ISOLASI DAN KARAKTERISASI ß-GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM LAKTAT DARI MAKANAN HASIL FERMENTASI
SITARESMI YUNINGTYAS
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRAK SITARESMI YUNINGTYAS. Isolasi dan Karakterisasi ß-Galaktosidase Bakteri Asam Laktat dari Makanan Hasil Fermentasi. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMI SENO dan TATIK KHUSNIATI. ß-Galaktosidase (EC 3.2.1.23) berguna untuk menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Penelitian ini bertujuan mendapatkan beberapa isolat bakteri asam laktat penghasil ß-galaktosidase dari makanan hasil fermentasi serta mengetahui aktivitas dan karakterisasi enzimatik dari isolat terseleksi. Aktivitas enzimatik ß-galaktosidase dari isolat terseleksi ini dibandingkan dengan bakteri pembanding, Lactobacillus bulgaricus. Penelitian ini diawali dengan isolasi dan seleksi bakteri asam laktat dari makanan hasil fermentasi. Aktivitas dan karakterisasi enzim ditentukan dengan menggunakan o-nitrofenil-ß-Dgalaktopiranosida (oNPGal). Isolasi bakteri asam laktat dari makanan hasil fermentasi mendapatkan 13 isolat yang menghasilkan ß-galaktosidase dengan aktivitas tertinggi pada isolat AV-1. ß-Galaktosidase dari isolat AV-1 mempunyai kondisi optimum pada waktu inkubasi 25 menit, suhu 43 °C, dan pH 6.5 dengan aktivitas sebesar 0.214 U/ml. ß-Galaktosidase dari L. bulgaricus mempunyai kondisi optimum pada waktu inkubasi 25 menit, suhu 43 °C, dan pH 6 dengan aktivitas sebesar 0.336 U/ml. Aktivitas ß-galaktosidase isolat AV-1 dengan isolat L. bulgaricus secara analisis statistik berbeda nyata (a = 0.05). Parameter kinetik (vmaks dan KM ) ß-galaktosidase isolat AV-1 sebesar 0.212 U/ml dan 0.326 mM sedangkan untuk L. bulgaricus sebesar 0.333 U/ml dan 0.457 mM.
ABSTRACT SITARESMI YUNINGTYAS. Isolation and Characterization of ß-Galactosidase Lactic Acid Bacteria from Fermented Food. Under the direction of DJAROT SASONGKO HAMI SENO and TATIK KHUSNIATI. ß-Galactosidase (EC 3.2.1.23) hydrolized lactose into glucose and galactose. The aim of this research is to find out lactic acid bacteria produced ß-galactosidase from fermented food and determine its activity and characterization of ß-galactosidase from selected isolate. The ß-galactosidase activity of selected isolate was compared with Lactobacillus bulgaricus which was used as a reference. The objective of this research was to isolation and selection lactic acid bacteria from fermented food. Activity and characterization of ß-galactosidase were determined using o-nitrophenyl-ß-galactopiranosida (oNPGal). Isolation lactic acid bacteria from fermented food had 13 isolates, isolate AV-1 has produced ß-galactosidase with the highest activity. The optimum ß-galactosidase activity from isolate AV-1 was shown 0.214 U/ml at 25 minute incubation, 43 °C and pH 6.5. The optimum ß-galactosidase activity from L. bulgaricus was shown 0.336 U/ml at 25 minute incubation, 43 °C and pH 6. ß-Galactosidase activity from isolate AV-1 was significantly different (a = 0.05) to ß-galactosidase activity from L. bulgaricus. ß-Galactosidase of isolate AV-1 had vmaks 0.212 U/ml and KM 0.326 mM while that L. bulgaricus had vmaks 0.333 U/ml and KM 0.457 mM.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI ß-GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM LAKTAT DARI MAKANAN HASIL FERMENTASI
SITARESMI YUNINGTYAS
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Skripsi: Isolasi dan Karakterisasi ß-Galaktosidase Bakteri Asam Laktat dari Makanan Hasil Fermentasi Nama : Sitaresmi Yuningtyas NIM : G44104012
Disetujui
Drs. Djarot Sasongko H.S, MS Ketua
Dr. Ir. Tatik Khusniati, M. App. Sc Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat, karunia, dan ridho-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan karya ilmiah yang berjudul Isolasi dan Karakterisasi ß-Galaktosidase Bakteri Asam Laktat dari Makanan Hasil Fermentasi. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong dari bulan Maret hingga Juli 2008. Penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Drs. Djarot Sasongko HS, MS. selaku pembimbing dari Program Studi Biokimia dan Ibu Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc selaku pembimbing dari institusi LIPI. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada staff Laboratorium Biokimia Mikrob, Mba Hamda, Teh Neng, Suri, Nyunyui, Indah, Dewi, Ela, Intan, Aulin, Hanifah, Safety, Amie, Abi, Sidiq dan rekan-rekan Biokimia 41 atas segala bantuannya. Penulis juga mengucapkan rasa terima kasih yang tulus dan rasa hormat setinggi-tingginya kepada Ayah, Mama, Yuthika, Ari, dan Nenek yang senantiasa tulus memanjatkan doa dan memberikan segala perhatian serta semangat. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan pihak yang membutuhkan.
