Aktivitas Enzimatis Isolat Bakteri Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Kepiting Bakau (Scylla spp.) Sebagai Kandidat Probiotik

Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan (ISSN: 2085-5842 )

Aktivitas Enzimatis Isolat Bakteri Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Kepiting Bakau (Scylla spp.) Sebagai Kandidat Probiotik Activity Enzymatic of Isolate Lactic Acid Bacteria from the Digestive Tract of Mud Crab (Scylla spp.) as a Candidate Probiotics Pipin Suciati1*, Wahju Tjahjaningsih2, Endang Dewi Masithah2 dan Heru Pramono**2 1

Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya Departemen Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya * [email protected] **[email protected] 2

Abstrak Probiotik dapat didefinisikan sebagai mikroba hidup yang ditambahkan dalam jumlah tertentu yang mampu bertahan hidup dalam ekosistem saluran pencernaan. Enzim yang dihasilkan oleh mikroba yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan dapat digunakan sebagai probiotik. Enzim proteolitik ekstraseluler secara alami diproduksi oleh mikroba untuk menghidrolisis polipeptida dalam media menjadi peptida dan asam amino. Bakteri asam laktat dapat menghasil enzim seperti protease, α-amilase, fitase, kitinase, lipase. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari saluran pencernaan kepiting bakau (Scylla spp.) yang mempunyai aktivitas proteolitik. Penelitian ini menggunakan metode deskriptif berupa aktivitas enzimatis dan karakterisasi uji biokimia isolat bakteri asam laktat dari saluran pencernaan kepiting bakau (Scylla spp.). Jumlah kepiting bakau yang digunakan adalah 10 ekor. Hasil penelitian didapatkan tiga isolat bakteri asam laktat yang memiliki aktivitas proteolitik kuat, yaitu WK 28, WK 33, dan WK 53. Hasil uji biokimia isolat WK 28 termasuk ke dalam genus Pediococcus sp., isolat WK 33 termasuk ke dalam Lactobacillus sp., dan isolat WK 53 termasuk ke dalam genus Streptococcus sp. WK 28 (Pediococcus sp.) dan WK 33 (Lactobacillus sp.) mempunyai aktivitas proteolitik dan aktivitas lipolitik. Isolat WK 53 (Streptococcus sp.) mempunyai aktivitas enzimatis yaitu aktivitas proteolitik, amilolitik, dan lipolitik. Kata kunci: Kepiting bakau, proteolitik, amilolitik, lipolitik Abstract Probiotics are defined as live microbes are added in a certain amount that is able to survive in the digestive tract ecosystem. Enzymes produced by microbes isolated from the digestive tract of fish can be used as probiotics. Extracellular proteolytic enzymes naturally produced by the microbes to hydrolyze a polypeptide in a media into peptides and amino acids. Lactic acid bacteria can produce enzymes such as proteases, α-amylase, phytase, chitinase, lipase. This study aims to get the lactic acid bacteria isolates from the gastrointestinal tract of mangrove crab (Scylla spp.) That have proteolytic activity. This research uses descriptive method such as enzymatic activity and biochemical characterization of isolates of lactic acid bacteria from the digestive tract of mangrove crab (Scylla spp.). Amount of mud crab used is 10 fish. The result showed three isolates of lactic acid bacteria that have a strong proteolytic activity, namely WK 28 WK 33 and WK 53. The results of biochemical tests WK 28 isolates belonging to the genus Pediococcus sp., Isolate WK 33 belonging to the Lactobacillus sp., And WK 53 isolates belonging to the genus Streptococcus sp. WK 28 (Pediococcus sp.) And WK 33 (Lactobacillus sp.) Have proteolytic activity and lipolytic activity. Isolates WK 53 (Streptococcus sp.) Have enzymatic activity is proteolytic activity, amylolytic, and lipolytic. Keywords: Mud crab, lactic proteolytic, amylolytic, lipolytic 94 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


Pendahuluan

Lactobacillus plantarum), Bifidobacterium

Salah satu upaya untuk meningkat-

(Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium

kan fungsi fisiologis ikan, terutama kemam-

thermophilum), dan Streptococcus lactis.

puan dalam mencerna pakan adalah dengan

Menurut Chotimah (2009), Streptococcus

menambahkan probiotik dalam pakan. Pe-

thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus

nambahan probiotik dalam pakan diharap-

tergolong dalam bakteri asam laktat (BAL).

kan dapat masuk dalam saluran pencernaan

Menurut Hardiningsih dkk. (2006),

komoditas budidaya (Jusadi dkk., 2004).

bakteri asam laktat tidak bersifat patogen

Probiotik didefinisikan sebagai mikroba hi-

dan aman bagi kesehatan sehingga sering

dup yang ditambahkan dalam jumlah terten-

digunakan pada industri pengawetan maka-

tu yang mampu bertahan hidup dalam eko-

nan, minuman serta berpotensi sebagai

sistem saluran pencernaan. Mikroba probio-

produk probiotik. Seiring dengan perkem-

tik memiliki peran positif pada inang. Peran

bangan penggunaan probiotik dalam kegia-

mikroba tersebut berpengaruh terhadap ke-

tan budidaya, perlu dilakukan penelitian

sehatan dan nutrisi inang (Gismondo et al.,

mengenai aktivitas enzimatis isolat bakteri

1999). Probiotik bermanfaat dalam menga-

asam laktat dari saluran pencernaan kepiting

tur keseimbangan mikroba pada saluran pen-

bakau (Scylla spp.) dalam memproduksi

cernaan dan menghambat perkembangan

enzim yang berperan dalam pencernaan.

mikroba patogen pada saluran pencernaan (Salminen et al., 1999) serta mensekresikan

Materi dan Metode Alat dan Bahan

enzim yang membantu proses pencernaan

Bahan yang digunakan dalam pene-

makanan. Peningkatan daya cerna menun-

litian yaitu kepiting bakau (Scylla spp.)

jukkan semakin tinggi nutrisi yang tersedia

dewasa dengan ukuran 7-10 cm dan berat

untuk diserap tubuh (Jusadi dkk., 2004).

