60
5 PEMBAHASAN UMUM Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Skrining Kandidat Probiotik Penelitian ini merupakan eksplorasi dalam upaya mencari strain bakteri asam laktat yang mempunyai potensi sebagai probiotik. Eksplorasi dilakukan pada mandai, makanan fermentasi tradisional Indonesia yang berbasis buah yang melibatkan fermentasi oleh bakteri asam laktat. Isolat yang diperoleh dikarakterisasi potensinya sebagai probiotik, yaitu dengan mengevaluasi kemampuannya bertahan melewati saluran pencernaan manusia, antagonismenya terhadap bakteri-bakteri patogen enterik, dan aspek keamanannya untuk dikonsumsi oleh manusia. Fermentasi yang terjadi pada mandai merupakan fermentasi spontan yang berlangsung selama dua minggu. Garam ditambahkan sebagai faktor penseleksi populasi mikroorganisme yang berperan selama fermentasi. Dalam penelitian ini, isolasi bakteri asam laktat dilakukan selama fermentasi mandai pada hari ke 4, 8 dan 12. Kadar garam 5, 10 dan 15% dijadikan sebagai variabel untuk memperbesar peluang diperolehnya jenis bakteri asam laktat yang lebih bervariasi selama isolasi. Kadar garam 5, 10 dan15% ditentukan berdasarkan jumlah garam yang ditambahkan oleh produsen mandai di Kalimantan Timur. Jumlah garam yang ditambahkan dalam pembuatan mandai tergantung pada masa simpan yang diinginkan. Semakin lama masa simpan yang diinginkan, maka semakin banyak jumlah garam yang diinginkan. Penambahan garam yang tinggi bertujuan untuk memperpanjang masa simpan karena cempedak merupakan buah yang bersifat musiman, tidak dapat ditemukan sepanjang tahun. Pengawetan dami dengan fermentasi garam agar dapat disimpan dalam waktu yang lama memungkinkan masyarakat dapat tetap mengkonsumsi mandai walaupun tidak sedang musim cempedak. Bakteri asam laktat merupakan bagian populasi kecil pada mikrobiota sayur dan buah mentah. Umumnya bakteri asam laktat yang diisolasi dari produk fermentasi sayur dan buah termasuk genera Lactobacillus, khususnya L. plantarum. Bakteri lain yang mungkin ditemukan adalah L. curvatus, L. brevis, L. fermentum, Pediococcus pentosaceus dan Leuconostoc mesenteroides (Vitali et al. 2012). Penelitian Rahayu (2003) mengisolasi L. plantarum dan P. pentosaceus dari mandai. Fermentasi mandai terjadi secara aerobik dengan adanya akses terhadap oksigen selama fermentasi mandai. Pemberian air untuk melarutkan garam dan merendam dami dilakukan sampai seluruh dami terendam. Perendaman dalam air dilakukan antara lain untuk mencegah pertumbuhan kapang pada permukaan dami. Garam yang ditambahkan selama fermentasi menurunkan potensi oksidasi lingkungan fermentasi sehingga menghambat pertumbuhan mikroorganisme pembusuk yang bersifat aerobik, seperti Erwinia dan Pseudomonas yang sering menyebabkan pembusukan pada buah dan sayur.. Selama fermentasi berlangsung, gula yang terdapat pada dami berdifusi keluar dan dimetabolisme oleh bakteri asam laktat menghasilkan asam organic. Produksi asam organik menurunkan pH lingkungan dan menghambat bakteri-bakteri yang
61
