Semmelweis Egyetem, Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Klinikai Endokrinológia és Experimentális Vonatkozásai Program DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
A CONGENITALIS ADRENALIS HYPERPLASIA AKTUÁLIS DIAGNOSZTIKUS KÉRDÉSEI ÚJSZÜLÖTTKORTÓL A SERDÜLŐKORIG
Dr. Török Dóra
Témavezető: Prof. Dr. Sólyom János Készült: Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika, Budapest, 2004
1
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
5
ÖSSZEFOGLALÁS
6
SUMMARY
7
1.
BEVEZETÉS
8
2.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
9
2.1
DEFINÍCIÓ ÉS NÓMENKLATÚRA
9
2.2
PATOFIZIOLÓGIA
10
2.2.1 BIOKÉMIAI HÁTTÉR 2.2.1.1 Hormonszintézis a mellékvesében 2.2.1.1.1 A 21-hidroxiláz enzim 2.2.1.2 A szteroidhormonok szintézisének szabályozása 2.2.1.3 A szteroidbioszintézis zavara 21-OHD-ban
10 10 12 13 14
2.2.2 FEJLŐDÉSTANI HÁTTÉR 2.2.2.1 A mellékvese fejlődése 2.2.2.2 A nemi differenciálódás 2.2.2.2.1 A kóros intrauterin virilizáció CAH-ban
15 15 16 17
2.2.3 ÉLETTANI HÁTTÉR 2.2.3.1 Az aldoszteron szerepe az elektrolithomeosztázisban 2.2.3.1.1 Az elektrolitháztartás zavara CAH-ban 2.2.3.2 Az adrenarche 2.2.3.2.1 A korai adrenarche 2.2.3.3 A fertilitás zavarai 2.2.3.4 Társuló tumorok 2.2.3.5 Pszichoszociális problémák
17 17 18 18 19 19 19 20
2.3 DIAGNOSZTIKA 2.3.1 Újszülöttkori tömegszűrés 2.3.1.1 A vérfolt 17-OHP meghatározás akalmazása egyedi diagnosztika során 2.3.2 Szérum szteroid profil 2.3.3 Vizelet szteroid profil 2.3.4 Molekuláris genetika 2.3.4.1 Prenatális diagnosztika
20 21 24 25 25 26 27
2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3
TERÁPIA Farmakoterápia Sebészi rekonstrukció Pszichoszociális támogatás
28 28 29 29
3.
CÉLKITŰZÉSEK
30
4.
BETEGEK ÉS MÓDSZEREK
31
2
31 31 31 31 32 32 32
4.1 A 17-OHP STABILITÁSA BESZÁRÍTOTT VÉRFOLT MINTÁBAN 4.1.1 Az autoklávozás hatása a 17-OHP koncentrációra 4.1.1.1 Vérfolt mintában 4.1.1.2 Oldott formában 4.1.1.3 Az autoklávozás 4.1.2. A tárolás időtartamának hatása a 17-OHP koncentrációra 4.1.3 A beszárított vérfolt 17-OHP koncentrációjának meghatározása DELFIA módszerrel 4.1.4 Statisztikai elemzés
32
4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4
A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE MAGYARORSZÁGON Betegek A 17-OHP koncentráció meghatározása RIA módszerrel A CYP21 gén genotípusának meghatározása Statisztikai elemzés
33 33 33 34 34 34
4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4
4.3 A 21-OHD RETROSPEKTÍV BETEGEKBEN Betegek Módszerek A 21-OHD-s betegek klasszifikációja Statisztikai analízis
4.4
SZŰRÉSE
KÖZÉP-EURÓPAI
34 34 35 35
4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4
A 21-OHD AZONOSÍTÁSA MAGYARORSZÁGON VÉRFOLT 17-OHP MÉRÉSSEL Betegek A betegek klasszifikációja Módszerek Statisztikai analízis
4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5.4 4.5.5
4.5 A NEM-KLASSZIKUS CAH STIMULÁCIÓS PRÓBÁVAL Betegek ACTH-stimulációs próba Szteroid-mérések A CYP21 gén genotípusának meghatározása Statisztikai analízis
5.
EREDMÉNYEK
AZONOSÍTÁSA
ACTH-
35 36 36 36 37 37 37 37 38 38 38 39
5.1 A 17-OHP STABILITÁSA BESZÁRÍTOTT VÉRFOLT MINTÁBAN 5.1.1 Az autoklávozás hatása a 17-OHP koncentrációra 5.1.1.1 Vérfolt mintában 5.1.1.2 Oldott formában 5.1.2. A tárolás időtartamának hatása a 17-OHP koncentrációra 5.1.2.1 Autoklávozott minták 5.1.2.2 Natív minták 5.1.3 A születési súly és a 17-OHP koncentráció összefüggése
39 39 39 41 41 41 42 42
5.2
44
A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE MAGYARORSZÁGON 3
5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4
A négynapos korban mért 17-OHP koncentráció Életkor a diagnóziskor A diagnóziskor mért 17-OHP koncentráció A 17-OHP koncentráció összefüggése a mutáció súlyosságával
5.3
44 45 46 47
A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE KÖZÉP-EURÓPAI BETEGEKBEN 5.3.1 A 21-OHD-s betegek újszülöttkori 17-OHP-koncentrációi 5.3.2 A szűréssel nem azonosítható betegek klinikai jellemzése
48
5.4
A 21-OHD AZONOSÍTÁSA MAGYARORSZÁGON VÉRFOLT 17-OHP MÉRÉSSEL A vizsgált betegek klinikai jellemzése A CAH-ként diagnosztizált betegek klinikai jellemzői A vérfolt 17-OHP koncentrációk megoszlása A diagnosztikus módszer hatékonysága Az egy hónapos kor előtt diagnosztizált betegek jellemzése A CAH becsült magyarországi incidenciája
50
5.5 A NEM-KLASSZIKUS CAH AZONOSÍTÁSA ACTH-STIMULÁCIÓS PRÓBÁVAL 5.5.1 A vizsgált betegek klasszifikációja 5.5.1.1 Alacsony 17-OHP koncentrációk az ACTH-stimulációs próbában 5.5.1.2 Magas 17-OHP koncentrációk az ACTH-stimulációs próbában 5.5.1.3 Közepes 17-OHP koncentrációk az ACTH-stimulációs próbában 5.5.2 A 21-OHD betegek jellemzése 5.5.3 Az ACTH-stimulációs próba CAH és nem-CAH betegekben 5.5.4 Tünetek 5.5.5 A szérum szteroid profil CAH és nem-CAH betegekben
57
5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6
48 49
50 51 52 54 55 55
57 57 57 57 59 59 61 63
6. MEGBESZÉLÉS 6.1 A 17-OHP STABILITÁSA BESZÁRÍTOTT VÉRFOLT MINTÁBAN 6.2 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE MAGYARORSZÁGON 6.3 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE KÖZÉP-EURÓPAI BETEGEKBEN 6.4 A 21-OHD AZONOSÍTÁSA MAGYARORSZÁGON VÉRFOLT 17-OHP MÉRÉSSEL 6.5 A NEM-KLASSZIKUS CAH AZONOSÍTÁSA ACTH-STIMULÁCIÓS PRÓBÁVAL
63 63 64 65
7.
71
EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
68 69
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
74
IRODALOMJEGYZÉK
75
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
87
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 11β-HSD
11béta-hidroxiszteroid-dehidrogenáz-defektus
11β-OHD
11béta-hidroxiláz-defektus
17-OHP
17-hidroxiprogeszteron
21-OHD
21-hidroxiláz-defektus
ACTH
adrenokortikotrop hormon
AMH
anti-Müller-cső hormon
CAH
congenitalis adrenalis hyperplasia
CYP21
a 21-hidroxiláz enzim génje
CYP21P
21-hidroxiláz pszeudogén
DELFIA
dissociation enhancement lanthanide fluorescent immunoassay
DHEA
dehidroepiandroszteron
DHEAS
dehidroepiandroszteron-szulfát
DOC
dezoxikortikoszteron
ELISA
enzyme linked immunoassay
ER
endoplazmás retikulum
GC/MS
gázkromatográfia / tömegspektrometria
IGF-I
inzulinszerű növekedési faktor I
NC-CAH
nem-klasszikus, későn manifesztálódó CAH
P450aldo
citokróm P450 aldoszteron szintáz
P450arom
citokróm P450 aromatáz
P450c11β
citokróm P450 11béta-hidroxiláz
P450c17
citokróm P450 17alfa-hidroxiláz / 17,20 liáz
P450scc
citokróm P450 koleszterin dezmoláz
PACAP
pitutary adenylate cyclase activating peptide
PRL
prolaktin
RAS
renin-angiotenzin rendszer
RIA
radioimmunoassay
SRY
szex-determináló régió az Y kromoszómán
StAR
szteroid akut regulátoros protein
SV-CAH
egyszerű virilizáló (simple virilizer) CAH
SW-CAH
sóvesztő (salt wasting) CAH
TDF
testis determináló faktor
VIP
vazoaktív intestinalis polipeptid
WNT-4
a Drosophila wingless-fehérjecsalád egér homológja 4
βLPH
béta lipotróp hormon
γMSH
gamma melanocitastimuláló hormon 5
ÖSSZEFOGLALÁS
A congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) potenciálisan életveszélyes veleszületett mellékvese-betegség, ezért világszerte több helyen is bekerült az újszülöttkori tömegszűrő programok közé. Ez alapvetően megváltoztatta a diagnosztikus gyakorlatot, és átértékelte a klasszikus diagnosztikus eljárások szerepét. Az újszülöttkori szűrőprogramok álnegativitás arányáról kevés információ áll rendelkezésre. A CAH irányában történő szűrés álnegativitási arányát retrospektív szűrés során határoztuk meg, tárolt újszülöttkori vérfolt minták segítségével. Megállapítottuk, hogy a hosszú, évtizedes tárolás során egy csekély, évi 2-3%-os 17-hidroxiprogeszteron (17-OHP) csökkenés tapasztalható. Matematikai korrekció után az autoklávozás után mért 17-OHP alapján jó közelítéssel határozható meg az eredeti. Az autoklávozás után, vagy anélkül, akár tíz évig tárolt vérfolt minták tehát alkalmasak 17-OHP mérésen alapuló populációs vizsgálatok elvégzésére. A retrospektív szűrés során megmértük a tárolt vérfoltok 17-OHP koncentrációit, és azt a szűrés során szokásos módon értékeltük. Azt találtuk, hogy az életveszélyesen érintett, sóvesztő betegek mindegyikét képes azonosítani az újszülöttkori szűrés, de a kevésbé súlyosan érintett, egyszerű virilizáló betegek harmadát, az összes CAH beteg 10%-át nem lehet kiszűrni újszülöttkorban. Magyarországon a CAH nem része az újszülöttkori tömegszűrő programnak, a vérfoltból történő 17-OHP meghatározás egyedi sürgősségi diagnosztika keretében alkalmazható. Húsz év gyakorlatát áttekintve azt találtuk, hogy ezzel a gyakorlattal azonosítható a sóvesztő betegek gyakorlatilag mindegyike, de a fiúknál nem előzhető meg a sóvesztő krízis. A diagnózis felállításának időpontja későbbre tolódik, ami hosszú távon károsan érinti a terápiás kimenetelt. A CAH magyarországi incidenciáját 1:15000-nek találtuk, ami nagyon hasonló az európai országokban tömegszűrések során talált incidenciákhoz. A vérfolt mérés után, szűrés keretében vagy azon kívül, verifikációs vizsgálatok elvégzése javasolt. Az egyik legegyszerűbb és legelterjedtebb az ACTH-stimulációs próba. 280 vizsgálat retrospektív áttekintése során úgy találtuk, hogy az esetek többségében az ACTH-stimuláció egyértelműen elkülöníti a CAH betegeket, de az ACTH-ra adott közepes 17-OHP válasz esetén a betegek továbbvizsgálatára van szükség érzékenyebb módszerekkel.
6
SUMMARY Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a potentially life-threatening adrenal disorder. In the past twenty years in several countries neonatal screening for CAH was introduced. This changed the diagnostic practice of CAH, therefore the classical diagnostic methods should be reevaluated. There is a lack of information about the false negativity rate of the neonatal CAH screening. We determined the false negativity rate by means of retrospective screening of stored neonatal blood spot samples. We found that prolonged storage, e.g. a decade, decreased the 17-hidroxiprogesterone (17-OHP) by some 2-3% yearly. If the samples were autoclaved, the original 17-OHP concentration can be assessed by an additional mathematical correction step with acceptable precision. Stored blood spot samples, autoclaved or not, are therefore appropriate candidates for retrospective population studies based on 17-OHP measurements. In the retrospective screening blood spot 17-OHP concentrations were measured and analyzed exactly the same way as in the neonatal screening programs. We found that patients with the life-threatening salt-wasting form were all identified by the screening, on the contrary, one third of the simple virilizer patients, i.e. 10% of all CAH patients were not identified by the screening. In Hungary CAH is not included in the neonatal mass screening program. Blood spot 17OHP measurement is available for patients suspected to have CAH based on clinical signs and symptoms. We reviewed our past twenty years experience with this method. We found that all patients with the salt-wasting form were identified, however, the salt wasting crisis in boys cannot be prevented without a mass screening. Patients are diagnosed remarkably later without screening, which is unwelcome for the long-term outcome. Incidence of CAH in Hungary without mass screening was found to be 1:15 000, which is very similar to those found in Europe by the neonatal mass screening programs. The results of the blood spot 17-OHP measurements should be verified by at least measurement of 17-OHP in the serum. One of the most popular tests for verification is ACTH-stimulation test. By retrospective analysis of 280 ACTH-stimulation tests we found that in most of the cases this method differentiates clearly the CAH patients from the healthy population, however, a minority of the cases with moderately elevated 17-OHP response to ACTH should be further investigated by more sensitive and specific methods.
7
1. BEVEZETÉS A congenitalis adrenalis hyperplasia potenciálisan életveszélyes veleszületett mellékvesebetegség. Az újszülöttkori tömegszűrés széleskörű elterjedése alapvetően átalakította a congenitalis adrenalis hyperplasia diagnosztikus gyakorlatát. Megállapítást nyert, hogy az optimális terápiás eredmény előfeltétele a terápia mielőbbi megkezdése, ilyen esetben akár az egészségestől alig elmaradó életminőség is biztosítható lehet. Az újszülöttkori szűrés óriási mértékben javította a betegek kilátásait. Nagy létszámú, a kezdetektől szorosan követett kezelt betegcsoportról áll információ rendelkezésre, ami a terápia optimalizálását tette lehetővé. Vitathatatlan előnyei mellett azonban a tömegszűrés új problémákat is felvetett. Jelen értekezésben a congenitalis adrenalis hyperplasia diagnosztikája körül felmerült kérdéseket több szempontból is meg kívántuk közelíteni. A tömegszűrések során az álnegativitás valódi aránya csak nagyon átfogó, alapos és hosszadalmas utánkövetéssel határozható meg, különösen nehézkes ez egy ritka, és különböző súlyosságú
formákban
jelentkező
betegség
esetén.
Ugyanakkor
ennek
ismerete
elengedhetetlen a szűrés valódi hatékonyságának megítéléséhez. Ezért a congenitalis adrenalis hyperplasia irányába történő újszülöttkori tömegszűrés álnegativitási arányát nagy, nemzetközi beteganyagon, retrospektív szűrés keretében kívántuk meghatározni. Az újszülöttkori szűrések körében szokatlanul magas álpozitivitási arány miatt fokozott figyelem fordult a verifikációra alkalmas vizsgálatok precizitása felé. A szóba jövő vizsgálatok közül a legszélesebb körben hozzáférhető, az ACTH-stimulációs próba érzékenységét és precizitását kívántuk megvizsgálni. Magas költségvonzatai miatt, bár a szűrés elterjedtsége igen széleskörű, mégsem teljesen általános. A tömegszűrést nem folytató területeken a figyelem olyan metodikák felé fordult, melyek alkalmazzák a szűrés során kifejlesztett technikákat, de költséghatékonyabban igyekeznek a betegeket széles körben korai diagnózishoz segíteni. Ezen rendszerek közül a tömegszűrés
alternatíváját
kínáló
magyarországi
gyakorlatot,
a
vérfolt
17-
hidroxiprogeszteron-mérés egyedi diagnosztikában való alkalmazását kívántuk értékelni 20 év tapasztalatai alapján. Munkánk során tisztázni kívántuk a különböző diagnosztikus tesztek hasznosságát és hitelességét a betegellátást végző klinikus számára, másrészt fényt kívántunk deríteni az egyes diagnosztikus módszerek gyenge pontjaira, ahol még tökéletesítésre és fokozott figyelemre van szükség a betegek életminőségének további javítása érdekében.
8
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 DEFINÍCIÓ ÉS NÓMENKLATÚRA A congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) a kortizol bioszintézis valamelyik enzimjének genetikusan determinált hibája miatt alakul ki. Az esetek 95%-ában a hiányzó vagy sérült enzim a 21-hidroxiláz, a 17-hidroxiprogeszteron (17-OHP) nem tud 11dezoxikortizollá alakulni, emiatt a kortizoltermelés sérül. Az elégtelen kortizoltermelés miatt az ACTH elválasztás növekszik, ami egyrészt a mellékvesekéreg következményes hyperplasiáját, másrészt a blokk előtti kortizolprekurzorok, köztük a 17-OHP fokozott termelését, harmadrészt az androgének fokozott elválasztását és virilizációs tüneteket eredményez. Az enzimhiány súlyosságától függően az aldoszteron-bioszintézis is elégtelen lehet, ami az elektrolit-háztartás zavarához vezet. [103] A klinikai megjelenés alapján a CAH betegeket három típusba sorolták. A legsúlyosabb a klasszikus sóvesztő forma (SW-CAH), az ilyen betegeknél a 21-hidroxiláz enzim aktivitása közel nulla, sem kortizol-, sem aldoszteronszintézis nincsen, ezért a korai virilizáció (leány újszülöttben átmeneti külső nemi szervek, fiú újszülöttben macrogenitosomia) jelei mellett a mineralokortikoidok hiánya miatt az első élethetekben súlyos hyponatraemia és hyperkalaemia alakul ki, életveszélyes sóvesztő krízist okozva. Az életet közvetlenül nem veszélyezteti a klasszikus egyszerű virilizáló forma (SV-CAH), ahol csekély (1-5%-os) 21-hidroxiláz aktivitás mellett az előbbihez hasonló korai virilizáció alakul ki az elektrolitháztartás zavara nélkül. A megfelelő terápia elmaradása esetén korai pubarche lép fel mindkét nemben, a növekedés felgyorsul, majd hamar leáll, a végső testmagasság alacsony, későbbi életkorban infertilitás és mellékvese-tumor alakulhat ki. Újszülött-korban nem okoz tüneteket a nem-klasszikus forma (NC-CAH), intrauterin virilizáció és sóvesztés nincs, a korai pubarche vagy a normális pubertás lezajlása után jelentkező androgén-túlsúly tünetei (nőkben oligomenorrhoea, hirsutismus, akne, férfiakban oligozoospermia) alakulnak ki, mellékvese-tumor kialakulása lehetséges. A 21-hidroxiláz aktivitás az ilyen betegekben részben megtartott, 20-60% lehet. [175] A CAH betegek túlnyomó része compound heterozigóta, azaz a két allélon eltérő jellegű és súlyosságú mutációkat hordoz, ezért a betegekben kialakuló 21-hidroxiláz aktivitások a gyakorlatban folyamatos spektrumot képeznek az aktivitás teljes kiesésétől (SW-CAH betegek) az enzimaktivitás enyhe csökkenéséig (NC-CAH-ban előfordulhat panaszmentes hordozás) [61]. Az elektrolitzavar súlyosságát, a virilizáció mértéket egyéb genetikus (pl. androgénreceptor érzékenységének polimorfizmusa, a 11β-hidroxiszteroid dehidrogenáz 9
(11β-HSD) enzim aktivitásának polimorfizmusa, stb.) és nem genetikus (pl. stressz, elektrolitvesztéssel járó betegségek, stb.) faktorok is befolyásolhatják. Ennek tükrében érthető, hogy a CAH betegek klinikai képe egy folyamatos spektrumot alkot, ami csak mesterségesen osztható fel formákra, és egyes betegek kategorizálása nehézségekbe ütközik [175]. Ugyanakkor, mivel a különböző formák egészen eltérő rizikóval járnak (az életveszélyestől a csupán kozmetikai problémát okozóig), a spektrum ellentétes szélein lévő betegek ellátása mind diagnosztikusan, mind terápiásan eltérő stratégiákat kíván meg. 2.2 PATOFIZIOLÓGIA A 21-hidroxiláz-defektus (21-OHD) mindhárom formájának hátterében ugyanannak a biokémiai folyamatnak különböző mértékű sérülése, és ennek élettani és fejlődéstani következményei állnak. 2.2.1
BIOKÉMIAI HÁTTÉR
A 21-OHD-s CAH betegekben az alapvető rendellenesség a mellékvese csökkent kortizoltermelése a 21-hidroxiláz enzim defektusa miatt. 2.2.1.1 HORMONSZINTÉZIS A MELLÉKVESÉBEN A felnőtt mellékvesekéregben a mineralokortikoid, glukokortikoid és androgén hatású hormonok szintézise funkcionálisan és szövettanilag is elkülönül. A zona glomerulosa a mineralokortikoid, a zona fasciculata a glukokortikoid, a zona reticularis az androgénszintézis helye. Az anatómiai elkülönülés a bioszintézisben résztvevő enzimek sejtspecifikus expressziójának
következménye.
A
sejten
belül
a
bioszintézis
egyes
lépései
a
mitokondriumban, mások az endoplazmás reticulumban (ER) történnek. Az enzimek megfelelő sejten belüli lokalizációja a teljes enzimaktivitás előfeltétele. [50] A koleszterin a citoplazmából a mitokondriumba a StAR protein segítségével jut be [145]. A szteroidhormonok bioszintézisének első enzimatikus lépése (1.A ábra) a koleszterin oldalláncának hasítása (P450scc), és ezáltal pregnenolon képződése. A pregnenolon az összes szteroidhormon közös prekurzora. [50] A zona glomerulosában a 3β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz (3β-HSD) az ER-ban a pregnenolont progeszteronná alakítja. A progeszteront a 21-hidroxiláz (P450c21) az ER-ban dezoxikortikoszteronná (DOC) alakítja. Az aldoszteron a DOC-ból a 11β-hidroxilációt, a 18-
10
hidroxilációt, majd a 18-oxidációt követően alakul ki, melyeket egyetlen enzim, az aldoszteron-szintáz (P450aldo) végez. [2] A kortizol szintézise során a pregnenolont a 17-hidroxiláz/17,20-liáz (P450c17) 17-OHpregnenolonná alakítja az ER-ban a zona fasciculatában, és a zona reticularisban, ahol androgénszintézis irányában folytatódik a szteroidszintézis. A zona fasciculatában a 3β-HSD a 17-OH-pregnenolont 17-OHP-ná alakítja, amit a 21-hidroxiláz 11-dezoxikortizollá alakít. Ebből 11β-hidroxiláció (P450c11) után lesz kortizol a mitokondriumban. [95]
Koleszterin
CH3 C O OH
CH3 C O
P450c17
P450scc
HO
HO
Pregnenolon 3β-HSD
17α−OH-pregnenolon CH3 C O
O
3β-HSD
CH3 C O OH
17α-OH-progeszteron CH2OH C O
O
P450c21
1. A
HO
dehidroepiandroszteron
O
Progeszteron P450c21
O
P450c17
3β-HSD
O
O
ANDROSZTÉNDION
CH2OH C O OH
O
11-dezoxikortikoszteron 11-dezoxikortizol P45011β2/ P450c11 P450aldo CH OH CH OH 2
HO
2
C O
O
Kortikoszteron
HO
C O OH
mellékvese hyperplasia
O
1. B
KORTIZOL
P450aldo HO
CH2OH OCH C O
ACTH 17-OHP ↑
O
ALDOSZTERON
21-OHD aldoszteron ↓
virilizáció
ACTH ↑
sóvesztés
1. ábra
kortizol ↓
androgének ↑
A. A szteroidhormonok bioszintézisének főbb lépései. A 21-hidroxilázt és szubsztrátját,
a
17-OHP-t
vörös
szín
jelzi
[95
alapján].
B.
A
szteroidbioszintézis megváltozása 21-OHD-ban. A normális anyagcserét fekete, a 21-OHD-ban bekövetkező változásokat vörös szín, a patofiziológiai hatásokat dőlt felirat jelzi. A zona reticularisban és a gonádokban a P450c17 17,20-liáz aktivitása révén a 17-OHpregnenolonból dehidroepiandroszteron (DHEA) keletkezik, ami a 3β-HSD hatására
11
androszténdionná alakul. A gonádokban a 17β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz (17β-HSD) tesztoszteronná alakítja az androszténdiont mindkét nemben [112]. Az ováriumban az aromatáz (P450arom) az androszténdiont ösztronná, a tesztoszteront ösztradiollá alakítja [130]. A tesztoszteron a célszervekben az 5α-reduktáz hatására dihidrotesztoszteronná alakul, így érve el teljes biológiai aktivitását [177]. A mellékvesekéregben a 21-hidroxiláz tehát a kortizol és az aldoszteron szintézisében vesz részt, az androgénekében nem. In vivo 100-1000-szer több kortizol termelődik, mint aldoszteron, ezért a 21-hidroxiláz aktivitásának részleges csökkenése esetén elképzelhető, hogy az aldoszteronszintézis biológiailag még elégséges, de a kortizoltermelés már nem. A 21-hidroxiláz fő szubsztrátja a 17-OHP (2.2.1.1.1 és 2.2.1.3), ezért 21-OHD esetén ennek koncentrációja
fog
jellegzetesen
és
nagy
mértékben
megemelkedni.
A
17-OHP
karakterisztikus emelkedése több diagnosztikus módszer alapját is képezi (2.3). 2.2.1.1.1
A 21-HIDROXILÁZ ENZIM (P450c21)
A CAH hátterében az esetek 90-95%-ban a 21-hidroxiláz enzim génjének mutációja áll. Jóval ritkábbak az egyéb formák, a gyakoriság sorrendjében a P450c11, a P450c17, a 3β-HSD és a StAR proteint érintő mutációk miatt kialakuló CAH. [103] A 21-hidroxiláz egy mikroszomális citokróm P450 enzim, a 17-OHP → 11dezoxikortizol és a progeszteron → DOC reakciókat katalizálja. Más mikroszomális P450ekhez hasonlóan működése során elektront vesz fel egy NADPH-dependens citokróm P450 reduktáztól, így a szubsztrát hidroxilációja során molekuláris oxigén redukálódik. [68] Az egészséges („vad”) 21-hidroxiláz enzim 494 aminosavból áll, molekulatömege 52 kDa [174]. A rekombináns humán P450c21 Km értéke 17-OHP-ra 1,2 μM, progeszteronra 2,8 μM, a 17-OHP Vmax-a a progeszteronénak mintegy kétszerese, azaz a 17-OHP a preferált szubsztrát [161]. A P450c21 enzim pontos térszerkezete nem ismert, a konzervatív szakaszok és más citokróm P450 enzimek térszerkezetének ismerete alapján összeállított hipotetikus modell áll rendelkezésre (2. ábra) [96]. Ez a modell funkcionálisan négy régiót különböztet meg. 1) A hem-kötő régió épsége elengedhetetlen a katalitikus funkcióhoz. 2) Az oxigén- és vízkötő régió a hem közelében van, az oxigén és víz kötése feltétele a hidroxilációnak. 3) A szubsztrátkötő régió elsősorban hidrofób aminosavakból áll, a szteroidok erősen hidrofób természete miatt ez nélkülözhetetlen. 4) Az elektront szolgáltató járulékos proteinnek
12
(citokróm P540 reduktáz) kötőhelyét nagyrészt bázikus aminosavak alkotják, a járulékos proteinen a kötőhelyen savas aminosavak vannak. [96] A 21-hidroxiláz enzim génje a 6. kromoszómán, a 6p21.3 régióban található. A gén szerkezetét, a transzkripciót és a 21-OHD-t okozó mutációkat a 2.3.4 fejezet ismerteti.
