PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT
SITARESMI YUNINGTYAS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae dan Potensinya terhadap Susu UHT adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, April 2011 Sitaresmi Yuningtyas NIM G851090041
ABSTRACT SITARESMI YUNINGTYAS. Purification, Immobilization, and Characterization of β-Galactosidase from Enterobacter cloacae with Potentiality to UHT Milk. Under direction of MARIA BINTANG and TATIK KHUSNIATI. Enzymatic hydrolysis of lactose is an important biotechnological process because the hydrolyzed products can be consumed by people with lactose intolerance. The aim of this study was purification, immobilization, and characterization of β-galactosidase from E. cloacae. This research also studied the hydrolysis of lactose in UHT milk. The stages of this research were production and purification β-galactosidase from E. cloacae; characterization of enzyme; optimization of immobilization formula; and hydrolisis of UHT milk. The βgalactosidase from E. cloacae was purified and showed a purification of 30.26fold, a yield of about 6.18%, and a specific activity of 101.781 U/mg. Free and immobilized enzyme exhibited maximum activity at an optimal pH of 7.0 and an optimum temperature of 40°C. This enzyme was activated by Co2+, Mn2+, and Mg2+; however, was inhibited by Ca2+, Zn2+, Cu2+, and Hg2+. KM for free and immobilized β-galactosidase were 0.434 and 2.068 mM, respectively. Optimal formulation of cell and enzyme immobilization were consist of 10% (w/v) cell with 5% (w/v) sodium alginate and 10% (v/v) purified enzyme with 5% (w/v) sodium alginate, respectively. This researh found that entrapped β-galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (28.09%) after 6 hours in batch process as compared to entrapped E. cloacae (22.01%) after 18 hours. Free β-galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (78.20%) after 6 hours as compared to free E. cloacae (55.14%) after 18 hours.
Keyword: β-galactosidase, Enterobacter cloacae, purification, immobilization
RINGKASAN SITARESMI YUNINGTYAS. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi βGalaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TATIK KHUSNIATI. Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-(1,4)-glikosidik dengan proporsi 4,7% dari total susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh. Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim β-galaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar. Orang-orang yang memiliki ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim β-galaktosidase yang rendah pada brush border pada usus halus disebut penderita laktosa intoleran. Salah satu solusi untuk penderita laktosa intoleran adalah memodifikasi susu dengan cara menghidrolisis laktosa secara enzimatik menggunakan βgalaktosidase. Penggunaan enzim dalam keadaan bebas yakni terlarut dalam air, kurang menguntungkan dalam skala industri karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan teknik amobilisasi. Sel atau enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi. Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan oleh Enterobacter colacae. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini menggali potensi β-galaktosidase dari E. cloacae. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan karakterisasi β-galaktosidase dari E. cloacae. Selain itu, untuk mengetahui aktivitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase teramobil. Tahap awal dari penelitian ini adalah penentuan waktu produksi βgalaktosidase optimum dari E. cloacae. Selanjutnya dilakukan produksi βgalaktosidase. Setelah memperoleh enzim β-galaktosidase kasar maka dilanjutkan dengan tahap purifikasi enzim yang terdiri dari pengendapaan dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel. Tahap selanjutnya adalah enzim βgalaktosidase terpurifikasi dan sel E. cloacae diamobilisasi dengan teknik penjebakan dengan kalsium alginat. Optimasi variasi konsentrasi alginat dan bobot sel yang digunakan untuk amobilisasi sel dilakukan terlebih dahulu sebelum dilakukan amobilisasi sedangkan untuk amobilisasi enzim dilakukan optimasi konsentrasi alginat saja. Setelah diperoleh konsentrasi optimum alginat maka dilakukan amobilisasi sel E. cloacae dan amobilisasi β-galaktosidase. Penentuan karakterisasi β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil yang dilakukan meliputi suhu optimum, stabilitas suhu, pH optimum, stabilitas pH, aktivator dan inhibitor, serta parameter kinetik (KM dan Vmaks). Tahap terakhir adalah penentuan potensi β-galaktosidase terhadap susu UHT yang meliputi hidrolisis laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase
bebas, dan β-galaktosidase teramobil. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase). Hasil penelitian ini menunjukan E. cloacae menghasilkan β-galaktosidase optimum pada waktu inkubasi jam ke-24 dengan suhu 37°C. Tahap purifikasi βgalaktosidase E. cloacae dengan menggunakan perlakuan pengendapan amonium sulfat 30-40%, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 101,781 U/mg dengan rendemen 6,18% dan tingkat kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali dari enzim kasar yang diperoleh. Suhu optimum bagi β-galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah 40°C. Stabilitas suhu pada β-galaktosidase bebas berkisar pada suhu 25-40°C sedangkan untuk enzim teramobil berkisar 25-45°C. pH optimum bagi β-galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah pH 7. Stabilitas β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil pada kisaran pH 5,5-8,0. Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor βgalaktosidase dari E. cloacae sedangkan Ca2+ dan Zn2+ merupakan inhibitor parsial. Kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ merupakan aktivator bagi enzim tersebut. Enzim β-galaktosidase bebas dari E. cloacae mempunyai kecepatan maksimum sebesar 0,655 µmol/menit dan nilai KM sebesar 0,434 mM. Pada β-galaktosidase teramobil, kecepatan maksimumnya sebesar 0,012 µmol/menit dengan nilai KM sebesar 2,068 mM. Konsentrasi optimum untuk amobilisasi sel adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% sedangkan konsentrasi optimum untuk amobilisasi enzim adalah larutan enzim terpurifikasi 10% (v/v) dan alginat 5%. E. cloacae bebas dapat menghidrolisis laktosa pada susu UHT sebesar 55,14% sedangkan E. cloacae teramobil sebesar 22,01% setelah 18 jam. Aktivitas hidrolisis laktosa oleh βgalaktosidase bebas sebesar 77,99% sedangkan β-galaktosidase teramobil sebesar 28,09% setelah 6 jam. Pemakaian berulang enzim amobil dan sel amobil masih dapat dilakukan hingga 6 kali pengulangan.
Kata kunci: β-galaktosidase, Enterobacter cloacae, purifikasi, amobilisasi
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT
SITARESMI YUNINGTYAS
Tesis sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Judul Tesis Nama NIM
: Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT : Sitaresmi Yuningtyas : G851090041
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Ketua
Dr. Ir. Tatik Khusniati, M. App. Sc. Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biokimia
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.
Tanggal Ujian: 7 April 2011
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini berjudul Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Kegiatan Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juli hingga November 2010 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), di Jalan Raya Bogor km 46, Cibinong. Penelitian ini dibiayai Proyek Puslitbang Biologi LIPI dari dana Program Insentif Penelitian dan Perekayasa, Ristek 2010. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan selama berlangsungnya penelitian serta dalam penyusunan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran dalam penulisan tesis. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, dan Abi yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa kepada penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada staf Laboratorium Biokimia Mikroba LIPI Biologi, Neneng Karimaryati, A.Md. AL, Bapak Abdul Kholiq, S.Pd, dan Resti Siti Mutmainah atas kerja samanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2011 Sitaresmi Yuningtyas
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 13 Juni 1987 dari ayah Ir. Suyono dan ibu Lina Herlina. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2004 penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB dan menamatkannya pada tahun 2008. Penulis pernah bekerja sebagai Asisten Peneliti di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2009. Kesempatan untuk melanjutkan program pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2009.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..............................................................................................xiii DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xiii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv PENDAHULUAN ................................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA Enzim β-Galaktosidase ................................................................................. 4 Enterobacter cloacae .................................................................................... 7 Susu UHT ..................................................................................................... 8 Purifikasi Enzim ......................................................................................... 10 Teknik Amobilisasi ..................................................................................... 12 Karakterisasi Enzim .................................................................................... 14 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................... 17 Metode Penelitian ....................................................................................... 18 HASIL DAN PEMBAHASAN Waktu Optimum Produksi β-Galaktosidase ................................................. 26 Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase ..................................................... 27 Karakterisasi β-Galaktosidase ..................................................................... 32 Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae .................................................................................. 40 Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi β-Galaktosidase .............. 42 Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT ................................................. 43 Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil ................................ 46 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .................................................................................................... 48 Saran .......................................................................................................... 48 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 49 LAMPIRAN ........................................................................................................ 53
DAFTAR TABEL Halaman 1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase ........................................................ 6 2 Komponen utama susu ....................................................................................... 9 3 Purifikasi β-galaktosidase dari E.cloacae ......................................................... 30
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase ................................................... 5 2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase .......................................................... 5 3 Enterobacter cloacae ........................................................................................ 7 4 Teknik amobilisasi enzim ................................................................................ 14 5 Kurva pertumbuhan E.cloacae dan kurva produksi β-galaktosidase ................ 27 6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase ................................................ 28 7 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan amonium sulfat .......... 29 8 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200 ............................................... 31 9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 32 10 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 34 11 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 35 12 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 36 13 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari E. cloacae ................................... 38 14 Kurva Lineweaver Burk dari enzim β-galaktosidase bebas dan enzim β-galaktosidase teramobil ...................................................................... 39 15 Variasi optimum penentuan sel amobil ............................................................ 41 16 Produk yang dihasilkan pada penentuan optimasi amobisisasi enzim............... 43 17 Aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil dan sel teramobil ................. 46 18 Penggunaan berulang enzim teramobil dan sel teramobil................................. 47
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan umum penelitian............................................................................... 54 2 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase .............................................................. 55 3 Morfologi Enterobacter cloacae ...................................................................... 55 4 Kurva standar oNP .......................................................................................... 56 5 Kurva standar protein ...................................................................................... 57 6 Penentuan waktu produksi optimum ................................................................ 58 7 Hasil purifikasi β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat ............. 58 8 Hasil kromatografi filtrasi gel .......................................................................... 59 9 Optimasi dan Stabilitas Suhu ........................................................................... 59 10 Optimasi dan stabilitas pH ............................................................................... 61 11 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase ........................................................... 62 12 Penentuan parameter kinetik enzim bebas dan enzim teramobil ....................... 63 13 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi variasi sel dan alginat untuk amobilisasi sel ....................................................................................... 65 14 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi enzim .................................................................................. 65 15 Potensi hidrolisis laktosa ................................................................................. 66 16 Penggunaan berulang enzim amobil dan sel amobil ......................................... 67
PENDAHULUAN Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah karbohidrat utama susu dengan proporsi 4,7% dari total susu (Chaplin 2004). Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-(1,4)-glikosidik (Fox & McSweeney 1981). Keberadaan laktosa dalam susu merupakan salah satu keunikan dari susu itu sendiri karena laktosa tidak terdapat di alam kecuali sebagai produk dari kelenjar susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh. Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim βgalaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar. Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim β-galaktosidase yang rendah pada brush border pada usus halus (Marsh & Riley 1998). Jika seseorang tidak mempunyai cukup β-galaktosidase maka laktosa menjadi tidak tercerna dan tidak dapat diserap masuk ke dalam darah. Bahan-bahan ini akan menumpuk di dalam usus. Oleh bakteri usus, tumpukan gula susu ini akan diubah menjadi asam-asam organik dan gas karbon dioksida, gas metan, dan hidrogen. Deposit asam ini merangsang timbulnya gerakan usus. Hal ini menyebabkan diare dengan tinja berair, berbusa, dan berbau asam. Penderita laktosa intoleran di dunia terdapat pada suku bangsa: Indian Amerika sekitar 95-100%, Mediterania 80-85%, Afrika 85-90%, Asia 90-100%, Eropa Utara 40-55%, dan Meksiko 50-75% (Rusynyk & Still 2001). Susu dapat dimodifikasi bagi penderita laktosa intoleran dengan ultrafiltrasi, fermentasi (Fox & McSweeney 1981), dan hidrolisis (Winarno 1999). Proses ultrafiltrasi akan menghilangkan makromolekul berbobot molekul besar seperti laktosa dan protein akibat filtrasi sehingga ini akan mengurangi nutrisi (Fox & McSweeney 1981). Proses fermentasi akan mengubah susu menjadi produkproduk baru, misalnya susu asam dan yoghurt yang pada umumnya dapat menurunkan 25% kadar laktosa (Winarno 1999). Hidrolisis laktosa dilakukan
2
secara enzimatik menggunakan β-galaktosidase yang akan menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa yang masih memiliki nilai energi tinggi namun aman bagi penderita laktosa intoleran. Selain itu, penderita laktosa intoleran dapat juga mengkonsumsi suplemen β-galaktosidase. Enzim β-galaktosidase yang sudah dijual di pasaran adalah Maxilact yaitu β-galaktosidase dari Kluyveromyces lactis. Enzim ini berupa kapsul maupun cairan. Jika enzim ini ditambahkan ke dalam susu dan didiamkan selama semalam dalam suasana dingin akan mampu menghidrolisis laktosa sebesar 70% (Mahoney 2004). Metode ini memang terbukti efektif mereduksi gejala yang berhubungan dengan malabsorbsi laktosa tetapi obat ini harganya mahal (Fox & McSweeney 1981). Penggunaan enzim dalam keadaan bebas, yakni terlarut dalam air, kurang menguntungkan karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan teknik amobilisasi (Palmer 1991). Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel. Proses ini biasanya menghasilkan bentuk tidak larut dalam air. Sel atau enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi (Mahoney 2004). Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan dari hewan dan mikroorganisme. Salah satunya adalah Enterobacter colacae. E. cloacae B5 menghasilkan βgalaktosidase dengan aktivitas transglikosilasi sebesar 55% (Lu et al. 2009). Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong telah mengidentifikasi kemampuan E. cloacae dalam memproduksi enzim ini. Isolat tersebut merupakan isolat dari buah-buahan yang berasal dari Gunung Salak. Pemilihan E. cloacae karena isolat ini belum diteliti dan diharapkan isolat ini menghasilkan enzim β-galaktosidase yang potensial dalam mendegradasi laktosa pada susu UHT. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan karakterisasi β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Selain itu, untuk mengetahui aktifitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase teramobil. Hipotesis penelitian ini adalah Enterobacter cloacae menghasilkan
3
enzim β-galaktosidase yang dapat menurunkan kadar laktosa pada susu UHT. Aktivitas penurunan kadar laktosa oleh sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase teramobil berbeda satu sama lain. Penelitian ini diharapkan dapat
memberikan
informasi
ilmiah
mengenai aktivitas β-
galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Enzim β-galaktosidase ini dapat juga digunakan dalam pembuatan susu UHT bebas laktosa untuk penderita laktosa intoleran.
TINJAUAN PUSTAKA Enzim β-Galaktosidase Enzim β-galaktosidase (EC 3.2.1.23) termasuk enzim hidrolase yang dapat menghidrolisis ikatan β-D-galaktosida pada ujung nonreduksi residu β-Dgalaktosa
(Gambar
1).