tidak dapat mentoleransi pH rendah. Karena bakteri asam laktat lebih tahan asam daripada mikrobiota lain, lingkungan fermentasi didominasi oleh bakteri asam laktat. Pada tahap awal fermentasi mandai, ditemukan isolat-isolat yang berbentuk kokus (Tabel 2.1). Pada fermentasi sayur dan buah, umumnya ditemukan Leuconostoc mesenteroides yang merupakan bakteri asam laktat yang berbentuk kokus, bersifat heterolaktat dan dapat mentoleransi garam. L. mesenteroides umumnya ditemukan berperan pada tahap awal fermentasi, memfermentasi gula menghasilkan asam laktat, asam asetat dan CO2 (Breidt et al. 2013). Karbondioksida yang dihasilkan pada awal fermentasi mendorong dami dan air naik dan keluar dari stoples mandai. Turunnya pH membantu pertumbuhan bakteri asam laktat yang lebih toleran terhadap asam dan garam seperti Pediococcus pentosaceus dan L. plantarum. Oleh karena itulah pada tahap akhir fermentasi mandai, L. plantarum yang merupakan bakteri berbentuk batang, yang lebih banyak diisolasi (Tabel 2.1). Dalam fermentasi garam, L. plantarum dapat berkompetisi dengan bakteri asam laktat lainnya karena diketahui sangat bersifat halotoleran. Oleh karena itu, isolat L. plantarum yang diperoleh selama fermentasi mandai diisolasi dari mandai dengan kadar garam 10% (3 isolat) dan 15% (6 isolat). Dilihat dari waktu fermentasi, sepuluh L. plantarum yang lolos skrining sebagai kandidat probiotik diperoleh pada hari fermentasi keempat (2 isolat), kedelapan (5 isolat) dan kedua belas (3 isolat) (Tabel 5.1). Strain L. plantarum MB427 yang diujikan secara in vivo pada tikus, diisolasi dari fermentasi pada hari keempat dari mandai dengan kadar garam 10%. Pada fermentasi yang melibatkan kadar garam tinggi, spesies Lactobacillus, khususnya L. plantarum ditemukan mendominasi, seperti pada kimchi atau zaitun (Breidt et al. 2013).
Tabel 5.1. Jumlah isolat diduga bakteri asam laktat yang diperoleh dari mandai pada berbagai kadar garam dan hari fermentasi
Kategori isolat
Total isolat Isolat yang lolos skrining ketahanan asam dan empedu Isolat yang lolos skrining antimikroba
Jumlah isolat diduga bakteri asam laktat yang diperoleh dari jenis mandai yang berbeda %Garam Hari fermentasi 5% 10% 15% 4 8 12 16 24 45 26 42 17 2 1
6 3
11 6
6 2
10 5
3 3
Jumlah isolat yang diperoleh dalam isolasi bakteri asam laktat asal mandai ini adalah 85 isolat. Konsentrasi garam berpengaruh pada jumlah dan keragaman bakteri asam laktat yang diisolasi pada fermentasi mandai. Pada mandai dengan kadar garam 5% terdapat bakteri asam laktat dengan jumlah paling besar (Gambar 2.1) akan tetapi
62
keragamannya rendah (Tabel 5.1). Sebaliknya mandai dengan kadar garam 15% mengandung bakteri asam laktat dengan jumlah paling sedikit akan tetapi mempunyai tingkat keragamannya rendah. Terhadap seluruh isolat bakteri asam laktat yang telah diperoleh dalam tahap isolasi, dilakukan evaluasi lebih lanjut guna menskrining karakteristiknya sebagai probiotik. FAO/WHO (2002) telah menggariskan panduan untuk mengevaluasi kandidat probiotik, yaitu resistensi terhadap keasaman lambung, resistensi terhadap garam empedu, aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen, penempelan pada sel epitel manusia atau cell line. Langkah penting dalam memilih kandidat probiotik yang potensial adalah dengan mengevaluasi kemampuannya bertahan dalam kondisi yang meniru kondisi di saluran pencernaan. Pemaparan terhadap kondisi ekstrim di saluran pencernaan dimulai di lambung yang mempunyai pH sangat asam 1.5-2.0 (Zago et al., 2011) dan usus bagian atas yang mempunyai kandungan garam empedu 0.3-0.5%. Dalam penelitian ini dipergunakan pH 2.0 dan garam empedu 0.5% untuk menseleksi