Bogor, September 2008
Sitaresmi Yuningtyas
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 13 Juni 1987 dari ayah Suyono dan ibu Lina Herlina. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2004 penulis menyelesaikan sekolah menengah umum dari SMU Negeri 4 Bogor. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan terdaftar sebagai mahasiswa pada Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biokimia Umum pada mahasiswa S1 Biologi tahun 2007-2008 dan mahasiswa S1 Fakultas Kedokteran Hewan tahun 2007-2008. Penulis juga aktif sebagai pengurus Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) sebagai staf Bidang Biokimia Industri dan Mikrobiologi periode 20052006 serta Sekretaris II periode 2006-2007. Penulis melakukan praktik lapangan di Laboratorium Bioproses 3 Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong dari bulan Juli sampai Agustus 2007. Judul praktik lapangan penulis adalah Aktivitas Antibakteri Curdlan dari Agrobacterium sp.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ...............................................................................................ix DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ix PENDAHULUAN..................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA ß-Galaktosidase................................................................................................ 2 Karakterisasi Enzim ......................................................................................... 2 Bakteri Asam Laktat ........................................................................................ 3 Lactobacillus bulgaricus.................................................................................. 4 Makanan Hasil Fermentasi .............................................................................. 4 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat................................................................................................. 5 Metode ............................................................................................................. 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asam Laktat dari Makanan Hasil Fermentasi.............................................................................................. 6 Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil ß-Galaktosidase................................ 7 Produksi Enzim ß-Galaktosidase..................................................................... 7 Penentuan Waktu Inkubasi Optimum.............................................................. 8 Penentuan Suhu Optimum............................................................................... 9 Penentuan pH Optimum .................................................................................. 9 Aktivitas ß-Galaktosidase pada Kondisi Optimum ....................................... 10 Parameter Kinetik (KM dan vmaks) ................................................................. 10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan........................................................................................................ 11 Saran .............................................................................................................. 11 DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................. 11 LAMPIRAN ............................................................................................................ 14
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Reaksi hidrolisis laktosa oleh ß-galaktosidase .................................................... 2 2. Lactobacillus bulgaricus ..................................................................................... 4 3. Morfologi koloni bakteri asam laktat dari makanan hasil fermentasi ................. 7 4. Hasil seleksi bakteri asam laktat penghasil ß-galaktosidase ............................... 7 5. Kurva pertumbuhan AV-1 dan L. bulgaricus...................................................... 8 6. Reaksi hidrolisis oNPGal oleh ß-galaktosidase................................................... 8 7. Penentuan waktu inkubasi optimum ß-galaktosidase isolat AV-1 dan L. bulgaricus................................................................................................. 9 8. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ß-galaktosidase isolat AV-1 dan L. bulgaricus................................................................................................. 9 9. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ß-galaktosidase isolat AV-1 dan L. bulgaricus............................................................................................... 10 10. Aktivitas enzim ß-galaktosidase sebelum dan sesudah optimasi ...................... 10 11. Kurva Michaelis Menten dari isolat AV-1 dan L. bulgaricus ........................... 10 12. Kurva Lineweaver Burk isolat AV-1 dan L. bulgaricus ................................... 11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Kegiatan penelitian............................................................................................ 15 2. Bentuk morfologi isolat bakteri asam laktat dari makanan hasil fermentasi..... 16 3. Hasil seleksi bakteri asam laktat penghasil ß-galaktosidase berdasarkan terbentuknya o-nitrofenol (oNP) ................................................... 