Nama
sistematiknya
adalah
β-D-galaktosida
galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase (IUBMB Enzyme Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisis ikatan β-(1,4)glikosida pada laktosa. Penggunaan enzim β-galaktosidase dalam proses hidrolisis ini mempunyai kekurangan dimana hidrolisis laktosa secara keseluruhan tidak mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya galaktosa didalam reaksi hidrolisis (Boyer 2002). Enzim β-galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler. Enzim ini pun bersifat induktif karena akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004). Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase dapat dilihat pada Tabel 1. Enzim βgalaktosidase dari bakteri seperti Lactobacillus bulgaricus bersifat aktif pada pH rendah (dibawah pH 5,5) dengan suhu berkisar 30-60ºC (Itoh et al. 1980; Cesca et al. 1984). Enzim β-galaktosidase dari yeast seperti Kluyveromyces lactis dan Kluyveromyces fragilis bersifat aktif pada pH 6-8 dengan suhu berkisar 25-40ºC. Enzim yang sama hasil produksi dari fungi seperti Aspergillus niger dan Aspergillus oryzae
aktif pada pH rendah berkisar 2,5-6,0 serta bersifat
termostabil (Mahoney 2004). Matthews (2005) menyatakan enzim ini berbentuk tetramer yang terdiri 4 rantai polipeptida (monomer) serta bobot molekul sekitar 464 kDa. Setiap monomer terdiri dari 1023 asam amino. Enzim ini mempunyai situs aktif pada Glu 461, Glu 537, dan Trp 999. Glu 461 terlibat pada stabilisasi elektrostatik pada keadaan transisi. Glu 537 berperan sebagai nukleofili. Trp 999 berperan mengikat ligan. Ion natrium akan berinteraksi dengan gugus hidroksil dari ligan (Huber et al. 1994). Langkah pertama mekanisme katalitiknya adalah laktosa membentuk intermediet dengan nukleofil Glu 537 dan dibantu dengan asam (A: Glu 461 atau ion Magnesium). Selanjutnya Glu 461 mendonorkan proton dengan memberikan
5
H+ pada oksigen glikosidik yang disertai pemutusan ikatan glikosidik dan pelepasan glukosa. Langkah kedua adalah pembentukan intermediet transient triagonal oxocarbonium
yang dibantu oleh basa (B: Glu 461) lalu terjadi
protonasi dari Glu 461 yang dikatalisis air dan diakhiri dengan transfer galaktosil ke air atau gula lain. Jika akseptor berupa air maka akan terjadi proses hidrolisis sehingga terbentuk glukosa dan galaktosa. Jika akseptornya berupa gula lain maka akan terjadi proses transglikosilasi yang akan membentuk galaktooligosakarida (Gambar 2) (Matthews 2005).
β-Galaktosidase
+ + H2O Laktosa
D-Galaktosa
D-Glukosa
Gambar 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase.
Laktosa
Pembentukan intermediet
Glukosa Pemutusan ikatan
Intermediet transient triagonal
Gambar 2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase (Matthews 2005).
6
Tabel 1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase (Mahoney 2004). Sumber Jenis-jenis Yeast Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus, Pichia pastoris Fungi
Alternaria alternata, Alternaria palmi, Aspergillus foetidus, A. fonsecaeus, A. niger, A. oryzae, Bauvaria bassiana, Curvalaria inaequalis, Fusarium moniliforme, Mucor meihei, Mucor pusillus, Paecilomyces varioti, Penicillium conescens, P. chrysogenum, P. notatum, P. simplicissum, P. melloti, Rhizomucor spp., Saccharopolyspora rectivirgula, Scopulariopsis spp., Sirobasidium magnum, Streptomyces violaceus, Trichoderma reesei
Bakteri
Arthrobacter spp., Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacilus subtilis, Bacteroides polypragmatus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Erwinia aroieae, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Lactobacillus acidophilus, L. crispatus, L. delbruecki, L. bulgaricus, L. kefiranofaciens, L. helveticus, L. lactis, L. sporogenes, L. thermophilus, Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento, Pseudoalteromonas haloplanktis, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus thermophillus, Sulfolobus solfataricus, Thermoanaerobacter spp., Thermus ruber, Thermus thermophillus, Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris
Perbandingan reaksi transglikosilasi laktosa dan hidrolisis
laktosa
tergantung dari jumlah substrat yang tersedia. Reaksi transglikosilasi akan terjadi pada konsentrasi laktosa yang tinggi sekitar 15-50% sehingga akan terbentuk galaktooligosakarida (Greenberg & Mahoney 1983). Jika konsentrasi laktosa rendah yaitu sekitar 5% maka akan terjadi reaksi hidrolisis yang akan membentuk glukosa dan galaktosa (Burvall & Dahlqvist 1979). Oleh karena itu, enzim ini digunakan pada industri pangan untuk mereduksi laktosa pada susu dan whey serta produksi galaktooligosakarida (Mahoney 1998). β-galaktosidase terdapat pada usus halus manusia yang dapat menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta mempunyai pH optimum 6 (Campbell
7
et al. 2005). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, laktosa yang mempunyai sifat osmotik yang tinggi ini dapat menarik air dan cairan tubuh ke dalam saluran pencernaan usus kecil. Masuknya cairan tubuh ke dalam usus kecil akan merangsang gerakan peristaltik dinding usus menjadi lebih cepat. Hal ini akan mendorong isi usus kecil berpindah secara cepat pula ke dalam usus besar. Di dalam usus besar ini bakteri-bakteri akan memfermentasikan laktosa menghasilkan berbagai asam organik dan gas. Akibatnya, akan timbul gejala sakit perut, mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). βgalaktosidase dapat diaplikasikan untuk penderita laktosa intoleran dengan cara hidrolisis laktosa pada susu serta konsumsi suplemen β-galaktosidase (Rusynyk & Still 2001).
Enterobacter cloacae Bakteri ini memiliki klasifikasi sebagai berikut kingdom Bacteria, filum Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili Enterobacteriaceae, genus Enterobacter, dan spesies Enterobacter cloacae. Bakteri ini mempunyai dua subspesies yaitu E. cloacae subsp. cloacae dan E. cloacae subsp. dissolvens (Holt et al. 1994).
E. cloacae merupakan bakteri
berbentuk batang (Gambar 3), Gram negatif, anaerobik fakultatif, ukurannya berkisar (0,3-0,6) µm × (0,8-2,0) µm, dan motil. Bakteri ini bergerak dengan menggunakan flagelum peritrikus yaitu flagela yang secara merata tersebar diseluruh permukaan sel. E. cloacae dapat hanya menggunakan sitrat dan asetat sebagai sumber karbon. Bakteri tersebut dapat diisolasi dari buah-buahan, usus hewan, tanah, dan perairan (Pelczar & Chan 1988).
Gambar 3 Enterobacter cloacae.
8
E. cloacae menghasilkan enzim β-galaktosidase, arginin dihidrolase, dan ornitin dekarboksilase (Huber 1999). β-Galaktosidase dari E. cloacae B5 yang diisolasi dari tanah mempunyai aktivitas transglikosilasi dan menghasilkan galaktooligosakarida sekitar 55% dari 275 g/L laktosa pada suhu 50ºC selama 12 jam. Enzim β-galaktosidase ini merupakan homotetramer dengan bobot molekul 442 kDa. Suhu optimumnya pada 35ºC dan aktif pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et al. 2009)
Susu UHT Susu adalah hasil ekskresi normal kelenjar susu induk mamalia betina untuk memberi makan anaknya. Secara kimiawi susu merupakan emulsi lemak dalam air yang mengandung gula, garam-garam mineral, dan protein dalam bentuk suspensi koloidal (Rahman et al. 1992). Menurut Walstra et al. (1999), komponen utama susu adalah air, lemak, protein, laktosa, asam organik, dan mineral (Tabel 2). Selain komponen-komponen dengan persentase besar, di dalam susu juga terdapat komponen lainnya seperti vitamin (vitamin B, C, dan D) dan enzim (fosfatase, peroksidase, lipoprotein lipase, protease). Berdasarkan kandungan lemaknya susu terbagi menjadi dua macam, yaitu susu berlemak (whole milk) dan susu skim (skim milk). Susu skim mengandung lemak yang lebih rendah dibanding susu berlemak. Susu merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme karena komposisinya yang sangat kompleks. Hal ini menyebabkan susu mudah sekali mengalami kerusakan oleh mikroorganisme, terutama oleh beberapa jenis bakteri patogen. Bakteri tersebut akan merusak susu sehingga menurunkan daya simpannya (Kusnawati 2004). Salah satu upaya untuk mengurangi jumlah bakteri patogen adalah dengan pemanasan. Fennema (1996) menyatakan bahwa ada tiga jenis pemanasan pada proses pengolahan susu, yaitu sterilisasi, pasteurisasi, dan ultra high temperature (UHT). Sterilisasi biasa dilakukan pada suhu 107-115ºC selama 20-40 menit atau pada suhu 120-130ºC selama 8-12 menit. Proses ini berpengaruh besar terhadap kandungan protein karena protein akan tereduksi hingga lebih dari 20%. Pasteurisasi terdiri dari Holding Methode dan High Temperature Short Time
9
(HTST). Holding Methode merupakan pemanasan dengan suhu 63ºC selama 30 menit. Sedangkan HTST merupakan pemanasan pada suhu 72ºC selama 15 detik. Tujuan pasteurisasi adalah untuk menghilangkan bibit penyakit sehingga mengurangi jumlah total bakteri untuk meningkatkan kualitas simpan. Semua produk pasteurisasi harus disimpan pada suhu rendah karena masih mengandung bakteri yang tahan panas seperti bakteri termofilik, bakteri asam laktat, bakteri penghasil spora, dan beberapa jenis bakteri aerobik dan bakteri aerobik fakultatif seperti Bacillus spp. (Early 1998). UHT merupakan pemanasan pada suhu yang sangat tinggi diatas 135ºC dalam waktu yang sangat singkat. Susu UHT dibuat dari susu cair segar yang diolah dengan menggunakan pemanasan pada suhu tinggi dan dalam waktu yang singkat untuk membunuh seluruh mikroba sehingga memiliki mutu yang baik. Proses UHT biasanya dilakukan pada suhu 136-138ºC selama 5-8 detik atau pada suhu 140-145ºC selama 2-4 detik (Fennema 1996). Kelebihan susu UHT adalah susu ini sangat higienis karena bebas dari mikroba dan spora sehingga potensi kerusakan mikrobiologis sangat kecil. Enzim-enzim pada susu seperti fosfatase, protease, katalase, lipoprotein lipase, laktoperoksidase, sulfhidril oksidase, dan xantin oksidase mengalami inaktivasi sehingga tidak akan merusak susu (Walstra et al. 1999). Oleh sebab itu, susu UHT mempunyai daya simpan yang panjang pada suhu kamar hingga 6 bulan. Kontak panas yang sangat singkat pada proses UHT menyebabkan mutu sensori seperti warna, aroma, dan rasa relatif tidak berubah (Fennema 1996). Nutrisi yang terkandung sedikit menurun seperti terjadinya reduksi protein berkisar 2-4%, menurunnya kadar vitamin B dan C, dan reaksi Maillard yang lebih rendah. Reaksi Maillard merupakan reaksi pencoklatan non enzimatik yang terjadi antara laktosa dan protein susu akibat proses pemanasan (Walstra et al. 1999). Tabel 2 Komponen utama susu (Walstra et al. 1999) Komponen Air Laktosa Lemak Protein Mineral Asam organik
Rata-rata (%) 87,1 4,6 4,0 3,25 0,7 0,17
Kisaran Normal (%) 85,3-88,7 3,8-5,3 2,5-5,5 2,3-4,4 0,57-0,83 0,12-0,21
10
Purifikasi Enzim Pemekatan Enzim Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses purifikasi sebelum tahap purifikasi selanjutnya (seperti kromatografi) dan dapat digunakan untuk keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode yaitu analitik dan preparatif. Metode analitik menggunakan pengendapan asam (contohnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik, ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edeistein 1991). Metode pemekatan β-galaktosidase biasanya menggunakan pengendapan dengan garam. Pengendapan protein pada tahap awal purifikasi berfungsi untuk memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim yang tidak dikehendaki. Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Pengendapan dengan garam biasanya menggunakan garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, dan amonium sulfat biasanya lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan KCl (Boyer 2000). Efek salting-in tidak dipengaruhi oleh sifat garam netral tetapi dipengaruhi oleh konsentrasi dan jumlah muatan pada tiap ion dalam larutan. Kelarutan protein meningkat pada kenaikan konsentrasi garam, kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein akan menurun (salting-out). Konsentrasi garam yang optimum ini sekaligus menurunkan aktivitas enzim, hal ini karena sebagian protein mengalami denaturasi dan rusak oleh pengaruh perlakuan selama pengendapan. Semakin banyak molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam akan menyebabkan penarikan molekul air yang mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling berinteraksi, teragregasi, dan mengendap (Scopes 1993).
11
Pemilihan garam amonium sulfat untuk pengendapan β-galaktosidase karena beberapa keuntungan seperti kelarutannya tinggi, tidak bersifat toksik, murah, dan stabilitasnya terhadap enzim. Pada proses pengendapan, terjadi penurunan kadar protein pada supernatan dan akan terjadi peningkatan protein pada endapan. Penambahan garam dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk pada suhu rendah, hal ini bertujuan untuk menghindari timbulnya buih yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Tahap selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses pemisahan molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh membran semipermeabel. Kantong dialisis selofan (MWCO 10 kD) dalam bufer mampu memisahkan molekul-molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti ion logam, inhibitor, peptida kecil, dan lainnya. Molekul yang besar dan mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam membran seperti β-galaktosidase. Setelah enzim dimasukkan ke kantong dialisis dan direndam dalam larutan bufer maka akan terjadi proses difusi dan osmosis. Konsentrasi garam di dalam kantong dialisis lebih tinggi sehingga larutan bufer akan masuk ke dalam kantong dialisis menggantikan garam yang keluar sehingga terjadi proses kesetimbangan (Scopes 1993).
Kromatografi Filtrasi Gel Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran molekulnya. Pemisahan akan berlangsung di dalam kolom yang berisi gel dalam bentuk granula dan terdiri atas struktur tiga dimensi dari polimer yang berikatan silang. Ikatan silang ini menghasilkan pori-pori di dalam granula. Ukuran pori dipengaruhi oleh tingkatan ikatan silang, makin besar tingkatan ikatan silang maka makin kecil ukuran pori. Polimer yang membentuk gel matrik harus mempunyai syarat: tidak mudah bereaksi; harus stabil di dalam kisaran pH, suhu, dan kekuatan ionik yang lebar; kandungan gugus ion harus kecil untuk mencegah efek pertukaran ion; mempunyai rigiditas mekanik yang tinggi untuk menahan laju aliran yang cepat; ukuran partikel harus seragam; dan tersedia untuk berbagai jenis gel sehingga dapat membedakan ukuran protein yang beraneka ragam (Boyer 2000).
