ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL FESES ORANGUTAN (Pongo pygmaeus) SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF LACTIC ACID BACTERIA FROM ORANGUTAN’S (Pongo Pygmaeus) FECES AS PROBIOTICS CANDIDATE Isma Prasthani H.P, Masdiana C. Padaga, Dyah A. Oktavianie Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya Email :
[email protected]; ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan mengetahui potensi probiotik BAL pada feses orangutan (Pongo pygmaeus). Sampel feses diisolasi dari 3 orangutan berusia lebih kurang 2 tahun yang diambil dari Taman Safari Indonesia II. Karakterisasi BAL berdasarkan sifat fenotip dan profil protein menggunakan SDS-PAGE. Kemampuan BAL sebagai probiotik berdasarkan ketahanan isolat pada kondisi saluran pencernaan menggunakan model cairan lambung pH 2,5 dan cairan getah empedu (Oxgall 0,3%). Hasil isolasi feses orangutan ditemukan kisaran jumlah BAL dengan rerata 5,09±1,74 107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara aerobic dan 5,86±2,15x107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara anaerobic. Dari 14 isolat BAL menunjukkan 2 isolat berbentuk kokus dan 12 isolat berbentuk batang yang berhasil diisolasi dari feses orangutan. 14 isolat BAL hasil karakterisasi fenotip berhasil dilakukan pendugaan isolat mendekati genus Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus sp dan Enterococcus sp. Berdasarkan hasil SDS-PAGE menunjukkan sebagian besar isolat BAL memiliki pita protein fungsional yang sama dengan berat molekul 111,6 kDa dan 99,96 kDa yang diduga merupakan protein bile salt hidrolase dan pita protein dengan berat molekul 33,25 kDa dan 31,47 kDa yang diduga merupakan protein bacteriocins. Hasil uji potensi BAL sebagai kandidat probiotik menunjukkan bahwa 14 isolat BAL mempunyai kemampuan tumbuh yang tinggi pada media asam (pH 2,5) dan garam empedu (Oxgall 0,3 %). Dapat disimpulkan bahwa Isolat BAL hasil isolasi dari feses orangutan (Pongo pygmaeus) memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai probiotik. Kata kunci : Orangutan, BAL, Karakterisasi, Probiotik ABSTRACT This study was aimed to isolate, characterize and discovered a potency of probiotics from orangutan (Pongo pygmaeus) feces. Feces samples were used from 3 orangutans approximately 2 years old, which were taken from Taman Safari Indonesia II. LAB characterization based on phenotype and protein profile was conducted by SDS-PAGE. Pottential assay of LAB as probiotic candidate was discovered by isolates resistance in gastrointestinal with pH of gastric fluid was 2.5 and bile fluid (Oxgall) was 0,3 %. The result of isolation LAB from orangutan feces was found LAB with average 5.09 ± 1.74 107 cfu / ml in aerobic condition and 5.86 ± 2.15 x107 cfu / ml in anaerobic condition. The results showed from 14 isolates of LAB there were 2 isolates with cocci form and 12 isolates with rods form. From phenotypic characterization of 14 LAB isolates can be predicted that the isolates have similiarity with Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus sp and Enterococcus sp. Based on the results of SDS-PAGE, the majority of LAB isolates has a functional protein bands with a molecular weight of 111.6 kDa and 99.96 kDa which suspected as bile salt hydrolase protein and the protein bands with molecular weight 33.25 kDa and 31.47 kDa which suspected as bacteriocins protein. The conclusion showed that the 14 LAB isolates from the orangutan (Pongo pygmaeus) feces have a potency as a probiotic candidates. Key words: Orangutan, LAB, Characterization, Probiotics
1
daging ayam mentah dan minuman tradisional yogurt. Namun demikian, penelitian tentang BAL pada wild animal terutama orangutan untuk mendapat isolat indigenous belum pernah dilakukan sebelumnya dan perlu penelitian lebih lanjut agar BAL dapat berperan sebagai probiotik. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL serta mengetahui potensi BAL sebagai kandidat probiotik yang diisolasi dari feses orangutan (Pongo pygmaeus).