90-100 gram sebanyak 10 ekor yang dida-

Menurut Lengkey dan Soeharsono

patkan dari pedagang pengumpul kepiting

(2010), mikroba probiotik adalah bakteri

bakau di hutan bakau Wonorejo Surabaya.

Gram positif, contohnya genus Lactobacil-

Bahan yang digunakan yaitu media selektif

lus dan Bifidobacterium. Bakteri yang

de Man Rogosa Sharpe (MRS), 0,5%

digunakan sebagai probiotik antara lain ter-

CaCO3, air laut, alkohol 70%, kapas, kertas

masuk dalam spesies Lactobacillus (Lacto-

pH, skim milk, bacto agar, amilum, lugol,

bacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, 95 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


minyak zaitun, paper disk blank, larutan

Pengambilan Sampel Saluran Pencernaan

NaCl fisiologis, akuades dan air laut. Media

Kepiting Bakau

untuk uji biokimia yaitu media MIO, media

Pengambilan sampel saluran pencer-

TSIA, media uji O/F parafin, media glukosa,

naan kepiting bakau (Scylla spp.) dewasa

zat warna Gram, paper oksidase, dan H2O2

baik jantan dan betina dari 10 ekor sebagai

3%. Peralatan yang digunakan dalam proses

sumber inokulum. Sampel saluran pencerna-

isolasi yaitu pinset, alat seksio, Petri dish,

an diambil dengan cara membuka karapas

tabung reaksi, autoklaf, pipet ukur, pipet

kepiting bakau kemudian pada saluran pen-

tetes, Beaker glass, bunsen, mikrotub,

cernaan dipotong mulai dari anterior lam-

pinset, oven, timbangan analitik, tabung

bung sampai pada posterior usus.

Erlenmeyer, Ose, dan Refraktometer. Prosedur Penelitian

Penanaman Bakteri Sampel diambil sebanyak 0,5 gram

Penelitian yang dilakukan menggu-

untuk diencerkan dengan 4,5 ml air laut

nakan metode deskriptif (Rohy dkk., 2014)

yang steril dalam tabung reaksi (10 -1). Pe-

berupa aktivitas enzimatis dan karakterisasi

ngenceran dilanjutkan hingga seri pengen-

uji biokimia isolat bakteri asam laktat dari

ceran 10-2. Metode penanaman dilakukan

saluran pencernaan kepiting bakau (Scylla

dengan metode permukaan (surface/spread

spp.).

plate) (Sumarsih dkk., 2010). Sampel diam-

Pembuatan Media

bil 1 ml dan diinokulasi pada media MRS

Media yang digunakan untuk isolasi

agar yang telah ditambah 0,5% CaCO3.

bakteri asam laktat adalah media MRS agar

Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama

yang ditambahkan 0,5% CaCO3 (Khunajarkr

satu sampai dua hari dengan posisi cawan

et al., 2008). Media MRS sebanyak 10,4

Petri terbalik (Setyadi dan Subagiyo, 2012).

gram, bacto agar sebanyak tiga gram dan

Pemurnian Isolat Bakteri

satu gram CaCO3 dilarutkan dengan air laut

Pemurnian isolat bakteri dilakukan

200 ml ke dalam Erlenmeyer. Media MRS

dengan metode streak plate pada media

agar dengan penambahan CaCO3 disterilisasi

MRS agar yang telah ditambah 0,5% CaCO3

dengan menggunakan autoklaf pada suhu

kemudian diinkubasi pada suhu 30ºC selama

121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit,

24 jam. Media MRS merupakan media

kemudian dituang pada Petri dish. 96 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


selektif untuk pertumbuhan bakteri asam laktat (Yelnetty et al., 2014). Seleksi Bakteri Asam Laktat Proteolitik

Uji katalase dilakukan dengan meneteskan beberapa larutan H2O2 3% pada kultur bakteri. Sifat reaksi terhadap uji katalase

Seleksi bakteri asam laktat proteoli-

ditentukan dengan terbentuk gelembung gas

tik dilakukan dengan uji aktivitas proteolitik

yang memberikan indikasi pembentukan air

pada media agar dengan menggunakan 1%

dan oksigen dari hidrogen peroksida (H2O2)

skim milk (Nespolo et al., 2010). Uji akti-

(Benson, 2001).