isolat asal mandai. Waktu pemaparan terhadap pH 2.0 adalah 3 jam sedangkan pemaparan terhadap garam empedu dilakukan dengan melihat pertumbuhan selama 24 jam (Vinderola dan Reinheimer 2003). Waktu pemaparan tersebut cukup lama untuk meniru kondisi yang sebenarnya di dalam saluran pencernaan manusia. Suasana asam merupakan lingkungan yang sangat berperan penting dalam fermentasi dan pengawetan produk pangan. Umumnya isolat bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi sayur-sayuran mampu mentoleransi pH di bawah 4.0. (Tamang et al 2009). Dalam seleksi ketahanan asam lambung dan garam empedu, strain bakteri asam laktat yang lolos dari seluruh isolat mandai terdiri atas 19 isolat yang dipilih dari isolat-isolat yang hanya mengalami penurunan jumlah bakteri asam laktat maksimal 1 log cfu/ml. Karakteristik lain yang digunakan untuk mengevaluasi isolat bakteri asam laktat asal mandai sebagai kandidat probiotik adalah sifat antimikroba. Pengujian sifat antimikroba dilakukan dengan metode sumur dalam media cair. Berdasarkan Pan et al. (2009), sifat antimikroba dikategorikan sebagai kuat jika zona penghambatan di atas 6 mm. Pengujian sifat antimikroba dilakukan terhadap lima bakteri uji yang merupakan bakteri enteropatogen, yaitu Listeria monocytogenes ATCC 13932, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 10876, Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium ATCC 14028. Salah satu isolat L. plantarum yaitu MC812 mempunyai sifat antimikroba yang kuat terhadap kelima bakteri uji.Isolat MC812 diperoleh dari mandai dengan kadar garam 15% dan hari fermentasi kedelapan. Empat isolat dapat menghambat empat bakteri uji dan lima isolat hanya menghambat tiga bakteri uji. Bakteri patogen yang dihambat oleh semua isolat bakteri asam laktat adalah L. monocytogenes. Berdasarkan sifat antimikroba dipilih 10 isolat unggul yang dikarakterisasi lebih lanjut. Probiotik juga harus memenuhi kriteria aman untuk dikonsumsi manusia. Tidak adanya resistensi terhadap antibiotik termasuk dalam kriteria keamanan yang dipersyaratkan oleh FAO/WHO (2002). Dalam penelitian ini, semua strain L. plantarum yang diujikan resisten terhadap delapan antibiotik dan hanya sensitif
63
terhadap streptomisin. Beberapa sifat resistensi antibiotik yang ditemukan pada bakteri asam laktat ditemukan bersifat intrinsik yang harus dibedakan dengan resistensi yang bersifat dapatan. Resistensi yang bersifat intrinsik tidak dapat dipindahkan secara horizontal antara sesama bakteri lain spesies sehingga resistensi yang bersifat intrinsik tidak melanggar kriteria keamanan. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk melihat keamanan dari tingkat resistensi ini (Mathur dan Singh 2005, Kastner et al. 2006). Identifikasi Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Sepuluh isolat unggul yang diperoleh dalam penelitian ini diidentifikasi sebagai L. plantarum berdasarkan sifat-sifat fermentasi karbohidrat sederhana melalui kit API 50 CHL. Penelitian Vitali et al. (2012) menunjukkan bahwa setelah diseleksi ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu, sebagian isolatnya yang lolos seleksi adalah L.plantarum. Demikian pula yang ditemukan oleh Zago et al. (2011). L. plantarum diketahui merupakan bakteri asam laktat yang mempunyai kapasitas beradaptasi dan berkompetisi yang tinggi di lingkungan