PENDAHULUAN Pemanfaatan probiotik terbukti telah meningkatkan kesehatan saluran pencernaan. Sesuai yang disampaikan Schrezenmeir & de Vrese (2008) bahwa probiotik merupakan mikroorganisme hidup non patogen yang berpengaruh positif bagi kesehatan hewan dengan cara memperbaiki keseimbangan mikroflora indigenous dalam saluran pencernaan. Probiotik bermanfaat untuk kesehatan antara lain: meningkatkan ketahanan terhadap penyakit infeksi terutama diare, menurunkan resiko lactose intolerance dan meningkatkan sistem imunitas (Roberfroid, 2000). Penelitian mengenai bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi probiotik untuk kesehatan telah banyak dilakukan seperti pemanfaatan probiotik dalam penanggulangan penyakit infeksi saluran pencernaan (Laudanno, 2006; Savadogo, 2006). Beberapa spesies BAL yang umum digunakan sebagai probiotik adalah lactobacillus, enterococcus dan lactococcus (Gibson, 2000). Orangutan merupakan satwa liar yang rentan terserang penyakit infeksi saluran pencernaan. Berdasarkan data yang diperoleh dari Taman Safari tahun 2003-2004 penyakit yang sering menyerang orangutan adalah diare yang merupakan tanda terjadinya enteritis (Tilley & Smith, 1980; Lestari, 2004). Data tersebut didukung oleh studi yang dilakukan Minarwanto (2008) bahwa kasus penyakit pada orangutan sebagian besar berupa gangguan pencernaan seperti enteritis, gastritis dan lactose intolerance. Penggunaan bakteri probiotik dari saluran pencernaan orangutan mampu menurunkan resiko gangguan pencernaan karena lebih mudah beradaptasi dengan lingkungannya sehingga keseimbangan mikroflora dengan cepat dapat diperoleh. Penelitian terdahulu mengenai isolasi dan karakterisasi BAL sebagai kandidat probiotik telah dilakukan oleh Beasly, 2004; Lengkey, 2009; Azhari, 2011 yang melakukan isolasi, identifikasi dan eksploitasi BAL dari mikrobiota manusia
MATERI DAN METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan adalah seperangkat alat steril pengambilan sampel, glass ware, vortex (Maxi Mix II), Laminar Air Flow (LAF) (Nuaire Labgard Class II), inkubator (MMM Medcenter), mikroskop cahaya (Olympus TL2), foto digital mikroskopik (Olympus CX41), anerobic jar (OXOID), spektrofotometer (Genesys 20), sentrifugasi, Ultrasonic clearer (Branson 200), power pac basic (Bio-Rad), cetakan gel 20x16x1 cm3, elektroforesis chamber. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah Peptone (HIMEDIA REF RM 001500G), MRS Agar (De Man,Rogosa And Sharpe 1.10660.0500), MRS broth (Merck), beef ekstrak, Oksidase stick, OF Basal medium (MERCK 1.10282), H2O2 3 %, Oksidase kit, NaCl 6,5%, 10%, dan 18%, pewarna gram, perwarna spora, cairan empedu (Oxgall) 0,3%, HCl, NaOH, Gel Polyacrylamide, inhibitor protease 1 mM PSMF, cell-lytic B-II-Bactreial solution, 0,3 % Tris, 1,44% glycine, 0,1% SDS, Coomassie blue R-250 (MP001), 50% methanol, 10 % acetic acid, Page Ruler TM Prestained Protein Ladder Plus (SM1811). Prosedur Penelitian Preparasi Sampel Feses Penelitian ini menggunakan sampel feses yang berasal dari tiga orangutan yang berusia lebih kurang 2 tahun diambil dari 2
TSI II Prigen-Pasuruan. Pengambilan sampel diambil dilakukan 2 kali ulangan dan sampel yang diambil pada setiap ulangan dilakukan duplo sebanyak 1 gram secara aseptis menggunakan cotton swab yang dimasukan kedalam botol sampel steril dan disimpan pada suhu 5oC.
pair group averages).
method
using
arithmetic
Uji Potensi Bakteri Asam Laktat sebagai Kandidat Probiotik (Lin et al., 2006) Uji potensi isolat BAL sebagai probiotik meliputi uji ketahanan BAL terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) dan uji ketahanan terhadap sekresi garam empedu (Oxgall 0,3%) dengan menggunakan media MRS broth dengan menginokulasi isolat bakteri pada populasi awal minimal 108 cfu/ml kedalam media uji. a) Uji ketahanan BAL terhadap asam lambung Isolat BAL diinokulasikan kedalam medium selektif MRS broth yang ditambahkan HCL 2 N sehingga pH mencapai 2,5-3 (disesuaikan dengan pH lambung). Selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu 37oC selama 3-4 jam. Pengamatan pertumbuhan isolat dinyatakan dengan tingkat kekeruhan menggunakan spektrofotometer berdasarkan nilai OD (optical dencity) pada λ= 660 nm dan penanaman 1 ml isolat ke dalam media MRSA dengan metode pourplate yang kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Intepretasi hasil positif akan terlihat dengan peningkatan nilai OD dan pertumbuhan isolat pada media MRSA setelah inkubasi. b) Uji ketahanan BAL terhadap garam empedu ketahanan BAL terhadap getah empedu disesuaikan dengan kadar garam empedu pada saluran pencernaan yaitu dengan menggunakan oxgall sebanyak 0,3 % w/v dalam media MRS broth dengan pH 7,2. Pengujian pada konsentrasi garam empedu 0,3 % mengacu pada Marteu et al., (1997). Kultur kerja isolat BAL diinokulasikan ke dalam medium selektif MRS broth yang ditambahkan garam empedu 0,3%. Selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu 37oC selama 3-4 jam. Pengamatan pertumbuhan isolat dinyatakan dengan tingkat kekeruhan menggunakan spektrofotometer berdasarkan nilai OD (optical dencity) pada λ= 660 nm