vitas proteolitik dilakukan dengan prosedur

Uji Morfologi dan Pewarnaan Gram

Benson (2001) yaitu kultur cair isolat yang

Pewarnaan Gram bertujuan untuk

diperoleh dari hasil isolasi diinokulasikan ke

mengamati morfologi bentuk koloni, warna

paper disc blank yang kemudian ditempat-

koloni, elevasi koloni, dan bentuk sel (bulat,

kan pada media skim milk agar (1%), diin-

bulat batang, tetrad, batang) serta menen-

kubasi pada suhu 30ºC selama 1-3 hari.

tukan kelompok bakteri yaitu bakteri Gram

Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara

negatif dan bakteri Gram positif (Benson,

memasukkan paper disc ke dalam kultur cair

2001).

isolat bakteri menggunakan pinset. Aktivitas proteolitik tampak dari ter-

Produksi Hidrogen Sulfida

bentuk zona jernih di sekitar paper disc. Uji

Pengujian produksi hidrogen sulfida

aktivitas proteolitik pengamatan dilakukan

bertujuan untuk menentukan sifat produksi

selama tiga hari. Berdasarkan tingkat ke-

H2S dan fermentasi karbohidrat. Media yang

mampuan menghidrolisis protein yang diha-

digunakan adalah media TSIA. Produksi

silkan oleh masing-masing isolat ditunjuk-

H2S ditandai dengan terbentuk warna hitam

kan berupa zona jernih, dipilih tiga isolat

pada dasar media. Fermentasi karbohidrat

dengan kemampuan menghidrolisis tiga ter-

menyebabkan warna media berubah dari

besar (Triyanto dkk., 2009). Hasil seleksi uji

oranye kemerahan menjadi warna kuning

aktivitas proteolitik, tiga isolat bakteri asam

(Benson, 2001).

laktat selanjutnya dilakukan karakterisasi yaitu dengan uji biokimia.

Motilitas Pengujian motilitas bertujuan untuk

Uji Biokimia

mengetahui bakteri bersifat motil atau tidak.

Uji Katalase

Uji motilitas dilakukan dengan cara menu97 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


sukkan inokulasi bakteri pada media soft

Uji Glukosa

agar (MIO). Bakteri bersifat motil akan

Uji glukosa bertujuan untuk menen-

terlihat penyebaran bakteri pada media

tukan kemampuan bakteri dalam menfer-

(Benson, 2001).

mentasikan glukosa dan menghasilkan asam organik serta menghasilkan gas. Uji glukosa

Oksidase

positif apabila terjadi perubahan warna men-

Tujuan uji oksidase adalah untuk membedakan kelompok

bakteri dengan

jadi kuning pada media uji glukosa (Benson, 2001).

menggunakan paper oksidase. Pengelompokan bakteri dengan uji oksidase diketahui adanya perubahan warna yang terjadi pada paper oksidase. Reaksi uji oksidase positif apabila terjadi perubahan warna pada paper oksidase menjadi biru yang nampak dalam waktu 10-15 detik (Benson, 2001). Oksidatif / Fermentatif

Uji Aktivitas Proteolitik II Uji aktivitas proteolitik pada media agar dengan menggunakan 1% skim milk (Nespolo et al., 2010). Uji aktivitas proteolitik dilakukan dengan prosedur Benson (2001), yaitu kultur cair isolat yang diperoleh dari hasil isolasi diinokulasikan ke paper

Uji O/F medium (oksidatif/fermenta-

disc blank yang kemudian ditempatkan pada

tif) bertujuan untuk mengetahui sifat oksida-

media skim milk agar (1%), diinkubasi pada

si atau fermentasi bakteri terhadap glukosa.

suhu 30ºC selama 1-3 hari. Inokulasi bakteri

Bakteri oksidatif memanfaatkan oksigen un-

dilakukan dengan cara memasukkan paper

tuk menghasilkan karbondioksida dan air,

disc ke dalam kultur cair isolat bakteri

memanfaatkan glukosa sebagai donor elek-

menggunakan pinset. Aktivitas proteolitik

tron dan oksigen sebagai sumber elektron

tampak dari terbentuk zona jernih di sekitar

utama. Bakteri bersifat oksidatif apabila

paper disc. Uji aktivitas proteolitik II penga-

media uji O/F berwarna biru. Bakteri fer-

matan dilakukan selama tujuh hari.

mentatif memanfaatkan glukosa sebagai

Aktivitas Amilolitik

sumber energi, dengan menghasilkan produk

Uji aktivitas amilolitik dilakukan pa-

akhir karbondioksida dan air. Bakteri ber-

da media agar dengan 1% amilum atau pati

sifat fermentatif apabila media uji O/F

(Fossi et al., 2005). Uji aktivitas amilolitik

berwarna kuning (Benson, 2001).

dilakukan dengan prosedur Benson (2001), 98 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


yaitu kultur cair isolat bakteri asam laktat

menunjukkan bahwa media larut atau ter-

proteolitik diinokulasikan ke paper disc

hidrolisis.

blank yang kemudian ditempatkan pada me-

Parameter Penelitian

dia agar dengan 1% amilum, kemudian diin-

Parameter dalam penelitian ini ada-

kubasi pada suhu 30ºC selama 24-48 jam.

lah aktivitas enzimatis dan karakterisasi

Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara me-

isolat bakteri asam laktat. Aktivitas enzi-

masukkan paper disc ke dalam kultur cair

matis tersebut meliputi aktivitas proteolitik,

isolat bakteri menggunakan pinset. Hasil ak-

amilolitik, dan lipolitik. Karakterisasi bak-

tivitas enzim amilase ekstraseluler ditunjuk-

teri asam laktat yaitu dengan uji biokimia.

kan oleh terbentuk zona jernih di sekitar

Pengamatan dilakukan secara makroskopik

koloni. Pengamatan zona jernih di sekitar

dan secara mikroskopik.

koloni dilakukan dengan penambahan lugol pada media (Fossi et al., 2005).