2. ábra
A 21-hidroxiláz enzim feltételezett térszerkezete. Fehér jelöli a hélixeket (hEhL), piros a leggyakoribb pontmutációkat. [96]
2.2.1.2 A SZTEROIDHORMONOK SZINTÉZISÉNEK SZABÁLYOZÁSA A szteroidhormonok bioszintézisének sebességét meghatározó lépés a koleszterin transzportja a sejt raktáraiból a mitokondrium belső membránjának mátrix felőli oldalára, ahol az oldallánc hasítását végző enzim található (P450scc). A koleszterin szállítását, valószínűleg nem kizárólag, de elsősorban, a StAR protein végzi, melynek mennyiségét az ACTH szabályozza. [145] A kortizol szekréciója elsősorban ACTH szabályozás alatt áll. Specifikus receptora heterotrimer G-fehérjékhez kapcsolódik, ezen keresztül emeli az intracelluláris cAMP koncentrációt. A cAMP emelkedése akutan (percek-órák) növeli a mitokondriumba irányuló koleszterintranszportot (StAR protein), krónikusan (órák-napok) a kortizol bioszintézisében résztvevő enzimek, köztük a 21-hidroxiláz transzkripcióját serkenti. Az ACTH szintén serkenti a koleszterin felvételét a plazma lipoproteinekből, és a mellékvesék méretét is szabályozza. [175] Az ACTH szekréciójának elsődleges pozitív regulátora a hipotalamikus CRH. A vazopresszin a CRH-val szinergizmusban stimulálja az ACTH elválasztását [125]. A CRH elválasztását a hipotalamikus peptidek (pl. VIP, PACAP) parakrin módon szabályozzák [101]. A CRH, és ennek következtében az ACTH elválasztása is pulzatilis. A kortizol napi ritmusát a szekrétoros periódusok frekvenciája határozza meg, a szérum kortizolkoncentrációja 13
hajnalban a legmagasabb, és éjszaka a legalacsonyabb. Az ACTH szekréciójának elsődleges negatív regulátora maga a kortizol, a klasszikus glukokortikoid receptoron keresztül mind az ACTH-ra, mind a CRH-ra negatív visszacsatolást gyakorol. Napi ritmusán kívül a kortizolkoncentrációt erősen befolyásolja számos anyagcserehatás, fizikai vagy emocionális stressz is az ACTH-n keresztül. [42] Az
aldoszteron
elválasztását
elsősorban
az
angiotenzin
II
és
a
szérum
káliumkoncentrációja határozza meg, az ACTH-nak csak az akut hatása érvényesül [13, 117, 137]. A mellékvese androgéntermelésének szabályozása nem teljesen tisztázott. Fontos stimuláló szerepe van az ACTH-nak, de emellett fontos hipofízis eredetű (pl. β-LPH, γ-MSH, β-endorphin, PRL) és nem hipofízis eredetű faktorok (pl. IGF-I) is hatnak rá. [42] 2.2.1.3 A SZTEROIDBIOSZINTÉZIS ZAVARA 21-OHD-BAN A 21-hidroxiláz enzim aktivitásának csökkenése a mellékvese hormonszintézisének komplex zavarát eredményezi. Az enzimaktivitás csökkenése vagy kiesése negatívan befolyásolja a kortizol és az aldoszteron bioszintézisét, és, bár a bioszintézisükhöz nincs szükség
a
21-hidroxilázra,
a
felbillent
szabályozás
miatt
serkentőleg
hat
az
androgéntermelésre. Az elégtelen kortizolbioszintézisre a hypothalamus és a hipofízis, a negatív visszacsatolás kiesése miatt, fokozott CRH és ACTH elválasztással reagál. A magas ACTH-koncentráció nem követi a fiziológiás napi ritmust. A tartós, erőteljes stimuláció hatására a mellékvese megnagyobbodik. A folyamatos stimuláció azonban nem képes helyreállítani az egyensúlyt, a kortizol irányú bioszintézis a 17-OHP-nál megakad, eközben az androgén irányú szintézis akadálytalanul történhet a magas ACTH által diktált fokozott ütemben. A termelt 17-OHP és az adrenális androgének a keringésbe kerülnek, az extraadrenális szövetekben az androszténdion
tesztoszteronná
és
dihidrotesztoszteronná,
illetve
kisebb
mértékben
ösztrogénekké alakul. A célszerveken az androgénhatás dominál, leánymagzatokban intrauterin virilizáció alakul ki, mindkét nemben a szomatikus fejlődés felgyorsulásához és az epifízisek korai záródásához vezet. A klasszikus betegek háromnegyede nem tud az elektrolitegyensúly fenntartásához elegendő aldoszteront sem termelni. Ez az állapot epizodikusan az életet veszélyeztető hyponatraemiás dehidrációhoz vezet. (1.B ábra) [175] A 21-hidroxiláz csökkent aktivitásának eredményeként a keringésbe fokozott mennyiségben jut ki az enzim fő szubsztrátja, a 17-OHP. Egészségesekben a szérum 17-OHP szintje igen alacsony, a 21-OHD legkarakterisztikusabb biokémiai eltérése a 17-OHP
14
koncentráció emelkedése a szérumban [47], és metabolitjainak fokozott jelenléte a vizeletben [27, 180]. A 17-OHP és metabolitjainak meghatározására épülnek a legszélesebb körben használt diagnosztikus tesztek, de egyes esetekben ezek értékelhetősége korlátozott (2.3) [49]. A korai újszülöttkorban (1. életnap) még a 21-OHD-s betegeknek is lehet alacsony 17-OHP szintjük [36], ill. a nem 21-OHD-s koraszülöttek 17-OHP szintje magas lehet [85, 100]. Csak a 17OHP meghatározásával a 21-OHD nem különíthető el egyértelműen a CAH többi formájától, ez a teljes szteroid profil meghatározásával lehetséges [135]. A szérum 17-OHP koncentrációja nagyjából korrelál a betegség súlyosságával, a legsúlyosabban érintett sóvesztő betegekben mérhetők a legmagasabb 17-OHP koncentrációk [138]. A 21-hidroxiláz enyhe érintettsége esetén (NC-CAH betegek) stresszmentes állapotban a 17-OHP koncentráció alacsony lehet. 21-OHD-re karakterisztikus, hogy ACTH stimuláció hatására (2.3.2) a mellékvese igen erőteljes 17-OHP elválasztással válaszol. [98] Kezeletlen CAH betegekben emelkedett lehet továbbá a progeszteron, az androszténdion és kisebb mértékben a tesztoszteron koncentrációja. A 21-dezoxikortizol megjelenése a szérumban igen jellemző a 21-OHD-ra, a DHEA és a DHEAS azonban nem jó markerek, hosszú féléletidejük miatt nem reagálnak jól az akut ACTH stimulációra. [48] 2.2.2
FEJLŐDÉSTANI HÁTTÉR
2.2.2.1 A MELLÉKVESE FEJLŐDÉSE A
mellékvesekéreg
mezodermális
eredetű,
a
6-7.
magzati
héttől
kezdve
szteroidhormonokat választ el. Felnőttkori szerkezete, a zona reticularisra, glomerulosára és fasciculatára való tagolódás, csak az extrauterin élet során alakul ki, intrauterin két zónából áll, a belső magzati és a külső felnőtt zónából [123]. A magzati mellékvese fő terméke a DHEAS, ami a magzati májban való átalakulás után a placentában ösztrogénné alakul. A 8. hét előtt nem működik a magzati hipofízis-mellékvese-tengely, és működése a későbbiek során is eltér az extrauterin életben tapasztalttól. Az első trimeszterben a placenta 11βhidroxiszteroid- dehidrogenáz (11β-HSD2) aktivitása alacsony, ezáltal relatíve szabadon juthat anyai kortizol a magzati keringésbe (ugyanis nem alakítódik kortizonná), ami szupprimálja a magzati ACTH-t. A harmadik trimeszterre fokozódik a placenta 11β-HSD2 aktivitása, az anyai kortizol egyre kevésbé képes átjutni a magzatba, akinek saját kortizol
15
termelése megnő, és a keringő kortizol szintje emelkedik [4, 169]. A mellékvesevelő megfelelő fejlődéséhez magas lokális kortizolkoncentrációra van szükség [28]. Az intrauterin életben tehát a mellékvesekéreg működésének szabályozása és termékei eltérnek a későbbi élet során tapasztalhatóktól, a magzat, az anya ill. a placenta enzimrendszerei
egymást kiegészítően működnek. Ebből következik egyrészt, hogy a
koraszülöttek mellékvesekérge, más szervrendszerekhez hasonlóan, még az intrauterin fejlődés egy korábbi fázisában van, termékei eltérnek az érett újszülött mellékveséjének termékeitől [85, 100, 169]. Másrészt a mellékvese hormonszintézisének veleszületett hibája, pl. a 21-OHD az intrauterin életben nem csak a magzati hipofízis-mellékvese tengelyt borítja fel, a feto-placento-maternalis egység révén a korai újszülöttkor hormonálisan eltérhet a későbbiektől [36], illetve a magzati mellékvese sajátosságait a prenatális terápia során is figyelembe kell venni (2.3, 2.4) [119]. 2.2.2.2 A NEMI DIFFERENCIÁLÓDÁS A 7. héten válik ketté férfi és női irányba az addig indifferens és bipotenciális gonádok fejlődése. Fiúmagzatban, azaz Y kromoszóma jelenlétében ekkor kezdődik az indifferens gonádok here irányú differenciálódása a testis-determináló génkaszkád termékeinek hatására [88]. A TDF (testis determináló faktor) génje a Y kromoszómán található (SRY), a géntermék transzkripciós faktorként további, immár autoszomális gének promóteréhez kötődve egy sor növekedési és transzkripciós faktor termelését indítja meg (pl. AMH), melyek a hereszövet kialakulását szabályozzák. Y kromoszóma (vagy működő SRY) jelenléte nélkül, azaz leány magzatban az indifferens gonádok petefészek irányban fejlődnek tovább, de ez sem passzív folyamat, pl. a WNT-4 aktív szerepet játszik az ováriumok differenciálódásában [162]. A fiúmagzat heréinek Sertoli sejtjei a 7. héttől AMH-t (anti-Müller-cső hormon, vagy MIF) termelnek, melynek hatására a Müller-cső visszafejlődik, és a Wolff-csőből epididymis, ductus deferens és vesicula seminalis alakul ki magas lokális tesztoszteron koncentráció mellett, amit a herék Leydig sejtjei biztosítanak. Leánymagzatban AMH hiányában a Müllercső fennmarad, és hormonális hatás nélkül is kialakul belőle a tuba uterina, az uterus és a vagina felső kétharmada [81]. A külső nemi szervek kezdeményei kezdetben szintén bipotenciálisak, a férfi irányú differenciálódás a tesztoszteron metabolitjának, az 5α-dihidrotesztoszteronnak (DHT) hatására történik, és szükséges hozzá az androgénreceptor (AR) épsége. Magas DHT koncentráció mellett a genitális redők fúzionálnak, a genitális gumó megnagyobbodik, az urethra és a genitális csatorna nyílása rostrum felé vándorol. Alacsony DHT koncentráció 16
mellett leánymagzatban mindez elmarad, a sinus urogenitalis és az uterus közötti sinovaginalis lemez kanalizációja során kialakul az introitus [177]. 2.2.2.2.1
A KÓROS INTRAUTERIN VIRILIZÁCIÓ CAH-BAN
A hipofízis-mellékvese tengely érése és a nemi differenciálódás tehát időben párhuzamosan zajlik. Leánymagzatokban a mellékvese eredetű abnormálisan magas androgénszint a belső nemi szervek fejlődését nem érinti, mert AMH nincs, és lokálisan ez a tesztoszteron koncentráció nem olyan magas, mint a here eredetű lenne. A külső nemi szerveken viszont változó mértékű virilizáció alakulhat ki, a genitális gumó enyhe megnagyobbodásától (clitoromegalia) a cryptorchismusos férfinak imponáló külső nemi szervekig. A külső női nemi szervek virilizáltságának megítélése a Prader skála szerint lehetséges (Pr I: clitoromegalia, Pr V: teljes labiális fúzió, phallus-szerű clitoris). [115] A fiúmagzatok differenciálódásában a fölös adrenális androgén általában nem okoz látványos elváltozásokat. Leány újszülötteknél tehát az intrauterin virilizáció korai figyelmeztető jele a CAH-nak, fiúknál csak a később jelentkező tünetek (sóvesztés, pubarche praecox) hívhatják fel a figyelmet a betegségre. [69, 80] 2.2.3
ÉLETTANI HÁTTÉR
2.2.3.1 AZ ALDOSZTERON SZEREPE AZ ELEKTROLITHOMEOSZTÁZISBAN Az aldoszteron hatását az orientált iontranszportot folytató epithelialis sejteken (vese disztális kanyarulatos csatorna alsó szakasza, corticalis gyűjtőcsatorna principális sejtjei, vastagbél és exokrin mirigyek kivezetőcső hámsejtjei) fejti ki. Serkenti a Na+ áramlását a sejt luminális oldaláról az interstitium felé a K+ ellenirányú áramlása mellett, összességében tehát elősegíti a szervezet Na+ konzerválását a K+ és H+ leadása mellett. A Na+ az extracelluláris tér fő kationja, ezért a szervezet só-, víz-, volumen- és ozmoregulációjában is részt vesz. Az aldoszteron elválasztás fő ingere a RAS (reninangiotenzin
rendszer)
aktiválódása
a
vese
vérátáramlásának
csökkenése
esetén
(juxtaglomeruláris apparátus), részben a szimpatikus tónus növekedése révén. A szérum emelkedő K+ szintje közvetlenül a glomerulosa sejteken serkenti az aldoszteron elválasztását. [2, 42, 137]
17
2.2.3.1.1
AZ ELEKTROLITHÁZTARTÁS ZAVARA CAH-BAN
A klasszikus CAH betegek mintegy háromnegyede a kortizol mellett nem képes elegendő aldoszteront sem szintetizálni, ezért Na+ vesztés következik be a vesén, a vastagbélen és az izzadságmirigyeken keresztül. CAH-ban az aldoszteron hiányán kívül még több tényező is súlyosbítja a hyponatraemiát, és vezet sokk kialakulásához. A glukokortikoidok hatására nő a cardiac output, a szívizom kontraktilitása, a szív és érrendszer érzékenysége a katekolaminok iránt. Kortizol hiányában ez elmarad, a szív teljesítménye csökken, ezáltal a vese vérátáramlása és a GFR is csökken, a szabad víz kiválasztása elmarad, és hyponatraemia alakul ki. Ezért klasszikus CAH betegekben a sokk kialakulása sokkal valószínűbb, mint az aldoszteron izolált hiánya esetén. [76] A mellékvesevelőben a katekolaminok szekrécióját végző enzimek működéséhez magas lokális kortizol koncentráció kell, ennek hiányában a katekolaminok szekréciója is elégtelen lehet. A katekolaminok presszorhatásának elmaradása tovább súlyosbítja a sokkot. [20, 28] A felgyülemlő abnormális szteroidprekurzorok antimineralokortikoid hatást fejthetnek ki. A progeszteron antimineralokortikoid hatása jól ismert, a 17-OHP-ről ezt nem sikerült kimutatni. [71] A sóvesztés kezdeti tünetei aspecifikusak, mint az étvágytalanság, hányás, letargia és a súlygyarapodás elmaradása. A sóvesztő krízis 1-4 hetes korra alakul ki hyponatraemiával, hyperkalaemiával és hyperreninaemiával. Ez a potenciálisan életveszélyes állapot megfelelő orvosi
ellátás
nélkül
jelentős
mortalitáshoz
vezet.
Különösen
a
fiúcsecsemők
veszélyeztetettek, akiknél ez lehet a betegség egyetlen és első tünete, ami végzetesen késlelteti a diagnózis felállítását. Ez az indoka számos országban az újszülöttkori tömegszűrés működtetésének. [80] Az életkor előrehaladásával a betegek Na+-egyensúlya javul, és a kisgyermekkor elmúlásával a sóvesztő krízis kialakulása ritka. A sóvesztés súlyossága, a krízisek kialakulása különböző lehet azonos mutációt hordozó betegek, de még testvérek között is [178]. Ez további genetikai és nem-genetikai faktorok jelentős módosító hatását veti fel. 2.2.3.2 AZ ADRENARCHE Nyolc éves kor körül a zona reticularis mérete megnő, ezzel egyidejűleg emelkedik a szérum DHEAS koncentrációja, majd felgyorsul a hossznövekedés. A változás független az ACTH, kortizol vagy aldoszteron elválasztásától. Hátterében feltételeztek egy független „androgén-stimuláló hormont”, de ennek jelenlétét igazolni eddig nem sikerült. Az adrenarche megelőzi a normális pubertás beindulását. [175] 18
2.2.3.2.1
A KORAI ADRENARCHE
A korai adrenarche kialakulása a kezeletlen CAH jellemző tünete, a DHEAS enyhe és a 17-OHP jelentős emelkedése kíséri. Az adrenális eredetű androgének következtében korán felgyorsul a hossznövekedés, az epifízisek érése, ami az epifízisek korai záródásához, és végeredményben alacsony testmagassághoz vezet. Fiúkban megjelenhet a nemi szőrzet, és a pénisz növekedése figyelhető meg a herevolumen növekedése nélkül. Lányokban a clitoromegalia progresszív lehet, a szeméremszőrzet megjelenése hasonló, később hirsutismus és akne alakulhat ki. [89] Az adrenarche praecox talaján előfordulhat valódi, centrális pubertas praecox kialakulása. A magas adrenális eredetű androgénszint beindíthatja a gonadotropinok szekrécióját. [116] 2.2.3.3 A FERTILITÁS ZAVARAI CAH lányokban a menarche időpontja későbbre tolódik az egészséges populációhoz képest. A tünetek összessége hasonló lehet a policisztás ovárium szindrómához: vérzészavar, petefészekciszták, anovuláció, hirsutismus, akne jelentkezhet [10, 40]. Fiatal felnőttkorban mindehhez az inzulinérzékenység csökkenése társulhat manifeszt diabétesz nélkül [140]. Kezelt klasszikus CAH betegekben spontán terhesség is lehetséges. Terhesség alatt a glukokortikoid-igény megnövekszik, de az anyai emelkedett androgénszint ellenére sem a leánymagzatok virilizációja, sem a veleszületett rendellenességek gyakoribb előfordulása nem tapasztalható. [86] Férfiakban ritkábbak a fertilitás zavarai, mint nőkben. A spermaszám alacsonyabb lehet, mint az egészséges populációban, de ez nem feltétlenül befolyásolja a fertilitást. A reproduktív funkciót csökkentő legsúlyosabb komplikációt a mellékvese maradvány-szövet (adrenal rest tissue) jelenti. A herében található kis mellékvese-sziget a magas ACTH hatására megnövekszik, és fizikailag nyomást fejt ki az ép hereszövetre, és azt károsítja. Megfelelő adrenális szuppresszióval kialakulása megelőzhető. [7] 2.2.3.4 TÁRSULÓ TUMOROK A véletlenül felfedezett mellékvese-daganatok mintegy 60%-ában kóros 17-OHP válasz tapasztalható ACTH-stimulációra, de a germline CYP21 mutációk aránya alacsony [16, 155, 156]. Ugyanakkor a mellékvese-tumorok kialakulásának gyakorisága magasabb CAH betegekben és heterozigóta hordozókban [111]. Szövettanilag adenoma, myelolipoma és hemangioma alakulhat ki. Szteroid-érzékeny nodularis adrenalis hyperplasia alakulhat ki a 19
korábban nem diagnosztizált betegekben későbbi életkorban. Ritkán virilizáló mellékvesekarcinóma is kialakulhat, de a gyermekekben kialakuló daganatok többsége jóindulatú. [83] Az adrenal rest tumorok a kezeletlen vagy nem megfelelően kezelt CAH betegekben már gyermekkorban is kialakulhatnak. Esetenként gondot jelenthet elkülönítésük a Leydig sejtes tumoroktól, melyek szintén termelhetnek 17-OHP-t. [7] 2.2.3.5 PSZICHOSZOCIÁLIS PROBLÉMÁK A kóros intrauterin androgénexpozíció hatása a központi idegrendszerre összetett. Kisgyermekkorban a CAH beteg lányok előnyben részesítik a fiús játékokat, a nagy mozgásigényű, agresszívabb viselkedést, későbbi életkorokban ez a különbség megszűnni látszik [15]. A CAH gyermekekben egy vizsgálat az androgénérzékeny félelem és agresszióközpontot, az amygdalát kisebbnek találta, mint egészségesekben, de ennek összefüggése a pszichológiai tesztekkel nem bizonyított [93]. A nemi orientáció, ill. a szexuális aktivitás inkább a genitoplasztika eredményességével, semmint a prenatális androgénhatással mutat összefüggést. Túlnyomórészt a CAH gyermekek neuropszichológiai fejlődése normális, és a lányok többsége női identitású és heteroszexuális érdeklődésű. [70] 2.3 DIAGNOSZTIKA A 21-OHD különböző súlyosságú formáinak diagnosztizálására labortechnikailag gyakorlatilag azonos módszerek alkalmasak, azonban a nagyon különböző klinikai szituációk miatt ezek alkalmazása eltérően szervezett körülmények között kell, hogy történjen. Újszülöttkorban – tömegszűrés kapcsán, vagy ennek hiányában a CAH-ra utaló tünetek felmerülése esetén – a fenyegető hipadréniás krízis miatt sürgősséggel kell a mérésnek megtörténnie, és inkább az álpozitivitás, mint az álnegativitás irányába történő tévedés az elfogadható, azaz inkább egy nem érintett gyermeknél kerüljön sor további vizsgálatokra, minthogy egy érintett kezelés nélkül maradjon. Későbbi életkorban, amikor életveszélyes szövődménytől nem kell tartani, a kivizsgálást sem kell sürgősséggel végezni, a terápia indításával a diagnózis igazolásáig várni lehet. A fentieken kívül gazdaságossági szempontokat is figyelembe véve a vizsgálatok elvégzése és a terápia megindítása az alábbi ábrán látható egymásra épülő sorrendben ajánlott (3. ábra).
20
NINCS
VAN
ÚJSZÜLÖTTKORI TÖMEGSZŰRÉS
ÚJSZÜLÖTTKORI TÖMEGSZŰRÉS VÉRFOLT 17-OHP
Tünetek bármilyen életkorban
0-2 hó
4. napon kóros
Mintavétel további vizsgálatokra, majd azonnali terápia: hydrocortison + fludrocortison
normális
normális
SE 17-OHP + elektrolitok
>3 hó
kóros
VÉRFOLT 17-OHP
CAH bármely formájának valószínűsége kicsi.
kóros
Nincs további teendő. NC-CAH nem zárható ki.
normális
ACTH stimulációs próba kóros
PRA/ALDO + elektrolitok kóros
SW-CAH Terápia: hydrocortison + fludrocortison
3. ábra
normális
4 éves kor fölött
NC-CAH Terápia: hydrocortison
normális* 4 éves kor alatt
SV-CAH Terápia: hydrocortison
verifikáció, CAH más formáinak kizárása: genetikai vizsgálat vizelet szteroid profil
A CAH diagnosztikájának és kezdeti terápiájának ajánlott folyamatábrája tömegszűréssel vagy a magyarországi gyakorlat szerint, szűrés nélkül. A vérfolt 17-OHP mérés egyedi diagnosztikában való alkalmazása a tömegszűrés alternatívája, a vérfolt mérést követő verifikációs lépések gyakorlatilag megegyeznek. Nem minden lépés kötelező, de a vérfolt 17-OHP mérést legalább szérum 17-OHP-méréssel ki kell egészíteni. A mintavételeknek még a terápia megkezdése előtt vagy terápiás szünetben kell történniük. *: Az újszülöttkori tömegszűrés során a SV-CAH és SW-CAH betegek nem különíthetők el, mert a diagnózis felállítása az elektrolit eltérések kialakulása előtt történik. A sóvesztés megítélésére későbbi életkorban kerülhet sor.
2.3.1
ÚJSZÜLÖTTKORI TÖMEGSZŰRÉS
A CAH irányában végzett újszülöttkori tömegszűrés elsődleges célja a sóvesztő krízis miatti mortalitás csökkentése. A CAH esetében teljesülnek az újszülöttkori tömegszűrés fő feltételei: kellően gyakori és életveszélyes betegség, megfelelő szűrőmódszer áll
21
rendelkezésre, és a korai felismerés és terápia alapvetően csökkenti a morbiditást és mortalitást [109, 126]. A CAH tömegszűrés szervezetileg a többi újszülöttkori tömegszűréssel együtt történik, a szűrőpapírra beszárított vérfoltból 17-OHP meghatározás is történik. Az első vérfoltot alkalmazó 17-OHP RIA 1977-ben került kifejlesztésre [106], azóta nem-radioaktív ELISA [94] és DELFIA [52] módszerek is rendelkezésre állnak. Ezek a módszerek nem tartalmaznak extrakciós és purifikációs lépést, ezért, bár eredményük jól korrelál a szérum 17-OHP koncentrációval, azzal nem tekinthető teljesen azonosnak. Emiatt, pozitív szűrési eredmény esetén a betegek továbbvizsgálata ajánlott a diagnózis verifikálása érdekében [179]. Elterjedt gyakorlat, hogy az elvágási határ kettős: az alacsonyabb határ fölé eső betegeknél megismétlik a mintavételt, míg a magasabb határ fölé eső betegek, a sóvesztő krízis nagy rizikója miatt, azonnal kórházba kerülnek [108]. A szűrőprogramokkal szemben támasztott általános elvárás, hogy inkább szenzitívek, mint specifikusak legyenek. A CAH-szűrések visszahívási határa módszerenként és programonként eltérő, de általában olyan alacsonyak, hogy a pozitív prediktív érték mindössze 2% [175]. A koraszülött, beteg vagy stresszelt újszülöttek 17-OHP koncentrációja magasabb (2.2.2.1) [100], ez az érett, egészséges újszülöttek alapján kalkulált elvágási határok mellett magas álpozitivitási arányt eredményez [120]. Ez egyrészt megemeli a költségeket, másrészt fölöslegesen nagy terhet ró a betegek visszahívását és az utánkövetést végző intézményekre, és nem utolsó sorban a családokra [59]. Ezért számos próbálkozás irányul a specificitás növelésére. Általánosan elterjedt a születési súlyra [5, 150], vagy a gesztációs korra [52, 154] korrigált elvágási határok alkalmazása, estleg az életkorra való korrigálással kiegészítve [102]. Felmerült a 17-OHP mérés kiegészítése a kérdéses esetekben genetikai vizsgálattal vagy kortizol meghatározással az eredeti mintából [94]. Az álnegatív eredényeket a túl korai mintavételnek (1. életnap) vagy az újszülöttkori szteroidterápiának tulajdonították a vizsgálatokban [179], bár más eredmények szerint a prenatális szteroidterápia nem zavarja a szűrést [64] . Az álnegativitás valódi arányáról azonban kevés adat áll rendelkezésre. A szenzitivitás növelése érdekében Texasban a szűrést 1-2 hetes korban megismétlik, de ez nagyon megnöveli a költségeket, és a klasszikus CAH betegek mindegyikét már az első mintavétel során azonosítani lehetett [150]. A világszerte végzett újszülöttkori tömegszűrések a klasszikus CAH incidenciáját általában 1 : 10 000 és 1 : 18 000 közé teszik (1. táblázat). A legmagasabb incidenciák
22
földrajzilag izolált populációkban, Alaszkában egy eszkimó közösségben és az Indiai-óceán La Reunion francia szigeten fordulnak elő [107, 110].
