A diabetes mellitus egy lehetséges őssejtterápiája Doktori értekezés
Urbán S. Veronika Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Dr. Prof. Habil. Uher Ferenc Ph.D.
Hivatalos bírálók:
Dr. Tóth Sára egyetemi docens, Ph.D. Dr. Bodó Imre osztályvezető főorvos, Ph.D.
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Prof. Falus András egyetemi tanár, MTA rendes tagja Dr. Darvas Zsuzsanna egyetemi docens, Ph.D. Dr. Apáti Ágota Ph.D.
Szigorlati bizottság tagjai:
Budapest 2009
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke
4
1.Bevezetés (irodalmi háttér)
6
1.1. A diabetes mellitus
7
Elterjedés, típusok
7
Történeti áttekintés, a kezelés fejlődése
8
Szövődmények
9
1.2. Kuratív terápiás lehetőségek diabetes mellitusban
10
Hasnyálmirigy vagy sziget-transzplantáció
10
A diabetes mellitus őssejtterápiájának lehetőségei
12
β-sejtek embrionális őssejtekből?
12
β-sejtek felnőtt szövetek sejtjeiből, prekurzorokból, szöveti őssejtekből?
17
1.3. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) különleges tulajdonságai
26
Az MSC-k könnyen izolálhatóak
26
A plasztikus MSC tenyészetek sokáig fenntarthatóak
27
Az MSC-k a szervezetben mindenhol jelen vannak
27
Az MSC-k mobilitása és regeneratív képességei
28
Az MSC-k és az immunrendszer kapcsolata
29
2. Célkitűzések
33
3. Módszerek
35 35
3.1. A diabetes kísérletes előidézése A diabetes állatmodellje
35
A vércukorszint, szérum inzulinszint és a testsúly követése
35
Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt
36
3.2. A csontvelői magvas sejtek szeparálása
36
3.3. A cukorbeteg egerek transzplantációja csontvelői magvas sejtekkel 36 3.4. A mesenchymális őssejtek izolálása, tenyésztése
1
37
3.5. A mesenchymális őssejtek jellemzése
38
Áramlási cytométerrel végzett marker-vizsgálatok
38
Csont irányú differenciáltatás
38
Zsírsejt irányú differenciáltatás
39
3.6. A mesenchymális őssejtek transzplantációra történő felhasználása
39
3.7. Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata
39
Az APC-k kinyerése
40
A T-lymphocyták izolálása
40
A sejtosztódás mérése
41
Gyógyszeres immunszuppresszió alkalmazása
41
3.8. Mikroszkópos vizsgálatok
41
Szövettan és immunhisztokémia
41
Kombinált immunhisztokémia és Y kromoszóma in situ hibridizáció
42
A csontvelői chimerizmus követése
43
3.9. Statisztikai analízis
43
4. Eredmények
44
4.1. Az 1-es típusú cukorbetegség állatmodelljének kialakítása
44
4.2. A csontvelő-transzplantáció hatása a diabetes progressziójára és a beteg állatok túlélésére
47
4.3. Egér mesenchymális őssejtek (MSC-k) karakterizálása és differenciáltatása
52
4.4. A mesenchymális őssejtek és a csontvelői vérképző sejtek sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában
55
4.5. A kotranszplantációt követő gyógyulás mechanizmusának vizsgálata
63
A gyógyulás nem a donor BMC-k, vagy MSC-k inzulin-termelő β-sejtté való transzdifferenciálódásának köszönhető
63
Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ
66
5. Megbeszélés
71
6. Következtetések
81
2
7. Összefoglalás
84
Összefoglalás
84
Abstract
85
8. Irodalomjegyzék
86
9. Publikációk jegyzéke
98
10. Köszönetnyilvánítás
101
3
Rövidítések jegyzéke
Rövidítés
angol
magyar
APC
-
antigen presenting cell
-
antigén bemutató sejt
BMC vagy
-
bone marrow cell
-
csontvelői magvas sejt
-
colony-forming unit
-
fibroblast kolónia képző
BM sejt CFU-F
fibroblast CsA
-
cyclosporine A
-
cyclosporin A
DAB
-
diaminobenzidine
-
diaminobenzidin
DC
-
dendritic cell
-
dendritikus sejt
DMEM
-
Dulbecco’s modified Eagle’s
-
Dulbecco által módosított
medium
Eagle-féle tápoldat
EDTA
-
ethylendiaminetetraacetate
-
etilén-diamin-tetra-acetát
ELISA
-
enzyme-linked
-
enzimhez kapcsolt
immunosorbent assay ESC vagy
immunszorbens vizsgálat
-
embryonic stem cell
-
embrionális őssejt
FCS
-
fetal calf serum
-
foetális borjú szérum
FISH
-
fluorescent in situ
-
fluorescens in situ
ES sejt
hibridisation
hibridizáció
FITC
-
fluorescein isothiocyanate
-
fluorescein isothiocyanát
GFP
-
green fluorescent protein
-
zöld fluoreszcens fehérje
GLP-1
-
glucagon-like peptide-1
-
glukagonszerű peptid-1
GVHD
-
graft versus host disease
-
graft versus host betegség
HBSS
-
Hank's Buffered Salt
-
Hank-féle pufferált sóoldat
Solution HE
-
haematoxylin-eosin
-
haematoxylin-eosin
HGF
-
hepatocyte growth factor
-
hepatocyta növekedési faktor
HSC
-
haematopoetic stem cell
-
haematopoetikus őssejt
4
IBMX
-
isobutyl-methylxanthine
-
Izobutil-metilxantin
ICM
-
inner cell mass
-
belső sejttömeg
ip
-
intraperitoneal
-
intraperitoneális (hasüregbe adott)
MAPC
-
multipotent adult progenitor
-
progenitor/előd sejt
cell MSC
-
multipotens felnőttkori
mesenchymal stromal/stem
-
mesenchymális stróma/őssejt
cell NK-sejt
-
natural killer sejt
-
természetes ölő sejt
NOD
-
non-obese diabetic
-
nem-kövér cukorbeteg (egér törzs elnevezése)
OVA
-
ovalbumin
-
ovalbumin
Pax4
-
paired box 4
-
paired box 4 (gén)
PBS
-
phosphate-buffered saline
-
foszfáttal pufferált sóoldat
Pdx-1
-
pancreatic and duodenal
-
pancreaticus és duodenális
homeobox 1 PECAM-1
-
homeobox 1 (gén) -
platelet endothelial cell adhesion molecule
SCF
-
vérlemezke-endothel sejt adhéziós molekula
stem cell factor / steel factor
-
/ c-kit ligand
őssejt faktor / steel faktor / c-kit ligand
SP-sejtek
-
side population cells
-
„side population” sejtek
SSC
-
standard saline citrate
-
citrát pufferált sóoldat
STZ
-
streptozotocin
-
streptozotocin
TBI
-
total body irradiation
-
egész test besugárzás
TBS
-
Tris-buffered saline
-
Tris-pufferált sóoldat
Treg
-
regulator T-cell
-
reguláló T-sejt
TZD
-
thiazolidinedion
-
thiazolidinedion
WHO
-
World Health Organisation
-
Egészségügyi Világszervezet
5
1.Bevezetés (Irodalmi háttér) A cukorbetegség (diabetes mellitus) az iparosodott országok lakosait sújtjó vezető kórokok és halálokok egyike. Kialakulásáért az inzulin abszolút vagy relatív hiánya okolható, melyben a működőképes β-sejtek csökkent mennyisége és/vagy a szövetek inzulinrezisztenciája a fő tényező. Igaz ugyan, hogy a diabetes napjainkra már egyike a legjobban kezelhető anyagcsere-betegségeknek, de még a legkörültekintőbb ápolás mellett is előfordulhatnak hirtelen fellépő életveszélyes állapotok, és gyakorlatilag elkerülhetetlenek a hosszú távú szövődmények. Tényleges kuratív terápiát csak az elpusztult β-sejtek tartós pótlása jelenthetne. Mára már jelentős számú Langerhans-sziget transzplantációt hajtottak végre az egyes típusú cukorbetegség kezelésére. Ez az ígéretes lehetőség azonban semmiképpen sem jelenthet a diabetesben szenvedő betegek milliói számára megoldást. Ezért fordult a figyelem olyan új lehetőségek irányába, mint az őssejtterápia. Embrionális vagy szöveti őssejtekből igyekeznek világszerte transzplantálható szigetsejteket előállítani. Még elegánsabb megoldás lenne a Langerhans-szigetek endogén regenerációjának serkentése, akár a szervezet saját őssejtjeinek vagy progenitorainak, akár kívülről bevitt őssejteknek a segítségével. Néhány szerző megfigyelte, hogy a csontvelő-transzplantáció - legalábbis átmenetileg - gyógyíthatja a diabetest. A csontvelőből kinyerhető egyik őssejttípus, a mesenchymális őssejtek (mesenchymal stromal/stem cell = MSC) hatásának vizsgálata különösen érdekesnek ígérkezik, már csak újabban előtérbe került immunszuppresszív tulajdonságaik miatt is. Akár hozzájárulnak ezek a sejtek a szervezet regenerációs folyamataihoz, akár nem, figyelemreméltóak egy olyan autoimmun eredetű sejtpusztulás terápiás lehetőségeinek kutatása során, mint amilyen az egyes típusú diabetes is.
6
1.1. A diabetes mellitus Elterjedés, típusok A cukorbetegséget civilizációs betegségnek tartják, mely főleg a jóléti társadalmakat sújtja. Terjedésének üteme járványszerű. Az 1990-es évek közepén a világon a cukorbetegek száma már megközelítette a százmilliót. Jelenleg legalább kétszázmillió ember szenved cukorbetegségben, és a WHO (World Health Organisation) előrevetítései szerint, még ennek a számnak is a megkettőződését várják 2025-re. Magyarország lakosságának 5%-a cukorbeteg és ebből legalább kétszázezren szorulnak inzulinkezelésre. A cukorbetegségnek számos oka lehet, de két alapvető típusát különböztetjük meg. Az 1-es típusú (vagy inzulin-dependens) diabetes mellitust – amitől a cukorbetegek körülbelül 10 %-a szenved - a hasnyálmirigy Langerhansszigeteiben található inzulintermelő β-sejtek pusztulása okozza. Súlyos T-sejt közvetített autoimmun betegség. Progressziója során a beteg immunrendszere megtámadja és elpusztítja a β-sejteket (Homo-Delarche és Drexhage 2004, Narendran és mtsai 2005). A beteg saját inzulintermelése gyorsan, teljesen és végérvényesen leáll, így az érintettek túlélése csak külső inzulin napi többszöri bevitelével biztosítható. Az 1-es típusú diabetes jellemzően a kamaszkor elején alakul ki, bár ritkán más életkorban is felléphet. A 2-es típusú (vagy nem inzulin-dependens) diabetes mellitus kialakulása gyakran, de nem minden esetben, összefügg az elhízással és egyre nagyobb számban érinti a fiatalokat is. Az éveken át elhúzódó, lassan progrediáló inzulinrezisztencia és az elégtelen inzulin-szekréció együttes fennállásának következtében létrejövő, bonyolult anyagcsere betegség, mely többnyire összefüggésbe hozható az ún. metabolikus szindrómával (Kim és Reaven 2004) és a szervezetben lejátszódó gyulladásos folyamatokkal (Hotamisligil 2006). A metabolikus szindrómát az elhízás, a magas vérnyomás, a magas vércukorszint és a diszlipidémia együttes fennállása jellemzi. Újabb elméletek szerint az sem kizárható, hogy mitokondriális diszfunkciók állnak az inzulin-szekréció és jelátvitel meghibásodásának hátterében legalábbis a betegek egy részénél (Lowell és Shulman 2005). Esetenként a hasnyálmirigy exocrin degenerációja
7
(is) okolható a szigetsejtek pusztulásáért (Larsen 1993). A 2-es típusú diabetesre inkább jellemző a családi halmozódás, mint az 1-es típusúra. Magyarországon a 60 év felettiek 15 %-a 2-es típusú cukorbeteg. Az időskori diabetes kezelése kezdeti stádiumban főként diétával és orális vércukorszintcsökkentő szerekkel (antidiabetikumokkal), később kiegészítő inzulin terápiával történik. Becslések szerint a 2-es típusú cukorbetegség kialakulása során a β-sejtek száma általában mintegy 50%-al csökken (Donath és Halban 2005). Az így előálló inzulintermelési elégtelenség kezelésére tehát, legalábbis részben ugyanúgy megfelelő mód lenne a hiányzó sejtek visszapótlása, mint az 1-es típusú diabetes esetében Történeti áttekintés, a kezelés fejlődése Noha a cukorbetegség terjedése csak napjainkra öltött járványszerű méreteket már a Kr. e. 1500-ból származó egyiptomi Ebers-papiruszban említik, de ismert volt az ősi kínai és indiai orvosok előtt is. A Kr. e. 200 körül élt Demetriosz görög orvos adta a betegségnek a "diabetes" nevet a diabainein görög szóból kiindulva, mely „túláradást”, vagyis fokozott vizeletürítést jelent. A "mellitus" jelző 1674-ben került az elnevezésbe Thomas Willis angol orvos jóvoltából, aki a cukorbetegek vizeletét megízlelve, édesnek találta azt. Paul Langerhans - akkor még orvostanhallgató - 1869ben írta le a hasnyálmirigy exocrin állományában szigetszerűen elhelyezkedő, ismeretlen rendeltetésű sejtcsoportokat. A leírójukról elnevezett Langerhans-szigetek βsejtjeiből elsőként 1921-ben Frederick G. Banting és Charles B. Best vonták ki az inzulint, melynek segítségével sikerrel kezeltek egy 13 éves, diabeteses comában fekvő fiút. Munkájukért 1923-ban Nobel-díjat kaptak (King és Rubin G. 2003, Winkler 2002). Az 1920-as évekig a cukorbetegséget csak különböző diétákkal tudták kezelni, illetve ha a szervezet saját inzulintermelése teljesen leállt, akkor a betegség minden esetben halálossá vált. Banting és Best eredményeit követően, közel 30 éven át használtak állati eredetű (sertés, szarvasmarha) inzulint a betegség kezelésére. Az inzulin az első peptid hormon melynek szerkezetét 1953-ban Frederick Sanger leírta és ugyancsak az első engedélyezett rekombináns módon előállított gyógyszer. Az Escherichia coli baktériumba bevitt emberi inzulin gén segítségével előállított "humán" inzulin 1987-ben került a gyógyszerpiacra. 1991
8
óta élesztőbe (Saccharomyces cerevisae) bejuttatott DNS segítségével is gyártanak inzulint (Raskin és Clements 1991). Napjainkra a géntechnológiával előállított készítmények teljesen kiszorították a gyakran immunológiai komplikációkat okozó állati inzulinokat. Magyarországon 1996-ban fejeződött be a cukorbetegek átállítása humán inzulinokra, és azóta is sokat fejlődött a kezelés. Létrehoztak olyan inzulin analógokat, melyek néhány aminosavban eltérnek az eredeti szekvenciától és így megváltozik a felszívódásuk sebessége vagy hatásuk időtartama. A gyors, közepes illetve az elhúzódó hatású inzulin analógok megjelenése még rugalmasabbá tette a kezelést (Tamás 2002). A sürgősségi állapotokat kivéve az inzulint általában bőr alá (subcutan) fecskendezik. A beadás segédeszközeinek fejlődése egyre fájdalmatlanabb befecskendezést, egyre pontosabb adagolást és mind nagyobb szabadságot biztosítanak a betegek számára, bár a tűszúrás kiváltására (inzulinpumpa, inhalációs inzulin) még nincsen széles körben lehetőség. Szövődmények A diabetes akut és krónikus szövődményekkel járhat. Inzulin-kezelés esetén ezeknek az a legfőbb oka, hogy a lökésszerűen bevitt inzulin nem képes a sejtek anyagcseréjének olyan finom szabályozására, mint a β-sejtekből - mindig az aktuális glükóz terhelésnek megfelelően – felszabaduló, endogén inzulin. Az egészséges szervezet β-sejtjei ugyanis nagyon pontosan érzékelik és követik a mindenkori vércukorszintet és szekréciós granulumaikban felhalmozott, kristályos inzulinból éppen annyit juttatnak a keringésbe, amennyit a homeosztázis fenntartása optimálisan igényel (Lowell és Shulman 2005). A hirtelen fellépő szövődmények közül a hyperglycaemiás coma többnyire a még kezeletlen 1-es típusú cukorbetegeknél kialakuló súlyos, életveszélyes állapot. A hypoglycaemiás coma jellemzően az inzulin relatív túladagolása miatt alakul ki, aminek következtében a vércukorszint túlzottan leesik. Az idült szövődmények között szerepelnek a microangiopathia, a macroangiopathia és a neuropathia (Halmos és Jermendy 2002). A microangiopathiás szövődmények jellegzetes diabetes-specifikus eltérések és a kiserek (pl. vese, retina, agyi kiserek) károsodását jelentik, ami veselégtelenséghez, vaksághoz, agyi infarktushoz vezethet. A
9
macroangiopathiás szövődmények lényegében atherosclerosist jelentenek, melynek patomorfológiai értelemben véve nem megkülönböztethetőek az egészséges szénhidrát anyagcseréjű egyének atherosclerosisától, és hasonlóan a nagy artériák (pl. szívkoszorúér, végtagok erei) károsodása, mely a szövetek vérellátási zavarát okozva szívinfarktust, alsó végtagi fekélyeket okozhat. A neuropathia egyrészt az érző és mozgató gerincvelői idegek bántalma miatt, főleg a lábszárakon kialakuló érzészavarokban (csökkent hő és fájdalomérzés, bizsergés, égő fájdalomérzet), reflex kiesésekben és izomgyengeségben mutatkozik meg. Másrészt a vegetatív idegek érintettsége miatt szívritmus problémák, nyelőcső és gyomor mozgászavarok, vizelet és székletürítési gondok, férfiaknál merevedési zavarok alakulhatnak ki. Az ér és idegkárosodások együtt vezetnek a hosszabb ideje cukorbetegek jellegzetes szövődményéhez, a lábujjak, a láb és lábszár fekélyeihez. Ezekhez az elváltozásokhoz gyakran társulnak gombás és bakteriális fertőzések, melyek súlyos szeptikus állapothoz, majd halálhoz vezethetnek. 1.2. Kuratív terápiás lehetőségek diabetes mellitusban Az utóbbi évtizedekben az élethosszig tartó kezelés eszközei és gyógyszerei sokat fejlődtek ugyan, de a cukorbetegség életminőségre gyakorolt negatív hatásai és a fenyegető hosszú távú szövődmények miatt, mégis indokoltak azok az erőfeszítések, amelyek új – lehetőleg végleges gyógyulást jelentő – kezelés(ek) kidolgozására irányulnak. Hasnyálmirigy- vagy sziget-transzplantáció Még mielőtt Banting és Best 1921-ben felfedezte volna az inzulint, már ismert tény volt, hogy a hasnyálmirigyből kivonható egy anyag, mely képes enyhíteni a diabetest. Ebből kiindulva hajtották végre az első hasnyálmirigytranszplantációt.
Bristolban,
1894-ben
Watson
Williams
egy
bárány
hasnyálmirigyének darabját ültette egy ketoacidózisban szenvedő, 15 éves cukorbeteg fiú bőre alá. Akkoriban még nem sokat tudtak arról a kilökődési
10
reakcióról, ami hamarosan bekövetkezett és természetesen immunszuppressziót sem állt módjukban alkalmazni. Azóta a transzplantációs lehetőségek rengeteget fejlődtek és több változatuk kínálkozik (Merani és Shapiro 2006). Néhány cukorbeteg számára a végleges gyógyulást jelenti egy egészséges hasnyálmirigy átültetése. A lehetséges halott donorok száma azonban rendkívül korlátozott, a műtéti beavatkozás nehéz és kockázatos, ráadásul a transzplantált betegek egész további életükben erős immunszuppresszív kezelésre szorulnak. A teljes hasnyálmirigy transzplantációját ezért az amúgy is vese-transzplantációra szoruló betegeknél, azzal együtt szokták végrehajtani
(Lipshutz
és
Wilkinson
2007).
Csaknem
30
éve
folynak
próbálkozások csak az endocrin területek átültetésére (Liu és Herold 2000), az ezredfordulóig
azonban
megoldhatatlannak
látszó
technikai
nehézségek
akadályozták az előrelépést. Végül 2000-ben Shapiro és mtsai (Shapiro és mtsai 2000) egy forradalmian új eljárással álltak elő. Az általuk kidolgozott ún. „Edmonton protokoll”, amelynek során 3-4 halott humán donorból izolált hasnyálmirigy szigeteket juttatnak be intravénásan egy-egy betegbe, kiküszöböli ugyan a technikai nehézségeket, de nem változtat a donorhiányon és a kezelést követő folyamatos immunszuppresszió szükségességén (Nanji és Shapiro 2004 ). Az immunszuppresszió még akkor is jelentős kockázatokkal jár, ha sikerült glucocorticoid-mentesen megoldaniuk. Ráadásul, a követéses tanulmányok azt mutatják, hogy a szigetek a betegek többségénél néhány év elteltével már nem működnek tovább, illetve felszívódnak (Ryan és mtsai 2005). A donorhiány miatt újszülött malacból izolált szigetsejtekkel is folynak kísérletek, de az ilyen xenotranszplantáció humán terápiás eljárásokban történő alkalmazása még az előzőnél is több nehézséget rejt magában, főleg a kilökődési reakció miatt (Rayat és mtsai 1999). Összefoglalva elmondhatjuk tehát, hogy ezek a terápiás eljárások csak nagyon kevés beteg számára jelentenek valódi alternatívát.
11
A diabetes mellitus őssejtterápiájának lehetőségei A fentiekből következik, hogy sokan reménykedve figyelik az utóbbi években robbanásszerűen fejlődő őssejtbiológia eredményeit. Betegek, klinikusok és kutatók bíznak abban, hogy hamarosan képesek leszünk őssejtekből terápiás célra
alkalmas
mennyiségű,
inzulint
termelő,
és
azt
a
vér
glükóz
koncentrációjának függvényében a keringésbe juttató - azaz a mindenkori vércukorszintnek megfelelően, szabályozottan működő - β-sejtet előállítani (Jones és mtsai 2008). Mindezt lehetőleg olyan „saját” (autológ) őssejtekből, amelyek a betegekben nem váltanak ki immunválaszt és nem hoznak létre tumort, ugyanakkor akár évtizedekig élet- és működőképesek maradnak a szervezetben. A következőkben azt szeretnénk bemutatni, hogy hol tartanak ma a diabetes őssejtterápiáját célzó alap- és preklinikai kutatások. Kitérünk mind az embrionális, mind a szöveti őssejtek β-sejt irányú differenciáltatásának és a különböző
ős-
és/vagy
β-sejt-transzplantációs
protokollok
kidolgozásának
eredményeire. A kutatások több irányban párhuzamosan folynak, hiszen ma még senki sem tudja megmondani, melyik területen várható az igazi áttörés. β -sejtek embrionális őssejtekből? Az embrionális őssejtek (embryonic stem cell = ESC, vagy ES sejtek), illetve a belőlük kifejlesztett, gyakorlatilag korlátlan élettartamú sejtvonalak a hólyagcsíra (blastocysta) állapotú embriók belső sejtcsomójából (inner cell mass = ICM) származnak. Az ún. terápiás klónozás révén elméletileg olyan humán ICM sejtek is nyerhetőek lennének, melyek immunológiai szempontból identikusak a beteg szervezetének többi sejtjével, tehát autológ transzplantációt is lehetővé tehetnének. Az ESC-k pluripotensek, vagyis mindhárom csíralemez irányába képesek differenciálódni, így a szervezet minden érett sejttípusa, szövete és szerve kialakulhat belőlük (GerechtNir és Itskovitz-Eldor 2004). Elvben tehát ideális kiindulási anyagot jelentenek nagy mennyiségű β-sejt előállításához (1. ábra).