Isolasi Bakteri Asam Laktat Isolasi bakteri dilakukan sesuai dengan Standar Nasional Indonesia (SNI) ISO 68871: 2012. Sampel feses yang telah dikoleksi dilakukan pengenceran secara berseri (101 ,10-2, 10-3, 10-4,10-5dan 10-6) menggunakan pepton water steril. Hasil pengenceran 10-2, 10-4, dan 10-6 ditanam menggunakan metode pour plate pada media selektif MRS agar (MRSA) (steril, diinkubasi secara anerobic dalam 5% CO2 pada suhu 37°C selama 48 jam. Pemurnian bakteri dengan menggunakan teknik penggoresan kuadran pada media MRSA. Target pemurnian adalah koloni yang memiliki morfologi koloni berbeda, bersifat katalase negatif dan termasuk kedalam bakteri Gram positif. Selanjutnya, dipilih 3 jenis koloni dominan untuk dilakukan karakterisasi koloni dan bakteri. Setiap koloni dibuat triplo sehingga diperoleh 54 isolat yang berasal dari orangutan A, orangutan B dan orangutan C. Karakterisasi Fenotip Bakteri Asam Laktat Karakterisasi isolat BAL berpedoman pada buku Cowan and Steel’s Manual for the identification of medical bacteria (Barrow & Feltham, 1993). Sifat morfologi yang diamati meliputi morfologi koloni dan morfologi sel. Pengamatan fisiologis yang meliputi motilitas, uji kemampuan tumbuh pada suhu 15°C, 37°C, dan 45°C, pada MRS broth dengan konsentrasi NaCl 6,5%, 10%, dan 18% Sedangkan karakterisasi secara biokimiawi yang dilakukan antara lain : uji katalase, oksidase, Indole, reduksi nitrat, hidrolisis pati, oksidatif-fermentatif (OF) dan uji fermentasi glukosa. Pendugaan isolat BAL berdasarkan nilai uji similaritas yang menggunakan metode UPGMA (Unwighted 3
dan penanaman 1 ml isolat ke dalam media MRSA dengan metode pourplate yang kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Intepretasi hasil yang menandakan positif akan terlihat dengan peningkatan nilai OD dan pertumbuhan isolat pada media MRSA setelah inkubasi.
ditambahkan 5 ml phospat buffer 0,1 M (pH7,4). Sel bakteri didapat setelah dilakukan sentifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Sel bakteri sebelumnya dilakukan sonifikasi selama 10 menit. Pellet ditambahkan etanol 96 % dengan rasio (1:1) kemudian di inkubasi pada suhu dingin -20oC selama 24 jam dan di sentifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pellet yang dihasilkan selanjutnya di tambahkan Tris Hcl dengan rasio (1:1). Protein marker yang digunakan dalam penelitian ini PageRuler™ Prestained Protein Ladder Plus (10 hingga 250 kDa).
Analisa Profil Protein BAL menggunakan SDS-PAGE (Ghazi et al., 2009) Hanya 9 isolat representatif dipilih berdasarkan nilai uji similaritas terdekat untuk diketahui profil proteinnya. Preparasi sampel protein menggunakan fresh culture isolat BAL dalam media MRS broth yang
Rerata jumlah BAL (cfu/ml) pada sampel feses tiga orangutan usia lebih kurang 2 tahun di TSI II dapat dilihat pada Tabel 1 berikut ini :
HASIL DAN PEMBAHASAN Jumlah Bakteri Asam Laktat Pada Feses Orangutan
Tabel 1. Rerata Jumlah BAL pada Feses Orangutan di TSI II Kode Sampel Rerata Jumlah Koloni BAL (107cfu/ml)* Aerobic Anaerobic 3,20±1,33 3,47±1,68 A 6,82±1,11 7,67±1,28 B 5,25±0,11 6.45±0,41 C 5,09±1,74 5,86±2,15 Rerata 5,09±1,74x107 cfu/ ml. Menurut Candra (2006) BAL termasuk kedalam mikroorganisme bersifat anaerob facultatif yang menggunakan proses fermentasi sebagai metabolisme utama dalam menghasilkan energi, tergantung dari ketersedian oksigen dalam lingkungan pertumbuhannya. Pada Tabel 1. dapat dilihat bahwa masing-masing individu orangutan mempunyai rerata jumlah koloni BAL berbeda. Perbedaan jumlah koloni BAL pada saluran pencernaan orangutan dipengaruhi oleh kapasitas fermentasi pada colon yang memungkinkan bakteri probiotik berkembangbiak dengan jumlah yang berbeda. Menurut Freitas et al., (2003) keseimbangan jumlah BAL yang ada di saluran pencernaan sangat bergantung pada kebiasaan makan dan kemampuan orangutan
Pada penelitian ini BAL memiliki jumlah yang cukup besar pada populasi mikroflora dalam feses orangutan dapat dilihat pada Tabel 1. Menurut Salminen (1998) saluran pencernaan orangutan diperkirakan mengandung flora normal mencapai 1012 bakteri per gram isi saluran cerna dan lebih kurang 500 spesies merupakan BAL. Penelitian terdahulu pernah dilakukan oleh Pertiwi (2008) yang berhasil mengisolasi BAL dari feses tikus dengan 9
rerata jumlah BAL berkisar 9,12 x10 cfu/ml. Berdasarkan Tabel 1. diketahui bahwa sampel feses orangutan yang di inkubasi secara anaerobic memiliki kisaran jumlah BAL dengan rerata 5,86±2,15x107 cfu/ml. Nilai ini lebih tinggi dibandingkan sampel feses yang diinkubasi secara aerobic yang memiliki kisaran jumlah BAL dengan rerata 4
untuk memfermentasi serat dalam jumlah
yang signifikan.