yang bervariasi. L. plantarum merupakan spesies homofermentatif dan dapat yang ditemukan dalam berbagai lingkungan yang bervariasi, termasuk tanaman, daging dan produk susu. L. plantarum dilaporkan mempunyai sifat-sifat probiotik seperti menurunkan insiden diare, konstipasi, mengurangi inflamasi, menurunkan kadar kolesterol darah dan dapat melakukan displacment enteropatogen dari sel CaCO-2 (Zhang et al 2014). Kit API 50 CHL mendeteksi mikroba berdasarkan pola fermentasi terhadap 49 jenis karbohidrat dibandingkan dengan kontrol (50 tabung fermentasi). Dari 49 jenis karbohidrat tersebut terdapat karbohidrat yang telah dikenal mempunyai efek sebagai prebiotik, seperti inulin yang menempati posisi no 33 pada kit API 50 CHL. Jika isolat kandidat probiotik asal mandai dapat memfermentasi inulin, terdapat kemungkinan untuk dikembangkan sebagai sinbiotik. Akan tetapi dari 10 isolat yang diidentifikasi dengan kit API 50 CHL tidak satu pun yang ditemukan dapat menfermentasi inulin. Dengan demikian dari 10 isolat tidak terdapat yang bersifat sinbiotik dengan inulin. Identifikasi molekuler pada strain L. plantarum dilakukan dengan qualitative PCR, menggunakan gen yang menyandi 16S rRNA sebagai penanda. Empat dari sepuluh isolat yang teridentifikasi sebagai L. plantarum oleh kit API 50 CHL dikonfirmasi sebagai L. plantarum dengan menggunakan q-PCR. Pada kondisi PCR yang tepat, analisis kurva pelelehan merupakan tool yang tepat untuk identifikasi bakteri berdasarkan spesies pada komunitas bakteri yang kompleks (Herbel et al. 2013). Qualitative-PCR menggunakan senyawa fluoresen SYBR-Green untuk mendeteksi amplifikasi templat DNA. Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan analisis kurva pelelehan yang merupakan fungsi dari kandungan GC, urutan basa dan panjang sekuen. Suhu pelelehan produk PCR bervariasi untuk setiap untai DNA. Dengan kandungan GC yang sama, primer dimer dengan 40 bp akan meleleh pada 12oC lebih rendah daripada produk 1000 bp. Kisaran suhu pelelehan (Tm) dapat bervariasi cukup luas untuk memungkinkan pembedaan produk PCR. Analisis kurva pelelehan dapat membedakan produk dengan panjang yang sama tetapi berbeda
64
urutan basa dan rasio kandungan GC/AT. Demikian juga dua produk dengan panjang sama dan kandungan GC sama tetapi urutannya berbeda juga akan mempunyai kurva pelelehan yang berbeda. Pada penelitian ini, identifikasi tidak dilakukan pada semua isolat yang diisolasi pada tahap awal. Isolasi dilakukan hanya pada isolat yang telah terkarakterisasi dan berpotensi sebagai probiotik. Diduga karena itulah, spesies yang teridentifikasi pada tahap ini hanya L. plantarum. Beberapa spesies lain dapat juga diperoleh, sebab terdapat beberapa isolat yang berbentuk kokus. Akan tetapi identifikasi tidak dilakukan terhadap isolat-isolat lain yang tidak melewati skrining sifat-sifat dasar sebagai probiotik. Penelitian Rahayu (2003) berhasil mengisolasi tidak hanya L. plantarum, tetapi juga P. pentosaceus karena mengidentifikasi semua isolate yang ditemukan. Identifikasi isolat yang telah dilakukan dengan API 50 CHL dan q-PCR telah berhasil mengidentifikasi isolat sampai ke level spesies. FAO/WHO (2002) menggariskan bahwa untuk kandidat probiotik harus diidentifikasi sampai level strain dan didaftarkan di genebank. Identifikasi isolat asal mandai yang diperoleh dalam