12
ES sejtvonal előállítása
Terápiás klónozás Sejtmagátültetés
Belső sejtmassza
Sejtmag
A beteg testi sejtje
Enukleált petesejt
Blastocysta
ES sejtek
Differenciáltatás
Allogén transzplantáció
Autológ transzplantáció
Blastocysta
Autológ β -sejtek
Allogén β -sejtek
1. ábra. β-sejtek előállítása embrionális őssejtekből sejttenyészetben Meg kell említeni, hogy az emberi embriók felhasználásával kapcsolatban súlyos etikai problémák merültek fel. A legszélsőségesebbektől eltekintve a véleményezők alapvetően két táborra oszlanak. Sokak szerint semmi esetre sem megengedhető az, hogy emberi embriókat pusztítsanak el kutatási célból, mert azok mindegyike egy-egy emberi élet lehetőségét rejti magában, és ezáltal személyiségi jogok illetik meg. Az ellentábor viszont arra hivatkozik, hogy csupán a mesterséges megtermékenyítés céljára létrehozott, de aztán felhasználásra nem került, úgymond felesleges embriókat használnák fel. Az amúgy is kidobásra ítélt sejtek védelmében pedig nem indokolt beteg emberektől elvenni a gyógyulás reményét (Hug 2004). A két vélemény ütköztetéséből az a félmegoldás született, pl. az Amerikai Egyesült Államokban, hogy lehetővé teszik a már meglévő sejtvonalakon folyó kutatásokat, de újabb embriók felhasználására a kormány nem nyújt támogatást az adófizetők pénzéből. Magyarországon még nem született az embrionális őssejt vonalak létrehozására vagy felhasználására vonatkozó törvény. Valójában azonban, ha ezeket a súlyos etikai aggályokat félre is tesszük, sok technikai probléma vár még megoldásra az ES sejtekkel kapcsolatban. Egyelőre még
13
nincs olyan hatékony protokoll, mely 100%-ban végdifferenciált sejteket lenne képes létrehozni, ebből adódóan egy esetleges terápia során fennáll az ES sejtek ismert tumorogenitásának veszélye. Kísérleti adatok szerint, ha a graftnak akár csak minden egymilliomodik sejtje ES sejt marad, már szinte biztosan teratoma alakul ki a befogadó szervezetben (Deb és Sarda 2008). A jelenleg alkalmazott tenyésztési módszerek többségénél fenyeget az állati eredetű immunogénekkel és/vagy patogénekkel történő szennyeződés lehetősége. A terápiás klónozás esetét kivéve számolnunk kell a szöveti összeférhetetlenség következményeként előálló kilökődési reakcióval is (Gruen és Grabel 2006). Inzulin-termelő sejteket ugyan számos munkacsoportnak sikerült már egér (Lumelsky és mtsai 2001, Hori és mtsai 2002, Kania és msai 2003, Kahan és mtsai 2003), sőt emberi ES sejtekből is (Assady és mtsai 2001, Segev és mtsai 2004) előállítania in vitro kultúrában, az eredmények nem igazán meggyőzőek. A legelső próbálkozások alapja a spontán differenciálódásnak induló, „multilineage” ES sejtek közül a pancreatikus progenitorok kiválogatása és támogatása volt (Lumelsky és mtsai 2001). A Lumelsky protokoll néven emlegetett eljárás azonban zsákutcának bizonyult, ugyanis az általuk alkalmazott - nestin+ sejtekre történő - válogatás nemcsak a pancreatikus, de a neuronális progenitoroknak is kedvez. Ismert, hogy a neuronális és a pancreatikus differenciációt ugyanazok a transzkripciós faktorok irányítják, de a kezdetben közös markerek csak a szigetfejlődés köztes stádiumában vannak jelen, az érett szigeteket már nem jellemzik. A vegyes tenyészet sejtjei nem válogathatóak szét és köztük csak kis mennyiségű inzulin pozitív sejt található. Az inzulin-termelő sejtekben sincsenek inzulin-szekréciós granulumok, a szekréció emiatt nem kontrollált, és csekély mértékű. Néhány esetben még az is felmerült, hogy a kezdeti próbálkozásokkal létrehozott ún. „β-sejtek” nem is differenciálódtak a megfelelő irányba, csupán abszorbeálták az inzulint a tenyésztőfolyadékból (Rajagopal és mtsai 2003). Ezért mindig igazolni kell, hogy a sejtek citoplazmájában inzulin specifikus mRNS, inzulin tartalmú vezikulák és C-peptid (emberi sejtek esetén) vannak. A további, azóta is folyó differenciáltatási próbálkozások célja az embrionális ill. magzati történések mind pontosabb lejátszása. Ennek érdekében elengedhetetlen a pancreas organogenezisének mind alaposabb felderítése,
14
melynek részleteit napjainkban is kutatják (Zaret 2008). Egyes kutatócsoportok csak egy vagy néhány növekedési faktort, morfogént vagy extracelluláris mátrix komponest alkalmaztak, így pl. Kubo és csoportja aktivint (Kubo és mtsai 2004), Shi és csoportja aktivint és retinsavat (Shi és mtsai 2005), mások viszont igyekeztek az embrionális fejlődés mind több ismert történését lépésről lépésre reprodukálni (D'Amour és mtsai 2006). Egy másik megközelítést képviselnek azok a kísérletek, melyekben a β-sejtek fejlődésében kulcsszerepet játszó transzkripciós faktor(ok) – például a pancreatikus és duodenális homeobox 1 (Pdx-1) és/vagy a paired box 4 (Pax4) - kifejeződését fokozták az őssejtekben (transzfekcióval vagy más módon) (Blyszczuk és mtsai 2003, Miyazaki és mtsai 2003). Megint más oldalról keresik a megoldást Kroon és mtsi, akik a humán ES sejttenyészeteket 4-6 hetes foetális pancreas szövetnek megfelelő sejtekké differenciáltatták, majd cukorbeteg egerekbe implantálták. A speciális implantátumban a pancreatikus endoderma irányába már elkötelezett sejtek fejlődése befejeződött, érett szigetsejtekké
alakulva
képesek
voltak
fenntartani
az
állatok
glükóz
homeosztázisát (Kroon és mtsai 2008) Az ES sejtek β-sejt irányú in vitro differenciáltatásának egyik fő problémája az, hogy a végeredmény mindig egy kevert sejtpopuláció, amin belül kisebbségben vannak az inzulin-termelő sejtek. Ráadásul az egy sejtre eső inzulintartalom ezekben a sejtekben is alacsonyabb, mint a Langerhans-szigetek βsejteiben és az inzulin-szekréció szabályozása sem teljesen egyezik a fiziológiás szabályozással (Sipione és mtsai 2004). További komoly gondot jelent, hogy a nem kellően differenciálódott, embrionális jellegű sejteket is tartalmazó készítmények terápiás célra nem alkalmasak a teratóma képződés kockázata miatt. A jelenlegi, már igen körültekintő módszerekkel „β-sejt irányba differenciáltatott” ES sejteket cukorbeteg egerekbe oltva, vagy graftként beültetve megszüntethető ugyan a hyperglycaemia, de az állatokban teratoma alakulhat ki, aminek következtében hamarosan elpusztulnak. A teratoma képződés kockázatát tehát feltétlenül ki kell zárni mielőtt az ES sejtek, illetve bármilyen belőlük differenciáltatott sejt, orvosi alkalmazása komolyan szóba kerülhetne. A klinikumban további, elsősorban immunológiai problémákkal is számolni kell. Az állatkísérletek során megoldható, hogy a cukorbeteg és az ESC
15
donor egyed azonos genotípusú (szingén) legyen. Ilyenkor a recipiens állat immunrendszere az adott ES sejt minden beültett utódsejtjét, legyen az bármilyen irányba differenciálódott leánysejt, „sajátként” ismeri fel és befogadja. A betegek esetében erre gyakorlatilag nincs esély. Így a transzplantáció után a recipiens immunrendszere a számára „idegen” (allogén) ES sejtek utódsejtjeit is idegenként fogja azonosítani és heves kilökődési reakcióval igyekszik majd megszabadulni tőlük. A transzplantált beteg tehát, más szervtranszplantált betegekhez hasonlóan, egész
további
életében
drága
és
az
életminőségét
jelentősen
rontó
immunszuppresszív kezelésre szorul majd. Ezt egyetlen módon, a jelenleg még gyermekcipőben járó terápiás klónozással lehetne megelőzni. A terápiás klónozás lényege, hogy a rendelkezésre álló – bármilyen genotípusú egyénből származó – ES sejt magját eltávolítják és helyére a kezelendő beteg egy szomatikus sejtjének magját ültetik (1. ábra). A kapott ES sejt és utódsejtjei ezután már a beteg örökítő anyagát hordozzák és így csak az abban kódolt fehérjéket tudják előállítani. Vagyis a klónozott sejt(ek) a beteg immunrendszere számára többé nem lesznek idegenek. Hozzá kell tennünk, hogy terápiás klónozást emberi sejtekkel eddig még nem sikerült véghezvinni. Ezen a téren, humán sejtekkel elért sikereiről beszámoló munkacsoport eredményeit nem sokkal később visszavonta (Hwang és mtsai 2005). Arról sem feledkezhetünk meg, hogy az 1-es típusú diabetes mellitus súlyos autoimmun betegség. Még ha elő is lehetne állítani szingén β-sejteket, az ilyen betegek citotoxikus – T, NK, és NKT – sejtjei azokat éppúgy elpusztítanák a beültetés
után,
mint
ahogy azt
az
eredetiekkel
tették.
A 1-es típusú
cukorbetegségben szenvedő betegek tehát az inzulintermelő sejtek egyszeri pótlásával – hacsak az autoimmun folyamatot nem sikerül közben megfékezni – semmiképpen sem gyógyíthatók meg.
16
β-sejtek felnőtt szövetek sejtjeiből, prekurzorokból, szöveti őssejtekből? A szöveti (felnőttkori) őssejtek terápiás felhasználásának az ES sejtekkel összehasonlítva számos előnye van. Elvben bármely betegből nyerhető, azaz nincs szükség választott donorra. Ráadásul az autológ – a beteg saját őssejtjeivel végzett - transzplantáció során kizárható a különböző fertőző betegségek átvitelének lehetősége, nincsenek immunológiai komplikációk (kilökődés vagy graft versus host betegség) és nem merülnek fel olyan etikai aggályok sem, mint az ESC-k esetében. Így rendkívül ígéretesek azok a próbálkozások, amelyek a diabetes csontvelő-transzplantációval történő gyógyítására irányulnak. β-sejtek β-sejtekből, vagy prekurzoraikból Számos
próbálkozás
történt
maguknak
a
β-sejteknek
in
vitro
felszaporítására is beültetés céljából. Az emberi β-sejtek kultúrában megfigyelt replikációs képessége azonban jóval kisebb, mint a rágcsálóké (Choi és mtsai 2004). Néhány munkacsoportnak sikerült szövetkultúrában tartott Langerhansszigetekből
olyan
dedifferenciálódott,
osztódóképes
sejteket
előállítania,
amelyekben kifejeződik néhány mesenchymalis marker (nestin, vimentin) és már nem termelnek sziget hormonokat. Ezek a sejtek többször átolthatók in vitro, redifferenciáltatásuk β-sejtekké viszont máig megoldatlan. A bennük kifejeződő inzulin specifikus mRNS mennyisége „redifferenciáltatás” után is legfeljebb 0,01%-a a normális β-sejtekének (Bonner-Weir és Sharma 2002, Gao és mtsai 2003). Az ún. hasnyálmirigy-őssejtek leírása óta pedig sokan abban is kételkednek, hogy valóban β-sejtek dedifferenciálódása útján keletkeztek. Multipotens, klonogén ős- és/vagy elődsejteket különböző módszerekkel sikerült izolálni a hasnyálmirigyből (Dor és Melton 2008). Suzuki és mtsai (Suzuki és mtsai 2004) áramlási cytometria segítségével azonosítottak egy rendkívül kicsi, cMet (a hepatocyta növekedési faktor (HGF) receptora) pozitív, de különböző vérsejtfejlődési sorokra és endothel sejtekre jellemző markerekre negatív sejtpopulációt az egér pancreasban. Az ezekből a sejtekből in vitro formálódott kolóniák a sziget-, acinus- és ductus-sejtekre, valamint hepatocytákra és
17
gastrointestinalis
sejtekre
jellemző
géneket
expresszáltak.
A
belőlük
differenciálódó sejtek inzulin-termelő képességét azonban nem vizsgálták. Seaberg és mtsai (Seaberg és mtsai 2004) - szintén egér hasnyálmirigy szigetekből és a ductusokból – in vitro kolóniaképző képességük alapján izoláltak egy olyan sejtpopulációt, amelynek tagjai a Langerhans-szigetekre és idegsejtekre jellemző markereket hordoztak. Az egyes kolóniák differenciálódása során különböző típusú ideg és gliasejtek, valamint hasnyálmirigy β-, α- és δ-sejtek keletkeztek. A β-sejtek
a környezet glükóz-koncentrációjától
függő
mennyiségű
inzulint
szekretáltak. További előrelépést jelent ezen a területen, hogy emberi foetalis pancreasból sikerült nagy mennyiségű multidrog-rezisztencia fehérjét expresszáló, ún. SP (side population) sejteket izolálni, amelyek 2-3%-a kolóniaképzőnek bizonyult, többször átoltható volt, és β-sejt irányba is képes volt differenciálódni (Zhang és mtsai 2005). Természetesen az ilyen hasnyálmirigy őssejtek – ha léteznek
és
egyszer
megfelelő
mennyiségben
szaporíthatók,
majd
differenciáltathatók lesznek is in vitro kultúrában – akkor sem nyerhetők majd magából a betegből. Vagyis kizárólag allogén graftként, immunszuppresszió alatt álló cukorbetegek transzplantációjára lesznek alkalmasak. Nyilvánvaló, hogy a pancreas in vivo is rendelkezik bizonyos regenerációs képességgel. Ismert tény, hogy a kifejlődött szervezetben fiziológiásan is változik a βsejtek száma. Növekvő, illetve csökkenő β-sejt tömeg kíséri a változó metabolikus igényeket (Bonner-Weir 2000). Így például terhesség alatt, vagy elhízott de nem cukorbeteg
egyénekben
megnövekedett
sejtmennyiséget
találunk,
míg
a
szénhidrátszegény diétával elért testsúlycsökkentéssel a sejtek száma is csökken. A 2-es típusú diabetesben szenvedő betegekben jelentősen - átlagosan 50 %-al - csökken a βsejtek mennyisége (Butler és mtsai 2003), ami gyógyszeresen (pl. thiazolidinedionokkal (TZD), javítható (Wajchenberg 2007). A veleszületetten autoimmun diabetesre hajlamos egértörzs (non-obese diabetic mice = NOD egerek) egyedeinek 1-es típusú diabetese meggyógyul, ha a β-sejteket pusztító autoimmun folyamatot sikerül megállítani (Sherry 2006). Méreggel vagy direkt sebészeti úton történő pancreas-írtást követő regenerációt is sikerült indukálni kísérleti állatokon (Bouwens 2006, Pasquali 2006). Az azonban nem világos, hogy az elpusztult β-sejtek regenerációja egyszerűen a
18
meglévő β-sejtek osztódásával (Dor 2006), vagy valódi neogenezissel, azaz ős- és/vagy elődsejtek osztódásával és differenciálódásával történik (Bonner-Weir és Sharma 2002). Esetleg - az életkorral változó arányban - de mindkettő szerepet játszik az új βsejtek születésében (Bonner-Weir 2000, Gao és mtsai 2003). A méhen kívüli élet korai időszakából vannak bizonyítékaink arra vonatkozólag, hogy maguk a β-sejtek is rendelkezhetnek jelentős proliferatív képességekkel (Georgia és Bhushan 2004), ami idővel valószínűleg visszaszorul, és ekkor kerülhetnek előtérbe az esetleges progenitorok. De a szóba jöhető ős- és/vagy elődsejtek eredete és lokalizációja – pancreason belüli (Hao 2006), vagy azon kívüli (esetleg csontvelői – ld.később) – egyelőre tisztázatlan. Mindenesetre a diabetes őssejtterápiájának legkíméletesebb módja valószínűleg az lenne, ha az endogén regenerációs folyamatot sikerülne felerősíteni, és egyáltalán nem lenne szükség transzplantációra (Halban 2004). Ennek első lépéseként értékelhetjük az exendin-4 sikeres bevezetését a 2-es típusú diabeteses betegek kezelésében (Holst 2004). Az exendin-4 a GLP-1-hez hasonlóan működik. A GLP-1 (glucagon-like peptide-1) az incretinek közé tartozik, melyek a béltraktus által, táplálékfelvétel hatására termelődő peptidek. Az incretinek sokrétűen támogatják a glükóz homeosztázist. Az exendin-4 GLP-1 receptor agonista, vagyis képes a GLP-1nek - G-protein kapcsolt - receptorát aktiválni. Ezáltal lassítja a gyomor ürülését, gátolja a glükagon szekrécióját, és ami a diabetes kezelésében a legfontosabb: növeli a β-sejtek
glükóz
érzékenységét,
fokozza
inzulin-szekréciójukat
és
sejtvédő,
antiapoptotikus valamint proliferatív hatással van rájuk. Az exendin-4 egy - kezdetben csak a mexikói viperagyík (Heloderma suspectum) mérgező nyálából kivonható - anyag szintetikus változata.
Alkalmazásával jelentősen lassítható a 2-es típusú diabetes
progressziója. β-sejtek májsejtekből Egyes
májsejtek
transdifferenciáció
révén
szintén
inzulin-termelő
sejtekké alakulhatnak. Cukorbeteg egereket pancreatikus és duodenális homeobox 1 (Pdx-1) gént tartalmazó adenovírussal fertőzve, az állatok májában Pdx-1 és inzulin expressziót lehetett kimutatni, miközben megszűnt az STZ-indukálta hyperglycaemia (Ferber és mtsai 2000). Emberi foetalis májsejteket szintén Pdx-1-
19
el,
valamint
telomeráz
enzim
génjével
együttesen
transzfektálva
olyan
folyamatosan növekedő sejtvonalakat kaptak, amelyek nagy mennyiségben termeltek és tároltak inzulint, immundeficiens, cukorbeteg egerekbe ültetve pedig, megszüntették a diabetest (Zalzman és mtsai 2003). Ezzel a módszerrel tehát elvileg egyetlen májból, sőt akár a beteg egyetlen májlebenyéből is igen nagy mennyiségű szingén inzulin-termelő sejtet lehetne előállítani. A telomeráz enzimet folyamatosan expresszáló sejtek azonban a normál sejteknél jóval könnyebben transzformálódhatnak, azaz a tumorkeletkezés veszélye az ilyen sejtekkel kezelt betegekben igen nagy lenne. Az sem világos, hogy milyen típusú májsejt alakulhat inzulin-termelő sejtté. A legvalószínűbb, hogy erre csak az ún. ovális sejtek képesek (Yang és mtsai 2002). β-sejtek csontvelői őssejtekből A csontvelő egy igen összetett, számos különböző felnőtt kori őssejtet tartalmazó szövet. A folyamatos vérképzést biztosító haematopoeticus őssejtek (hematopoetic stem cell = HSC) mellett mesenchymalis őssejteket (mesenchymal stem/stromal cell = MSC) (részletesen ld. 26.o.), angioblastokat és ún. haemangioblastokat is tartalmaz. A haemangioblastok a HSC-k, angioblastok és valószínűsíthető, hogy egyes símaizom sejtek közös őssejtjei (Herzog és mtsai 2003). Többen feltételezik azonban, hogy mindez csak a jéghegy csúcsa és a csontvelőben egy még fiatalabb, pluripotens – lényegében az ESC-khez hasonló – az egyedfejlődés embrionális szakaszából „megmaradt” őssejtpopuláció is található. Ezt a MAPC–nak (multipotent adult progenitor cell) elnevezett csontvelői sejttípust eddig csak egyetlen csoportnak (Verfaillie 2002) sikerült izolálni, pedig ha létezése többek által is igazolást nyerne, pluripotenciája miatt, joggal kerülhetne a regeneratív orvoslás kutatásainak középpontjába. A MAPC még mindhárom csíralemez irányába történő teljes differenciálódási képességét megőrizte, így nem csak a mesenchymális őssejtek, de endodermális és ectodermális őssejtek is differenciálódhatnak belőlük (2.ábra).
20
2. ábra. Csontvelői őssejttípusok Az ábra Verfaillie (Verfaillie 2002) csoportjának elképzelése szerinti leszármazást mutatják. A sejtek neve alatt jellemző markereiket soroltuk fel.
Nemrégiben
egy
másmilyen
fenotípusú,
de
ugyancsak
primitív,
embrionális jellegű sejttípust is azonosítottak a csontvelőben és számos más szervből is izolálták. Ezeket a relatíve kicsiny méretű sejteket Ratajczak és mts.-i írták le és nevezték el VSEL sejteknek (very small embryonic-like cells) (Ratajczak és mtsai 2008). Sorolhatnánk még azokat az embrionális jellegűnek talált sejteket, melyeket különböző szervekből csak egy-egy kutatócsoport tudott izolálni, de másoknak - a körülmények pontos betartásával - sem sikerült eredményeiket reprodukálni (Quesenberry és mtsai 2005). A nehézségek ellenére nyilvánvalónak tűnik,
hogy testszerte találhatóak
a
felnőtt
szervezetben
pluripotens sejtek, de mivel a szöveti őssejteket igen nehézkes, sok esetben lehetetlen sejtfelszíni markereik alapján beazonosítani, az adott szövet sejtjei között, sokszor „megfoghatatlanok” maradnak. Izolálásuk nem egyszerű feladat.
21
Az őssejtek terápiás hatásaival kapcsolatosan is sok a bizonytalanság. A diabetes kezelésére beadott csontvelői sejtek hatását vizsgáló eddigi állatkísérletek rendkívül nehezen értékelhetők. A különböző munkacsoportok lényegében csak abban értenek egyet, hogy az egerekben és patkányokban – általában streptozotocin (STZ) segítségével előidézett (Banerjee és mtsai 2005), vagy az adott beltenyésztett törzsben (például a NOD egerekben)(Lee és mtsai 2006) öröklődő - diabetes csontvelői sejtek beadásával legalábbis időlegesen, de néha véglegesen is gyógyítható. Banerjeenek és munkatársainak 3 egymást követő csontvelő-transzplantációval sikerült javítaniuk az STZ-indukált diabetesen, míg Lee csoportja nagyszámú MSC-vel ért el kedvező hatást NOD egereknél. A gyógyulás vagy átmeneti javulás okát, a csontvelői sejtek kedvező hatásának mechanizmusát illetően azonban már erősen megoszlanak a vélemények. Ianus és mtsai (Ianus és mtsai 2003) szerint például egyes csontvelői eredetű
őssejtek
a
hasnyálmirigyben
inzulin-termelő
β-sejtekké
transzdifferenciálódnak (3.A ábra). Egy ilyen átalakulás azért is rendkívül érdekes lenne,
mert
nem
tartaná
tiszteletben
a
csíralemezek
közötti,
sokáig
átjárhatatlannak hitt határokat. Erre csak egy valóban embrionális jellegű, pluripotens sejt lenne képes. Ianus csoportja csontvelőhalált okozó dózisú (myeloablatív) besugárzással kezelt egészséges nőstény egereket oltott GFP (green fluorescecent protein = zöld fluoreszcens fehérje) transzgenikus hím állatokból származó csontvelővel. A transzplantáció után 4-6 héttel a recipiens állatok hasnyálmirigyének
Langerhas-szigeteiben
a
sejtek
1,7-3%-a
volt
zölden
fluoreszkáló, Y kromoszómát hordozó és inzulint tartalmazó, azaz a donor csontvelőből származó β-sejt. További technikai finomításokkal azt is igazolták, hogy ezek a sejtek nem a donor eredetű csontvelői sejtek és a recipiens βsejtjeinek fúziójával jöttek létre, tehát egyértelműen transzdifferenciálódás történt. Mindez véleményük szerint arra is igazolásul szolgálhat, hogy a csontvelő a nem cukorbeteg állatokban, fiziológiás körülmények között is β-sejt forrásként működik. A csontvelőből kis számban, de folyamatosan kilépő, keringő őssejtek megtapadnak a hasnyálmirigyben és β-sejtekké alakulnak, amikor arra szükség van a normális mértékű sejtpusztulás, vagy a megnövekedő metabolikus igények miatt.
Sajnos
másoknak,
hasonló
kísérleti
22
feltételek
mellett,
ezeket
az
eredményeket nem sikerült megerősíteni (Choi és mtsai 2003, Lechner és mtsai 2004). A transzplantált állatok hasnyálmirigyében GFP+ Y+inzulin+ sejteket még STZ kezelés és részleges pancreas-írtás után sem találtak. Előfordultak ugyan GFP+ sejtek a Langerhans-szigetekben, ezek azonban kivétel nélkül CD45-öt (egy a leukocyta sejtfejlődési sorra jellemző markert), vagy von Willebrand faktort (endothel markert) is kifejeztek. Semmiképpen sem lehettek tehát β-sejtek, csak leukocyták és endothel sejtek. Az utóbbi megfigyelések inkább Hess és mtsainak (Hess és mtsai 2003) az eredményeivel vannak összhangban (3.B ábra). Ez a kanadai munkacsoport immunhiányos egerekben STZ kezeléssel indukált diabetest, majd - szubletális (nem myeloablatív) besugárzás után – GFP-transzgénikus donor állatokból származó csontvelői sejtekkel, vagy azok c-kit+ frakciójával oltotta a beteg állatokat. A c-kit (másik neve: CD117) egy citokinnek, a stem cell factornak (SCF) a receptora, mely többek között a haematopoeticus őssejtek markere. A következő négy hétben mind a teljes csontvelővel, mind a szeparált c-kit+ csontvelői sejtekkel transzplantált egerekben jelentősen csökkent a vércukorszint. Az állatok hasnyálmirigyének össztömege és inzulin termelése növekedett, a Langerhans-szigetekben az endogén (recipiens eredetű) β-sejtek osztódása fokozódott. A kevés (2,5%) GFP+ inzulin+ sejtben Pdx-1 specifikus mRNS-t nem találtak, ezek a sejtek tehát valószínűleg a környezetükből vettek fel némi inzulint. (Számuk
is
túl
alacsony
ahhoz,
hogy
megmagyarázza
a
vércukorszint
csökkenését). Ugyanakkor a hasnyálmirigy területére bejutott – jelentős számú – donor eredetű GFP pozitív sejt 9,2%-a PECAM-1-et (platelet endothelial cell adhesion molecule = vérlemezke-endothel sejt adhéziós molekula) fejezett ki, ami az érfalat alkotó endothel sejtek jellemző markere. A szerzők feltételezik, hogy ezek a donor eredetű, PECAM-1+ endothel sejtek bizonyos faktorok segítségével és nem elsősorban a keringés közvetlen javításával - fejtik ki hatásukat, azaz fokozzák
a
recipiens
saját
β-sejtjeinek
osztódását,
vagyis
a
pancreas
regenerálódását. Ez azért sem meglepő, hiszen az endothel sejtek, illetve az ezekből érkező paracrin jelzések meghatározó szerepe az endocrin pancreas fejlődésében jól ismert az egyedfejlődés során (Lammert és mtsai 2003)
23
A harmadik lehetőség (3.C ábra), hogy csontvelő-transzplantáció után, az eddig közelebbről nem meghatározott típusú, donor eredetű sejtek, a csontvelőbe történt homingjukat követően, ismeretlen faktor(oka)t termelnek, amely(ek) a keringéssel eljutnak a hasnyálmirigybe és ott biztosítják az endogén β-sejtek, vagy azok prekurzorainak osztódását és a Langerhans-szigetek regenerációját (Li és mtsai 2003). Ez a modell azokhoz az új megfigyelésekhez kapcsolható, amelyek szerint egy adott szövet öregedő vagy sérült, endogén őssejtjeinek aktivitása és az érintett szövet illetve szerv regenerációja fokozható, ha ezek az öregedő őssejtek fiatal szöveti őssejtekkel, illetve azok mikrokörnyezetével kerülnek kapcsolatba (Conboy és mtsai 2005). Vizsgálták azt is, hogy ezek az esetleges ismeretlen faktorok közelebbről milyen természetű jelátviteli molekulák lehetnek. Például az egyik valószínűsíthető ilyen anyag a hepatocyta növekedési faktor (hepatocyta grow factor = HGF), amely ismert mitogén faktor (Izumida és mtsai 2005). Minden esetre a hasnyálmirigy, illetve a β-sejtek csontvelő átültetés utáni regenerációjában e szerint az elképzelés szerint is csak közvetett szerepet játszanak a donor eredetű csontvelői őssejtek.