Alaszka, Yupik eszkimók Franciaország, La Reunion Brazília Svédország Svájc USA, Wisconsin Franciaország, Lille USA, Texas Kanada Skócia Spanyolország Olaszország Japán Új-Zéland 1. táblázat
Incidencia 1 : 280 1 : 2 100 1 : 7 533 1 : 9 800 1 : 10 970 1 : 11 000 1 : 13 000 1 : 16 000 1 : 16 666 1 : 17 000 1 : 17 239 1 : 18 000 1 : 18 000 1 : 23 000
CAH / vizsgált 5 / 1 131 7 / 14 987 11 / 82 870 73 / 715 400 6 / 65 823 14 / 149 684 31 / 408 138 121 / 1 936 998 3 / 50 000 7 / 119 960 12 / 206 875 27 / 420 960 250 / 4 500 000 23 / 536 915
[107] [110] [97] [152] [143] [5] [26] [150] [78] [110] [105] [11] [147] [34]
A 21-OHD incidenciája a világ különböző országaiban a tömegszűrések eredményei alapján.
Az esetkontrollos tanulmányok és a tömegszűrések eredményeinek összehasonlításával kimutatták, hogy a szűrés csökkenti a 21-OHD-s csecsemők, elsősorban a fiúk halálozását [69], csökkenti továbbá a diagnózis felállításáig eltelt időt, a hyponatraemia súlyosságát, és a betegek valamivel kevesebb időt töltenek kórházban [11, 24, 150, 152]. Bár a halálozás felkészült, jól szervezett regionális csecsemőellátás mellett csökkenthető [134, 166], az első sóvesztő krízis szűrés nélkül csak a lányoknál előzhető meg, akiknél a virilizált külső nemi szervek
már
az
elektroliteltérések
kialakulása
előtt
felhívhatják
a
figyelmet
a
rendellenességre. A minél korábbi pontos diagnózis csökkenti a felnevelési nem téves megállapításának arányát, ezáltal kisebb pszichés teher hárul a családokra [62, 142]. A CAH tömegszűrés költséghatékonysága, az álpozitivitás magas arány miatt, folyamatos vita tárgya. Közöltek arra utaló eredményeket, hogy 4 napos korban nem azonosítható az összes SV-CAH beteg, ehhez egy második mintavételre van szükség 1-2 hetes korban, ami tovább növeli a költségeket [23, 151]. A kérdés reális megítéléséhez elengedhetetlen az álnegatív esetek valódi arányának ismerete. A szűrőprogramok során a vizsgálatok elvégzése után a maradék mintákat akár egy évtizedig is tárolják. Ha a tárolás során a 17-OHP stabilitása a mintákban megfelelő, az ismert CAH betegek 4 napos kori mintája kikereshető, 23
és a 17-OHP meghatározásával megbecsülhető, hogy a bizonyítottan CAH betegek hány százalékát nem azonosította volna a szűrés. A CAH szűrés valódi álnegativitási aránya tehát retrospektív szűréssel meghatározható. A szűrési eredmények interpretálását tovább bonyolítja, hogy esetenként NC-CAH betegek is azonosításra kerülhetnek a szűrés során, de ez se nem megbízható, se nem költséghatékony módja a betegek diagnosztizálásának [147, 150]. Jelenleg nem állnak még rendelkezésre az újszülöttkorban azonosított NC-CAH betegek követési adatai, így nem tudható, később milyen arányban jelentkeznek náluk az androgéntúltermelés tünetei [175]. 2.3.1.1
A
VÉRFOLT
17-OHP
MEGHATÁROZÁS
AKALMAZÁSA
EGYEDI
DIAGNOSZTIKA SORÁN A tömegszűrés elterjedtsége széleskörű, de nem teljesen általános. A világszerte születő gyermekek túlnyomó többsége nem esik át CAH-szűrésen. Az ilyen területeken a diagnózis minél előbbi felállítását segítik az olyan rendszerek, melyek a szűrés során használt vérfolt 17-OHP mérés gyorsaságát használják ki, és minden, CAH-ra veszélyeztetett beteg számára hozzáférhetőek [133]. A tömegszűrés és az egyedi diagnosztika közötti átmenetet képezi pl. a Cseh Köztársaságban 2001-ben bevezetett rendszer, melynek során a fiúk újszülöttkori tömegszűrése kiterjed a CAH-szűrésre is, a lányoké nem, mert közöttük a sóvesztésre veszélyeztetettek az átmeneti külső nemi szervek alapján elvileg időben kiszűrhetők. Magyarországon a CAH iránti szűrés semmilyen formában nem része az újszülöttkori tömegszűrő programnak. A 17-OHP meghatározására vérfolt mintából 1978-tól van hazánkban lehetőség. A tüneteik alapján CAH-ra gyanús, bármilyen életkorú betegektől az ellátást végző intézményben mintavétel történik szűrőpapírra, a beszárított vérfolt továbbítása a központi laboratóriumba egyszerű és gyors. A 17-OHP meghatározás eredményéről az ellátó intézmény 6-48 órán belül értesül, és konzultációs lehetőség áll rendelkezésre a további ellátást illetően. Ez a gyakorlat a tömegszűrésnél költségkímélőbb, ugyanakkor a SW-CAH fiúk első sóvesztő krízisét semmilyen módon nem tudja megelőzni, de a tünetes betegek adekvát ellátását és a sóvesztés miatti mortalitást hatékonyan javítja [134].
24
2.3.2
SZÉRUM SZTEROID PROFIL
A 17-OHP koncentrációja pontosabban határozható meg szérum mintából, mint vérfoltból. A 17-OHP koncentrációja mérsékelten emelkedett lehet más CAH formákban is, pl. 11β-OHD-ban [135]. A 21-OHD elkülöníthető a többi, ritkább CAH típustól további szteroidmérésekkel, a 17-OHP mellett informatív a kortizol, a DOC, DHEA, az androszténdion, a tesztoszteron, továbbá a 11-dezoxikortizol és a 17-OH-pregnenolon szérumkoncentrációja. 21-OHD-ban emelkedett lehet a 17-OHP-n kívül a progeszteron, az androszténdion és kisebb mértékben a tesztoszteron koncentrációja [57, 58]. Egy atípusos szteroid, a 21-dezoxikortizol koncentrációjának emelkedése 21-OHD-ban jellegzetes [48]. Az elkülönítést tovább segíti a hormonok ACTH-stimulációs próba során történő vizsgálata. 250 μg iv. bólusban adott ACTH hatására az enzimatikus blokk előtti prekurzor, 21-OHD-ban a 17-OHP koncentrációja jellegzetesen megemelkedik 60 perc után [98]. Három hónapos kor fölött a szteroidmérésekhez, akár vérfoltból, akár szérumból történnek, a mintavételt, a kortizol napi ritmusának kialakulása miatt, reggel kell végezni [146]. A bazális szteroidkoncentrációk alapján nehezen eldönthető esetekben az ACTHstimulációs próba eredménye döntő lehet. Különösen későbbi életkorban, NC-CAH gyanúja esetén lehet erre szükség [132]. Korábbi vizsgálatok [98, 121] igazolták, hogy a bazális és az ACTH-ra adott 17-OHPválasz a 21-hidroxiláz-aktivitás érzékeny markere. Kimutatták, hogy a tünetmentes heterozigóta hordozók valamivel magasabb 17-OHP-választ adnak, mint azok, akik nem is hordozzák a betegséget, de alacsonyabbat, mint a tünetes 21-OHD betegek. Mivel a 21-OHD mind a fennmaradó enzimaktivitás, mind a klinikai kép szempontjából folyamatos spektrumot képez, felmerül a kérdés, hogy az ACTH-stimulációra adott válasz spektruma is folyamatos-e, és ebben az esetben lehetséges-e az ACTH stimulációs próba eredménye alapján minden esetben diagnózist mondani, vagy a bazális 17-OHP értelmezéséhez hasonlóan, az ACTH stimulációs eredményeknél is meg kell különböztetni a „pozitív” és „negatív” között egy átmeneti zónát, ahol a betegek további vizsgálata indokolt. 2.3.3
VIZELET SZTEROID PROFIL
A vizelettel ürülő szteroidmetabolitok vizsgálata az egyes CAH-formák precíz elkülönítését teszi lehetővé. A gázkromatográfia / tömegspektrometria (GC/MS) segítségével végzett meghatározás igen pontos, egyszerre nyújt információt az összes ürülő szteroidról, és mentes az antitestreakcióknál olykor zavaró keresztreaktivitási problémáktól [57, 58]. Régóta
25
az immunoassay-k referenciaméréseként alkalmazzák, de munka- és szakértelem-igényessége, valamint magas költségvonzata miatt a napi gyakorlatban nem terjedt el. Az utóbbi években a fejlesztés a technika hozzáférhetőbbé tétele felé irányult, és egyre nagyobb teret kaphat a 21OHD diagnosztikájában [180]. 2.3.4
MOLEKULÁRIS GENETIKA
A CYP21 gén a 6p21.3 régióban található az MHC III régió mellett, tőle 30 kb távolságban a CYP21P pszeudogén helyezkedik el, a C4A és C4B komplement faktorokkal alternálóan (4. ábra) [25, 173]. Itt található még az RP1 (G11) DNS-helikázhoz hasonló nukleáris fehérje génje, és ennek töredék-változata, az RP2 [124]. A CYP21 gén átfed a másik szálon található tenascin-X, egy extracelluláris mátrix fehérje génjével [21]. A CYP21 és a CYP21P 10-10 exonból állnak, és legalább 96%-ban azonosak, azonban a pszeduogénnek funkcionálisan ép terméke nincsen [174]. A tény, hogy az ebben a régióban található gének egymás mellett két nagyon hasonló kópiában találhatók meg, arra enged következtetni, hogy ez a régió egy ősi megkettőződés következtében alakult ki, és az eredeti gének mellett egy sor működő (C4B) vagy nem működő (CYP21P) másolat helyezkedik el. Ennek a megkettőződésnek több, a 21-OHD kialakulását és diagnosztikáját érintő következménye van. Populációgenetikai vizsgálatok igazolták, hogy a CYP21-t érintő leggyakoribb pontmutációk a CYP21P-n is megvannak, valószínűleg a gének közötti rekombináció során onnan másolódtak át az ép génbe. Ezzel a mechanizmussal a de novo mutációk kialakulásának gyakorisága is nagyobb, mint az olyan szakaszokon, ahol pszeudogén nincsen [55, 176]. A betegséget okozó leggyakoribb mutációk fő jellemzőit a 2. táblázat foglalja össze. A pszeudogén jelenléte a mutációk azonosítását is megnehezíti, ugyanis a detektálás során el kell különíteni, hogy a kimutatott mutáció a CYP21-ben vagy a pszeudogénben vane. A 8 leggyakoribb pontmutáció kimutatására gyors és viszonylag egyszerű lehetőség az allél-specifikus PCR, de ez a módszer a makrokonverziók és a nagy deléciók kimutatására nem alkalmas. A módszer biztonságát növeli a szülői DNS-ek egyidejű vizsgálata.
26
RP1
C4A
CYP21P RP2
C4B
TNXA
4. ábra
TNXB
A CYP21 gén elhelyezkedése a 6p21.3 régióban [175]
Deléció Konverzió P30L Int2Splice I172N V281L R356W Q318X L307Tins
2. táblázat
CYP21
Enzimaktivitás (%) 0 0 30-60 <5 1 20-50 0 0 0
Hatás nincs enzim nincs enzim ER orientáció? abnormális splicing ER insertio? hem kötés? ER? reduktáz interakció nonszensz frameshift
Klinikai forma SW-CAH SW-CAH NC-CAH SV-SW-CAH SV-CAH NC-CAH SW-CAH SW-CAH SW-CAH
A CYP21-et érintő leggyakoribb mutációk, és hatásuk az enzim aktivitására és a fenotípusra. [175 alapján]
2.3.4.1 PRENATÁLIS DIAGNOSZTIKA Chorionboholy-mintából lehetséges a magzat CYP21 génjének vizsgálata. A prenatális diagnosztika kiemelt jelentőségét az adta, hogy az ún. prenatális terápia során lehetséges az érintett leánymagzatok kóros virilizációjának megelőzése. Az anya által a terhesség 7-8. hetétől szedett dexamethason átjut a placentán, és megelőzi, hogy a nemi differenciálódás során túlzott adrenális androgén hatás érje a fejlődő nemi szerveket. A megszületett leánycsecsemőkön kedvező eredményeket sikerült elérni, de az anyák változó mértékben tolerálták a glukokortikoid kezelés mellékhatásait [91], és állatkísérletes eredmények alapján felvetődött [131], hogy az intrauterin dexamethason expozíció esetleges kedvezőtlen központi idegrendszeri hatásai nem eléggé ismertek a prenatális terápia széles körű alkalmazásához, ezért az újabb ajánlások a prenatális terápiát kutatási jellegűnek minősítik, és folytatását néhány centrumnak tartják fenn [62]. A prenatális diagnosztika mindazonáltal genetikai tanácsadás keretében felajánlható azon családoknak, ahol már született 21-OHD-os gyermek, és a szülők a tanácsadást igénylik.
27
2.4 TERÁPIA A CAH-os betegek ellátása multidiszciplináris feladat, a gyermekendokrinológus, a sebész és a pszichológus összehangolt munkájára van szükség. Az optimális terápiás eredmény elérésének előfeltétele az adekvát terápia mielőbbi megkezdése, a minél hamarabbi pontos diagnózis. 2.4.1
FARMAKOTERÁPIA
A klasszikus és a nem-klasszikus betegek kezelésének egyaránt a glukokortikoid-pótlás az alapja, ami nem csak a hiányzó kortizol pótlására szolgál, de a hipofízis-mellékvese tengely
szuppressziójával
a
kóros
androgéntermelést
is
csökkenti.
A
fiziológiás
kortizoltermelés ismeretében (6-7 mg/m2/die) [63, 84] az ajánlott napi adagot 10-20 mg hydrocortison/m2/die-re csökkentették [1, 62], ami kedvezőbb növekedési eredményeket is hozott, mint a korábban alkalmazott, magasabb dózisok [12, 54, 114, 144, 164]. Az orális hydrocortison biológiai hasznosulása közel 100% [30]. A hosszabb hatású glukokortikoidok, a prednisolon és a dexamethason káros hatást gyakorolnak a csontfejlődésre, de az epifízisfugák záródása után kényelmesebben, napi 1-2 adagban alkalmazhatók [99]. Stressz, műtét, lázas betegség esetén a szokásos szubsztitúciós dózist a háromszorosára ajánlott emelni [31]. A
glukokortikoid
pótlás
monitorozására
17-OHP
koncentrációk
és
a
növekedés/csontosodás alakulásának követése alkalmas módszer. A 17-OHP mérése a diagnosztikában is alkalmazott vérfolt-méréssel is lehetséges [136]. A csontosodás követésére évente csontkor meghatározást kell végezni, és pontosan dokumentálni a növekedési ütemet [129]. A túlzott szuppresszió jele az alacsony 17-OHP, a lassú növekedés és az elhízás. A
SW-CAH
betegek
mineralokortikoid-
és
NaCl-pótlásra
is
szorulnak
elektrolitegyensúlyuk fenntartásához. 0,1-0,2 mg/die fludrocortison általában megfelelő, a PRA és a vérnyomás követése tájékoztat a szubsztitúció megfelelő voltáról. Az életkor előrehaladtával a mineralokortikoid-igény csökken [1]. Vannak arra utaló adatok, hogy SVCAH betegeknél, akik ugyan képesek elegendő kortizolt termelni, a terápia kiegészítése mineralokortokoidokkal segíti a szuppressziót, és csökken a glukokortikoid-igény, ami hosszú távon kedvezően hat a növekedésre [175]. A jobb növekedés érdekében egy vizsgálatban a gyógyszeres terápiát flutamiddal (antiandrogén) vagy testolactonnal (aromatáz inhibitor) próbálták kiegészíteni, de a valódi pubertas praecox megjelenésének nagyobb gyakoriságát találták [79]. Gyermekeknek és fiatal
28
nőknek, ha elkerülhető, az antiandrogén terápia nem ajánlott [118]. Egy másik vizsgálatban a jobb növekedés érdekében a terápiát növekedési hormon adásával egészítették ki [116]. 2.4.2
SEBÉSZI REKONSTRUKCIÓ
A virilizált leánycsecsemők átmeneti külső nemi szerveinek sebészi rekonstrukcióját 1218 hónapos kor körül tartják ideálisnak elvégezni [62]. Esetenként pubertáskorban egy második korrekció válhat szükégessé. A rekonstrukció sikeressége nagyban függ a virilizáltság fokától, a genitoplasztikán átesett betegek mintegy 60%-a minősíti kielégítőnek az eredményt felnőtt korában [9]. Szóba jövő további sebészeti terápiás beavatkozás az adrenalectomia. Felvetették, hogy a gyógyszeresen nehezen kontrollálható betegeknél jobb eredményt lehet elérni, ha a mellékveséket, mint a fölös androgének forrását eltávolítják, és tulajdonképpen addisonosként kezelik a betegeket tovább [165]. Az eljárás nem terjedt el, mert túlságosan kiszolgáltatja a betegeket egy iatrogén mellékvese-elégtelenségnek, a DHEA-termelés kiesése pedig hosszú távon rontja az életminőséget [6, 74]. A modern terápiás irányelvek szem előtt tartásával általában enélkül is biztosítható a megfelelő kontroll. 2.4.3
PSZICHOSZOCIÁLIS TÁMOGATÁS
A CAH beteg gyermekeknek és szüleiknek már a szülőszobától kezdve hozzáértő pszichés támogatásra lehet szükségük az interszex csecsemő okozta megrázkódtatás feldolgozására, és a hosszú távú jó orvos-beteg együttműködés megalapozására. A genitoplasztikára
szoruló
gyermekeket
életkoruknak
megfelelően
tájékoztatni
kell
állapotukról, és arról, hogy mi történik velük. A szomatomentális fejlődési zavarok nagyon ritkák. Magatartási zavarok, aggresszívebb viselkedés elszórtan előfordulhatnak, de megfelelő támogatás mellett, elfogadó környezetben a CAH betegek zavartalan pszichoszociális fejlődése biztosítható [175].
29
3
CÉLKITŰZÉSEK Korábbi kutatások egyértelműen igazolták, hogy az optimális betegellátás, a 21-OHD
miatti morbiditás és mortalitás csökkentése a pontos diagnózis minél korábbi felállítása révén valósulhat meg. Munkánk során a CAH diagnosztikája körül felmerülő alábbi kérdésekre kerestük a választ. 1) Az autoklávozás befolyásolja-e, és ha igen, milyen módon a szűrőpapíron beszárított vérfolt minta 17-OHP koncentrációját? 2) A hosszú, évtizedes szobahőn történő tárolás során a szűrőpapíron beszárított vérfolt minta 17-OHP koncentrációja megváltozik-e? 3) Tárolt vérfolt mintákon igazolható-e a születési súly és a 17-OHP koncentráció összefüggése? 4) Alkalmasak-e az autoklávozás után vagy anélkül tárolt szűrőpapíron beszárított újszülöttkori vérfolt minták 17-OHP mérésen alapuló populációs vizsgálatok elvégzésére? 5) Tárolt, újszülöttkori vérfolt mintákon „retrospektív” szűréssel a magyarországi és közép-európai CAH betegek mekkora arányban azonosíthatók, mekkora az álnegativitás aránya? 6) A „retrospektív” szűrés során nem azonosítható, álnegatív betegeknek mik a közös klinikai jellemzőik? 7) Magyarországon tömegszűrés nélkül a vérfolt 17-OHP meghatározás egyedi diagnosztikában való alkalmazásával a klasszikus CAH betegek mekkora hányada azonosítható? 8) Magyarországon, tömegszűrés nélkül milyen életkorban lehetséges a CAH betegek azonosítása? 9) A magyarországi CAH regiszter alapján mekkora a CAH becsült magyarországi incidenciája? 10) Milyen elvágási határok ajánlhatók az ACTH stimulációs próba értékelésében? 11) Az ACTH stimulációs próba során is tapasztalható-e a CAH súlyossági spektrumának folyamatos jellege?
30
4. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK A retrospektív szűrések során (Magyarország, illetve Közép-Európa) az adott területeken folyamatban lévő diagnosztikus rutinra vonatkozó információkat próbáltunk szerezni, ezért a 17-OHP-kocentrációkat (az átváltásból és kerekítésből adódó statisztikai pontatlanságok elkerülése érdekében) az adott területen szokásos dimenzióban ismertetjük. Magyarországon a jelenleg szokásos mértékegység a ng/ml, az ausztriai újszülöttkori tömegszűrésben, és így a stabilitási vizsgálatokban és a közép-európai retrospektív szűrésben is nmol/l-t használtunk (1 ng/ml=3 nmol/l). 4.1 A 17-OHP STABILITÁSA BESZÁRÍTOTT VÉRFOLT MINTÁBAN [160] A retrospektív szűréshez bizonyítottan CAH-os betegek és egészséges kontrollok archívumban tárolt vérfolt mintáit használtuk fel. Mivel az osztrák archívumba autoklávozás után kerültek a minták, ezért a 17-OHP stabilitását meg kellett vizsgálnunk (1) autoklávozással szemben és (2) hosszú tárolás során. 4.1.1 AZ AUTOKLÁVOZÁS HATÁSA A 17-OHP KONCENTRÁCIÓRA A 17-OHP stabilitását autoklávozással szemben megvizsgáltuk (1) szűrőpapírra (Scleicher-Schüll 2992) szárított vérfolt mintában és (2) vizes oldatban. 4.1.1.1 VÉRFOLT MINTÁBAN 25 érett újszülött és 25 koraszülött új szűrőpapír-mintáját használtuk fel. Megmértük a minták 17-OHP koncentrációját (natív minta) DELFIA neonatal 17α-OH-progesterone kittel (Wallac, Oy, Turku, Finnország), majd a maradék mintát kiautoklávoztuk, és újból megmértük a 17-OHP-t a DELFIA módszerrel (autoklávozott minta) (4.1.3). 4.1.1.2 OLDOTT FORMÁBAN Az oldott 17-OHP stabilitásának vizsgálatához egy 29,59 nmol/l 17-OHP koncentrációjú vizes oldatot készítettünk. Az oldat felét kiautoklávoztuk, majd autoklávozás után az elpárolgott vizet pótoltuk. Mind a natív, mind az autoklávozott oldatból 6-6 cseppet szűrőpapírra cseppentettünk, és beszárítottuk. A natív oldatból további mintát cseppentettünk szűrőpapírra, beszárítottuk és kiautoklávoztuk. A minták 17-OHP koncentrációját DELFIA módszerrel (4.1.3) határoztuk meg.
31
4.1.1.3. AZ AUTOKLÁVOZÁS A szűrőpapírokat a mintavétel évében autoklávozták egy Varioklav Dampfsterilizator, Typ 400 (H+P Labortechnik GmbH, München, Németország) típusú készülékben 5 percig, 121 oC-on, 100% páratartalmon, automatikusan beállított nyomás mellett. 4.1.2. A TÁROLÁS IDŐTARTAMÁNAK HATÁSA A 17-OHP KONCENTRÁCIÓRA A hosszú távú szobahőmérsékleten történő tárolás hatását külön megvizsgáltuk az autoklávozott és a natív mintákon. Minden év első 40, az alábbi születési súly kritériumokat teljesítő szűrőkártyáját válogattuk ki az archívumból: 25 db minta 2500 g fölötti újszülöttől, 5 db 2000-2500 g közöttitől, 5 db 1500-2000 g közöttitől, 5 db 1500 g alattitól. Az autoklávozott mintákat az osztrák szűrőpapír-archívumból kerestük ki 1991 és 2000 közötti mintákból (összesen 400 minta), a natív minták a cseh szűrőpapír-archívumból származtak 1988 és 2000 között (összesen 520 minta). 4.1.3
A
BESZÁRÍTOTT
VÉRFOLT
17-OHP
KONCENTRÁCIÓJÁNAK
MEGHATÁROZÁSA DELFIA MÓDSZERREL A 17-OHP stabilitási vizsgálatokban a 17-OHP koncentrációját a DELFIA neonatal 17αOH-progesterone kittel (Wallac Oy, Turku, Finnország) határoztuk meg a gyártó útmutatása szerint. Az egész éjszakán át tartó inkubációs protokoll szerint, azaz a 3 mm-es szűrőpapírkorongokat − a standardot, a kontrollt és az ismeretlen mintákat − 18-22 órán át inkubálva a módszer detekciós határai 0,2 nmol/l és 260 nmol/l vér. A görbe hasznos tartománya (80%20% gátlás) 7 és 110 nmol/l vér közé esik. Az intra-assay variancia 7,0 CV% volt 21,9 nmol/l 17-OHP koncentrációnál natív mintákon, és 6,8 CV% volt 12,3 nmol/l 17-OHP koncentrációnál autoklávozott mintákon. A megfelelő koncentrációknál az inter-assay variancia 7,9 CV% és 8,0 CV% volt. A fluoreszcencia mérésére és az eredmények kiszámítására a Victor 1420 Multilabel Countert (Wallac Oy, Turku, Finnország) használtuk. 4.1.4 STATISZTIKAI ELEMZÉS Az autoklávozás előtti és utáni 17-OHP-kocentrációkat párosított t-próbával hasonlítottuk össze, a korrelációt a Pearson-féle lineáris korrelációs koefficienssel jellemeztük. A korrigált autoklávozott 17-OHP és a natív 17-OHP koncentráció közötti relatív (százalékos) különbséget úgy számítottuk ki, hogy az abszolút különbséget elosztottuk a két mérés átlagával Bland és Altman módszere szerint [17, 18]. A relatív különbséget a mérések
32
átlagának függvényében ábrázoltuk. Mivel feltehető, hogy a mérési hibák függetlenek, a relatív különbség varianciája (VD) VD=CV%A2+CV%N2, ahol CV%A2 a korrigált autoklávozott, CV%N2 a natív minták CV%-nak a négyzete. CV%A ezek alapján CV%A=√(VD-CV%N2). A tárolási idő hatásának vizsgálatakor lineáris regressziót alkalmaztunk a logtranszformált 17-OHP koncentráció és az eltelt idő között. A születési súly hatását a 17-OHP koncentrációra nem-paraméteres Kruskall-Wallis teszttel elemeztük. A p<0,05-öt tekintettük szignifikanciaszintnek. A statisztikai elemzéseket a SigmaStat és SigmaPlot (SPSS Inc., Chicago, IL, 2000), valamint a SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, 2000) szoftverekkel végeztük. 4.2 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE MAGYARORSZÁGON [157] 4.2.1 BETEGEK Huszonhét 1993 és 1997 között született, genetikai vizsgálattal igazoltan 21-OHD-s beteg mintáit használtuk fel. Az országos szűrőközpontok archívumaiból kikerestük a négynaposkori, tárolt vérfoltmintákat (újszülöttkori minta), továbbá a diagnózis felállítása során vett első, terápia előtti mintát saját archívumunkból (diagnosztikus minta). Kontrollként a szűrőközpontok archívumából, azonos évekből származó, véletlenszerűen választott 104 négynaposkori vérfoltminta szolgált. A 21-OHD-s betegek nem és diagnózis szerinti megoszlása a következő volt: 18 sóvesztő: 11 lány és 7 fiú; 9 egyszerű virilizáló: 8 lány, 1 fiú. 4.2.2 A 17-OHP KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA RIA MÓDSZERREL Mind az újszülöttkori, mind a diagnosztikus minta Scleicher-Schüll 2992 szűrőpapírra beszárított vérfolt. A 17-OHP RIA pontos jellemzőit korábban ismertettük [136]. Röviden, 5 mm átmérőjű korongokat vágtunk ki a vérfoltokból. Az extrakciót 1,0 ml metanol : dietil-éter : etil-acetát keverékkel végeztük. Az extrakció hatékonysága 83%, az intra-assay variancia 11,1 CV%, az inter-assay variancia 13,8 CV% volt. Az antiszérum 18,9%-os keresztreaktivitást mutatott progeszteronnal, és 3,7%-ot kortizollal. A vérfolt (y) és a szérum (x) 17-OHP koncentráció (ng/ml) lineáris regressziós egyenese y=9,3+1,28x volt.
