ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT INDIGENOUS DARI KECAP IKAN LEMURU ( Sardinella longiceps ) SELAMA FERMENTASI
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana
I WAYAN SUDIARTA NIM. 0890861001
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2011
ii
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL : 13 Juli 2011
Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Ir. I W. Redi Aryanta, M.Sc., Ph.D. NIP. 19431011 196902 1 001
Ir. Agus Selamet Duniaji., M.Si NIP. 19570816 198503 1 002
Mengetahui
Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana
Dr.G.N. Alit Susanta W.,S.P., M.Agr. NIP. 19680115 199403 1 001
Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana
Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) NIP. 19590215 198510 2 001
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS
Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 11 Juli 2011
Panitia Penguji Tesis , berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana Nomor : 1171/UN14.4/HK/2011 Tanggal 27 Juni 2011
Ketua
: Prof. Ir. I Wayan Redi Aryanta, M.Sc., Ph.D
Anggota
:
1. Ir. Agus Selamet Duniaji, M.Si. 2. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, MS. 3. Prof. Dr. I Made Dira swantara, M.Si.. 4. Prof. Ir. Nyoman Semadi Antara, MP., Ph.D.
iv
UCAPAN TERIMA KASIH
Pertama-tama
perkenankanlah
penulis
memanjatkan
puji
syukur
kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa, karena atas asung wara nugraha-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul ” Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Indigenous Dari Kecap Ikan Lemuru (Sardinella longiceps) Selama Fermentasi” , tepat pada waktunya. Dalam penyusunan tesis ini, penulis telah menerima banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, untuk itu pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Bapak Prof. Ir. I Wayan Redi Aryanta, M.Sc., Ph.D, dan Bapak Ir. Agus Selamet Duniaji, M.Si selaku Pembimbing I dan Pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan selama perencanaan dan pelaksanaan penelitian serta penyusunan tesis ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Bapak Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I Made Bakta, Sp. PD(K), Ibu Direktur Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) dan Bapak Dr. G.N. Alit Susanta W. SP., M.Agr., selaku Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana. Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Bapak Drs. Yan Ramona, M.App.Sc, Ph.D. selaku Plt. Kepala UPT. Lab. Biosain dan Bioteknologi, Universitas Udayana, Bapak Prof. Dr. Ir. I Ketut Suter, MS. Kepala Laboratorium Analisis Pangan Fakultas Teknologi Pertanian
Universitas
Udayana yang telah memberikan ijin penggunaan fasilitas laboratorium selama penelitian
berlangsung. Ucapan terima kasih juga Penulis sampaikan kepada
Bapak Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D, Ibu Ni Wayan Nursini, S.Tp., MP, Ibu Ni Putu Desy Aryantini, S.KM. dan seluruh staf UPT. Lab. Biosain dan Bioteknologi yang telah banyak membantu selama melakukan penelitian dan penyusunan tesis ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Pemerintah Republik Indonesia c.q, Menteri Pendidikan Nasional yang telah memberikan bantuan finansial dalam bentuk BPPS sehingga meringankan beban Penulis dalam v
menyelesaikan studi ini. Ucapan terimakasih penulis sampaikan pula kepada para penguji tesis yaitu Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, MS., Prof. Dr. I Made Dira Swantara, M.Si dan Prof. Ir. Nyoman Semadi Antara, MP., Ph.D., yang telah memberikan saran, sanggahan dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Istri tercinta Ni Nyoman Suarni, SH dan anak-anak, Ni Luh Gede Nita Sintiadewi dan I Made Ari Mahaputra yang selalu memberikan doa dan dukungan semangat kepada penulis selama menyelesaikan pendidikan ini, Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyusunan tesis ini. Penulis berharap semoga tesis ini dapat memberikan sumbangan bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan Teknologi.