Analisa Data Data hasil uji aktivitasi enzimatis dan

Aktivitas Lipolitik

karakterisasi isolat bakteri asam laktat Di-

Uji aktivitas lipolitik dilakukan pada

analisis secara deskriptif. Data diperoleh da-

media MRS agar dengan penambahan 2 ml

ri hasil uji aktivitas enzimatis yaitu aktivitas

minyak zaitun dalam 100 ml media MRS

proteolitik, amilolitik, dan lipolitik serta uji

agar (Svetlitshnyl et al., 1996). Uji aktivitas

biokimia kemudian dianalisis dan dilengkapi

lipolitik dilakukan dengan cara kultur cair

dengan Tabel dan Gambar.

isolat bakteri asam laktat proteolitik diinokulasikan ke paper disc blank dari kertas saring kemudian ditempatkan pada media MRS agar dengan penambahan 2 ml minyak zaitun. Inkubasi pada suhu 30ºC selama 2448 jam (Benson, 2001). Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara memasukkan paper disc ke dalam kultur cair isolat bakteri menggunakan pinset. Aktivitas enzim lipase bakteri asam laktat ditandai dengan terbentuk zona jernih di sekitar koloni yang

Hasil dan Pembahasan Hasil Isolasi dan Seleksi Bakteri Asam Laktat Hasil isolasi 10 ekor kepiting bakau (Scylla spp.) diperoleh 96 isolat bakteri yang tumbuh pada media de Man Rogosa Sharpe (MRS) agar dengan penambahan 0,5% CaCO3. Hasil permurnian isolat diperoleh sebanyak 65 isolat bakteri asam laktat, kemudian dilanjutkan seleksi bakteri asam laktat proteolitik. 99 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


Seleksi Bakteri Asam Laktat Proteolitik

coccus sp. berbentuk bulat tersusun berantai

Seleksi bakteri asam laktat proteo-

pendek atau sepasang. Isolat bakteri WK 33

litik dilakukan dengan uji aktivitas proteo-

(Lactobacillus sp.) mempunyai ciri-ciri ben-

litik dari 65 isolat bakteri asam laktat hasil

tuk koloni bulat berwarna putih susu dengan

pemurnian. Berdasarkan hasil uji aktivitas

elevasi cembung. Sel Lactobacillus sp. Ber-

proteolitik didapatkan tiga isolat bakteri

bentuk batang dan lurus tersusun berpa-

asam laktat yang mempunyai aktivitas pro-

sangan. Isolat bakteri WK 53 (Streptococcus

teolitik kuat ditandai dengan terbentuk zona

sp.) mempunyai bentuk koloni bulat beruku-

jernih. Zona jernih di sekitar koloni meru-

ran kecil berwarna putih susu dengan elevasi

pakan hasil aktivitas hidrolisis protein pada

cembung. Sel Streptococcus sp. berbentuk

media oleh enzim protease ekstraseluler, tiga

bulat tersusun berantai pendek.

isolat tersebut yaitu WK 28, WK 33, dan WK 53. Lebar diameter zona jernih isolat WK 28 adalah 12 mm, isolat WK 33 adalah 9 mm, dan isolat WK 53 adalah 10 mm. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat

a.

b.

Proteolitik Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan uji morfologi dan uji biokimia. Dari hasil uji morfologi koloni (Gambar 1) dan uji biokimia dibandingkan dengan

buku

Bergey’s

Determinative

Bacteriologi (Holt et al., 1994) didapatkan

c. Gambar 1. Morfologi koloni bakteri. Keterangan: a. Isolat WK 28, b. Isolat WK 33, c. Isolat WK 53

kecocokan karakteristik isolat pada jenis

Hasil uji biokimia menunjukkan iso-

bakteri Pediococcus sp., Lactobacillus sp.,

lat bakteri WK 28 (Pediococcus sp.), WK 33

dan Streptococcus sp (Tabel 1.).

(Lactobacillus sp.), dan WK 53 (Streptococ-

Ciri-ciri morfologi isolat bakteri WK

cus sp.) bersifat positif terhadap pewarnaan

28 (Pediococcus sp.) yaitu bentuk koloni

Gram, katalase negatif, oksidase negatif,

bulat dengan tepian bergerigi berwarna putih

glukosa positif, metil red (MR) negatif,

susu dengan elevasi cembung. Sel Pedio-

voges proskauer (VP) negatif, tidak meng100 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


hasilkan gas dan H2S serta bersifat fermen-

motil. Hasil pewarnaan Gram isolat bakteri

tatif pada uji O/F. Bakteri Pediococcus sp.

WK 28 (Pediococcus sp.), WK 33 (Lacto-

dan Lactobacillus sp. bersifat non motil, se-

bacillus sp.), dan WK 53 (Streptococcus sp.)

dangkan bakteri Streptococcus sp. bersifat

dapat dilihat pada Gambar 2.