penelitian ini masih perlu dilakukan sampai level strain karena karakteristik probiotik bersifat spesifik strain. Sifat Aggregasi dan Adhesi Kandidat Probiotik Salah satu sifat yang penting dalam karakterisasi sebagai probiotik adalah antagonisme terhadap patogen usus. Sifat antagonisme telah dikarakterisasi sebelumnya dengan pengujian antimikroba menggunakan metode sumur. Sifat antimikroba ini ditemukan berkorelasi dengan kemampuan koagregasi, bahwa MC812 dan keempat isolat yang menghambat empat bakteri uji (MC802, MC804, MC805, MC807) mempunyai nilai koagregasi di atas 25% terhadap 4 bakteri uji. Koagregasi probiotik dengan patogen akan mempermudah proses eliminasi patogen oleh probiotik, sebab dalam keadaan koagregasi, kontak antara komponen antimikroba dari probiotik dengan pathogen dapat berlangsung lebih efektif. Diduga polisakarida permukaan sel berperan dalam proses koagregasi probiotik dengan patogen (Vidhyasagar dan Jeevaratnam, 2013). Probiotik mempunyai berbagai dampak pada sel inang dan diarahkan untuk pencegahan dan pengobatan terhadap gangguan yang lebih luas. Mode aksi utama probiotik adalah 1) peningkatan barrier epitel, 2) peningkatan adhesi ke mukosa usus dan penghambatan simultan terhadap adhesi patogen, 3) kompetitif eksklusi mikroorganisme patogen, 4) produksi senyawa yang bersifat antimikroba, 5) modulasi sistem imun. Efek probiotik juga menunjukkan berhubungan dengan quorum sensing (Goudarzi et al. 2014). Mekanisme proteksi oleh probiotik terhadap patogen yang terdapat di dalam saluran pencernaan inang juga dapat dilakukan dengan adhesi dan kolonisasi permukaan mukosa usus melalui kompetisi memperebutkan sisi penempelan dan nutrisi. Strain L. plantarum dalam penelitian ini menunjukkan kemampuan adhesi yang tinggi pada sel HCT-116 di atas 50%. Kemampuan proteksi probiotik ditunjukkan juga dengan autoagregasi di atas 50% ditunjukkan oleh 4 strain (MC805,
65
MC807, MB411 dan MB427). Kemampuan autoagregasi berhubungan dengan adhesi dan berperan dalam kolonisasi pada mukosa usus sehingga mencegah adhesi pathogen (Kos et al. 2003). Berdasarkan kemampuan adhesi dan kompetisi dengan L. monocytogenes, EPEC dan S. Typhimurium, strain L. plantarum MB427 terpilih untuk diujikan secara in vivo karena menunjukkan kemampuan adhesi, kompetisi dan eksklusi terbaik terhadap EPEC dibandingkan isolat yang lain. Kemampuan L. plantarum MB427 dalam melakukan adhesi, kompetisi dan eksklusi terhadap EPEC juga lebih baik dibandingkan dengan kemampuannya terhadap patogen yang lain. Skrining kandidat yang dapat melakukan adhesi sangat diperlukan dalam skrining probiotik. Ouwehand dan Salminen (2003) mengungkapkan bahwa strain yang dapat melakukan adhesi akan mengkolonisasi usus lebih mudah. Di dalam usus yang mempunyai laju aliran relatif tinggi, kemampuan adhesi diduga penting untuk mempertahankan eksistensi probiotik di usus. Probiotik dapat beradhesi pada sel epitel, dan dengan demikian menghambat adhesi patogen. Efek antiadhesi dapat menghasilkan kompetisi antara strain probiotik dan patogen dalam memperebutkan reseptor yang sama. Beberapa studi menunjukkan bahwa laktobacilli menghasilkan protein yang memediasi adhesi ke mukus (mucus binding protein) (Goudarzi et al. 2014). Probiotik dapat secara kompetitif menghambat adhesi dan mengeksklusi bakteri patogen berdasarkan beberapa