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Isolasi BAL asal feses orangutan (Pongo pygmaeus) diperoleh 54 koloni (Lampiran 5) setelah dilakukan pewarnaan Gram dan Uji katalase di dapatkan 14 koloni
murni dipilih berdasarkan kemampuan tubuh isolat dengan karakteristik yang disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Karakterisasi Isolat BAL Karakteristik fenotipe Growth in air Anaerobic Suhu 370C Suhu 450C Suhu 150C NaCl 6,5% NaCl 10 % NaCl 18 % Oksidase Katalase Motilitas Indole Reduksi nitrat Hidrolisis pati O/F Galaktosa Glukosa Xylose Arabinos Fruktosa Laktosa Maltose Sukrosa Manitol
AA + + + + + + + F + + + -
AF + + + + + + + + F + + + + + + -
AG + + + + + + + + F + + -
BD + + + + + + + F + + + + + + -
CI + + + + + + + + F + + -
+ + + + + + + + F + + + + + + + +
AK + + + + + + + + F + + + + + +
AL + + + + + + + + F + + + + +
BM + + + + + + + + F + + + +
BN + + + + + + + + F + + + + + -
BO + + + + + + + + F + + + + + +
CP + + + + + + + + F + + + + + + +
CQ + + + + + + + + F + + + + + + +
CR + + + + + + + + F + + + + + + +
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
AJ
5
Lactobacillus sp
Keterangan : O : Oksidatif; F: Fermentatif; (+): Reaksi positif; (-): Reaksi negatif.
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Enterococcus sp\ Aerococcus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
ccus spp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Lactobacillus sp
Pedicoccus sp
Ribose Pendugaan Genus
Kode Isolat
Karakterisasi isolat berpedoman pada buku Cowan and Steel Manual of The Identification of Medical Bacteria. Hasil karakterisasi isolat dapat dilakukan Pendugaan isolat BAL mendekati genus Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus sp dan Enterococcus sp berdasarkan nilai uji similaritas masing-masing isolat yang disajikan dalam bentuk fenogram untuk
mengetahui jarak kedekatan antar isolat BAL hasil isolasi dengan isolat BAL acuan. Nilai similaritas mendekati 1 menunjukan bahwa ada kemungkinan isolat tersebut dari genus dan spesies yang sama. Dari nilai similaritas diperoleh 14 isolat BAL yang dikelompokkan kedalam 5 kelompok bakteri yang memiliki genus dan spesies berbeda seperti pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengelompokan dugaan isolat BAL hasil karakterisasi berdasarkan nilai uji similaritas dengan isolat acuan (Lactobacillus sp, Pedicoccus spp, Aerococcus spp dan Enterococcus spp) Kode Sumber Isolat Nilai Dugaan isolat Isolat similaritas CP Orangutan C 0,919 Lactobacillus casei /plantarum CQ Orangutan C 0,919 Lactobacillus casei /plantarum CR Orangutan C 0,919 Lactobacillus casei /plantarum BO Orangutan B 1,000 Lactobacillus casei /plantarum AL Orangutan A 0,919 Lactobacillus casei/plantarum AK Orangutan A 0,919 Lactobacillus casei/plantarum AJ Orangutan A 1,000 Lactobacillus casei/plantarum BN Orangutan B 1,000 Lactobacillus acidophilus AF Orangutan A 0,944 Lactobacillus acidophilus BD Orangutan B 0,933 Lactobacillus delbrueckii /brevis AG Orangutan A 0,741 Lactobacillus delbrueckii /brevis CI Orangutan C 0,741 Lactobacillus delbrueckii /brevis AA Orangutan A 0,730 Pedicoccus sp BM Orangutan B 0,740 Aerococcus sp /Enterococcus sp Berdasarkan Tabel 3 isolat BAL yang terkoleksi dapat dikelompokkan menjadi 5 kelompok isolat BAL yang mempunyai genus dan spesies yang berbeda. Kelompok satu terdiri dari isolat CP, CR, CQ, BO, AL, AK dan AJ yang memiliki karakteristik mendekati spesies Lactobacillus casei dan Lactobacillus plantarum. Kelompok dua terdiri dari isolat BN dan AF yang memiliki karakteristik mendekati spesies Lactobacillus acidophilus. Kelompok tiga terdiri dari isolat BD, AG dan CI yang memiliki karakteristik mendekati spesies Lactobacillus delbrueckii dan Lactobacillus brevis. Kelompok empat, isolat AA yang memiliki karakteristik mendekati genus Pedicoccus sp. Kelompok lima, isolat BM yang memiliki karakteristik mendekati genus Aerococcus sp dan