Denpasar, Juli 2011
Penulis
vi
ABSTRAK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT INDIGENOUS DARI KECAP IKAN LEMURU (Sardinella longiceps) SELAMA FERMENTASI Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui spesies bakteri asam laktat (BAL) indigenous yang berperan selama fermentasi, untuk memperoleh isolat yang potensial untuk dikembangkan sebagai kandidat kultur starter, mempelajari dinamika suksesi pertumbuhan BAL indigenous serta untuk mengetahui perubahan mikrobiologis dan biokimiawi yang terjadi selama fermentasi kecap ikan lemuru. Dalam penelitian ini, analisis dilakukan terhadap kecap ikan lemuru yang dibuat dengan kadar garam 20 % dan difermentasi selama 3 bulan dan analisis dilakukan setiap bulan dengan parameter yang diamati meliputi total BAL, total kapang, total khamir, total asam, pH dan kadar protein terlarut. Bakteri asam laktat ditumbuhkan pada medium De Man Rogosa Sharpe (MRS) yang selanjutnya diisolasi dan dikarakterisasi dengan menggunakan metode standar antara lain uji morfologi sel, pewarnaan gram, uji motilasi, uji katalase, uji produksi gas dari glukosa, produksi asam dan uji pertumbuhan pada suhu, pH dan konsentrasi garam yang berbeda. Untuk mengidentifikasi spesies BAL digunakan perangkat kit API 50 CH dan API 50 CHL medium versi 5.1 yang dilanjutkan dengan analisis data dengan menggunakan software APIWEB. Selama fermentasi kecap ikan lemuru berhasil diisolasi sebanyak 52 isolat BAL indigenous yang terdistribusi kedalam enam kelompok berdasarkan perbedaan pertumbuhan pada suhu, pH dan konsentrasi garam yang berbeda. Dengan perangkat kit berhasil diidentifikasi dua spesies BAL yaitu Tetragenococcus halophilus dengan empat strain : T. halophilus KI03, T. halophilus KI29, T. halophilus KI13, T. halophilus KI31 dan Aerococcus viridans dengan dua strain : A. viridans KI11 dan A. viridans KI18. Semua strain BAL tersebut selama fermentasi telah menunjukkan dinamika suksesi pertumbuhan BAL indigenous. Perubahan mikrobiologis dan biokimiawi terjadi selama fermentasi kecap ikan lemuru. Total BAL dan total khamir meningkat tajam setelah kecap ikan lemuru difermentasi selama 1 bulan, kemudian populasinya menurun dengan semakin lamanya fermentasi. Nilai total asam dan kadar protein terlarut meningkat, sedangkan pH mengalami penurunan. Tetragenococcus halophilus merupakan spesies BAL homofermentatif yang tetap tumbuh selama fermentasi kecap ikan lemuru dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai kandidat kultur starter kecap ikan. Namun demikian, perlu dilakukan uji potensi dan uji produksi serta kajian lebih mendalam dari isolat tersebut pada tingkat molekuler melalui analisis DNA untuk lebih meyakinkan filogenetiknya.
Kata kunci : BAL indigenous, isolasi, identifikasi, kecap ikan lemuru, suksesi
vii
ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF INDIGENOUS LACTIC ACID BACTERIA FROM SARDINES (Sardinella longiceps) SAUCE DURING FERMENTATION
This research was performed to know the indigenous LAB (lactic acid bacteria) which played a role during fermentation, to gain potential isolates to be developed as a starter of culture candidate, to study the indigenous LAB growth succession dynamic and to know the microbiological and biochemical changed happening during the sardines sauce fermentation. In this research, the analysis was done on sardines sauce fermentation that was made with 20 % salt concentration and fermented for 3 months and the analysis was run each month with the parameter observation covered the total of LAB, yeast, mold, the total value of acid, pH and protein concentration soluble respectively. Lactic acid bacteria was grown on De Man Rogosa Sharpe (MRS) media and then were isolated and characterized by using a standard method, among others are: cell morphologic examining, Gram coloring, motility examining, catalase examining, gases production examining from glucose, acid production and growth examining on temperature, pH and salt concentration differ. To identify the LAB species, were used API 50 CH and API 50 CHL tool kits media 5,1 version and which be continued with data analysis by APIWEB software usage. During the sardines sauce fermentation, succeeded to isolate in amount of 52 indigenous LAB isolates which distributed within six clusters based on the difference of growth on temperature, pH and salt concentration differ. With the tool kit succeeded to identify two LAB species, namely Tetragenococcus halophilus with four strains: T. halophilus KI03, T. halophilus KI29, T. halophilus KI13, T. halophilus KI31 and Aerococcus viridans with two strains: A. viridans KI11 and A. viridans KI18. All those LAB strains, during fermentation indicated the dynamic of indigenous LAB growth succession. Microbiological and biochemical changed occured during the sardines sauce fermentation. LAB and yeast total increased significantly after one month fermented, then the population decreased for more fermentation time as well. The total value of acid and protein concentration soluble increased, while the pH decreased absolutly. Tetragenococcus halophilus is a homofermentative LAB spesies which still grow during fermentation of sardines sauce and have a potency to be developed as a candidate for fishes sauce starter culture. Nevertheles, it is needed to be run a potential test and deeper study from those isolates on the molecular rank through DNA analysis for more convince of their phylogenetic.