33
A vérfolt RIA-módszerre vonatkozó elvágási határokat egy korábbi vizsgálat során határoztuk meg [134]. Egy hónapos kor alatt 80 ng/ml, 1,1 és 3 hónapos kor között 60 ng/ml, 3,1 és 12 hónapos kor között 40 ng/ml és 1 éves kor fölött 20 ng/ml volt az elvágási határ. 4.2.3 A CYP21 GÉN GENOTÍPUSÁNAK MEGHATÁROZÁSA A CYP21 gén genotípusát allél-specifikus PCR módszerrel határoztuk meg. A módszer részleteit Ferenczi és munkatársai közleménye ismerteti [46]. Röviden összefoglalva, a DNS-t vénás vér fehérvérsejtjeiből vontuk ki. Az allél-specifikus PCR Wedell és munkatársai módszere szerint történt [170]. Az aktív CYP21 gén jelenlétének igazolása után (exon 3 primerrel) a 7 leggyakoribb, betegséget okozó mutációt kerestük. Az allél-specifikus PCR termékeit 1%-os agaróz gélen szeparáltuk, és etidium-bromiddal tettük láthatóvá. Ezzel a módszerrel a deléciók és a nagy génkonverziók nem különíthetők el egymástól. A homozigótákat a heterozigótáktól (mutáció/deléció) a szülőktől származó minták analízisével különítettük el ahol erre lehetőség volt. 4.2.4 STATISZTIKAI ELEMZÉS Mivel a minták nem követték a normális eloszlást, a hipotézisvizsgálatot Mann-Whitney nem-paraméteres teszttel végeztük, a p<0,05-öt tekintettük szignifikanciaszintnek. Az optimális elvágási határt ROC-analízissel határoztuk meg. A statisztikai elemzést Prism 3.0 (Graphpad Inc.) szoftverrel végeztük. 3.3 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE KÖZÉP-EURÓPAI BETEGEKBEN [167] 4.3.1 BETEGEK Száztíz genetikailag igazolt 21-OHD-s beteg mintáit használtuk fel. A betegek Ausztriában, Csehországban, Magyarországon, Szlovákiában vagy Szlovéniában születtek, betegségük adatait egy egységes közép-európai CAH adatbázis rögzíti [69]. Az archivált újszülöttkori vérfoltmintákat a nemzeti szűrőközpontokból kerestük ki. 4.3.2 MÓDSZEREK A vérfolt minták 17-OHP-koncentrációját a DELFIA neonatal 17α-OH-progesterone kittel (Wallac Oy, Turku, Finnország) [168] határoztuk meg a fent ismertetettel azonos módon (4.1.3).
34
A szérum 17-OHP koncentrációk meghatározása RIA módszerrel történt a diagnózis felállításának idejében és helyén. A csontkort Greulich és Pyle módszere szerint [51], a pubertas stádiumot Tanner szerint [148], a genitális maszkulinizációt Prader szerint [115] határoztuk meg. A DNS-analízis részleteit korábbi publikációk ismertetik [14, 38, 46]. 4.3.3 A 21-OHD-S BETEGEK KLASSZIFIKÁCIÓJA A diagnózis alapját a jellegzetes klinikai kép, a szérum 17-OHP koncentráció egyértelmű emelkedése és a genetikai analízis alkotta. Sóvesztő formába soroltuk a betegeket, ha az élet első négy hetében sóvesztő krízis alakult ki, azaz dehidráció, szérum Na-koncentráció 125 mmol/l alatt és szérum K koncentráció 6 mmol/l fölött, ami miatt folyadékterápia és kombinált glukokortikoid és mineralokortikoid kezelés vált szükségessé. Egyszerű virilizáló formába soroltuk a betegeket, ha a CAH jellegzetes tünetei a fiziológiás pubertás kezdete előtt jelentkeztek. 4.3.4 STATISZTIKAI ANALÍZIS Ahol az adatok nem követték a normális eloszlást, medián (1-99 vagy 25-75 percentilis) formában közöljük őket. A hipotézisviszgálatot a Mann-Whitney rank sum test vagy a Kruskal-Wallis one-way ANOVA on the ranks test segítségével végeztük a Dunn-féle páronkénti többszörös összehasonlítást végző post-testtel kiegészítve szükség szerint. A statisztikai elemzést a SigmaStat, Version 2.03 (SPSS Inc, Chicago, USA) szoftverrel végeztük. 4.4
A
21-OHD
AZONOSÍTÁSA
MAGYARORSZÁGON
VÉRFOLT
17-OHP
MÉRÉSSEL [14648216] Magyarországon nem működik újszülöttkori tömegszűrés 21-OHD irányában, de mivel a szérumból történő 17-OHP meghatározás hozzáférése korlátozott (kevés labor, nehézkes mintaszállítás, hosszú várakozási idő), ezért az egyedi diagnosztika meggyorsítása és jobb hozzáférhetősége érdekében 1978-ban bevezetésre került a 17-OHP koncentrációt vérfoltból meghatározó metodika. Az 1978 és 1998 közötti 20 év betegforgalmát retrospektív analízissel dolgoztuk fel.
35
4.4.1 BETEGEK Húsz év során (1978. okt. 1. − 1998. szept. 30.) összesen 1837 beteget vizsgáltunk, akiknél a klinikai jelek, tünetek alapján CAH-betegség gyanúja merült fel az első vizsgálatot végző gyermekorvosban. A figyelemfelkeltő tünetek az alábbiak voltak: átmeneti külső nemi szervek újszülöttben, sóvesztő szindróma fiatal csecsemőben, gyermekekben korai pubarche, és serdülő lányokban hirsutismus oligomenorrhoeával. A betegek vérmintáit és adatait az ellátó orvosok küldték be az egész ország területéről a vizsgálatot végző laboratóriumba. Minden esetet bevettünk a retrospektív analízisbe, ha a mérést CAH gyanúja miatt kérték, ha egynél több mérésre került sor ugyanannál a betegnél, az első eredményét vettük figyelembe. A beutaló orvos 6−48 órán belül kapott értesítést az eredményről a beteg további ellátására vonatkozó javaslattal együtt. A betegek kórlefolyását a beküldő orvos segítségével követtük. A betegek életkora 1 nap és 18 év között volt: 1 – 30 nap: 526; 2 – 3 hó: 250; 4 hó – 4 év: 300; 5 – 18 év: 761. 4.4.2 A BETEGEK KLASSZIFIKÁCIÓJA Klasszikus CAH–ként soroltuk be a betegeket, ha intrauterin vagy 4 éves kor előtti kóros virilizáció jeleit tapasztaltuk. Ezen belül sóvesztő formába soroltuk a betegeket, ha súlygyarapodási elmaradás, hyperkalaemia és hyponatraemia jelentkezett az élet első nyolc hetében. Ha sóvesztésre utaló tünetek nem jelentkeztek, a betegeket az egyszerű virilizáló formába soroltuk. Ha biokémiailag igazolható volt a CAH, de az intrauterin virilizáció jelei nem voltak jelen, és a kóros virilizáció 4 éves kor után kezdődött, nem-klasszikus CAH-ként soroltuk be a betegeket. 4.4.3 MÓDSZEREK A vérfolt minták 17-OHP-koncentrációját RIA módszerrel határoztuk meg a fent ismertetettel azonos módon (4.2.2). A CAH végső diagnózis felállításához meghatároztuk a szérum szteroid profilt (17-OHP, 11-dezoxikortizol, dehidroepiandroszteron, dehidroepiandroszteron szulfát, RIA módszerrel) és a vizelet szteroid profilt (gázkromatográfia / tömegspektrometria, részletes metodikát l. [57]), és genetikai analízist (részletes metodikát l. [46]) végeztünk. A CAH diagnózis kizárásáig szorosan követtük a betegeket a területi gyermekorvossal együttműködve, ismételt vérfolt és szérum 17-OHP méréseket végeztünk.
36
4.4.4 STATISZTIKAI ANALÍZIS A normális eloszlást követő adatokat átlag ±SE formában közöljük, és a hipotézisvizsgálatot a Student t-teszttel végeztük. Máskülönben az adatokat medián (25-75 percentilis) formában közöljük. Az arányok összehasonlítását χ2-teszttel végeztük. A p<0,05öt tekintettük szignifikanciaszintnek. Az adatok elemzését a Prism 3.0 (Graphpad Inc.) programmal végeztük. 4.5
A
NEM-KLASSZIKUS
CAH
AZONOSÍTÁSA
ACTH-STIMULÁCIÓS
PRÓBÁVAL [159] 4.5.1 BETEGEK Összesen 280 (270 leány, 17 fiú) adatait vontuk be a retrospektív elemzésbe. Mind a 280 betegnél ACTH-stimulációs próba történt nem-klasszikus CAH gyanúja miatt, amit a kóros posztnatális vagy pubertás körüli virilizáció vetett fel. A vizsgálatok elvégzésére 1984 és 1999 között került sor. A betegek életkora az első vizsgálat végzésekor 4 és 18 év között volt. A vizsgálatot indikáló tünetek a következők voltak: macrogenitosomia (N=3, életkor: átlag 6,6 év; tartomány 4-10), korai pubarche (leányok: N=67, 5,6 év; 4-8; fiúk: N=6, 7,4 év; 5-9), csak hirsutismus (N=132, 13,0 év; 8-18), hirsutismus és oligomenorrhoea (N=52, 16,7 év; 15-18) és egyéb okok (pl. obezitással járó enyhe hiperandrogenizmus, N=66). Korai pubertásnak tekintettük, ha a Tanner 2-es stádiumú serdülés lányoknál 8, fiúknál 9 éves kor előtt jelentkezett. A hirsutismust a vizsgálatot indikáló orvos értékelte. Oligomenorrheát állapítottunk meg, ha a menarche után 2 évvel évi 6-nál kevesebb ciklus jelentkezett. A valódi pubertás praecoxot GnRH stimulációs próbával zártuk ki. A menarche után a lányokat a follicularis fázisban vizsgáltuk. A vér- és vizeletmintákat a hormonterápia megkezdése előtt vettük le. Ha a 21-OHD bebizonyosodott, a betegek 10-20 mg/m2/die hidrokortizon szubsztitúcióban részesültek. 4.5.2 ACTH-STIMULÁCIÓS PRÓBA Az ACTH-stimulációs próbát kora reggel végeztük. Szteroid hormonok meghatározására vért vettünk a 250 μg tetracosactrid (Synachten) intravénás beadása előtt (0 min) és 60 perccel utána (60 min).
37
4.5.3 SZTEROID-MÉRÉSEK A 17-OHP, kortizol, DHEA, DHEAS és tesztoszteron szérumkoncentrációját nemkromatográfiás RIA módszerrel mértük. A vizelet szteroid profil meghatározása 24 órás gyűjtött vizeletből történt kapilláris gázkromatográfiával [57] Shackleton és Honour módszere alapján [127]. 4.5.4 A CYP21 GÉN GENOTÍPUSÁNAK MEGHATÁROZÁSA A CYP21 gén genotípusát allél-specifikus PCR módszerrel határoztuk meg. A módszer részleteit Ferenczi és munkatársai közleménye ismerteti [46]. 4.5.5 STATISZTIKAI ANALÍZIS Az analízis során a 17-OHP-értékek log-transzformációját alkalmaztuk a normalitás elérése érdekében, a visszatranszformált eredményeket közöljük. A hipotézisvizsgálatokat Student-féle t-próbával, Mann-Whitney-teszttel és χ2-próbával végeztük. Szignifikánsnak tekintettük az eltérést, ha a probabilitás 0,05-nél kisebb volt (p<0,05).
38
5. EREDMÉNYEK 5.1 A 17-OHP STABILITÁSA BESZÁRÍTOTT VÉRFOLT MINTÁBAN [160] 5.1.1 AZ AUTOKLÁVOZÁS HATÁSA A 17-OHP KONCENTRÁCIÓRA 5.1.1.1 VÉRFOLT MINTÁBAN Ugyanazon újszülöttek szűrőpapíron beszárított vérfolt-mintájában autoklávozás után (autoklávozott minta) szignifikánsan alacsonyabb 17-OHP koncentrációt mértünk, mint autoklávozás előtt (natív minta): 11,9 (5,6-21,5) nmol/l autoklávozott és 18,8 (13,6-33,2) nmol/l natív 17-OHP; medián (25-75 percentilis); p=0,001). A csökkenés ellenére az autoklávozott és a natív 17-OHP koncentrációk között igen erős korrelációt tapasztaltunk: r=0,952; p<0,001, y= -1,77+0,68x; y=autoklávozott 17-OHP, x=natív 17-OHP (5.A ábra). Az autoklávozás mintegy 32%-kal csökkentette a mérhető 17-OHP szintjét a vérfoltokban. Az autoklávozás hatásának további vizsgálatához az autoklávozott 17-OHP értékek alapján a fenti egyenlet szerint megbecsültük a natív 17-OHP-koncentrációt (korrigált autoklávozott 17-OHP). A natív 17-OHP és a korrigált autoklávozott 17-OHP közötti egyezést Bland és Altman módszere szerint vizsgáltuk [17, 18]. Mintánként kiszámítottuk a natív 17-OHP és a korrigált autoklávozott 17-OHP különbségét, valamint meghatároztuk, hogy ez a különbség az átlaguknak hány százaléka, a két mutatót egymás függvényében ábrázoltuk, és statisztikailag elemeztük (5.B ábra). A korrigált autoklávozott 17-OHP és a natív 17-OHP között egy csekély, statisztikailag nem-szignifikáns –5,0 ± 4,7% -os (átlag ± SEM) eltérést találtunk. Koncentrációfüggő torzítás nem volt, mert a százalékos különbség és az átlag között számottevő lineáris korreláció nem volt kimutatható (r=0,13; p=0,33). A differencia 23,8% (SD) volt 10 és 110 nmol/l között (a standard görbe központi része, 5.B ábra), ami megfelel a korrigált autoklávozott 17-OHP 22,4%-os inter-assay varianciájának (4.1.4 alapján). Mivel az autoklávozás maga nem növelte jelentősen a 17-OHP-mérés standard hibáját (l. 4.1.4), a standard hiba növekedésének túlnyomó része a korrekciós lépésből kell, hogy származzon. Azonban 10 nmol/l 17-OHPkoncentráció alatt és 110 nmol/l fölött az eltérés elfogadhatatlanul magas, ami valószínűleg az immunoassay-k azon általános tulajdonságából adódik, hogy a standard görbe széleinél a mérési hiba rohamosan növekszik. A 10 nmol/l alatti és a 110 nmol/l fölötti tartomány értékeit ezért kihagytuk a Bland & Altman analízisből.
39
100
Autoklávozott 17-OHP
(nmol/l)
120
10
20
Natív 17-OHP (ng/ml) 40 30
40
r=0,95; p<0,001 30
y = -1.17+0.68x
80
20
60
40 10
20 0
0
20
0
40
60
80
Natív 17-OHP
5.B 120
A natív 17-OHP és a korrigált autoklávozott 17-OHP különbsége (%)
60
50
Autoklávozott 17-OHP (ng/ml)
5.A
0
0
100
Átlag 17-OHP (ng/ml) 20 30
10
120
140
160
180
(nmol/l)
50
40
60
100 80 60 40
+2 SD
20
+1 SD
0
átlag
-20
-1 SD
-40 -2 SD
-60 -80 0
2 0
40
60
80
100
120
140
160
180
Átlag 17-OHP (nmol/l)
5. ábra
Az autoklávozás hatása a vérfolt mintában mérhető 17-OHP koncentrációra. A. Az autoklávozás után mért 17-OHP koncentrációt (y) a natív 17-OHP koncentráció (x) függvényében ábrázoltuk, és meghatároztuk a regressziós egyenest. B. Az autoklávozás hatásának Bland & Altman szerinti analízise. Az értékelhető tartományba eső mintákat fekete (•) jelzi, a fehérrel jelzett (ο) mintáknál az assay precizitása nem kielégítő.
40
5.1.1.2 OLDOTT FORMÁBAN Vizes oldatban mindhárom esetben hasonló 17-OHP-koncentrációt mértünk: (1) autoklávozás előtt (28,9±3,7 nmol/l; átlag ± SEM), (2) ha a mintát lombikban, folyadékfázisban autoklávoztuk, és a vízveszteséget visszapótoltuk (27,7±3,5 nmol/l), (3) vagy a vizes oldatot szűrőpapírra cseppentettük, beszárítottuk, és ezután autoklávoztuk (28,6±3,6 nmol/l). Ezek alapján a vérfolt mintáknál tapasztalható eltérés oka valószínűleg nem a 17-OHP bomlása, hanem csupán a 17-OHP szűrőpapírból való kivonhatósága romlik a vér koagulációja miatt. 5.1.2. A TÁROLÁS IDŐTARTAMÁNAK HATÁSA A 17-OHP KONCENTRÁCIÓRA 5.1.2.1 AUTOKLÁVOZOTT MINTÁK Megvizsgáltuk a hosszú tárolás hatását a minták 17-OHP-koncentrációira. Évenként összehasonlítottuk a szűrőpapírok 17-OHP koncentrációit. A mediánok 4,6 és 6,3 nmol/l között voltak (6. ábra) Csekély, 2,1%-os évi csökkenést észleltünk a tárolás során, ami nem volt statisztikailag szignifikáns (r=0,06, p=0,23; y=e-40,5+0,021x; y=17-OHP koncentráció
1000
333
100
33
10
3,3
1
0,1 1990
Autoklávozott 17-OHP (ng/ml)
Autoklávozott 17-OHP (nmol/l)
nmol/l, x= mintavétel éve).
0,33
1992
1994
1996
1998
2000
2002
Születés éve
6. ábra
Az egyes évekből származó autoklávozott újszülöttkori minták 17-OHP koncentrációi. ⎯: medián; : 25-75 pc;
: 10-90 pc; •: a 10-90 pc-en kívül
eső értékek, N=40x10. A mért értékeket nem korrigáltuk sem a tárolásra, sem az autoklávozásra.
41
5.1.2.2 NATÍV MINTÁK A natív minták 17-OHP koncentrációinak mediánjai az egyes években 7,0 és 9,1 nmol/l között voltak (7. ábra). Az autoklávozott mintákhoz hasonlóan egy csekély, 3,2%-os évenkénti csökkenést tapasztaltunk (r=0,12, p<0,001; y=e-62,6+0,032x; y=17-OHP-koncentráció
1000
333
100
33
10
3,3
1
0,1 1987
Natív 17-OHP (ng/ml)
Natív 17-OHP (nmol/l)
nmol/l, x=mintavétel éve).
0,33
1989
1991
1993
1995
1997
1999
2001
Születés éve
7. ábra
Az egyes évekből származó nem-autoklávozott újszülöttkori minták 17-OHP koncentrációi. ⎯: medián; : 25-75 pc;
: 10-90 pc; •: a 10-90 pc-en kívül
eső értékek, N=40x13. A mért értékeket nem korrigáltuk a tárolásra. Az autoklávozott mintákban átlagosan 27,3%-kal alacsonyabb 17-OHP koncentrációt mértünk, mint a natív mintákban (5,6 (3,6-8,9) nmol/l az autoklávozott és 7,7 (5,3-11,1) nmol/l a natív mintákban; medián (25-75 percentilis)), ami közelítőleg megfelel a korrekciós képlet alapján várható különbségnek. 5.1.3 A SZÜLETÉSI SÚLY ÉS A 17-OHP KONCENTRÁCIÓ ÖSSZEFÜGGÉSE Mivel a tárolás során a 17-OHP koncentráció csökkenése elenyésző volt, ezért a mintavétel évétől függetlenül, születési súly szerint csoportosítottuk külön az autoklávozott és külön a natív szűrőpapírmintákat (8. ábra). A teljes populációban előforduló gyakorisághoz képest több kis súlyú újszülött mintáját vontuk be a vizsgálatba, hogy a magasabb 17-OHP koncentráció-tartományokat is megfelelő elemszám mellett vizsgálhassuk. Az irodalmi adatokkal megegyezően a kis születési súlyú, éretlen újszülöttek mintáiban egyértelműen magasabb 17-OHP koncentrációkat mértünk, mint a normális súlyú, érett újszülöttek 42
mintáiban (p<0,001 mind a natív, mind az autoklávozott mintákra). Ez az egyezés az irodalmi adatokkal azt erősíti meg, hogy az évtizedes tárolás, illetve esetenként az autoklávozás ellenére az ilyen mintákban mért 17-OHP koncentráció a valós hormonális helyzetet tükrözi.
Autoklávozott 17-OHP (nmol/l)
300
100
250 200 50
150 100 50 0
Autoklávozott 17-OHP (ng/ml)
8.A
0
<1500
2000-2500
1500-2000
>2500
Születési súly (g)
300
100
Natív 17-OHP (nmol/l)
250 200 50
150
Natív 17-OHP (ng/ml)
8.B
100 50 0
0
<1500
1500-2000
2000-2500
>2500
Születési súly (g)
8. ábra
A 17-OHP koncentrációk születési súly szerint. A. Autoklávozott minták. B. Natív minták. ⎯: medián; : 25-75 pc;
: 10-90 pc; •: a 10-90 pc-en kívül
eső értékek. A mért értékeket nem korrigáltuk sem a tárolásra, sem az autoklávozásra.
43
5.2 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE MAGYARORSZÁGON [157] Miután a 17-OHP-t megfelelően stabilnak találtuk beszárított vérfolt mintában hosszú tárolás során, a bizonyítottan 21-OHD-s betegek újszülöttkori vérfoltmintáit elemeztük, hogy megállapítsuk, egy újszülöttkori tömegszűrés során 4 napos korban azonosítható lett volna-e a betegségük. 5.2.1 A NÉGYNAPOS KORBAN MÉRT 17-OHP KONCENTRÁCIÓ Huszonhét klasszikus 21-OHD-s beteg és 104 kontroll újszülött négynapos korban levett, tárolt vérfoltmintájában megmértük a 17-OHP szintjét. A leghosszabb tárolási idő 7 év volt. A (5.1.2) alapján az ilyen hosszú tárolás által okozott változás hasonló, mint az inter-assay variancia. A 21-OHD-s betegek átlagos 17-OHP-szintje mintegy 9-szer magasabb volt, mint a kontrollok mintáiban mért 17-OHP (kontroll: 39 ng/ml vs. 21-OHD: 364 ng/ml; p<0,0001). A markáns különbség ellenére a két csoport egyedi értékei között nem elhanyagolható átfedés volt (kontroll: 17-88 ng/ml, 21-OHD: 38-1150 ng/ml). Az egyszerű virilizáló betegek 17OHP szintjei az újszülöttkori mintákban szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint a sóvesztő
Újszülöttkori minta 17-OHP (ng/ml)
betegekéi (medián SW-CAH 350 ng/ml vs. SV-CAH 158 ng/ml; p=0,0277) (9.ábra).
1000
100
10 kontroll
9. ábra
SV-CAH
SW-CAH
A CAH-os betegek és a kontrollok 17-OHP koncentrációi a 4. életnapon. . ⎯: medián; : 25-75 pc;
: 3-97 pc; •: egyedi 17-OHP koncentrációk,
elvágási határ, 80 ng/ml.
44
……
:
ROC 1,00
0,80 Szenzitivitás
71 ng/ml 0,60
0,40
0,20
0,00 0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1-Specificitás
10. ábra
ROC analízis. A görbe a szenzitivitás és specificitás kapcsolatát mutatja különböző elvágási határok mellett. Az optimumot nyíl jelzi.
A kontrollok és betegek 17-OHP-koncentrációi alapján ROC-analízissel számítható optimális elvágási határ 71 ng/ml (10. ábra). Ezt alkalmazva 3 álpozitív (104 kontroll közül) és 3 álnegatív (27 betegből, 2 SV-CAH, 1 SW-CAH) adódik. A szenzitivitás 89%, a specificitás 97%, a pozitív prediktív érték 89%, a negatív prediktív érték 97%, az effektivitás 95%. Egy valódi szűrőprogram során ennél alacsonyabb elvágási határt kellene ezért választani, ami csökkenti az álnegatív esetek számát, ugyanakkor az álpozitív esetek számának rohamos növekedésével jár. 5.2.2 ÉLETKOR A DIAGNÓZISKOR A diagnózis felállításakor a betegek életkora különböző volt a nem és a 21-OHD súlyossága szerint. A sóvesztő betegeket jóval hamarabb ismerték fel, mint az egyszerű virilizálókat (medián: 28 nap a SW-CAH fiúk, 5 nap a SW-CAH lányok, 178 nap a SV-CAH lányok és 455 nap a SV-CAH fiúk esetében; p=0,0012). Az irodalomban fellelhető adatok alapján a legtöbb tömegszűrő program 7-10 napos életkorra diagnosztizálja a 21-OHD-s betegeket [163]. Megvizsgáltuk ezért saját mintánkon, hogy a 10. életnap előtt hány betegnél történt meg a diagnosztikus célú mintavétel. Anyagunkban egyetlen fiú sem került azonosításra a klinikai jelek alapján a 10. életnapig.
45
Ugyanekkor a 8 SV-CAH lány közül egytől, a 11 SW-CAH lány közül héttől vettek mintát, mivel a külső nemi szervek eltérése miatt felmerült a 21-OHD lehetősége. 5.2.3 A DIAGNÓZISKOR MÉRT 17-OHP KONCENTRÁCIÓ A 21-OHD-s betegek diagnosztikus mintáiban a 17-OHP koncentráció átlagosan másfélszerese volt az újszülöttkorinak (364 ng/ml négynapos korban, 582 ng/ml diagnóziskor; p=0,05). A 17-OHP szintje kezelés nélkül emelkedik a születés után. Négy esetben, az átmeneti külső nemi szervek alarmírozó volta miatt, a mintavétel már négynapos kor előtt megtörtént, a tömegszűrés idején a betegek már szteroidpótlásban részesültek, ezért két esetben a másodikként levett minta 17-OHP koncentrációja alacsonyabb, bár még így is a patológiás tartományban van (11. ábra) 1000
17-OHP (ng/ml)
11.A
100
SV-CAH 4. életnapon diagnóziskor
10 4
1
21
14
7
28
1
napok
3
2
évek Életkor a mintavételkor
1000
17-OHP (ng/ml)
11.B
100
SW-CAH 4. életnapon diagnóziskor
10 1
4
7
14
21
28
35
42
Életkor a mintavételkor (napok)
11. ábra
A CAH-os betegek vérfolt mintáinak 17-OHP koncentrációja a 4. életnapon (•) és a diagnózis időpontjában (). A. SV-CAH betegek B. SW-CAH betegek. 46
5.2.4
A
17-OHP
KONCENTRÁCIÓ
ÖSSZEFÜGGÉSE
A
MUTÁCIÓ
12.A
17-OHP (ng/ml) a 4. életnapon
SÚLYOSSÁGÁVAL
1200
1000
SW-CAH 800
SV-CAH 600 400 200
Közepes/ Súlyos
Súlyos/ Súlyos
Közepes/ Közepes
Enyhe/ Súlyos
Mutáció típusa
12.B
a diagnóziskor
17-OHP (ng/ml)
2000
1500
SW-CAH SV-CAH
1000
500
Súlyos/ Súlyos
Közepes/ Közepes
Közepes/ Súlyos
Enyhe/ Súlyos
Mutáció típusa
12. ábra
A genotípus, a klinikai forma és a 17-OHP koncentráció összefüggésea négynapos korban (A) és a diagnózis időpontjában (B). Mutációk: súlyos/súlyos:
I2Splice/I2Splice,
L307Tins/L307Tins,
I2Splice/Del,
L307Tins/Del;
I2Splice/I2Splice+V281L,
közepes/súlyos:
I172N/Q318Stop,
I172N/I2Splice, I172N/Del; közepes/közepes: I172N/I172N; enyhe/súlyos: V281L/R356W+L307Tins. :SW-CAH betegek 17-OHP koncentrációi, ο: SV-CAH betegek 17-OHP koncentrációi.