12
Gel yang dapat digunakan untuk kromatografi filtrasi gel berupa dekstran, poliakrilamida, agarosa, kombinasi poliakrilamida-dekstran, dan kombinasi dekstran-agarosa. Gel yang pertama dikembangkan adalah dekstran yang berasal dari polisakarida. Dekstran mempunyai nama dagang sephadex. Jika dekstran berikatan silang dengan N,N-metilenbisakrilamida dinamakan Sephacryl. Gel poliakrilamida
diproduksi
dari
kopolimerisasi
akrilamida
dengan
N,N-
metilenbisakrilamida. Agarosa terbuat dari galaktosa dan anhidrogalaktosa. Nama dagang gel agarosa adalah Bio Gel-A, Sepharose, dan Superose. Kombinasi poliakrilamida-dekstran mempunyai nama dagang Ultragel. Sedangkan kombinasi dekstran-agarosa dinamakan Superdex (Boyer 2000). Superdex tersusun dari pengikatan kovalen antara dekstran dan agarosa. Superdex 200 dapat memisahkan fraksi protein dengan bobot molekul sekitar 10.000-600.000 Dalton dengan ukuran gelnya berkisar 13 µm. Superdex 200 stabil antara pH 1-14. Superdex 200 mempunyai keunggulan yaitu tingkat resolusi yang tinggi walaupun dalam keadaan laju alir yang cepat (Hellberg, Ivarsson, Johansson 1996). Teknik Amobilisasi Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel. Metode amobilisasi yang ideal harus mudah pengerjaannya dan tidak merusak substansi yang mengalami amobilisasi. Faktor-faktor seperti suhu, perubahan pH, dan radikal bebas selama proses amobilisasi harus ditetapkan kondisi optimumnya (Cao 2005). Bahan penyangga yang digunakan bersifat inert dan teraktivasi. Menurut Illanes et al. (2008), teknik amobilisasi terdiri atas penempelan pada permukaan padat (adsorpsi), ikatan kovalen (covalen bonding), ikatan silang (crosslinking), mikroenkapsulasi, dan penjebakan (entrapment) (Gambar 4). Teknik amobilisasi adsorpsi berdasarkan interaksi ikatan ionik, interaksi ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik atau gaya Van der Waals antara enzim atau sel mikrob dan bahan penyangga (Ramakrishna & Prakasham 1999). Bahan penyangga yang biasa digunakan adalah alumina, kaca, tanah liat dan penukar ion. Amobilisasi dengan pengikatan kovalen adalah pembuatan ikatan antara gugus fungsi enzim seperti –OH, -SH, -NH2, dan -COOH atau sel mikrob dengan bahan penyangga
13
anorganik untuk membentuk ikatan kovalen yang stabil. Pembentukan ikatan kovalen ini akibat penambahan agen pengikat. Bahan penyangga yang digunakan adalah silika gel yang terlapisi glutaraldehida. Glutaraldehida digunakan untuk membangun protokol antara gugus fungsi enzim dan bahan penyangga. Amobilisasi dengan menggunakan teknik pengikatan silang dilakukan dengan menggunakan dua atau lebih pereaksi. Bahan yang digunakan adalah polietilenglikol (PEG) dan glutaraldehida. Polietilenglikol sebagai agen presipitasi dan glutaraldehida sebagai pembentuk ikatan silang (Illanes et al. 2008). Teknik mikroenkapsulasi adalah suatu teknik yang menggunakan enzim atau sel mikrob dilingkupi oleh membran polimer semipermeabel yang bulat dengan diameter 1100 µm. Walaupun molekul enzim atau sel mikrob dilingkupi oleh membran, substrat maupun produk dapat berdifusi secara bebas melalui membran. Bahan yang digunakan adalah liposom-polimer (Cao 2005). Teknik amobilisasi dengan penjebakan adalah membuat enzim atau sel mikrob terjebak di dalam polimer butiran gel (Illanes et al. 2008). Prinsip metode penjebakan adalah inklusi sel atau enzim di dalam jaringan rigid yang berfungsi mencegah sel atau enzim berdifusi keluar medium namun substrat masih tetap dapat masuk ke dalam butiran gel (beads). Butiran gel berupa polisakarida (seperti agar, alginat, karagenan, dan selulosa), protein (kolagen dan gelatin), dan sintetik (poliakrilamida). Matriks alginat, karagenan, dan poliakrilamid paling luas dipakai pada teknik amobilisasi sel maupun enzim. Alginat adalah heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan L-guluronat (Najafpour et al. 2004). Alginat berasal dari alga coklat yang secara luas telah dipakai sebagai pengental, penstabil, gel, dan film. Penjebakan sel atau enzim menggunakan alginat karena alginat tidak larut air, pengerjaannya mudah, dan tidak berbahaya. Campuran sel atau enzim dengan natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen misalnya kalsium klorida akan membentuk reaksi antara alginat dan kation multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh adanya ion kalsium tetapi tidak menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan tekanan osmotik yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi kalsium alginat dalam bentuk butiran gel (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium
14
alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi yang dapat meningkatkan kestabilan kimia butiran gel tanpa membatasi transfer masa. Keuntungan teknik amobilisasi adalah lebih mudah memisahkan produk yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, penggunaan kembali biokatalis, produktivitas volumetrik yang tinggi, dan mereduksi biaya produksi. Enzim yang teramobilisasi mempunyai half-live lebih panjang dan dapat diprediksi rata-rata kerusakannya (Cao 2005).
Gambar 4 Teknik amobilisasi enzim. (a) pengikatan kovalen; (b)pengikat silang; (c) adsorpsi; (d) penjebakan; (e) enkapsulasi.
Karakterisasi Enzim Suhu dan pH Suhu mempunyai dua pengaruh yang saling bertentangan. Suhu dapat meningkatkan aktivitas enzim, tetapi dapat pula merusak struktur enzim. Suhu optimum merupakan batas keduanya (Dixon & Webb 1978). Peningkatan suhu sebelum tercapai suhu optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi katalitik enzim karena energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi, yaitu pada saat
15
kompleks enzim-substrat melampaui energi aktivasi terlalu besar, sehingga memecah ikatan sekunder pada konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini mengakibatkan enzim terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya (Martin 1981). Efek pH pada enzim berkaitan dengan keadaan ionisasi dari sistem yang dikatalisis, termasuk substrat, dan enzim itu sendiri. Perubahan pH dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Kadar pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan ketidakstabilan pada konformasi enzim sehingga menyebabkan struktur pada enzim rusak. Enzim mempunyai pH optimum yang khas yang akan menyebabkan aktivitas maksimal. Keadaan optimum ini dihubungkan dengan saat gugus pemberi proton atau penerima proton yang aktif pada sisi enzim berada pada kondisi ionisasi yang tepat. Keadaan optimum tidak harus sama dengan pH lingkungannya (Lehninger 2004).
Aktivator dan Inhibitor Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila komponen tambahan tersebut berupa senyawa anorganik disebut kofaktor, sedangkan jika senyawa organik disebut koenzim. Pada beberapa enzim, kofaktor dan koenzim terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi ada juga yang berfungsi sebagai pembawa gugus fungsional tertentu. Hampir semua enzim dapat dihambat oleh senyawa kimia tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat, senyawa organik, bahkan substrat enzim itu sendiri (Lehninger 2004). Ion K+ dan Mg2+ dibutuhkan agar aktivitas enzim β-galaktosidase optimum (Mahoney 2004).
Parameter Kinetik Kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim dijaga konstan. Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan reaksi amat rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini
16
dilampaui, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan bertambahnya konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004). Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan sebagai tetapan Michaelis-Menten (KM) adalah konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Kecepatan maksimum (vmaks) adalah kecepatan yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi substrat tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi substrat ([S]), kecepatan awal (v0), vmaks, dan KM (Lehninger 2004). Persamaan Michaelis-Menten adalah sebagai berikut. v0
vmaks [S] K M [S]
Persamaan Michaelis – Menten dapat
ditransformasikan ke suatu
persamaan lain yang disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini akan menghasilkan nilai vmaks dan KM yang lebih tepat karena pemetaan 1/v0 terhadap 1/[S] menghasilkan garis lurus. Garis ini akan memiliki sudut KM/vmaks, perpotongan garis pada sumbu y sebesar 1/vmaks dan perpotongan pada sumbu x sebesar -1/KM (Lehninger 2004). Persamaan Lineweaver-Burk adalah sebagai berikut. 1
v0
KM
.
1
1
vmaks [S] vmaks
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan antara lain biakan berupa Enterobacter cloacae yang merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong. Media kultur dan media produksi terdiri atas 20 g laktosa, 10 g pepton, 20 g ekstrak khamir, dan 10 g NaCl yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Bufer yang digunakan adalah bufer fosfat 0,05 M. Bahan untuk penentuan aktivitas enzim β-galaktosidase, pembuatan kurva
standar,
dan
penentuan
karakterisasi
enzin
adalah
enzim
β-
galaktosidase,bufer fosfat 0,1 M pH 7, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal), Na2CO3 1 M, o-nitrofenol (oNP), CaCl2.2H2O, CoCl2.6H2O, ZnSO4.7H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, HgCl2, MgSO4.7H2O Bahan untuk penentuan kadar protein metode Bradford dan kurva standar adalah enzim βgalaktosidase, pereaksi Bradford (100 mg coomassie briliant blue dalam 50 ml etanol 95% kemudian ditambahkan 100 ml H3PO4 85% lalu ditera dengan akuades hingga 1 liter), dan bovine serum albumin (BSA). Bahan untuk pengendapan enzim yaitu amonium sulfat dan membran selofan. Pengisi kolom kromatografi berupa Superdex 200 dan glasswol. Bahan untuk amobilisasi enzim dan sel adalah Na-alginat dan CaCl2. Bahan untuk mengetahui potensi βgalaktosidase pada susu UHT adalah susu UHT, sel E. cloacae amobil, sel E. cloacae bebas, enzim β-galaktosidase amobil, dan enzim β-galaktosidase hasil kromatografi filtrasi gel, dan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (Cypress Diagnostics). Alat-alat yang digunakan untuk penentuan waktu produksi optimum, uji aktivitas enzim β-galaktosidase dan karakterisasinya, penentuan kadar protein, dan produksi β-galaktosidase adalah mikropipet, tabung reaksi, erlenmeyer, termometer, neraca analitik, vorteks, penangas air Memmert, penangas es, stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet, spektrofotometer UV-Vis 1700 Shimadzu, inkubator Isuzu, botol sentrifus, High Speed Refrigerated Centrifuge 6500 KUBOTA, dan sonikator Eyela. Alat-alat yang digunakan untuk purifikasi enzim adalah kolom kromatografi, kolektor fraksi, dan ruang pendingin. Alat
18
yang digunakan untuk amobilisasi dan aplikasi β-galaktosidase pada susu UHT adalah pengaduk bermagnet, syringe, dan penangas bergoyang.
Metode Penelitian
Penentuan Waktu Produksi β-Galaktosidase Optimum Sebanyak 2% inokulum bakteri Enterobacter cloacae dengan kerapatan optik 0,7 diinokulasi ke dalam 300 ml media kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC. Sampling dilakukan setiap 6 jam dalam dua hari pada hari ke-0 hingga hari ke-2 sebanyak 15 ml. Jumlah bakteri diukur pada panjang gelombang 600 nm kemudian sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (15.880 g) selama 10 menit pada suhu 4ºC. Pelet yang diperoleh dicuci dengan bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC. Peletnya dilarutkan dalam 1 ml bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian dilakukan pemecahan sel dengan glass bead selama 5 menit. Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas βgalaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009).
Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997) Sebanyak 2% inokulum E. cloacae dengan kerapatan optik 0,7 setara dengan 1,40×1010 sel/ml diinokulasikan ke dalam 1.000 ml media produksi yang telah steril, diinkubasi pada suhu 37°C. Sel dipanen pada waktu fermentasi yang menunjukkan waktu produksi β-galatosidase optimum. Setelah fermentasi selesai, cairan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Peletnya dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan bufer fosfat 0,05 M pH 6,5. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian dilakukan pemecahan sel dengan sonikator 50 kHz selama 10 menit pada suhu 4°C. Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar βgalaktosidase.
19
Purifikasi β-Galaktosidase Pengendapaan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1993). Pengendapan enzim dilakukan dengan membuat fraksi pengendapan amonium sulfat 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, dan 70% secara bertahap. Ekstrak kasar β-galaktosidase diendapkan dengan amonium sulfat dengan cara ekstrak kasar ditambahkan dengan amonium sulfat secara bertahap hingga konsentrasi 10% lalu diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 60 rpm selama 20 menit pada suhu 4ºC. Setelah itu campuran didiamkan selama 1 jam pada suhu 4ºC. Selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4ºC. Endapan enzim dipisahkan dan dilarutkan dalam bufer fosfat 0,05 M
pH 6,5 kemudian diukur aktivitas β-galaktosidase dan kadar
protein. Supernatan ditambahkan amonium sulfat kembali seperti prosedur diatas untuk fraksi pengendapan selanjutnya. Jumlah amonium sulfat (gram) yang digunakan untuk melarutkan 1 liter larutan enzim menggunakan rumus dibawah ini dengan S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat sedangkan S2 merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat. Angka 533 menunjukkan bahwa untuk membuat larutan jenuh 100% dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per liter. Aktivitas spesifik β-galaktosidase yang tertinggi menunjukan persentase kejenuhan amonium sulfat yang optimum dan selanjutnya digunakan dalam tahap purifikasi berikutnya. 533 (S2 - S1)
Jumlah amonium sulfat (gram/liter) =
100 - 0,3S2
Dialisis. Potongan membran selofan dibasahi dan direbus dengan natrium bikarbonat 10 mM selama 10 menit. Selanjutnya membran selofan ditiriskan dan direbus kembali dengan Na2EDTA 10 mM selama 10 menit. Membran selofan dicuci beberapa kali dengan akuades. Salah satu ujung membran selofan diikat dan enzim dimasukkan ke dalam kantung dialisis. Kantung dialisis dimasukkan ke dalam bufer fosfat 0,01 M pH 6,5 sambil digoyang dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm. Dialisis dilakukan pada suhu 4°C selama 24 jam. Kromatografi Filtrasi Gel (Rao & Dutta modifikasi 1981). Matriks Superdex 200 dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang berdiameter 2,5 cm dan tinggi 100 cm, pada bagian dasar kolom diberi glasswool sebagai penahan.
20
Volume enzim yang dimasukkan adalah 1 ml. Matriks dielusi dengan bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 dengan kecepatan elusi 0,2 ml/menit. Volume fraksi yang ditampung masing-masing sebanyak 3 ml. Fraksi eluen yang ditampung dalam tabung diukur aktivitas enzim β-galaktosidase dan kadar protein. Kadar protein diukur dengan mengukur eluen pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. A280 merupakan panjang gelombang yang menyerap protein, A260 merupakan panjang gelombang yang menyerap asam nukleat, 1,55 adalah koefisien serapan maksimum dari protein, dan 0,76 adalah koefisien serapan maksimum dari asam nukleat (Boyer 2002). Grafik profil elusi dibuat dengan memplotkan sumbu X berupa nomor fraksi dan sumbu Y berupa nilai kadar protein dan nilai aktivitas βgalaktosidase. Konsentrasi Protein (mg/ml) = 1,55 A280 – 0,76 A260 Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009). Uji aktivitas β-galatosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1.000 µl bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu 35°C selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl onitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) 2 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 35°C selama 10 menit. Pada menit ke-10 ditambahkan 1.000 µl Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV VIS pada panjang gelombang 420 nm. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara membuat berbagai konsentrasi oNP dari 0-0,500 µmol dengan selang 0,010 µmol yang dilarutkan dalam bufer fosfat 0,01 M pH 7. Sebanyak 1.000 µl bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 200 µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 35°C selama 10 menit. Selanjutnya campuran ditambahkan 1.000 µl Na2 CO3 1 M. Larutan divorteks dan intensitas warna kuning yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galatosidase sampel akan diplotkan pada hasil kurva standar. Satu unit aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari substrat oNPGal permenit pada kondisi percobaan.
