TENTAMEN BIOCHEMIE (8RA00) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld 28-06-2013 09:00 – 12:00 (totaal 100 punten) 6 opgaven in totaal! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! 1 Peptiden en eiwitten (~15 minuten; 15 punten) Het eerste jaar van uw studie zit erop. U gaat een weekje op vakantie en ziet bij binnenkomst in uw vakantieplaats de naam van de stad aangekondigd met onderstaande peptidesequentie. U ziet daarbij natuurlijk meteen dat deze sequentie een aminozuur bevat welke normaal gesproken niet in eiwitten voorkomt. Dit aminozuur is ornithine, een intermediair in de biosynthese van arginine, en wordt aangeduid met de 1-lettercode O.
a.
Geef de 1-lettercode van de corresponderende volgorde. (4P) LLORETDEMAR (iedere fout -1P) b.
aminozuren
in
het
peptide
in
de
Bovenstaande aminozuursequentie is afgebeeld in niet-geïoniseerde vorm. Wat is echter de netto lading van dit peptide bij een fysiologische pH 7? (2P)
0 Eenmaal terug in Nederland besluit u een extra stage te doen in het laboratorium voor chemische biologie om bovenstaand peptide beter te onderzoeken. Het blijkt dat deze aminozuursequentie graag in een -helix vouwt. c. Geef met een tekening aan hoe de waterstofbruggen in de hoofdketen van een peptide lopen / vormen als een -helix wordt gevormd. (3P)
Het blijkt dat bij hoge alcoholconcentraties bovenstaand peptide niet meer in een helix maar in een andere vorm vouwt. In deze nieuwe vorm komen meerdere van deze peptides bij elkaar en vormen samen een andere secundaire structuur, welke toxisch is voor de hersenen. d. Wat voor secundaire structuur wordt er dan gevormd? (2P) Beta-sheet De peptidesequentie zelf blijkt onderdeel te zijn van prion eiwitten. U wilt de aanwezigheid van dit eiwit bij uzelf onderzoeken en neemt daarvoor een hersenbiopt (een klein sample van uw hersenen; u kan wel wat missen). e. Beschrijf hoe u vervolgens gaat aantonen dat u dit eiwit wel of niet heeft. M.a.w. beschrijf een techniek om de aanwezigheid van dit eiwit aan te tonen. (4P) Hier zijn meerdere antwoorden goed (mits correct uitgelegd en geïnterpreteerd). Meest voor de handliggend: Eerst middels SDS-PAGE de eiwitten scheiden op basis van grootte. Eiwitten worden gedenatureerd met behulp van SDS (waarbij er gemiddeld 1 SDS molecuul aan 2 aminozuren in het eiwit bindt). Hiermee krijgt het eiwit een overall negatieve lading. De eiwitten worden opgebracht op een (polyacrylamide) gel en dmv gel electrophorese door de gel heen getrokken. Ieder eiwit ondervindt gemiddeld dezelfde kracht omdat de lading correleert met de grootte van het eiwit, maar omdat de gel vernet is lopen de kleinere eiwitten er sneller doorheen. Na het scheiden van de eiwitten op grootte dmv SDS-PAGE moet u specifiek uw eiwit visualiseren. Hiervoor heeft u een antilichaam nodig dat specifiek aan uw eiwit bindt en tevens een moleculaire marker bevat welke gevisualiseerd kan worden. Het antilichaam kan bijvoorbeeld gemerkt / gelabeld zijn met een fluorescente groep of radioactiviteit, of middels een sandwich assay met een gelabeld antilichaam gedetecteerd worden. Overbrengen van uw eiwitbanden uit de gel op vloeipapier en vervolgens incuberen met het antilichaam laadt specifiek de aanwezigheid (of niet) van het eiwit zien.
2 Knippen met eiwitten (~25 minuten; 20 punten) Proteasen zijn enzymen die specifieke substraateiwitten knippen door middel van het hydrolyseren van peptidebindingen. Cysteine proteasen hebben een cysteine en een histidine in de actieve site. a.
Maak met behulp van een aantal tekeningen duidelijk hoe het mechanisme van peptide-binding hydrolyse door een cysteine protease verloopt. (10P) Ongeveer zoals onderstaand, of zoals figuur 9.8 uit het boek, maar dan zonder aspartaat en met cysteine ipv serine. Belangrijk is de tweestapsreactie en de activatie van de thiol groep met de histidine.
b.
Serine proteasen hebben hebben additioneel naast de serine (i.p.v. de cysteine) en de histidine nog een aspartaat in de actieve site (een katalytische triade). Legt u uit waarom cysteine proteasen deze aspartaat echter niet nodig hebben. (4P) De thiol-groep van cysteine is nucleofieler dan de hydroxy-groep van serine. In geval van serine is de aspartaat noodzakelijk om voor voldoende nucleofiliciteit van de serine te zorgen. De thiol heeft zo’n sterke polarisatie niet nodig.
U voert een enzymatische reactie uit bij verschillende substraatconcentraties in aanwezigheid van een vaste concentratie non-competitieve inhibitor en meet daarbij de initiële snelheid van substraatomzetting (zie tabel). Substraatconcentratie [S] (mM) 0.5 1 2 4 8 c.