16 4. Hasil penentuan kurva pertumbuhan isolat AV-1 ............................................. 17 5. Hasil penentuan kurva pertumbuhan dari L.bulgaricus .................................... 17 6. Hasil penentuan absorbansi larutan standar o-nitrofenol (oNP)........................ 18 7. Aktivitas ß-galaktosidase pada berbagai waktu inkubasi.................................. 19 8. Aktivitas ß-galaktosidase pada berbagai variasi suhu ....................................... 20 9. Aktivitas ß-galaktosidase pada berbagai variasi pH.......................................... 21 10. Data penentuan kinetika enzim ......................................................................... 22 11. Analisis statistik aktivitas enzim ß-galaktosidase ............................................. 23 12. Pembuatan pereaksi ........................................................................................... 23
1
PENDAHULUAN Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti lemak susu, protein susu, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah karbohidrat utama susu dengan proporsi 4.7% dari total susu (Chaplin 2004). Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan ß(1,4)-glikosidik (Fox & McSweeney 1981). Keberadaan laktosa dalam susu merupakan salah satu keunikan dari susu itu sendiri karena laktosa tidak terdapat di alam kecuali sebagai produk dari kelenjar susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh. Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim ßgalaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar. Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah pada brush border pada usus halus (Marsh & Riley 1998). Jika seseorang tidak mempunyai cukup enzim ß-galaktosidase maka laktosa menjadi tidak tercerna dan tidak dapat diserap masuk ke dalam darah. Bahanbahan ini akan menumpuk di dalam usus. Oleh bakteri usus, tumpukan gula susu ini akan diubah menjadi asam-asam organik dan gas karbon dioksida, gas metan, dan hidrogen. Deposit asam ini merangsang timbulnya gerakan usus. Hal ini menyebabkan diare dengan tinja berair, berbusa, dan berbau asam. Penderita laktosa intoleran di Amerika sekitar 95%, Eropa 50%, Asia 80%, dan Afrika 80% (Rusynyk & Still 2001). Penyebab munculnya laktosa intoleran dapat disebabkan bawaan dari lahir, penyebab primer, dan penyebab sekunder. Penyebab primer dapat akibat dari penurunan aktivitas ßgalaktosidase seiring bertambahnya usia. Bagi sebagian besar populasi di dunia, aktivitas ßgalaktosidase meningkat selama periode gestasi lanjut (27-32 minggu), dan tetap tinggi sampai usia sekitar 5-7 tahun. Setelah usia ini, aktivitas tersebut turun sampai dewasa. Hal ini disebabkan setelah dewasa, susu tak lagi menjadi makanan utama lagi sehingga kebutuhan enzim pengurai susu pun menjadi menurun. Penyebab sekunder dapat diakibatkan rusaknya sel-sel permukaan usus halus yang jadi pabrik pembuat enzim ßgalaktosidase (Rusynyk & Still 2001). Kerusakan ini disebabkan infeksi dan
gangguan-gangguan yang merusak sel-sel usus. Dengan demikian perlu dilakukan upayaupaya untuk menurunkan kadar laktosa susu dan meningkatkan kecernaan laktosa bagi penderita laktosa intoleran. Susu dapat dimodifikasi bagi penderita laktosa intoleran dengan ultrafiltrasi, fermentasi (Fox & McSweeney 1981), dan hidrolisis (Winarno 1999). Proses ultrafiltrasi akan menghilangkan mineral dan vitamin sehingga proses ini akan mengurangi nutrisi (Fox & McSweeney 1981). Proses fermentasi akan mengubah susu menjadi produk-produk baru, misalnya susu asam dan yoghurt yang pada umumnya dapat menurunkan 25% kadar laktosa dan sisanya masih tersisa dalam produk susu tersebut (Winarno 1999). Hidrolisis laktosa dilakukan secara enzimatik menggunakan enzim ß-galaktosidase yang akan menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa yang masih memiliki nilai energi tinggi namun aman bagi penderita laktosa intoleran. Dalam proses hidrolisis dengan menggunakan ß-galaktosidase, tidak semua laktosa dihidrolisis tetapi disisakan sebanyak 25% (Tossaveinen 2003). Selain itu, penderita laktosa intoleran dapat juga mengonsumsi suplemen ß-galaktosidase. Metode perlakuan dengan konsumsi suplemen ß-galaktosidase memang terbukti efektif mereduksi gejala yang berhubungan dengan malabsorbsi laktosa tetapi obat ini harganya mahal (Fox & McSweeney 1981). Produksi hidrolisis laktosa dapat menggunakan bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat mempunyai enzim-enzim ßgalaktosidase dan laktat dehidrogenase (LDH) yang menghasilkan asam laktat dari laktosa pada proses fermentasi (Surono 2004). Secara alami bakteri asam laktat ditemukan pada beberapa bahan makanan seperti daging, buahbuahan, sayur-sayuran, susu, dan makanan hasil fermentasi. Menurut Wierzbicki dan Kosikowski (1973), Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus dapat menghidrolisis laktosa hingga 50-60%. Penelitian ini bertujuan mendapatkan beberapa isolat bakteri asam laktat penghasil ß-galaktosidase dari makanan hasil fermentasi serta mengetahui aktivitas dan karakterisasi enzimatik (kondisi optimum dan parameter kinetik) dari beberapa isolat tersebut. Aktivitas enzimatik ß-galaktosidase isolat terseleksi ini dibandingkan dengan bakteri pembanding, yaitu Lactobacillus bulgaricus. Hipotesis penelitian ini adalah isolat bakteri asam laktat dari makanan hasil fermentasi menghasilkan ßgalaktosidase. Selain itu, terdapat perbedaan