Key words: Indigenous LAB, isolation, identification, sardines sauce, succession
viii
RINGKASAN
I Wayan Sudiarta, NIM. 0890861001. ”Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Indigenous dari Kecap Ikan Lemuru (Sardinella longiceps)” Selama Fermentasi. Dibawah bimbingan I Wayan Redi Aryanta dan Agus Selamet Duniaji. Kecap ikan merupakan salah satu produk perikanan tradisional yang diolah dengan cara fermentasi dan telah dikenal sejak lama dengan ciri khas berupa cairan jernih berwarna kekuningan sampai coklat , agak kental, mempunyai rasa gurih asin dengan bau sedikit amis. Selama ini proses pembuatan kecap ikan yang banyak dilakukan adalah menggunakan teknik penggaraman. Teknik ini merupakan teknik yang paling tradisional, yaitu fermentasi hanya dengan memanfaatkan bakteri-bakteri indigenous (yang secara alamiah terdapat pada tubuh ikan) sehingga membutuhkan waktu yang cukup lama untuk menghasilkan kecap ikan, kualitas produknya kurang baik dan tidak konsisten serta mudah sekali mengalami pembusukan. Upaya yang dapat dilakukan untuk memperbaiki proses pembuatannya adalah dengan memperhatikan faktor kesegaran ikan, kadar garam dan memperpendek waktu fermentasi dengan menggunakan kultur starter yang sesuai. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui spesies BAL yang berperan selama fermentasi, mempelajari dinamika suksesi pertumbuhannya, mendapatkan isolat yang teridentifikasi dan yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai kandidat kultur starter, serta untuk mengetahui perubahan mikrobiologis dan biokimiawi yang terjadi selama fermentasi kecap ikan lemuru. Dalam penelitian ini, analisis dilakukan terhadap kecap ikan lemuru yang dibuat dengan kadar garam 20 % dan difermentasi selama 3 bulan dan analisis dilakukan setiap bulan, dengan parameter yang diamati meliputi total BAL, total kapang, total khamir, total asam, pH dan kadar protein terlarut. Bakteri asam laktat ditumbuhkan pada medium De Man Rogosa Sharpe (MRS) yang selanjutnya diisolasi dan dikarakterisasi dengan menggunakan metode standar antara lain uji morfologi sel, pewarnaan gram, uji motilasi, uji katalase, uji
ix
produksi gas dari glukosa, produksi asam dan uji pertumbuhan pada suhu, pH dan kadar garam yang berbeda.
