ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI ORGAN SALURAN PENCERNAAN AYAM SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA ISOLATION AND IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA FROM CHICKEN GASTROINTESTINAL TRACT AS ANTIMICROBIAL COMPOUNDS PRODUCER SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi sebagian dari syarat-syarat guna memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pangan Oleh: ARYA WIDINATHA 06.70.0058
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATA SEMARANG 2013 i
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI ORGAN SALURAN PENCERNAAN AYAM SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROBA ISOLATION AND IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA FROM CHICKEN GASTROINTESTINAL TRACT AS ANTIMICROBIAL COMPOUNDS PRODUCER Oleh: ARYA WIDINATHA NIM: 06.70.0058 Program Studi: Teknologi Pangan Skripsi ini telah disetujui dan dipertahankan di hadapan sidang penguji pada tanggal: 29 Juli 2013
Semarang, 29 Juli 2013
Pembimbing I
Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Katolik Soegijapranata Dekan
Ir. Lindayani, MP, PhD.
Ita Sulistyawati, STP, MSc.
Pembimbing II
Dra. Laksmi Hartayanie, MP.
ii
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Organ Saluran Pencernaan Ayam sebagai Penghasil Senyawa Antimikroba” ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari ternyata terbukti bahwa skripsi ini sebagian atau seluruhnya merupakan hasil plagiasi, maka saya rela untuk dibatalkan, dengan segala akibat hukumnya sesuai peraturan yang berlaku pada Universitas Katolik Soegijapranata dan/atau peraturan perundang-undangan yang berlaku
Semarang, Juli 2013
(Arya Widinatha) NIM: 06.70.0058
iii
RINGKASAN Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam industry pangan mampu diaplikasikan sebagai biopreservatif karena kemampuannya menghasilkan senyawa yang bersifat antagonis terhadap mikroba lain, misalnya: bakteriosin, hidrogen peroksida, dan diasetil. Beberapa studi telah dilaporkan bahwa BAL memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri enteropatogenik, misalnya Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella sp. Salah satu habitat bakteri asam laktat terdapat didalam organ saluran pencernaan hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri asam laktat dari organ saluran pencernaan ayam yang mempunyai aktivitas antimicrobial terhadap bakteri pathogen, khususnya Staphylococcus aureus dan Eschericia coli. Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi isolasi BAL; tahap pemurnian dan pembuatan stok BAL; identifikasi BAL, pengujian antimikrobial menggunakan metode difusi sumuran (well diffusion). Dari seluruh proses tersebut didapatkan 19 isolat BAL, yang terdiri dari genus Lactobacillus sebanyak 3 isolat, genus Aerococcus 2 isolat dan genus Enterococcus 14 isolat. Dalam pengujian antimikrobial, seluruh isolat mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Isolat 411 memiliki kemampuan penghambatan paling baik terhadap S. aureus (zona bening = 24,70mm) dan E. coli (zona bening = 15,50mm). Berdasarkan uji menggunakan instrument API 20 STREP diketahui bahwa isolat 411 adalah Aerococcus viridans I
iv
SUMMARY
Lactic Acid Bacteria (LAB) in food industry have an important role for food preservation because of the ability of some strains to produce antimicrobial compounds, including organic acids, hydrogen peroxide and bacteriocins. A number of studies have reported that the LAB has antagonistic properties by inhibit the growth of enteric pathogensi.e. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella sp. Lacticacid bacteria are commonly found in the gastrointestinal tract of various endothermic animals andhumans. The aim of this researchwas to isolate and to characterize lactic acid bacteria from small intestine of chickensthat have antimicrobial activity against entericpathogenic i.e. Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Four steps in this research were LAB isolation, purification, characterization and antimicrobial activity testing using diffusion method. Nineteen strains were isolated and identified as lactic acid bacteria based on their morphology and biochemical characteristics. All isolates were Gram-positive, non-sporulating, nonmotile, catalase negative, did not produce gas and classified as Lactobacillus (3 isolates), Aerococcus (2 isolates) and Enterococcus (14 isolates). In antimicrobial testing, all isolates produced antimicrobial compounds which were active against pathogenic bacteria, indicated by the formation of clear zones around the well (9-15 mm diameter zones). Isolate number of 411 had the highest inhibitory zone, which produced more than 15 mm clear zone. Based on API 20 STREP assay, isolate number of 411 known as Aerococcus viridians I.
v
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat-Nya, penulis berhasil menyelesaikan skripsi dengan judul “Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Organ Saluran Pencernaan Ayam sebagai Penghasil Senyawa Antimikroba”.