Initiële snelheid (V0) (M/minuut) 0.65 1 1.4 1.8 2
Bereken/bepaal KM en Vmax voor dit enzym in aanwezigheid van de inhibitor. (4P) 2.0 1.8
1/V0 (min./M)
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6
Zonder Inhibitor
0.4 0.2 0.0 -1.0
-0.5
0.0 -0.2
0.5 1/[S] (mM 1.0 -1)
1.5
2.0
2.5
Km = 1.33 mM Vmax = 2.4 M/min d.
U voert bovenstaand experiment nogmaals uit, maar dan zonder inhibitor. Teken hoe het verloop van de lijn in de dubbel-reciproce plot verandert t.o.v. het experiment met de non-competitieve inhibitor? (2P) Zonder non-competitieve inhibitor is de Vmax hoger (en de y-as afsnede dus lager) en verandert de Km niet.
3 Eiwitten in het membraan (~20 minuten; 15 punten) Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit eiwitten en specifieke lipiden, voornamelijk fosfolipiden, glycolipiden en cholesterol. a.
Laterale diffusie van lipiden in het membraan is snel vergeleken met transverse diffusie van diezelfde lipiden. Legt u uit waarom dit zo is. (5P) Bij laterale diffusie bewegen de lipiden horizontaal door het membraan. De hydrofobe componenten van de lipiden blijven daarbij in contact met elkaar en de polaire elementen met de andere polaire elementen en water. Bij transverse diffusie moeten de polaire groep(en) door het hydrofobe gedeelte heen, wat een hoge activeringsenergie heeft. Tevens moet voor dit proces het water dat coördineert aan de polaire kopgroep worden ‘losgemaakt’ / gedesolvateerd, wat entropisch ongunstig is. Dit heeft een hoge activeringsenergie / energiebarrière en dientengevolge is transverse diffusie veel langzamer / heeft het een veel lagere/kleine “reactiesnelheidsconstante”. (N.B. het kost dus effectief geen energie). b.
Beschrijf schematisch hoe een perifeer membraaneiwit aan/in het membraan verankerd kan zitten. Illustreert u dit met een schematische tekening van het membraan en het eiwit en gaat u in uw antwoord vooral in op de secundaire interacties die voor de membraanbinding van het eiwit verantwoordelijk zijn. (N.B. Er zijn meerdere membraanverankeringen mogelijk. Selecteert u er 1 en leg deze correct uit.) (5P) Bijvoorbeeld een van de eiwitten uit onderstaand plaatje bij c, d, e, of f. Daarbij moet dan duidelijk beschreven worden met behulp van welk type secundaire interacties en welke eiwit elementen (bijv. positief geladen eiwit met negatief geladen membraankopgroepen, of hydrofoob lipide etc.) de interactie tot stand komt.
c.
Bepaalde membraaneiwitten zorgen voor het transport van toxische stoffen uit de cel, zoals Multidrug-Resistance Proteins. Deze eiwitten bevatten zogenaamde ABC domeinen (ATP Binding Cassette). Maak met behulp van een aantal schematische tekeningen duidelijk hoe zo’n Multidrug-Resistance Protein werkt. (5P) Ongeveer zoals onderstaand.
a.
4 We beginnen met DNA (~25 minuten; 20 punten) Teken de volledige moleculaire structuur van het nucleotide 3’-dAMP. (5P)
b.
Alhoewel het G-C basenpaar en het A-T basenpaar moleculair van elkaar verschillen, heeft dit geen invloed op de vorming van de B-DNA helix. Legt u uit waarom niet. (3P) Belangrijk is de afstand tussen de twee suiker-fosfaat ketens van de DNA dubbelhelix. Door altijd een combinatie van een purine en een pyrimidine te hebben als basepaar is die afstand altijd gelijk en maakt het dus niet uit dat de basen een ander waterstofburgpatroon hebben. c.
Bij de replicatie van DNA worden verschillende enzymen gebruikt. Wat is de rol / wat doet het DNA ligase? Maak in uw antwoord duidelijk wanneer en bij welk proces precies het DNA ligase een rol speelt. (4P) De DNA ligase ligeert/plakt twee Okazaki fragmenten aan elkaar waarbij de intacte suikerfosfaat backbone wordt gevormd nadat de RNA primer is verwijderd en het ontstane “gat” is opgevuld met DNA nucleotiden door de DNA polymerase. d. Topoisomerasen spannen en ontspannen de DNA dubbel helix m.b.t. supercoiling. ATP hydrolyse levert de chemische energie voor Topoisomerase II om te functioneren. Welke chemische energie zorgt voor de werking van Topoisomerase I? (3P) De spanning (overspanning) in de DNA dubbelhelix. De verlaging van deze in de gespannen DNA dubbelhelix opgeslagen energie maakt de chemische reacties (breken van een van de ketens en weer aan elkaar plakken na draaiing/ontspanning) mogelijk. e. De Polymerase Chain Reaction (PCR) is een reactieprotocol wat cyclisch doorgevoerd wordt bij een aantal verschillende temperaturen. Beschrijf elke temperatuurstap, geef aan wat er bij iedere temperatuur gebeurt, waarom hiervoor deze specifieke temperatuur nodig is en in welke volgorde de verschillende temperatuurstappen worden doorlopen. (5P) Verwarm tot 95 graden om alle dubbelstrengs DNA te smelten (de twee strengen van elkaar af te halen). Dit gebeurt bij hoge temperatuur zodat alles uit elkaar gaat. Bij 55 graden wordt geequilibreert om de korte primers te laten binden aan het templaat DNA. Deze temperatuur ligt dus onder het smeltpunt van de primers met het templaat. Bij de optimale temperatuur voor de DNA polymerase, ca 72 graden, wordt de templaatreactie gestart, primers worden verlengd. Proces wordt vervolgens herhaald volgens 95 55 72 95.
