ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI FESES BAYI DAN EVALUASI IN VITRO POTENSI PROBIOTIK
1. Widodo, S.P., M.Sc., Ph.D. 2. Prof. drh. Widya Asmara, S.U., Ph.D. 3. Tiyas Tono Taufiq, S.Pt, M.Biotech
Latar Belakang Penelitian ManfaatDidominasi bagi kesehatan produk probiotik Pangan fungsional
Pengetahuan konsumen JaminanMemanfaatkan keamanan pangan kultur probiotik
1. Bakteri Peningkatan kesehatan saluran pencernaan. hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah cukup 2. Menurunkan gejala lactose intolerance. dapat memberikan pengaruh kesehatan bagi inangnya 3. Menurunkan aktivitas bakteri yang bersifat merugikan. 4. Merangsang sistem kekebalan saluran pencernaan.
Mikrobiota saluran pencernaan
Bakteri asam laktat (BAL) Bakteri non patogen dan termasuk ke dalam kelompok bakteri yang memiliki status Generally Recognized as Safe (GRAS) (1) Menurut produk akhir metabolisme dapat dibagi menjadi dua kategori umum: homofermentatif dan heterofermentatif (2) Menghasilkan sejumlah faktor antibakteri: asam organik, hidrogen peroksida, CO2 dan bakteriosin (3)
Probiotik Bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah cukup dapat memberikan pengaruh kesehatan pada inang (4) Terutama berasal dari genus Lactobacillus dan Bifidobacterium. Prasyarat bakteri probiotik (5): resisten terhadap pH yang rendah toleran terhadap asam empedu mampu menempel pada sel mukosa pencernaan dapat memberikan bukti klinis manfaatnya dapat memfermentasi oligosakarida
saluran
Tujuan Penelitian 1. Mengisolasi BAL dari feses bayi. 2. Mengidentifikasi isolat BAL yang memiliki potensi sebagai probiotik in vitro. 3. Mengetahui kemampuan isolat dalam memanfaatkan prebiotik inulin sebagai sumber karbon.
Hipotesis • Bakteri asam laktat dapat diisolasi dari feses bayi yang mengkonsumsi ASI eksklusif. • Bakteri asam laktat yang diisolasi dari feses bayi yang mengkonsumsi ASI eksklusif memiliki potensi sebagai probiotik dan mampu memanfaatkan prebiotik sebagai sumber karbon.
Flow Chart Isolasi Identifikasi fenotip Identifikasi genotip Uji potensi probiotik
Pengambilan sampel
Inokulasi Pengecatan Gram Inkubasi Uji pembentukan CO2 dari glukosa Pemurnian dan seleksi Ekstraksi DNA Uji pertumbuhan Pembuatan kultur Amplifikasi gen 16Sstok rRNA Uji katalase,terhadap Ketahanan motilitas,pH spora 2,0 Elektroforesis dan visualisasi Ketahanan terhadap garam empedu Sekuensing (Metode dideoksi) Aktivitas penghambatan patogen Kemampuan penempelan Pertumbuhan pada prebiotik inulin
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi fenotip Kode Isolat
Gram
Bentuk
1
1AA 1AA
+
2
1AB
3
Pertumbuhan
10ºC
45ºC
Batang
CO2 dari glukosa -
+
-
-
+
Batang
+
+
+
-
1AC
+
Batang
-
+
+
-
4
1AD
+
Kokus
-
+
-
-
5
1AE
+
Batang
-
+
-
-
6
1AF 1AF
+
Batang
-
+
-
-
7
1AG
+
Batang
-
-
+
-
8
1AH
+
Batang
+
+
+
-
9
1AI
+
Batang
-
-
-
-
10
1AK
+
Batang
+
+
-
-
11
1AL 1AL
+
Batang
-
-
-
-
12
1AN
+
Batang
-
+
+
-
13
1BE
+
Kokus
-
+
-
-
14
1BH
+
Kokus
-
+
-
-
15
1BK
+
Kokus
-
+
-
-
16
1BL
+
Kokus
-
-
+
-
17
1A7 1B71
+
Kokus
-
-
-
-
No.