A
B
Transzdifferenciálódás
Teljes BM
C Új kapillárisok képződése
? Teljes BM
C-kit+ BM sejtek
BM sejtek β-sejtek
BM sejtek endothelsejtek, endogén őssejtek
?
Ianus et al. J Clin Invest 2003,111:843.
Hess et al. Nat Biotechnol 2003,21:763.
Li et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003,100:12935.
3. ábra. A diabetes mellitus kezelése csontvelő transzplantációval: a jelzett munkacsoportok által feltételezett mechanizmusok (Magyarázat a következő oldalon)
24
3. ábra. A diabetes mellitus kezelése csontvelő transzplantációval: a jelzett munkacsoportok által feltételezett mechanizmusok (A villám jele az állatok felett a transzplantációt megelőző egésztest besugárzást jelképezi. Az injekció a farokvénába juttatott sejteket mutatja)
A: A donor eredetű csontvelői őssejtek a hasnyálmirigyben inzulin-termelő β-sejtekké
transzdifferenciálódnak B: A donor eredetű, PECAM-1+ endothel sejtek a hasnyálmirigyben bizonyos faktorok
segítségével, esetleg a keringés javításával is elősegítik a pancreas regenerálódását. C: Donor eredetű, közelebbről nem meghatározott csontvelői sejtek, ismeretlen
faktorok segítségével elősegítik a pancreas regenerálódását. A fentiek alapján tehát, vagy valamely csontvelői, vagy egyéb - endogén eredetű - szöveti őssejt vesz részt a cukorbeteg állatok hasnyálmirigyének regenerációjában csontvelő-transzplantáció után. Így joggal merül fel a kérdés, hogy van-e reális esély inzulin-termelő sejtek, netán egész Langerhans-szigetek előállítására valamely - lehetőleg autológ – csontvelői őssejtből kiindulva in vitro kultúrában?
Ha
igen,
akkor
ezek
a
sejttenyészetben
felszaporított
és
differenciáltatott őssejtek vagy Langerhans-szigetek terápiás célra is alkalmasak lennének-e? A csontvelői őssejtek közül az MSC-k azok, amelyek viszonylag könnyen izolálhatók, in vitro kultúrában nagyon jól szaporodnak és rendkívül plasztikusak. Nikotinamid és exendin-4 tartalmú, azaz a β-sejtek osztódását és differenciálódását támogató anyagokat tartalmazó tápfolyadékban tenyésztve őket számos, a β-sejtek fejlődése során nélkülözhetetlen gén (inzulin I, inzulin II, Glut2, glükóz-kináz, Pdx-1 és Pax6) kifejeződése kimutatható. Az ilyen sejtek pár hét alatt sziget-szerű képletekbe rendeződnek, inzulint termelnek és cukorbeteg egerekbe, vagy patkányokba oltva csökkentik a hyperglykaemiát és javítják a glükóz toleranciát (Tang és mtsai 2004, Chen és mtsai 2004, Oh és mtsai 2004). Hasonló eredményt – inzulin-termelést - lehet elérni, ha adenovírus vektor segítségével néhány, az endocrin pancreas fejlődése során nélkülözhetetlen transzkripciós faktort (FOXA2, HLXB9, IPF1) fejeztetnek ki emberi mesenchymalis őssejtekben (Moriscot és mtsai 2005). Úgy tűnik tehát, hogy lehetséges működőképes, azaz a környezet glükóztartalmának megfelelő mennyiségű inzulint
25
szekretáló sejteket kialakítani csontvelői eredetű MSC-kből. Más szerzők azonban arra hívják fel a figyelmet, hogy a fenti tenyésztési feltételek mellett az őssejteknek csak kis része differenciálódik és az érintett sejtek sem termelnek terápiás szempontból elégséges inzulint (Jahr, Bretzel (2003). Tisztázásra vár az is, hogy az így előállított inzulin-termelő sejtek beültetés után vajon meddig életképesek a szervezetben. Kérdés, hogy transzplantációjukkal végleges gyógyulást, vagy csak átmeneti javulást lehetne-e elérni a betegekben. Természetesen arról sem szabad megfeledkeznünk, hogy mind a csontvelő-transzplantációs,
mind
a
differenciáltatott
MSC-kkel
végzett
kísérleteket jórészt STZ-vel indukált, tehát 1-es típusú (autoimmun) diabetes-szerű betegségben
szenvedő állatokon
transzplantációval
számos
végezték.
különböző
Ismert
autoimmun
tény,
hogy csontvelő-
betegség
eredményesen
gyógyítható (Burt és mtsai 2002). Ugyanakkor az MSC-knek önmagukban is figyelemreméltó immunszuppresszív hatása van. Vagyis ezekben a kísérletekben a sejtek kettős - egyrészt a β-sejtek regenerációjára, másrészt az autoimmun folyamat gátlására - gyakorolt hatásával kell számolnunk, ami klinikai szempontból igazán kedvező. A csontvelői sejtekkel történő transzplantáció azonban csak akkor válhat terápiás eljárássá a cukorbetegek számára, ha rendkívül kíméletes, nem myeloablatív kondicionálás mellett végezhető, hiszen a korántsem kockázatmentes myeloablatív előkezelés nagy részüket – koruk, általános egészségi állapotuk, vagy egyéb betegségeik miatt – mindenképpen kizárná a kezelésből. 1.3. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) különleges tulajdonságai
Az utóbbi időben a mesenchymális őssejtteknek számos olyan különleges tulajdonsága került napvilágra, ami miatt a regeneratív orvoslás szinte valamennyi területén felfigyeltek rájuk (Krampera és mtsai 2006). Az MSC-k könnyen izolálhatóak
Elsőként Friedenstein és mtsai (Friedenstein és mtsai 1987) írták le őket, mint a csontvelőben található, in vitro kultúrában a tenyésztőedény felületéhez tapadva növekedő (azaz adherens), fibroblast-szerű morfológiát mutató kolóniaképző sejteket,
26
amiket CFU-F-nek ( = colony-forming unit fibroblast) neveztek el. Bőr alá oltva ezeket a sejteket olyan speciális mikrokörnyezetet tudnak kialakítani, amely biztosítja a vérképző ős- és elődsejtek fejlődéséhez szükséges minimális feltételeket. Szerepük a csontvelőben tehát elsősorban a vérképző elemeket körülvevő stroma állomány kialakítása. Mivel őssejtspecifikus sejtfelszíni markereket igen nehéz találni, az őssejtek izolálása mindig nehéz feladat. Az MSC-k műanyag felületekhez való kitapadási hajlama („plasztik adherenciája”) nagyon leegyszerűsíti ezt, és már ez a technikai könnyebbség is vonzóvá teszi a sejttípust az őssejtbiológusok számára. A csontvelőből kitapasztott stroma sejteket, miután benőtték a rendelkezésükre álló felületet, trypsin és EDTA segítségével felszedjük, majd megfelelő hígítás után új tenyésztőedényekbe oltjuk őket. Többszöri átoltás után egy morfológiailag többé-kevésbé homogénnek tűnő, exponenciálisan növekedő sejttenyészetet kapunk, amit – ha már nem tartalmaz vérképző elemeket - mesenchymális sejtkultúrának tekinthetünk. Mivel az ilyen tenyészetekben a sejtosztódással egyidejűleg mindig történik spontán differenciálódás is, valójában egy heterogén, mesenchymális őssejtekből és a belőlük képződött tri- bi- és unipotens elődsejtek keverékéből álló sejtkultúráról van szó. A plasztikus MSC tenyészetek sokáig fenntarthatóak
Az MSC-k sok millió utódsejtet képesek létrehozni in vitro. Megfelelő tenyésztési
körülmények
között
elsősorban
különböző
mesodermalis-eredetű
sejtekké/szövetekké (pl.: a vérképzést támogató – un. myelosupportiv - stroma, csont, porc, zsírszövet, inak, símaizom) képesek differenciálódni (Pittenger és mtsai 1999). Bizonyos induktorok hatására akár ectodermalis (neuron, glia) (Azizi és mtsai 1998, Sanchez-Ramos 2002, Woodbury és mtsai 2000) és endodermalis (inzulintermelő βsejtek, májsejtek) irányú differenciálódásra is kényszeríthetők (Oh és mtsai 2004, Petersen 1999, Tang és mtsai 2004, Lakshmipathy és Verfaillie 2005). Hozzá kell tenni, hogy a humán MSC-k nem halhatatlanok, az osztódások során öregszenek is, plaszticitásuk fokozatosan csökken és végül senescenssé válnak. A C57Bl/6 egerekből
27
előállított MSC tenyészetek azonban több tucatszor átolthatók, és a senescencia legcsekélyebb jelét sem mutatják, sokáig megőrzik plaszticitásukat, euploidiájukat. Az MSC-k a szervezetben mindenhol jelen vannak
Az MSC-k nem csak a csontvelőben találhatók. Gyakorlatilag minden eddig vizsgált szövetünkben, szervünkben előfordulnak (da Silva Meirelles és mtsai 2006, Pierdomenico és mtsai 2005). Könnyen hozzáférhető forrásuk lehet például minden zsírleszívásból származó szövetminta (Zuk és mtsai 2001), vagy a köldökzsinór (Erices és mtsai 2000) is. Valójában igen nehéz pontosan meghatározni, hogy mely sejtek is azok a mesenchymális őssejtek, és hogyan tudjuk egyértelműen megkülönböztetni őket a belőlük származó fibroblastoktól vagy akár a (valószínűleg szintén MSC-eredetű) pericytáktól (da Silva Meirelles és mtsai 2008, Kovacic, Boehm 2008). A különböző szövetekből izolált MSC-kkel régóta folyó, szerteágazó kísérletek, illetve ezek sokszor egymásnak ellentmondó eredményei miatt az ISCT (= International Society for Cellular Therapy) időszerűnek találta legalább azt definiálni, hogy milyen sejteket is nevezhetünk MSC-knek (Dominici és mtsai 2006). A fenti nemzetközi szövetség 2006-ban a következő javaslatot tette: nevezzük a mesenchymális ős-, vagy helyesebben stroma sejteknek (tekintettel a mesenchymális sejttenyészetek heterogén voltára) mindazokat a sejteket amelyek: •
adherensek;
•
CD105, CD73 és CD90 pozitívak, de nem hordoznak semmilyen, vérképző ős- és elődsejtekre, illetve a különböző vérsejtfejlődési sorokra jellemző felszíni markert (azaz CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a és CD19 negatívak);
•
csont-, porc- és zsírsejtekké egyaránt képesek differenciálódni.
Az MSC-k mobilitása és regeneratív képességei
Már korábban felfigyeltek arra, hogy minden csontvelő-transzplantált beteg és kísérleti állat stromája recipiens eredetű (Rieger 2005). Kiderült, hogy a sejttenyészetben felszaporított és a szervezetbe intravénásan visszajuttatott MSC-k
28
sem vándorolnak a csontvelőbe, hanem inkább szétszóródnak a különböző – elsősorban sok kapillárist tartalmazó – szövetekben. Tetemes részük például a tüdőben és a vesékben telepszik meg (Anjos-Afonso és mtsai 2004, Gao és mtsai 2001). Ennek lehet egyszerű fizikai oka: a nagyméretű és könnyen összetapadó sejtek elakadnak a szűk kapillárisokban. Más feltételezések szerint azonban az MSC-k igazi „hazája” az erek falában található, ahol pericytákként funkcionálnak, és ezért vándorlásuk („homing”-juk) is ide irányul (Zannettino és mtsai 2008). Sérülés esetén viszont – kemotaktikus ingerek hatására - egy részük a sérült szervekbe, szövetekbe vándorol, ahol kulcsszerepet játszik az adott szövet, illetve szerv regenerációjában. Közvetlenül a sérülés helyére adva az őssejteket általában még jobb eredmények érhetők el (Chamberlain és mtsai 2007). A számtalan sikeres állatkísérlet után ma már folyik az „MSC terápia” klinikai kipróbálása is. Porc és csontsérülések gyógyításával (Caplan 2005), szívinfarktuson átesett betegek (Bunnell 2005, Zimmet és Hare 2005) és idegrendszert érintő károsodások (Bang 2005) kezelésével próbálkoznak különböző munkacsoportok. Még osteogenesis imperfectában szenvedő gyermekekben is sikerült átmeneti javulást, a csont alapállományának növekedését és a csonttörések gyakoriságának csökkenését elérni MSC-k adásával (Horwitz és mtsai 1999). A terápiás hatás mechanizmusát azonban nem ismerjük. Annyi bizonyos, hogy az MSC-k sokszor nem is épülnek be (vagy legfeljebb igen kis számban) a sérült szövetbe, azaz nem transzdifferenciálódnak tömegesen például szívizom sejtekké vagy neuronokká in vivo, hanem inkább indirekt módon – az általuk termelt „trofikus” faktorok segítségével – indítják el a károsodott szövetek regenerációját (Caplan, Dennis 2006). Az MSC-k és az immunrendszer kapcsolata
Részben az állatkísérletek, részben a klinikai kipróbálás során derült ki, hogy az MSC-k két további különleges sajátsággal is rendelkeznek: •
allogén (ugyanazon faj genetikailag eltérő másik egyede), sőt néha xenogén (másik faj egyede) recipiensbe oltva sem váltanak ki erőteljes, a sejtek kilökődésével járó immunválaszt, azaz nem, vagy alig immunogének.
29
•
kifejezett – in vitro és in vivo egyaránt megfigyelhető - immunszuppresszív hatásuk van (Bartholomew 2002, Uccelli 2006). Mára már számos kísérlet bizonyítja, hogy a szövettenyészetben tartott
MSC-k minden, az immunválaszban fontos szerepet játszó sejt – T- és Blymphocyta, NK-sejt, és hivatásos antigén bemutató sejt (antigen presenting cell = APC) - funkcióját képesek gátolni. A gátlás nem antigénspecifikus, MHCfüggetlen és elsősorban feltehetően szolubilis faktorok révén valósul meg. A sejtkommunikáció közvetítésével kapcsolatban számos anyag szóba került, több elmélet látott napvilágot (melyeket a 4.ábra foglal össze) és további kutatások folynak (Rasmusson 2006, Aggarwal és Pittenger 2005, Deng és mtsai 2005).
4. ábra A mesenchymális őssejtek (MSC) immunszuppresszív hatásának feltételezett mechanizmusa Rövidítések: Treg = reguláló T-sejt, DC = dendritikus sejt, NK-sejt = natural killer sejt, IL =interleukin, PGE2 = prosztaglandin E2, M-CSF = makrofág kolónia-stimuláló faktor, TGF-β = transzformáló növekedési faktor-β, HGF = hepatocyta növekedési faktor, IFN-γ = interferon-γ, IDO = indolamin-2,3-dioxigenáz
30
Az in vitro kísérletek mellett számos állatmodellben - sőt néhány esetben már betegekben is - igazolták, hogy az MSC-k képesek gátolni mind a saját, mind a nem-saját antigének elleni, (auto- illetve alloantigén-specifikus) immunválaszt. Elsőként
páviánokon
figyelték
meg,
hogy
MSC-k
systemás
adásával
megnövelhető az allogén bőrgraftok túlélése (Bartholomew és mtsai 2002). Azóta számos, főleg rágcsálókon előidézett autoimmun betegségmodell gyógyítása révén az MSC-k immunszuppresszív működése további igazolást nyert (Gerdoni 2007, Zappia 2005, Augello 2007). Így kerülhetett sor a humán gyógyászatban is alkalmazásukra. 2004-ben Le Blanc és mtsai (Le Blanc és mtsai 2004) a „The Lancet” című folyóiratban számoltak be az első, az MSC-k in vivo gyulladásgátló és immunszuppresszív hatásán alapuló sikeres terápiás beavatkozásról. Egy 9 éves, akut lymphoid leukaemiája miatt allogén csontvelő-transzplantációval kezelt kisfiúban rendkívül súlyos (IV. stádiumú), a bőrt, az emésztőrendszert és a májat is érintő – gyógyszer rezisztens - akut graft versus host betegség (GVHD) alakult ki. Ezt sikerült leküzdeni a gyermek édesanyjából (haploidentikus donor) származó
MSC-k
ismételt
intravénás
adásával.
Napjainkra
az
Egyesült
Államokban az FDA (Food and Drug Administration) már engedélyt adott több „gyári” (Osiris Therapeutics, Inc.) MSC készítmény klinikai kipróbálására GVHDban (fázis II/III), Crohn-betegségben (fázis II) és rheumatoid arthritisben (fázis I/II). Az eddigi, korlátozott számú betegen végzett vizsgálat azt mutatja, hogy az MSC kezelésnek - legalábbis viszonylag rövid távon - nincs káros mellékhatása, és a beavatkozás során érvényesül az őssejtek szövet-regenerációt elősegítő képessége is. Nem csak megállítják, vagy legalábbis lassítják a GVHD progresszióját, hanem fokozzák a betegség következtében károsodott szövetek, például a bélhám és a máj regenerációját is. Összefoglalásként tehát elmondhatjuk, hogy az MSC-k megismerése számtalan új – eddig nem is remélt – lehetőséggel kecsegtet a gyulladásos és autoimmun betegségek kezelésében, valamint a regeneratív orvoslás és a szervtranszplantáció területén. Különösen immunszuppresszív hatásuk ígéretes, mivel az MSC-k – mint láttuk – előszeretettel vándorolnak a sérült és/vagy gyulladt szövetekbe, tehát aktivitásukat is elsősorban ott, lokálisan fejtik ki. Így, bár immunszuppresszív hatásuk a jelenleg alkalmazott gyógyszerekéhez hasonlóan
31
nem antigén specifikus, alkalmazásuk remélhetőleg jóval kevesebb nem kívánatos mellékhatással (toxicitás, a kórokozók elleni védelem gyengítése, stb.) jár. A
mindennapi
gyógyító
gyakorlatban
történő
alkalmazásukat
megkönnyítené, hogy adott beteg kezeléséhez nincs szükség feltétlenül autológ őssejtekre, elvben bármely egészséges donor MSC-je felhasználható anélkül, hogy gyógyszerekkel gátolnánk a recipiens immunrendszerének működését. Az MSC-k regeneratív képességeik miatt az 1-es és a 2-es típusú diabetesben
szenvedő
betegek
β-sejtjeinek
regenerációjában
is
szerepet
játszhatnak, de ha immunszuppresszív tulajdonságaikat is számításba vesszük, akkor mindkét okból terápiás hatással bírhatnak autoimmun diabetesben. Ezért az MSC-k hatásának vizsgálata különösen indolkolt a streptozotocinnal (STZ) kialakított diabetes esetén, ugyanis ez az autoimmun diabetes modellje. Az STZ a β-sejteket specifikusan pusztító méregként működik. Miközben belülről roncsolja azokat, olyan antigéneket hoz felszínre, amelyek miatt egyúttal az autoreaktív Tsejt válasz elindítójaként is szerepet játszik (Like és Rossini 1976, Paik és mtsai 1980, Kiesel és Kolb 1982). A T-sejt válasz ezután az addig nem érintett βsejteket is elpusztítja, illetve gátolja a regenerációt, mert az újonnan képződő βsejteket sem hagyja életben. A kialakuló T-sejt infiltráció nagyon hasonlít az 1-es típusú diabetes kialakulása során megfigyelhetőhöz.
32
2. Célkitűzés A diabetesben elpusztult β-sejtek pótlására világszerte folynak kutatások, melyek vagy a beteg saját β-sejtjeinek támogatását és számuk növelését célozzák, vagy β-sejteket kívánnak előállítani endogén vagy exogén őssejtekből. Az eddigi egérkísérletek eredményei, melyekben β-sejtek pótlására, vagy osztódásuk elősegítésére csontvelői magvas sejteket, esetleg többé-kevésbé tisztított vérképző ős- és elődsejteket adtak, ellentmondásosak voltak, nem minden esetben bizonyultak megismételhetőnek és a legkevésbé sem szolgálnak egységes magyarázattal a gyógyulás mechanizmusára vonatkozólag. Munkánk célja a frissen szeparált csontvelői magvas sejtek (bone marrow cell = BMC/ BM sejt) és a csontvelői eredetű in vitro felszaporított mesenchymális őssejtek (mesenchymal stem/stromal cell = MSC) szerepének vizsgálata cukorbeteg egerekben. 1. A diabetes őssejtterápiájára vonatkozó kérdések vizsgálata előtt megfelelő állatmodellre volt szükségünk. A streptozotocin (STZ) indukálta diabeteses állatmodellt kívántuk alkalmazni. A betegség kialakulásának folyamatát a vércukorszint, a szérum inzulinszint és a testsúly folyamatos mérésével tudtuk nyomon követni. Terveztük, hogy a Langerhans-szigetek degenerálódását és az inzulin szekréció csökkenését szövettani metszeteken immunhisztokémiai módszerekkel is igazoljuk. 2. Az 1. pontban mért paraméterek alapján egyértelműen cukorbeteg állatokon,
mint
az
autoimmun
diabetes
állatmodelljén
végzett
transzplantációs kísérleteink elsődleges célja annak a kérdésnek a tisztázása volt, hogy a frissen szeparált csontvelői magvas sejtek valójában milyen hatással vannak a betegség lefolyására, esetleg pancreas regenerációt is előidézhetnek-e. Ha igen, akkor ez milyen mértékű ill. mennyire tartós? Az egérmodell sikeres létrehozását követően mindenek előtt erre a kérdésre kerestük a választ.
33
Pontosan meg akartuk határozni a transzplantációt megelőző legkisebb, de még hatásos besugárzási dózist, a transzplantáció ideális időpontját, valamint a terápiás szempontból leginkább hatásos - beadandó sejtszámot. 3. Tekintettel a mesenchymális őssejtek figyelemreméltó regeneratív és immunszuppresszív
tulajdonságaira,
a
2.
pontban
célul
kitűzött
transzplantációs kísérleteinket ki kívántuk egészíteni azzal, hogy a csontvelői őssejtek egyik típusát, a mesenchymális őssejteket (mesenchymal stem/stromal cell = MSC) in vitro felszaporított formában is alkalmazzuk. Az MSC-ket plasztik adherenciájuk alapján szeparálva és in vitro tenyésztve akartuk felszaporítani. Annak bizonyítására, hogy az így nyert sejtek azonosak az International Society for Cellular Therapy által 2006-ban megfogalmazott definícióban szereplő MSC-kel, illetve valóban multipotensek, áramlásos cytométerben markereik alapján akartuk karakterizálni, majd adipocyta és osteoblast irányba is differenciáltatni őket. 4. Az előzőleg in vitro kultúrában felszaporított MSC-ket önmagukban is be akartuk juttatni a cukorbeteg állatok keringésébe ill. kotranszplantációt is terveztünk, azaz a frissen szeparált csontvelői sejtekkel egyidejűleg MSC-ket is be akartunk adni az állatoknak. A terápiás szempontból leginkább megfelelő sejtszámokat kellő számú kísérlet eredményeként kívántuk meghatározni. 5. Ha bármelyik esetben és feltétellel átmeneti javulást vagy gyógyulást sikerül megfigyelnünk, annak mechanizmusára vonatkozóan is terveztünk információkat nyerni. Ebből a célból követni kívántuk a beadott sejtek sorsát. Igazolni kívántuk a BMC-k „hazatalálását” (homingját) a csontvelőbe, és az ott kialakuló átmeneti kevert chimerizmust. Keresni kívántuk még a MSC-k megtapadásának esetleges nyomait, illetve ki akartuk mutatni immunszuppresszív működésüket.