47
A betegeket a hordozott mutációk súlyossága szerint csoportosítottuk. Súlyosnak tekintettük az előforduló mutációk közül az I2Splice, Del, L307Tins, Q318Stop, zéró maradék enzimaktivitással járó mutációkat, közepesnek az I172N, alacsony maradék enzimaktivitással járó mutációt, és enyhének a V281L, közepes maradék enzimaktivitással járó mutációt [138]. A vérfoltok 17-OHP koncentrációi szoros összefüggést mutattak a klinikai képpel és a betegséget okozó mutáció típusával mind négynapos korban, mind a diagnóziskor. A súlyos enzimhibát okozó mutációt hordozó betegek mind a négynapos kori, mind a diagnosztikus mintáiban magasabb 17-OHP-szinteket mértünk, mint a közepes, illetve enyhe enzimhibát okozó mutációt hordozó betegek mintáiban. A súlyos mutációt hordozók klinikai képe a sóvesztő formának, az enyhébbeket hordozók klinikai képe az egyszerű virilizáló formának felel meg. (12. ábra) 5.3 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE KÖZÉP-EURÓPAI BETEGEKBEN [167] Mivel a magyarországi beteganyagban 3 olyan, bizonyítottan CAH-os beteget találtunk, akiknek a 4. életnapon az egészséges kontrollokétól nem volt megkülönböztethető a 17-OHPkoncentrációja, ezért nagyobb elemszámú mintán, szenzitívebb és specifikusabb 17-OHP assay-vel is megvizsgáltuk, hogy a tömegszűrésben az álnegativitás aránya mekkora. 5.3.1 A 21-OHD-S BETEGEK ÚJSZÜLÖTTKORI 17-OHP-KONCENTRÁCIÓI Száztíz bizonyítottan 21-OHD-s beteg újszülöttkori mintáit tudtuk előkeresni, közülük 77 a sóvesztő formába (SW-CAH), 33 a nem-sóvesztő formába (SV-CAH) tartozott. Ez az arány nagyjából megfelel az ebben a populációban, gyakorlatilag teljes beteganyagon tapasztalható aránynak (65% sóvesztő, 35% egyszerű virilizáló) [69]. A sóvesztő betegek négynapos kori mintáiban a 17-OHP koncentráció jóval magasabb volt, mint az egyszerű virilizáló betegekéiben: 561 nmol/l SW-CAH (tartomány 91-1404 nmol) és 40 nmol/l SV-CAH (tartomány 4-247 nmol/l) (13. ábra). Az ESPE a szűrőprogramok számára kétlépcsős elvágási határt ajánl [62]. Érett, egészséges újszülöttek esetén a 30 nmol/l alatti vérfolt 17-OHP koncentráció esetén a 21OHD-t kizárhatónak tekinti, e fölött a mérés megismétlését javasolja. Ha a 17-OHPkoncentráció 90 nmol/l-nél is magasabb, a beteg szoros megfigyelését, alapos kivizsgálását és azonnali hospitalizációt javasolnak. A fenti elvágási határokat alkalmazva mintáinkon a 77 sóvesztő beteg mindegyikét azonosította volna a szűrés, és idejében kórházba kerültek volna, mert mindegyikük 17-OHP
48
koncentrációja fölötte volt a 90 nmol/l-es határnak. A 33 egyszerű virilizáló beteg közül azonban tízen alatta maradtak a 30 nmol/l-es határnak is, ez az SV-CAH betegek 33%-a, az összes CAH beteg 10%-a. Őket a szűrőprogram nem azonosította volna semmilyen módon, csak a tünetek jelentkezésekor kerültek volna orvoshoz, ahogyan szűrés nélkül is.
333
100
33
10
3,3
1
17-OHP (ng/ml)
17-OHP (nmol/l)
1000
0,33
0,1 0
3000
2000
1000
4000
5000
Születési súly (g)
13. ábra
17-OHP koncentrációk a 4. életnapon. +: kontroll újszülöttek, •: SW-CAH, ο: SV-CAH, ⎯: elvágási határ az egészségesek és a CAH betegek között (30 nmol/l), ……: elvágási határ a sürgős beavatkozást igénylő és nem igénylő CAH betegek között (90 nmol/l)
5.3.2 A
SZŰRÉSSEL
NEM
AZONOSÍTHATÓ
BETEGEK
KLINIKAI
JELLEMZÉSE A nemek aránya kiegyensúlyozott volt mind a szűréssel azonosítható (N=23, fiú: leány=12:11), mind a szűréssel nem azonosítható (N=10, fiú: leány=4:6) betegek körében. A szűréssel nem azonosítható betegek átlagosan idősebbek voltak a diagnóziskor, mint azok akiket a szűréssel azonosítani lehetett volna (5,16±2,86 év vs. 2,01±1,96 év; p=0,00088; átlag ± SD). Négynapos korban ugyan alacsonyabb volt a 17-OHP-koncentrációjuk, de a diagnózis felállításának időpontjában mindkét csoport 17-OHP koncentrációi egyértelműen a kóros tartományban voltak (nem-azonosíthatók: 159,1±179,1 nmol/l, azonosíthatók: 425±556,5 nmol/l; p=0,153; átlag ± SD). A tíz álnegatív esetből 9-nél történt genetikai vizsgálat. Mindegyikük legalább egyik allélján enyhe vagy közepes súlyosságú mutációt hordozott (I172N, V281L, P30L), de a 49
szűrés által azonosított betegek között is volt több olyan, akiknek a genotípusa egyezett a nem-azonosíthatókéval, ezért a születés utáni alacsony 17-OHP hátterében a CYP21 gén genotípusán kívül további (genetikai és nem-genetikai) faktorok meghatározó szerepe is feltételezhető. 5.4
A
21-OHD
AZONOSÍTÁSA
MAGYARORSZÁGON
VÉRFOLT
17-OHP
MÉRÉSSEL [158] Miután úgy találtuk, hogy az újszülöttkori tömegszűrés mellett egy kb. 10%-os álnegativitási arány feltételezhető, az egyedi diagnosztikai módszerek hatékonyságát kezdtük tanulmányozni. Először az egyedi diagnosztika első lépéseként használt, a tömegszűrés alternatívájának tekintett, a tünetes betegek beszárított vérfolt mintáiból történő 17-OHPmérés hatékonyságát vizsgáltuk. 5.4.1 A VIZSGÁLT BETEGEK KLINIKAI JELLEMZÉSE Az 1978 és 1998 közötti húsz éves periódusban 1837 betegtől érkezett vérfolt minta CAH gyanúja miatt. A betegek életkora 1 nap és 18 év között volt, 1-3 napos korban 100, 4-7 napos korban 172, 8-30 napos korban 254, 2-3 hónapos korban 250, 4-12 hónapos korban 152, 2-8 éves korban 426 és 9-18 éves korban 483 betegtől érkezett minta. A hiperandrogenizmus tünetei a két nemben eltérő időpontban jelennek meg. Az érintett lányoknál az átmeneti külső nemi szervek már közvetlenül a születés után jól felismerhetők, a fiúknál a macrogenitosomia születéskor kevésbé markáns, és a sóvesztés vagy a pubarche praecox megjelenése pedig későbbi életkorra esik, ezért először a nemek arányát vizsgáltuk meg az egyes korcsoportokban. Összesen 518 fiútól és 1319 lánytól érkezett minta. Az első héten szignifikánsan több lánytól vettek mintát, mint fiútól (104 lány és 68 fiú; p=0,006). A nemek aránya kiegyenlített volt 8 napos és 12 hónapos kor között (322 lány és 334 fiú; p=0,639). Egy éves kor fölött egyértelművé vált a lányok túlsúlya (793 lány és 116 fiú; p<0,0001). A CAH-ként diagnosztizált betegek nemek szerinti megoszlása hasonló volt a teljes mintáéhoz, de a nemek közötti különbség valamivel kisebb (3. táblázat).
50
Korcsoport
Összes vizsgált beteg
21-OHD
11β-OHD
Fiú (n)
Lány (n)
Összes (n)
Fiú (n)
Lány (n)
Összes (n)
Fiú (n)
1-30 nap
184
342
526
33
57
90
-
2-3 hó
142
108
250
14
9
23
-
4-12 hó
76
76
152
3
3
6
-
2-18 év
116
793
909
24
39
63
3
Összes (n)
518
1319
1837
74
108
182
3
3. táblázat
A vizsgált betegek nem, életkor és végső diagnózis szerinti megoszlása.
Az első élethónap során a CAH gyanúja leggyakrabban az átmeneti külső nemi szervek miatt merült fel mindkét nemben, 34 fiúnál a 184-ből, és 253 lánynál a 342-ből. Az átmeneti külső nemi szervek miatt vizsgált betegek mintegy kétharmadától (181 a 287-ből) az első hetén vettek mintát. Az elektrolit-eltérések előfordulása az első hónapban volt a leggyakoribb, a két nemnél hasonló gyakorisággal alakult ki, és előfordulása időben egyenletes volt: a 398 sóvesztés miatt vizsgált betegből 202 esetben az első hónapban történt mintavétel (63, 35, 52 és 52 az 1., 2., 3. és 4. héten), közülük 103 volt fiú, és 99 lány (p=0,8422). Egy éves kor fölött a betegek túlnyomó többsége lány volt (793 a 909-ből), akit androgéntúltermelés tünetei miatt vizsgáltak (694 a 793-ból). Az egy év fölötti fiúk többségét korai pubarche miatt vizsgálták (92 a 116-ból), a nemi szervek rendellenessége miatt 5 esetben, kóros elektroliteltérések miatt 19 esetben került sor vizsgálatra. 5.4.2 A CAH-KÉNT DIAGNOSZTIZÁLT BETEGEK KLINIKAI JELLEMZŐI A CAH végső diagnózist 185 esetben állítottuk fel (182 21-OHD, 3 11β-OHD), a CAHra gyanús betegek tehát mintegy 10%-ánál lehetett bizonyítani az enzimdefektust. A CAH betegek nem és altípus szerinti megoszlása a következő volt: 77 fiú: 51 SW-CAH, 13 SVCAH, 10 NC-CAH és 3 11β-OHD; 108 lány: 59 SW-CAH, 32 SV-CAH és 17 NC-CAH (4. táblázat). Minden altípusban több volt a lány, de a különbség csak az egyszerű virilizáló betegek esetében volt szignifikáns (p=0,012 az összes CAH betegre; p=0,004 az SV-CAH betegekre; p=0,5894 a SW-CAH betegekre és p=0,409 a NC-CAH betegekre). Az incidencia pontosabb meghatározásához feldolgoztuk azon további 19 CAH beteg adatait is, akiket ebben az időszakban, de nem a vérfolt 17-OHP meghatározás segítségével diagnosztizáltak Magyarországon, összesen 11 fiút (8 SW-CAH és 3 SV-CAH) és 8 lányt (2 SW-CAH és 6 SV-CAH) találtunk. 51
A korai diagnózis fontos a kedvező hosszú távú kimenetel szempontjából, ezért külön is megvizsgáltuk a CAH betegek életkorát a mintavétel időpontjában. A SW-CAH betegeket általában egy hónapos kor előtt diagnosztizálták, a fiúkat átlagosan két héttel később, mint a lányokat (medián (25 pc; 75 pc): 7 nap (3; 17) a lányoknál, 25 nap (18; 31) a fiúknál; p<0,0001). Az SV fiúk és lányok közel egyidősek voltak a diagnózis időpontjában (fiúk: 2 év, lányok: 2,5 év; p=0,9202). (4. táblázat) CAH
Nem-CAH
SW
SV
NCAH
11β-OHD Összes
Lányok
7 nap (3 nap; 17 nap) (n=59)
2 év 6 hó (3 hó; 4 év) (n=32)
13 év (7 év; 15 év) (n=17)
-
N=108 6 év (1 hó; 14 év) (n=1211)
Fiúk
25 nap (18 nap; 1 hó) (n=51)
2 év (1 év 2hó; 3,5 év) (n=13)
7 év (6 év; 9 év) (n=10)
4 év (n=3)
N=77
Összes
17 nap (5 nap; 1 hó) (n=110)
2 év (1 év 1 hó; 4 év) (n=45)
8 év 6 hó (6 év 9 hó; 13 év) (n=27)
4 év (n=3)
N=185 1 év 6 hó (1 hó; 10 év) (n=1652)
4. táblázat
2 hó 13 nap (24 nap; 6 hó) (n=441)
A CAH-ként diagnosztizált betegek életkora a diagnózis felállításakor (medián (25 pc; 75 pc)).
5.4.3 A VÉRFOLT 17-OHP KONCENTRÁCIÓK MEGOSZLÁSA A CAH betegek 17-OHP koncentrációi szignifikánsan magasabbak voltak, mint a nemCAH-osokéi minden életkorban (p<0,0001 az 1-30 napos, 2-3 hónapos és 2-18 éves korcsoportban, p=0,005 a 4-12 hónapos korcsoportban, és p<0,01 az összes korcsoportra). Az esetek túlnyomó többségében a CAH betegek 17-OHP koncentrációja egyértelműen magasabb a nem-CAH-osokénál, de van néhány beteg, akinek a 17-OHP szintje közel van a korspecifikus elvágási határhoz (1-30 napos korban 111,3 ng/ml, 2-3 hónapos korban 113,3 ng/ml, 4-12 hónapos korban 35,6 ng/ml és 2-18 éves korban 19,8 ng/ml) (14. ábra). A SWCAH betegek 17-OHP koncetrációja magasabb volt, mint az SV betegeké, és a klasszikus CAH betegek (SV-CAH és SW-CAH) 17-OHP szintjei szignifikánsan magasabbak a diagnózis felállításakor, mint a NC-CAH betegekéi (p<0,0001) (5. táblázat). Minden 11βOHD-ként diagnosztizált beteg vérfolt 17-OHP koncentrációja magasabb volt a korspecifikus elvágási határnál (57, 58 és 97 ng/ml). A 11β-OHD végső diagnózist a szérum és a vizelet szteroid profil vizsgálatával állítottuk fel [135].
52
CAH
Nem-CAH
SW
SV
NCAH
1-30 nap Medián (25 pc; 75 pc) N
581,5 (360;999) 84
163,3 (96; 210) 6
-
-
35 (24,9; 56) 436
2-3 hó Medián (25 pc; 75 pc) N
270 (246; 793) 20
183 3
-
-
20,3 (13,6; 35) 227
4-12 hó Medián (25 pc; 75 pc) N
286,5 (160; 416) 4
344,8 2
-
-
8,5 (5,3; 14,5) 146
2-18 év Medián (25 pc; 75 pc) N
701,5 2
298,4 (233; 492) 24
100 (47; 167) 27
57,6 3
8,3 (5,3; 12) 843
Összesen (n)
110
45
27
3
1652
5. táblázat
11β-OHD
A vérfolt 17-OHP koncentrációk az egyes betegcsoportokban. 8000
Medián 25%-75% 5%-95% nem-CAH CAH
Vérfolt 17-OHP (ng/ml)
3000
2000
1000
800
600
400
200
0
nemCAH CAH 1-30 nap
nemCAH CAH 2-3 hó
nemCAH CAH 4 hó-4 év
nemCAH CAH 4-18 év
Életkor
14. ábra
A vérfolt 17-OHP koncentrációk a CAH-ként és nem-CAH-ként diagnosztizált betegekben az egyes korcsoportokban. 53
5.4.4 A DIAGNOSZTIKUS MÓDSZER HATÉKONYSÁGA A betegek életkora a vizsgálat időpontjában széles tartományban mozgott, ezért korspecifikus elvágási határok alkalmazására volt szükség. Korábbi vizsgálatok eredményei alapján [134] 1-30 napos életkorban 80 ng/ml-t, 2-3 hónapos korban 60 ng/ml-t, 4-12 hónapos korban 40 ng/ml-t és 2 éves kor fölött 20 ng/ml-t tekintettük elvágási határnak. A vizsgálat során a tünetes CAH betegek között kettő álnegatív eset fordult elő, náluk a vizelet szteroidprofil meghatározása bizonyította a 21-OHD-t. Egyikük egy leány újszülött volt átmenetei külső nemi szervekkel, elektrolit eltérések nélkül. A szérum 17-OHP szintje hatnapos korban 2,8 ng/ml volt, ami 18 ng/ml-re emelkedett 35 napos korra. A másik vérfolt vizsgálattal álnegatív eset egy 16 éves lány volt, aki hirsutismus és rendszertelen menstruáció miatt került kivizsgálásra. Az ACTH-stimulációs próba során a bazális 14,8 ng/ml szérum 17-OHP 56,1 ng/ml-re emelkedett. Az álpozitivitás aránya 5,2% volt az egész vizsgált populációra, a legfiatalabbak között volt a legmagasabb, 1-30 napos korban 6,5%, 2-3 hónapos korban 8,4%, 4-12 hónapos korban 3,3%, és 2 éves kor fölött 3,8%. Az álnegativitás aránya 0,1% volt a teljes vizsgált populációra. A szenzitivitás 98,9%, a specificitás 94,2%, az effektivitás 94,7% (15. ábra). CAH / nem CAH Vérfolt 17-OHP (ng/ml)
180
84/2 22/2
160
33/1
140 120
30/0
5/32
100
1/19 80
3/4
60 40
1/402
0/206
5/30 0/259
20 1 - 30 nap
2 - 3 hó
4 hó - 4 év
1/695 5 - 18 év
Életkor
15. ábra
A CAH és nem-CAH betegek száma a korspecifikus elvágási határok alatt, fölött, és az átmeneti „szürke” zónában.
54
5.4.5
AZ
EGY
HÓNAPOS
KOR
ELŐTT
DIAGNOSZTIZÁLT
BETEGEK
JELLEMZÉSE A 30 napos kornál fiatalabb életkorban diagnosztizált CAH betegek adatait külön elemeztük, mert az ő helyzetük összemérhető a tömegszűrés során azonosított társaikéval. Jóval több lány volt ebben a korcsoportban, mint fiú (33 fiú és 57 lány; p=0,011, 3. táblázat). 30 napos életkor előtt nem tudtunk egyetlen SV-CAH fiút sem diagnosztizálni, de 6 SV-CAH lánytól érkezett minta. A 17-OHP koncentrációk tekintetében nem mutatkozott jelentős különbség a nemek között (medián (25 pc; 75 pc) lányok: 493 ng/ml (339; 850), fiúk: 720 ng/ml (294; 1200); p=0,09). A 4 és 7 napos kor között, ami megfelel az újszülöttkori tömegszűrések időpontjának, levett minták átlagos 17-OHP koncentrációja 536,8 ng/ml volt CAH betegekben (n=18; CI 95% 383,5-609,1 ng/ml), és 40,8 ng/ml nem CAH-os betegekben (n=154; CI 95% 36,5-45,1 ng/ml). A lányokat általában közel két héttel hamarabb sikerült felismerni, mint a fiúkat (medián (25 pc; 75 pc) fiúk: 21 nap (16; 25), lányok: 5 nap (2; 9)). Összességében a klasszikus CAH betegek 58%-át (90/155), ezen belül a sóvesztő betegek 76%-át (84/110) sikerült 30 napos kor előtt azonosítani tömegszűrés nélkül (5. táblázat). 5.4.6 A CAH BECSÜLT MAGYARORSZÁGI INCIDENCIÁJA A CAH magyarországi incidenciájának pontos becsléséhez felkutattuk az ezen időtartam alatt, de nem vérfolt módszerrel azonosított CAH betegeket is: összesen 19-et találtunk. A vizsgálat időtartama alatt Magyarországon 2.661.691 újszülött született, 1.365.238 fiú és 1.296.453 lány. Vérfolt minta alapján azonosítottunk 155 klasszikus CAH beteget, a 19 további esettel együtt összesen 174 klasszikus CAH beteget diagnosztizáltunk a vizsgálat időtartama alatt az országban, 75 fiút (59 SW-CAH és 16 SV-CAH) és 99 lányt (61 SW-CAH és 38 SV-CAH). Az ez alapján számított teljes incidencia 1 : 15.297 (CI 95% 1 : 13.318 – 1 : 17.966), ami hasonló az európai szűrőprogramok során meghatározott incidenciákhoz (1 : 11.000 – 1 : 18.000) [11, 143]. A fiúkra számított incidencia 1 : 18.203 (75 : 1.365.238) (CI 95% 1 : 14.843 – 1 : 23.527), a lányokban számított incidencia 1 : 13.095 (99 : 1.296.453) (CI 95% 1 : 10.940 – 1 : 16.308). A CAH autoszómás recesszív módon öröklődik, tehát a két nem között a várható előfordulás azonos, jelen esetben azonban joggal feltételezhetjük, hogy a fiúk egy részét nem diagnosztizálják, mert tüneteik nem olyan markánsak. Tekintetbe véve, hogy legalább annyi fiúbetegnek kellene lenni, mint lánynak, a 20 év folyamán legalább 24 CAH beteg fiút nem ismertek fel (99-75). A SW-CAH és SV-CAH lányok aránya 61 : 38, ennek alapján becslésünk szerint minimum 2 SW-CAH és 22 SV-CAH fiút nem diagnosztizáltak (16. ábra). 55
Vérfolt 17-OHP meghatározásra 1978 óta van lehetőség Magyarországon. A retrospektíve felkutatható esetszámok alapján 1966 és 1978 között az eseteknek csak egy töredékét sikerült diagnosztizálni. A felismerési arány a hatvanas évektől folyamatosan javuló tendenciát mutat (16. ábra). 100
CAH-betegek száma
Várható Azonosított
80
60
40
20
1966-1978
16. ábra
1979-1988
1989-1998
A becsült incidencia és az élveszületések száma alapján várható CAH estek és a valóban diagnosztizált CAH esetek száma az egyes időszakokban.
Élveszületések száma
SW-CAH
SV-CAH
CAH összesen
Incidencia
1966-1978
2 139 488
41
29
70
1 : 30 564
1979-1988
1 346 645
67
20
87
1 : 17 265
1989-1998
1 145 522
58
24
82
1 : 13 970
6. táblázat
Az egyes időszakokban az élveszületések száma és a diagnosztizált CAH esetek alapján számított incidenciák.
56
5.5
A
NEM-KLASSZIKUS
CAH
AZONOSÍTÁSA
ACTH-STIMULÁCIÓS
PRÓBÁVAL [159] A vérfoltból történő 17-OHP mérés után még legalább egy verfikációs lépés elvégzése ajánlott. Ezek közül az egyik legelterjedtebb, az ACTH-stimulációs próba hatékonyságát vizsgáltuk meg. 5.5.1 A VIZSGÁLT BETEGEK KLASSZIFIKÁCIÓJA Kóros virilizáció miatt vizsgált 287 betegnél történt ACTH-stimulációs vizsgálat. A bazális 17-OHP medián 2,2 ng/ml, a stimulált 17-OHP medián 4,3 ng/ml volt az egész vizsgált populációban, a 84. percentilis (átlag + 1 SD) 4,2 ng/ml volt bazálisan és 8,0 ng/ml stimuláció után. 5.5.1.1
ALACSONY
17-OHP
KONCENTRÁCIÓK
AZ ACTH-STIMULÁCIÓS
PRÓBÁBAN Azokat a betegeket, akiknél a stimulált 17-OHP értéke alacsonyabb volt, mint 8,0 ng/ml (+1 SD), nem vizsgáltuk tovább specifikusan 21-OHD irányában (N=248). A figyelmes követési periódus alatt egyetlen esetben sem tapasztaltunk náluk progresszív virilizációt. 5.5.1.2
MAGAS
17-OHP
KONCENTRÁCIÓK
AZ
ACTH-STIMULÁCIÓS
PRÓBÁBAN Tíz beteg stimuláció utáni 17-OHP koncentrációja volt 40 ng/ml-nél magasabb. Genetikailag mindegyiküknél igazolható volt a 21-OHD, a vizelet szteroid profil, illetve a glukokortikoid szubsztitúciós terápiára adott klinikai és hormonális válasz is a 21-OHD diagnózist támasztotta alá. 5.5.1.3
KÖZEPES
17-OHP
KONCENTRÁCIÓK
AZ
ACTH-STIMULÁCIÓS
PRÓBÁBAN Ha a stimuláció utáni 17-OHP-koncentráció 8 és 40 ng/ml közé esett, a 21-hidroxiláz működésének további vizsgálata során meghatároztuk a vizelet szteroid profilt és egyes esetekben a CYP21 gén genotípusát (N=18) (7. táblázat). A vizelet szteroid profil analízis során a 17-OHP metabolitok kortizol metabolitokhoz viszonyított arányát vettük figyelembe, ha ez 0,7-nél magasabb, az a 21-hidroxiláz enzim csökkent működésére utal [57]. A 21-OHDt bizonyítottnak tekintettük, ha azt vagy a genetikai vizsgálat, vagy a vizelet szteroid profil
57
analízise, vagy mindkettő alátámasztotta. A 18-ból így összesen 11 esetben bizonyosodott be a 21-OHD. Életkor (év)
Nem
Tünet
17-OHP (ng/ml) 0 min
OHP-M/ C-M
Genotípus
21OHD
60 min
1
7,0
L
pubarche praecox
3,4
8,5
0,10
V281L/nd
nem
2
7,7
L
pubarche praecox
1,9
9,2
0,06
n.a.
nem
3
7,8
L
pubarche praecox
5,7
9,5
0,16
n.a.
nem
4
15,0
L
Hirsutismus
7,0
10,0
0,14
nd/nd
nem
5
18,0
L
Hirsutismus, oligomenorrhoea
3,7
10,5
0,19
n.a.
nem
6
9,5
F
pubarche praecox
3,1
11,5
0,04
nd/nd
nem
7
16,5
L
Hirsutismus, oligomenorrhoea
14,8
16,2
2,19
n.a.
+
8
15,0
L
Hirsutismus, primer amenorrhoea
9,8
18,0
1,22
V281L/ inaktív
+
9
13,0
L
Hirsutismus
11,0
18,0
0,26
nd/nd
10
14,0
L
Hirsutismus
7,1
18,8
1,24
V281L/V281L
+
11
8,0
L
pubarche praecox
9,0
20,0
1,06
V281L/V281L
+
12
17,0
L
Hirsutismus
4,4
23,3
2,07
V281L/V281L
+
13
14,3
L
oligomenorrhoea
12,0
23,3
2,11
n.a.
+
14
5,0
F
pubarche praecox, macrogenitosomia
9,0
26,6
15,23
I172N/I172N
+
15
10,0
L
pubarche praecox
6,5
26,7
2,65
V281L/ inaktív
+
16
17,0
L
hirsutismus, oligomenorrhoea
3,7
33,0
0,86
V281L/V281L
+
17
7,0
F
pubarche praecox, macrogenitosomia
18,3
37,0
2,94
n.a.
+
18
9,0
L
clitoromegalia
16,7
39,0
1,89
V281L/ inaktív
+
7. táblázat
nem
Az ACTH-stimulációra 8,0 és 40,0 ng/ml közötti választ adó betegek néhány vizsgálati eredménye. OHP-M/C-M: 17-OHP metabolitok és kortizol metabolitok aránya a vizeletben, L: lány, F: fiú, n.a.: nem elemeztük, nd: nem volt kimutatható mutáció.