21
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976). Enzim β-galaktosidase sebanyak 20 µl ditambahkan 1 ml pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan adalah bovine serum albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dari 0,05-1,25 mg/ml dengan selang 0,05 mg/ml serta perlakuan yang sama dengan penentuan kadar protein.
Karakterisasi Enzim β-Galaktosidase Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan substrat selama 10 menit pada berbagai suhu antara 25-50ºC dengan selang 5ºC (Lu et al. modifikasi 2009). Aktivitas β-galaktosidase dihitung dengan mengukur oNP yang terbentuk. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan larutan enzim pada berbagai suhu (25-50ºC dengan selang 5ºC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es. Selanjutnya aktivitas enzim tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis β-galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009). Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan substrat pada suhu 35ºC selama 10 menit (Lu et al. modifikasi 2009) pada berbagai kondisi pH larutan bufer (pH 5,5-8,0 dengan selang 0.5 unit). Aktivitas β-galaktosidase dihitung dengan mengukur oNP yang terbentuk. Stabilitas enzim terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim dalam 0,1 M larutan bufer berbagai pH (5,5-8,0 dengan selang 0.5 unit) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, dengan cepat diuji aktivitas enzim β-galaktosidase tersisanya pada kondisi optimum reaksi enzim β-galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009). Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Bufer yang digunakan yaitu bufer asetat (pH 5,5-6.0) dan bufer fosfat (pH 6,5-8,0).
22
Pengaruh logam kation terhadap aktivitas β-galaktosidase. Pengaruh kation terhadap aktivitas β-galaktosidase diuji dengan cara menambahkan kation (konsentrasi 0,01 M) ke dalam campuran substrat-bufer-enzim, dan diinkubasikan pada kondisi optimal reaksi enzimatis (Lu et al. modifikasi 2009). Penghambatan atau peningkatan aktivitas β-galaktosidase oleh kation dinyatakan dalam persentase aktivitas β-galaktosidase dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa penambahan kation logam). Kation yang ditambahkan dalam bentuk larutan CaCl2, CoCl2, ZnSO4, CuCl2, MnCl2, HgCl2, dan MgSO4. Penentuan parameter kinetik. Sebanyak 1.000 µl bufer fosfat 0,1 M pH optimum, 100 µl enzim, dan substrat oNPGal berbagai konsentrasi (0,01-5 mg/ml dengan selang 0,5 mg/ml) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Campuran diinkubasi selama 25 menit pada suhu optimum reaksi enzimatis. Setiap 5 menit sekali campuran diangkat dan ditambahkan 1.000 µl Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV VIS pada panjang gelombang 420 nm. Grafik dibuat dengan memplotkan hubungan antara waktu (sumbu X) dan kadar oNP yang terbentuk (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk menentukan nilai KM dan Vmaks. Grafik Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan produk persatuan waktu.
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae dan β-Galaktosidase Optimasi Konsentrasi Alginat dan Jumlah Sel untuk Amobilisasi Sel (Becerra et al. modifikasi 2001). Sebelum melakukan amobilisasi sel E.cloacae, penentuan konsentrasi alginat dan sel optimum terlebih dahulu dilakukan dengan menggunakan variasi natrium alginat steril 4%, 5%, dan 6% serta variasi bobot sel sebanyak 10%, 20%, dan 40% (b/v). Variasi butiran gel yang diperoleh kemudian diinkubasikan pada substrat o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) selama 1 jam pada suhu 37°C. Formula konsentrasi alginat dan bobot sel yang menghasilkan aktivitas pembentukan produk yang paling tinggi merupakan komposisi optimum yang digunakan untuk amobilisasi sel.
23
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Enzim (Haider dan Husain modifikasi 2007). Sebelum melakukan amobilisasi enzim, penentuan konsentrasi alginat optimum terlebih dahulu dilakukan dengan menggunakan variasi natrium alginat steril 4%, 5%, dan 6% serta enzim β-galaktosidase 10% (v/v). Variasi butiran gel yang diperoleh kemudian diinkubasikan pada substrat onitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) selama 24 jam. Konsentrasi alginat yang menghasilkan aktivitas pembentukan produk yang paling tinggi merupakan konsentrasi optimum alginat yang digunakan untuk amobilisasi enzim.
Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae dan β-Galaktosidase Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae (Becerra et al. modifikasi 2001). Sel E. cloacae hasil pemanen jam ke-18 ditambahkan ke dalam natrium alginat steril. Butiran gel yang dibuat dengan meneteskan suspensi sel dalam natrium alginat dengan syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 0,2 M steril sambil diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm selama proses pembentukkan butiran gel. Butiran gel yang sudah terbentuk dibiarkan selama 2 jam dalam larutan CaCl2 0,2 M pada suhu 4ºC supaya gel yang terbentuk lebih mengeras. Selanjutnya butiran gel disaring dengan kertas saring steril kemudian dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril untuk dicuci dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Pencucian dengan akuades steril bertujuan untuk menghilangkan larutan kalsium klorida yang masih menempel pada butiran gel dan sel yang tidak terjebak oleh natrium alginat. Butiran gel yang telah dicuci diaplikasikan untuk menurunkan kadar laktosa pada susu UHT. Amobilisasi Enzim β-Galaktosidase (Haider & Husain modifikasi 2007). Enzim β-galaktosidase hasil kromatografi filtasi gel ditambahkan ke dalam natrium alginat steril (konsentrasi optimum). Butiran gel yang dibuat dengan meneteskan suspensi dengan syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 0,2 M steril sambil diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm selama proses pembentukkan butiran gel. Butiran gel yang sudah terbentuk dibiarkan selama 2 jam dalam larutan kalsium klorida. Setelah 2 jam, butiran gel disaring dengan kertas saring steril kemudian dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril
24
untuk dicuci dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Butiran gel yang telah dicuci diaplikasikan untuk menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.
Aplikasi β-Galaktosidase pada Susu UHT Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT (Haider & Husein modifikasi 2007). Sel amobil, sel bebas, β-galaktosidase amobil, dan β-galaktosidase hasil kromatografi filtrasi gel masing-masing dimasukkan ke dalam susu UHT dengan perbadingan susu UHT dan butiran gel adalah 1:1 (v/v). Sampel diinkubasi goyang dengan kecepatan 100 rpm pada suhu optimum selama 24 jam. Setiap 3 jam dilakukan pengambilan sampel sebanyak 250 µl. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase). Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil. Sel amobil dan enzim amobil masing-masing dimasukan ke dalam susu UHT. Sampel diinkubasi goyang pada suhu 37°C untuk sel amobil dan 40°C untuk enzim amobil. Pengambilan sampel setelah waktu optimasi amobilisasi sel dan amobilisasi enzim. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD. Analisis Laktosa Menggunakan Kit Enzimatik GOD-POD. Sampel diambil sebanyak 10 µl kemudian ditambahkan 1 ml reagen GOD-POD kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 505 nm. Absorbansi yang diperoleh dibandingkan dengan absorbansi standar glukosa 100 mg/dL. Jumlah laktosa yang terhidrolisis setara dengan jumlah glukosa yang terbentuk pada kondisi percobaan.
Analisis Statistika Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini dilakukan dengan tiga kali ulangan. Model linier (Matjik & Sumertajaya 2002) yang digunakan adalah: Yij = µ + λi + βj+ εij
25
Keterangan: : pengaruh rataan umum; λi: pengaruh hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase pada jam ke-i; βj: pengaruh ulangan ke-j; ij: pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j; i= jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, dan 24; j = 1, 2, 3. Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data dilakukan dengan program SPSS 10.0. Jika hasil uji berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN Waktu Optimum Produksi β-Galaktosidase Kultur Enterobacter cloacae ditumbuhkan pada media yang mengandung substrat laktosa 2% yang berperan sebagai energi, karbon, dan induser enzim βgalaktosidase.
Keberadaan suatu substrat tertentu dapat
memicu suatu
mikroorganisme untuk mensekresi metabolit selnya. Pepton dan ekstrak khamir sebagai sumber karbon, asam amino, nitrogen, dan vitamin. NaCl berperan sebagai sumber mineral yang digunakan untuk metabolisme. Nutrisi-nutrisi tersebut dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri, berkembang biak, dan menghasilkan enzim yang diinginkan. Pertumbuhan sel perlu diamati untuk mengetahui sel yang telah diinokulasi dapat tumbuh di dalam media pertumbuhan. Tujuan lain dari pengamatan tersebut adalah untuk mengamati pola pertumbuhan dari mikrob tersebut. Prinsip dari penelitian ini adalah media tumbuh (cair) yang sudah diinokulasi sel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm setiap interval waktu tertentu. Penentuan waktu produksi optimum berdasarkan aktivitas enzim βgalaktosidase tertinggi. Satu unit aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari substrat oNPGal permenit pada kondisi percobaan. Gambar 5 menunjukan bahwa aktivitas enzim tersebut dari jam ke-12 hingga jam ke-24 mengalami peningkatan hingga 3,712 U/ml dan akan mengalami penurunan pada jam ke-30 hingga jam ke-48. Penurunan aktivitas enzim ini disebabkan telah terbentuknya produk berupa glukosa atau galaktosa. Menurut Mahoney (2004), glukosa dan galaktosa ini akan menghambat kerja β-galaktosidase dalam menghidrolisis substrat laktosa. Pemanenan sel E. cloacae dilakukan pada waktu produksi β-galaktosidase optimum yaitu pada jam ke-24 dengan aktivitas sebesar 3,712 U/ml. Selain itu, bakteri tersebut menghasilkan β-galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam ke-24 dengan nilai OD berkisar 1,849 atau setara 3,70×1010 sel/ml (Lampiran 6). Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju yang konstan, masa menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolik yang konstan, dan menghasilkan enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1988).
27
Bobot basah dan bobot kering sel perlu diamati untuk menyeragamkan sel yang digunakan untuk fermentasi. Berdasarkan penelitian yang dilakukan, didapatkan bobot basah sel sebesar 0,558 g/50 ml media setelah 24 jam masa inkubasi pada suhu 37°C. Hasil ini diikuti dengan didapatnya bobot kering sel sebesar 0,066 g/50 ml media dan mempunyai jumlah sel sebanyak 3,70×1010 sel/ml.
Gambar 5 Kurva pertumbuhan E.cloacae (■) dan kurva produksi β-galaktosidase (♦). Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase Produksi β-galaktosidase dari E.cloacae dilakukan pada media cair yang mengandung 2% laktosa lalu diinkubasi berdasarkan penentuan waktu produksi optimum yaitu pada suhu 37°C selama 24 jam tanpa pengocokan. Hal ini disebabkan bakteri tersebut bersifat anaerobik fakultatif. Pemanenan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C, untuk mencegah kerusakan enzim. Dengan demikian, sel yang berbobot molekul lebih besar dari larutan media akan mengendap karena gaya gravitasi. Sel yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer fosfat 0,05 M pH 6,5 agar terbebas dari pengotor yang berasal dari media. Selanjutnya sel mengalami pemecahan sel dengan metode sonikasi. Metode ini bertujuan untuk memecah dinding sel dengan frekuensi gelombang suara yang tinggi. Sel dipecah di dalam buffer fosfat 0,05 M pH 6,5 pada suhu 4°C agar enzim tidak rusak. Sel dipisahkan dari ekstrak enzim dengan sentrifugasi. Menurut Lu et al. (2009), enzim βgalaktosidase pada bakteri E. cloacae merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan dinding sel.
28
H2O
β-Galaktosidase oNPGal (tidak berwarna)
Galaktosa
oNP (kuning)
Gambar 6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase (Miller 1972). Metode analisis aktivitas β-galaktosidase pada penelitian ini menggunakan substrat o-nitrofenil-β-galaktopiranosida (oNPGal). Dalam keadaan normal, oNPGal tidak berwarna. Ketika β-galaktosidase menghidrolisis oNPGal maka akan menghasilkan galaktosa dan o-nitrofenol (oNP). Reaksi ini dihentikan dengan penambahan Na2CO3 sehingga pH di dalam larutan menjadi basa sekitar pH 10-11. Pada pH tersebut oNP akan berubah menjadi bentuk anionik yang berwarna kuning dan β-galaktosidase menjadi inaktif (Gambar 6). Jumlah oNP sebanding dengan jumlah β-galaktosidase yang bereaksi sehingga intensitas warna kuning yang dihasilkan dari oNP dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi enzim. Jumlah oNP yang terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada λ = 420 nm (Miller 1972). Berdasarkan hasil percobaan, aktivitas spesifik enzim β-galaktosidase kasar yang diperoleh sebesar 3,364 U/mg (Tabel 3). Setelah didapatkan enzim kasar, proses purifikasi selanjutnya adalah dengan pengendapan menggunakan garam amonium sulfat. Pengendapan protein pada tahap awal pemurnian berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim dan memisahkan protein target dari sebagian kontaminan yang tidak dikehendaki. Terjadinya pengendapan protein pada saat penambahan garam amonium sulfat dikarenakan terjadinya netralisasi muatan pada permukaan protein enzim, pengurangan aktivitas kimia protein dan pengurangan konsentrasi efektif air oleh garam amonium sulfat. Konsentrasi garam yang diperlukan agar terjadi pengendapan suatu protein berhubungan dengan jumlah dan distribusi residu bermuatan dan residu polar ionik pada permukaan protein, jumlah dan distribusi residu hidrofobik yang terekspos pada permukaan protein serta ukuran dan bentuk protein (Scopes 1993). Proses pengendapan dengan amonium sulfat dilakukan dalam suasana dingin agar tidak terjadi peningkatan suhu karena pembebasan energi selama penambahan amonium sulfat dan mencegah terjadinya denaturasi protein. Amonium sulfat ditambahkan
29
sedikit demi sedikit dengan kecepatan konstan agar konsentrasi amonium sulfat dapat merata dalam berinteraksi dengan enzim. Enzim β-galaktosidase diperoleh dengan cara sentrifugasi karena enzim akan mengendap. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 untuk menjaga stabilitas enzim. Pengendapan dilakukan dengan cara penambahan amonium sulfat dengan beberapa konsentrasi dimulai dari 10% hingga 70%. Gambar 7 menunjukan bahwa pengendapan enzim dengan amonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 30% dan 40% (Data pada Lampiran 7). Aktivitas spesifik βgalaktosidase akan menurun pada fraksi lebih dari 40% karena pada fraksi tersebut enzim yang terendapkan bukan enzim yang diinginkan sehingga aktivitas β-galaktosidase rendah sedangkan kadar protein tinggi. Oleh sebab itu fraksi enzim hasil semipurifikasi amonium sulfat 30-40% yang diperoleh aktivitas spesifik 22,804 U/mg. Aktivitas spesifik enzim hasil pengendapan dengan amonium sulfat lebih tinggi dibandingkan dengan enzim kasar karena konsentrasi protein yang diperoleh pada tahap semipurifikasi dengan amonium sulfat ini mempunyai konsentrasi yang lebih sedikit yaitu 6,524 mg protein (Tabel 3). Tingkat kemurnian presipitat pun meningkat dari 1 kali menjadi 6,78 kali. Sementara itu, rendemen β-galaktosidase pada tahap pengendapan dengan amonium sulfat yang diperoleh sebesar 8,21%.