34
3. Módszerek 3.1. A diabetes kísérletes előidézése A diabetes állatmodellje
A diabetes előidézésére az egérmodelleket igénylő kutatások „gold standard”-jaként számon tartott C57Bl/6 (B6) elnevezésű beltenyésztett törzs nőstény egyedeit használtuk fel. Az állatokat az Országos Onkológiai Intézettől vásároltuk. Az állatkísérletek az Országos Gyógyintézeti Központ Munkahelyi Állatkísérleti Bizottsága által előírt szabályoknak megfelelően folytak. A 8-10 hetes nőstény C57Bl/6 egerek 5 egymást követő napon testsúlykilogrammonként 50-50 mg streptozotocint (STZ) (Sigma-Aldrich, St. Louis) kaptak intraperitoneálisan (ip). Az STZ oldatot minden oltás előtt frissen, nátrium-citrát puffer (pH: 4,5) felhasználásával készítettük. A testsúly, a vércukorszint, és a szérum inzulinszint követése
Az állatok testsúlyát laboratóriumi mérlegen, vércukorszintjüket glükométerrel (Accu-Chek Active vércukorszint mérő, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Svájc) hetente két alkalommal mértük. A szérum inzulinszinteket patkány/egér inzulinra specifikus ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Kit (Linco Research, St. Charles, MO) segítségével határoztuk meg, a gyártó utasításait követve. Azokat az állatokat tekintettük cukorbetegnek, melyek éhezés utáni vércukorszintje az STZ kezelés megkezdését követő 14. és a 15. napon meghaladta a 10 mmol/l-t a. Alapnak tekintettük, hogy az egészséges C56Bl/6 egerek 6 órányi éhezést követő vércukorszintje 4-5 mmol/l.
35
Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt
Ennek a vizsgálatnak a során az állatok négy órás éhezést követően testsúlykilogrammonként 2 g glükózt kaptak intraperitoneálisan. A cukor feldolgozását a vércukorszint 30 percenkénti mérésével követtük nyomon. A glükóz tolerancia teszt azt mutatja, hogy a glükózterhelésre bekövetkező vércukorszint emelkedés mennyi idő alatt esik vissza az éhezési értékre. A beadott glükóz feldolgozásának sebességén keresztül tájékoztatást kaphatunk a βsejtek
inzulin-kibocsátásáról,
a
szénhidrát-anyagcsere
válaszkészségéről,
állapotáról. Ha ez az idő hosszabbodik, vagy jelentősen megnyúlik, azt jelenti, hogy az állatok a diabetest megelőző glükóz intoleranciában szenvednek, vagy már cukorbetegek. 3.2. A csontvelői magvas sejtek szeparálása
A szingén (C57Bl/6) hím egerekből származó csontvelői sejteket közvetlenül a transzplantációjuk előtt nyertük ki az állatok comb- és lábszárcsontjaiból. A túlaltatott állatokból kiemelt csontokat steril alkoholos gézlapok felhasználásával alaposan megtisztítottuk a csonthártyától, az inaktól és az izmoktól, majd steril HBSS (Hank's Buffered Salt Solution) oldatba helyeztük. A csontok epiphysiseinél csipesz és kisolló használatával megnyitottuk a velőűrt, majd injekciós tű és fecskendő segítségével, hideg HBSS oldattal többször átöblítettük azt. Így alaposan kimostuk a csontokból a sejteket. A magvas sejtek számát az így nyert szuszpenzióban Türk-oldattal (genciánibolya + ecetsav) végzett festés után, Bürker-kamrában határoztuk meg. 3.3. A cukorbeteg egerek transzplantációja csontvelői magvas sejtekkel
A frissen szeparált csonvelői magvas sejtekkel azonnal elvégeztük a transzplantációt. A sejteket 0,2 ml szérum mentes szuszpenzióban (HBSS vagy fiziológiás sóoldatban) adtuk be a letálisan (900cGy) vagy szubletálisan (450, 250, vagy 150cGy) besugárzott diabeteses, valamint kontroll recipiens egerek
36
farokvénájába. (A besugárzás egy dózisban,
137
Cs-forrásból származó, 80
cGy/perc intenzitású γ-sugárzással történt). A transzplantációt az STZ kezelés megkezdése utáni 15. napon végeztük, kivéve azokat a kísérleteket, ahol ezt az Eredmények fejezetben külön jeleztük. 3.4. A mesenchymális őssejtek izolálása, tenyésztése
Az MSC-k izolálását Peister és mtsai (Peister és mtsai 2004) által leírt módszerrel, néhány apróbb módosítással végeztük. A csontvelőt a 3.2. ( „A csontvelői magvas sejtek szeparálása”) pontban leírtakkal megegyezően nyertük ki. A 8-10 hetes hím egerek femurjainak és tíbiáinak velőűrét hideg HBSS oldattal
átmostuk,
majd
–
egy
további
mosás
után
-
komplett
tenyésztőfolyadékban felszuszpendáltuk őket. Az itt használt komplett médium a következőket tartalmazta: DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium /F12, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% foetális borjú szérum (fetal calf szérum = FCS), 5 % ló szérum (Invitrogen), 50 U/ml penicillin, 50 µg/ml streptomycin (Sigma-Aldrich), és 2 mM L-glutamin (Invitrogen). Egy-egy 25 cm2 letapadási felületet nyújtó (T25-ös) tenyésztő edénybe (BD Falcon, Bedford, MA, USA) 7 ml, 2-5x106 sejt/ml-es szuszpenziót pipettáztunk. Az edényeket ezután 72 órára 37 C o-os hőmérsékletű CO2 -termosztátba helyeztük. Az adherens sejteket 3-4 naponként friss tápfolyadékkal (a fenti komplett médiummal) láttuk el, miközben azok osztódtak és lassan benőtték a tenyésztőedény alját. A kultúrákról 3-4 hét múlva - amikor az adherens sejtréteg összefüggővé (konfluenssé) vált eltávolítottuk a tápfolyadékot, majd PBS-ben (phosphate-buffered saline) mostuk. Ezt követően 1 mM EDTA-t (etilén-diamin-tetra-acetát, Sigma-Aldrich) tartalmazó 0,25 %-os trypsinnel (Sigma-Aldrich) 5 percig, 37 C o-on inkubáltuk a tenyészeteket. A trypsin/EDTA inkubáció hatására a sejtek leváltak az edény felszínéről. A trypsines emésztést azonos térfogatú FCS hozzáadásával állítottuk le. Egy ezt követő szérummentes (DMEM/F12 vagy Hank’s) médiumos felöntés és 10 percig tartó, 1200-as percenkénti fordulatszámon végzett centrifugálás (mosás) után egy 75 cm2 -es tenyésztő edénybe (BD Falcon) szélesztettük a sejteket. A későbbi átoltások ehhez hasonlóan történtek. A tenyészetekből a
37
haematopoeticus sejtek (CD45+, CD34+ és /vagy granulocyta-macrophag kolónia képző sejtek) a 6. 7. átoltással teljesen eltűnnek, ugyanis az osztódások során a vérképző sejtek eldifferenciálódtak és elöregedtek. Az elöregedő sejtek nem adherensek, így azokat a tenyésztőfolyadék rendszeres cseréjével hetente kétszer eltávolítottuk. Az egérből így nyert MSC tenyészetek nagyon sokáig – több mint 100 átoltáson keresztül is - fenntarthatók voltak. Legalább 8 alkalommal in vitro átoltottuk a sejteket jellemzésük, illetve transzplantációra történő felhasználásuk előtt. 3.5. A mesenchymális őssejtek jellemzése Áramlási cytométerrel végzett marker-vizsgálatok
A trypsines emésztéssel felszedett MSC-ket 5x105 sejtet tartalmazó mintákra osztottuk. A mintákat sötétben jelöltük egér Sca-1, CD44, CD73, CD90.2,
és
CD34
elleni,
fluorescein
isothiocyanáttal
(FITC),
vagy
phycoerythrinnel (PE) konjugált monoklonális antitesttel, illetve biotinnal konjugált anti-CD3, anti-CD45R/B220, anti-CD11b, anti-Ly-6G, és anti-TER119 monoklonális ellenanyaggal (valamennyi a BD PharMingen, San Diego, CA terméke). Utóbbi esetben második reagensként PE-el jelölt streptavidint (SigmaAldrich) alkalmaztunk. A megfestett sejteket PBS-ben mostuk, majd azonnal analizáltuk FACScan flow cytométerben a Cell Quest software segítségével (Becton-Dickinson. Mountain View, CA). Csont irányú differenciáltatás
Az osteoblast irányú differenciálódás kiváltására Pittenger szerint (Pittenger és mtsai 1999) jártunk el. A konfluens MSC tenyészeteket olyan komplett médiumban tartottuk két héten át, amelyet hydrocortisonnal, βglycerophospháttal,
és
aszkorbinsavval
(valamennyi
a
Sigma-Aldrichtól)
egészítettünk ki. Ennek az ún. osteogén médiumnak a pontos összetétele: DMEM, 10% FCS, 2mM L-glutamin, 10-8 M hydrocortison, 10mM β-
38
glycerophosphat, 50 µg/ml aszkorbinsav, 100 IU penicillin és 50µg/ml streptomicin. A pH (7,2) beállításához NaHCO3-t használtunk. A médiumot a differenciáltatás során is 3-4 naponta cseréltük a tenyészeten. Két hét elteltével a kalcium lerakódások megfigyelésére a tenyészeteket Alizarin Red festékkel (Sigma-Aldrich) festettük meg és inverz mikroszkópban vizsgáltuk (Olympus CK2, Olympus Optical Co., Tokió, Japán). Zsírsejt irányú differenciáltatás
Az adipocyta irányú differencialódás kiváltására Pittenger szerint (Pittenger és mtsai 1999) jártunk el. A konfluens MSC kultúrákat olyan komplett médiumban tenyésztettük két héten át, amelyet dexamethasone-al és 3-isobutyl1-methylxanthine-nal (IBMX) (Sigma-Aldrich) egészítettünk ki. Ennek az ún. adipogén médiumnak a pontos receptje: DMEM/F12, 10% FCS, 10 -7 M dexamethazone, 0,5 mM IBMX, 100 IU penicillin és 50 µg/ml streptomicin. A pH (7,2) beállításához NaHCO3 -t használtunk. A médiumot a differenciáltatás során 3-4 naponta cseréltük a tenyészeten. Ezt követően a sejteket 10%-os formalinban fixáltuk és Oil Red O (SigmaAldrich) festékkel festettük, majd inverz mikroszkópban vizsgáltuk (Olympus CK2). 3.6. A mesenchymális őssejtek transzplantációra történő felhasználása
Az MSC-ket ugyanúgy juttattuk az állatok farokvénáján keresztül a keringésükbe, mint a BMC-ket. A kotranszplantációhoz az előzőleg sejtkultúrában felszaporított MSC-ket a BM grafttal 0,2 ml szérum mentes médiumban (HBSS-ben) összekevertük, majd így adtuk be a recipiens állatoknak. 3.7. Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata
A T-sejt proliferációs méréseket, néhány módosítással, a Horwitz és munkatársai (Horwitz és mtsai 2002) által leírt módon végeztük el.
39
Az APC-k kinyerése
Antigén prezentáló sejteket (antigen-presenting cell = APC) kezeletlen kontroll és STZ-vel kezelt (a kezelés 8. napján) C57Bl/6 nőstény egerek lépéből nyertünk. Az állatok lépét mechanikai módszerrel szétroncsoltuk. Az ezáltal alaposan homogenizált lépsejt szuszpenziót NH4Cl-tartalmú pufferoldattal végzett lizálás útján tisztítottuk meg a vörösvértestektől: 0,01 M TRIS (trishydroxymethyl-amino-metan) és 8,3g/l ammónium klorid 7-es pH-jú steril oldatában, mint hipotóniás lízispufferben 5 percig kezeltük a homogenizátumot. A HBSS oldattal felhígított, majd lecentrifugált sejtek felülúszójával elöntöttük a vörövértestek lizátumát. Az üledékben megmaradt sejteket 0,5 ml, 10% FCS-el kiegészített DMEM-ben reszuszpendáltuk, majd a sejtek Bürker-kamrában történő megszámolását követően úgy állítottuk be a higítást, hogy 107 sejt jusson a szuszpenzió 1 ml-ébe. Ezután 4 órán keresztül, Petri csészékben, 37C o-on inkubálva letapasztottuk az adherens sejteket, köztük az APC-ket. A le nem tapadt sejteket hideg PBS-ben történő többszöri mosással távolítottuk el, míg az adherens sejtekhez a felületről történő mechanikai eltávolítással (lekaparással) jutottunk hozzá. Az ezzel az eljárással nyert, APC-kre nézve feldúsított sejtpopulációt 15 Gy-el sugároztuk be a felhasználás előtt, meggátolva így további esetleges osztódásukat. A T-lymphocyták izolálása
A T-lymphocytákat az STZ-kezelt állatok hasnyálmirigyéből, illetve az előzőleg ovalbuminnal (OVA) (Sigma-Aldrich) immunizált állatok lépéből nyertük a kezeléseket követő különböző időpontokban (ld. az eredményeket bemutató grafikonokon jelölve: 23.ábra). Az OVA kezelés állatonként 10 µg OVA és 1 mg Al(OH)3 intraperitoneális beadását jelentette. Az egyes állatokból kiemelt hasnyálmirigyeket, illetve lépeket külön-külön, mechanikai módszerrel, addig homogenizáltuk, míg a sejteket nem sikerült annyira szeparálni egymástól, hogy egyesével helyezkedjenek el a szuszpenzióban. A sejtek mosása után a Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) anti-T sejt
40
ellenanyaggal
fedett,
mágnesezhető
szemcséinek
segítségével,
a
gyártó
utasításait követve, T-sejtekre nézve feldúsítottuk a szuszpenziót. A sejtosztódás mérése
Az APC-ket és a T-sejteket ezután összekevertük és együtt inkubáltuk úgy, hogy egy 96 lyukú tálca (BD Falcon) minden egyes lyukába 5x104 APC-t és 2x105 Tsejtet tettünk. Ennek során esetenként szolúbilis antigéneket (pancreas szövet kivonata, illetve ovalbumin) is adtunk a tenyészethez. Az inkubálást 72 órán át, 37C o-on folytattuk. Az inkubációs idő letelte előtt 18 órával a tenyészetekhez 1 µCi 3H-timidint adtunk. A sejtek learatása után az S fázison áthaladó sejtek DNS-ébe beépült 3 H-timidin relatív mennyiségét (cpm) folyadékszcintillátorban mértük. Gyógyszeres immunszuppresszió alkalmazása
Egy kiegészítő kísérlet során az állatok az STZ kezelés első napjától számított 10., 17., és 19. napon 10 mg/kg Cyclosporin A-t (Sandimmun) kaptak a bőr alá oltva, melyet a Sandoztól (Novartis Hungaria Kft., Budapest) vásároltunk. 3.8. Mikroszkópos vizsgálatok Szövettan és immunhisztokémia
A hasnyálmirigyből, májból és tüdőből származó szövetmintákat 4%-os, semleges kémhatásúra pufferelt formalinban 3 órán át fixáltuk. Ezután paraffinba ágyaztuk és 5 µm vastagra metszettük. A metszeteket haematoxylin-eosinnal festettük (HE, Sigma-Aldrich). A formalinban fixált szövetekből készült metszeteken immunhisztokémiai vizsgálatokat is végeztünk. Ehhez először eltávolítottuk a paraffint és rehidratáltuk a szöveteket, majd hidrogén-peroxid oldatban
végzett inkubációval
gátoltuk
az
endogén
peroxidáz enzimek
aktivitását. Ezt követően monoklonális egér anti-inzulin IgG ellenanyagot (Sigma-Aldrich) cseppentettünk a metszetekre (1:1000-es higításban) majd 15
41
perc elteltével biotinilált nyúl anti-egér IgG, valamint streptavidinnal konjugált peroxidáz enzimet adtunk. Ezután a metszeteket - a gyártó utasításait követve diaminobenzidinnel (DAB) kezeltük (Peroxidase Kit; Dako, Glostrup, Denmark). Végül a metszeteket hematoxylinnal is megfestettük és kontrasztosítottuk. Ha az első ellenanyagot kihagytuk, nem tapasztaltunk háttérfestődést, tehát az immunhisztokémia valóban inzulin-specifikus volt. Kombinált immunhisztokémia és Y kromoszóma in situ hibridizáció
A hím egyedekből származó, inzulin tartalmú donor sejtek kimutatására, az STZvel kezelt nőstény recipiensek szöveteiben, ugyanazon a metszeten alkalmaztunk Y kromoszóma specifikus fluorescens in situ hibridizációt (FISH) és inzulinra specifikus immunhisztokémiát (Albera és mtsai 2005). A formalinban fixált és paraffinba ágyazott szövetekből készült metszeteket, a paraffin eltávolítását követő rehidratálás után blokkoltuk Tris-pufferben (TBS) oldott zsírmentes tejporral 1 órán át. TBS-el történt mosás után monoklonális egér anti-inzulin IgG ellenanyagot
(Sigma-Aldrich)
cseppentettünk
a
metszetekre
(1:1000-es
higításban). Egy órányi inkubálás után ezt alkalikus foszfatáz enzimmel kapcsolt nyúl anti-egér IgG antitest (Sigma-Aldrich) követte (1:100-as higításban). Az inkubációs idő itt is 1 óra volt. Az alkalikus foszfatáz működését Fast Red (Sigma-Aldrich) festéssel tettük láthatóvá. Negatív kontrollként az első ellenanyagot elhagyva ismételtük meg az eljárást. A következőkben az Y kromoszómák kimutatását az egér Y kromoszóma specifikus próbához kötött fluorescein isothiocyanáttal (FITC) (StarFish Y, Cambio, Cambridge, UK), a gyártók utasításait követve, végeztük el. A metszeteket desztillált vízzel történő mosás után 10 percig, 80 C o-on Nathiocyanátban inkubáltuk, majd 0.1 M-os sósavban oldott 0.4% pepsinnel 10 percig emésztettük. A emésztést glicin oldatban állítottuk le, majd PBS-el mostuk a metszeteket. Ezután 4%-os parafolmaldehidben fixáltuk a mintákat, felszálló alkoholsorban dehidratáltuk, és végül levegőn szárítottuk. Lefedés előtt az előzőleg feloldott StarFish Y próba egy cseppjét juttattuk az így előkészített metszetekre. A fedőlemezeket gumi cementtel rögzítettük, majd egy 60C o-on végzett 10 perces denaturálás után egy éjszakás inkubálás következett 37C o-on.
42
A fedőlemezek eltávolítása után a metszeteket formamid oldatban átöblítettük, és 15 peren át 37C o-os, 1x-es vagy 2x-es töménységű SSC-ben (standard saline citrát) (Invitrogen) mostuk. Ezután 10 perces, 0,05% Tween 20-at (SigmaAldrich) tartalmazó SSC-vel végzett mosás következett 37 C o-on. Az SSC feleslegét PBS-el távolítottuk el. Végül a metszeteket Vectashield médiumban (Vector Lab. Burlingame, CA) 4',6-diamidino-2-phenylindollal (DAPI) festettük. A
reakció
specificitását
egészséges
kontroll
hím
és
nőstény
egerek
hasnyálmirigyének metszeteivel történő összehasonlítás útján ellenőriztük. A metszetek vizsgálatára egy Fview II digitális fényképezőgéppel ellátott, Olympus BX51 epifluorescencia mikroszkópban (Olympus Europa, Hamburg, Germany) került sor. A képeket 40-szeres nagyítással 0,75 NA lencsékkel készítettük és az AnalySIS Pro programmal dolgoztuk fel. A csontvelői chimerizmus követése
A standard citogenetikai eljárásokkal - belértve a hipotóniás KCl oldattal 37C oon, 20 percig tartó inkubációt és a fixációs lépéseket (ecetsav/metanol 1:3) – előkészített csontvelői sejteken fluorescens in situ hibridizáció (FISH) analízist végeztünk. Az egér Y kromoszómára specifikus, rodaminnal jelölt DNS-próbát a Qbiogene-től (Irvine, CA) vásároltuk és a gyártó által javasolt módon alkalmaztuk. A legjobb eredményeket akkor kaptuk, ha a próbát tartalmazó keveréket 73C o-on, 5 percig denaturáltuk. A hibridizációt követően a mosási lépéseket a formamidos eljárással végeztük. Mintánként legalább 50 magot számoltunk meg. 3.9. Statisztikai analízis
A Student-féle t próbát alkalmaztuk a p értékek meghatározására. Az eredményt akkor tekintettük szignifikánsnak, amikor a p értéke kisebb volt, mint 0.05. A Kaplan-Meier módszert használtuk a túlélési adatok megjelenítésére. A kezelések kimenetelének összehasonlítása során a szignifikanciát a Mann-Whitney féle U próba segítségével határoztuk meg.
43
4. Eredmények 4.1. Az 1-es típusú cukorbetegség állatmodelljének kialakítása
A betegséget kis mennyiségű – összesen 50mg/kg – streptozotocin (STZ) ismételt intraperitoneális adásával idéztük elő felnőtt, C57Bl/6 nőstény egerekben. Az STZ kémiailag glükózamin-nitrozóurea. Mint alkalikus nitrozóurea főleg a DNS-t teszi tönkre. A glükózamin része pedig hasonlít annyira a glükózra, hogy egy glükóz transzport proteinen keresztül bejusson a sejtbe. Főleg a GLUT2 transzporter hajlamos glükózként kezelni az STZ-t. Ebből a transzporterből a szervezet többi sejtjéhez viszonyítva igen sok van éppen a β-sejteken. Így az STZ célzottan és belülről roncsolva pusztítja a β-sejteket. Közben olyan antigének kerülnek a felszínre, amelyek autoimmun folyamatokat indítanak el. Ezért alkalmas ez a módszer az 1-es típusú, vagy autoimmun diabetes modellezésére. (Like és Rossini 1976, Reusser 1971) A betegség kialakulását a vércukorszint emelkedésének, a szérum inzulinszint csökkenésének, és a testsúly csökkenésének mérésével követtük nyomon. Az összehasonlító szövettani és az immunhisztokémiai vizsgálatok további bizonyítékkal szolgáltak az STZ kezelés miatt bekövetkező β-sejt pusztulásra nézve. Az STZ kezelés megkezdésétől számított 7.nap után kezdődött vércukorszint emelkedést a 35.napig követtük nyomon. Ekkor már 4-5-ször magasabb reggeli vércukorértékeket (24.91+3.93 mM) mértünk a cukorbeteggé vált egereknél a kezeletlen állatokban mért értékekhez (5.71+0.42 mM) viszonyítva, ami egyértelműen súlyos hyperglycaemiás állapotot jelent (5.a.ábra). A vércukorszint emelkedés mellett nyomon követtük a szérum inzulinszint drasztikus csökkenését (5. b ábra), mely nyilvánvalóan a hyperglycaemiás állapot kialakulásáért közvetlenül okolható. A vércukorszint emelkedés és a szérum inzulinszint csökkenés – a diabetes pathomechanismusának megfelelően - együtt járt a testsúly fokozatos csökkenésével (5. c ábra).
44
0
14
28
42
5. ábra. A diabetes kialakítása (vércukorszint, szérum inzulinszint, testsúly követése)
A sterptozotocin (STZ) kezelést követően az állatok vércukorszintje jelentősen megnőtt (a ), aminek hátterében a szérum inzulinszintjének csökkenése (b ) állt. Ezzel párhuzamosan az állatok testsúlya jelentősen csökkent (c). (n >10 mellett az átlagokat és a szórást ábrázoltuk.)
45
Az egészséges
(6. a ábra) és
cukorbeteg (6.
b ábra) állatok
hasnyálmirigyeiből készült szövettani metszetek összehasonlító vizsgálatát a 21. napon
végeztük
el.
A
cukorbeteg
állatok
pancreasában
megfigyeltük
a
Langerhans-szigetek jelentős méretbeli csökkenését, valamint azt is, hogy a még megmaradt szigetsejtek is erősen piknotikus magvúakká váltak, ami a szintetikus folyamatok visszaszorulására illetve a sejtek tömeges pusztulására utal.
6. ábra. A diabetes kialakítása (szövettani metszet)
Haematoxylin eosinos festéssel készült pancreas metszeten jól látszanak a világosabbra festődő Langerhans-szigetek, melyeket a sötétebbre festődő exocrin területek, az acinusok és ductusok vesznek körül. Megfigyelhetőek a kontroll állat (a ) és az STZ kezelésen átesett állat (b ) szigetei közötti méret-, szerkezet-, és festődésbeli különbségek. Lépték: 20 µm Emellett az inzulintermelő β-sejteket célzó, tehát inzulinra specifikus immunhisztokémiai festést is végeztünk. Ez az eljárás megmutatta, hogy a cukorbeteg egerekben (7. b ábra) az egészséges kontroll állatokhoz képest (7. a ábra), már csak elenyésző számban találhatóak inzulin-pozitív sejtek.