Tabel 1. Hasil uji biokimia Isolat

TSIA

Gas

H2S

-

-

-

F

+

-

-

-

-

F

+

-

-

-

F

+

WK 28

O/F Glukosa Motilitas Oksidase

Katalase

Gram

-

-

+

-

-

-

+

+

-

-

+

(Pediococcus sp. )

WK 33 (Lactobacillus sp.)

WK 53 (Streptococcus sp.)

Kemampuan Aktivitas Proteolitik II

dalam Genus Lactobacillus sp., dan isolat

Isolat Bakteri Asam Laktat

WK 53 termasuk dalam Genus Streptococ-

Berdasarkan hasil seleksi aktivitas proteolitik

isolat

laktat

kukan uji aktivitas proteolitik II. Uji akti-

diperoleh tiga isolat bakteri asam laktat yang

vitas proteolitik II dilakukan pengamatan

mempunyai

kuat

selama tujuh hari untuk mengetahui kemam-

ditandai dengan terbentuk zona jernih, tiga

puan bakteri dalam menghasilkan enzim

isolat tersebut yaitu WK 28, WK 33, dan

protease ekstraseluler berupa zona jernih di

WK 53. Hasil uji morfologi dan uji biokimia

sekitar koloni yang merupakan hasil hidro-

isolat

proteolitik

lisis enzim protease (Gambar 3). Hasil uji

Bergey’s

aktivitas proteolitik II dapat dilihat pada

aktivitas

bakteri

dibandingkan

bakteri

asam dengan

asam

cus sp. Tiga isolat tersebut kemudian dila-

proteolitik

laktat buku

Determinative Bacteriologi (Holt et al., 1994) didapatkan kecocokan karakteristik bakteri isolat WK 28 termasuk dalam Genus

Tabel 2. Kemampuan Aktivitas Amilolitik dan Aktivitas Lipolitik

Pediococcus sp., isolat WK 33 termasuk 101 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


a.

b.

c. Gambar 2. Pewarnaan Gram isolat bakteri asam laktat Keterangan : a. Isolat bakteri WK 28 (Pediococcus sp.), b. Isolat bakteri WK 33 (Lactobacillus sp.), c. Isolat bakteri WK 53 (Streptococcus sp.).

jernih di sekitar koloni merupakan hasil Hasil uji aktivitas amilolitik isolat

aktivitas hidrolisis amilum oleh amilase eks-

WK 28 (Pediococcus sp.), WK 33 (Lacto-

traseluler. Isolat WK 28 (Pediococcus sp.)

bacillus sp.), dan WK 53 (Streptococcus sp.)

dan WK 33 (Lactobacillus sp.) tidak meng-

menunjukkan bahwa isolat WK 53 (Strepto-

hasilkan enzim amilase ekstraseluler ditan-

coccus sp.) mampu menghasilkan enzim

dai dengan tidak terbentuk zona jernih di

amilase ekstraseluler ditunjukkan dengan

sekitar koloni (Gambar 4).

terbentuk zona jernih di sekitar koloni. Zona Tabel 2. Data diameter zona jernih uji aktivitas proteolitik II No .

Diameter zona jernih (mm) Isolat

H-1

H-2

H-3

H-4

H-5

H-6

H-7

1.

WK 28 (Pediococcus sp.)

18

18

19

24

28

28

28

2.

WK 33 (Lactobacillus sp.)

13

14

14

18

22

26

30

3.

WK 53 (Streptococcus sp.)

11

14

14

30

30

30

32

102 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


dengan menggunakan media MRS agar WK 28

dengan penambahan 0,5% CaCO3. Koloni bakteri asam laktat yang tumbuh membentuk zona jernih di sekitar pertumbuhan koloni pada media MRS agar dengan penambahan 0,5% CaCO3. Zona jernih terbentuk

AB C Gambar 3. Uji aktivitas proteolitik

karena bakteri menghasilkan metabolit se-

Keterangan: A. Zona jernih, B. Koloni bakteri,

kunder berupa asam laktat yang berlebih

C. Media tidak terhidrolisis.

sehingga kelebihan asam laktat ditunjukkan dengan terbentuk zona jernih (Melliawati

WK 53 WK 28

dkk., 2015).

WK 33

AB

C

WK 53

WK 33

Gambar 4. Uji aktivitas amilolitik Keterangan: A. Zona jernih, B. Koloni bakteri, C. Media tidak terhidrolisis.

WK 28

Hasil uji aktivitas lipolitik menun-jukkan terbentuk zona jernih di sekitar koloni pada media MRS agar dengan penambahan 2 ml minyak zaitun (Gambar 5). Isolat WK 28 (Pediococcus sp.), WK 33 (Lactobacillus sp.), dan WK 53 (Streptococ-cus sp.) mampu

menghasilkan

enzim

lipase

ekstraseluler.

AB C D Gambar 5. Uji aktivitas lipolitik Keterangan: A. Zona jernih, B. Koloni bakteri, C. Asam lemak bebas, D. Media tidak terhidrolisis.