Enterococcus sp. Hasil karakterisasi isolat BAL asal feses orangutan didominasi oleh genus Lactobacillus sp. Menurut pendapat Dibner & Richard (2005); Carol et al., (2011) bahwa koloni BAL genus Lactobacillus banyak ditemukan pada saluran pencernaan hewan. Uji Potensi BAL sebagai Kandidat Probiotik Kondisi yang kritikal bagi BAL pertama kali pada saat bakteri memasuki saluran pencernaan, yakni terpapar pada cairan asam lambung dan cairan garam empedu yang ada di usus. Menurut Havenaar et al., (1992) untuk mengembangkan galur probiotik baru perlu dilakukan seleksi secara 6
in vitro yang meliputi sensitivitas ketahanan terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) dan cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %). Data
hasil ketahanan isolat terhadap asam lambung dan cairan garam empedu dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Kemampuan hidup isolat BAL pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 % diukur menggunakan spektrofotometer λ= 660nm dengan satuan Optical density (OD) Kode Isolat
Nilai Optical dencity (OD) isolat pada jam kepH 2,5
Oxgall 0,3 %
t0 t4 t0 0,444 0,569 0,404 AA 0,439 0,546 0,402 BD 0,369 0,383 0,316 AF 0,521 0,677 0,521 AG 0,464 0,588 0,441 CI 0,504 0,529 0,457 AJ 0,428 0,508 0,365 AK 0.490 0,538 0,435 AL 0,476 0,539 0,414 BM 0,459 0,501 0,499 BN 0,537 0,618 0,497 BO 0,401 0,575 0,491 CP 0,501 0,593 0,504 CQ 0,455 0,567 0,438 CR Keterangan : t0 : sebelum inkubasi; t4: setelah 4 jam inkubasi Hasil kemampuan tumbuh isolat BAL menunjukkan bahwa terdapat peningkatan nilai OD dari sebelum inkubasi (t0) dan setelah inkubasi (t4). Peningkatan nilai OD menunjukkan isolat BAL yang diisolasi dari feses orangutan mempunyai ketahanan cukup tinggi terhadap cairan asam lambung dan garam empedu.
t4 0,888 0,678 0,510 0,874 0,870 0,696 0,482 0,658 0,678 0,660 0,949 0,722 0,865 0,714
mempunyai ketahanan untuk beradaptasi pada cairan asam lambung (pH 2,5) karena kemampuannya dalam mempertahankan pH sitoplasma melalui translokasi protein yang dibantu oleh enzim. Enzim-enzim yang berperan dalam ketahanan BAL terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) adalah enzim histidin dekarboksilase, enzim arginin deiminase dan enzim protease (De Angelis et al., 2002; Casiano-Colon & Marquis 1998). Isolat AA merupakan isolat BAL berbentuk kokus memiliki ketahanan terhadap cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %) paling tinggi diantara isolat yang berbentuk kokus. Isolat BO merupakan isolat BAL berbentuk batang memiliki ketahanan terhadap cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %) paling tinggi diantara isolat yang berbentuk batang. Hal ini menunjukkkan
Isolat CP merupakan isolat BAL berbentuk batang yang memiliki ketahanan terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) paling tinggi diantara isolat yang berbentuk batang. Isolat AA merupakan isolat BAL berbentuk kokus memiliki ketahanan terhadap cairan asam lambung (pH 2,5) paling tinggi diantara isolat yang berbentuk kokus. Hal ini menunjukkkan bahwa Isolat BAL yang di uji mampu melewati saluran lambung yang bersifat asam. Isolat BAL 7
bahwa Isolat BAL yang di uji mampu melewati saluran pencernaan terutama usus tempat disekresikannya cairan garam empedu. Hasil penelitian terdahulu (Kusumawati, 2002; Ngatriah et al., 2000; Wijayanto, 2009) menunjukan bahwa BAL memiliki ketahanan terhadap cairan garam empedu yang beragam. Menurut Smet et al., (1995) beberapa jenis BAL memiliki enzim bile salt hydrolase dengan aktivitas untuk menghidrolisis garam empedu yang mampu mengubah kemampuan fisik dari kimia garam empedu sehingga tidak bersifat racun
bagi BAL. Hal ini yang menyebabkan isolat BAL mempu bertahan pada kondisi kritikal ketika terpapar pada cairan garam empedu yang ada di usus. Penanaman pada media MRSA merupakan pengujian tahap lanjut terhadap isolat BAL yang terlebih dahulu telah ditumbuhkan pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 %. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolat BAL mampu tumbuh dengan baik setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam (Gambar 1).