46
7. ábra. A diabetes kialakítása (immunhisztokémia)
A peroxidáz enzimmel jelölt anti-inzulin ellenanyaggal végzett immunhisztokémia jól mutatja az inzulin-termelés drasztikus csökkenését a kezelt állatokban, amit láthatóan az inzulin-termelő sejtek pusztulása okoz. Megfigyelhető a kontroll állat (a ) és az STZ kezelésen átesett állat (b ) inzulinra nézve pozitív β-sejtjeinek jelentős számbeli eltérése. Lépték: 20 µm Az
STZ
β-sejteket
pusztító
hatásának
további
bizonyítéka,
hogy
inzulinkezelés, vagy más terápia nélkül a beteg állatok a 4.-6. héten - a szénhidrátanyagcsere súlyos zavara következtében - elpusztultak (9. ábra).
4.2. A csontvelő-transzplantáció hatása a diabetes progressziójára és a beteg állatok túlélésére
Miután a felnőtt, nőstény C57Bl/6 egerekben, STZ kezeléssel diabetest idéztünk elő, első kérdésünk az volt, hogy frissen szeparált csontvelői eredetű – elsősorban vérképző – ős- és progenitor sejtek transzplantációjával lassítható-e a diabetes progressziója, illetve gyógyítható-e a betegség. A csontvelői sejtek beadása előtt a recipiens állatok vérképző rendszerét legalább részlegesen károsítani kell ahhoz, hogy legalább átmenetileg befogadják a
47
donor sejteket. Károsítás nélkül a graft sejtjei néhány nap alatt eltűnnének a recipiens szervezetéből és nem lenne idejük annak a hatásnak a kifejtésére, amit tanulmányozni szeretnénk. Az állatok túlélése és a későbbiekben lehetséges humán terápiás felhasználás miatt meg kellett találnunk a károsításnak azt a legkisebb mértékét, amely kísérleteink szempontjából még hatásos, de az állatok számára a legkevésbé ártalmas, túlélési esélyeiket a lehető legcsekélyebb mértékben befolyásolja. A károsítást az egész testre kiterjedő röntgen besugárzással (total body irradiation = TBI) valósítottuk meg, mely főleg az osztódó sejteket károsítja, ezért a csontvelőre is pusztító hatással van. A besugárzás és transzplantáció optimális időpontját úgy választottunk meg, hogy a vércukorszint és szérum inzulinszint változások alapján már biztosak lehettünk a cukorbetegség kialakulásában. Ez akkor következett be, amikor az állatok vércukorszintje 2 egymást követő napon (a 14. és 15. nap) - elérte, vagy meghaladta a 10 mmol/l értéket. Az STZ kezelés megkezdésétől számított 15. napon tehát a cukorbeteg állatokat egész test besugárzásnak tettük ki. A legkisebb hatásos dózis meghatározása végett az egész test besugárzást az egyes állatcsoportoknál különböző dózisokban alkalmaztuk: 900, 450, 250, vagy 150 centiGray (cGy). A 900 cGy jelenti a C57Bl/6 egerek számára a letális, csontvelőhalált okozó dózist, ami teljes myeloablatiót idéz elő, vagyis ezt követően csontvelő-transzplantáció nélkül az állatok hamarosan elpusztulnának a vérképző rendszer hiánya miatt. A 450, 250 ill. a 150 cGy-el végzett besugárzás szubletális dózist jelent, amit követően a csontvelő saját sejtjeiből gyorsan képes regenerálódni. A TBI után közvetlenül 106 magvas csontvelői sejtet (bone marrow cell = BMC) adtunk intravénásan a cukorbeteg állatoknak, melyeket szingén C57Bl/6 hím állatok combcsontjából és sípcsontjából frissen szeparáltunk. A csontvelőtranszplantációs kísérletek vázlata a 8. ábrán látható.
48
C57Bl/6 Szingén BMC transzplantáció a 15.napon
TBI 150-900 cGy
C57Bl/6 Túlélélés ? Vércukorszint ? Szérum inzulinszint ?
STZ kezelés (1-5. napon, 50 mg/kg/ ip.)
8. ábra. A csontvelő-transzplantációs kísérletek menete
C57Bl/6 nőstény egerek STZ kezelése, majd a TBI-t követő szingén csontvelőtranszplantáció. Vizsgáltuk a kezeléseken átesett állatok túlélését, követtük vércukor és szérum inzulinszint értékeiket. Rövidítések: STZ = streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői magvas sejtek), TBI = total body irradiation (egész test besugárzás), i.p.: intraperitoneális (hasüregbe adott injekció)
A legmagasabb dózisú, letális TBI-t (900cGy) kapott cukorbeteg állatok mindegyike – az azonnali csontvelő transzplantáció ellenére – hamarosan elpusztult, noha az azonos dózissal besugárzott és transzplantált, de egészséges kontroll állatok 6 hónapnál is tovább éltek (9. és 10. b, f ábra), vagyis a transzplantáció során technikai hiba nem történt. A pusztulás hátterében az állhat, hogy a cukorbeteg állatok nem bírták elviselni az erős méreg (STZ) és a 900 cGy dózisú TBI együttes toxikus hatását. A legalacsonyabb TBI (150cGy) alkalmazása, majd az azt követő transzplantáció – a mért vércukorszint értékek emelkedésének tekintetében – nem idézett elő különbséget a besugározatlan, transzplantálatlan, de szintén cukorbeteg
49
állatokéhoz képest. Mivel a transzplantációs kezelés nem volt hatással a cukorbetegség lefolyására, az állatok hamarosan elpusztultak. (9. és 10. a, e ábra). A vércukorszint értékek emelkedése azonban átmenetileg megállt, vagy legalábbis lelassult azokban az esetekben, amikor a cukorbeteg egereket a közepes dózisú besugárzással (250 vagy 450cGy) kezeltük a csontvelő-transzplantáció előtt (10. d, c ábra). Ennek ellenére nem állt véglegesen helyre a vércukorszint, sőt 2-3 hét múlva gyors emelkedésnek indult és valamennyi egér elpusztult a transzplantációt követő 8.-10. héten. A mérsékelt dózisú (250 vagy 450cGy), szubletális besugárzást követő csontvelő-transzplantáció tehát átmenetileg lassítja ugyan az STZ kezelt egerek vércukorszintjének emelkedését és túlélési idejüket is meghosszabbítja 10-14
Élő állatok száma
nappal, de tartós hatása nincs a diabetes alakulására. STZ 6 STZ
5
STZ+900 cGy+BMC STZ+450 cGy+BMC STZ+250 cGy+BMC STZ+150 cGy+BMC
4 3
900 cGy+BMC
2
0
14
28
42
56
70
84
180
Túlélés (napok) 0
9. ábra. Eltérő mértékű besugárzásnak kitett, majd transzplantált kísérleti állatok túlélése
Látható, hogy a cukorbeteg állatok közül azok élnek a legtovább, amelyek közepes dózisú (450 ill. 250 cGy) besugárzást és BMC transzplantációt kaptak. (n=6) Rövidítések: STZ = streptozotocin kezelés megindításának időpontja, Tr = 106 frissen szeparált,
szingén
csontvelői
magvas
sejttel
transzplantáció időpontja
50
(bone
marow
cell=BMC)
történő
a
b
900 cGy 106 BMC
Idő (hetek)
150 cGy 6
10 BMC
Idő (hetek)
Idő (hetek)
900 cGy
Vércukorszint mM/l
10 BMC
f
Vércukorszint mM/l
6
106 BMC
Idő (hetek)
e 250 cGy
450 cGy
Idő (hetek)
d Vércukorszint mM/l
Vércukorszint mM/l
Vércukorszint mM/l
Vércukorszint mM/l
c
106 BMC
Idő (hetek)
10.ábra. Eltérő mértékű besugárzásnak kitett, majd transzplantált kísérleti állatok vércukorértékeinek alakulása (magyarázat a következő oldalon)
51
10. ábra. Az eltérő mértékű besugárzásnak kitett, majd transzplantált kísérleti állatok vércukorértékeinek alakulása a : Az állatokat csak STZ-vel kezeltük (n=6) b-e: A cukorbeteg (STZ kezelt)
állatokat (n=6) a 15. napon 106 BMC-vel transzplantáltuk, miután 900 cGy (b ), 450 cGy (c), 250 cGy (d ) és 150 cGy (e) egésztest besugárzásnak (TBI) tettük ki őket. f: Nem cukorbeteg egereket 900 cGy TBI-t követően 106 BMC-vel transzplantáltunk (n=3). Minden szimbólum egy-egy állatot reprezentál. A szimbólum eltűnése a diagramról az adott állat halálát mutatja. Az adatokat két független kísérlet eredményeiből nyertük. Rövidítések: STZ = streptozotocin kezelés megindításának időpontja, Tr = 106 frissen szeparált, szingén csontvelői magvas sejttel (bone marrow cells = BMC) történő transzplantáció időpontja
4.3. Egér mesenchymális őssejtek (MSC-k) karakterizálása és differenciáltatása
A szingén (C57Bl/6), szemiallogén ((C57Bl/6xDBA/2)F1) és allogén (CD1 és CD1-TgEGFP) hím állatok csontvelői sejtjei közül izoláltuk a plasztik adherens sejteket (ld. 3.4. alatt), majd a nyolcadik átoltás után karakterizáltuk azokat. A sejtek
fenotípusának
vizsgálata
a
sejtfelszíni
antigének ,
mint
markerek
expressziója alapján áramlási cytométerben történt. A műszeres mérés előtt a jellegzetes MSC markert (Sca-1) és a vérképző sejtfejlődési sorok tipikus markereit (CD3, CD45R/B220, TER-119, GR-1, és11b) fluoreszkáló (fluorescein isothiocyanáttal vagy phycoerythrinnel-jelzett) monoklonális ellenanyagokkal jelöltük. Mint az a 11. ábrán látható a kultúrában felszaporított adherens sejtek több mint 95%-ban pozitívak voltak az MSC-kre specifikus markerre (Sca-1), de negatívak a többi csontvelői vérképző sejtfejlődési sor differenciációja során megjelenő markerekre. Izolált
és
felszaporított
sejtek
jellemzéséhez
hozzá
tartozott
még
morfológiájuk megfigyelése és leírása. A 12.a ábrán láthatóak a Giemsával
festődő, kissé nyúlványos, adherens sejtek, melyek ebben a közel konfluens tenyészetben még éppen megfigyelhető jellegzetes koncentrikus csoportokban helyezkednek el. Ezeket a csoportosulásokat az osztódást követően együtt maradó sejtek képezik.
52
a
b
Kontroll
Kontroll CD3 CD45R TER-119 GR-1 CD11b
Sca-1 95%
11. ábra. Az MSC-k karakterizálása sejtfelszíni markereik alapján a: a sejtek erősen pozitívak az Sca-1 MSC specifikus markerre b: a sejtek
negatívak a CD3, CD45R, TER-119, Gr-1, CD11b, vérképző sejtfejlődési sorokra jellemző markerekre. Az egyes ellenanyagokat egyenként vizsgáltuk, negatív kontrollként azonos izotípusba tartozó, de indifferens (nem specifikus) ellenanyagot használtunk.
Az MSC tenyészetek további lényeges jellemzője még plaszticitásuk , vagyis az a képességük, hogy a külső körülmények függvényében képesek tulajdonságaikat
megváltoztatni.
A
komplett
tenyésztő
médiumban
tartott
tenyészetekben a stromasejtek, köztük az őssejtek és leszármazottaik is osztódnak és differenciálódnak. Az újonnan keletkező sejtek folyamatosan és spontán fibroblast-szerű sejtekké differenciálódnak, melyek idővel elöregszenek és elpusztulnak. A leglassabban az őssejtek öregszenek el és ezek a leginkább multipotensek is. Úgy is mondhatjuk, hogy ezek a legfiatalabbak. A tenyészetek alakíthatósága a bennük lévő őssejteknek köszönhető. A tenyészetek plaszticitását, vagyis
őssejtjeinek
multipotenciáját
csont
és
zsírsejt
irányba
történő
eldifferenciáltatásukkal igazoltunk. A 8. átoltás után a sejteket 14 napig osteogén ill. adipogén médiumban tartottuk. A médium eltávolítása után a tenyészeteket megfestettük. Az alizarinvörös festést elterjedten használják az extracelluláris mátrix csontképződést megelőző - kalcifikációjának kimutatására. Alizarin vörös
53
festékkel megfestve az előzőleg osteogén médiumban tartott kultúrát, a sejtek között vörösre festődő kalcium lerakódásokat figyelhettünk meg, melyek az osteoblasttá differenciálódott sejtek működését bizonyítják (12. b ábra). Az olajvörös festék ismert módon vörösre színezi a zsírsavakat és a triglicerideket. A két hétig adipogén médiummal kezelt sejtekben található olajvörössel festődő vezikulumok nyilvánvalóan lipidcseppek, melyek jelenléte az adipocytává történt differenciálódás bizonyítéka (12. c ábra).
12. ábra. Az MSC- karakterizálása morfológiájuk és plaszticitásuk alapján a : A komplett tenyésztő médiumban tartott szubkonfluens MCS kultúra sejtjei a 8.
átoltás után Giemsával festve. (Eredeti nagyítás: 10x) b: A két hétig osteogén médiumban tartott MSC-k osteoblastokká differenciálódtak: alizarinvörössel festve kalcium lerakódásokat látunk a sejtek között. (Eredeti nagyítás: 10x) c: A két hétig adipogén médiumban tartott MSC-k adipocytákká differenciálódtak: bennük nagy számban zsírcseppek halmozódtak fel, melyeket olajvörös festéssel tettünk láthatóvá. (Eredeti nagyítás: 20x)
54
4.4. A mesenchymális őssejtek és a csontvelői vérképző sejtek sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában
A szakirodalom szerint a szingén vagy allogén MSC-k képesek többféle sérült szövettípus regenerálására (Krampera és mtsai 2006, Chamberlain és mtsai 2007, Caplan, Dennis 2006). Azt kívántuk megvizsgálni, hogy vajon az MSC-k önmagukban, vagy nem frakcionált csontvelői magvas – elsősorban vérképző sejtekkel (BMC-kel) együttműködve képesek-e a pancreas endocrin működésének helyreállítására. Ezért az STZ-vel kezelt állatokat – a legkisebb, még hatásosnak bizonyult - 250 cGy szubletális dózissal egész test besugárzásnak tettük ki. Ezt követően az állatok intravénásan – a farokvénájukon keresztül - MSC-ket kaptak, vagy különböző mennyiségekben MSC-ket és BMC-ket egyszerre juttattunk a keringésükbe. A BMC-k minden esetben C57Bl/6, tehát szingén hím donorból származtak, míg az MSC-k lehettek szingén, szemiallogén, vagy allogén eredetűek. A szemiallogén MSC-ket (C57Bl/6xDBA/2)F1 hím egerekből izoláltuk. Az allogén MSC-k vagy CD1 egerekből, vagy – a még jobb követhetőség végett - ugyanennek az egértörzsnek zöld fluoreszkáló fehérjére (enhanced green fluorescent proteinre = EGFP) nézve transzgenikus hím egyedeiből (CD1-TgEGFP) származtak. A kísérletek összefoglaló vázlata a 13. ábrán látható. A cukorbeteg állatok vércukorszintje és szérum inzulin koncentrációja a 15. napon, 250 cGy TBI-t követően beadott 5x105 - 106 BMC és legalább 5x104 – de még jobb, ha 105 – szemiallogén MSC hatására gyorsan visszatért a normális szintre (14. a, b, e ábra). Ezek az egerek több mint 16 hétig éltek inzulin-kezelés nélkül, tehát a gyógyulás teljesnek és véglegesnek tekinthető (16. ábra). Ha a 106 BMC adása mellett lecsökkentettük a beadott MSC-k mennyiségét 2.5x104 -re, akkor a vércukor és a szérum inzulin szintek normalizálódásában mutatkozó gyógyító hatás megszűnt (14. c). Ha az optimális MSC mennyiség (105/állat) mellett a BMC-k számának csökkentésével próbálkoztunk, akkor 2x105 sejtszámnál már szintén megszűnt a gyógyító hatás (14. f). Önmagukban sem az MSC-k (2x105 ), sem a BMC-k (106 ) nem voltak hatással a magas vércukorszintre
55
(14. d, 10. d ábra) és az alacsony szérum inzulinszintre (15. b, c ábra) illetve az állatok túlélésére (16., 9. ábra). A 16. és 17. ábra összefoglalóan bemutatja az állatok túlélését (ill. a gyógyulást jelentő tartós túlélését is) a különböző sejtszámok alkalmazása esetén. Először 106 BMC adása mellett az MSC-k mennyiségét változtattuk, illetve egyik esetben csak MSC-kkel transzplantáltunk (16. ábra). Majd az optimálisnak bizonyult 5x104 MSC adása mellett a BMC-k mennyiségét változtattuk (17. ábra). Itt is jól látható, hogy a tartós gyógyuláshoz legalább 5x104 MSC és 106 BMC együttes transzplantációja kellett.
Szingén BMC
Allogén MSC
C57Bl/6
kotranszplantáció a 15.napon
BMC
In vitro kultúra TBI 250 cGy
C57Bl/6
(C57Bl/6xDBA/2)F1, CD1 CD1-TgEGFP
Túlélélés? Vércukorszint? Szérum inzulinszint? Immunhisztokémia? FISH? EGFP?
STZ kezelés (1-5. napon, 50 mg/kg/ip.)
13. ábra. A BMC-k és az MSC-k együttes transzplantációjának vázlata
A kétféle sejttípust az STZ kezelés megkezdésétől számított 15. napon, 250cGy TBI-t követően, a farokvénán keresztül juttattuk az állatok keringésébe, majd a felsorolt vizsgálatokat végeztük el. Rövidítések: STZ = streptozotocin, i.p.: intraperitoneális (hasüregbe adott injekció), BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek) TBI = total body irradiation (egész test besugárzás), FISH = fluorescent in situ hibridisation, EGFP = enhanced green fluorescent protein
56
14. ábra. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) és a csontvelői sejtek (BMC-k) sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában
(folytatás és magyarázat a következő oldalon)
57
250cGy 5x105 BMC 105 MSC
250cGy 2x105 BMC 105 MSC
14. ábra. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) és a csontvelői sejtek (BMC-k) sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában
Az STZ kezelés első napjától számított 15. napon, 250 cGy TBI-t követően beadott 106 szingén BMC és 105 (a ) vagy 5x104 (b ) MSC együttes transzplantációja normalizálja a vércukorszintet és tartós gyógyulást eredményez. A 2.5x104 MSCvel végzett kotranszplantáció már nem elegendő a gyógyuláshoz (c), míg önmagukban alkalmazva az MSC-k semmilyen hatással nincsenek a vércukorszint alakulására, még akkor sem, ha 2x105 számban alkalmazzuk azokat (d ). Ha az optimálisnak bizonyult MSC-k adása mellett lecsökkentjük a BMC-k számát, szintén a gyógyító hatás megszűnését tapasztalhatjuk (e), (f). Az MSC-ket C57Bl/6xDBA/2F1 hím egerekből nyertük (n=6). Minden szimbólum egy-egy állatot reprezentál. A szimbólum eltűnése a diagramról az adott állat halálát jelenti. Rövidítések: STZ= streptozotocin, Tr = a (ko)transzplantáció időpontja, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek),
58
15. ábra. A cukorbeteg egerek szérum inzulin-szintje normalizálódott a BMCkel és MSC-kel végzett kotranszplantációt követően a : 106 BMC-vel és 105 MSC-vel b: csak 106 BMC-vel c: csak 105 MSC-vel végzett transzplantáció
Az adatok az átlagokat és a szórásokat mutatják. ( n = 9)
59
Tr
Élő állatok száma
STZ 6 5 4
STZ+TBI+106BMC+105MSC
3
STZ+TBI+106BMC+5x104MSC STZ+TBI+106BMC+2.5x104MSC
2
STZ+TBI+2x105MSC
1 0
14
28
42
56
70
84
180
Idő (napok)
16. ábra. A különböző számú MSC-vel transzplantált kísérleti állatok túlélése
106 BMC adása mellett az MSC-k mennyiségét változtattuk, illetve egyik esetben csak MSC-kel transzplantáltunk. Látható, hogy a tartós gyógyuláshoz 106 BMC és legalább 5x104 MSC együttes transzplantációja kellett. (n=6)
Élő állatok száma
STZ
Tr
6 5 4 3 STZ+TBI+5x104MSC+106BMC STZ+TBI+5x104MSC+5x105 BMC STZ+TBI+5x104MSC+2x105 BMC
2 1
0
14
28
42
56
70
84
180
Idő (napok) 17. ábra. A különböző számú BMC-vel transzplantált kísérleti állatok túlélése
5x104 MSC adása mellett a tartós gyógyuláshoz legalább 5x105 BMC egyidejű transzplantációja is kellett. (n=6) Rövidítések: STZ = streptozotocin kezelés megindításának időpontja, Tr = transzplantáció időpontja, TBI = total body irradiation (egész test besugárzás)
60
Az optimális számban történő alkalmazás esetén, a kétféle sejttípusnak a diabetes gyógyításában kifejtett sikeres együttműködését bizonyítják a gyógyult állatok glükóz tolerancia tesztjeinek a kontrollokéhoz nagyon hasonló eredményei is (18. ábra). További megerősítő bizonyítékként szolgált a hasnyálmirigy metszeteken vizsgált inzulin pozitív sejtek jelentős számbeli növekedése (19. c ábra). A regenerálódott szigetek mérete és inzulintermelése csaknem elérte az egészséges kontrollok metszeteiben megfigyelhetőt (19. a. ábra). Megvizsgáltuk még azt is, hogy nem találhatóak-e inzulin pozitív sejtek más szervekben is, de sem a májban, sem a lépben, sem a tüdőben, sem a
Vércukorszint (mM/l)
csontvelőben nem találtunk ilyeneket (az eredményeket nem mutatjuk).
Kontroll STZ (4. hét) STZ/BMT+MSC (12. hét)
30
20
10 C57/Bl/6 2 g/kg glukóz ip.
0
30
60 90 Idő (percek)
18. ábra Glükóz tolerancia teszt
Az előzőleg éheztetett állatok 2g/kg glükózt kaptak intraperitoneálisan, majd a jelzett időpontokban mértük a vércukorértékeket. Barna oszlopok: egészséges kontroll állatok értékei Kék oszlopok: STZ indukálta diabetesben szenvedő állatok értékei Piros oszlopok: 5x104 MSC és 106 BMC együttes transzplantációját követő 12. héten mért glükóz tolerancia teszt értékek Az adatok az átlagokat és a szórásokat mutatják ( n = 15)
61
19. ábra. Anti-inzulin ellenanyaggal végzett immunhisztokémia
Megfigyelhető a kontroll állat (a ) és az STZ kezelésen átesett állat (b ) inzulinra nézve pozitív β-sejtjeinek jelentős számbeli eltérése. A kotranszplantált, gyógyult állatok (c) Langerhans-szigeteinek mérete és inzulintartalma a 12. héten csaknem azonos mértékű a kontrollokéval. Lépték: 20 µm Az eredményeket nem befolyásolta az alkalmazott MSC-k genetikai háttere. Akár szingén (hím C57Bl/6 egerekből nyert), akár allogén (hím CD1 vagy CD1TgEGFP) egérből nyert MSC-ket használtunk a transzplantációhoz, éppúgy együttműködtek a BMC-kel a kísérletesen előidézett diabetes gyógyításában, mint a szemiallogén MSC-k (1.táblázat). 1. táblázat. Az MSC-k genetikai háttere nem befolyásolja a gyógyulás esélyeit Mesenchymális őssejt forrás
C57Bl/6 (C57Bl/6xDBA/2)F1 CD1 CD1-TgEGFP
Gyógyult állatok száma/ kotranszplantált állatok száma 10/11 35/37 7/7 9/9
A transzplantáció időpontja azonban jelentősen befolyásolta a betegség kimenetelét. Ha a transzplantációt az STZ kezelés megkezdésétől számított 8. napon végeztük, akkor 9-ből 6 állat élt még több mint 20 héttel is a beavatkozás után. Amennyiben a transzplantáció a 15. napon történt, valamennyi - 9-ből 9 állat túlélt. A 22. napon transzplantált 9 állatból már csak 2 gyógyult meg, míg a 29.napon transzplantáltak egyikén sem segített a beavatkozás.