Hasil penelitian isolasi bakteri asam laktat dari saluran pencernaan kepiting bakau didapatkan sebanyak 65 isolat yang

Isolasi bakteri adalah memisahkan

mempunyai zona jernih dan bersifat katalase

bakteri dari lingkungan dan menumbuhkan

negatif. Menurut Hardiningsih dkk. (2006),

sebagai biakan pada media buatan (Suryani

zona jernih yang terbentuk diduga bakteri

dkk., 2010). Menurut Khunajarkr et al.

asam laktat, selanjutnya dilakukan uji kata-

(2008), isolasi bakteri asam laktat dilakukan

lase. Zona jernih yang terbentuk serta kata103 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


lase negatif merupakan karakteristik bakteri

1.0-10.0 μm. Bakteri Lactobacillus sp. Ber-

asam laktat.

sifat Gram positif, tidak membentuk spora,

Hasil pemurnian isolat yaitu seba-

dan bersifat mikroaefilik. Bakteri Lacto-

nyak 65 isolat bakteri asam laktat dilanjut-

bacillus sp. tumbuh optimum pada suhu 30-

kan pada uji aktivitas proteolitik I. Hasil uji

40ºC. Menurut Holt et. al., (1994) bakteri

aktivitas proteolitik I dipilih tiga isolat yaitu

Streptococcus sp. berbentuk bulat, diamater

isolat WK 28 dengan diameter zona jernih

sel berukuran 0.5-2.0 μm. Bakteri Strepto-

12 mm, isolat WK 33 dengan diameter zona

coccus sp. bersifat non motil, tidak mem-

jernih 9 mm, dan isolat WK 53 dengan

bentuk spora, Gram positif, fakultatif an-

diameter zona jernih 10 mm. Isolat bakteri

aerob, katalase negatif. Bakteri Strepto-

asam laktat WK 28, WK 33, dan WK 53

coccus sp. tumbuh pada kisaran suhu 25-45

selanjutnya dilakukan karakterisasi dengan

ºC, optimum pada suhu 37ºC.

uji biokimia. Hasil uji biokimia pada Tabel

Uji aktivitas proteolitik II menun-

1. dibandingkan dengan Bergey’s Manual of

jukkan bahwa aktivitas proteolitik isolat WK

Determinative Bacteriology (Holt et al.,

28 (Pediococcus sp.), WK 33 (Lactobacillus

1994). Hasil uji biokimia menunjukkan

sp.), dan WK 53 (Streptococcus sp.) terus

isolat WK 28 termasuk ke dalam genus

meningkat sampai pada hari ke tujuh ber-

Pediococcus sp., isolat WK 33 termasuk ke

dasarkan diamater zona jernih yang diha-

dalam Lactobacillus sp., dan isolat WK 53

silkan. Menurut Yusmarini dkk. (2009),

termasuk ke dalam genus Streptococcus sp.

aktivitas proteolitik yang terus mengalami

Menurut Holt et. al., (1994), bakteri

peningkatan hal tersebut karena bakteri

Pediococcus sp. berbentuk bulat berantai

mampu tumbuh dan berkembangbiak. Bak-

pendek, beberapa berpasangan dan tidak

teri pada fase pertumbuhan menghasilkan

membentuk rantai. Diameter sel Pediococ-

metabolit primer berupa enzim protease eks-

cus sp. 1.0-2.0 μm. Bakteri Pediococcus sp.

traseluler, semakin besar zona jernih yang

bersifat Gram positif, tidak membentuk spo-

dihasilkan menunjukkan semakin besar ke-

ra, katalase negatif, tidak menghasilkan

mampuan isolat tersebut menghasilkan en-

nitrat. pertumbuhan optimum pada suhu

zim protease.

25º–40ºC. Menurut Holt et. al., (1994), bak-

Tujuan uji aktivitas proteolitik bak-

teri Lactobacillus sp. berbentuk batang be-

teri asam laktat adalah untuk mengetahui

rantai pendek umumnya berukuran 0.5-1.2 x

aktivitas enzim protease ekstraseluler pada 104 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


bakteri. Enzim protease ekstraseluler secara

zona jernih di sekitar koloni. Pengamatan

alami diproduksi oleh mikroba untuk meng-

zona jernih pada media agar 1% amilum

hidrolisis polipeptida dalam media menjadi

dengan diteteskan lugol sehingga terlihat

peptida dan asam amino (Wilson and

zona jernih di sekitar koloni, sedangkan

Remigio, 2012). Asam amino selanjutnya

daerah lainnya berwarna biru gelap. Hal

digunakan bakteri untuk pertumbuhan teru-

tersebut karena terjadi ikatan antara gugus

tama senyawa nitrogen yang akan masuk ke

amilum

dalam sel bakteri (Setyati dan Subagiyo,

(Frobisher, 1962).

2012).

dengan

senyawa

iodin/lugol

Isolat WK 53 (Streptococcus sp.) Senyawa nitrogen tidak dapat disin-

mampu

menghasilkan Menurut

enzim

amilase

Benson

(2001),

tesis oleh bakteri sehingga membutuhkan

ekstraseluler.

dari lingkungan hidup bakteri (Benson,

bakteri menghasilkan enzim amilase untuk

2001). Menurut Pollack

et al. (2005),

menghidrolisis amilum menjadi molekul

sumber senyawa nitrogen dipecah dari asam

maltosa, glukosa, dan dekstrin. Menurut

amino, peptida, pepton dan asam nukleat.

Frazier and Westhof (1988), glukosa sebagai

Senyawa nitrogen digunakan bakteri untuk

sumber energi untuk pertumbuhan bakteri.

memperbaiki sel yang rusak, nutrisi partum-

Isolat WK 28 (Pediococcus sp.) dan isolat

buhan bakteri, dan sintesis DNA/RNA.