cara, yaitu membuat lingkungan yang tidak sesuai, menghambat secara fisik sisi reseptor yang ada, memproduksi dan mensekresi komponen antimikroba, dan kompetisi untuk memperoleh nutrisi esensial (Alakomi et al. 2000). Hilangnya adhesi karena perlakuan fisik seperti pemanasan dan autoklaf, perlakuan dengan protease dan senyawa kimia tertentu menguatkan dugaan bahwa adhesi sangat ditentukan oleh struktur protein. Interaksi dengan permukaan sel usus yang terlibat dalam adhesi melibatkan interaksi elektrostatik dan hidrofobik antara protein pada permukaan sel bakteri dengan reseptor pada permukaan sel usus. Komponen nonprotein yang penting untuk adhesi adalah asam lipoteikoat, suatu komponen yang terdapat pada permukaan bakteri (Tuomola et al. 2000). Kajian Antidiare Kandidat Probiotik Terpilih Pada Tikus FAO/WHO (2002) mensyaratkan studi pada hewan model perlu dilakukan dalam karakterisasi fungsional setelah karakterisasi in vitro. Pengujian in vivo pada penelitian ini dilakukan menggunakan tikus dengan perlakuan pemberian probiotik sebelum dan setelah dilakukan infeksi EPEC. Perlakuan ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan L. plantarum MB427 dalam mencegah ataupun mengurangi diare yang disebabkan oleh infeksi EPEC. Ketahanan asam dan empedu isolat L. plantarum asal mandai yang diuji secara in vitro dengan menguji ketahanan terhadap pH 2.0 dan garam empedu 0.5% terbukti menghasilkan strain yang mempunyai kemampuan bertahan sampai di usus tikus. Strain L. plantarum MB427 yang diberikan secara oral sejumlah 109 cfu/ml, sedangkan bakteri asam laktat yang ditemukan di feses tikus pada kisaran 9.0-9.5 log cfu/ml untuk kelompok yang menerima L. plantarum MB427, mengindikasikan
66
bahwa L. plantarum MB427 yang diberikan secara oral dapat melewati hambatan pada saluran pencernaan, yaitu berupa pH lambung yang rendah maupun adanya garam empedu. Jumlah bakteri asam laktat yang ditemukan pada feses kelompok tikus yang tidak menerima probiotik hanya 8.4-8.7 log cfu/ml, yang merupakan bakteri asam laktat alami yang terdapat di dalam saluran pencernaan. Dalam penelitian ini, jumlah probiotik yang dapat bertahan sampai ke saluran pencernaan manusia ditentukan dengan menghitung total bakteri asam laktat fases dan isi sekum kemudian dibandingkan dengan kontrol tanpa pemberian probiotik dengan asumsi bahwa peningkatan jumlah total bakteri asam laktat disebabkan oleh pemberian probiotik. Akan tetapi untuk memastikan asumsi tersebut, perlu dilakukan deteksi secara molekuler terhadap populasi bakteri asam laktat pada feses untuk mengetahui jumlah probiotik yang benar-benar mampu sampai ke saluran pencernaan manusia. Deteksi lebih lanjut dapat dilakukan dengan beberapa cara seperti penggunaan penanda fluoresen pada bakteri probiotik atau pengenalan dengan gen yang menyandi 16S rRNA. Penggunaan penanda fluoresen dapat dilakukan dengan metode Fluoresence in situ Hybridization (FISH). Deteksi secara molekuler dapat dilakukan dengan metode quantitative-PCR, yang selain dapat mengenali jenis mikroorganisme, dapat sekaligus mengetahui jumlahnya yang terdapat dalam suatu populasi (Herbel et al. 2013). EPEC merupakan patogen ekstraseluler yang menyebabkan penyakit dengan melakukan penempelan pada permukaan sel inang dengan menggunakan adhesin. Dengan melakukan penempelan, EPEC dapat secara