62
4.5. A kotranszplantációt követő gyógyulás mechanizmusának vizsgálata A gyógyulás nem a donor BMC-k, vagy MSC-k inzulin-termelő β-sejtté való transzdifferenciálódásának köszönhető
A továbbiakban azokat az állatokat vizsgáltuk, amelyeket az STZ kezelés első napjához viszonyított 15. napon 250 cGy TBI-nek tettünk ki, majd 106 BMCvel és 105 MSC-vel transzplantáltunk és meggyógyultak. A gyógyult egerek új β-sejtjei elméletileg kialakulhattak akár endogén, vagy akár donor eredetű sejtekből is. A hasnyálmirigy metszeteken Y kromoszómára specifikus fluorescens in situ hibridizáció (FISH) analízist, valamint inzulinra specifikus immunfestési eljárást egyidejűleg alkalmaztunk. A FISH próba specificitását és transzplantációs kísérletekben való alkalmazhatóságát korábbi munkánkban már igazoltuk (Kertész és mtsai 2006). A donor eredetű sejteket megmutató FISH-próba és a β-sejteket jelölő immunfestés együttes alkalmazásával kívántuk eldönteni, hogy a donor BMC-k és/vagy MSC-k szolgáltak-e kiindulási sejtként az új inzulin-termelő sejtek létrejöttéhez, vagy a recipiens saját sejtjei. A mérés validáláshoz egészséges hím kontroll egerek hasnyálmirigy metszeteit használtuk. Ezeken a metszeteken mind az acinus, mind a szigetsejtek magjain egyértelműen látszott az Y kromoszómák pontszerű, zölden fluoreszkáló festődése (20. a ábra). A cukorbeteg nőstény recipiensek esetében a FISH analízist, a BMC és MSC transzplantációt követő 2. (20. b ábra) és a 82. (16. c ábra) napon végeztük el. Az eredmény egyértelműen negatív lett, több mint 200 vizsgált metszetből egyetlen-egyen sem igazolódott hím eredetű (Y kromoszóma pozitív) sejtek jelenléte a regenerálódó hasnyálmirigyben. A donor eredetű MSC-k kimutatása a recipiensekben még akkor sem volt lehetséges, ha amellett, hogy a donor ellenkező nemű még zöld fluorescens fehérjére (enhanced green flourescence protein = EGFP) transzgenikus is volt (CD1-TgEGFP). A recipiens hasnyálmirigyében egyetlen zölden fluoreszkáló sejtet sem találtunk. Az eredmények tehát egyértelműen azt igazolják, hogy az új β-sejtek recipiens és nem donor eredetűek.
63
20. ábra. A donorsejtek nem mutathatók ki a recipiensek regenerálódó Langerhans-szigeteiben
sejtmagok: kékek (DAPI) / inzulin: vörös (immunhisztokémia) / Y-kromoszómák: zölden fluoreszkálnak (FISH) a : egészséges hím C57Bl/6 egér pancreas metszete (mint pozitív kontroll) b: STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egér pancreas metszete a kotranszplantáció 2.
napján c: STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egér pancreas metszete a kotranszplantáció 84.
napján Lépték: 100 µm Bizonyos azonban, hogy a donor-eredetű BMC-k és/vagy MSC-k eljutottak (homingoltak) a recipiens csontvelőbe, mert ott Y-kromoszómát tartalmazó sejteket találtunk. A csontvelő chimerizmusa (kevert jellege) a transzplantációt követő 10. napon volt a legkifejezettebb (6-12% donor eredetű sejtet számoltunk meg a recipiens csontvelőben), majd ezután gyorsan csökkent (21. a ábra). Miközben a donor eredetű sejtek eltűntek, a magvas sejtek összmennyisége fokozatosan nőtt (21. b ábra), ahogy a csontvelő regenerálódott a recipiens saját sejtjeiből. Nem találtunk zöld fluoreszkáló fehérjét expresszáló MSC-ket a transzplantált állatok csontvelejében, perifériás vérében, májában, tüdejében és lépében sem.
64
21. ábra. Csontvelői chimerizmus az STZ kezelt, majd kotranszplantált állatokban a : A donor sejteket Y-kromoszóma specifikus FISH analízissel mutattuk ki és
számoltuk meg a recipiens csontvelejében. Látható, hogy a chimerizmus a transzplantációt követő 10. napon a legkifejezettebb. Minden szimbólum egy-egy állat adatát jelképezi (n=5) b: A magvas csontvelői sejtek száma gyorsan nő a recipiens állatok femurjában.
Az adatok az átlagokat és szórásokat mutatják (n=5). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a befogadó szervezetben aktiválódott, endogén regeneratív folyamatok eredményezték a hasnyálmirigy inzulin-termelő sejtjeinek visszatérését, valamint a vércukorszint és a szérum inzulin-szint normalizálódását. Meg kell jegyeznünk, hogy a máj, a lép, a gyomor, a belek, a tüdők, és a csontvelő alapos vizsgálatával sem találtuk neoplasztikus elváltozás jeleit a szingén BMC-kel és a szingén vagy allogén MSC-kel transzplantált egerekben.
65
Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ
A β-sejtek STZ-vel történő direkt roncsolásának következtében autoreaktív T-sejtek aktiválódnak a kísérleti állatokban, melyek tovább rombolják a szigeteket (Like és Rossini 1976, Paik és mtsai 1980). Ugyanakkor az MSC-k T-sejt választ gátló immunszuppresszív hatásáról is többen beszámoltak (Gerdoni 2007, Zappia 2005, Augello 2007). Ezért arra a következtetésre jutottunk, miszerint lehetséges, hogy az MSC-k, a β-sejt specifikus immunválasz gátlásával (is) hozzájárulnak a szigetek integritásának endogén helyreállításához. Hipotézisünk bizonyítására a 22.ábrán látható kísérletet terveztük meg. Ennek során a cukorbeteg egerek hasnyálmirigyeiből T-sejteket izoláltunk. Külön vizsgáltuk a csak BMC-kkel, a csak MSC-kkel (23. d. és c ábra), valamint a kettő kombinációjával (23. b ábra) transzplantált, és a nem transzplantált (23. a ábra) állatok hasnyálmirigyéből származó T-sejteket. Ugyancsak STZ-vel kezelt állatok lépéből antigén bemutató sejteket (antigen presenting cell = APC) izoláltunk. Ezek az APC-k csak azokat a pancreasból származó, autoreaktív T-sejteket késztették intenzív proliferációra, amelyek a nem transzplantált (23. a ábra), vagy a csak BMC-kkel transzplantált állatokból származtak (23. c ábra). Ezzel szemben az akár kizárólag MSC-kkel (23. d ábra), vagy akár BMC-kkel együtt adott (23. b ábra) MSC-kkel transzplantált állatok T-sejtjeinek proliferációja egészen csekély mértékű volt. Amint azt az előzőekben bemutattuk az MSC-ket önmagukban adva nem érhető el gyógyulás, tehát az MSC-knek köszönhető immunszuppresszió szükséges, de önmagában nem elegendő a gyógyuláshoz. A két sejttípus együttes adása hozza csak meg a kívánt eredményt a β-sejt funkció tartós helyreállásában és az állatok diabetesből történő felgyógyulásbában. Emellett szól az is, hogy Cyclosporin A (CsA) adagolásával (10mg/testsúly kg, a 10. 17. és a 19.napon), mely erős immunszuppresszív szer, az MSC-k nem helyettesíthetők kísérleti rendszerünkben.
66
BMC
Autoreaktív T-sejtek proliferációja
MSC In vitro kultúra
C57Bl/6 3
Transzplantáció a 15. napon
H-timidin
TBI 15. nap, 250 cGy
15 Gy T-sejtek a pancreasból Lép APC-k (a 8. napon)
C57/Bl/6 C57Bl/6
STZ kezelés
STZ kezelés
22. ábra. Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata (Az STZ-kezelt
állatok pancreasában található β-sejt specifikus T-sejtek kimutatására szolgáló kísérletek vázlata) Az STZ-vel kezelt állatok lépéből, a pusztuló β-sejtekből felszabaduló saját antigéneket bemutató adherens sejteket nyertünk ki. Ezek a sejtek felhasználhatóak voltak a β-sejt specifikus, autoreaktív T lymphocyták proliferációjának kiváltására. A proliferációt triciált timidin felvételének mérésével követhettük nyomon. Rövidítések: STZ = streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek), TBI = total body irradiation (egész test besugárzás) APC = antigén presenting cell (antigén bemutató sejt)
67
23. ábra. Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ (magyarázat a
következő oldalon)
68
23. ábra. Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ a:
STZ-vel kezelt, de nem transzplantált állatok pancreasából származó T-sejtek
β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata b:
STZ-vel
kezelt, majd
BMC-vel
és MSC-vel
kotranszplantált
állatok
pancreasából származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata c: STZ-vel kezelt, majd csak BMC-vel transzplantált állatok pancreasából
származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata d: STZ-vel kezelt, majd csak MSC-vel transzplantált állatok pancreasából
származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata Kontrollként olyan APC-ket használtunk melyek STZ-vel nem kezelt állatok lépéből származtak. Rövidítések: STZ= streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek),
Azt is ellenőriztük, hogy a 22. ábrán látható módon kivitelezett proliferációs vizsgálat során valóban antigén specifikus - azaz esetünkben β-sejt specikus - sejtszaporodást váltottunk-e ki. Előfordulhatott volna ugyanis, hogy a Tsejtek intenzív osztódása mögött csak valamilyen ismeretlen, antigén-független mitogén hatás áll, hibás pozitív eredményt okozva. Az STZ kezelt (cukorbeteg), vagy ovalbuminnal (OVA) kezelt (nem cukorbeteg) egerekből származó T-sejteket olyan APC-kkel kevertük össze, amelyek szintén STZ kezelt (cukorbeteg), vagy kezeletlen kontroll állatok lépéből származtak. (2.táblázat) Az autoimmun T-sejtek proliferációját csak a cukorbeteg egerekből származó APC-k tudták kiváltani, míg a kontroll állatok APC-inek nem volt ilyen hatása. Ha a kontroll APC-ket in vitro β-sejt kivonattal kezeltünk, akkor azok is képessé váltak, az autoimmun β-sejt specikus T-sejtek aktiválására. Tehát az STZvel kezelt állatok lépéből kivont APC-k éppúgy β-sejt specikus antigéneket prezentálnak mint az in vitro β-sejt kivonattal kezeltek.
69
2. táblázat. Az STZ-kezelt állatokból nyert antigén bemutató sejtek (APC-k) β-sejt specifikus antigéneket mutatnak be
A táblázatban feltüntetett forrásokból a tenyésztő tálca lyukaiba 5x104 APC-t és 2x105 T-sejtet tettünk, valamint a jelölt esetekben szolubilis antigéneket - pancreas kivonatot, illetve ovalbumint (OVA) - is adtunk a tenyészethez. A 72 órás 37 C oon végzett inkubáció befejezése előtt 18 órával a tenyészetekhez 1 µCi 3 H-timidint adtunk. A sejtek learatása után az S fázison áthaladó sejtek DNS-ébe beépült 3Htimidin relatív mennyiségét (cpm) folyadékszcintillátorban mértük. APC forrás
T-sejt forrás
Hozzáadott szolubilis antigén
STZ-kezelt
3255 ± 344
Pancreas kivonat
8762 ± 744
OVA
3420 ± 320
-
598 ± 52
Pancreas kivonat
604 ± 59
OVA-kezelt egerek
OVA Kezeletlen
-
STZ-kezelt egerek
Egerek
H-timidin beépülés (cpm/tenyészet) átlagok ±szórás n=3
-
STZ-kezelt egerek
egerek
3
Pancreas kivonat
4472 ± 418 505 ± 33 7010 ± 698
OVA
511 ± 64
-
523 ± 69
Pancreas kivonat
544 ± 61
OVA-kezelt egerek
OVA
70
8245 ± 780
5. Megbeszélés A cukorbetegségről szóló első lejegyzett, több mint 3500 éves beszámoló óta a vele kapcsolatos tudásunk nagyon sokat fejlődött. A különböző diabetes típusok kialakulásának patomechanizmusáról, a szövődményekről és a kezelés változatos lehetőségeiről vaskos tankönyveket írtak, írnak (Halmos és Jermendy 2002). Ismereteink és terápiás lehetőségeink fejlődése elsősorban annak köszönhető, hogy a korábban ritka betegség sajnos már százmilliókat érint világszerte. Az 1-es és a 2-es típusú diabetes mellitusos esetek száma is növekszik, de lényegesen nagyobb arányban fordulnak elő a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek. A szövetek inzulinrezisztenciája és a β-sejtek csökkenő inzulintermelő képessége glükóz intoleranciához vezet, ami már felismerhető tüneteket és szövődményeket okoz. A betegek β-sejtjeiknek átlagosan a fele eközben elpusztul. A fokozatosan kialakuló betegség során több mód és alkalom kínálkozik a különböző életmódbeli változtatásokra, gyógyszeres kezelésekre, végül az inzulinpótlásra. Amióta az inzulinpótlás lehetősége a rendelkezésünkre áll, még a β-sejtek gyors és teljes pusztulásával járó, 1-es típusú cukorbetegség is jól kezelhető. Többé nem halálos betegség, mint volt az 1920-as évekig. Világos azonban, hogy a kezelés nem egyenlő a gyógyulással. A leglelkiismeretesebb diéta, a legszakszerűbb gyógyszeres kezelés, a leggondosabb inzulin-adagolás mellett is fenyegetnek - ritkán az akut, de főleg - a krónikus szövődmények. Nem is beszélve arról, hogy mennyire megkeseríti a betegek életét az állandó odafigyelés és az ismétlődő tűszúrások. Mind az 1-es, mind a 2-es típusú cukorbetegség hátterében, végső soron, az inzulin-termelő β-sejtek pusztulása áll. A kívülről adagolt inzulin nem képes annyira pontosan követni a szervezet percről percre változó igényeit, mint ahogy azt a β-sejtek által megvalósuló szabályozás a betegség kialakulása előtt lehetővé tette (Lowell és Shulman 2005). Kézenfekvő tehát, hogy ténylegesen gyógyító (kuratív) terápiát az jelentene, ha valahogyan ezeket az elveszett sejteket „fel lehetne támasztani” a szervezeten belül rendelkezésre álló sejtekből, vagy valamilyen idegen forrásból
71
vissza lehetne pótolni őket. Az első lehetőség, az endogén regeneráció gyógyszeres serkentése, mely kétségkívül a legkíméletesebb megoldásnak tűnik, sajnos még nem teljesen megoldott. Kívülről származó sejtek bevitelére viszont több lehetőség is kínálkozik. A már embernél is alkalmazott módszerek a teljes hasnyálmirigy- illetve a sziget-transzplantáció. Ezeknek az eljárásoknak azonban a tömeges alkalmazása, elsősorban a donorhiány miatt lehetetlen, de ellene szólnak az immunszuppresszív kezelés hátrányai is. Az
állatkísérletek
illetve
az
emberi
sziget-transzplantációk
megmutatták, hogy akkor is működőképesek maradnak a β-sejtek, ha nincsenek a hasnyálmirigy állományába ágyazva. Állatkísérletekben jól működnek a graftok akár vesetokba oltva, vagy bőr alá ültetve (Kroon és mtsai 2008). Embernél az Edmonton-protokoll során alkalmazott eljárással a máj portális keringésébe injektálva a szigeteket, azok megtapadnak a máj szövetében, és működőképesek maradnak, noha nem korlátlan ideig (Merani és Shapiro 2006). Ha sikerülne tehát kellő számú inzulin-termelő sejtet előállítani, akkor azokat máshova bejuttatva is képesek lennének feladatuk ellátására. Sajnos maguk a β-sejtek in vitro nem szaporíthatóak fel, ezért fordult a figyelem - ezen a téren is - a mind népszerűbb őssejtterápiás lehetőségek felé. Mind az embrionális, mind a szöveti őssejtekkel világszerte folynak olyan kísérletek, melyek célja az in vitro β-sejt előállításra alkalmas differenciáltatási protokollok kifejlesztése (Jones és mtsai 2008). Az
embrionális
kifinomultabban
igyekeznek
őssejtekkel a
kutatók
folytatott az
kísérletek
során
embrionális/magzati
egyre
történések
reprodukálására a tenyésztőedényben. Néhány kutatócsoport eredményei tényleg figyelemreméltóak (D'Amour és mtsai 2006, Kroon és mtsai 2008), de még senkinek sem sikerült teljes egészében lejátszani azt a folyamatot in vitro, amely a pancreas organogenezise során elvezet egy pluripotens sejttől a végdifferenciált βsejtig. Nincs tehát egyelőre olyan protokoll, amely maradéktalanul és teljes mértékben eldifferenciáltatná a sejteket, így kiküszöböletlen maradt a teratomaképzés veszélye. Emellett továbbra is fennállnak az ismert etikai problémák és nyitottak az immunológiai kérdések (Gruen és Grabel 2006). A felnőtt - vagy szöveti - őssejtek életünk végéig, mint embrionális maradványok ott bujkálnak differenciálódott szöveti sejtjeink között (Ratajczak és
72
mtsai 2008). Ezek kinyerésével a beteg olyan saját sejtjeihez juthatnánk hozzá, melyek,
kellően
plasztikusak
lévén,
elméletileg
akár
β-sejtekké
is
differenciáltathatóak. Ezzel a megoldással megszűnnének az etikai aggályok, megoldódna a donorhiány, elkerülhetővé válna a kilökődési reakció. Sokan keresik a lehetőséget az ún. hasnyálmirigy őssejtek izolálására és felszaporítására, amelyekből azután β-sejtek is előállíthatóak lennének (Seaberg és mtsai 2004). Megjegyzendő, hogy a kinyerésüket célzó számos próbálkozás ellenére a hasnyálmirigy őssejtek létezése máig vitatott (Yalniz és Pour 2005, Hao 2006). Mások a csontvelő mesenchymális őssejtjeit (MSC-it) (Morisot és mtsai 2005) vagy a máj sejtjeit (Zalzman és mtsai 2003) szeretnék β-sejt irányú differenciálódásra kényszeríteni. Kicsit más irányzatot képviselnek azok, akik azt feltételezik, hogy egyes szöveti őssejtek - akár előzetes differenciáltatás nélkül beadva is - képesek a sérült
szöveteket
közvetve (szolúbilis
faktorok
útján),
vagy közvetlenül
(hominggal) megtalálni és regenerálni. Ezt az elméletet továbbgondolva jutottak néhányan arra a következtetésre, hogy talán az lehet a fiziológiás regeneráció alapja is, hogy sérüléskor az endogén őssejtek mobilizálódnak, a sérülés helyére vándorolnak és ott transzdifferenciálódva a pótlandó sejtekké alakulnak (Ianus és mtsai 2003). Feltételezések szerint a csontvelői őssejtek is képesek többféle szövet regenerálására, adott esetben akár a Langerhans-szigetekére is. Ezt az elképzelést látszik alátámasztani több arról szóló beszámoló, hogy a csontvelő-transzplantáció képes gyógyítani, de legalábbis átmenetileg javítani a diabetes állatmodelljeinek cukorbetegségét (Banerjee és mtai 2005). A mechanizmus egyelőre vitatott. Az elméletek szerint a szigetek regenerációja megvalósulhat nem csak a csontvelői sejtek transzdifferenciációja, de akár valamely ismeretlen faktor(ok) termelése (Li és mtsai 2003), esetleg új kapillárisok kialakítása által is (Hess és mtsai 2003). Kísérleteinkben mi is ez utóbbi kérdést vizsgáltuk, vagyis a csontvelői sejtek hatását a diabetes lefolyására illetve ennek a hatásnak a mechanizmusát. Az STZ-vel indukált 1-es típusú diabetesben szenvedő egereken vizsgáltuk a csontvelő-transzplantáció, majd a csontvelői sejtek és in vitro felszaporított MSCk együttes transzplantációjának hatását. Eredményeink megvitatása a Célkitűzés c. fejezetben szereplő pontok szerint következik:
73
1.
Kis dózisban adott, többszöri STZ kezelés hatására kísérleti állataink –
nőstény C56Bl/6 egerek - vércukorszint értékei gyorsan emelkedésnek indultak, ugyanakkor testsúlyuk és szérum inzulinszint értékeik lecsökkentek. Mindez arra utal, hogy az inzulin-termelés fokozatos megszűnésével párhuzamosan a Langerhans-szigetek funkciója gyorsan elveszett. A szövettani metszetek és a rajtuk végzett immunhisztokémia feltárta a szigetek drasztikus méretbeli csökkenését, degenerációját és az inzulin pozitív sejtek jelentős megfogyatkozását. Funkcionális és morfológiai adatok alapján is elmondható tehát, hogy az 1-es típusú diabetes állatmodelljét C57Bl/6 egereinken, kisdózisú streptozotocin (STZ) ismételt adásával sikeresen kialakítottuk.
2.
Akkor tekintettük az állatokat cukorbetegeknek, amikor vércukorszintjük 2
egymást követő napon elérte a 10 mmol/l értéket. Ez az STZ kezelés megkezdésétől számított 14. és 15. napra esett, ezért a csontvelő-transzplantáció ideális időpontját a 15. napban határoztuk meg. A legkisebb, de még hatásos besugárzási dózisnak 250 cGy bizonyult. Ez egy relatíve alacsony szubletális dózis, az állatok olyan mérsékelt károsítását jelenti, melyből spontán módon, teljes mértékben képesek regenerálódni. Ha a fenti feltételek mellett az állatok 106 frissen szeparált csontvelői sejtet (BMC-t) kaptak, akkor ez a transzplantáció - az irodalmi adatokkal részben megegyezően (Banerjee és mtsai 2005, Ianus és mtsai 2003) - valóban képes volt átmenetileg lelassítani a vércukorszint értékek emelkedésének ütemét. Az állatok 10-14 nappal tovább éltek, mint nem transzplantált társaik, de végül elhatalmasodott rajtuk is a betegség és hamarosan elpusztultak. Az állatok mérsékelt károsítását követő, 106 frissen szeparált csontvelői magvas sejttel (BMC) történt transzplantáció tehát egyértelműen lelassította az
STZ-vel
előidézett
diabetes
progresszióját.
A
beadott
sejtek
feltételezhetően valamilyen regeneratív folyamat támogatása vagy előidézése révén érték el hatásukat, de ez a hatás semmiképpen nem nevezhető tartósnak. Elmondhatjuk tehát, hogy a csontvelői sejtek önmagukban nem elegendőek a diabetes kezelésére.
74
3.
A csontvelői sejtek közül különösen figyelemre méltóak a könnyen
szeparálható és plasztikus mesenchymális őssejtek (MSC-k). A szakirodalomban, sőt már egyes betegségek szabadalmaztatott őssejt-terápiájában is egyre gyakrabban kerülnek szóba, mint gyógyító sejtek. Mára már bizonyított ténnyé vált az a megfigyelés is, miszerint az MSC-k immunszuppresszív tulajdonsággal bírnak. Emellett az MSC-k nem immunogének, vagyis az immunrendszer számára gyakorlatilag láthatatlanok, tehát egy későbbi klinikai felhasználáshoz könnyen elérhető, donor-független, ideális sejtforrásként szolgálhatnak. Miután az STZ indukálta diabetes az 1-es típusú, azaz autoimmun diabetes modellje, azt vártuk, hogy a feldúsított MSC-kel kiegészített csontvelőtranszplantáció növeli majd a regeneráció esélyeit az immunszuppresszió révén. De annak lehetőségét sem zártuk ki, hogy akár transzdifferenciálódás útján pótolva a β-sejteket, vagy esetleg valamely később azonosítandó szolúbilis faktor termelése által járulnak hozzá az endocrin pancreas funkciójának helyreállításához. Az
egér
karakterizáltuk.
csontvelőből
kinyert
Plaszticitásukat
MSC-ket
adipocytává
in és
vitro
felszaporítottuk
osteoblasttá
és
történt
differenciáltatásukkal igazoltuk. Sejtfelszíni markereik, morfológiájuk és plaszticitásuk alapján elmondható, hogy az általunk használt sejtek azonosak az International Society for Cellular Therapy által 2006-ban definiált MSC-kkel (Dominici és mtsai 2006).
4.
Amint kellően bizonyítottnak láttuk, hogy tenyészeteink valóban MSC
tenyészetek, felhasználtuk azokat transzplantációs kísérleteink kiegészítésére: BMC-k mellett egyúttal MSC-ket is beadtunk az állatoknak. A cukorbeteg állatok vércukorszintje és szérum inzulin koncentrációja a 15. napon, mérsékelt károsítást követően beadott 5x105 - 10 6 BMC és 5x104 - 105 MSC hatására gyorsan visszatért a normális szintre. A szövettani metszeteken egyértelműen látszik, hogy a kotranszplantációs kezelés hatására regenerálódó Langerhans-szigetek mérete megközelíti az egészséges pancreasban találhatókét. Immunhisztokémiával jól detektálható módon újra megjelennek a működőképes, inzulin-termelő β-sejtek. A gyógyult állatok glükóz tolerancia teszt eredményei azonosnak mondhatóak a kezeletlen kontroll állatok eredményeivel. A kezelés sikerességét nem befolyásolta
75
az MSC-k genetikai háttere, ami az MSC-k szakirodalomban leírt (Bartholomew 2002, Uccelli 2006) hypoimmunogén voltát támasztja alá. A gyógyult állatok több mint 16 hétig éltek inzulin-kezelés nélkül, tehát a gyógyulás teljesnek és véglegesnek tekinthető. Világosan kiderül azonban a bemutatott eredményekből, hogy sem a BMC-k, sem az MSC-k önmagukban nem elegendőek az állatok gyógyulásához. Ebből
következik,
hogy
a
keverékként
beadott,
de
kétféle
(előéletű)
transzplantátum sejtjeinek együttműködése szükséges a szigetek regenerációjához. Ez ellentmond azoknak a korábbi eredményeknek, amelyek szerint az STZ-vel előidézett diabetes gyógyítására csontvelői magvas sejtek önmagukban is képesek (Banerjee és mtsai 2005). Továbbá azzal a tanulmánnyal sincs összhangban, mely szerint csupán humán MSC-k adása megvédte a pusztulástól NOD/scid egerek β-sejtjeit (Lee és mtsai 2006). Az ellentmondások részben akár a különböző kísérleti elrendezésből is fakadhatnak. Banerjee és munkatársai legalább 3 egymást követő BMC injekciót találtak szükségesnek a sikeres kezeléshez (Banerjee és mtsai 2005), míg a mi esetünkben egyetlen kotranszplantáció elegendő volt.