Gambar 1. Isolat BAL yang mempunyai kemampuan tumbuh paling tinggi pada media MRSA setelah ditumbuhkan pada pH 2,5 dan Oxgall 0,3 %. Menurut Zavaglia et al., (1998) dan Jacobsen et al., (1999), bakteri yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam media selektif MRS yang ditambahkan oxgall 0,3 % dan pH asam dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu dan tahan terhadap asam lambung.
mendukung hasil karakteristik fenotip isolat BAL. Dari hasil running dengan elektroforesis menggunakan acuan protein marker PageRuler™ Prestained Protein Ladder Plus (10 hingga 250 kDa) dapat terdeteksi berat molekul isolat BAL dengan kisaran 12, 34 kDa hingga 155,26 kDa, berat molekul protein dan jumlah pita masingmasing isolat BAL dapat dilihat pada (Gambar 2).
Analisa Profil Protein BAL Analisa profil protein isolat akan mendukung dari hasil karakterisasi isolat BAL. Sesuai dengan pendapat Ghazi et al., (2009) yang menyatakan metode analisa SDS-PAGE dengan ekspresi profil protein yang berbeda dapat digunakan untuk 8
Marker
K (1)
K (2)
K (3)
K (4)
K (5)
Gambar 2. Profil Pita Protein Isolat BAL berdasarkan kelompok Keterangan : K(1): kelompok isolat bakteri 1 K(2): kelompok isolat bakteri 2 K(3): kelompok isolat bakteri 3 K(4): kelompok isolat bakteri 4 K(5): kelompok isolat bakteri 5 Dari hasil SDS-PAGE dapat dilihat karakteristik profil pita protein masingmasing isolat yang memperlihatkan jumlah profil pita protein yang terdeteksi beserta berat molekul protein terdeteksi. Isolat CR, AJ dan BO memiliki karakteristik yang sama ditunjukkan dengan adanya profil pita protein dengan berat molekul 64,36 kDa yang dimiliki ketiga isolat tersebut, antara AJ dan BO memiliki kemiripan karakteristik yang lebih tinggi dengan adanya 3 pita protein yang sama dengan berat molekul berturut-turut 111,6 kDa, 71,85kDa dan 64,36 kDa. Isolat BN dan AF memiliki karakteristik sama ditunjukkan dengan pita protein yang memiliki berat molekul sama yakni 64,36 kDa. Selain itu, isolat AG dan BD memiliki tingkat kemiripan karakteristik yang tinggi ditunjukkan dengan banyaknya pita protein yang sama dengan berat molekul 111,6 kDa, 94,6 kDa, 71,8 kDa dan 20,2 kDa. Sesuai Tabel 5.6 hasil karakterisasi
pita protein Isolat AA dan BM mampu terdeteksi berturut-turut sebanyak 17 dan 7 pita protein. Hal tersebut sesuai dengan karakteristik fenotip isolat BAL yang mengkelompokan isolat BAL kedalam genus yang sama. Hasil penelitian ini didukung oleh Sanchez et al., 2003; Ghazi et al., 2009 yang menyebutkan adanya profil protein yang terlihat pada karakterisasi profil protein menggunakan SDS-PAGE akan mendukung hasil karakterisasi fenotip isolat. Bakteri asam laktat mempunyai profil protein yang menunjukkan protein fungsional. Hasil analisa profil protein terlihat adanya kesamaan beberapa profil protein dari sebagian besar isolat BAL (AJ, BO, BN, AG, BD, AA dan BM) dengan berat molekul 111,6 kDa dan 99,96 kDa yang diduga protein tersebut merupakan protein fungsional yang dimiliki oleh sebagian besar isolat BAL. Profil protein yang menunjukkan berat molekul 111,6 kDa 9
dan 99,96 kDa diduga jenis protein bile salt hidrolase (BSH) yang dimiliki oleh BAL. Hasil tersebut didukung oleh penelitian yang dilakukan Lundeen & Savage (1992) berhasil mendeteksi berat molekul protein BSH dari Lactobacillus.sp dengan kisaran berat molekul 80,00 sampai 115,00 kDa. Bile salt hidrolase adalah enzim untuk menghidrolisis garam empedu yang mampu mengubah kemampuan fisik dari kimia garam empedu sehingga tidak bersifat racun bagi BAL dan menyebabkan BAL mampu tahan terhadap garam empedu. Hal ini mendukung hasil uji potensi BAL sebagai probiotik yang ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan isolat BAL pada media yang telah ditambahkan Oxgall 0,3 %. Pada isolat BAL (AJ, BD, AG dan BO) mempunyai profil protein dengan berat molekul berturut-turut 33,25 kDa dan 31,47 kDa yang diduga merupakan berat molekul dari protein bacteriocins. Profil protein yang menunjukkan berat molekul 33,25 kDa dan 31,47 kDa diduga jenis protein bacteriocins yang dimiliki oleh BAL. Hasil tersebut didukung oleh penelitian yang dilakukan Drider et al., (2006) telah berhasil mengindentifikasi protein bacteriocins yang memiliki berat molekul berkisar > 30 kDa pada BAL. Bacteriocins merupakan salah satu senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh BAL. Dari hasil running elektroforesis telah terdeteksi pita-pita protein lain yang belum diketahui jenis proteinnya, hal ini dikarenakan hasil ekstraksi yang digunakan adalah crude protein sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut untuk purifikasi dan identifikasi protein lain terutama yang ditemukan pada beberapa isolat BAL.