Gambar 7 Aktivitas total (■) dan protein total (♦) hasil purifikasi dengan amonium sulfat.
30
Tabel 3 Purifikasi β-galaktosidase dari E.cloacae Total Total Aktivitas Rendemen Kemurnian Tahapan Aktivitas Protein Spesifik (%) (kali) (U) (mg) (U/mg) Enzim Kasar1 1812,057 538,645 3,364 100,00 1,00 Pengendapan amonium sulfat 148,781 6,524 22,804 8,21 6,78 30-40% Dialisis 126,868 2,026 62,609 7,00 18,61 Superdex 200 111,939 1,100 101,781 6,18 30,26 1
Berasal dari 8 gram bobot basah pelet sel E.cloacae
Tahap purifikasi selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses pemisahan molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh membran semipermeabel serta proses yang terjadi adalah difusi dan osmosis. Pada proses ini, kantong dialisis selofan yang digunakan adalah membran selofan dengan MWCO (molecular weight cut-off) 10 kD. Tujuannya agar molekulmolekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti ion logam, inhibitor, peptida kecil, dan lainnya akan keluar dari membran tersebut sedangkan molekul besar dan mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam membran seperti β-galaktosidase. Pada tahap dialisis ini total aktivitas yang diperoleh adalah 126,868 U dan kadar protein 2,026 mg sehingga aktivitas spesifiknya meningkat hingga 62,609 U/mg. Rendemen yang dihasilkan sekitar 7,00% dan kemurniannya meningkat hingga 18,61 kali (Tabel 3). Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran molekulnya. Saat sampel diaplikasikan ke dalam kolom maka partikel dengan ukuran besar akan bergerak turun lebih cepat dari partikel yang berukuran kecil karena partikel besar dapat bergerak turun tanpa melalui pori-pori gel. Sementara itu, partikel yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori gel sehingga mengalami hambatan untuk sampai ke ujung kolom bagian bawah. Profil elusi filtrasi gel menggunakan Superdex 200 (Gambar 8) memperlihatkan adanya satu puncak protein utama yang terelusi pada fraksi 7 hingga fraksi 20. Rendahnya aktivitas β-galaktosidase pada puncak protein menunjukkan bahwa pada fraksi tersebut masih terdapat protein-protein lain yang memiliki bobot molekul yang besarnya relatif lebih kecil dibandingkan bobot molekul β-galaktosidase. Hasil
31
pengujian aktivitas β-galaktosidase menunjukkan adanya satu puncak aktivitas enzim dimana aktivitas yang tertinggi pada fraksi 12. Pada fraksi nomor 12 memiliki total aktivitas sebesar 111,939 U dan kadar protein 1,100 mg sehingga aktivitas spesifiknya sebesar 101,781 U/mg (Data pada Lampiran 8). Rendemen yang dihasilkan adalah 6,18% dan kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali. Aktivitas spesifik β-galaktosidase E. cloacae hasil purifikasi ini lebih besar jika dibandingkan dengan aktivitas spesifik dari Arthrobacter psychrolactophilus F2 yaitu 20,4 U/mg (Nakagawa et al. 2006). Tetapi hasil aktivitas spesifik βgalaktosidase dari penelitian ini lebih rendah jika dibandingkan Arthrobacter acidocaldarius sebesar 112,7 U/mg (Gul-Guven et al. 2007), Bacillus stearothermophilus sebesar 125 U/mg (Chen et al. 2008), dan Arthrobacter sp. HB7 sebesar 108,7 U/mg (Trimbur et al. 1994). Perbedaan aktivitas ini disebabkan perbedaan jumlah induser (laktosa) yang diberikan pada saat produksi enzim dan perbedaan perlakuan pada saat purifikasi enzim. Selain itu, ekspresi genetik β-galaktosidase yang berbeda dari berbagai mikroorganisme juga mempengaruhi perbedaan aktivitas spesifik enzim yang dihasilkan seperti pada Streptococcus themophilus LMD9 sebesar 464 U/mg (Rhimi et al. 2010) dan Lactobacillus acidophilus R22 sebesar 230 U/mg (Nguyen et al. 2002). Peningkatan aktivitas enzim β-galaktosidase dapat disebabkan akibat rekombinasi genetik seperti pada S. themophilus LMD9 dan L. acidophilus R22.
Gambar 8 Aktivitas total (■) dan protein total (♦) hasil purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200.
32
Karakterisasi β-Galaktosidase
Suhu Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim. Penentuan suhu optimum dan stabilitas suhu dilakukan pada rentang suhu 2550°C. Gambar 9 menunjukan aktivitas β-galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil meningkat hingga suhu 40°C. Sebelum suhu optimum, aktivitas enzim meningkat karena terjadi peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta rotasi enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk saling bertumbukan. Suhu yang lebih besar dari suhu optimum menyebabkan
protein
enzim
mengalami
perubahan
konformasi
yang
menyebabkan aktivitasnya berkurang. Selain itu, penurunan aktivitas enzim dikarenakan terputusnya ikatan sekunder enzim karena besarnya energi kinetik dari molekul enzim melebihi untuk mempertahankan ikatan sekunder. Ikatan sekunder yang terputus menyebabkan hilangnya struktur sekunder dan tersier enzim disertai berkurangnya atau hilangnya aktivitas enzim. Substrat juga dapat mengalami perubahan konformasi sehingga sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim pada suhu tinggi. Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase diperlihatkan pada Gambar 9. Aktivitas β-galaktosidase bebas maupun teramobil meningkat seiring meningkatnya suhu hingga mencapai 40ºC. Enzim β-galaktosidase bebas dan teramobil pada suhu 40ºC menunjukkan aktivitas tertinggi dengan nilai aktivitas masing-masing sebesar 17,620 U/ml dan 0,026 U/ml (Data pada Lampiran 9). Selanjutnya aktivitasnya akan menurun pada suhu 45ºC dan akan kehilangan aktivitasnya pada suhu 50ºC. Teknik amobilisasi enzim dengan penjebakan enzim menggunakan kasium alginat tidak mengubah suhu optimum dari enzim yang bersangkutan. Pada suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum, aktivitas relatif βgalaktosidase teramobil lebih besar dibandingkan aktivitas relatif β-galaktosidase bebas. Jika pada suhu 50°C, aktivitas relatif β-galaktosidase bebas hanya sebesar 0,95% tetapi aktivitas relatif β-galaktosidase teramobil masih bisa dipertahankan hingga 21,39%.
33
Gambar 9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas (♦) dan teramobil (■). Kestabilan suatu enzim bergantung pada ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, interaksi ion, dan jembatan disulfida. Kestabilan enzim terhadap panas dapat terjadi karena pelipatan asam amino penyusun protein membentuk konformasi tertentu yang tahan terhadap efek denaturasi akibat panas. Gambar 10a menunjukan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas. Enzim βgalaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran suhu 25-40°C karena masih menyisakan aktivitasnya diatas 50%. Selanjutnya mengalami penurunan pada suhu 45°C dan 50°C dengan menyisakan masingmasing 7,41% dan 2,42% dari aktivitasnya (Data pada Lampiran 9). Gambar
10b
menunjukkan
pengaruh
suhu
terhadap
stabilitas
β-
galaktosidase teramobil. Enzim β-galaktosidase teramobil relatif stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran suhu 25-40°C. Hal ini disebabkan pada kisaran suhu tersebut aktivitas β-galaktosidase masih dapat menyisakan aktivitasnya sekitar 60%. Selanjutnya mengalami penurunan pada suhu 45°C dan 50°C dengan menyisakan masing-masing 40,31% dan 14,86% dari aktivitasnya (Data pada Lampiran 9). Penurunan aktivitas pada enzim teramobil pada suhu 4550°C tidak terlalu signifikan karena penjebakan enzim di dalam kalsium alginat dapat meminimalkan protein enzim yang dapat terdenaturasi akibat peningkatan suhu karena enzim terlingkupi dalam suatu gel. Sebagai perbandingan, suhu optimum β-galaktosidase E. cloacae B5 sekitar 35°C dan enzim ini stabil pada suhu dibawah 30°C (Lu et al. 2009). Enzim β-
34
galaktosidase dari Streptococcus themophilus LMD9 mempunyai suhu optimum berkisar 25-40°C (Rhimi et al. 2010), Lactobacillus bulgaricus berkisar 35-50°C (Rhimi et al. 2009), dan Kluyveromyces lactis adalah 40°C (Kim et al. 2003).
(a)
(b) Gambar 10
Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas βgalaktosidase bebas (a) dan teramobil (b). Enzim β-galaktosidase diinkubasi pada berbagai suhu selama 1 jam, selanjutnya aktivitas β-galaktosidase diuji pada kondisi pH dan suhu optimum.
pH Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase diuji dengan menggunakan 2 jenis bufer yaitu bufer asetat (pH 5,5-6.0) dan bufer fosfat (pH 6,5-8,0). Gambar 11 menunjukkan β-galaktosidase bebas dan teramobil mempunyai aktivitas tertinggi pada pH 7,0 dengan masing-masing aktivitasnya 18,181 U/ml dan 0,025 U/ml (Data pada Lampiran 10). Selanjutnya aktivitas βgalaktosidase menurun seiring dengan penigkatan pH. Aktivitas relatif enzim βgalaktosidase bebas pada kondisi mendekati pH 7,0 meningkat dari 26,87%
35
menjadi 100%. Selain itu, aktivitas relatif enzim β-galaktosidase teramobil mendekati pH 7,0 pun meningkat dari 31,20% menjadi 100%. Berdasarkan penelitian ini, pH optimum enzim bebas tidak berbeda dengan enzim teramobil sehingga menunjukan penjerapan enzim di dalam kalsium alginat tidak akan membuat perubahan pH yang dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari asamasam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH larutan yang tidak terlalu besar (sedikit dibawah atau diatas pH optimalnya) disebabkan oleh berubahnya keadaan ion enzim dan seringkali juga keadaan ion substrat. Perubahan kondisi ion enzim dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi katalitik mengikat substrat maupun pada residu asam amino yang berfungsi untuk mempertahankan struktur tersier dan kuartener enzim yang aktif. Aktivitas enzim yang mengalami penurunan tersebut dapat dipulihkan kembali dengan merubah kondisi reaksi enzimatis pada pH optimalnya. Pada pH tertentu perubahan muatan ion pada rantai samping yang dapat terionisasi dari residu asam amino enzim menjadi terlalu besar sehingga mengakibatkan terjadinya denaturasi enzim yang disertai dengan hilangnya aktivitas katalitik enzim. Disamping itu, perubahan struktur tersier menyebabkan kelompok hidrofobik (yang pada mulanya tersembunyi dibagian dalam molekul enzim) kontak dengan air sehingga solubilitas enzim menjadi berkurang. Berkurangnya solubilitas enzim dapat mengakibatkan turunnya aktivitas enzim secara bertahap (Palmer 1991).
Gambar 11 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas (♦) dan teramobil (■).
36
(a)
(b) Gambar 12 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b). Enzim β-galaktosidase diinkubasi pada berbagai pH selama 1 jam, selanjutnya aktivitas β-galaktosidase diuji pada kondisi pH dan suhu optimum. Kestabilan
enzim
berhubungan
dengan
ketahanan
enzim
dalam
mempertahankan konformasinya terhadap kondisi lingkungan sehingga tidak mengubah kedudukan sisi aktif (Lehninger 2004). Pengaruh pH terhadap stabilitas enzim dimodifikasi oleh jenis dan konsentrasi bufer, ketersediaan substrat, kekuatan ion, dan konstanta dielektrik medium (dipengaruhi oleh penambahan pelarut organik), efek kofaktor, dan aktivator. Gambar 12a menunjukan pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas. Enzim β-galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran pH 5,5-8,0 karena masih
37
menyisakan aktivitasnya diatas 60% (Data pada Lampiran 10). Gambar 12b juga memperlihatkan β-galaktosidase juga relatif stabil pada kisaran pH 5,5-8,0 (Data Lampiran 10). Aktivitas β-galaktosidase relatif stabil pada kisaran pH tersebut artinya ion-ion hidrogen tidak banyak mempengaruhi gugus-gugus fungsional enzim pada kisaran pH 5,5-8,0 sehingga konformasi enzim tetap terjaga. Selain itu, penjerapan dengan kalsium alginat tidak membuat perubahan terhadap kestabilan enzim terhadap pH yang dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Sebagai perbandingan, β-galaktosidase dari E. cloacae B5 aktif dan stabil pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et al. 2009). Enzim β-galaktosidase dari Streptococcus themophilus LMD9 stabil pada kisaran pH 6,5-7,5 (Rhimi et al. 2010), dan Kluyveromyces lactis berkisar pada pH 7,0 (Kim et al. 2003). Szczodiak (2000) menyatakan β-galaktosidase yang dapat digunakan untuk biokonverter laktosa pada susu harus dapat aktif pada pH 6,7-6,8 dan biokonverter pada whey dapat aktif pada pH 5,5-6,0. Berdasarkan penelitian ini, βgalaktosidase dari E. cloacae mempunyai kisaran pH yang luas sehingga enzim ini dapat digunakan untuk aplikasi biokonverter laktosa untuk produk susu.
Aktivator dan Inhibitor Ikatan inhibitor atau aktivator dengan enzim dapat mengubah kemampuan enzim dalam mengikat substrat sehingga dapat mengubah daya katalisisnya. Interaksi ion dengan residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif dapat mengakibatkan berubahnya afinitas enzim terhadap substrat yaitu dapat meningkatkan atau menurunkan afinitas terhadap substrat. Interaksi ion dengan residu asam amino yang mempertahankan konformasi aktif enzim mengakibatkan berubahnya konformasi enzim menjadi lebih aktif atau nonaktif. Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor kuat β-galaktosidase dari E. cloacae karena dapat menurunkan aktivitas sebesar 99,15% dan 89,09% dari kontrol enzim yang tidak diberikan perlakuan penambahan kation (Gambar 13). Hal ini disebabkan Hg2+ dan Cu2+ merupakan logam berat yang dapat membentuk endapan logam proteinat dengan ikatan yang terbentuk sangat kuat sehingga akan memutuskan jembatan
38
disulfida sehingga protein mengalami denaturasi. Kation Ca2+ dan Zn2+ menghambat aktivitas β-galaktosidase sebesar 5,45% dan 10,85% terhadap kontrolnya. Berbeda dengan kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ yang merupakan aktivator bagi β-galaktosidase dari E. cloacae karena aktivitasnya akan meningkat 5,01%, 32,24%, dan 20,99% dari aktivitas kontrolnya (Data pada Lampiran 11). Logam Mg2+ berperan sebagai penstabil reaksi katalisis β-galaktosidase dan substrat karena Mg2+ berikatan dengan nukleofili Glu 537 sehingga sisi aktif terstabilkan dan lebih memudahkan reaksi antara enzim dan substrat (Matthews 2005). Lu et al. (2010) menyatakan bahwa kation Hg2+, Cu2+, dan Ag2+ bersifat sebagai inhibitor kuat terhadap β-galaktosidase yang berasal dari E.cloacae B5. Kation Co2+, Mg2+, Mn2+, DTT, EDTA, dan imidazol tidak berefek terhadap aktivitas β-galaktosidase dari E.cloacae B5. Selain itu, kation Zn2+ dan SDS menghambat secara parsial terhadap aktivitas enzim dengan masing-masing nilai penghambatannya 82% dan 51%.
