inziens? (3P)
c.
De twee basismechanismen voor de elongatie van biomoleculen zijn weergegeven in bovenstaande figuur. In type 1 wordt de activerende groep (X) verwijderd van de groeiende keten. In type 2 wordt de activerende groep verwijderd van de inkomende nieuwe eenheid. Welk mechanisme (1 of 2) vind in de cel plaats bij: (3P) i DNA synthese ii RNA synthese iii Eiwit synthese
d.
Wat wordt, in de context van eiwitsynthese, bedoeld met een geactiveerd aminozuur? (2P)
e.
Bij het beladen van de verschillende t-RNAs door de respectievelijke amino acyl-tRNA synthetasen is er een proof reading mechanisme, zowel tijdens de belading van het tRNA in the active site als zowel direct daarna in de editing site. Welk ander enzym kent u dat van een soortgelijk proof reading mechanisme gebruik maakt. (3P)