Untuk mengidentifikasi spesies BAL digunakan
perangkat kit API 50 CH dan API 50 CHL medium versi 5.1 yang dilanjutkan dengan analisis data dengan menggunakan software APIWEB. Pada penelitian ini berhasil diisolasi sebanyak 52 isolat BAL indigenous yang terdistribusi kedalam enam kelompok berdasarkan perbedaan pertumbuhan pada suhu, pH dan konsentrasi garam yang berbeda. Hasil identifikasi diperoleh dua spesies BAL yaitu Tetragenococcus halophilus dengan empat strain : T. halophilus KI03, T. halophilus KI29, T. halophilus KI13, T. halophilus KI31 dan Aerococcus viridans dengan dua strain : A. viridans KI11 dan A. viridans KI18. Semua strain BAL tersebut selama fermentasi telah menunjukkan dinamika suksesi pertumbuhan BAL indigenous. Pada awal fermentasi, BAL yang tumbuh didominasi oleh
T. halophilus KI03. Setelah difermentasi selama 1 bulan,
populasi BAL meningkat tajam, dimana T. halophilus KI13 dan T. halophilus KI31 banyak yang tumbuh, sedangkan T. halophilus KI29, A. viridans KI11 dan A. viridans KI18 sedikit yang tumbuh. Selama 2 bulan fermentasi, BAL yang masih tumbuh mendominasi adalah T. halophilus KI31 dan yang sedikit tumbuh yaitu T. halophilus KI29. Setelah 3 bulan fermentasi ternyata hanya T. halophilus KI31 yang masih tetap hidup dengan populasi yang sedikit. Perubahan mikrobiologis dan biokimiawi terjadi selama fermentasi kecap ikan lemuru. Total BAL dan total khamir meningkat tajam setelah difermentasi selama 1 bulan, kemudian populasinya menurun dengan semakin lamanya fermentasi. Nilai total asam dan kadar protein terlarut meningkat, sedangkan pH mengalami penurunan. Tetragenococcus halophilus merupakan spesies BAL homofermentatif yang tetap tumbuh selama fermentasi kecap ikan lemuru dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai kandidat kultur starter kecap ikan. Namun demikian, perlu dilakukan uji potensi dan uji produksi serta kajian lebih mendalam dari isolat tersebut pada tingkat molekuler melalui analisis DNA untuk lebih meyakinkan filogenetiknya.
x
DAFTAR ISI
Halaman SAMPUL DALAM.......................................................................................
i
PRASYARAT GELAR.................................................................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN ..........................................................................
iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ..............................................................
iv
UCAPAN TERIMA KASIH .........................................................................
v
ABSTRAK ...................................................................................................
vii
ABSTRACT .................................................................................................
viii
RINGKASAN ...............................................................................................
ix
DAFTAR ISI ................................................................................................
xi
DAFTAR TABEL ........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
xv
DAFTAR SINGKATAN ..............................................................................
xvi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvii
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang .............................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................
3
1.3 Tujuan Penelitian ..........................................................................
4
1.4 Manfaat Penelitian .......................................................................
4
BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Ikan Lemuru .................................................................................
5
2.2 Fermentasi Kecap Ikan .................................................................
7
2.3 Mikrobiologi Kecap Ikan ..............................................................
9
2.4 Bakteri Asam Laktat (BAL) ..........................................................
12
2.4.1 Bentuk, Sifat dan Klasifikasi BAL...............................................
14
2.4.2 Isolasi dan Identifikasi BAL .......... .......................................
17
2.5 Senyawa Antimikroba ............................................................ .....
19
xi
BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Konsep ........................................................................
21
3.2 Hipotesis Penelitian .....................................................................
22
BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................
24
4.2 Bahan dan Alat Penelitian ............................................................
24
4.3 Metode Penelitian ........................................................................
25
4.4 Prosedur Penelitian ......................................................................
26
4.4.1 Pembuatan Kecap Ikan Lemuru ...............................................
26
4.4.2 Analisis Mikrobiologis.............................................................
27
4.4.2.1 Total Bakteri Asam Laktat ..............................................
27
4.4.2.2 Karakterisasi Bakteri Asam Laktat ..................................
29
4.4.2.3 Identifikasi Bakteri Asam Laktat .....................................
33
4.4.2.4 Total Kapang/Khamir......................................................
35
4.4.3 Analisis Biokimiawi .................................................................
36
4.4.3.1 Penentuan Total Asam ...................................................
36
4.4.3.2 Penentuan Derajat Keasaman (pH) ...................................
36
4.4.3.3 Penentuan Kadar Protein terlarut .....................................
37
4.4.4 Penyajian dan Analisis Data.....................................................
38
BAB V HASIL PENELITIAN 5.1 Karakteristik Kecap Ikan Lemuru Selama fermentasi ..................