Ismert, hogy maga a
csontvelő graft is tartalmaz néhány MSC-t: 1-10 MSC található 106 magvas csontvelői sejt között. Nekünk ennél 10 000-szer több MSC-t kellett bejuttatnunk a BMC-kkel egyidőben a gyógyulás eléréséhez. Bizonyos, hogy Banerjee és mtsai 3 egymást követő BMC transzplantációval sem tudtak ezt még csak megközelítő számú MSC-t bejuttatni. Kérdés, hogy ők miért nem figyelték meg azt a – kezdeti javulást követő, újbóli - visszaesést, ami nálunk jelentkezett, amikor csak BMCkkel transzplantáltunk. Lee csoportja (Lee és mtsai 2006) nálunk lényegesen nagyobb számú MSC-vel dolgozott, de frissen szeparált BMC-ket egyáltalán nem használtak. Ők 2,5x106 MSC-t juttattak a NOD/scid egerek szívének bal kamrájába a mellkasfalon keresztül. Véleményük szerint a beadásnak ez a módja alkalmas a magas sejtszámból adódó MSC-aggregáció okozta embólia kockázatának mérséklésére. A mi kísérleteinkben a sejtek aggregálódása nem fenyegetett, mert maximum 2x105 MSC-t adtunk be, egyetlen injekcióban, a farokvénán keresztül. Ekkora sejtszám mellett mi nem tapasztaltunk a betegség progressziójára gyakorolt hatást, bár a T-
76
sejt válasz gátlása kimutatható volt. Nem világos, hogy az MSC-k - Lee és mtsainak eredményeiben leírt - protektív hatása csak a magas sejtszámnak köszönhető, vagy a súlyosan immundeficiens és öröklődő diabetesben szenvedő NOD/scid egerekben többé-kevésbé más mechanizmusok működnek, mint a C57Bl/6 törzsben STZ-vel indukált diabetes esetében. Az eredményeink tehát azt mutatják, hogy C57Bl/6 egerekben STZ-vel előidézett diabetes legalább 5x105 szingén, csontvelői magvas sejt (BMC) és legalább 5x104 szingén, szemiallogén vagy allogén, előzőleg tenyészetben felszaporított mesenchymális őssejt (MSC) egyidejű adásával gyógyítható. A gyógyító hatás eléréséhez a BMC-k és az MSC-k együttműködésére van szükség, önmagában egyik sem bír tartós hatással.
5.
Felvetődik a kérdés, hogy modellállatainkban milyen mechanizmussal
voltak képesek a csontvelői-eredetű sejtek a pancreatikus szövetek regenerációját előidézni. Vajon közvetlenül eltaláltak a sérülés helyére és betelepülve a befogadó szervezet hasnyálmirigyébe újjáépítették a Langerhans-szigeteket, miközben transzdifferenciálódás útján „egyszerűen” átvették az elpusztult sziget-sejtek szerepét és helyreállították a szénhidrát homeosztázist? A mi eredményeink szerint nem ez a lehetőség valósult meg. A regenerálódott hasnyálmirigyben sem Y kromoszómát hordozó, sem EGFP + donor eredetű, ugyanakkor inzulinra is pozitív sejtet nem találtunk. Az új β-sejtek mindegyike recipiens eredetű volt. Ez Ianus és munkatársai eredményeinek és elméletének (Ianus és mtsai 2003) ellentmondva, arra utal, hogy a felnőttkori csontvelői eredetű sejtek differenciálódási képessége már beszűkült annyira, hogy nem szolgálhatnak terápiásan, de feltehetőleg fiziológiásan sem a β-sejtek pótlására. Nemhogy az inzulin-termelő sejtek között, de sehol máshol sem a pancreasban: sem az endocrin, sem az exocrin területeken nem volt egyetlen egy kimutatható BMC vagy MSC sem a beadott sejtekből. Ez ellentmond Hess és munkatársai elméletének, mely szerint a sérült pancreasba betelepülő donoreredetű sejtek, endothel markereket hordozó sejtekké alakulva, valamilyen rövid hatótávolságú sejtkommunikációs kapcsolat útján segítik elő a recipiens sejtjeiből
77
bekövetkező regenerációt (Hess és mtsai 2003). Az elmélet alapja az endothel sejteknek a későbbi endocrin sejtekkel való jól ismert szoros kapcsolata a pancreas organogenezise során (Lammert és mtsai 2003). Eredményeink szerint a beadott sejtek és a hasnyálmirigy sejtjei ezúttal nem kerültek - kimutatható számban ill. tartósan - olyan közel egymáshoz, hogy egy ilyen paracrin vagy juxtacrin kapcsolat állhasson a regeneráció hátterében. A beadott sejtek sorsát tisztázandó, a nőstény állatok különböző szerveiből származó metszeteken is elvégeztük az Y kromoszóma specifikus FISH analízist. Zölden fluoreszkáló Y kromoszómát tartalmazó sejtekre azonban kizárólag a csontvelőben találtunk. Ott ezek a sejtek átmeneti chimerizmust idéztek elő, mely a transzplantációt követő 10. napon volt a legkifejezettebb (6-13%). A csontvelőnek - a recipiens saját sejtjeiből történő - gyors regenerációjával párhuzamosan a donor eredetű sejtek fokozatosan, mintegy 3 hét alatt teljesen kiszorultak. Li és munkatársai elgondolásainak jól megfeleltethetők az általunk talált eredmények. Elméletük szerint a recipiens csontvelőbe betelepült sejtek olyan ismeretlen szolúbilis faktorok útján képesek regenerációt előidézni, melyek a keringés útján jutnak el a csontvelőből a sérült szövethez (Li és mtsai 2003). Noha ezeknek a faktoroknak a mibenlétéről még nagyon keveset tudunk, létezésükre több tanulmány enged következtetni. Izumida és munkatársai arról számoltak be, hogy a transzplantált BMC-k hepatocyta növekedési faktor (HGF) termelésük révén képesek támogatni az STZ-vel kezelt patkányok β-sejt regenerációját (Izumida és munkatársai 2005). Nem csak a beadott BMC-k, de nagyon valószínű, hogy az MSC-k is termeltek
olyan
faktorokat,
melyek
szerepet
játszhattak
a
szigetek
regenerációjának előidézésében. Ismert ugyanis, hogy az MSC-k bizonyos trofikus hatások révén gátolni képesek a fibrózist és különböző citokinek termelése révén serkentik az angiogenezist (Caplan és Dennis 2006). Ezeket az ismereteket számos szívinfarktus (Bunnell 2005, Zimmet és Hare 2005), izületi porc és csontsérülés (Caplan 2005, Horwitz és mtsai 1999), valamint stroke utáni (Bang 2005) regenerációs területekről származó klinikai tanulmány is alátámasztja.
78
Az endocrin pancreasnak a Bevezetésben részletezett fiziológiásan is működő
regenerációs
képességei
(Bouwens
2006,
Pasquali
2006)
elengedhetetlenek a graft által kiváltott, de a recipiens saját sejtjeiből megvalósuló regenerációhoz is. Az azonban nem világos még, hogy vajon az újonnan megjelenő inzulin-termelő sejtek a recipiensnek pontosan mely sejtjeiből származnak. Mai ismereteink alapján, éppúgy lehetnek az STZ-kezelést túlélő néhány β-sejt utódai (Dor 2006), mint egy más, nem is endocrin jellegű, hanem pl. epitheliális sejt (Hao 2006) transzdifferenciálódásából létrejött sejt leszármazottai. De az is elképzelhető, hogy keletkezésüket szöveti őssejtek proliferációja és differenciálódása előzte meg (Bonner-Weir és Sharma 2002). Egyértelmű tehát, hogy a kotranszplantációt követően megjelent új βsejtek recipiens eredetűek voltak. A donor BMC-k eltaláltak (homingoltak) ugyan a recipiens csontvelőbe és ott átmenetileg chimerizmust idéztek elő, de a hasnyálmirigy területén nem sikerült őket kimutatni. Feltételezhető, hogy a BMC-k és az MSC-k olyan szolúbilis faktorokat termeltek, melyek megindították a Langerhans-szigetek endogén regenerációját. Ezeknek a faktoroknak a beazonosítása további vizsgálatokat igényel. Annak a kérdésnek a megválaszolása, hogy a gyógyult állatok új β-sejtjei mely endogén forrásból származhatnak, szintén a jövő feladata marad.
Az MSC-k másik lehetséges szerepe a degeneratív β-sejt pusztulás megállításában nemrégiben felfedezett immunszuppresszív tulajdonságaikból következik. In vitro és in vivo is többszörösen bizonyítást nyert, hogy ezek a sejtek képesek gátolni mind az auto-, mind az alloantigének által kiváltott immunválaszt (Bartholomew 2002, Uccelli 2006), sőt sikeresen alkalmazták őket GVHD kezelésében (Le Blanc és mtsai 2004). Több autoimmun betegség kezelésére folyik az MSC-k klinikai kipróbálása. Bár az STZ-nek a β-sejteket célzottan pusztító hatása indítja el a degeneratív folyamatokat, a pusztuló β-sejtekből felszabaduló saját antigének Tsejt választ is indukálnak a kísérletes diabetes kialakulása során (Like és Rossini 1976, Paik és mtsai 1980). A kifejlődő autoimmun válasz pedig nem engedi érvényre jutni többé az autoregeneratív folyamatokat. (Az autoimmun válasz kialakulása miatt lehet az STZ indukálta diabetes a humán 1-es típusú diabetes
79
modellje.) A β-sejt specifikus immunválasz leállítása tehát, támogathatja mind a még meglévő β-sejtek megmenekülését a pusztulástól, mind pedig az újonnan létrejövő β-sejtek túlélését. Mindezek tükrében érthetővé válik, hogy MSC-k jelenlétében, a mi esetünkben is jelentősen csökkent a β-sejt specifikus autoimmun T-sejt válasz. Tsejt proliferációt mérő kísérleteink eredményeiből kitűnik, hogy azoknak az STZkezelt állatoknak a pancreasából hiányoznak a β-sejt specifikus T-sejtek, melyeket MSC-kkel (illetve MSC-kkel is) kezeltünk. A kizárólag BMC-kkel kezelt állatok pancreasában viszont még erőteljesebbnek mutatkozik a β-sejt specifikus T-sejtek aktivitása, mint az egyáltalán nem transzplantált, de STZ-indukálta diabetesben szenvedő egerekében. Ennek oka az lehet, hogy a BMC-k által kiváltott regeneráció miatt az állatok tovább éltek, több idő volt az autoimmun válasz kifejődésére és az újratermelődő β-sejtek miatt hosszabb ideig volt jelen a Tsejteket odavonzó autoantigén is. A kizárólag MSC-kkel kezelt állatokban az MSC-k hiába gátolták meg a T-sejtek aktivációját és osztódását, a betegséget már nem voltak képesek megfékezni. Erre csak a kétféle graft együttműködése esetén van lehetőség. Korábbi vizsgálatokból úgy tűnik, hogy a különböző gyulladás-gátló szerekkel végzett immunszuppresszió képes késleltetni vagy megakadályozni az 1es típusú diabetes kialakulását NOD egérben (Kodama és mtsai 2003). Mi is megvizsgáltuk,
hogy
Cyclosporin
A
(CsA)
adásával,
tehát
gyógyszeres
immunszuppresszióval elérhetünk-e cukorbeteg állatainknál hasonló sikereket. Azt tapasztaltuk, hogy az MSC-k hatása nem helyettesíthető CsA-val. Ennek hátterében az állhat, hogy az MSC-k gyulladáscsökkentő hatásuk mellett a szövetregenerációs folyamatokban is részt vettek. Emellett a CsA komoly mellékhatásai - úgy mint nephro- és hepatotoxicitása - is gátolhatták a szövetregenerációt (Rezzani 2004). Az MSC-knek a β-sejt pusztulás megakadályozásában, illetve az endogén regeneráció elindításában betöltött szerepe tehát kettős: A BMCkkel
együttműködve
segítik
a
szövetregenerációt
és
egyidejűleg
immunszuppresszív hatásuk révén lehetővé teszik, hogy a kialakuló új βsejtek életben maradjanak.
80
6. Következtetések 1. Megállapítottuk, hogy szingén csontvelő graft (5x105 - 106 BMC/egér iv.) és szingén, szemiallogén vagy allogén mesenchymális őssejtek (5x104 – 105 MSC/egér iv.) egyidejű adásával a streptozotocin (STZ) indukálta 1-es típusú diabetes gyógyítható. A kezelés hatására az addig súlyos hyperglycaemiás állapotban lévő,
roncsolt szigetekkel bíró egerek Langerhans-szigeteiben újra megjelennek az inzulintermelő sejtek és helyreáll a szénhidrát-anyagcsere. Önmagukban sem a BMC-k sem pedig az MSC-k nem hatásosak. A siker eléréséhez a kétféle graft együttműködése szükséges.
2. Mivel minden cukorbeteg (recipiens) állatunk nőstény volt, viszont a csontvelőgraftokat és a mesenchymális őssejteket hím, illetve részben EGFP transzgenikus egerekből izoláltuk, a beültetett donorsejtek sorsát követni tudtuk a recipiensek szöveteiben. Így sikerült igazolnunk, hogy a hasnyálmirigy-szigetek regenerációja során nem keletkeznek kettős - inzulinra (immunhisztokémia) és Y kromoszómára (in situ FISH) vagy EGFP-re – egyaránt pozitív sejtek. A transzplantált csontvelői eredetű sejtek tehát csak közvetett módon segítik a pancreas regenerációját, de ők maguk nem transzdifferenciálódnak β-sejtekké.
3. Cukorbeteg és kontroll állataink hasnyálmirigyéből T-sejteket izoláltunk, amiket olyan, ugyancsak STZ-vel kezelt állatok lépéből nyert adherens sejtekkel kevertünk össze, amelyek felszínükön a méreg hatására elpusztuló β-sejtekből felszabaduló saját antigéneket prezentálnak. Az ilyen kultúrákban két-három napos inkubálás után jól mérhető az autoreaktív (azaz β-sejt specifikus) T lymphocyták osztódása (3H-timidin felvétele).
Megállapítottuk,
hogy
kísérleti
állataink
hasnyálmirigyében,
a
cukorbetegség kialakulásával párhuzamosan, β-sejt specifikus, autoreaktív Tsejtek is megjelennek. A csak BMC-kkel oltott cukorbeteg állatokban - mivel ezek az
egerek néhány héttel tovább élnek, mint nem transzplantált cukorbeteg társaik - a β-sejt specifikus T-sejt válasz az állatok pusztulásáig erősödik. Egyértelmű tehát, hogy az autoreaktív T-sejtek folyamatosan elpusztítják a BMC-transzplantáció hatására képződő új β-sejteket és ezzel megakadályozzák a cukorbeteg állatok gyógyulását.
81
4. Ezzel szemben a BMC-kkel és MSC-kkel, vagy csak az utóbbiakkal transzplantált egerek hasnyálmirigyében a T-sejt válasz elmaradt. Ebből arra következtetünk, hogy két, párhuzamosan zajló, egymást erősítő folyamat vezetett az állatok gyógyulásához. A grafttal bevitt MSC-k – a többi csontvelő-sejttel együttműködve - részben a Langerhans-szigetek regenerációjának elindításában játszottak szerepet. Másrészt – immunszuppresszív hatásuk révén – megakadályozták a βsejt specifikus T-sejt közvetítette immunválaszt, lehetővé téve az újonnan keletkezett β-sejtek túlélését ebben a megváltozott immunológiai környezetben. Végeredményben, ez a munka egy új terápiás protokoll lehetőségét kínálja az 1-es típusú diabetes kezelésére. Szingén BMC-k és szingén,
szemiallogén, vagy akár allogén MSC-k egyidejű adása egyértelműen támogatja a pancreatikus szövetregenerációt, képes helyreállítani a vércukorszintet és a szérum inzulinszintet, tehát képes meggyógyítani és hosszú távú túléléshez segíteni az STZ-vel indukált cukorbetegségben szenvedő egereket. Az általunk itt kínált protokoll újdonságai és előnyei az eddig megjelentekhez viszonyítva az alábbiak: a) Az alkalmazott szubletális, alacsony dózisú besugárzás csak minimális szövetkárosodást okoz, amiből spontán módon megtörténik a regeneráció. b) Az egylépéses kotranszplantációs eljárás egyetlen intravénás injekcióval kivitelezhető, anélkül, hogy a sejtek aggregációja miatt fellépő embólia kockázatával kellene számolni. c) A
beadott
MSC-k
genetikai
hovatartozása
nem
befolyásolja
a
transzplantáció sikerességét, tehát nincs szükség választott donorra. Így a sejtek felszaporítása már előre megoldható, azonnal bármely recipiens számára rendelkezésre állhatnak. d) Nincs szükség kiegészítő immunszuppresszió alkalmazására sem. Eredményeink további – a gyógyulás pontos mechanizmusára vonatkozó kérdéseket is felvetnek. Tisztázandók még a kétféle graft együttműködésének részletei. Milyen faktorokat termelnek a BMC-k és milyeneket az MSC-k? Milyen
82
jelátviteli mechanizmusokon keresztül és milyen sejtekre hatnak ezek a faktorok? Milyen sejttípusból indul ki az endokrin pancreas regenerációja? Fontos hangsúlyoznunk azt is, hogy egy esetleges humán terápiára történő alkalmazás előtt számos további kérdés vár még tisztázása. Lényeges különbségek lehetnek a humán autoimmun diabetesben és az egérben STZindukálta diabetesben működő mechanizmusok között. Elképzelhető, hogy az újonnan képződő β-sejtek védelmére emberben MSC-k többszöri adására lesz szükség. Mielőtt az eljárást emberre is ki lehetne dolgozni, az egérnél nagyobb testű, az emberhez evolúciós szempontból közelebb álló emlősökön végzett további kísérletekre is szükség lenne.
83
7. Összefoglalás Bevezetés: A diabetes mellitusban elpusztult β-sejtek pótlását célzó egyes tanulmányok
szerint a csontvelőben található sejtek serkentőleg hatnak a diabeteses állatok βsejtjeinek regenerációjára, más szakirodalmi adatok viszont cáfolják ezt. Célunk ezen sejtek gyógyító hatásának közelebbi felderítése. Módszerek:
Nőstény,
C57Bl/6
egereken,
streptozotocinnal
(STZ)
előidézett
cukorbetegség szolgált az 1-es típusú diabetes modelljeként. A szubletálisan besugárzott cukorbeteg egereknek frissen szeparált, ellenkező nemű egérből származó, szingén csontvelői sejteket (bone marrow cell = BMC) és szingén vagy allogén mesenchymális őssejteket (mesenchymal stromal/stem cell = MSC) juttattunk a keringésébe. Eredmények: Megállapítottuk, hogy szingén BMC-k és szingén vagy allogén MSC-k
egyidejű adásával az STZ-indukált 1-es típusú diabetes gyógyítható. Egyetlen kotranszplantációs injekció helyreállította a vércukor- és a szérum inzulinszintet, egyidejűleg szövetregenerációt láttunk a pancreasban. Az újjáépült Langerhansszigetekben nem találtunk donor eredetű sejteket. A szövetregeneráció tehát nem közvetlenül a graftból történt, hanem az egy endogén regenerációs folyamatot indított el. Az MSC-kkel (is) transzplantált egerek hasnyálmirigyében az STZ-indukált diabetes kialakulását egyébként kísérő autoreaktív T-sejt válasz elmaradt. Következtetés: Két párhuzamos folyamat játszódik le a gyógyulás hátterében. A BMC-
k és az MSC-k megindítják a szervezet saját inzulin-termelő sejtjeinek regenerációját, az MSC-k ugyanakkor gátolják az újonnan képződő β-sejtek elleni T-sejtes immunválaszt. Ez a terápia, megfelelő módosításokkal humán klinikai alkalmazás szempontjából is ígéretes.
84
Abstract Introduction: Recent studies have suggested that the adult bone marrow harbours cells
that can influence β-cell regeneration in diabetic animals. Other reports, however, contradicted these findings. Our aim was to elucidate this question. Materials and Methods: To address this issue, we used an animal model with type 1
diabetes in which the disease was induced with streptozotocin (STZ) in female C57Bl/6 mice. Freshly prepared sex-mismatched bone marrow cells (BMC) and syngeneic or allogeneic mesenchymal stem cells (MSC) were concomitantly administrated into sublethally (250 cGy) irradiated diabetic mice. Results: Blood glucose and serum insulin concentrations rapidly returned to normal
levels accompanied with efficient tissue regeneration after a single injection of a mixture of 106 BMC/105 MSCs. Successful treatment of diabetic animals was not due to the reconstitution of the damaged islet cells from the transplant since no donor-derived β-cells were found in the recovered animals, indicating a graft initiated endogenous repair process. Moreover, MSC injection caused the disappearance of β-cell-specific T lymphocytes from diabetic pancreas. Conclusion: We suggest that two aspects of this successful treatment regimen operate
parallelly in our model. First, BMCs and MSCs induce the regeneration of recipientderived pancreatic insulin-secreting cells. Second, MSCs inhibit T-cell-mediated immune responses against newly formed β-cells. Thus, the application of this therapy in human patients suffering from diabetes may be feasible.
85
8. Irodalomjegyzék 1.
Aggarwal S, Pittenger MF. (2005) Human mesenchymal stem cells modulate
allogeneic immune cell responses. Blood, 105(4):1815-22. 2.
Albera C, Polak JM, Janes S, Griffiths MJ, Alison MR, Wright NA,
Navaratnarasah S, Poulsom R, Jeffery R, Fisher C, Burke M, Bishop AE. (2005) Repopulation of human pulmonary epithelium by bone marrow cells: a potential means to promote repair. Tissue Eng, 11(7-8):1115-21. 3.
Anjos-Afonso F, Siapati EK, Bonnet D. (2004) In vivo contribution of murine
mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions. J Cell Sci, 117(Pt 23):5655-64. 4.
Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, Tzukerman M.
(2001) Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes, 50(8):1691-1697. 5.
Augello A, Tasso R, Negrini SM, Amateis A, Indiveri F, Cancedda R, Pennesi G.
(2005) Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway. Eur J Immunol, 35(5):1482-90. 6.
Azizi SA, Stokes D, Augelli BJ, DiGirolamo C, Prockop DJ.(1998) Engraftment
and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-similarities to astrocyte grafts. Proc Natl Acad Sci U S A, 95(7):3908-13. 7.
Banerjee M, Kumar A, Bhonde RR. (2005) Reversal of experimental diabetes by
multiple bone marrow transplantation. Biochem Biophys Res Commun, 328(1):318-25. 8.
Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. (2005) Autologous mesenchymal stem cell
transplantation in stroke patients. Ann Neurol, 57(6):874-82. 9.
Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, Ferrer K, McIntosh K, Patil S, Hardy
W, Devine S, Ucker D, Deans R, Moseley A, Hoffman R. (2002) Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol, 30(1):42-8. 10.
Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, Wagner M, Roll U, St-Onge L, Wobus AM.
(2003) Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestinpositive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(3):9981003.
86
11.
Bonner-Weir S, Sharma A. (2002) Pancreatic stem cells. J. Pathol, 197
(4):519−526 12.
Bonner-Weir, S (2000) Perspective: Postnatal pancreatic cell growth.
Endocrinology, 2000, 141(6) 1926-1929 13.
Bouwens L. (2006) Beta cell regeneration. Curr Diabetes Rev, 2(1):3-9.
14.
Bunnell BA, Deng W, Robinson CM, Waldron PR, Bivalacqua TJ, Baber SR,
Hyman AL, Kadowitz PJ. (2005) Potential application for mesenchymal stem cells in the treatment of cardiovascular diseases. Can J Physiol Pharmacol, 83(7):529-39. 15.
Burt RK, Slavin S, Burns WH, Marmont AM. (2002) Induction of tolerance in
autoimmune diseases by hematopoietic stem cell transplantation: getting closer to a cure? Blood, 99(3):768-84. 16.
Butler AE, Janson J, Bonner-Weir S, Ritzel R, Rizza RA, Butler PC. (2003) Beta-
cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes, 52(1):102-10. 17.
Caplan AI, Dennis JE. (2006) Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J
Cell Biochem, 98(5):1076-84. 18.
Caplan AI. (2005) Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive
therapy in orthopedics. Tissue Eng, 11(7-8):1198-211. 19.
Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J. (2007) Concise review:
mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells, 25(11):2739-49. 20.
Chen LB, Jiang XB, Yang L. (2004) Differentiation of rat marrow mesenchymal
stem cells into pancreatic islet beta-cells. World J Gastroenterol, 10(20):3016-20. 21.
Choi JB, Uchino H, Azuma K, Iwashita N, Tanaka Y, Mochizuki H, Migita M,
Shimada T, Kawamori R, Watada H. (2003) Little evidence of transdifferentiation of bone marrow-derived cells into pancreatic β cells. Diabetologia, 46(10): 1366–1374. 22.