langsung menempelkan protein adhesin sebagai faktor virulensi EPEC ke permukaan sel, berinteraksi dengan sel inang dan menyebabkan penyakit. EPEC menyebabkan diare pada balita di negara berkembang. Selama infeksi, EPEC menyebabkan karakteristik attaching dan effacing, menyebabkan pembentukan lesi. Untuk dapat menempel dan menyebabkan lesi, patogen ini harus berkompetisi dengan flora normal di usus. Kejadian diare menguntungkan EPEC untuk mengubah keseimbangan mikroflora di usus, sementara mikroba lain yang kurang menempel akan tersapu keluar (Vallance dan Finlay 2000). Dari pengujian in vivo dengan tikus diperoleh hasil bahwa kejadian diare pada kelompok tikus yang memperoleh probiotik prainfeksi EPEC berlangsung dalam durasi lebih singkat, tingkat keparahan lebih rendah dan jumlah tikus yang mengalami diare lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok yang menerima probiotik pascainfeksi EPEC ataupun kelompok yang hanya menerima EPEC. Diduga karena L. plantarum MB427 telah lebih dahulu beradhesi dan mengkolonisasi usus sehingga peluang EPEC beradhesi menjadi lebih sedikit. Jumlah bakteri asam laktat ketiga kelompok yang memperoleh probiotik tidak menunjukkan perbedaan akan tetapi jumlah E. coli pada feses tikus kelompok yang memperoleh probiotik prainfeksi menurun lebih cepat hari ketiga setelah infeksi. L. plantarum MB427 mempunyai kemampuan mengeksklusi EPEC sebesar 26%, oleh karena itu walaupun L. plantarum MB427 telah diberikan pada tikus sebelum tikus diinfeksi EPEC akan tetapi diare tetap terjadi meskipun jumlah kejadian dan tingkat keparahannya lebih rendah dibandingkan dengan kelompok yang menerima probiotik pascainfeksi EPEC. Kemampuan displacement L. plantarum
67
MB427 adalah sebesar 34%. Pemberiannya pascainfeksi EPEC dapat membantu mengurangi kejadian dan tingkat keparahan diare karena EPEC. L. plantarum MB427 yang diujikan in vivo tidak teramati melakukan translokasi ke hati dan limfa. Pengujian translokasi juga merupakan bagian dari pemenuhan kriteria aman probiotik untuk dikonsumsi manusia. Translokasi dapat terjadi jika terdapat kerusakan pada barrier usus. Barrier usus pada individu sehat terdiri atas lapisan mukus, peptida antimikroba, IgA yang disekresikan dan sel epitel yang membentuk tight junction. Rusaknya fungsi barrier usus dapat menyebabkan terjadinya infeksi enterik. Konsumsi probiotik dapat berkontribusi pada peningkatan fungsi barrier usus (Goudarzi et al. 2014). Kemampuan L. plantarum MB427 meningkatkan level IgA dan IgG serum pada kelompok tikus yang memperoleh probiotik prainfeksi EPEC menunjukkan respon imun yang lebih cepat dan dapat menjelaskan hasil pengamatan kejadian diare yang lebih singkat dengan tingkat keparahan lebih rendah. Hasil ini mengindikasikan kemampuan L. plantarum MB427 dalam mencegah dan mengurangi durasi serta keparahan diare yang disebabkan oleh EPEC. Dari hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa sesuai hipotesis, bshws strain L. plantarum MB427 asal mandai telah terbukti secara in vivo memiliki sifat fungsional khusus, yaitu dapat mencegah dan mengurangi durasi serta keparahan diare. Strain-strain lain yang juga telah diuji penempelan dan kompetisinya dengan patogen perlu diteliti lebih lanjut kemampuannya secara in vivo, baik terhadap EPEC maupun terhadap patogen lain seperti S. Typhimurium.