Kontrol
Ca2+
Co2+
Zn2+ Cu2+ Kation
Mn2+
Hg2+
Mg2+
Gambar 13 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari E. cloacae.
Parameter Kinetik Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan reaksi amat rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini dilampaui, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan bertambahnya konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004). Penentuan nilai KM dan vmaks
39
secara lebih tepat dan mudah dilakukan pemetaan data dengan memanfaatkan transformasi aljabar persamaan Lineweaver Burk (Gambar 14). Persamaan Lineweaver Burk untuk β-galaktosidase bebas dari E. cloacae adalah y = 0,663x + 1,526 dengan nilai r2 sebesar 0,986 sehingga kecepatan maksimum aktivitas βgalaktosidase sebesar 0,655 µmol/menit dan nilai KM sebesar 0,434 mM. Pada βgalaktosidase teramobil, peningkatan konsentrasi substrat juga meningkatkan kecepatan reaksi. Persamaan Lineweaver Burk untuk β-galaktosidase teramobil adalah y = 176,465x + 86,787 dengan nilai r2 sebesar 0,943 sehingga kecepatan maksimumnya sebesar 0,012 µmol/menit dengan nilai KM sebesar 2,068 mM (Data pada Lampiran 12).
(a)
(b) Gambar 14
Kurva Lineweaver Burk dari β-galaktosidase bebas (a) dan βgalaktosidase teramobil (b).
40
Semakin rendah nilai KM maka semakin kuat ikatan antara enzim dan substrat. Dengan mengetahui nilai KM dan vmaks maka kecepatan reaksi suatu enzim pada setiap konsentrasi substrat dapat dihitung. Selain itu, dengan mengetahui nilai KM dapat mengetahui enzim tersebut berikatan kuat dengan substrat atau ikatannya lemah, yang berarti dapat diketahui kesesuaian enzim dengan substrat yang diberikan (Winarno 1999). Berdasarkan nilai diatas, nilai KM enzim β-galaktosidase bebas dari E. cloacae lebih kecil dibandingkan nilai KM dari
β-galaktosidase teramobil sehingga β-galaktosidase bebas lebih kuat
mengikat substrat daripada β-galaktosidase yang teramobil. Nilai KM yang rendah ini, menyebabkan energi yang diperlukan untuk memulai terjadinya reaksi enzimatik lebih sedikit sehingga reaksi lebih mudah terjadi. Nilai KM dari β-galaktosidase teramobil lebih tinggi dibandingkan KM dari β-galaktosidase bebas tetapi vmaks β-galaktosidase teramobil lebih rendah dibandingkan vmaks dari
β-galaktosidase bebas. Keadaan ini disebabkan
perubahan konformasi pada molekul enzim yang terjerap di dalam butiran kalsium alginat sehingga menurunkan daya gabung antara enzim dengan substrat. Kecepatan reaksi enzim teramobil pun sangat rendah akibat adanya pengaruh difusi substrat yang cukup lama agar dapat berinteraksi dengan enzim karena harus melalui butiran kalsium alginat sebelum bereaksi dengan sisi aktif enzim. Sebagai perbandingan, KM dan vmaks dari enzim β-galaktosidase dari E. cloacae B5 adalah 0,01 mM dan 2 mM/menit (Lu et al. 2009). Nilai tersebut berimplikasi bahwa enzim β-galaktosidase dari E. cloacae B5 lebih tinggi afinitasnya dibandingkan β-galaktosidase dari E. cloacae yang dihasilkan dalam percobaan ini. Hal ini disebabkan adanya perbedaan tahapan pada proses purifikasi enzim.
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae Campuran sel atau enzim dengan natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen yaitu kalsium klorida akan membentuk reaksi antara alginat dan kation multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh adanya ion kalsium tetapi tidak menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan tekanan osmotik yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi kalsium alginat dalam bentuk
41
butiran gel. Reaksi tersebut akan menjebak sel dengan bentuk butiran gel berukuran pori antara 5-200 nm (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi yang dapat meningkatkan kestabilan kimia butiran tanpa membatasi transfer masa Pada penelitian ini variasi alginat yang digunakan adalah 4, 5, dan 6% (b/v). Pada konsentrasi alginat dibawah 4%, butiran gel alginat agak rapuh sehingga dapat menyebabkan kebocoran pada saat proses pemakaian Pada konsentrasi alginat diatas 6%, butiran gel yang terbentuk terlalu padat sehingga menyulitkan difusi substrat. Variasi konsentrasi alginat dan bobot sel yang digunakan untuk amobilisasi merupakan hal yang peting untuk memperoleh aktivitas optimum. Pemilihan konsentrasi alginat dan bobot sel dilakukan untuk mendapatkan variasi formula yang dapat menjerap sel bakteri dengan baik tanpa mengurangi kemampuan sel dalam menghasilkan β-galaktosidase. Interaksi antara berbagai variasi bobot sel dan konsentrasi alginat menghasilkan produk oNP yang signifikan berbeda (α=0,05) antar berbagai variasi yang digunakan (Data pada Lampiran 13). Berdasarkan berbagai variasi yang dilakukan, terdapat 3 variasi yang menghasilkan produk oNP yang tertinggi adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5%; bobot sel 20% (b/v) dan alginat 6%; serta bobot sel 40% (b/v) dan alginat 6% (Gambar 15). Dari ketiga variasi tersebut, aktivitas β-galaktosidase sel E. cloacae teramobil yang mempunyai aktivitas terbesar dengan variasi bobot sel 40% (b/v) dan alginat 6% dengan produk yang dihasilkan sebesar 0,946 µmol. Setelah dilakukan dengan uji lanjut Duncan (α=0,05), variasi tersebut berbeda nyata dengan variasi bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% dengan produk oNP sebesar 0,898 µmol setelah 1 jam inkubasi pada suhu 37°C. 0,946 f
0,898 e
Sel 40%, alginat 6%
Sel 10%, alginat 5%
0,893 e
Sel 20%, alginat
Variasi Komposisi
Gambar 15 Variasi optimum penentuan sel amobil. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
42
Pada penelitian ini, variasi yang dipilih untuk amobilisasi sel adalah variasi bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5%. Hal ini disebabkan sel yang dipakai lebih sedikit sehingga lebih efisien. Selain itu, konsentrasi alginat yang dipakai tidak terlalu tinggi menyebabkan pori-pori yang terbentuk tidak terlalu kecil sehingga substrat dan nutrien tidak sulit masuk ke dalam gel. Pada variasi alginat 5% (b/v), penggunaan bobot sel 20% dan 40% (b/v) menghasilkan aktivitas pembentukan produk oNP yang rendah. Hal ini terjadi karena pada waktu butiran gel dicuci dengan akuades steril, banyak sel bakteri yang tidak terjerap akan ikut terbilas. Pencucian ini akan membuat sel yang teramobilisasi hanya sebagian. Penggunaan konsentrasi alginat yang semakin tinggi (alginat 6% (b/v)) maka dapat menjerap sel yang lebih banyak. Penjerapan tersebut akan menurunkan viskositas alginat dan dapat meningkatkan porositas dari gel tersebut. Proses tersebut akan menyebabkan tingginya produk yang dihasilkan tetapi hal ini tidak efisien karena membutuhkan sel yang terlalu banyak.
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi β-Galaktosidase Variasi alginat yang digunakan untuk optimasi amobilisasi enzim βgalaktosidase dari E. cloacae adalah enzim terpurifikasi 10% (v/v) yang diamobilisasi dengan variasi konsentrasi alginat 4, 5, dan 6% (b/v) (Data pada Lampiran 14). Gambar 16 menunjukan produk yang dihasilkan dari berbagai konsentrasi alginat dengan konsentrasi produk dari enzim bebas sekitar 1,548 µmol setelah 24 jam inkubasi. Dari berbagai variasi tersebut, konsentrasi alginat 5% menghasilkan produk yang paling tinggi yaitu 1,009 µmol. Produk yang dihasilkan tersebut lebih tinggi dan berbeda nyata (α=0,05) dibandingkan produk yang dihasilkan dari variasi alginat 4% dan 6%. Konsentrasi alginat 6% hanya menghasilkan produk sebesar 0,760 µmol karena butiran gel yang terbentuk terlalu padat sehingga menyulitkan difusi substrat. Penggunaan konsentrasi alginat 4% menghasilkan produk yang rendah yaitu 0,560 µmol. Hal ini terjadi karena pada waktu butiran gel dicuci dengan akuades steril, banyak enzim yang tidak terjerat akan ikut terbilas, sehingga hanya sebagian enzim yang
43
teramobilisasi. Hasil penelitian ini sesuai dengan Haider dan Husain (2007) yang menyatakan bahwa konsentrasi alginat 5% merupakan konsentrasi alginat yang optimum untuk mengamobilisasi β-galaktosidase dari Aspergillus oryzae karena dapat meminimalkan kebocoran pada saat pemakain berulang dan pori-pori butiran gel yang terbentuk tidak terlalu kecil. 1,548 d 1,009 b 0,560 a
Alginat 4%
Alginat 5%
0,760 c
Alginat 6%
Enzim bebas
Variasi Alginat
Gambar 16 Produk yang dihasilkan pada penentuan optimasi amobilisasi enzim. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%. Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT Laktosa merupakan kompenen utama karbohidrat yang berada pada susu sekitar 4,8% (b/v). Jika laktosa pada susu dihidrolisis oleh β-galaktosidase maka akan menghasilkan glukosa dan galaktosa karena enzim tersebut menghidrolisis ikatan β-(1,4)-glikosidik dari laktosa sehingga akan meningkatkan kemanisan, kelarutan, serta mudah dicerna oleh penderita laktosa intoleran. Pada penelitian ini pengukuran hasil hidrolisis laktosa dengan menggunakan kit reagen glukosa GOD-POD. Glukosa yang terbentuk sebanding dengan laktosa yang dihidrolisis oleh β-galaktosidase. Glukosa yang terbentuk akan bereaksi dengan glukosa oksidase dengan bantuan air sehingga menghasilkan asam glukonat dan hidrogen peroksida.
Peroksidase
akan
mengoksidasi
hidrogen
peroksidase,
4-
aminofenazon, dan fenol sehingga akan menghasilkan 4-(p-benzokuinon monoimino)-fenazon yang berwarna merah muda dan air. Jumlah 4-(pbenzokuinon monoimino)-fenazon yang terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada λ = 505 nm (Sachnez-Manzanares et al. 1993). Kadar laktosa total pada susu UHT yang digunakan pada penelitian ini adalah 4,77% (b/v) Perlakuan hidrolisis laktosa pada susu UHT dengan sel bebas dan sel amobil dilakukan secara sistem batch selama 24 jam pada suhu 37°C. Selama 24 jam
44
dilakukan sampling setiap interval 3 jam dan dianalisis laktosa yang terhidrolisis (Data pada Lampiran 15). Hasil penelitian menunjukan aktivitas hidrolisis laktosa oleh sel E. cloacae bebas dan sel E. cloacae teramobil meningkat dari jam ke-0 hingga jam ke-18. Setelah jam ke-18, peningkatan hidrolisis laktosa tidak terlalu signifikan tetapi cenderung stasioner karena produk hasil hidrolisis laktosa yaitu glukosa dan galaktosa menghambat aktivitas β-galaktosidase atau bersifat feed back inhibition. Aktivitas hidrolisis laktosa relatif pada jam ke-18 oleh E. cloacae bebas sebesar 55,14% dari total laktosa yang berada di dalam susu UHT sedangkan aktivitas hidrolisis laktosa relatif oleh E. cloacae teramobil sebesar 22,01% (Gambar 17). Hidrolisis laktosa oleh sel amobil menghasilkan nilai optimum pada jam ke18 karena substrat berupa laktosa harus masuk ke dalam dinding sel bakteri. Proses tersebut terjadi karena β-galaktosidase dari E. cloacae bersifat intraseluler. Selain itu, sel bakteri yang teramobil menyebabkan lambatnya difusi substrat ke dalam butiran gel, sehingga kontak antara substrat dan sel bakteri menjadi lambat. Rendahnya nilai hidrolisis laktosa oleh sel teramobil juga dapat disebabkan diameter butiran gel yang terlalu besar yaitu 5 mm. Idris dan Suzana (2006) menyatakan diameter butiran gel optimum sebesar 2 mm karena semakin kecil diameter butiran gel menyebabkan semakin besarnya luas permukaan kontak, sehingga produk yang terbentuk pun semakin besar. Sel E. cloacae bebas yang diaplikasikan ke dalam susu UHT setelah 24 jam akan menyebabkan pecahnya emulsi susu. Bakteri ini merusak protein pada susu sehingga tidak bagus untuk diaplikasikan pada susu dalam keadaan bebas. Sel teramobil tidak membuat emulsi susu pecah karena sel E. cloacae terbatasi dengan butiran gel alginat sehingga tidak terjadi kebocoran sel. Perlakuan hidrolisis laktosa pada susu UHT dengan enzim bebas dan enzim amobil dilakukan secara sistem batch selama 24 jam pada suhu 40°C. Selama 24 jam dilakukan sampling setiap interval 3 jam dan dianalisis laktosa yang terhidrolisis (Data pada Lampiran 15). Hasil penelitian menunjukan aktivitas hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil meningkat dari jam ke-0 hingga jam ke-6. Aktivitas hidrolisis laktosa relatif pada jam ke-6 oleh β-galaktosidase bebas sebesar 77,99% dari total laktosa yang berada
45
di dalam susu UHT sedangkan aktivitas hidrolisis laktosa relatif oleh βgalaktosidase teramobil sebesar 28,09% (Gambar 17). Setelah jam ke-6, laju reaksi enzimatis tidak terlalu terjadi peningkatan laju reaksi enzimatis secara signifikan tetapi cenderung stasioner karena meningkatnya galaktosa yang bersifat inhibitor kompetitif dan glukosa yang bersifat inhibitor nonkompetitif untuk βgalaktosidase (Mahoney 2004). Haider dan Husein (2009) menyatakan 54% laktosa pada susu dapat dihidrolisis dengan 1000 U enzim β-galaktosidase Aspergillus oryzae teramobil setelah 3 jam pada suhu 32°C. Rhimi et al. (2010) menyatakan 1000 U βgalaktosidase teramobil Streptococcus thermophillus LMD9 menghidrolisis laktosa pada susu sebanyak 77% setelah 6 jam pada suhu 45°C. Pada penelitian ini, walaupun konsentrasi enzim yang digunakan hanya 37 U tetapi laktosa yang dapat dihidrolisis oleh enzim teramobil sebesar 28,09%. Peningkatan konsentrasi enzim perlu dilakukan untuk meningkatkan kelajuan hidrolisis laktosa pada susu. Aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT yang rendah juga dapat disebabkan efek ion-ion divalen yang berada pada susu yaitu Ca2+, Mg2+, dan Zn2+. Enzim β-galaktosidase dari E. cloacae dapat dihambat oleh Ca2+ dan Zn2+ tetapi Mg2+ bersifat sebagai aktivator. Guy dan Bingham (1978) menyatakan aktivitas β-galaktosidase dalam menghidrolisis laktosa pada susu dapat mengalami penurunan karena pengaruh logam yang berada pada susu, jumlah logam yang terdapat pada susu, dan kelarutan logam tersebut pada susu. Pada penelitian ini, kalsium yang terdapat pada susu UHT sebesar 265 mg, seng sebesar 1 mg, dan magnesium sebesar 31 mg. Meskipun dalam susu UHT terdapat magnesium, tetapi kuantitasnya lebih rendah dibandingkan kuantitas kalsium sehingga β-galaktosidase E. cloacae dapat dihambat aktivitasnya dalam mengidrolisis laktosa pada susu. Gambar 17 menunjukan perbandingan aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil dan sel teramobil. Aktivitas hidrolisis laktosa pada sel teramobil lebih lambat dibandingkan enzim teramobil karena membutuhkan waktu sekitar 18 jam. Substrat berupa laktosa tidak hanya harus melintasi butiran gel alginat tetapi harus masuk ke dalam dinding sel bakteri karena β-galaktosidase dari E. cloacae bersifat intraseluler. Hal ini berbeda dengan aktivitas hidrolisis dengan
46
enzim teramobil yang lebih cepat menghidrolisis yaitu 6 jam. Pada enzim teramobil, substrat hanya melintasi butiran gel lalu langsung berinteraksi dengan sisi aktif enzim. Dari kedua variasi tersebut, penggunaan enzim teramobil lebih efisien karena aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT lebih cepat dan tinggi dibandingkan dengan sel teramobil.