58
5.5.2 A 21-OHD BETEGEK JELLEMZÉSE Összesen a 287 vizsgált betegből 21-nél volt bizonyítható a 21-OHD (7,3%) a vizelet szteroid profil analízisével és a genetikai vizsgálattal. Az esetek felében (N=10) a 17-OHP egyértelműen emelkedett volt az ACTH-stimulációs próbában, az esetek másik felében (N=11) az emelkedés csak közepes volt. A 270 vizsgált lányból 17 (6,3%), a 17 vizsgált fiúból 4 (23,5%) bizonyult CAH-nak. 5.5.3 AZ ACTH-STIMULÁCIÓS PRÓBA CAH ÉS NEM-CAH BETEGEKBEN A további elemzéshez a nem-CAH-os betegek 17-OHP koncentrációinak megoszlása szerinti csoportokba soroltuk a betegeket: stimuláció előtti átlag 1,9 ng/ml, -2 SD 0,5 ng/ml, 1 SD 1,0 ng/ml, +1 SD 3,5 ng/ml, +2 SD 6,6 ng/ml; stimuláció utáni átlag 4,0 ng/ml, -2 SD 1,5 ng/ml, -1 SD 2,5 ng/ml, +1 SD 6,4 ng/ml, +2 SD 10,3 ng/ml. A CAH-os betegek 17-OHP koncentrációi ugyan magasabbak voltak, mint a nem-CAHos betegekéi, de átfedés volt tapasztalható mind ACTH stimuláció előtt (3,5-20 ng/ml), mind utána (10,3-30 ng/ml), ami stimuláció előtt a +1 SD fölötti, stimuláció után a +2 SD fölötti tartományba esik. (17. , 18. ábra) 17.A
1000
CAH
Poszt-ACTH 17-OHP (ng/ml)
nem-CAH
10 0
10
1 0,1
1
10
Bazális 17-OHP (ng/ml)
59
100
1000
40
30
30
20
20
10
1 0
NemCAH
17. ábra
POSZT-ACTH
BAZÁLIS 40
CAH
Nem-CAH
17-OHP (ng/ml)
17-OHP (ng/ml)
17.B
CAH
Az ACTH-stimulációs próba eredményei CAH és nem-CAH betegekben. A. Az ACTH-ra adott 17-OHP válasz a bazális 17-OHP függvényében. B. Bazális és ACTH utáni 17-OHP koncentrációk CAH és nem-CAH betegekben. : átlag ±1 SD,
: átlag ±2 SD, •: egyedi 17-OHP értékek. BAZÁLIS
18. ábra
POSZT-ACTH
A CAH és a nem-CAH betegek aránya az egyes 17-OHP-tartományokban ACTH stimuláció előtt és után. A bazális 3,5 és 6,6 ng/ml, ill. a poszt-ACTH 6,4 és 10,3 ng/ml a nem-CAH-os betegek átlag +1 SD ill. +2SD-nek felel meg. 60
5.5.4 TÜNETEK A kivizsgálás alapját képező leggyakoribb tünet a korai pubarche, a hirsutismus és az oligomenorrhoea volt. A CAH betegeket a többi hiperandrogenizmus miatt vizsgált betegtől specifikusan elkülönítő klinikai jelet vagy tünetet nem lehetett azonosítani. Korai pubarche a CAH betegek 33%-ban és a nem-CAH betegek 43%-ban, hirsutismus és oligomenorrhea a CAH betegek 52%-ban és a nem-CAH betegek 42%-ban volt tapasztalható. A prepubertális tünetek (pubarche praecox vagy macrogenitosomia) és a posztpubertális tünetek (oligomenorrhoea és hirsutismus) miatt vizsgált betegek között nem találtunk különbséget sem a stimuláció előtti, sem a stimuláció utáni 17-OHP koncentráció tekintetében. A 21-OHD autoszómás öröklődése ellenére sokkal több lány volt mind a vizsgált (270 a 287-ből) , mind a CAH-nak bizonyult esetek között (17 a 21-ből), mint fiú. 5.5.5 A SZÉRUM SZTEROID PROFIL CAH ÉS NEM-CAH BETEGEKBEN A stimuláció előtti kortizol koncentráció nem különbözött a CAH és a nem-CAH betegekben, de az ACTH-ra adott kortizol válasz jóval alacsonyabb volt a CAH betegekben (p<0,0001). A stimuláció előtti DHEA szintek magasabbak voltak a CAH-osokban (p<0,0001), amit egy mérsékelt emelkedés követett ACTH hatására. A CAH betegek tesztoszteron koncentrációi minden korcsoportban magasabbak voltak (p<0,0001), de a többi beteg közül is többnek volt emelkedett a tesztoszteron szintje. Pubertás előtt nem találtunk különbséget a CAH-os fiúk és lányok tesztoszteron szintjei között (7. táblázat). 7.A
17-OHP (ng/ml) Kortizol (μg/dl) DHA (ng/dl)
CAH
nem-CAH
0 min
55 (3,7-250)
2,3 (0,3-11)
60 min
75,2 (16,2-346)
4,5 (0,9-18)
0 min
9,9 (3,6-17,9)
9,9 (2,5-44)
60 min
12,8 (6-22)
20,5 (6-73)
0 min
901 (25-2060)
549 (25-2900)
60 min
979 (25-2200)
839,5 (25-3400)
74 (1,4-335)
189 (5-313)
DHAS (μg/dl)
61
7.B Tesztoszteron
7. táblázat
CAH
nem-CAH
fiúk
lányok
fiúk
lányok
8 év alatt
62 (14,5-102)
53,8 (5-121)
40 (5-105)
14,5 (5-60)
8-14 év
185 (58-312)
85 (11,6-260)
131 (8-313)
40 (2-256)
14 év fölött
-
69,4 (24-101)
90 (15-175)
49 (5-120)
A. A CAH és nem-CAH betegek szérum szteroid profilja az ACTH stimuláció során. B. Tesztoszteron koncentrációk az egyes betegcsoportokban.
62
6. MEGBESZÉLÉS 6.1 A 17-OHP STABILITÁSA BESZÁRÍTOTT VÉRFOLT MINTÁBAN A szteroidhormonok általában igen ellenállónak bizonyulnak különféle környezeti hatásokkal szemben, jól ellenállnak pl. a magas változó hőmérsékletnek (40 oC-ig) [19], az ismételt fagyasztásnak és felolvasztásnak, és napokig stabilak szobahőmérsékleten tárolt teljes vérben [60, 65]. Ezzel ellentétben vizsgálatunk során azt találtuk, hogy az autoklávozás, azaz magas hőmérséklet, magas páratartalom és nagy nyomás, jelentősen, 32%-kal csökkentette a vérfoltból mért 17-OHP koncentrációt. Az autoklávozás azonban a vizes 17-OHP oldat 17OHP koncentrációját nem csökkentette. Ez arra enged következtetni, hogy a vérfolt mintánál tapasztalt csökkenés oka nem a 17-OHP bomlása, hanem az az autoklávozás hatására erősebben kötődik a szűrőpapír anyagához, és nehezebben vonható ki onnan. Matematikai korrekcióval jó közelítéssel megbecsülhető az autoklávozott mintából mért 17-OHP koncentráció alapján az eredeti, natív koncentráció koncentrációfüggő torzítás nélkül. A mérési hiba növekedése hasonló a más immunoassay-knél tapasztalhatókhoz egy előzetes preparációs lépés beiktatása esetén. A hosszú tárolás hatásának vizsgálata során egy évi 2-3%-os csökkenést tapasztaltunk a 17-OHP koncentrációban mind a natív, mind az autoklávozott mintákban. Ez a csökkenés csak a natív mintáknál érte el a statisztikai szignifikancia szintjét, az autoklávozott mintáknál nem, valószínűleg a kisebb elemszám és a vizsgált periódus rövidebb volta miatt. A 17-OHP koncentráció mérésére széles körben alkalmazott DELFIA eljárás inter-assay varianciája 8% [168], ennek tükrében néhány éves minták esetén a tárolásból adódó csökkenéstől el lehet tekinteni. Évtizedesnél régebbi minták esetén érdemes a csökkenéssel kalkulálni, bár a korrekció növeli a mérési hibát. Korábbi vizsgálatok a 17-OHP-t szűrőpapíron stabilnak találták egy évig [56, 106]. A progeszteron szintén igen ellenállónak bizonyult egy korábbi vizsgálatban, szűrőpapíron 25 oC-on 15 hétig, 37 oC-on 9 hétig találták stabilnak [113]. Plazmában –25 oC-on egy évtized után is stabilnak találtak több szteroidhormont [66]. A mérsékelt éghajlaton, átlagos körülmények között tárolt vérfolt mintákban a 17-OHP eredményeink alapján stabilnak tekinthető hosszú idő után is. Az egyes években átlagosan valamivel magasabb 17-OHP koncentrációkat mértünk a nem-autoklávozott mintákban, mint az irodalomban közölt értékek [128, 153, 154]. Ez azzal magyarázható, hogy az adott évből gyűjtött mintáknál szándékosan arra törekedtünk, hogy a kis súlyú, feltehetően koraszülöttektől származó minták aránya 32,5% legyen az átlagos
63
körülmények között előforduló 6-8%-os gyakoriság helyett [45]. Azért állítottuk így össze a vizsgált csoportot, hogy minél több minta 17-OHP koncentrációja essen a 7 nmol/l fölötti tartományba, ahol a DELFIA 17-OHP assay mérési precizitása a legmegbízhatóbb. Erre az elrendezésre azért volt szükség, hogy az évek során esetlegesen bekövetkező kis mértékű csökkenést az assay optimális precizitása mellett tudjuk vizsgálni. Mivel a tárolás során bekövetkező csökkenést esetünkben elhanyagolhatónak találtuk, az összes évből származó mintát összevontuk, és születési súly szerinti csoportokat alakítottunk ki. Az egyes súlycsoportok 17-OHP mediánjai és percentilisei hasonlóak voltak a korábban publikált, nem tárolt szűrőpapírokkal nyert eredményekhez [128, 146, 153, 154]. Az alacsony születési súlyú újszülöttek mintáiban statisztikailag is szignifikánsan magasabb 17-OHP koncentrációkat mértünk, mint az egészségesekben, összhangban a korábbi eredményekkel [[128, 146, 153, 154]. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy az autoklávozott vérfolt mintákban mért 17OHP alapján kielégítő precizitással megbecsülhető az eredeti 17-OHP koncentráció. Kimutattuk továbbá, hogy mind a natív, mind az autoklávozott, tárolt újszülöttkori vérfolt minták kielégítően stabilak akár egy évtized után is, íly módon alkalmasak az eredeti 17-OHP koncentráció megbízható megítélésére, és retrospektív populációs vizsgálatok elvégzésére. 6.2 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE MAGYARORSZÁGON A congenitalis adrenalis hyperplasia diagnosztikája során elterjedten alkalmazzák a 17OHP vérfoltból történő meghatározását, újszülöttkorban tömegszűrés keretében, vagy egyedi diagnosztika során is. Az újszülöttkori tömegszűrés előnyeit az azonosított betegek számára több, nagy esetszámú vizsgálat igazolta, de az álnegativitás valódi arányáról nem állnak rendelkezésre megbízható információk [1, 104, 108]. Az újszülöttkori tömegszűrés költséghatékonyságának reális megítélése nem lehetséges az álnegativitás tényleges arányának ismerete nélkül. Az irodalomban néhány esetismertetés számol be egy-egy olyan betegről, akiket az újszülöttkori tömegszűrés nem volt képes azonosítani, és csak később, a tünetek jelentkezése alapján azonosították őket [150, 152]. Ezek a beszámolók valószínűleg a szűrés által nem azonosított betegeknek csak kis hányadát ismertetik, az utánkövetés sem időben, sem térben nem volt olyan alapos és kiterjedt, hogy további azonosítatlan, esetleg később diagnosztizált betegek léte biztonsággal kizárható lenne. A kérdést tisztázó nagy esetszámú, átfogó vizsgálat eddig nem készült. Ráadásul ismert az a jelenség, hogy, bár a klasszikus betegek túlnyomó többsége a vérfolt 17-OHP szintje alapján azonosítható az élet első hetében, egy kisebb 64
hányaduknál, akik többnyire SV-CAH betegek, csak valamivel később emelkedik a 17-OHP a jellegzetesen magas szintre [53, 150, 151]. Ezek alapján feltételeztük, hogy az álnegativitás aránya valójában magasabb, mint amennyit eddig az utánkövetések során találtak, ezért ennek igazolására egy eltérő stratégiát dolgoztunk ki. Az igazolt klasszikus CAH beteg gyermekektől származó, tárolt újszülöttkori vérfolt mintákon utólagosan végeztünk el egy, a szűréshez metodikájában igen hasonló 17OHP mérést, és az eredményt az 1 hetes korra vonatkozó normálértékek szerint elemeztük. Így az összes sóvesztő beteget azonosítani tudtuk volna, de a SV-CAH betegek 1/3-ánál (3 a 9-ből) a születés utáni 17-OHP koncentráció még nem volt diagnosztikus, ez a tünetek súlyosbodásával párhuzamosan emelkedett, és elérte a kóros tartományt a diagnózis felállításának idejére (11. ábra). Ez ugyan megkönnyíti a diagnózis felállítását, de hátrányos a betegek szempontjából, a csontkor és a pubertás kóros előrehaladása esetenként visszafordíthatatlanul csökkenti a végső testmagasságot [92, 175]. Vizsgálatunkban az álpozitivitás aránya igen magas volt (3%). A CAH szűréseknél az álpozitivitás általában magas, ezt a perinatális stressznek ill. a koraszülötteknek tulajdonítják, a mi vizsgálatunkban ezt tovább ronthatta a viszonylag kicsi elemszám, és a 17-OHP meghatározásra használt direkt RIA sajátosságai. Rendelkezésre állnak ennél szenzitívebb és specifikusabb módszerek, fluoroimmunometriával [52], más radioimmunometriákkal [33, 106], ELISA-val [94] és tandem tömegspektrometriával is vannak kedvező tapasztalatok [75]. A direkt RIA vizsgálataink alapján tehát alkalmas a tünetes betegek egyedi diagnosztikájára, hiszen a tünetek jelentkezésekor magasabb a 17-OHP koncentráció, mint újszülöttkorban, és a jellemző klinikai képpel együtt értékelve megbízható alapját képezi a diagnózisnak. Tömegszűréshez azonban ennél specifikusabb módszerre van szükség. Eredményeink felvetik, hogy a CAH irányában történő tömegszűrés során az álnegativitás aránya jelentős lehet, a klasszikus betegek között mintegy 10%, a SV-CAH betegek körében mintegy 30%. A pontos arány meghatározásához ezért egy hasonló vizsgálatot végeztünk egy ennél specifikusabb, újszülöttkori tömegszűrésre rutinszerűen használt módszerrel, az eddiginél nagyobb mintán. 6.3 A 21-OHD RETROSPEKTÍV SZŰRÉSE KÖZÉP-EURÓPAI BETEGEKBEN Öt közép-európai ország együttműködésével összesen 110 bizonyítottan CAH beteg tárolt újszülöttkori vérfoltmintáin végeztük el a retrospektív szűrést, miután meggyőződtünk a minták erre alkalmas voltáról (5.1). A retrospektív szűrés gyakorlati kivitelezése az újszülöttkori tömegszűréssel együtt történt, ugyanaz a labor, ugyanazokkal a módszerekkel 65
végezte a méréseket, és az eredmények kiértékelése is azonos protokoll szerint történt, az ESPE CAH tömegszűrésre vonatkozó ajánlását követve [62], ezért vizsgálatainkból a valódi tömegszűrésre vonatkoztatható következtetések vonhatók le. Vizsgálatunkban mind a 77 SW-CAH betegtől származó minta 17-OHP koncentrációja meghaladta a European Society for Pediatric Endocrinology (ESPE) által javasolt 90 nmol/les határt. Az ESPE ajánlás szerint érett újszülöttek esetében a 90 nmol/l fölötti 17-OHP koncentráció igen nagy valószínűséggel a 21-OHD súlyos formáját (SW-CAH) jelzi, és azonnali kivizsgálásra és a terápia megkezdésére van szükség [62], a 30 nmol/l alatti 17-OHP koncentrációt az ajánlás normálisnak tekinti, a 30 és 90 nmol/l közötti tartományban pedig a mintavétel megismétlését ajánlja. Ennek szellemében az összes SW-CAH beteget azonosítani lehetett volna az élet első két hetében, ezzel szemben a 33 SV-CAH betegből 10 kikerült volna az egészségügy látóköréből a tünetek jelentkezéséig a szűréskor mért 30 nmol/l alatti 17-OHP koncentráció alapján. A retrospektív szűrés megerősítette, hogy tömegszűréssel valóban azonosítható az összes SW-CAH beteg, ami a tömegszűrés elsődleges célja azonban, az eddigi statisztikákkal ellentétben [104, 122, 143, 150], SV-CAH-ra csak 73%-os szenzitivitást találtunk. A fel nem ismerhető SV-CAH betegek aránya még ennél is nagyobb lehet, mert a tünetes, de nem diagnosztizált betegek mintái, és azoké, akik még túl fiatalok ahhoz, hogy a tünetek jelentkezzenek − a vizsgálat 2001-ben történt, a legfiatalabb minták 2000-ből valók − a mi vizsgálatunkba sem kerültek be. Azaz lehetséges, hogy a mi mintánkban is relatíve túlreprezentáltak azok, akiknek tüneteik a születés után relatíve hamar észlelhetők, és hiányzik néhány beteg, akiknek tünetei csak a későbbi prepubertásban lesznek felismerhetők. Bár feltehető, hogy a születés után alacsonyabb 17-OHP koncentrációjú betegek a 21-OHD enyhébb formájában szenvednek, őket is hátrányosan érinti a terápia késedelmes volta. A tömegszűrés deklarált céljai között szerepel a nem téves meghatározásának megelőzése, a tömegszűrés az általunk vizsgált SV-CAH leányok egyharmadát ettől nem védte volna meg. Egyes tömegszűrések során, az álpozitivitás és a vonatkozó költségek csökkentésének céljából, eltérnek az ESPE ajánlástól, és kevésbé szigorú elvágási határokat alkalmaznak, pl. 37,5 nmol/l-t [100], vagy 40 nmol/l-t [163]. Ilyen határok mellett mintánkban az SV-CAH betegek mintegy felét nem sikerült volna kiszűrni, de minden SW-CAH beteg vérfoltjának 17OHP koncentrációja a határ fölött volt. A CAH szűrőprogram szenzitivitása és specificitása növelhető a 17-OHP assay tökéletesítésével [3]. Az immunometrián alapuló módszerek közös problémája az újszülöttek
66
szérumában lévő egyéb szteroidokkal, elsősorban pregnántriol származékokkal adott keresztreakció [77]. A 17-OHP GC/MS-val való meghatározása vérfolt mintából ugyan mentes ettől a problémától, de nagy szakértelem- és költségigénye miatt nem elterjedt módszer. A jelenleg rendelkezésre állók közül tömegszűrésre ára, pontossága és a radioaktivitás elkerülése miatt optimálisnak az általunk is használt DELFIA tekinthető [3, 104]. Az álpozitivitás arányának csökkentésére
másik lehetőség, hogy a vérfolt 17-OHP
koncentrációt további információk tükrében értékelik. Korábbi vizsgálatok igazolták, hogy több lépcsős elvágási határt alkalmazva születési súly, gesztációs kor [52], vagy életkor és születési súly [102] szerint növelhető a specificitás a ráfordítás növelése nélkül. Egy további szűrőprogram során a magas 17-OHP koncentrációjú vérfoltokban a kortizol koncentrációt is meghatározták, és csak akkor hívták vissza a betegeket, ha a magas 17-OHP alacsony kortizolszinttel társult [73]. Metodikai okokból ez nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket, túlságosan csökkent a szenzitivitás is. Felvetették, hogy a mellékvesevelő egyidejű vizsgálata is csökkentheti az álpozitivitás arányát, de ez szűrés keretében még nem került eddig kipróbálásra [28]. Több szűrőprogramban genetikai vizsgálattal egészítik ki a 17-OHP-mérést [151], de ez egyrészt nagyon megdrágítja a szűrést, másrészt a genetikai vizsgálat elvégzése vérfoltból technikailag még nem megoldott. Az álnegativitás arányának csökkentése érdekében Texasban a tömegszűrés két lépcsőben történik, a 4 napos kori mintavételt egy héttel később egy újabb mintavétel követi. Eredményeinkhez hasonlóan, a texasi szűrés során is az összes SW-CAH beteget azonosították már az első mintavétel során, de az SV-CAH betegeknek csak a 40%-át az összes szűréssel azonosított beteghez képest, és nem közlik, vannak-e még további, egyáltalán ki nem szűrt betegek a populációban. Bár a szűrés szenzitivitását hatékonyan növeli a kettős mintavétel, a költségeket ez mintegy a duplájára emeli [22, 23, 150]. Vizsgálatunk során igazoltuk, hogy a jelenlegi ajánlásokkal összhangban elvégzett újszülöttkori tömegszűrés során az összes SW-CAH beteg kiszűrhető, és a szűrés így maradéktalanul teljesíti az életveszélyes sóvesztő krízis megelőzésére vonatkozó célkitűzést. Az SV-CAH betegeknek azonban mintegy egyharmada nem szűrhető ki az első héten, ezért a nem téves megállapításának megelőzésére vonatkozó célkitűzés csak részben teljesülhet. Az ilyen esetekben a felismerést és a terápiát tovább késleltetheti, hogy a területi ellátást végző orvos, abban a hiszemben, hogy a negatív tömegszűrési eredmény biztosan kizárja a 21-OHDt, esetleg csak a kivizsgálás későbbi fázisában gondol rá. Ezért fontos annak tudatosítása,
67
hogy a negatív újszülöttkori szűrési eredmény nem zárja ki automatikusan a CAH enyhébb formáit, ugyanakkor igen hatékony elsődleges céljának megvalósításában, a sóvesztő krízis megelőzésében. 6.4
A
21-OHD
AZONOSÍTÁSA
MAGYARORSZÁGON
VÉRFOLT
17-OHP
MÉRÉSSEL Magyarországon a CAH nem része az újszülöttkori tömegszűrésnek, de az egyedi diagnosztika segítésére rendelkezésre áll az a lehetőség, hogy a tüneteik alapján CAH-ra gyanús, bármilyen életkorú betegtől beszárított vérfolt minta küldhető egy központi laboratóriumba, és a küldő 24 órán belül értesítést kap a 17-OHP koncentrációról. A 17-OHP meghatározása szérumból nem mindenütt rutinszerűen megoldott, a vérfolt minták tárolása és szállítása viszont roppant egyszerű. A központi laboratórium a 17-OHP meghatározásán kívül konzultációs lehetőséget is kínál a további teendőkre vonatkozóan [134]. Húsz év tapasztalatainak elemzésével hasonlítottuk össze a CAH diagnosztikájában folytatott magyarországi gyakorlatot a tömegszűrések eredményességével. Elsősorban arra kerestük a választ, hogy tömegszűrés nélkül a CAH betegek mekkora hányada nem kerül felismerésre, illetve a felismert betegek mekkora hátrányt szenvednek a terápia késlekedése miatt az újszülöttkorban diagnosztizáltakhoz képest. Vizsgálatunk során a CAH magyarországi incidenciáját az Európában a tömegszűrések során megállapított incidenciákhoz nagyon hasonlónak találtuk. A klasszikus CAH betegek gyakorlatilag mind felismerhetők a magyarországi gyakorlat során, viszont a nemek arányának kiegyensúlyozatlanságából kikövetkeztethető, hogy a fiú SV-CAH betegek egy jelentős részét, számításunk szerint évi 1 fiút, az SV-CAH fiúk több, mint felét, nem sikerül azonosítani, valószínűleg relatíve tünetszegény mivoltuk miatt. Megjegyzendő, hogy ez az a betegcsoport, akik között a tömegszűrés hatékonysága is a legrosszabb [167]. Mind a SW-CAH, mind a SV-CAH betegeket később tudtuk diagnosztizálni, mint ahogy tömegszűréssel lehetséges [24], bár a SV-CAH fiúk és lányok életkora között a diagnózis felállításakor nem volt jelentős különbség. Az enyhén virilizált külső női nemi szervek ezek szerint nem minden esetben eléggé figyelemfelkeltőek, és csak a progresszív virilizáció jelentkezése során kerül a betegség felismerésre. A SW-CAH lányok többségét korán, egy hónapos kor előtt sikerült diagnosztizálni, legtöbbjüket már az első héten az átmeneti, erősen virilizált külső nemi szervek erőteljesebb figyelemfelkeltő volta miatt. A SW-CAH fiúk mintegy 2 héttel voltak idősebbek a
68
diagnóziskor a lányoknál, ami ugyan rövid, de élettanilag jelentős idő, ugyanis ez a sóvesztés kialakulásának felel meg, ami fiúkban tömegszűrés nélkül semmilyen módon nem előzhető meg. A sóvesztés önmagában nem feltétlenül fatális, idejében történő felismerés és kezelés mellett [166]. A vizsgált periódusban a SW-CAH fiúk és lányok száma között nincs szignifikáns különbség, ennek alapján ezen időszakban a CAH fiúk felismerése és kezelése sikeresnek mondható. A sóvesztő krízisen átesett betegeknél a késői káros következmények azonban nem zárhatók ki, egyes betegekben enyhe agyi károsodásról számoltak be [39], hosszú és átfogó követési adatok nem állnak rendelkezésre. Az SV-CAH betegek szűrés nélkül előnytelenebb helyzetben vannak, mivel csak későn kerülnek azonosításra, a fiúk egy része pedig egyáltalán nem. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy Magyarországon tömegszűrés nélkül is lehetséges a 21-OHD-s betegek túlnyomó többségének felismerése, de későbbi életkorban, mint tömegszűréssel. Ez a késlekedés hátrányosan érinti a betegeket a súlyos, esetenként életveszélyes tünetek megjelenése miatt, melyek így nem előzhetők meg. A fiúk a késedelmes vagy elmaradó diagnózis miatt nagyobb hátrányt szenvednek, mint a lányok, akiket nagyobb arányban és előbb sikerül felismerni. A centralizált egyedi diagnosztika eredményei azonban sokkal kedvezőbbek az 1978 előtti, vérfolt méréssel nem támogatott egyedi diagnosztikánál. A jelenlegi magyarországi gyakorlat elfogadható alternatívát kínál a 21-OHD-s betegek diagnosztikájában az újszülöttkoron túl is, ahol tömegszűrés megszervezésére nincs lehetőség. A definitív diagnózis felállításához a vérfolt 17-OHP mérésen kívül minden betegnél kiegészítő verifikáló vizsgálatokra van szükség, de sürgős esetekben az adekvát terápia korai indításában gyorsasága és egyszerűsége révén más módszereknél hatékonyabb segítséget nyújt a 17-OHP-szint vérfoltból történő meghatározása. 6.5
A
NEM-KLASSZIKUS
CAH
AZONOSÍTÁSA
ACTH-STIMULÁCIÓS
PRÓBÁVAL A CAH szűrések eredményét az ajánlások szerint [62] mindig verifikálni kell, a 17-OHPt a szérumból is meg kell határozni. A verifikációra alkalmazott vizsgálatok közül a legegyszerűbb és legelterjedtebb az ACTH-stimulációs próba. A CAH gyanúja miatt végzett ACTH-stimulációs próbák eredményének elemzése során megállapítottuk, hogy, bár az ACTH hatására történő 17-OHP-emelkedés igen specifikus a 21-OHD-ra, mégis a bizonyítottan CAH és nem-CAH betegek eredményei között az esetek kis hányadában átfedés
69
tapasztalható, összhangban azzal a felfogással, hogy a CAH súlyossága biokémiailag, élettanilag és klinikailag egyaránt folyamatos spektrumot alkot. A CAH enyhébb, nem-klasszikus formájában a 21-hidroxiláz enzim aktivitásának csökkenése nem teljes, a tünetek később jelentkeznek, mint a klasszikus CAH-ban, gyakran pubertás után, és a kezelés nélküli 17-OHP koncentrációk alacsonyabbak [87]. A diagnózis felállítása során ezért szenzitív módszerek alkalmazására van szükség. A bazális 17-OHP koncentráció emelkedése ACTH hatására a 21-hidroxiláz aktivitásának érzékeny markere, a heterozigóta hordozók is valamivel emelkedettebb választ adnak, mint az egészségesek [98], és ritkán tüneteik is lehetnek [35]. Bár minden kutató egyetért abban, hogy a 17-OHP emelkedése az ACTH-stimulációs próbában nagyon jellegzetes a 21-OHD-ra, nincs egyetértés a referenciatartomány tekintetében, 7 és 20 ng/ml közötti értékeket ajánlottak [72, 37, 98]. Vizsgálatunk során nem tudtunk éles határt húzni a CAH-os és nem-CAH-os, de hyperandrogenismusra utaló tüneteket mutató betegek bazális vagy ACTH stimulációs értékei között. Más szerzők is tapasztaltak hasonlót [32, 67]. Eredményeink alapján az ACTH stimulációs próba értékelésénél egyetlen elvágási határ helyett a kettős elvágási határ alkalmazását javasoljuk, és a két érték, mintánkban 10 és 30 ng/ml közé eső stimulált 17-OHP esetén a betegek további vizsgálatára van szükség a 21-OHD bizonyítására vagy egyéb mellékvesebetegségek, pl. a 11β-OHD [135] vagy a mellékvese-adenoma [156] kizárására. A vizelet szteroid profil meghatározása GC/MS-val igen érzékeny és specifikus módszer a CAH igazolására. A vizelettel ürített 17-OHP és kortizol metabolitok aránya egyértelműen különbséget tesz a 21-OHD-s és nem-21-OHD-s betegek között. A módszer azonban igen időigényes, és csak szűk körben hozzáférhető [180]. A genetikai vizsgálat egyértelműen képes elkülöníteni a 21-OHD-s betegeket mind a hordozóktól, mind az egészségesektől, így hasznos kiegészítő információt nyújt az ACTHstimulációs próba értékeléséhez [141]. Az ACTH-stimulációs próba azonban jóval olcsóbb és gyorsabb eljárás, mint a genetikai vizsgálat. A szérum szteroid profil vizsgálatával nem tudtuk vizsgálatunkban elkülöníteni a 21OHD-s betegeket a többiektől. A CAH betegek bazális kortizol koncentrációi a normáltartományban voltak, és ACTH hatására a kortizol a normális tartomány alsó régiójába emelkedett, három beteg kivételével. A CAH enyhe formájában szenvedő betegek tehát, mivel az enzimaktivitás csak részben csökken, képesek lehetnek élettanilag kielégítő mennyiségű kortizol termelésére, de csak megnövekedett prekurzor- és androgénprodukció
70
árán [8, 43, 90]. A tesztoszteron koncentrációját a hiperandrogén tünetek miatt vizsgált betegek mintegy háromnegyedében, a CAH betegek mintegy felében normálisnak találtuk. Vizsgálatunkban a hiperandrogenizmusra utaló tünetek hátterében az esetek 7%-ában igazolódott 21-OHD. Ez az érték hasonló a más vizsgálatok során tapasztaltakhoz, a korai pubarche hátterében az esetek 10-30%-ában igazoltak 21-OHD-t [35, 82, 149], serdülő, hirsutismusos lányok között 10%-ban [41], felnőtt hirsutismusos nőkben 1-3%-ban [10, 43, 72] találtak 21-OHD-t. A diagnosztizált NC-CAH betegek között sokkal több lány volt, mint fiú. Örökléstani megfontolások alapján azonban ugyanannyi betegnek kellene lenni mindkét nemben, de fiúkban a pubertás utáni esetleges tünetek, pl. oligozoospermia felnőttkorig nem ismerhetők fel. Ugyanakkor az enyhe adrenális andogéntúlsúly férfiakban nem feltétlenül okoz panaszokat, míg nőkben oligomenorrhoeához, hirsutismushoz és aknehez vezet. A krónikusan magas ACTH azonban tünetmentes betegeknél is adrenalis adenoma kialakulásához vezethet [8, 16]. Vizsgálatunk során úgy találtuk, hogy az ACTH stimulációs próba az esetek túlnyomó többségében alkalmas a CAH enyhe formáinak diagnosztizálására is, de az esetek egy kisebb hányadában az eredmény nem értelmezhető egyértelműen, ilyenkor a vizelet szteroid profil meghatározásától vagy a genetikai vizsgálattól várható egyértelmű eredmény.