fenotip mendekati genus Lactobacillus sp, Pedicoccus sp, Aerococcus sp Enterococcus sp. Bakteri asam laktat hasil isolasi feses orangutan memiliki karakteristik profil protein yang sama dan mempunyai pita protein yang menunnjukkan protein fungsional BAL sebagai probiotik. Isolat BAL hasil isolasi feses orangutan diketahui mempunyai potensi tinggi sebagai probiotik yang ditunjukkan dengan kemampuan tumbuh yang cukup tinggi pada media yang ditambahkan cairan asam lambung (pH 2,5) dan cairan garam empedu (Oxgall 0,3 %). UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada direktorat jenderal DIKTI yang telah memberikan pembiayaan penelitian ini sehingga penelitian ini mampu selesai sesuai dengan yang diharapkan. Terima kasih kepada pihak Taman Safari Indonesia II yang telah membantu dalam penyediaan sampel feses orangutan. Terima kasih kepada Laboratorium Sentral Ilmu Hayati dan Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya yang telah menjadi tempat penelitian. Terima kasih kepada dosen pembimbing serta rekanrekan peneliti atas dukungan serta bantuan dalam kerjasama yang baik untuk penyelesaian penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Anonimus. 2012. Standar Nasional Indonesia (SNI) ISO 6887-1: 2012. 2012. Penyiapan Contoh Uji, Suspensi Awal, Dan Pengenceran Awal Untuk Pengujian Mikrobiologi. Badan Standarisasi Nasional Indonesia.
KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian maka disimpulkan bahwa dari hasil isolasi BAL asal feses orangutan didapatkan 14 isolat BAL dengan rerata jumlah bakteri 5,09±1,74 107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara aerobic dan 5,86±2,15x107 cfu/ml yang ditumbuhkan secara anaerobic. Bakteri asam laktat hasil isolasi feses orangutan memiliki karakteristik
Azhari, Asmahan. 2011. Isolation and Identification of LAB Isolated from Traditional Drinking Yoghurt in Khartoum State, Sudan. Current Research in Bacteriology 4(1) :16-22. Barrow, G.I. and R. Feltham. 1993. Cowan and Steel’s Manual for 10
the identification of medical bacteria. 3rd ed. Cambridge University Press: Great Britain.
Drider, D., G. Fimlan., Y. Hechard., L. M. McMullen and H. Prevost. 2006. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev 70: 564–582.
Beasley, Shea. 2004. Isolation, Identification and Exploitation of LAB from Human and Animal Microbiota. Academic Dissertation in Microbiology, Faculty of Agriculture and Forestry and Viikki Graduate School in Biosciences University of Helsinki.Finland.
Freitas, M., E. Tavan., C. Cayuela., L. Diop., C. Sapin and G. Trugnan. 2003. HostPathogens Cross-Talk. Indigenous Bacteria and Probiotics Also Play The Game. Biology of the Cell 95 : 503–506.
Candra, Joddi. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos Chanos). [Skripsi]. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institu Pertanian Bogor.
Ghazi, F., D. E. Henni., Z. Benmechernene and M. Kihal. 2009. Phenotypic and Whole Cell Protein Analysis by SDSPAGE for Identification of Dominants Lactic Acid Bacteria Isolated from Algerian Raw Milk. World Journal of Dairy & Food Sciences 4 (1) : 78-87.
Carol, A., V. Reene., and L.M.T. Dicks. 2011. Horizontal Gene Transfer Amongst Probiotic Lactic Acid Bacteria and Other Intestinal Microbiota: What Are The Possibilities?. Arch Microbiol. 193:157-168.
Havenaar, R and J.H.J. Huis in’t Veld. 1992. Selection of Strains for Probiotic Use. Dalam: Fuller, R. (ed.). Probiotics : The Scientific Basic. London.209-224. Jacobsen, C.N., V.R. Nielsen., A.E. Hayford., P.L. Moller., K.F. Michaelsen., A.P. Erregard., B. Sandstrom., M. Tvede and M. Jakobsen. 1999. Screening of Probiotic Activities of Forty Seven Strains of Lactobacillus spp. by In Vitro Techniques and Evaluation of The Colonization Ability of Five Selected Strains in Human. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4949-4956.