5 Via RNA (~20 minuten; 15 punten) Eukaryotisch mRNA wordt direct na de synthese chemisch gemodificeerd. Welke modificaties worden er aan het 5’- en aan het 3’-uiteinde van het mRNA uiteindelijk ingevoerd? Beschrijf uw antwoord zo specifiek mogelijk. (4P) -5’-cap. Er wordt een methylguanylaat toegevoegd alsmede methyleringen van 2’OH posities. -3’-poly A staart. Een lange keten van adenylaten wordt toegevoegd door een poly(A) polymerase. a.
b. Wat voor functies heeft de 5’-modificatie? Noem er twee. (4P) Verhoogt de stabiliteit van het mRNA. Dient als herkenningspunt/startpunt voor het binden van het ribosoom aan mRNA. c.
mRNA ondergaat verder nog zogenaamde splicing. Wat is het evolutionaire voordeel van exonen en intronen? (4P)
Bijv. -Uit een gen kunnen onder verschillende cellulaire omstandigheden andere eiwitten voortkomen. -Bij het ontstaan van nieuwe genen kan door plakken en knippen met grote functionele gedeelten (exonen) van bestaande genen heel snel nieuwe functie / nieuwe eiwitten gegenereerd worden. Hier zou ‘bottom up’ evolutie veel langer duren. d.
U wilt RNA, maar niet DNA, radioactief labelen in groeiende en zich delende bacteriën. Welk radioactief molecuul doet u bij het groeimedium? (3P) Bijv. radioactief (bijvoorbeeld tritium gelabeld) uridine.
6 Naar het eiwit (~20 minuten;15 punten) Van een stukje van een dubbelstrengs prokaryotisch DNA is de volgende sequentie bekend voor de templaat streng: Templaat: 5’-GACTTATCTACAGGGCAT-3’ Coderend: 5’-ATGCCCTGTAGATAAGTC-3’ mRNA: 5’-AUGCCCUGUAGAUAAGUC-3’ a.
Geef de sequentie van de coderende strand (coderende streng) van het DNA en de sequentie van het mRNA als dit dubbelstrengs DNA met een RNA polymerase wordt uitgelezen. Geeft u hierbij ook de uiteindposities aan (3’ / 5’). (4P) Zie boven
b.
Het zo ontstane mRNA codeert voor een peptideketen en wordt vervolgens uitgelezen met behulp van het ribosoom (U mag er dus vanuit gaan dat de eerste 3 basen een compleet codon vormen). Welke aminozuur sequentie volgt dan uit dit dubbelstrengs DNA? Geef hierbij de -NH2 en -COOH uiteinden van de aminozuursequentie aan. (4P) H2N-MetProCysArg-COOH c.
tRNA moleculen hebben zowel unieke structurele en moleculaire kenmerken, alsook overeenkomstige kenmerken. Verklaart u deze paradox. Met andere woorden, welke elementen van het tRNA zijn geconserveerd en waarom en welke juist niet? (4P) Unieke kenmerken zijn nodig zodat de aminoacyl-tRNA synthetases een onderscheid kunnen maken tussen de verschillende tRNAs en het juiste aminozuur op het juiste tRNA kunnen zetten. Overeenkomstige kenmerken zijn nodig omdat alle tRNAs een interactie aan moeten gaan met dezelfde eiwit-synthese fabriek (ribosoom), en deze daarvoor overeenkomstige elementen moet herkennen en de tRNA’s allen de afstand tussen het mRNA en de eiwitsynthesepositie moeten overbruggen. d.
De Elongatie Factor Tu (EF-Tu, of EF1 voor eukaryoten) bindt aan de aminoacyl-tRNA (tRNA beladen met een aminozuur) en escorteert deze naar het ribosoom. Wat zijn de twee belangrijkste functies van EF-Tu in dit proces. (3P) EF-Tu bindt aan beladen tRNA en voorkomt daarmee een vroegtijdige hydrolyse van de amino acyl binding De combinatie van de EF-Tu met de beladen tRNA maakt een correcte herkenning door het ribosoom mogelijk en alleen indien daaraan voldaan is laat de EF-TU het tRNA los onder hydrolyse van GTP.