71
7. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 1)
Autoklávozás során a szűrőpapíron beszárított vérfolt mintából mérhető 17-OHP koncentrációja mintegy 32%-kal csökken, mert a 17-OHP erősebben kötődik a szűrőpapír anyagához.
2)
Szobahőn történő hosszú tárolás során a szűrőpapíron beszárított vérfolt mintában a 17-OHP gyakorlatilag stabilnak tekinthető, koncentrációja mindössze évi 2-3%-kal csökken.
3)
Tárolt újszülöttkori vérfolt mintákon is igazolható, hogy a kis súlyú újszülöttek mintáiban szignifikánsan magasabb 17-OHP koncentráció mérhető, mint a normális súlyú újszülöttek mintáiban.
4)
Mind az autoklávozás után, mind a natív formában tárolt szűrőpapíron beszárított újszülöttkori vérfolt minták akár egy évtized után is alkalmasak 17-OHP mérésen alapuló populációs vizsgálatok elvégzésére.
5)
A tárolt, újszülöttkori vérfolt mintákon elvégzett retrospektív szűrés során a klasszikus CAH betegek mintegy 90%-a azonosítható mind a magyarországi, mind a közép-európai beteganyagban. A súlyos, sóvesztő betegek 100%-ban azonosíthatók, az enyhébb, egyszerű virilizáló betegek 70%-ban. Az azonosítás hatékonysága a valódi CAH tömegszűrés során is hasonló lehet.
6)
A retrospektív szűrés során nem azonosítható, álnegatív betegek mindegyike a CAH enyhébb, egyszerű virilizáló formájában szenvedett. Mindkét nemben azonos az álnegatív betegek aránya.
7)
Magyarországon tömegszűrés nélkül, a vérfolt 17-OHP meghatározás egyedi diagnosztikában való alkalmazásával gyakorlatilag az öszes sóvesztő beteg és az egyszerű virilizáló betegek háromnegyede azonosítható. Évi egy egyszerű virilizáló fiút azonban nem sikerül így megtalálni.
8)
Magyarországon tömegszűrés nélkül a klasszikus CAH betegek későbbi életkorban kerülnek felismerésre, mint ahogy tömegszűréssel lehetséges lenne. A sóvesztő lányok többségét egy hónapos kor előtt, még a sóvesztő krízis kialakulása előtt sikerül diagnosztizálni, így az megelőzhető. A sóvesztő fiúkat egy hónapos kor környékén, a sóvesztő krízis kialakulása kapcsán lehet diagnosztizálni. Az egyszerű virilizáló fiúkat és lányokat egyaránt két éves kor után, a korai pubarche jelentkezése kapcsán sikerül diagnosztizálni.
72
9)
A magyarországi CAH regiszter alapján a CAH magyarországi incidenciája 1 : 15.000, ami igen hasonló az Európában, tömegszűrések során talált incidenciákhoz.
10)
Az ACTH stimulációs próbában egyetlen elvágási határ helyett kétlépcsős elvágási határ javasolható, ahol a két érték között további vizsgálatok elvégzésére van szükség a diagnózis felállításához. Eredményeink szerint a 10 és a 30 ng/ml közötti ACTH stimuláció utáni 17-OHP koncentrációk esetén van erre szükség.
11)
A 17-OHP koncentráció emelkedése ACTH hatására a 21-hidroxiláz enzim aktivitásának érzékeny markere, és ahogy az enzimaktivitás csökkenésében és a klinikai tünetek súlyosságában, úgy az exogén ACTH-ra adott 17-OHP válasz nagyságában is tapasztalható a CAH súlyossági spektrumának folyamatos jellege.
73
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Sólyom János Professzor Úrnak az áldozatos és folytonos támogatásért és a hosszú éveken át belém vetett bizalomért. Köszönöm továbbá Klinikánk igazgatójának, Fekete György Professzor Úrnak a támogatást és figyelmet, mellyel munkámat mindvégig kísérte. Hálával tartozom az Endokrin Munkacsoport tagjainak, névsorrendben Dr. Halász Zitának, Dr. Hosszú Évának, Dr. Luczay Andreának és Dr. Sallai Ágnesnek nem csak azért, mert tudásukat mindig készségesen és végtelen türelemmel készek voltak megosztani velem, hanem a családias hangulatért és a gondoskodásért, mellyel körülvettek. A felbecsülhetetlen értékű technikai asszisztenciáért hálával tartozom Eckhardt Gudrunnak és Kurdi Krisztinának. A genetikai vizsgálatok elvégzéséért köszönet illeti Ferenczi Annát és Dr. Garami Miklóst. Köszönet illeti a magyar gyermekendokrin ellátásban résztvevő orvosokat a hosszú és készséges együttműködésért. Köszönöm a szűrőközpontok munkatársainak, hogy a mintagyűjtésben készségesen együttműködtek. Nélkülük nem lett volna lehetséges vizsgálataink ilyen nagy populációra való kiterjesztése. Hálás vagyok Franz Waldhauser Professzor Úrnak, bécsi mentoromnak, hogy bekapcsolódhattam kutatócsoportjának munkájába, és értékes tapasztalatokat szerezhettem. Köszönöm torontoi mentoraimnak, Amira Klip Professzor Asszonynak, Dr. Assaf Rudichnak és Dr. Kapus Andrásnak, hogy az orvosi kutatások egy újabb dimenziójával ismertettek meg. Emberi és szakmai tanácsaikkal és iránymutatásukkal pótolhatatlanul hozzájárultak jelen disszertáció elkészüléséhez is. Köszönöm a II. sz. Gyermekklinika valamennyi munkatársának, hogy segítő és baráti légkörben végezhettem doktori munkámat. Végezetül köszönöm családomnak és barátaimnak a türelmet és a kitartó támogatást.
74
IRODALOMJEGYZÉK
1.
[No authors listed] Technical report: congenital adrenal hyperplasia. Section on Endocrinology and Committee on Genetics. Pediatrics. 2000; 106:1511-8.
2.
Agarwal MK, Mirshahi M. General overview of mineralocorticoid hormone action. Pharmacol Ther. 1999; 84:273-326.
3.
al Saedi S, Dean H, Dent W, Stockl E, Cronin C. Screening for congenital adrenal hyperplasia: the Delfia Screening Test overestimates serum 17-hydroxyprogesterone in preterm infants. Pediatrics. 1996; 97:100-2.
4.
Alfaidy N, Li W, MacIntosh T, Yang K, Challis J. Late gestation increase in 11betahydroxysteroid dehydrogenase 1 expression in human fetal membranes: a novel intrauterine source of cortisol. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88:5033-8.
5.
Allen DB, Hoffman GL, Fitzpatrick P, Laessig R, Maby S, Slyper A. Improved precision of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia using weightadjusted criteria for 17-hydroxyprogesterone levels. J Pediatr. 1997; 130:128-33.
6.
Arlt W, Callies F, van Vlijmen JC, Koehler I, Reincke M, Bidlingmaier M, Huebler D, Oettel M, Ernst M, Schulte HM, Allolio B. Dehydroepiandrosterone replacement in women with adrenal insufficiency. N Engl J Med. 1999; 341:1013-20.
7.
Avila NA, Shawker TS, Jones JV, Cutler GB Jr, Merke DP. Testicular adrenal rest tissue in congenital adrenal hyperplasia: serial sonographic and clinical findings. AJR Am J Roentgenol. 1999; 172:1235-8.
8.
Azziz R, Dewailly D, Owerbach D. Clinical review 56: Nonclassic adrenal hyperplasia: current concepts. J Clin Endocrinol Metab. 1994; 78:810-5.
9.
Azziz R, Mulaikal RM, Migeon CJ, Jones HW Jr, Rock JA. Congenital adrenal hyperplasia: long-term results following vaginal reconstruction. Fertil Steril. 1986; 46:1011-4.
10. Azziz R, Zacur HA. 21-Hydroxylase deficiency in female hyperandrogenism: screening and diagnosis. J Clin Endocrinol Metab. 1989; 69:577-84. 11. Balsamo A, Cacciari E, Piazzi S, Cassio A, Bozza D, Pirazzoli P, Zappulla F. Congenital adrenal hyperplasia: neonatal mass screening compared with clinical diagnosis only in the Emilia-Romagna region of Italy, 1980-1995. Pediatrics. 1996; 98:362-7. 12. Balsamo A, Cicognani A, Baldazzi L, Barbaro M, Baronio F, Gennari M, Bal M, Cassio A, Kontaxaki K, Cacciari E. CYP21 genotype, adult height, and pubertal development in 55 patients treated for 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88:5680-8. 13. Bassett MH, White PC, Rainey WE. The regulation of aldosterone synthase expression. Mol Cell Endocrinol. 2004; 217:67-74. 14. Baumgartner-Parzer SM, Schulze E, Waldhausl W, Pauschenwein S, Rondot S, Nowotny P, Meyer K, Frisch H, Waldhauser F, Vierhapper H. Mutational spectrum of the steroid 21-hydroxylase gene in Austria: identification of a novel missense mutation. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86:4771-5.
75
15. Berenbaum SA. Effects of early androgens on sex-typed activities and interests in adolescents with congenital adrenal hyperplasia. Horm Behav. 1999; 35:102-10. 16. Bernini GP, Brogi G, Vivaldi MS, Argenio GF, Sgro M, Moretti A, Salvetti A. 17Hydroxyprogesterone response to ACTH in bilateral and monolateral adrenal incidentalomas. J Endocrinol Invest. 1996 Dec;19(11):745-52. 17. Bland JM, Altman DG. Comparing methods of measurement: why plotting difference against standard method is misleading. Lancet. 1995; 346:1085-7. 18. Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1986; 1:307-10. 19. Bode HH, Rivkees SA, Cowley DM, Pardy K, Johnson S. Home monitoring of 17 hydroxyprogesterone levels in congenita1 adrenal hyperplasia with filter paper blood samples. J Pediatr. 1999; 134:185-9. 20. Bornstein SR, Tajima T, Eisenhofer G, Haidan A, Aguilera G. Adrenomedullary function is severely impaired in 21-hydroxylase-deficient mice. FASEB J. 1999; 13:1185-94. 21. Bristow J, Tee MK, Gitelman SE, Mellon SH, Miller WL. Tenascin-X: a novel extracellular matrix protein encoded by the human XB gene overlapping P450c21B. J Cell Biol. 1993; 122:265-78. 22. Brosnan CA, Brosnan P, Therrell BL, Slater CH, Swint JM, Annegers JF, Riley WJ. A comparative cost analysis of newborn screening for classic congenital adrenal hyperplasia in Texas. Public Health Rep. 1998; 113:170-8. 23. Brosnan CA, Brosnan PG, Swint JM. Analyzing the cost of neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia. Pediatrics. 2001; 107:1238. 24. Brosnan PG, Brosnan CA, Kemp SF, Domek DB, Jelley DH, Blackett PR, Riley WJ. Effect of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia. Arch Pediatr Adolesc Med. 1999; 153:1272-8. 25. Carroll MC, Campbell RD, Porter RR. Mapping of steroid 21-hydroxylase genes adjacent to complement component C4 genes in HLA, the major histocompatibility complex in man. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985; 82:521-5. 26. Cartigny-Maciejewski M, Guilley N, Vanderbecken S, Gonde S, Stuckens C, Ponte C, Weill J, Farriaux JP, Paux E. Neonatal screening of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: Lille experience 1980-1996. Arch Pediatr. 1999 Feb;6(2):151-8. 27. Caulfield MP, Lynn T, Gottschalk ME, Jones KL, Taylor NF, Malunowicz EM, Shackleton CH, Reitz RE, Fisher DA. The diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in the newborn by gas chromatography/mass spectrometry analysis of random urine specimens. J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87:3682-90. 28. Charmandari E, Eisenhofer G, Mehlinger SL, Carlson A, Wesley R, Keil MF, Chrousos GP, New MI, Merke DP. Adrenomedullary function may predict phenotype and genotype in classic 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87:3031-7. 29. Charmandari E, Hindmarsh PC, Johnston A, Brook CG. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: alterations in cortisol pharmacokinetics at puberty. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86:2701-8.
76
30. Charmandari E, Johnston A, Brook CG, Hindmarsh PC. Bioavailability of oral hydrocortisone in patients with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. J Endocrinol. 2001; 169:65-70. 31. Charmandari E, Lichtarowicz-Krynska EJ, Hindmarsh PC, Johnston A, Aynsley-Green A, Brook CG. Congenital adrenal hyperplasia: management during critical illness. Arch Dis Child. 2001; 85:26-8. 32. Cisternino M, Dondi E, Martinetti M, Lorini R, Salvaneschi L, Cuccia M, Severi F. Exaggerated 17-hydroxyprogesterone response to short-term adrenal stimulation and evidence for CYP21B gene point mutations in true precocious puberty. Clin Endocrinol (Oxf). 1998; 48:555-60. 33. Cordova RA, Vignola G. Screening and diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in Basilicata (Italy). Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1999; 30:103. 34. Cutfield WS, Webster D. Newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in New Zealand. J Pediatr. 1995 Jan;126(1):118-21. 35. Dacou-Voutetakis C, Dracopoulou M. High incidence of molecular defects of the CYP21 gene in patients with premature adrenarche. J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84:1570-4. 36. de Peretti E, Forest MG. Pitfalls in the etiological diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in the early neonatal period. Horm Res. 1982; 16:10-22. 37. Dewailly D, Vantyghem-Haudiquet MC, Sainsard C, Buvat J, Cappoen JP, Ardaens K, Racadot A, Lefebvre J, Fossati P. Clinical and biological phenotypes in late-onset 21hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 1986; 63:418-23. 38. Dolzan V, Prezelj J, Vidan-Jeras B, Breskvar K. Adrenal 21-hydroxylase gene mutations in Slovenian hyperandrogenic women: evaluation of corticotrophin stimulation and HLA polymorphisms in screening for carrier status. Eur J Endocrinol. 1999; 141:132-9. 39. Donaldson MD, Thomas PH, Love JG, Murray GD, McNinch AW, Savage DC. Presentation, acute illness, and learning difficulties in salt wasting 21-hydroxylase deficiency. Arch Dis Child. 1994; 70:214-8. 40. Ehrmann DA, Rosenfield RL, Barnes RB, Brigell DF, Sheikh Z. Detection of functional ovarian hyperandrogenism in women with androgen excess. N Engl J Med. 1992; 327:157-62. 41. Emans SJ, Grace E, Fleischnick E, Mansfield MJ, Crigler JF Jr. Detection of late-onset 21-hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia in adolescents. Pediatrics. 1983; 72:690-5. 42. Enyedi P. A mellékvese élettana és kórtana. In: A klinikai endokrinológia és anyagcsere-betegségek kézikönyve. Szerk.: Leövey A. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2001; 377-386. 43. Erel CT, Senturk LM, Oral E, Mutlu H, Colgar U, Seyisoglu H, Ertungealp E. Results of the ACTH stimulation test in hirsute women. J Reprod Med. 1999; 44:247-52. 44. Ezquieta B, Oliver A, Gracia R, Gancedo PG. Analysis of steroid 21-hydroxylase gene mutations in the Spanish population. Hum Genet. 1995; 96:198-204.
77
45. Fekete Gy. Melléklet. In: Nelson: A gyermekgyógyászat tankönyve. Szerk.: Behrman RE, Kliegman RM, Arvin AM. Melania Kiadó Kft., Budapest, 1997. 46. Ferenczi A, Garami M, Kiss E, Pék M, Sasvári-Székely M, Barta C, Staub M, Sólyom J, Fekete G. Screening for mutations of 21-hydroxylase gene in Hungarian patients with congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84:2369-72. 47. Fernandes VT, Ribeiro-Neto LM, Lima SB, Vieira JG, Verreschi IT, Kater CE. Reversed-phase high-performance liquid chromatography separation of adrenal steroids prior to radioimmunoassay: application in congenital adrenal hyperplasia. J Chromatogr Sci. 2003 May-Jun;41(5):251-4. 48. Fiet J, Villette JM, Galons H, Boudou P, Burthier JM, Hardy N, Soliman H, Julien R, Vexiau P, Gourmelen M. The application of a new highly-sensitive radioimmunoassay for plasma 21-deoxycortisol to the detection of steroid-21-hydroxylase deficiency. Ann Clin Biochem. 1994; 31:56-64. 49. Frank GR, Yoon DY, Kreitzer PM. Near-fatal misdiagnosis of congenital adrenal hyperplasia. J Pediatr. 1997; 131:165-6. 50. Granner DK. Hormones of the adrenal cortex. In: Harper’s biochemistry. Eds.: Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Prentica-Hall International Inc. 23rd Edition. 1993; 523-536. 51. Greulich WW, Pyle SI. Radiographic skeletal development of the hand and wrist. In: Stanford University Press, Stanford, 1959. 52. Gruneiro-Papendieck L, Prieto L, Chiesa A, Bengolea S, Bossi G, Bergada C. Neonatal screening program for congenital adrenal hyperplasia: adjustments to the recall protocol. Horm Res. 2001; 55:271-7. 53. Gudmundsson K, Majzoub JA, Bradwin G, Mandel S, Rifai N. Virilising 21hydroxylase deficiency: timing of newborn screening and confirmatory tests can be crucial. J Pediatr Endocrinol Metab. 1999; 12:895-901. 54. Hargitai G, Sólyom J, Battelino T, Lebl J, Pribilincova Z, Hauspie R, Kovacs J, Waldhauser F, Frisch H; MEWPE-CAH Study Group. Growth patterns and final height in congenital adrenal hyperplasia due to classical 21-hydroxylase deficiency. Results of a multicenter study. Horm Res. 2001; 55:161-71. 55. Higashi Y, Tanae A, Inone H, Fuji-Kuriyama Y. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21) gene: implications for 21hydroxylase deficiency. Am J Hum Genet. 1988; 42:17-25. 56. Hofman LF, Klaniecki JE, Smith EK. Direct solid-phase radioimmunoassay for screening 17 alpha-hydroxyprogesterone in whole-blood samples from newborns. Clin Chem. 1985; 31:1127-30. 57. Homoki J, Sólyom J, Teller WM. Detection of late onset steroid 21-hydroxylase deficiency by capillary gas chromatographic profiling of urinary steroids in children and adolescents. Eur J Pediatr. 1988; 147:257-62. 58. Homoki J, Sólyom J, Wachter U, Teller WM. Urinary excretion of 17hydroxypregnanolones in patients with different forms of congenital adrenal hyperplasia due to steroid 21-hydroxylase deficiency. Eur J Pediatr. 1992; 151:24-8. 59. Honour JW, Torresani T. Evaluation of neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia. Horm Res. 2001; 55:206-11.
78
60. Howe CJ, Handelsman DJ. Use of filter paper for sample collection and transport in steroid pharmacology. Clin Chem. 1997; 43:1408-15. 61. Hughes IA. Congenital adrenal hyperplasia--a continuum of disorders. Lancet. 1998; 352:752-4. 62. Joint LWPES/ESPE CAH Working Group. Consensus statement on 21-hydroxylase deficiency from the Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society and the European Society for Paediatric Endocrinology. J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87:4048-53. 63. Kerrigan JR, Veldhuis JD, Leyo SA, Iranmanesh A, Rogol AD. Estimation of daily cortisol production and clearance rates in normal pubertal males by deconvolution analysis. J Clin Endocrinol Metab. 1993; 76:1505-10. 64. King JL, Naber JM, Hopkin RJ, Repaske DR, Bailey L, Leslie ND. Antenatal corticosteroids and newborn screening for congenital adrenal hyperplasia. Arch Pediatr Adolesc Med. 2001; 155:1038-42. 65. Kley HK, Rick W. The effect of storage and temperature on the analysis of steroids in plasma and blood. J Clin Chem Clin Biochem. 1984; 22:371-8. 66. Kley HK, Schlaghecke R, Kruskemper HL. Stability of steroids in plasma over a 10year period. J Clin Chem Clin Biochem. 1985; 23:875-8. 67. Knochenhauer ES, Cortet-Rudelli C, Cunnigham RD, Conway-Myers BA, Dewailly D, Azziz R. Carriers of 21-hydroxylase deficiency are not at increased risk for hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 1997; 82:479-85. 68. Kominami S, Hara H, Ogishima T, Takemori S. Interaction between cytochrome P-450 (P-450C21) and NADPH-cytochrome P-450 reductase from adrenocortical microsomes in a reconstituted system. J Biol Chem. 1984; 259:2991-9. 69. Kovács J, Votava F, Heinze G, Sólyom J, Lebl J, Pribilincova Z, Frisch H, Battelino T, Waldhauser F; Middle European Workshop on Paediatric Endocrinology-Congenital Adrenal Hyperplasia Study Group. Lessons from 30 years of clinical diagnosis and treatment of congenital adrenal hyperplasia in five middle European countries. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86:2958-64. 70. Kuhnle U, Bullinger M. Outcome of congenital adrenal hyperplasia. Pediatr Surg Int. 1997; 12:511-5. 71. Kuhnle U, Land M, Ulick S. Evidence for the secretion of an antimineralocorticoid in congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab. 1986; 62:934-40. 72. Kuttenn F, Couillin P, Girard F, Billaud L, Vincens M, Boucekkine C, Thalabard JC, Maudelonde T, Spritzer P, Mowszowicz I, et al. Late-onset adrenal hyperplasia in hirsutism. N Engl J Med. 1985; 313:224-31. 73. Kwon C, Farrell PM. The magnitude and challenge of false-positive newborn screening test results. Arch Pediatr Adolesc Med. 2000; 154:714-8. 74. Labrie F, Belanger A, Luu-The V, Labrie C, Simard J, Cusan L, Gomez JL, Candas B. DHEA and the intracrine formation of androgens and estrogens in peripheral target tissues: its role during aging. Steroids. 1998; 63:322-8.