Skripsi ini dapat selesai atas adanya bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1.
Ita Sulistyawati, STP., MSc. selaku Dekan FTP Unika Soegijapranata.
2.
Ir. Lindayani, MP., PhD. dan Dra. Laksmi Hartayanie, MP. sebagai pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu dalam membimbing, member saran, kesempatan, dan semangat dari awal hingga akhir penulisan skripsi ini.
3.
Papa Abuk Agus Widjaja, Mama Ina Kristiani, Aditya Widinatha, dan Wisnu Widinatha, yang selalu memberikan dukungan, perhatian, doa, dan cinta.
4.
Seluruh staf pengajar FTP Unika Soegijapranata yang telah mendidik dan mengajar penulis selama ini.
5.
Mbak Endah, Mas Soleh, dan Mas Pri yang telah mendampingi dan memberikan informasi yang berguna selama berlangsungnya penelitian di laboratorium.
6.
Seluruh tenaga kependidian FTP Unika Soegijapranata yang telah banyak membantu dalam urusan administrasi hingga terselesaikannya skripsi ini.
7.
Adhiprana Waraputra yang telah setia menemani dalam suka dan duka selama proses penelitian dan penyusunan skripsi.
8.
Seluruh teman-teman FTP Unika Soegijapranata angkatan 2004 s.d. 2012 yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.
Semoga laporan skripsi ini dapat bermanfaat dan member informasi bagi semua pihak yang membutuhkan dan saran bagi penelitian selanjutnya.
Semarang, Juli 2013
Penulis
vi
DAFTAR ISI Halaman iv v vi vii ix x xii
RINGKASAN SUMMARY KATA PENGANTAR DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN BAB 1. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang 1.2. Tinjauan Pustaka 1.2.1. Bakteri Asam Laktat (BAL) 1.2.1.1. Genus Lactobacillus 1.2.1.2. Genus Pediococcus 1.2.1.3. Genus Leuconostoc 1.2.1.4. Genus Steptococcus 1.2.2. Isolasi, Karakterisasi, dan Penentuan Aktivitas Antimikroba 1.2.3. Peranan Bakteri Asam Laktat 1.2.4. Organ Pencernaan Ayam 1.3. Tujuan
1 1 2 2 5 6 6 7 7 8 10 11
BAB 2. MATERI DAN METODE 2.1. Materi 2.1.1. Alat 2.1.2. Bahan 2.2. Proses Penelitian 2.3. Metode 2.3.1. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Organ Saluran Pencernaan Ayam 2.3.2. Pembuatan Kultur Stok dan Kultur Kerja 2.3.3. Konfirmasi Isolat Bakteri Asam Laktat 2.3.3.1. Uji Katalase 2.3.3.2. Pengamatan Morfologi 2.3.3.2.1. Pengecatan Gram (Pengecatan Hucker) 2.3.3.2.2. Pengamatan Bentuk Sel dan Bentuk Koloni 2.3.3.3. Pengecatan Spora (Pengecatan Bartholomew & Mittew) 2.3.3.4. Uji Motilitas 2.3.3.5. Uji Pembentukan Gas 2.3.3.6. Kemampuan Pertumbuhan Bakteri pada Berbagai Kondisi Lingkungan (suhu, pH, dan NaCl) 2.3.3.6.1. Pertumbuhan Bakteri pada Suhu 10 oC, 45oC, dan 50 oC 2.3.3.6.2. Pertumbuhan Bakteri pada pH 4,4 dan 9,6
12 12 12 12 12 14 14 14 15 15 15 15 16 16 16 17
vii
17 17 17
viii
2.3.3.6.3. Pertumbuhan Bakteri pada Kadar NaCl 6,5% dan 18% 2.3.4. Pengujian Senyawa Antimikroba (metode difusi sumur) 2.3.5. Identifikasi Bakteri Asam Laktat menggunakan API 20 STREP test kit BAB 3. HASIL PENELITIAN 3.1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Organ Saluran Pencernaan Ayam 3.2. Aktivitas Antimikroba 3.3. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Menggunakan API 20 STREP test kit
17 18 18 19 19 24 26
BAB 4. PEMBAHASAN 4.1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Organ Saluran Pencernaan Ayam 4.2. Aktivitas Antimikroba dari Bakteri Asam Laktat 4.3. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Menggunakan API 20 STREP test kit