Katalase Motilitas
-
Spora -
-
-
Amplifikasi M
1B7
1AF
1AL 1AA
Gambar 4. Visualisasi hasil PCR pada marker 100 bp
Identifikasi genotip • Sekuen parsial gen16S rRNA isolat 1AF:
Gambar 5. Sekuens isolat IAF
Pohon filogeni Lactobacillus casei strain 41-189 Lactococcus lactis Lactobacillus paracasei subsp. paracasei strain 28-140 Lactobacillus casei strain Lc18 Lactobacillus casei strain: Shirota Lactobacillus casei strain KH-1 Isolat 1AF 1st Base Lactobacillus casei strain: YIT 0209 ( NCDO 151) Lactobacillus casei strain 29-147 Lactobacillus casei strain ZJ3 Lactobacillus casei strain J026 Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain: JCM 1002 Bifidobacterium bifidum DSM 20456
0.02
Gambar 6. Dendogram neighbour joining isolat 1AF
Ketahanan terhadap pH rendah Tabel 1. Viabilitas isolat L.casei 1AF terhadap inkubasi pH 2,0 Waktu (menit)
Jumlah (Log10 cfu/ml)
0
8,67 ± 0,06a
30
7,16 ± 0,10b
60
6,28 ± 0,17c
90
5,24 ± 0,15d
Terjadi penurunan signifikan hingga 3 log10 setelah inkubasi pada pH 2,0 selama 90 menit.
Ketahanan terhadap pH rendah Tabel 2. Viabilitas isolat L.casei 1AF terhadap terhadap gradien pH 2–8
pH
Jumlah (Log10 cfu/ml)
2,0
4,82 ± 0,42
3,0
5,18 ± 0,02
4,0
6,29 ± 0,29
5,0
7,53 ± 0,22
6,0
8,37 ± 0,05
6,2
8,50 ± 0,07
7,0
8,32 ± 0,18
8,0
6,31 ± 0,28
Ketahanan terhadap garam empedu Tabel 3. Viabilitas isolat L.casei 1AF terhadap 0,5% ox bile Perlakuan
Jumlah (Log10 cfu/ml)
MRS normal
8,50 ± 0,07
MRS + ox bile
6,74 ± 0,04
Terjadi penurunan sekitar 2 log10 setelah inkubasi pada media dengan 0,5% ox bile.
Kemampuan penghambatan terhadap patogen Tabel 4. Kemampuan L.casei 1AF dalam penghambatan patogen Perlakuan Escherichia coli Bacillus cereus
Diameter zona hambat (mm) 12,00 ± 1,00 15,33 ± 1,53
Isolat L. casei 1AF memiliki kemampuan penghambatan terhadap bakteri patogen. Penghambatan terhadap patogen terjadi karena penurunan pH akibat metabolisme heksosa oleh isolat L. casei 1AF.
Kemampuan penempelan bakteri Tabel 5. Penempelan pada permukaan padat Isolat L. Casei 1AF
Jumlah (koloni/ml) 9.367 ± 1.721,43
Isolat L. casei 1AF mampu membentuk biofilm pada permukaan padat.
Pertumbuhan pada glukosa, sukrosa, dan laktosa 1.600 1.400
1.000 MRS
0.800
Glukosa
0.600
Laktosa Sukrosa
0.400
0.200 0.000 0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 15.00 16.50 18.00 19.50 21.00 22.50 24.00 25.50 27.00 28.50 30.00
Absorbansi
1.200
Waktu (jam)
0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 15.00 16.50 18.00 19.50 21.00 22.50 24.00 25.50 27.00 28.50 30.00
Absorbansi
Pertumbuhan pada inulin
1.200
1.000
0.800
0.600 Glukosa
0.400 Inulin
0.200
0.000
Waktu (jam)
Inulin sebagai sumber karbon Inulin dapat dihidrolisis oleh L. casei 1AF. Laju pertumbuhan isolat pada inulin rendah dibandingkan dengan glukosa sebagai sumber karbon. Hidrolisis inulin oleh probiotik telah diteliti oleh Rossi et al. (6) yang menyebutkan peranan enzim β-fruktofuranosidase ekstraseluler.
Kesimpulan Isolat Lactobacillus casei 1AF memiliki potensi in vitro sebagai probiotik. Isolat tersebut mampu memanfaatkan inulin sebagai satu-satunya sumber karbon. Enzim spesifik yang berperan dalam hidrolisis inulin oleh genus Lactobacillus belum karakterisasi secara lengkap.
Saran Perlu dilakukan analisis lanjutan potensi isolat sebagai probiotik untuk mencapai status GRAS. Sumber alternatif inulin dapat dicobakan misalnya inulin dari umbi Dahlia. Isolat yang disimpan dapat dimanfaatkan untuk analisis aspek fungsional lain, misalnya produksi conjugated linoleic acid.