WK 33 (Lactobacillus sp.) tidak meng-

Kemampuan menghidrolisis protein sebagai

hasilkan enzim amilase ektraseluler ditandai

salah satu kriteria seleksi bakteri probiotik.

dengan tidak terbentuk zona jernih di sekitar

Uji aktivitas amilolitik bertujuan

koloni pada media strach agar. Menurut

untuk mengetahui aktivitas enzim amilase

Frazier and Westhof (1988), setiap bakteri

ekstraseluler pada media agar dengan 1%

mempunyai kemampuan mensintesis enzim

amilum. Kemampuan isolat dalam mengha-

di dalam sel, tetapi hanya beberapa bakteri

silkan enzim amilase ekstraseluler ditunjuk-

yang mempunyai enzim ekstraseluler.

kan terbentuk zona jernih pada media agar

Uji aktivitas lipolitik bertujuan untuk

dengan 1% amilum (Sjofjan and Ardyati,

mengetahui aktivitas enzim lipase ekstra-

2011). Hasil uji aktivitas amilolitik menun-

seluler pada isolat bakteri asam laktat. Uji

jukkan bahwa isolat bakteri asam laktat WK

aktivitas lipolitik pada isolat bakteri asam

53 (Streptococcus sp.) yang mempunyai

laktat WK 28 (Pediococcus sp.), WK 33

aktivitas amilolitik dengan menghasilkan

(Lactobacillus sp.), dan WK 53 (Strepto105 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


coccus sp.) pada media MRS dengan pe-

Kesimpulan dan Saran

nambahan 2 ml minyak zaitun mampu

Hasil seleksi bakteri asam laktat pro-

menghasilkan zona jernih. Menurut Telussa

teolitik didapatkan tiga isolat yaitu WK 28,

(2013), enzim lipase akan menghidrolisis

WK 33 dan WK 53. Hasil uji biokimia isolat

minyak zaitun dan membentuk asam lemak.

WK 28 termasuk ke dalam genus Pedio-

Enzim lipase menghidrolisis asam palmiat

coccus sp., isolat WK 33 termasuk ke dalam

dalam minyak zaitun menjadi asam lemak

Lactobacillus sp., dan isolat WK 53 ter-

bebas berwarna kuning pada media.

masuk ke dalam genus Streptococcus sp.

Kemampuan bakteri menghidrolisis

WK 28 (Pediococcus sp.) dan WK 33

lemak dengan menghasilkan enzim lipase.

(Lactobacillus sp.) mempunyai aktivitas

Molekul lemak dihidrolisis menjadi molekul

proteolitik dan lipolitik. Isolat WK 53

gliserol dan asam lemak. Gliserol dan asam

(Streptococcus sp.) mempunyai aktivitas

lemak digunakan bakteri untuk mensintesis

enzimatis yaitu aktivitas proteolitik, amilo-

lemak pada bakteri dan komponen sel

litik, dan lipolitik. Perlu dilakukan pengujian

lainnya. Gliserol dan asam lemak teroksidasi

aktivitas antagonistik terhadap bakteri pato-

menghasilkan energi dalam kondisi aerobik

gen, pengujian ketahanan terhadap paparan

(Benson, 2001).

garam empedu dan beberapa uji lainnya un-

Isolat bakteri asam laktat WK 28 (Pediococcus sp.) dan WK 33 (Lactobacillus

tuk memenuhi kriteria sebagai bakteri kandidat probiotik.

sp.) diidentifikasi memiliki kemampuan dalam menghidrolisis protein dan lemak. Isolat WK 53 (Streptococcus sp.) diidentifikasi memiliki kemampuan dalam menghidrolisis protein, amilum, dan lemak. Sehingga dapat digolongkan sebagai kandidat probiotik. Menurut Bairagi et al. (2002), kriteria bakteri probiotik antara lain mempunyai aktivitas amilolitik, selulolitik, lipolitik dan proteolitik.

Daftar Pustaka Bairagi, A., K.S. Ghosh, S. K. Sen and A. K. Ray. 2002. Enzyme Producing Bacterial Flora Isolated from Fish Digestive Tracts. Aquaculture International, 10 : 109-121. Benson. 2001. Microbiological Applications. Laboratory Manual in General Microbiology. Eighth Edition. McGraw-Hill Science Company : New York. pp. 72-175. Chotimah, S.C. 2009. Peranan Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus dalam Proses Pembuatan Yogurt. Jurnal Ilmu Peternakan. Vol. 4 (2) : 49. 106 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