27 30 32
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan 5.2.Saran
33 33 33
BAB 6. DAFTAR PUSTAKA
34
BAB 7. LAMPIRAN
38
viii
27
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Tabel uji konfirmasi Bakteri Asam Laktat
Halaman 15
Tabel 2. Hasil uji karakteristik Bakteri Asam Laktat
23
Tabel 3. Hasil pengukuran zona hambat dari isolat bakteri asam laktat terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
25
Tabel 4. Hasil absorbansi pertumbuhan bakteri asam laktat pada berbagai kondisi lingkungan (suhu, pH, dan NaCl) pada panjang gelombang 700nm
40
ix
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Proses biokimia pembentukan asam laktat pada bakteri homofermentatif
3
Gambar 2. Proses biokimia pembentukan asam laktat pada bakteri heterofermentatif
4
Gambar 3. Diagram Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat
5
Gambar 4. Organ saluran pencernaan ayam
11
Gambar 5. Diagram alir proses penelitian
13
Gambar 6. Koloni bakteri yang menghasilkan zona bening pada media MRS agar + 1% CaCO3 (tanda panah) (a) dan koloni yang tidak menghasilkan zona bening (b)
19
Gambar 7. Hasil uji katalase negatif (tidak membentuk gelembung) pada isolat 412
20
Gambar 8. Hasil uji identifikasi bakteri asam laktat berdasarkan jenis gram dan morfologi bakteri isolat 522 (cocci) (a) dan isolat 412 (bacill) (b). Kedua isolat merupakan bakteri gram positif. Pengamatan dengan mikroskop trinokuler Olympus BX41 dengan kamera Olympus DP20, perbesaran 10 x 100.
20
Gambar 9. Hasil uji identifikasi bakteri asam laktat berdasarkan pembentukan spora isolat 522 (cocci) (a) dan isolat 412 (bacill) (b). Kedua isolat tidak menghasilkan spora. Pengamatan dengan mikroskop trinokuler Olympus BX41 dengan kamera Olympus DP20, perbesaran 10 x 100.
21
Gambar 10. Hasil uji identifikasi bakteri asam laktat terhadap isolat 522 dan 412 berdasarkan pembentukan gas (tanda panah) (a) dan motilitas (lihat panah) (b).
21
Gambar 11. Hasil uji pertumbuhan isolat bakteri asam laktat pada berbagai kondisi lingkungan. Isolat BAL mampu tumbuh pada suhu 10oC (a-i) dan 45oC (a-ii) tetapi tidak pada 50oC (a-iii); beberapa isolat tumbuh pada pH 4,4 (b-i) sedangkan isolat lainnya tumbuh pada pH 9,6 (b-ii); tumbuh pada 6,5% NaCl (c-i) tetapi tidak pada 18% NaCl (c-ii). Pertumbuhan isolat ditandai dengan munculnya kekeruhan.
22
Gambar 12. Aktivitas antimikroba isolat Bakteri Asam Laktat terhadap bakteri Escherichia coli (kuning) dan Staphylococcus aureus (ungu)
25
x
xi Gambar 13. Hasil aktivitas antimikroba paling tinggi oleh isolat 411 terhadap Escherichia coli yaitu 15,50 mm (a) dan terhadap Staphylococcus aureus yaitu 24,17 mm (b), yang ditandai dengan tampaknya zona bening (panah kuning) disekitar lubang sumuran (panah merah)
xi
27
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Komposisi Media MRS mercks (Agar dan Broth)
Halaman 38
Lampiran 2. Komposisi Media Nutrient Agar (NA)
38
Lampiran 3. Komposisi Larutan Standar McFarland 0.5 dan McFarland 3
38
Lampiran 4. Hasil Pengujian Isolat 411 menggunakan instrument API 20 STREP test kit
39
Lampiran 5. Kemampuran Bakteri Asam Laktat Tumbuh pada Berbagai Kondisi Lingkungan
40
xii