Casiano-Colón A, and R.E. Marquis. 1998. Role of The Arginine Deiminase System In Protecting Oral Bacteria and An Enzymatic Basis for Acid Tolerance. Appl Environ Microbiol. 54(6):1318– 1324. De Angelis, M., L. Mariotti., J. Rossi., M. Servili., P. F. Fox.,G. Rollan and M.Gobbetti. 2002. Arginine Catabolism By Sourdough Lactic Acid Bacteria: Purification And Characterization Of The Arginine Deiminase Pathway Enzymes From Lactobacillus Sanfranciscensis CB1. Applied And Environmental Microbiology 68(12): 6193-6201.
Kusumawati, N. 2002. Seleksi Bakteri Asam Laktat Indigenus sebagai Galur Probiotik dengan Kemampuan Mempertahankan Keseimbangan Mikroflora Usus Feses dan Mereduksi Kolesterol Serum Darah Tikus. [Tesis]. Program Studi Ilmu Pangan. Institut Pertanian Bogor.
Dibner, J.J. and J.D. Richards. 2005. Antibiotic growth promoters in agriculture: History and mode of action. Poul. Sci. 84: 634–643.
Laudanno, O. M., L. Vasconcelos., J. Catalana and J.A. Cesolari. 2006. Anti-Inflammatory Effect of Bioflora Probiotic Administered Orally or 11
Subcutaneously with Live or Dead Bacteria. Dig Dis Sci 51: 2180–2183
Lactobacillus Plantarum.[Skripsi]. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor.
Lengkey, H.A.W., R. L. Balia., I. Togoe., B. A. Tasbac and M. Ludog. 2009. Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Raw Poultry Meat. Biotechnology in Animal Husbandry 25 (5-6): 1071-1077.
Salminen, S and A. V. Wright. 1998. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspecs 2 nded. Marcel Dekker, Inc. New York. Sanchez, I., S. Sesena and L. Palop. 2003. Identification of lactic acid bacteria from spontaneous fermentation of ‘Almagro’ eggplant by SDS-PAGE whole cell protein fingerprinting. Int. J. Food Microbiol. 2555: 181-189.
Lestari, R. 2004. Pengaruh umur, Pakan, dan Kesehatan Terhadap Kerontokan Bulu Orangutan (Pongo pygmaeus) di Taman Safari Cisarua Bogor. [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan. Institut Pertanian Bogor.
Savadogo, A., C. Ouattara., I. Bassol and S. Traore. 2006. Review Bacteriocins and lactic acid bacteria. African Journal of Biotechnology 5 (9): 678-683
Lin W. H., C. F. Hwang, L. W. Chen and H. Y. Tsen. 2006. Viable Counts, Characteristic Evaluation for Commercial Lactic Acid Bacteria Products. J. Food Microbiol. 23: 74-81.
Schrezenmeir, J. M. and de Vrese . 2008. Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics. Adv Biochem Engin/Biotechnol (111): 1–66.
Lundeen, S.G and D. C. Savage. 1992. Multiple Forms of Bile Salt Hydrolase from Lactobacillus sp. Strain 100-100. Journal of Bacreriology. 174(22): 72177220.
Smet, I.D., L. van Hoorde, M.V. Woestyne, H. Christiaens and W. Verstraete. 1995. Significance of Bile Salt Hydrolytic Activities of Lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 79 : 292-301.
Minarwanto, Hendra. 2008. Studi Aktivitas Harian Orangutan (Pongo pygmaeus wurmbii, Grove, 2001) Di Orangutan Care Center And Quarantine Pangkalan Bun, Kalimantan Tengah. [skripsi]. Fakultas Kehutanan. Institu Pertanian Bogor.
Tilley, L and P. Smith.1980.The 5-minute veterinary Consult. Wijayanto, Umar. 2009. Analisis In Vitro Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat Asal Daging Sapi Terhadap pH Lambung, pH Usus dan Garam Empedu sebagai Kandidat Probiotik. [Skripsi]. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor.
Ngatirah, A., E. S. Harmayanti dan T. Utami. 2000. Seleksi Bakteri Asam Laktat Sebagai Agensia Probiotik yang Berpotensi Menurunkan Kolesterol. Prosiding Seminar Nasional Industri Pangan. PATPI (II) : 63-70.
Zavaglia, A. G., G. Kociubinski, P. Perez and G. De Antoni. 1998. Isolation and Characterization of Bifidobacterium Strains for Probiotic Formulation. J. Food Protect. 61(7) : 865-873.
Pertiwi, Widimartani. A. 2008. Profil Mikroflora Feses Dan Usus Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Dengan Konsumsi Daging Yang Difermentasi Oleh 12
13