Choi Y, Ta M, Atouf F, Lumelsky N. (2004) Adult pancreas generates
multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells, 22(6):1070-84. 23.
Conboy IM, Conboy MJ, Wagers AJ, Girma ER, Weissman IL, Rando TA.
(2005) Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. Nature, 433(7027):760-4.
87
24.
da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. (2008) In Search of the in vivo
Identity of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells, doi:10.1634/stemcells.2007-1122 25.
da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB. (2006) Mesenchymal stem
cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci, 119(Pt 11):2204-13. 26.
D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, Smart NG,
Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE.(2006) Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol, 24(11):1392-401. 27.
Deb KD, Sarda
K.J (2008) Human embryonic stem cells: preclinical
perspectives. Transl Med., 6:7. 28.
Deng W, Han Q, Liao L, You S, Deng H, Zhao RC. (2005) Effects of allogeneic
bone marrow-derived mesenchymal stem cells on T and B lymphocytes from BXSB mice. DNA Cell Biol, 24(7):458-63. 29.
Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D,
Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4):315-7. 30.
Donath, MY, Halban PA. (2004) Decreased β-cell mass in diabetes: significance,
mechanisms and therapeutic implications. Diabetologia, 47: 581−589. 31.
Dor Y, Melton DA. (2008) Facultative endocrine progenitor cells in the adult
pancreas. Cell, 132(2):183-4. 32.
Dor Y.(2006) beta-Cell proliferation is the major source of new pancreatic beta
cells. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2(5):242-3. 33.
Erices A, Conget P, Minguell JJ. (2000) Mesenchymal progenitor cells in human
umbilical cord blood. Br J Haematol, 109(1):235-42. 34.
Ferber S, Halkin A, Cohen H, Ber I, Einav Y, Goldberg I, Barshack I, Seijffers R,
Kopolovic J, Kaiser N, Karasik A. (2000) Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nature Med, 6(5):568−572. 35.
Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. (1987) Bone marrow
osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet, 20(3):263-72.
88
36.
Gao J, Dennis JE, Muzic RF, Lundberg M, Caplan AI. (2001) The dynamic in
vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs, 169(1):12-20. 37.
Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, Lundin K, Korsgren O, Otonkoski T. (2003)
Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes, 52(8):2007-15. 38.
Georgia S, Bhushan A. (2004) Beta cell replication is the primary mechanism for
maintaining postnatal beta cell mass. J Clin Invest, 114(7):963-8. 39.
Gerdoni E, Gallo B, Casazza S, Musio S, Bonanni I, Pedemonte E, Mantegazza
R, Frassoni F, Mancardi G, Pedotti R, Uccelli A. (2007) Mesenchymal stem cells effectively modulate pathogenic immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis. Ann Neurol, 61(3):219-27. 40.
Gerecht-Nir S, Itskovitz-Eldor J. (2004) The promise of human embryonic stem
cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 18(6):843-52. 41.
Gruen L, Grabel L. (2006) Concise review: scientific and ethical roadblocks to
human embryonic stem cell therapy. Stem Cells, 24(10):2162-9. 42.
Halban PA. (2004) Cellular sources of new pancreatic beta cells and therapeutic
implications for regenerative medicine. Nat Cell Biol, 6(11):1021-5. 43.
Halmos T, Jermendy Gy. (szerk.), Diabetes mellitus elmélet és klinikum.
Medicina, Budapest, 2002: 381.-392, 406-408, 413-421, 478-488. 44.
Hao E, Tyrberg B, Itkin-Ansari P, Lakey JR, Geron I, Monosov EZ, Barcova M,
Mercola M, Levine F. (2006) Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nat Med, 12(3):310-6 45.
Herzog EL, Chai L, Krause DS. (2003) Plasticity of marrow-derived stem cells.
Blood, 102(10):3483-93. 46.
Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA, Bhatia
M. (2003) Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration. Nat Biotechnol, 21(7):763-70. 47.
Holst, J. J. (2004) Treatment of Type 2 diabetes mellitus with agonists of the
GLP-1 receptor or DPP-IV inhibitors. Expert Opin Emerg Drugs, 9(1):155-66. 48.
Homo-Delarche F, Drexhage HA. (2004) Immune cells, pancreas development,
regeneration and type 1 diabetes. Trends Immunol, 25(5):222-229.
89
49.
Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC, Heit JJ, Cahoy JD, Kim SK. (2002) Growth
inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 99(25):16105-10. 50.
Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M,
Sussman M, Orchard P, Marx JC, Pyeritz RE, Brenner MK. (1999) Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med, 5(3):309-13. 51.
Horwitz MS, Ilic A, Fine C, Rodriguez E, Sarvetnick N. (2002) Presented antigen
from damaged pancreatic beta cells activates autoreactive T cells in virus-mediated autoimmune diabetes. J Clin Invest, 109(1):79-87. 52.
Hotamisligil GS. (2006) Inflammation and metabolic disorders. Nature,
444(7121):860-7. 53.
Hug K. (2005) Sources of human embryos for stem cell research: ethical
problems and their possible solutions. Medicina (Kaunas), 41(12):1002-10. 54.
Hwang WS, Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW,
Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY, Schatten G. (2005) Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science,
308(5729):1777-83.
Visszavonva
(!):
Kennedy
D.
Science.
2006;
311(5759):335. 55.
Ianus A, Holz GG, Theise ND, Hussain MA. (2003) In vivo derivation of
glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion. J. Clin. Invest, 111(6): 843–850. 56.
Izumida Y, Aoki T, Yasuda D, Koizumi T, Suganuma C, Saito K, Murai N,
Shimizu Y, Hayashi K, Odaira M, Kusano T, Kushima M, Kusano M. (2005) Hepatocyte growth factor is constitutively produced by donor-derived bone marrow cells and promotes regeneration of pancreatic beta-cells. Biochem Biophys Res Commun, 333(1):273-282 57.
Jahr H, Bretzel RG. (2003) Insulin-positive cells in vitro generated from rat bone
marrow stromal cells. Transplant Proc, 35(6):2140-1. 58.
Jones PM, Courtney ML, Burns CJ, Persaud SJ. (2008) Cell-based treatments for
diabetes. Drug Discov Today, doi: 10.1016/j.drudis.200806.014
90
59.
Kahan BW, Jacobson LM, Hullett DA, Ochoada JM, Oberley TD, Lang KM,
Odorico JS. (2003) Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes, 52(8):2016-24. 60.
Kania G, Blyszczuk P, Czyz J, Navarrete-Santos A, Wobus AM. (2003)
Differentiation of mouse embryonic stem cells into pancreatic and hepatic cells. Methods Enzymol, 365:287-303. 61.
Kertész Z, Vas V, Kiss J, Urbán VS, Pozsonyi E, Kozma A, Pálóczi K, Uher F.
(2006) In vitro expansion of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the presence of immobilized Jagged-1 and early acting cytokines. Cell Biol Int, 30(5):401-5. 62.
Kiesel U, Kolb H. (1982) Low-dose streptozotocin-induced autoimmune diabetes
is under the genetic control of the major histocompatibility complex in mice. Diabetologia, 23(1):69-71. 63.
Kim SH, Reaven GM. (2004) The metabolic syndrome: one step forward, two
steps back. Diab Vasc Dis Res, 1(2):68-75. 64.
King KM, Rubin G. (2003) A history of diabetes: from antiquity to discovering
insulin. Br J Nurs., 12(18):1091-5. 65.
Kodama S, Kühtreiber W, Fujimura S, Dale EA, Faustman DL. (2003) Islet
regeneration during the reversal of autoimmune diabetes in NOD mice. Science, 302(5648):1223-7. 66.
Kovacic JC, Boehm M. (2008). Resident vascular progenitor cells: An emerging
role for non-terminally differentiated vessel-resident cells in vascular biology. Stem Cell Res, doi: 10.1016/j.scr.2008.05.005 67.
Krampera M, Pasini A, Pizzolo G, Cosmi L, Romagnani S, Annunziato F (2006)
Regenerative and immunomodulatory potential of mesenchymal stem cells.Curr Opin Pharmacol, 6(4):435-41. 68.
Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG, Kelly OG, Eliazer S, Young H,
Richardson M, Smart NG, Cunningham J, Agulnick AD, D'Amour KA, Carpenter MK, Baetge EE. (2008) Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol, 26(4):44352.
91
69.
Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, Kouskoff V, Kennedy M, Woo S, Fehling
HJ, Keller G.(2004) Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development,131(7):1651-62. 70.
Lakshmipathy U, Verfaillie C. (2005) Stem cell plasticity. Blood Rev, (1):29-38.
71.
Lammert E, Cleaver O, Melton D. (2003) Role of endothelial cells in early
pancreas and liver development. Mech Dev, 120(1):59-64. 72.
Larsen S. (1993) Diabetes mellitus secondary to chronic pancreatitis. Dan Med
Bull, 40(2):153-62. 73.
Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B, Götherström C, Hassan M, Uzunel M,
Ringdén O. (2004) Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet, 363(9419):1439-41. 74.
Lechner A, Yang YG, Blacken RA, Wang L, Nolan AL, Habener JF. (2004) No
evidence for significant transdifferentiation of bone marrow into pancreatic β-cells in vivo. Diabetes, 53(3): 616–623. 75.
Lee RH, Seo MJ, Reger RL, Spees JL, Pulin AA, Olson SD, Prockop DJ. (2006)
Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(46):17438-43. 76.
Li FX, Zhu JW, Tessem JS, Beilke J, Varella-Garcia M, Jensen J, Hogan CJ,
DeGregori J. (2003) The development of diabetes in E2f1/E2f2 mutant mice reveals important roles for bone marrow-derived cells in preventing islet cell loss. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(22):12935-40. 77.
Like AA, Rossini AA. (1976) Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new
model of diabetes mellitus. Science, 193(4251):415-7. 78.
Lipshutz
GS,
Wilkinson
AH.
(2007)
Pancreas-kidney
and
pancreas
transplantation for the treatment of diabetes mellitus. Endocrinol Metab Clin North Am, 36(4):1015-38. 79.
Liu EH, Herold KC. (2000) Transplantation of the islets of Langerhans: new
hope for treatment of type 1 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab, 11(9):379-82. 80.
Lowell BB, Shulman GI. (2005) Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes.
Science, 307(5708):384-7.
92
81.
Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, McKay R. (2001)
Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science, 292(5520):1389-94. 82.
Merani S, Shapiro AM. (2006) Current status of pancreatic islet transplantation.
Clin Sci (Lond), 110(6):611-25 83.
Miyazaki, S., Yamato, E., Miyazaki, J.(2003) Regulated expression of pdx-1
promotes in vitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stem cells. Diabetes, 53(4):1030-7. 84.
Moriscot C, de Fraipont F, Richard MJ, Marchand M, Savatier P, Bosco D,
Favrot M, Benhamou PY. (2005) Human bone marrow mesenchymal stem cells can express insulin and key transcription factors of the endocrine pancreas developmental pathway upon genetic and/or microenvironmental manipulation in vitro. Stem Cells, 23(4):594-603. 85.
Nanji SA, Shapiro AM. (2004) Islet transplantation in patients with diabetes
mellitus: choice of immunosuppression. BioDrugs, 18(5):315-28. 86.
Narendran P, Estella E, Fourlanos S. (2005) Immunology of type 1 diabetes.
QJM, 98(8):547-56. 87.
Oh SH, Muzzonigro TM, Bae SH, LaPlante JM, Hatch HM, Petersen BE. (2004)
Adult bone marrow-derived cells trans-differentiating into insulin-producing cells for the treatment of type I diabetes. Lab Invest, 84(5):607-17. 88.
Paik SG, Fleischer N, Shin SI. (1980) Insulin-dependent diabetes mellitus
induced by subdiabetogenic doses of streptozotocin: obligatory role of cell-mediated autoimmune processes. Proc Natl Acad Sci U S A, 77(10):6129-33. 89.
Pasquali L, Fan Y, Trucco M, Ringquist S. (2006) Rehabilitation of adaptive
immunity and regeneration of beta cells. Trends Biotechnol, 24(11):516-22. 90.
Peister A, Mellad JA, Larson BL, Hall BM, Gibson LF, Prockop DJ. (2004)
Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential. Blood, 103(5):1662-8. 91.
Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, Mars WM, Sullivan AK, Murase N,
Boggs SS, Greenberger JS, Goff JP. (1999) Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science, 284(5417):1168-70.
93
92.
Pierdomenico L, Bonsi L, Calvitti M, Rondelli D, Arpinati M, Chirumbolo G,
Becchetti E, Marchionni C, Alviano F, Fossati V, Staffolani N, Franchina M, Grossi A, Bagnara GP. (2005) Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation, 80(6):836-42. 93.
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD,
Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284(5411):143-7. 94.
Quesenberry PJ, Dooner G, Colvin G, Abedi M. (2005) Stem cell biology and the
plasticity polemic. Exp Hematol, 33(4):389-94. 95.
Rajagopal J, Anderson WJ, Kume S, Martinez OI, Melton DA. (2003) Insulin
staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science, 299(5605):363. 96.
Raskin P, Clements RS Jr. (1991) The use of human insulin derived from baker's
yeast by recombinant DNA technology. Clin Ther, 13(5):569-78. 97.
Rasmusson I. (2006) Immune modulation by mesenchymal stem cells. Exp Cell
Res, 312(12):2169-79. 98.
Ratajczak MZ, Zuba-Surma EK, Machalinski B, Ratajczak J, Kucia M. (2008)
Very Small Embryonic-Like (VSEL) Stem Cells: Purification from Adult Organs, Characterization, and Biological Significance. Cell Rev, 4(2):89-99. 99.
Rayat GR, Rajotte RV, Korbutt GS. (1999) Potential application of neonatal
porcine islets as treatment for type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci, 875:175-88. 100.
Rezzani R. (2004) cyclosporin A and adverse effects on organs:histochemical
studies. Prog Histochem Cytochem, 39(2) 85-128 101.
Rieger K, Marinets O, Fietz T, Körper S, Sommer D, Mücke C, Reufi B, Blau
WI, Thiel E, Knauf WU. (2005) Mesenchymal stem cells remain of host origin even a long time after allogeneic peripheral blood stem cell or bone marrow transplantation. Exp Hematol, 33(5):605-11. 102.
Ryan EA, Paty BW, Senior PA, Bigam D, Alfadhli E, Kneteman NM, Lakey JR,
Shapiro AM. (2005) Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes, 54(7):2060-9. 103.
Sanchez-Ramos JR. (2002) Neural cells derived from adult bone marrow and
umbilical cord blood. J Neurosci Res, 69(6):880-93.
94
104.
Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G, Asghar Z, Wheeler MB,
Korbutt G, van der Kooy D. (2004) Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology, 22(9):1115 – 1124. 105.
Segev H, Fishman B, Ziskind A, Shulman M, Itskovitz-Eldor J.
(2004)
Differentiation of human embryonic stem cells into insulin producing-clusters. Stem Cells, 22(3):265-74 106.
Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman
NM, Rajotte RV. (2000) Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med, 343(4):230-8. 107.
Sherry NA, Kushner JA, Glandt M, Kitamura T, Brillantes AM, Herold
KC.(2006) Effects of autoimmunity and immune therapy on beta-cell turnover in type 1 diabetes. Diabetes, 55(12):3238-45. 108.
Shi Y, Hou L, Tang F, Jiang W, Wang P, Ding M, Deng H.(2005) Inducing
embryonic stem cells to differentiate into pancreatic beta cells by a novel three-step approach with activin A and all-trans retinoic acid. Stem Cells, 23(5):656-62. 109.
Sipione S, Eshpeter A, Lyon JG, Korbutt GS, Bleackley RC. (2004) Insulin
expressing cells from differentiated embryonic stem cells are not beta cells. Diabetologia, 47(3):499-508. 110.
Suzuki A, Nakauchi H, Taniguchi H. (2004) Prospective isolation of multipotent
pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes, 53(8):2143-52 111.
Tamás Gy. Insulinkezelés. In: Halmos T., Jermendy Gy. (szerk.), Diabetes
mellitus elmélet és klinikum. Medicina, Budapest, 2002: 305.-332. 112.
Tang DQ, Cao LZ, Burkhardt BR, Xia CQ, Litherland SA, Atkinson MA, Yang
LJ. (2004) In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow. Diabetes, 53(7):1721-32. 113.
Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. (2006) Immunoregulatory function of
mesenchymal stem cells. Eur J Immunol, 36(10):2566-73. 114.
Verfaillie CM (2002) Adult stem cells: assessing the case for pluripotency.
Trends in Cell Biology, 12(11):502-508
95
115.
Wajchenberg BL. (2007) Beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical
treatment. Endocr Rev, 28(2):187-218. 116.
Winkler G. A diabetes mellitus diagnózisa, In: Halmos T., Jermendy Gy. (szerk.),
Diabetes mellitus elmélet és klinikum. Medicina, Budapest, 2002: 43.-44. 117.
Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. (2000) Adult rat and human
bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 61(4):364-70. 118.
Yalniz M, Pour PM. (2005) Are there any stem cells in the pancreas? Pancreas,
31(2):108-18. 119.
Yang L, Li S, Hatch H, Ahrens K, Cornelius JG, Petersen BE, Peck AB. (2002) In
vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormoneproducing cells. PNAS, 99(12):8078-8083 120.
Zalzman M, Gupta S, Giri RK, Berkovich I, Sappal BS, Karnieli O, Zern MA,
Fleischer N, Efrat S. (2003) Reversal of hyperglycemia in mice by using human expandable insulin-producing cells differentiated from fetal liver progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USA, 100 (12): 7253−7258. 121.
Zannettino AC, Paton S, Arthur A, Khor F, Itescu S, Gimble JM, Gronthos S.
(2008) Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol, 214(2):413-21. 122.
Zappia E, Casazza S, Pedemonte E, Benvenuto F, Bonanni I, Gerdoni E, Giunti
D, Ceravolo A, Cazzanti F, Frassoni F, Mancardi G, Uccelli A. (2005) Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy. Blood, 106(5):1755-61. 123.
Zaret KS. (2008) Genetic programming of liver and pancreas progenitors: lessons
for stem-cell differentiation. Nat Rev Genet, 9(5):329-40. 124.
Zhang L, Hu J, Hong TP, Liu YN, Wu YH, Li LS. (2005) Monoclonal side
population progenitors isolated from human fetal pancreas. Biochem Biophys Res Commun, 333(2):603-608. 125.
Zimmet JM, Hare JM. (2005) Emerging role for bone marrow derived
mesenchymal stem cells in myocardial regenerative therapy. Basic Res Cardiol, 100(6):471-81.
96
126.
Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz
HP, Hedrick MH. (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng, (2):211-28.
97
9. Publikációk jegyzéke A disszertációhoz kapcsolódó közlemények:
Folyóirat cikkek: 1. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Vas Virág, Kovács János, Uher Ferenc. (2006) A diabetes mellitus őssejtterápiája: eredmények, lehetőségek és kérdőjelek. Orvosi Hetilap, 147:791-797. 2. Zsuzsanna Kertész, Virág Vas, Judit Kiss, Veronika S. Urbán, Éva Pozsonyi, András Kozma, Katalin Pálóczi, Ferenc Uher. (2006) In vitro expansion of longterm repopulating hematopoetic stem cells in the presence of immobilized Jagged-1 and early acting cytokines. Cell biology International, 30: 401-405. (IF=1.363) 3. Veronika S. Urbán, Judit Kiss, János Kovács, Elen Gócza, Virág Vas, Éva Monostori, Ferenc Uher. (2008) Mesenchymal Stem Cells Cooperate with Bone Marrow Cells in Therapy of Diabetes. Stem Cells, 26: 244-253. (IF=7.531) 4. Kiss Judit, Urbán S. Veronika, Dudics Valéria, VasVirág, Uher Ferenc (2008) A mesenchymális őssejtek és az immunrendszer – immunszuppresszió gyógyszerek nélkül? Orvosi Hetilap, 149: 339-346.
Poszterek és előadások: 1. Kiss Judit, Vas Virág, Urbán S. Veronika, Monostori Éva, Uher Ferenc: A galektin-1 gátolja a vérképző ős- és elődsejtek ciklofoszfamid és granulocytakolónia-stimuláló faktor indukált mobilizációját. MIT XXXV. Vándorgyűlése, Sopron, 2005 (poszter), Magy Immunol 4:23. 2. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Kovács János, Monostori Éva, Uher Ferenc: A streptozotocin indukált 1-es típusú diabetes gyógyítható szingén csontvelősejtek és in vitro kultúrában tenyésztett allogén mesenchymalis őssejtek egyidejű transzplantációjával. MIT XXXV. Vándorgyűlése, Sopron, 2005 (poszter), Magy Immunol 4:42.
98
3. Uher Ferenc, Kiss Judit, Urbán S. Veronika, és Vas Virág: Regeneratív medicína és őssejtterápia: eredmények, lehetőségek és kérdőjelek. OGYK, Intézeti Tudományos Nap, 2005 (előadás) 4. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Kovács János, Uher Ferenc: A streptozotocin indukált 1-es típusú diabetes őssejtterápiája. OGYK, Intézeti Tudományos Nap, 2006 (előadás) 5. Urbán S. Veronika, Kovács János, Kiss Judit, Vas Virág, Gócza Elen, Monostori Éva, Uher Ferenc: Streptozotocin indukált (1-es típusú) diabetes őssejtterápiája I. A modell. XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Balatonfüred, 2007 (előadás) 6. Uher Ferenc, Kovács János, Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Gócza Elen, Monostori Éva, Vas Virág: Streptozotocin indukált (1-es típusú) diabetes őssejtterápiája II. A mechanizmus. XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Balatonfüred, 2007 (előadás) 7. Kiss Judit, Nagy György, Kovács János, Urbán S. Veronika, Andrikovics Hajnalka, Uher Ferenc: Őssejt plaszticitás és mitokondrium biogenezis. XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Balatonfüred, 2007 (előadás) 8. Urbán VS, Kiss J, Kovács J, Vas V, Monostori É, Uher F: Cooperativity between bone marrow cells and culture-expanded mesenchymal stem cell during reversal of type-1 diabetes. International Society of Haematology Congress of the European and African Division, Budapest, 2007 (poszter), Blood Rev 21 (Suppl 1):S98 (No. 039) (IF=5.756) 9. Urbán V.S, Kiss J, Kovács J, Vas V, Monostori É, Uher F: Cooperativity between bone marrow cells and culture-expanded mesenchymal stem cells during reversal of type-1 diabetes. Magyar Őssejtkutatás Szimpózium (ESTOOL), Budapest, 2008 (poszter) 10. Hegyi B, Sági B, Kiss J, Urbán V.S, Uher F: Phenotype, differentiation potential and immunomodulatory activity of mesenchymal stromal cells isolated from diverse mouse tissues. Magyar Őssejtkutatás Szimpózium (ESTOOL), Budapest, 2008 (poszter)
99
A disszertációtól független közlemények:
1. Suhajdáné Urbán Veronika. Általános szövettan. In: Polgár Veronika (szerk.): Szövettani alapismeretek (főiskolai tankönyv – S.E. E.F.K.) Budapest, 2003: 9-55 2. Mikala Gábor, Urbán S.Veronika, Masszi Tamás. (2007) A biszfoszfonátok myeloma-ellenes hatásai. Pathology Oncology Research. 13 (S1): 24-32. 3. Suhajdáné Urbán Veronika. Az eukarióta sejt szerkezete és működése. In: Polgár Veronika (szerk.) Alkalmazott biológia (főiskolai tankönyv – S.E. E.T.K.) Budapest, 2008: 46-99. 4. Suhajdáné Urbán Veronika. A molekuláris genetika alapjai. In: Polgár Veronika (szerk.) Alkalmazott biológia (főiskolai tankönyv – S.E. E.T.K.) Budapest, 2008: 249-260.
100
10. Köszönetnyilvánítás
Megköszönöm témavezetőmnek, Dr. Prof. Habil. Uher Ferencnek (Országos Vérellátó Szolgálat) hogy lehetővé tette, hogy a vezetése alatt álló Őssejt-biológia Osztályon dolgozhassak. Köszönet a szakmai irányításért, és a munkámhoz adott segítségért. Köszönöm Dr. Vas Virágnak és Kiss Juditnak – akik velem egyidejűleg szintén PhD hallgatóként az Őssejt-biológia Osztályon dolgoztak - a sikeres együttműködést és azt, hogy tudományos tapasztalataikat segítőkészen megosztották velem. Külön köszönet Ullrich Olgának és Renner Máriának az Őssejt-biológia Osztály asszisztenseinek mindig precíz munkájukért. A tudományos együttműködésért és önzetlen szakmai segítségért köszönettel tartozom: Dr. Monostori Évának (MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai intézet) Dr. Kovács Jánosnak és asszisztensének Sipos Saroltának (ELTE TTK Anatómiai,
Sejt és Fejlődésbiológiai Tanszék) Dr. Gaál Dezsőnek (Országos Onkológiai Intézet Kísérletes Farmakológiai Osztály) Dr. Gócza Elennek (MBK, Állatbiológiai Intézet, Gödöllő)
Köszönet
a
Semmelweis
Egyetem
Egészségtudományi
Kar
Tudományos
Bizottságának, hogy munkám eszközigényéhez hozzájárult.
Ez a munka nem jöhetett volna létre a NKTH (OMFB-00541/2004) támogatása nélkül.
101