Gambar 17 Aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil (■) dan sel teramobil (♦). Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil Salah satu kelebihan penggunaan sel dan enzim teramobil adalah lebih mudah memisahkan produk yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, dan penggunaan kembali biokatalis. Setelah inkubasi pertama, sel teramobil dan enzim teramobil disaring dan dicuci dengan akuades steril untuk menghilangkan substrat dan produk yang mungkin terbawa. Selanjutnya butiran gel yang sudah bersih dimasukan ke dalam susu UHT baru dan diinkubasi kembali sesuai kondisi optimumnya. Pengulangan penggunaan butiran gel yang teramobilisasi dilakukan sebanyak 6 kali. Gambar 18a menunjukan aktivitas hidrolisis mengalami penurunan pada penggunaan enzim amobil berulang. Penggunaan enzim teramobil secara berulang mempunyai perbedaan aktivitas hidrolisis laktosa yang nyata dari pemakaian berulang pertama hingga kelima (α=0,05) (Data Lampiran 16). Penurunan aktivitas hidrolisis ulangan kelima terjadi hingga 78,89% dari aktivitas awalnya. Penggunaan butiran gel enzim teramobil pada ulangan kelima dan keenam tidak
47
berbeda nyata (α=0,05). Gambar 18b menunjukan aktivitas hidrolisis mengalami penurunan pada penggunaan sel teramobil berulang (Data Lampiran 16). Penggunaan sel teramobil secara berulang mempunyai perbedaan aktivitas hidrolisis laktosa nyata dari pemakaian berulang pertama hingga keempat (α=0,05). Penurunan aktivitas hidrolisis ulangan keempat terjadi hingga 75,49% dari aktivitas awalnya. Penurunan aktivitas hidrolisis ini disebabkan adanya lemak susu yang menempel pada butiran gel pada saat penggunaan berulang. Hal ini menyebabkan terhambatnya difusi substrat ke dalam butiran gel. 100,00 a 84,26 b
42,42 c 23,61 d 21,11 e 20,54 e
(a) 100,00 a
61,52 b 44,85 c 24,51 d 24,02 d
17,65 e
(b)
Gambar 17 Penggunaan berulang enzim teramobil (a) dan sel teramobil (b).
SIMPULAN Enterobacter cloacae menghasilkan β-galaktosidase optimum pada waktu inkubasi jam ke-24 dengan suhu 37°C. β-galaktosidase terpurifikasi dari E. cloacae menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 101,781 U/mg dengan rendemen 6,18% dan tingkat kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali dari enzim kasar yang diperoleh. Enzim β-galaktosidase bebas dan teramobil mempunyai aktivitas optimum pada suhu 40°C dan pH 7,0. Kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ merupakan aktivator bagi enzim tersebut sedangkan Ca2+, Zn2+, Cu2+, and Hg2+ bersifat sebagai inhibitor. Enzim β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil secara berturut-turut mempunyai KM sebesar 0,434 mM dan 2,068 mM. Variasi optimum untuk amobilisasi sel adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% (b/v). Variasi optimum untuk amobilisasi enzim adalah larutan enzim terpurifikasi 10% (v/v) dan alginat 5% (b/v). Aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT oleh βgalaktosidase teramobil lebih tinggi yaitu sebesar 28,09% setelah 6 jam dibandingkan dengan sel E. cloacae teramobil sebesar 22,01% setelah 18 jam. Enzim β-galaktosidase bebas mempunyai aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT lebih tinggi sebesar 78,20% setelah 6 jam dibandingkan sel E. cloacae bebas sebesar 55,14% setelah 18 jam.
SARAN Purifikasi untuk memperoleh β-galaktosidase murni dapat digunakan kromatografi afinitas. Formulasi variasi teknik amobilisasi enzim atau sel perlu dilakukan agar enzim amobil atau sel amobil dapat menghasilkan produk yang tinggi dan butiran gel yang lebih stabil.
DAFTAR PUSTAKA Beccera M, Baroli B, Fadda AM, Mendez JB, Siso MIG. 2001. Lactose bioconversion by calcium-alginate immobilization of Kluyveromyces lactis cells. Enzyme Microb Technol 29: 506-512. Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York: Wiley-Liss. Boyer R. 2000. Modern Experimental Biochemistry. San Fransisco: Adison Wesley Longman Inc. Boyer R. 2002. Concepts in Biochemistry. United States: Brook Cole. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254. Burvall A, Dahlqvist A. 1979. Oligosaccharides formation during hydrolysis of lactose with S. lactis lactase. Food Chem 4: 243-250. Campbell et al. 2005. The molecular basis of lactose intolerance. Sci Progress 88:157-202. Cao L. 2005. Carrier-bound Immobilized Enzymes. Weinheim: Wiley-VCH Verlag. Cesca et al. 1984. β-D-Galactosidase of Lactobacillus sp. J Microbiol 29: 288294. Chaplin M. 2004. The use of lactases in dairy industry. [terhubung berkala]. http://www. lsbu.ac.uk/biology/enztech/lactase.html. [10 Januari 2010]. Chen W, Chen H, Xia Y, Zhao J, Tian F, Zhang H. 2008. Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J. Dairy Sci 91: 1751-1758. Dixon M, Webb EC. 1978. Enzymes. New Yok: Academica Pr. Early R. 1998. Liquid milk and cream. Dalam: The Tecnology of Dairy Products. London: Blackie Academic & Professional. Euber JR, Brunner JR. 1979. Determination of lactose in milk products by high performance liquid chromatography. J Dairy Sci 62: 685-690. Fennema OR.1996. Food chemistry. Ed 3th. New York: Maicel Dekker. Fox PF, McSweeney PLH. 1981. Dairy Chemistry and Biochemistry. London: Blackie Academic and Professional.
50
Greenberg NA, Mahoney RR. 1983. Formation of oligosaccharides by βgalactosidase from Streptococcus thermophilus. Food Chem 10: 195-204. Gul-Guven R, Guven K, Poli A, Nicolaus B. 2007. Purification and some properties of a β-galactosidase from the thermoacidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii isolated from Antarctica. Enzyme Microb Technol 40: 1570-1577. Haider T, Husain Q. 2007. Calcium alginate entrapped preparations of Aspergillus oryzae β-galactosidase: Its stability and applications in the hydrolysis of lactose. Int J Biol Macromol 41: 72-80. Hellberg U, Ivarsson JP, Johansson BL. 1996. Characteristics of Superdex ® Prep Grade Media for Gel Filtration Chromatography of Proteins and Peptides. Process Biochem 31 (2): 163-172. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Stalely JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edition. Baltimore: Williams &Wilkins Huber RE, Gupta MN, Khare SK. 1994. The active site and mechanism of the βgalactosidase from Escherichia coli. Int J Biochem 26 (3): 309-318. Idris A, Suzana W. 2006. Effect of sodium alginat concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem 41: 11171123. Illanes A, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM, Wilson L. 2008. Heterogeneous Enzyme Kinetics. Di dalam: Enzyme Biocatalysis Principle and Aplication. Valpraiso: Spinger Science. Itoh T, Ohhashi M, Toba T, Adachi S. 1980. Purification and properties of βgalactosidase from Lactobacillus bulgaricus. Milchwissenschaft 35: 593-597. IUBMB Enzyme Nomenclature. 1980. EC 3.2.1.23. [terhubung berkala]. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/23.html.[6 Maret 2008]. Kim CS, Ji ES, Oh DK. 2003. Expression and characterization of Kluyveromyces lactis β-galactosidase in Escherichia coli. Biotechnol Lett 25: 1769-1774. Kusnawati Y. 2004. Aktivitas protease susu pasteurisasi yang ditambah Bifidobacterium bifidum pada berbagai waktu simpan. [Skripsi]. Bogor: IPB. Lehninger AL. 2004. Principles of Biochemistry. Amhrest: Elsevier Science. Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating βgalactosidase from Enterobacter cloacae B5. Process Biochem 44: 232-236. Mahoney RR. 1998. Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chem 63:147–154.
51
Mahoney RR. 2004. Enzymes exogenous to milk in dairy technology. Di dalam: Encyclopedia of Dairy Science. Amhrest: Elsevier Science. Marsh MN, Riley SA. 1998. Digestion and absorption of nutrients and vitamins. Sleisenger and Fordtran’s Gastrointestinaland Liver Disease 26:1495-1496. Marshall VME, Tamime AY. 1997. Physiology and Biochemistry of Fermented Milks. New York: Chapman & Hall. Martin DW. 1981. Harper’s Review of Biochemistry. California: Medical. Matthews BW. 2005. The structure of E. coli β-galactosidase. CR Biologies 328: 529-556. Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Bogor: IPB Pr. Miller J. 1972. Experiments in Molecular Genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Najafpour G. Younesi H, Ismail KSK. 2004. Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Sacharomyces cerevisiae. Bioresource Tech 92: 251-260. Nakagawa T, Fujimoto Y, Ikehata R, Miyaji T, Tomizuka N. 2006. Purification and molecular characterization of cold-active β-galactosidase from Arthrobacter psychrolactophilus strain F2. Appl Microbiol Biotechnol 72: 720-725. Nguyen TH, Splechtna B, Krasteva S, Kneifel W, Kulbe KD, Divne C, Haltrich D. 2007. Characterization and molecular cloning of a heterodimeric βgalactosidase from the probiotic strain Lactobacillus acidophilus R22. FEMS Microbiol Lett 269: 136-144. Nur MA. Adijuana H, Kosasih. 1992. Teknik Laboratorium. Bogor: Pusat Antar Universitas Ilmu Hayati Institut Pertanian Bogor. Palmer T. 1991. Understanding Enzymes. Ed ke-3. New York: Ellis Horwood. Pelczar MJ, Chan ECS. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Ramakrishna SV, Prakasham RS. 1999. Microbial fermentation with immobilized cells. Current Sci 77:87-100. Rao MVR, Dutta SM. 1981. Purification and properties of beta-galactosidase from Streptococcus thermophillus. J Food Sci 46: 1419-1423. Rahman A, Fardiaz S, Rahayu WP, Suliantri, Nurwitri CC. 1992. Teknologi Fermentasi. Bogor: IPB Pr.
52
Rhimi M et al. 2010. Efficient bioconversion of lactose in milk and whey: immobilization and biochemical characterization of a β-galactosidase from the dairy Streptococcus thermophilus LMD9 strain. Res in Microbiol 161: 515525. Rhimi M, Aghajari N, Jaouadi B, Juy M, Boudebbouze S, Maguin E, Haser R, Bejar S. 2009. Exploring the acidotolerance of β-galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: an attractive enzyme for lactose bioconversion. Res Microbiol 160: 775-784. Rusynyk AR, Still CD. 2001. Lactose intolerance. JAOA 101 :10-12. Sachnez-Manzanares JA, Fernandez-Villacafias MR, Marin-Iniesta F, Laencina J. 1993. Determination of lactose by an enzymatic method. Food Chem 46: 425427. Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York: RR Doneley and Sons. Szczodrak J. 2000. Hydrolysis of lactose in whey permeate by immobilized βgalactosidase from Kluyveromyces fragilis. J Mol Catal B Enzymatic 10: 631637. Trimbur DE, Gutshall KR, Prema P, Brenchley JE. 1994. Characterization of a psychrotrophic Arthrobacter gene and its cold-active β-galactosidase. Appl Environ Microbiol 60: 4544-4552. Walstra P, Geurts TJ, Noomen A, Jellema A, Van Boekel MAJS. 1999. Dairy Technology : Principles of Milk Properties and Processes. New York: Marcell Dekker. Wang D, Sakakibara M. 1997. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem 4: 255-261. Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
LAMPIRAN
54
Lampiran 1 Tahapan umum penelitian
Optimasi konsentrasi alginat
Amobilisasi sel
Enterobacter cloacae
Penentuan waktu produksi β-galaktosidase optimum
Produksi β-galaktosidase
Purifikasi β-galaktosidase Aplikasi terhadap susu UHT dan Penggunaan berulang
Analisis Statistik
Amobilisasi β-galaktosidase
Optimasi konsentrasi alginat
Penentuan Karakterisasi enzim
55
Lampiran 2 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase mikromol oNP
Aktivitas (U/ml)
=
Aktivitas Total (U)
= volume enzim (ml) × Aktivitas (U/ml)
Total Protein (mg)
= volume enzim (ml) × Kadar Protein (mg/ml)
V t
Aktivitas spesifik (U/mg) = Total Aktivitas (U) / Total Protein (mg) Rendemen (%)
=
Total aktivitas purifikasi
× 100%
Total aktivitas ekstrak kasar
Tingkat kemurnian
=
Aktivitas spesifik purifikasi Aktivitas spesifik ekstrak kasar
Aktivitas Relatif (%) =
Aktivitas X
× 100%
Aktivitas yang paling besar
Lampiran 3 Morfologi Enterobacter cloacae
Pertumbuhan E. cloacae setelah diinkubasi 24 jam pada media agar LPY.