Daftar Pustaka Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, Mattila- Sandholm T, Latva-Kala K, Helander IM. 2000. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane. Appl Environ Microbiol 66: 2001–2005. Argyri, A.A., Zoumpopoulou, G., Karatzas, K.G. Tsakalidou, E., Nychas, G.E., Panagou, E.Z., dan Tassou, C.C. 2013. Selection of potential probiotic lactic acid bacteria from fermented olives by in vitro tests. Food Microbiology 33:282-291 Astawan M, Wresdiyati T, Arief II, Suhestia E. 2011. Gambaran hematologi tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinfeksi Escherichia coli enteropatogenik dan diberikan probiotik. J Anim Sci Technol 34:7-13. [FAO/WHO].2002. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Ontario, Canada Gagnon, M., E.E. Kheadr, N.Dabour, D. Richard, I.Fliss. 2006. Effect of Bifidobacterium thermacidofilum probiotic feeding on enterohemorrhagic
68
Escherichia coli O157:H7 infection in BALB/c mice. Int J Food Microbiol, 111:26-33 Goudarzi M., Goudarzi H., Rashidan M. 2014. Probiotics: an update on mechanisms of action and clinical applications. Novelty in Biomedicine 2: 22-30 Herbel S.R., Vahjen W., Wieler L.H., Guenther S. 2013. Timely approaches to identify probiotic species of the genus Lactobacillus. Gut Pathogens 5:27 Kos, B., J. Suskovic, S. Vukovic, M. Simpraga, J. Frece and S. Matosic. 2003. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J. Appl. Microbiol. 94: 981-987 Lee H., Yoon H., Ji Y., Kim H., Park H., Lee J., Shin H., Holzapfel W. 2011. Functional properties of Lactobacillus strains isolated from kimchi. Int J Food Microbiol 145: 155-161 Nuraida L., Susanti, Palupi, N.S., Hana, Bastomi R.R., Piriscilia D., Nurjanah S. 2012. Evaluation of probiotics properties of lactic acid bacteria isolated from brast milk and their potency as starter culture for yoghurt fermentation. Int J Food Nutrition and Public Health. 5, 1/2/3 Pan, X., F. Chen, T. Wua, H. Tang, Z. Zhao. 2009. The acid, bile tolerance and antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus NIT. Food Control20: 598–602 Soliman RH dan Othman AA.2009.Evaluation of DNA Melting Curve Analysis RealTime PCR for Detection and Differentiation of Cryptosporidium Species.Parasitologists United Journal2(1): 47 - 54 Tamang, J.P., Tamang B., Schillinger U., Guigas C., Holzapfel W. H. 2009. Functional properties of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented vegetables of the Himalayas. Int J Food Microbiol 135: 26-33 Tuomola E.M., Ouwehand A.C., Salminen S.J. 2000. Chemical, physical, and enzymatic pre-treatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoproteins. International Journal of Food Microbiology 98: 211-217 Vallance B.A dan B. B. Finlay. 2000. Exploitation of host cells by nteropathogenic Escherichia coli. PNAS 97: 8799 – 880 Vidhyasagar, V., dan Jeevaratnam, K.(2013). Evaluation of Pediococcus pentosaceus strains isolated from Idly batter for probiotic properties in vitro.Journal of Functional Food5:235 –243
69
Wang, B., J.Li, Q.Li, H.Zhang, N.Li. 2009. Isolation of adhesive strains and evaluation of the colonization and immune response by Lactobacillus plantarum L2 in the rat gastrointestinal tract. Int J Food Microbiol. 132: 5966 Zago,
M., M.E. Fornasari, D.Carminati, P.Burns, V.Suarez, G.Vinderola, J.Reinheimer, G.Giraffa. 2011. Characterization and probiotic potential of Lactobacillus plantarum strains isolated from cheeses. Food Microbiol 28: 1033-1040
Zhang J., Zhang X., Zhang L., Zhao Y., Niu C., Yang Z., Li S. 2014. Potential characterization of Lactobacillus plantarum strains isolated from inner Mongolia “Hurood” Cheese. Journal microbiology Biotechnology 24 (2) Zonenschain D, Rebecchi A, Morelli L. 2009. Erythromycin- and tetracyclineresistant lactobacilli in Italian fermented dry sausages. J Appl Microbiol. 107(5):1559-68. doi: 10.1111/j.1365-2672.2009.04338.x.