79
75. Lai CC, Tsai CH, Tsai FJ, Wu JY, Lin WD, Lee CC. Rapid screening assay of congenital adrenal hyperplasia by measuring 17alpha-hydroxyprogesterone with highperformance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry from dried blood spots. J Clin Lab Anal. 2002; 16:20-5. 76. Lamberts SW, Bruining HA, de Jong FH. Corticosteroid therapy in severe illness. N Engl J Med. 1997; 337:1285-92. 77. Lange-Kubini K, Zachmann M, Kempken B, Torresani T. 15beta-hydroxylated steroids may be diagnostically misleading in confirming congenital adrenal hyperplasia suspected by a newborn screening programme. Eur J Pediatr. 1996; 155:928-931. 78. Larsson A, Hagenfeldt L, von Dobeln U, Curstedt T, Gustafsson J, Svensson E. Neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia using 17-hydroxyprogesterone assay in filter paper blood spots. Horm Res. 1988;30(6):235-40. 79. Laue L, Merke DP, Jones JV, Barnes KM, Hill S, Cutler GB Jr. A preliminary study of flutamide, testolactone, and reduced hydrocortisone dose in the treatment of congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab. 1996; 81:3535-9. 80. Lebovitz RM, Pauli RM, Laxova R. Delayed diagnosis in congenital adrenal hyperplasia. Need for newborn screening. Am J Dis Child. 1984; 138:571-3. 81. Lee MM, Donahoe PK. Mullerian inhibiting substance: a gonadal hormone with multiple functions. Endocr Rev. 1993; 14:152-64. 82. Leite MV, Mendonca BB, Arnhold IJ, Estefan V, Nunes C, Nicolau W, Bloise W. Identification of nonclassical 21-hydroxylase deficiency in girls with precocious pubarche. J Endocrinol Invest. 1991; 14:11-5. 83. Lightner ES, Levine LS. The adrenal incidentaloma. A pediatric perspective. Am J Dis Child. 1993; 147:1274-6. 84. Linder BL, Esteban NV, Yergey AL, Winterer JC, Loriaux DL, Cassorla F. Cortisol production rate in childhood and adolescence. J Pediatr. 1990; 117:892-6. 85. Linder N, Davidovitch N, Kogan A, Barzilai A, Kuint J, Mazkeret R, Sack J. Longitudinal measurements of 17alpha-hydroxyprogesterone in premature infants during the first three months of life. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 1999; 81:F1758. 86. Lo JC, Schwitzgebel VM, Tyrrell JB, Fitzgerald PA, Kaplan SL, Conte FA, Grumbach MM. Normal female infants born of mothers with classic congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84:9306. 87. Lobo RA, Goebelsmann U. Adult manifestation of congenital adrenal hyperplasia due to incomplete 21-hydroxylase deficiency mimicking polycystic ovarian disease. Am J Obstet Gynecol. 1980; 138:720-6. 88. MacLaughlin DT, Donahoe PK. Sex determination and differentiation. N Engl J Med. 2004; 22;350:367-78. 89. Manoli I, Kanaka-Gantenbein Ch, Voutetakis A, Maniati-Christidi M, DacouVoutetakis C. Early growth, pubertal development, body mass index and final height of patients with congenital adrenal hyperplasia: factors influencing the outcome. Clin Endocrinol (Oxf). 2002; 57:669-76.
80
90. McKenna TJ, Cunningham SK. The pathogenesis of adrenal and extra adrenal hyperandrogenism. J Steroid Biochem Mol Biol. 1993; 45:117-21. 91. Mercado AB, Wilson RC, Cheng KC, Wei JQ, New MI. Prenatal treatment and diagnosis of congenital adrenal hyperplasia owing to steroid 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 1995; 80:2014-20. 92. Merke DP, Bornstein SR, Avila NA, Chrousos GP. NIH conference. Future directions in the study and management of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Ann Intern Med. 2002; 136:320-34. 93. Merke DP, Fields JD, Keil MF, Vaituzis AC, Chrousos GP, Giedd JN. Children with classic congenital adrenal hyperplasia have decreased amygdala volume: potential prenatal and postnatal hormonal effects. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88:1760-5. 94. Mikami A, Fukushi M, Oda H, Fujita K, Fujieda K. Newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in Sapporo City: sixteen years experience. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1999; 30:100-2. 95. Miller WL. Pathophysiology, genetics, and treatment of hyperandrogenism. Pediatr Clin North Am. 1997; 44:375-95. 96. Mornet E, Gibrat JF. A 3D model of human P450c21: study of the putative effects of steroid 21-hydroxylase gene mutations. Hum Genet. 2000; 106:330-9. 97. New MI, Josso N. Disorders of gonadal differentiation and congenital adrenal hyperplasia. Endocrinol Metab Clin North Am. 1988; 17:339-66. 98. New MI, Lorenzen F, Lerner AJ, Kohn B, Oberfield SE, Pollack MS, Dupont B, Stoner E, Levy DJ, Pang S, Levine LS. Genotyping steroid 21-hydroxylase deficiency: hormonal reference data. J Clin Endocrinol Metab. 1983; 57:320-6. 99. New MI. Diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia. Annu Rev Med. 1998; 49:311-28. 100. Nordenström A, Wedell A, Hagenfeldt L, Marcus C, Larsson A. Neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia: 17-hydroxyprogesterone levels and CYP21 genotypes in preterm infants. Pediatrics. 2001; 108:E68. 101. Nussdorfer GG, Malendowicz LK. Role of VIP, PACAP, and related peptides in the regulation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Peptides. 1998; 19:1443-67. 102. Olgemoller B, Roscher AA, Liebl B, Fingerhut R. Screening for congenital adrenal hyperplasia: adjustment of 17-hydroxyprogesterone cut-off values to both age and birth weight markedly improves the predictive value. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88:5790-4. 103. OMIM +201910: Adrenal hyperplasia, congenital, due to 21-hydroxylase deficiency. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=201910 104. Pang S, Clark A. Congenital adreanl hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: Newborn screening and its relationship to the diagnosis and treatment of the disorder. Screening. 1993; 2:105-139 105. Pang S, Clark A. Newborn screening, prenatal diagnosis, and prenatal treatment of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency . Trends Endocrinol Metab. 1990; 1:300-307.
81
106. Pang S, Hotchkiss J, Drash AL, Levine LS, New MI. Microfilter paper method for 17 alpha- hydroxyprogesterone radioimmunoassay: its application for rapid screening for congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab. 1977; 45:1003-8. 107. Pang S, Murphey W, Levine LS, Spence DA, Leon A, LaFranchi S, Surve AS, New MI. A pilot newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in Alaska. J Clin Endocrinol Metab. 1982; 55:413-20. 108. Pang S, Shook MK. Current status of neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia. Curr Opin Pediatr. 1997; 9:419-23. 109. Pang S. Newborn screening for congenital adrenal hyperplasia. Pediatr Ann. 2003; 32:516-23. 110. Pang SY, Wallace MA, Hofman L, Thuline HC, Dorche C, Lyon IC, Dobbins RH, Kling S, Fujieda K, Suwa S. Worldwide experience in newborn screening for classical congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Pediatrics. 1988; 81:866-74. 111. Patócs A, Tóth M, Barta C, Sasvári-Székely M, Varga I, Szűcs N, Jakab C, Gláz E, Rácz K. Hormonal evaluation and mutation screening for steroid 21-hydroxylase deficiency in patients with unilateral and bilateral adrenal incidentalomas. Eur J Endocrinol. 2002; 147:349-55. 112. Penning TM. Molecular endocrinology of hydroxysteroid dehydrogenases. Endocr Rev. 1997; 18:281-305. 113. Petsos P, Ratcliffe WA, Anderson DC. Assessment of corpus luteum function by direct radioimmunoassay for progesterone in blood spotted on filter paper. Clin Chem. 1985; 31:1289-93. 114. Pinto G, Tardy V, Trivin C, Thalassinos C, Lortat-Jacob S, Nihoul-Fekete C, Morel Y, Brauner R. Follow-up of 68 children with congenital adrenal hyperplasia due to 21hydroxylase deficiency: relevance of genotype for management. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88:2624-33. 115. Prader A. 1954 Genital findings in the female pseudo-hermaphroditism of the congenital adrenogenital syndrome; morphology, frequency, development and heredity of the different genital forms. Helv Paediatr Acta. 3:231-248. 116. Quintos JB, Vogiatzi MG, Harbison MD, New MI. Growth hormone therapy alone or in combination with gonadotropin-releasing hormone analog therapy to improve the height deficit in children with congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86:1511-7. 117. Rainey WE, White PC. Functional adrenal zonation and regulation of aldosterone biosynthesis. Curr Opin Endocrinol Diab. 1998; 5:175-182. 118. Rittmaster RS. Clinical review 73: Medical treatment of androgen-dependent hirsutism. J Clin Endocrinol Metab. 1995; 80:2559-63. 119. Ritzen EM. Prenatal dexamethasone treatment of fetuses at risk for congenital adrenal hyperplasia: benefits and concerns. Semin Neonatol. 2001; 6:357-62. 120. Röhrer TR, Gassmann KF, Pavel ME, Dörr HG. Pitfall of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Biol Neonate. 2003; 83:65-8.
82
121. Rumsby G, Avey CJ, Conway GS, Honour JW. Genotype-phenotype analysis in late onset 21-hydroxylase deficiency in comparison to the classical forms. Clin Endocrinol (Oxf). 1998; 48:707-11. 122. Sack J, Front H, Kaiserman I, Schreiber M. 21-Hydroxylase deficiency: screening and incidence in Israel. Horm Res. 1997;48(3):115-9. 123. Sadler TW. Orvosi embryologia. Glandula suprarenalis. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 1999; 419. 124. Sargent CA, Anderson MJ, Hsieh SL, Kendall E, Gomez-Escobar N, Campbell RD. Characterisation of the novel gene G11 lying adjacent to the complement C4A gene in the human major histocompatibility complex. Hum Mol Genet. 1994; 3:481-8. 125. Scott LV, Dinan TG. Vasopressin and the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal axis function: implications for the pathophysiology of depression. Life Sci. 1998; 62:1985-98. 126. Seymour CA, Thomason MJ, Chalmers RA, Addison GM, Bain MD, Cockburn F, Littlejohns P, Lord J, Wilcox AH. Newborn screening for inborn errors of metabolism: a systematic review. Health Technol Assess. 1997; 1:1-95. 127. Shackleton CH, Honour JW. Simultaneous estimation of urinary steroids by semiautomated gas chromatography. Investigation of neo-natal infants and children with abnormal steroid synthesis. Clin Chim Acta. 1976; 69:267-83. 128. Shimozawa K, Matsumoto M, Okada K, Murata M, Tsuchiya Y, Kitagawa T. Analysis of blood spot 17alpha-hydroxyprogesterone concentrations in neonates. Horm Res. 1988; 30:246-51. 129. Silva IN, Kater CE, Cunha CF, Viana MB. Randomised controlled trial of growth effect of hydrocortisone in congenital adrenal hyperplasia. Arch Dis Child. 1997; 77:214-8. 130. Simpson ER, Mahendroo MS, Means GD, Kilgore MW, Hinshelwood MM, GrahamLorence S, Amarneh B, Ito Y, Fisher CR, Michael MD, Mendelson CR, Bulun E. Aromatase cytochrome P450, the enzyme responsible for estrogen biosynthesis. Endocr Rev. 1994; 15:342-55. 131. Slotkin TA, Zhang J, McCook EC, Seidler FJ. Glucocorticoid administration alters nuclear transcription factors in fetal rat brain: implications for the use of antenatal steroids. Brain Res Dev Brain Res. 1998; 111:11-24. 132. Sólyom J, Gács G, Keszei K, Láng K, Örley J, Petheő I, Ságodi L. Detection of lateonset adrenal hyperplasia in girls with peripubertal virilization. Acta Endocrinol (Copenh). 1987; 115:413-8. 133. Sólyom J, Hammond GL, Vihko R. A method for identification and follow-up of patients with a steroid-21-hydroxylase deficiency. Clin Chim Acta. 1979; 92:117-24. 134. Sólyom J, Hughes IA. Value of selective screening for congenital adrenal hyperplasia in Hungary. Arch Dis Child. 1989; 64:338-42. 135. Sólyom J, Rácz K, Péter F, Homoki J, Sippell WG, Peter M: Clinical, hormonal and molecular genetic characterization of Hungarian patients with 11β-hydroxylase deficiency. J Endocr Genet 2001; 2:37-44.
83
136. Sólyom J. Blood-spot 17 alpha-hydroxyprogesterone radioimmunoassay in the followup of congenital adrenal hyperplasia. Clin Endocrinol (Oxf). 1981; 14:547-53. 137. Spät A. Glomerulosa cell--a unique sensor of extracellular K+ concentration. Mol Cell Endocrinol. 2004; 217:23-6. 138. Speiser PW, Dupont J, Zhu D, Serrat J, Buegeleisen M, Tusie-Luna MT, Lesser M, New MI, White PC. Disease expression and molecular genotype in congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. J Clin Invest. 1992; 90:584-95. 139. Speiser PW, Dupont J, Zhu D, Serrat J, Buegeleisen M, Tusie-Luna MT, Lesser M, New MI, White PC. Disease expression and molecular genotype in congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. J Clin Invest. 1992; 90:584-95. 140. Speiser PW, Serrat J, New MI, Gertner JM. Insulin insensitivity in adrenal hyperplasia due to nonclassical steroid 21-hydroxylase deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 1992; 75:1421-4. 141. Speiser PW, White PC. Congenital adrenal hyperplasia due to steroid 21-hydroxylase deficiency. Clin Endocrinol (Oxf). 1998; 49:411-7. 142. Speiser PW, White PC. Congenital adrenal hyperplasia. N Engl J Med. 2003; 349:77688. 143. Steigert M, Schoenle EJ, Biason-Lauber A, Torresani T. High reliability of neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia in Switzerland. J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87:4106-10. 144. Stikkelbroeck NM, Van't Hof-Grootenboer BA, Hermus AR, Otten BJ, Van't Hof MA. Growth inhibition by glucocorticoid treatment in salt wasting 21-hydroxylase deficiency: in early infancy and (pre)puberty. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88:352530. 145. Stocco DM, Clark BJ. Regulation of the acute production of steroids in steroidogenic cells. Endocr Rev. 1996; 17:221-44. 146. Sulyok E, Sólyom J, Fuller M, Kerekes L. Postnatal changes in blood spot 17hydroxyprogesterone level in healthy preterm and full-term neonates. Acta Paediatr Hung. 1988; 29:239-43. 147. Tajima T, Fujieda K, Nakae J, Toyoura T, Shimozawa K, Kusuda S, Goji K, Nagashima T, Cutler GB Jr. Molecular basis of nonclassical steroid 21-hydroxylase deficiency detected by neonatal mass screening in Japan. J Clin Endocrinol Metab. 1997; 82:2350-6. 148. Tanner JM. Growth and adolescence. In: Blackwell Sci Publ, Oxford, 1973. 149. Temeck JW, Pang SY, Nelson C, New MI. Genetic defects of steroidogenesis in premature pubarche. J Clin Endocrinol Metab. 1987; 64:609-17. 150. Therrell BL Jr, Berenbaum SA, Manter-Kapanke V, Simmank J, Korman K, Prentice L, Gonzalez J, Gunn S. Results of screening 1.9 million Texas newborns for 21hydroxylase-deficient congenital adrenal hyperplasia. Pediatrics. 1998; 101:583-90. 151. Therrell BL. Newborn screening for congenital adrenal hyperplasia. Endocrinol Metab Clin North Am. 2001 Mar;30(1):15-30.
84
152. Thil'en A, Nordenstrom A, Hagenfeldt L, von Dobeln U, Guthenberg C, Larsson A. Benefits of neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in Sweden. Pediatrics. 1998; 101:E11. 153. Thompson R, Seargeant L, Winter JS. Screening for congenital adrenal hyperplasia: distribution of 17alpha-hydroxyprogesterone concentrations in neonatal blood spot specimens. J Pediatr. 1989; 114:400-4. 154. Torresani T, Grüters A, Scherz R, Burckhardt JJ, Harras A Zachmann M, 1994 Improving the efficacy of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia by adjusting the cut-off level of 17-hydroxyprogesterone to gestational age. Screening. 3:77-84 155. Tóth M, Rácz K, Adleff V, Varga I, Futó L, Jakab C, Karlinger K, Kiss R, Gláz E. Comparative analysis of plasma 17-hydroxyprogesterone and cortisol responses to ACTH in patients with various adrenal tumors before and after unilateral adrenalectomy. J Endocrinol Invest. 2000; 23:287-94. 156. Tóth M, Rácz K, Gláz E. Increased plasma 17-hydroxyprogesterone response to ACTH in patients with nonhyperfunctioning adrenal adenomas is not due to a deficiency in 21hydroxylase activity. J Clin Endocrinol Metab. 1998; 83:3756-7. 157. Török D, Eckhardt G, Sallay É, Sculer Á, Fekete Gy, Sólyom J. Retrospektív vizsgálat a 21-hidroxiláz-defektus neonatalis szűrési lehetőségéről Magyarországon. Gyermekgyógyászat. 2004; 54:383-389. 158. Török D, Eckhardt G, Sólyom J. Twenty years experience in rapid identification of congenital adrenal hyperplasia in Hungary. Eur J Pediatr. 2003; 162:844-9. 159. Török D, Halász Z, Garami M, Homoki J, Fekete G, Sólyom J. Limited value of serum steroid measurements in identification of mild form of 21-hydroxylase deficiency. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2003; 111:27-32. 160. Török D, Mühl A, Votava F, Heinze G, Sólyom J, Crone J, Stockler-Ipsiroglu S, Waldhauser F. Stability of 17alpha-hydroxyprogesterone in dried blood spots after autoclaving and prolonged storage. Clin Chem. 2002; 48:370-2. 161. Tusie-Luna MT, Traktman P, White PC. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus. J Biol Chem. 1990; 265:20916-22. 162. Vainio S, Heikkila M, Kispert A, Chin N, McMahon AP. Female development in mammals is regulated by Wnt-4 signalling. Nature. 1999; 397:405-9. 163. Van der Kamp HJ, Noordam K, Elvers B, Van Baarle M, Otten BJ, Verkerk PH. Newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in the Netherlands. Pediatrics. 2001 Dec;108(6):1320-4. 164. Van der Kamp HJ, Otten BJ, Buitenweg N, De Muinck Keizer-Schrama SM, Oostdijk W, Jansen M, Delemarre-de Waal HA, Vulsma T, Wit JM. Longitudinal analysis of growth and puberty in 21-hydroxylase deficiency patients. Arch Dis Child. 2002; 87:139-44. 165. Van Wyk JJ, Gunther DF, Ritzen EM, Wedell A, Cutler GB Jr, Migeon CJ, New MI. The use of adrenalectomy as a treatment for congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab. 1996; 81:3180-90.
85
166. Virdi NK, Rayner PH, Rudd BT, Green A. Should we screen for congenital adrenal hyperplasia? A review of 117 cases. Arch Dis Child. 1987; 62:659-62. 167. Votava F, Török D, Kovács J, Möslinger D, Sólyom J, Pribilincova Z, Battelino T, Lebl J, Frisch H, Waldhauser F for the MEWPE-CAH Estimation of the false negative rate in the newborn screening of congenital adrenal hyperplasia. Horm Res. 2002; 58: 98 168. Wallac Oy. DELFIA neonatal 17-OH-progesterone: product information. Turku, Finland: Wallac Oy, 2001. 169. Watterberg KL. Adrenocortical function and dysfunction in the fetus and neonate. Semin Neonatol. 2004; 9:13-21. 170. Wedell A, Thilen A, Ritzen EM, Stengler B, Luthman H. Mutational spectrum of the steroid 21-hydroxylase gene in Sweden: implications for genetic diagnosis and association with disease manifestation. J Clin Endocrinol Metab. 1994; 78:1145-52. 171. Wedell A. Molecular genetics of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency): implications for diagnosis, prognosis and treatment. Acta Paediatr. 1998; 87:159-64. 172. Wedell A. Molecular genetics of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency): implications for diagnosis, prognosis and treatment. Acta Paediatr. 1998; 87:159-64. 173. White PC, Grossberger D, Onufer BJ, Chaplin DD, New MI, Dupont B, Strominger JL. Two genes encoding steroid 21-hydroxylase are located near the genes encoding the fourth component of complement in man. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985; 82:108993. 174. White PC, New MI, Dupont B. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986; 83:5111-5. 175. White PC, Speiser PW. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Endocr Rev. 2000; 21:245-91. 176. White PC, Vitek A, Dupont B, New MI. Characterization of frequent deletions causing steroid 21-hydroxylase deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85:4436-40. 177. Wilson JD, Griffin JE, Russell DW. Steroid 5 alpha-reductase 2 deficiency. Endocr Rev. 1993;14:577-93. 178. Wilson RC, Mercado AB, Cheng KC, New MI. Steroid 21-hydroxylase deficiency: genotype may not predict phenotype. J Clin Endocrinol Metab. 1995; 80:2322-9. 179. Working Group on Neonatal Screening of the European Society for Paediatric Endocrinology. Procedure for neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Horm Res. 2001; 55:201-5. 180. Wudy SA, Hartmann M, Homoki J. Hormonal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency in plasma and urine of neonates using benchtop gas chromatography-mass spectrometry. J Endocrinol. 2000; 165:679-83.
86
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK Közlemények: 1.
Török D, Mühl A, Votava F, Heinze G, Sólyom J, Crone J, Stöckler-Ipsoroglu S, Waldhauser F. Effect of autoclaving and prolonged storage on the stability of 17αOH-progesterone in dried blood spots. Clin Chem. 2002; 48:370-372.
2.
Török D, Halász Z, Garami M, Homoki J, Fekete Gy, Sólyom J. Limited value of serum steroid measurements in identification of mild form of 21-hydroxylase deficiency. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2003; 111:27-32.
3.
Sólyom J, Török D, Eckhardt G, Homoki J, Fekete Gy: Enyhe, nem-klasszikus 21hidroxiláz-defektus azonosítása. Gyermekgyógyászat. 2003; 54: 377-382.
4.
Török D, Eckhardt G, Sallay É, Schuler Á, Fekete Gy, Sólyom J. Retrospektív vizsgálat
a
21-hidroxiláz-defektus
szűrési
lehetőségéről
Magyarországon.
Gyermekgyógyászat. 2003; 54: 383-389. 5.
Török D, Eckhardt G, Sólyom J. Twenty years experience in rapid identification of congenital adrenal hyperplasia in Hungary. Eur J Ped. 2003; 162: 844-9.
6.
Sólyom J, Eckhardt G, Török D. Congenitalis adrenalis hyperplasia azonosítása vérfolt 17-hidroxiprogeszteron méréssel. Orv Hetil. 2004; 145: 2051-6.
Kongresszusi előadások és poszterek: 1.
Sólyom J, Török D, Eckhardt G. Blood-spot 17-hydroxyprogesterone measurements in patients at risk for congenital adrenal hyperplasia. 37th Annual Meeting of the ESPE, In: Horm Res. 1998;50(S3):1-150
2.
Sólyom J, Török D, Ferenczi A, Homoki J. Identification of patients with mild form of 21-hydroxylase deficiency. 38th Annual Meeting of ESPE, In: Horm Res. 1999; 51(S2):1-153
87
3.
Török D, Kirchknopfné EG, Hosszú É, Sólyom J. 21-hidroxiláz-defektus? ENDOPED 2000, Seregélyes
4.
Török D, Eckhardt G, Sallay É, Schuler Á, Sólyom J. Retrospective screening for 21-hydroxylase deficiency in Hungary. The 7th Middle European Workshop on Paediatric Endocrinology 2000, Olomouc, In: DMEV 2000; 3: 213
5.
Török D, Mühl A, Votava F, Heinze G, Sólyom J, Crone J, Stöckler-Ipsoroglu S, Waldhauser F. Effect of autoclaving and prolonged storage on the stability of 17αOH-progesterone in dried blood spots. The 8th Middle European Workshop on Paediatric Endocrinology 2001, Bled, In: Slov Pediatr. 2001; 8:59
6.
Török D., Eckhardt G., Sallay É., Schuler Á., Sólyom J.: Retrospective screening for 21-hydroxylase deficiency in Hungary. ESPE Meeting 2001, Montreal, In: Ped Res. 2001; 49:118A
7.
Votava F, Török D, Kovács J, Möslinger D, Sólyom J, Pribilincova Z, Battelino T, Lebl J, Frisch H, Waldhauser F for the MEWPE-CAH. Estimation of the false negative rate in the newborn screening of congenital adrenal hyperplasia. ESPE Meeting 2002. Horm Res. 58(S2): 98
8.
Török D, Dobos M, Fekete Gy, Sólyom J. A congenitalis adrenalis hyperplasia diagnosztikájának buktatóiról egy eset kapcsán. Fiatal Gyermekorvosok III. Kongresszusa, Szeged, 2004
9.
Török D. Cut-off values for evaluating mild 21-OHD. Meeting of AQUAPE (Arbeitsgruppe
Qualitätssicherung
der
Arbeitsgemeinschaft
Pädiatrische
Endokrinologie), Mainz, Németország, 2004. 10.
Votava F, Török D, Kovács J, Möslinger D, Sólyom J, Waldhauser F. Do screening levels of 17α-hydroxyprogesterone predict the severity of congenital adrenal hyperplasia? The 11th Middle European Workshop on Paediatric Endocrinology 2004, Krems, Austria, In: Slov Pediatr. 2004; 11:57
88
EGYÉB KÖZLEMÉNYEK Közlemények: 1.
Huang C, Somwar R, Patel N, Niu W, Török D, Klip A. Sustained exposure of L6 myotubes to high glucose and insulin decreases insulin-stimulated GLUT4 translocation but upregulates GLUT4 activity. Diabetes 2002; 51:2090-2098.
2.
Ben-Romano R, Rudich A , Török D, Vanounou S, Riesenberg K, Schlaeffer F, Klip A, Bashan N. Agent and cell-type specificity in the induction of insulin resistance by HIV protease inhibitors. AIDS. 2003; 17:23-32
3.
Rudich A, Konrad D, Török D, Ben-Romano R, Huang C, Niu W, Garg RR, Wijesekara N, Germinario RJ, Bilan PJ, Klip A. Indinavir uncovers different contributions of GLUT4 and GLUT1 towards glucose uptake in muscle and fat cells and tissues. Diabetologia. 2003; 46:649-58.
4.
Török D, Patel N, Jebailey L, Thong FS, Randhawa VK, Klip A, Rudich A. Insulin but not PDGF relies on actin remodeling and on VAMP2 for GLUT4 translocation in myoblasts. J Cell Sci. 2004 Oct 15;117(Pt 22):5447-55.
Kongresszusi előadások és poszterek: 1.
Török D, Eckhardt G, Sólyom J. A testsúly és a leptinszint összefüggése kezelt congenitalis adrenalis hyperplasiás betegekben. ENDOPED 2001, Epona
2.
Török D, Rudich A, Klip A. A HIV1 proteáz inhibitor indinavir gátolja a glukózfelvételt L6 izomsejtekben. ENDOPED 2002, Győr
3.
Török D, Rudich A, Klip A. Two distinct mechanisms for the induction of insulin resistance in skeletal muscle cells by HIV protease inhibitors. 11th Meeting on Middle-European Pediatric Research, 2002, Budapest
4.
Török D, Bilan PJ, Konrad D, Niu W, Wijesekara N, Germinario RJ, Klip A, Rudich A. GLUT4 is the major transporter isoform responsible for basal and insulinstimulated glucose uptake in L6 myotubes overexpressing a myc-GLUT4 and in
89
primary adipocytes, but not in 3T3-L1 adipocytes. 38th EASD meeting 2002, Budapest, In: Diabetologia 2002; 45:S2:A 21 5.
Ben-Romano R, Rudich A, Török D, Riesenberg K, Schlaeffler F, Bashan N. Agents and cell-type specificity in the induction of insulin resistance by HIV protease inhibitors. 38th EASD meeting 2002, Budapest, In: Diabetologia 2002; 45:S2:A 199
6.
Török D, Rudich A, Klip A. Insulin and PDGF mobilizes distinct GLUT4 containing vesicles. 10th Workshop of the Middle European Pediatric Endocrinologists, Conference of the Middle European Society for Pediatric Endocrinology, 2003, Kőszeg, In: Slov Pediatr 2003; 10: 201
7.
Török D: Képzelt beteg - Fiatalkori hypertonia a mineralokortikoid receptor aktiváló mutációja miatt. ENDOPED 2004, Pécs
8.
Török D, Rudich A, Klip A. Az inzulin és a PDGF különböző GLUT4 tartalmú vezikulákat mobilizál. Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XX. Kongresszusa, Szolnok, 2004, Orv Hetil. 2004; 145: S3: 6
9.
Török D, Patel N, Rudich A, Klip A. The insulin-sensitive pool of GLUT4 is characterized by VAMP2 and its dependence on actin remodeling. American Diabetes Association, 64th Meeting, 2004, Orlando
90