56
Lampiran 4 Kurva standar oNP [ONP] (µmol) 0,010 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,200 0,400 0,500
Absorbansi Ulangan 1
Ulangan 2
0,016 0,031 0,073 0,101 0,141 0,176 0,382 0,753 0,874
0,015 0,031 0,065 0,108 0,147 0,177 0,370 0,729 0,889
Arerata ± SD 0,016 ± 0,0007 0,031 ± 0,0000 0,069 ± 0,0057 0,105 ± 0,0049 0,144 ± 0,0042 0,177 ± 0,0007 0,376 ± 0,0085 0,741 ± 0,0170 0,882 ± 0,0106
y = 1,805x – 0,0005 R2 = 0,9993
57
Lampiran 5 Kurva standar protein [ONP] (µmol) 0,010 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,200 0,400 0,500
Absorbansi Ulangan 1
Ulangan 2
0,016 0,031 0,073 0,101 0,141 0,176 0,382 0,753 0,874
0,015 0,031 0,065 0,108 0,147 0,177 0,370 0,729 0,889
Arerata ± SD 0,016 ± 0,0007 0,031 ± 0,0000 0,069 ± 0,0057 0,105 ± 0,0049 0,144 ± 0,0042 0,177 ± 0,0007 0,376 ± 0,0085 0,741 ± 0,0170 0,882 ± 0,0106
y = 0,797 x + 0,014 R2 = 0,993
58
Lampiran 6 Penentuan waktu produksi optimum Optical density pada pertumbuhan E. cloacae Jam ke-
OD1
OD2
ODrerata ± SD
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0,085 0,592 1,601 1,768 1,850 1,849 1,849 1,801 1,722
0,089 0,592 1,605 1,768 1,847 1,849 1,849 1,796 1,724
0,087 ± 0,0028 0,592 ± 0,0000 1,603 ± 0,0028 1,768 ± 0,0000 1,849 ±0,0021 1,849 ± 0,0000 1,849 ± 0,0000 1,799 ± 0,0035 1,723 ± 0,0014
Jumlah Selrerata (sel/ml) 1,74×109 1,18×1010 3,21×1010 3,54×1010 3,70×1010 3,70×1010 3,70×1010 3,60×1010 3,45×1010
Produksi β-galaktosidase dari E. cloacae Jam ke-
[oNP]1 (µmol)
[oNP]2 (µmol)
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0,000 0,030 3,075 3,573 5,568 3,740 3,019 2,299 1,801
0,000 0,027 2,742 3,186 5,568 3,906 3,130 2,355 2,244
Aktivitas (U) Ulangan 1
Ulangan 2
Aktivitasrerata ± SD
0,000 0,020 2,050 2,382 3,712 2,493 2,013 1,533 1,200
0,000 0,018 1,828 2,124 3,712 2,604 2,087 1,570 1,496
0,000 ± 0,000 0,019 ± 0,0010 1,939 ± 0,1567 2,253 ± 0,1828 3,712 ± 0,000 2,548 ± 0,0783 2,050 ± 0,0522 1,551 ± 0,0261 1,348 ± 0,2089
Lampiran 7 Hasil purifikasi β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat Fraksi 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%
Total Proteinrerata (mg) 15,000 8,550 8,550 15,300 31,050 28,500 2,886
Aktivitasrerata (U) 9,668 13,214 85,790 165,014 92,936 1,690 0,006
Aktivitas Spesifik ± SD (U/mg) 0,645 ± 0,084 1,545 ± 0,213 10,034 ± 0,271 10,785 ± 0,417 2,993 ± 0,618 0,059 ± 0,082 0,002 ± 0,000
Aktivitas Relatif (%) 5,98 14,33 93,03 100,00 27,75 0,55 0,02
59
Lampiran 8 Hasil kromatografi filtrasi gel Fraksi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
[Protein] Volume (mg/ml) (ml) 0,028 0,008 0,003 0,007 0,013 0,018 0,045 0,224 1,199 1,199 0,703 0,367 0,247 0,203 0,179 0,145 0,112 0,071 0,055 0,040
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Aktivitas (U/ml) 0,000 0,000 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,006 0,061 0,390 9,557 37,313 8,227 5,402 0,840 0,506 0,303 0,243 0,157 0,133
Aktivitas [Protein] (U) (mg) 0,001 0,001 0,002 0,002 0,002 0,004 0,004 0,017 0,184 1,171 28,670 111,939 24,681 16,205 2,520 1,517 0,908 0,729 0,471 0,398
0,085 0,023 0,008 0,020 0,040 0,054 0,134 0,673 3,597 3,597 2,108 1,100 0,742 0,610 0,538 0,435 0,336 0,212 0,165 0,119
Aktivitas spesifik (U/mg) 0,010 0,037 0,304 0,127 0,062 0,076 0,031 0,026 0,051 0,326 13,599 101,781 33,277 26,556 4,686 3,490 2,706 3,432 2,852 3,339
Lampiran 9 Optimasi dan Stabilitas Suhu Optimasi suhu enzim bebas Suhu (°C) 25 30 35 40 45 50
Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 ± SD (U/ml) 8,648 8,803 8,493 8,648 ± 0,115 10,510 10,587 10,510 10,536 ± 0,045 15,474 15,551 15,474 15,500 ± 0,045 17,568 17,645 17,645 17,620 ± 0,045 4,382 4,382 4,305 4,356 ± 0,045 0,116 0,194 0,194 0,168 ±0,045
Aktivitas Relatif (%) 49,08 59,79 87,97 100,00 24,72 0,95
60
Lanjutan Lampiran 9 Optimasi suhu enzim teramobil Aktivitas (U/ml)
Suhu (°C)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
25 30 35 40 45 50
0,011 0,014 0,016 0,026 0,012 0,005
0,011 0,014 0,016 0,026 0,012 0,006
0,020 0,014 0,016 0,026 0,012 0,006
0,014 ± 0,005 0,014 ± 0,000 0,016 ± 0,000 0,026 ± 0,000 0,012 ± 0,000 0,006 ± 0,000
Aktivitas Relatif (%) 54,27 54,51 61,46 100,00 45,20 21,39
Stabilitas suhu enzim bebas Suhu (°C)
Aktivitas (U/ml) Ulangan 1
Ulangan 2 Ulangan 3
25 12,759 12,837 30 13,147 13,147 35 13,380 13,457 40 10,355 10,432 45 1,357 1,202 50 0,427 0,427 Aktivitasrerata kontrol: 17,620 U/ml
12,837 13,147 13,380 10,355 1,357 0,427
Aktivitasrerata ± SD (U/ml) 12,811 ± 0,045 13,147 ± 0,000 13,405 ± 0,045 10,380 ± 0,045 1,306 ± 0,090 0,427 ± 0,000
Aktivitas tersisa (%) 72,71 74,61 76,08 58,91 7,41 2,42
Stabilitas suhu enzim teramobil Suhu (°C)
Aktivitas (U/ml) Ulangan 1
Ulangan 2
25 0,016 0,016 30 0,016 0,016 35 0,016 0,016 40 0,016 0,016 45 0,010 0,010 50 0,004 0,004 Aktivitasrerata kontrol: 0,026 U/ml
Ulangan 3
Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
0,016 0,016 0,016 0,016 0,011 0,004
0,016 ± 0,0001 0,016 ± 0,0001 0,016 ± 0,0001 0,016 ± 0,0001 0,010 ± 0,0001 0,004 ± 0,0001
Aktivitas tersisa (%) 61,02 61,38 61,50 63,16 40,31 14,86
61
Lampiran 10 Optimasi dan stabilitas pH Optimasi pH enzim bebas pH 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
Aktivitas (U/ml) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 4,848 4,848 4,958 10,720 10,499 10,499 17,535 14,820 14,820 18,089 18,144 18,310 13,435 13,324 15,263 9,889 9,834 9,889
Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas Relatif (%)
4,885 ± 0,064 10,572 ± 0,128 15,725 ± 1,567 18,181 ± 0,115 14,007 ± 1,089 9,871 ± 0,032
26,87 58,15 86,49 100,00 77,04 54,29
Optimasi pH enzim teramobil pH 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
Aktivitas (U/ml) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 0,008 0,008 0,008 0,009 0,009 0,009 0,012 0,012 0,012 0,025 0,025 0,025 0,017 0,017 0,017 0,011 0,011 0,011
Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas Relatif (%)
0,008 ± 0,000 0,009 ± 0,000 0,012 ±0,000 0,025 ± 0,000 0,017 ± 0,000 0,011 ± 0,000
31,20 34,65 47,20 100,00 68,49 43,38
Stabilitas pH enzim bebas Aktivitas (U/ml) pH
Ulangan 1
Ulangan 2 Ulangan 3
5,5 13,535 13,612 6,0 14,000 13,922 6,5 14,078 14,078 7,0 14,155 14,155 7,5 11,828 11,751 8,0 11,285 11,440 Aktivitasrerata kontrol: 18,181 U/ml
13,612 14,000 14,078 14,233 11,751 11,285
Aktivitasrerata ± SD (U/ml) 13,586 ± 0,045 13,974 ± 0,045 14,078 ± 0,000 14,181 ± 0,045 11,777 ± 0,045 11,337 ± 0,090
Aktivitas tersisa (%) 74,73 76,86 77,43 78,00 64,77 62,36
62
Lanjutan Lampiran 10 Stabilitas pH enzim teramobil Aktivitas (U/ml) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 5,5 0,019 0,019 0,019 6,0 0,021 0,022 0,022 6,5 0,027 0,027 0,027 7,0 0,035 0,035 0,035 7,5 0,020 0,020 0,020 8,0 0,010 0,010 0,010 Aktivitasrerata kontrol: 0,037 U/ml pH
Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas tersisa (%)
0,019 ±0,0002 0,022 ± 0,0003 0,027 ± 0,0002 0,035 ± 0,0001 0,020 ± 0,0001 0,010 ± 0,0001
50,95 58,77 73,49 93,88 54,69 28,24
Lampiran 11 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase Kation
Aktivitas (U/ml) ulangan ulangan ulangan 1 2 3
Aktivitasrerata ± SD
Aktivitas Relatif (%)
Kontrol Ca2+
69,432 66,440
69,765 66,357
69,848 64,861
69,681 ± 0,220 65,886 ± 0,889
100,00 94,55
Co2+
72,341
74,003
73,172
73,172 ± 0,831
105,01
2+
62,202
61,953
62,202
62,119 ± 0,144
89,15
2+
7,936
7,355
7,521
7,604 ± 0,300
10,91
2+
Mn
91,122
93,864
91,454
92,147 ± 1,497
132,24
Hg2+
0,374
0,873
0,540
0,596 ± 0,254
0,85
Zn
Cu
2+
Mg 82,645 87,133 83,144 84,307 ± 2,460 120,99 Keterangan: Kontrol adalah aktivitas enzim tanpa penambahan kation.
63
Lampiran 12 Penentuan parameter kinetik enzim bebas dan enzim teramobil Enzim bebas Dari persamaan y = 0,663x + 1,526 diperoleh nilai 1/Vmaks = 1,526 dan nilai Km / Vmaks = 0,663. Maka nilai Vmaks = 0,655 µmol/menit dan nilai Km sebesar 0,434 mM. [S] (mg/ml)
[S] (mM)
1/S
V (µmol/menit)
1/V
0,010 0,050 0,100 0,500
0,033 0,166 0,332 1,659
30,136 6,027 3,014 0,603
0,047 0,143 0,298 1,126
21,277 6,993 3,356 0,888
Kurva linier konsentrasi oNP vs waktu
Kurva Michaelis-Menten
Kurva Lineweaver-burk
64
Lanjutan Lampiran 12 Enzim teramobil Dari persamaan y = 179,465x + 86,787 diperoleh nilai 1/Vmaks = 86,787 dan nilai Km / Vmaks = 179,465. Maka nilai Vmaks = 0,012 µmol/menit dan nilai Km sebesar 2,068 mM. [S] [S] V 1/S 1/V (mg/ml) (mM) (µmol/menit) 0,100 2,000 4,000 5,000
0,332 6,637 13,273 16,591
3,014 0,151 0,075 0,060
0,00160 0,00489 0,01423 0,02526
625,000 204,499 70,274 39,588
Kurva linier konsentrasi oNP vs waktu
Kurva Michaelis-Menten
Kurva Lineweaver-burk
65
Lampiran 13 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi variasi sel dan alginat untuk amobilisasi sel Na-Alginat (%b/v) Bobot Sel (%b/v) 4 5 6 10 0,854 e 0,898 e 0,865 e 20 0,597 c 0,732 d 0,893 e 40 0,124 a 0,288 b 0,946 f Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada baris dan kolom menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
Lampiran 14
Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi enzim
[Na-Alginat] (%)
[Produk] (µmol)
[Produk relatif] (%)
4 0,560 a 5 1,009 b 6 0,760 c Enzim bebas 1,548 d Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
36,18 a 65,16 b 49,11 c 100,00 d sama menunjukkan
66
Lampiran 15 Potensi hidrolisis laktosa Sel amobil Sel bebas Aktivitas Aktivitas [Laktosa] [Laktosa] Hidrolisis Hidrolisis terhidrolisis (g) terhidrolisis (g) Relatif (%) Relatif (%) 0 0,000 a 0,00 a 0,000 a 0,00 a 3 0,025 b 5,24 b 0,032 b 6,71 b 6 0,039 c 8,18 c 0,094 c 19,71 c 9 0,058 d 12,16 d 0,179 d 37,53 d 12 0,088 e 18,45 e 0,192 e 40,25 e 15 0,094 f 19,71 f 0,211 f 44,23 f 18 0,105 g 22,01 g 0,263 g 55,14 g 21 0,105 g 22,01 g 0,265 g 55,56 g 24 0,106 g 22,22 g 0,263 g 55,14 g Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5% Jam ke-
Enzim teramobil Enzim bebas Aktivitas [Laktosa] Aktivitas [Laktosa] Hidrolisis terhidrolisis Hidrolisis terhidrolisis (g) Relatif (%) (g) Relatif (%) 0 0,000 a 0,00 a 0,003 a 0,63 a 3 0,032 b 6,71 b 0,304 b 63,73 b 6 0,134 c 28,09 c 0,372 c 77,99 c 9 0,136 c 28,51 c 0,373 c 78,20 c 12 0,137 c 28,72 c 0,373 c 78,20 c 15 0,136 c 28,51 c 0,373 c 78,20 c 18 0,136 c 28,51 c 0,373 c 78,20 c 21 0,137 c 28,72 c 0,373 c 78,20 c 24 0,137 c 28,72 c 0,373 c 78,20 c Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5% Jam ke-
Konsentrasi laktosa pada susu = 0,477 gram/10 ml susu UHT ≈ 4,77%
67
Lampiran 16 Penggunaan berulang enzim amobil dan sel amobil Sel amobil Ulangan [Laktosa] terhidrolisis (g) Aktivitas Hidrolisis Relatif (%) 1 0,105 a 100,00 a 2 0,065 b 61,52 b 3 0,047 c 44,85 c 4 0,026 d 24,51 d 5 0,025 d 24,02 d 6 0,019 e 17,65 e Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
Enzim amobil Ulangan [Laktosa] terhidrolisis Aktivitas Hidrolisis Relatif (%) 1 0,134 a 100,00 a 2 0,113 b 84,26 b 3 0,057 c 42,42 c 4 0,032 d 23,61 d 5 0,028 e 21,11 e 6 0,028 e 20,54 e Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