39
5.1.1 Karakteristik Mikrobiologis kecap Ikan Lemuru................
39
5.1.2 Karakteristik Biokimiawi Kecap Ikan Lemuru....................
40
5.2 Isolasi dan Identifikasi BAL .......................................................
43
5.3 Karakteristik BAL ......................................................................
46
5.4 Suksesi Pertumbuhan BAL Selama fermentasi Kecap Ikan Lemuru..........................................................................................
xii
49
BAB VI PEMBAHASAN 6.1 Karakteristik Kecap Ikan Lemuru Selama Fermentasi..................
51
6.1.1 Karakteristik Mikrobiologis Kecap Ikan Lemuru...............
51
6.1.2 Karakteristik Biokimiawi Kecap Ikan Lemuru....................
54
6.2 Isolasi dan Identifikasi BAL..........................................................
58
6.3 Suksesi Pertumbuhan BAL Selama Fermentasi Kecap Ikan Lemuru..........................................................................................
62
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN 7.1 Simpulan .....................................................................................
65
7.2 Saran..............................................................................................
66
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
67
LAMPIRAN
72
...........................................................................................
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
5.1 Karakteristik Mikrobiologis Kecap Ikan Lemuru Selama Fermentasi....
39
5.2 Karakteristik Biokimiawi Kecap Ikan Lemuru Selama Fermentasi........
43
5.3 Karakteristik fenotifik 6 Kelompok BAL...............................................
47
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
3.1 Kerangka Konsep Penelitian....................................... ..............................
23
4.1 Diagram Alir Proses Pelaksanaan Penelitian............................................
27
5.1 Perubahan Pertumbuhan BAL dan Khamir Pada Kecap Ikan Lemuru Selama Fermentasi……………….......... .............................................. ..
41
5.2 Penampakan Koloni BAL pada Media MRSA ........................................
41
5.3 Penampakan Koloni Khamir Pada Media MEA.......................................
42
5.4 Pemisahan Koloni BAL dengan Metode Gores........................................
44
5.5 Hasil Identifikasi Isolat BAL pada Perangkat KIT API 50 CH.................
45
5.6 Morfologi Sel T. halophilus.....................................................................
46
5.7 Morfologi Sel A. viridans...........................................................................
46
5.8 Uji Pertumbuhan Isolat BAL pada Media MRSA .....................................
48
5.9 Suksesi Pertumbuhan BAL indigenous Selama Fermentasi Kecap Ikan Lemuru........................................................................................................
xv
50
DAFTAR SINGKATAN
SINGKATAN BAL
: Bakteri Asam Laktat
CFU
: Colony Forming Unit
g
: gram
ml
: mililiter
MRS
: de Man Rogosa Sharpe
MRSA
: de Man Rogosa Sharpe Agar
MEA
: Malt Extract Agar
SIM
: Sulphide Indole Motility
NaCl
: Natrium Clorida
NaOH
: Natrium Hidroksida
HCL
: Asam Klorida
H2O2
: Hidrogen Peroksida
BCP
: Bromo Cresol Purple
API
: Analytical Profile Index
TCA
: Trichloroacetic Acid
µl
: mikro liter
nm
: nano meter
cm
: centimeter
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
1. Total BAL Kecap Ikan Lemuru selama Fermentasi(cfu/ml) …………….
72
2.
Jumlah masing-masing Strain BAL Selama Fermentasi (cfu/ml)……….
72
3. Total Khamir Kecap Ikan Lemuru selama Fermentasi(cfu/ml) …………
73
4. Nilai Total Asam Kecap Ikan Lemuru Selama Fermentasi(%)………….
73
5. Derajat Keasaman (pH) Kecap Ikan Lemuru selama Fermentasi………...
73
6. Kadar Protein Terlarut Kecap Ikan Lemuru selama Fermentasi(%)…….
74
7. Hasil Pengamatan Identifikasi BAL Indigenous Dengan Kit API 50 CH
75
8. Pembuatan Media…………………………………………………………
79
9. Standar Mutu Kecap Ikan………………………………………………...
82
10. Karakteristik Kecap Ikan Lemuru Setelah 3 bulan Fermentasi…………..
82
xvii