Fossi, B.T., F. Tavea, and R. Ndjouenkeu. 2005. Production and Partial Characterization Thermostable Amilase from Ascomycetes Yeast Strain Isolated from Starchy Soils. African Journal of Biotechnology, 4 (1) : 14-18. Frazier, W.C. and D.C. Westhoff. 1988. Food Microbiology. Fourth Edition. McGraw-Hill : USA. pp. 11-80. Frobisher, M. 1962. Fundamental of Microbiology. Seventh Edition. W.B. Saunders : USA. pp. 99-106, 172177, 248-251. Gismondo, M.R., L.Drago and A. Lombardi. 1999. Review of Probiotics Available to Modify Gastrointestinal Flora. Internasional Journal of Antimicrobial Agents, 12 : 287-292. Hardiningsih, R., R.N.R. Napitupulu dan T. Yulinery. 2006. Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas, 7 (1) : 15-17. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Wiliams. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Wilkins : USA. pp. 530-566. Jusadi, D., E. Gandara dan I. Mokoginta. 2004. Pengaruh Penambahan Probiotik Bacillus sp. pada Pakan Komersil terhadap Konversi Pakan dan Pertumbuhan. Jurnal Akuakultur Indonesia, 3 (1) : 15-18. Khunajakr, N., A. Wongwicham, D. Moonmangmee and S. Tantipaiboonvut. 2008. Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria Producing Antimicrobial Compounds From Pig Gastrointestinal Tracts. KMITL Sci. Tech. J., 8 (1) : 8-17. Lenkey, H.A.W. dan Soeharsono. 2010. Probiotik sebagai Makanan Fung-

sional. Probiotik. Widya Padjadjaran: Bandung. hal. 66-106. Melliawati, R., A.C. Djohan, and Yopi. 2015. Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Penghasil Enzim Protease. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1 (2) : 184-188. Nespolo, C.R. and A. Brandelli. 2010. Production of Bacteriocin-Like Substances by Lactic Acid Bacteria Isolated from Regional Ovine Cheese. Brazilian Journal of Microbiology, 41 : 1009-1018. Pollack, R.A., L. Findlay, W. Mondschein and R.R. Modesto. 2005. Laboratory Exercises in Microbiology. Second Edition. John Wiley and Sons, Inc : New Zaeland. pp. 44-45. Rohy, G.S., B.S. Rahardja dan Agustono. 2014. Jumlah Total Bakteri dalam Saluran Pencernaan Ikan Gurami (Osphronemus gouramy) dengan Pemberian Beberapa Pakan Komersial yang Berbeda. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 6 (1) : 2124. Salminen, S., A. Ouwehand, Y. Benno and Y.K. Lee. 1999. Probiotics. Trends in Food Science and Technology, 10 : 107-110. Setyati, W.A. dan Subagiyo. 2012. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Ekstraseluler (Proteolitik, Amilolitik, Lipolitik dan Selulolitik) yang Berasal dari Sedimen Kawasan Manggrove. Ilmu Kelautan, 17 (3) : 164168. Sjofjan, O. and T. Ardyati. 2011. Extracellular Amylase Activity of Amylolytic Bacteria Isolated from Quail’s (Coturnix japonica) Intestinal Tract in Corn Flour Medium. International Journal of Poultry Science, 10 (5) : 411-415. 107 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16


Sumarsih, S., B. Sulistiyanto, H.S. Adi dan C.S. Utama. 2010. Pengaruh Aras Starter Lactobacillus sp. terhadap Performa Mikrobiologi Silase Ikan Dilihat dari Total Bakteri, Bakteri Asam Laktat dan Fungi. Jurnal Kesehatan, 3 (1) : 43-50. Suryani, Y., Astuti, B. Oktavia dan S. Umniyati. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Limbah Kotoran Ayam sebagai Agensi Probiotikdan Enzim Kolesterol Reduktase. Prosiding Seminar Nasional Biologi. Universitas Negeri Yogyakarta. hal. 138-147. Svetlitshnyl, V., F. Rainey, and J. Wiegel. 1996. Thermosyntropha Lipolytica Grn. Nov., sp. Nov., a Lipolytic, Anaerobic, Alkalitolerant, Thermophilic Bacterium Utilizing Short and Long Chain Fatty Acidin Syntrophic Coculture with a Methanogenic Archaeum. International Journal of Systematic Bacteriology, 46: 1131-1137. Telussa, I. 2013. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Lipase dari Coco ButterSubtitute dan Karakterisasi Lipasenya. Prosiding FMIPA Universitas Pattimura. 10 hal.

Triyanto, A. Isnansetyo, I.D. Prijambada, J. Widada dan A. Tarmiawati. 2009. Isolasi, Karakterisasi dan Uji Infeksi Bakteri Proteolitik dari Lumpur Kawasan Hutan Bakau. Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci), 11 (1): 13-18. Wilson, P. and Z. Remigio. 2012. Production and Characterisation of Protease Enzyme Produced by a Novel Moderate Thermophilic Bacterium (EP1001) Isolated from an Alkaline Hot Spring, Zimbabwe. African Journal of Microbiology Research, 6 (27) : 5542-5551. Yelnetty, A., H. Purnomo, Purwadi, A. Mirah. 2014. Biochemical Characteristics of Lactic Acid Bacteria with Proteolytic Activity and Capability as Starter Culture Isolated from Spontaneous Fermented Local Goat Milk. Journal of Natural Sciences Research, 4 (10) : 137-146. Yusmarini, R. Indrati, T. Utami dan Y. Marsono. 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Proteolitik dari Susu Kedelai yang Terfermentasi Spontan. Jurnal Natur Indonesia, 12 (1) : 28-33.

108 | J I P K V o l . 8 N o . 2 D iterima /sub mitted :29 ja nuari 20 16 D isetu ju i/acce pted :21 Ju ni 20 16

Aktivitas Enzimatis Isolat Bakteri Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Kepiting Bakau (Scylla spp.) Sebagai Kandidat Probiotik

Recommend Documents