II. METODE 2.1 Rancangan Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 6 perlakuan dan 2 ulangan pada uji patogenisitas, serta 4 perlakuan dan 3 ulangan pada uji antagonistik in vivo. Model statistik RAL yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1982):
Dimana: Yij
= Data respon yang diamati pada perlakuan ke-i dan ulangan ke- j
µ
= Nilai tengah data
βi
= Pengaruh perlakuan ke- i
εij
= Galat percobaan pada perlakuan ke- i dan ulangan ke- j
2.2 Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik Bakteri kandidat probiotik diisolasi dari air kolam pembesaran ikan nila merah Departemen BDP, FPIK IPB dan saluran pencernaan (usus) berbagai macam ikan budidaya air tawar. Kolam pembesaran tersebut menggunakan sistem budidaya intensif, terdapat satu kincir air listrik pada bagian tengah serta inlet dan outlet yang terus dialiri air. Ikan yang digunakan adalah ikan nila Oreochromis niloticus yang berasal dari daerah Ciseeng, Kabupaten Bogor, ikan nila merah Oreochromis sp. yang berasal dari daerah Parung, Kabupaten Bogor, ikan lele Clarias batrachus yang berasal dari daerah Parung, Kabupaten Bogor, serta ikan mas Cyprinus carpio yang berasal dari daerah Ciherang, Kabupaten Bogor. Air kolam sebagai larutan stok diencerkan dengan phosphat buffer saline (PBS) hingga menjadi pengenceran 10-5. Sampel air kolam yang diencerkan pada 10-3, 10-4, dan 10-5 disebar sebanyak 0,1 mℓ pada cawan petri berisi media trypticase soy agar (TSA) lalu diinkubasi pada suhu 27-30 °C selama 24 jam. Pengambilan organ pencernaan (usus) ikan dilakukan dengan cara dibedah. Usus dipotong menjadi beberapa bagian, setiap 0,1 g usus dicampurkan dengan 0,9 mℓ PBS dalam Eppendorf lalu digerus hingga halus. Hasil gerusan usus ini yang menjadi stok inokulum, kemudian 0,1 mℓ stok diencerkan ke dalam 0,9 mℓ PBS hingga pengenceran 10-6. Suspensi sampel pada pengenceran 10-4, 10-5,
3
dan 10-6 disebar sebanyak 0,1 mℓ pada cawan petri berisi media TSA lalu diinkubasi pada suhu 27-30 °C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni tunggal yang tumbuh pada media kultur dan memiliki profil berbeda diambil menggunakan ose lalu digores pada cawan petri berisi media TSA steril dengan metode gores kuadran. Isolat yang telah digores tersebut diinkubasi kembali pada suhu 27-30 °C selama 24 jam untuk mendapatkan isolat tunggal yang murni. Isolat murni dipindahkan ke tabung reaksi berisi media TSA steril untuk disimpan sebagai stok isolat bakteri kandidat probiotik dan digunakan untuk uji selanjutnya. 2.3 Uji Aktivitas Amilolitik dan Proteolitik Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim amilase dan protease yang dihasilkan oleh masing-masing isolat, untuk menunjukkan kemampuannya dalam menghidrolisis karbohidrat dan protein. Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media brain heart infusion agar (BHIA) yang telah ditambahkan pati sebanyak 2% untuk uji amilolitik. Kemampuan menghidrolisis karbohidrat ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang tumbuh, setelah agar digenangi dengan reagen KI 1%. Koloni yang tidak mampu menghidrolisis karbohidrat tidak terdapat zona bening di sekitar koloni yang tumbuh. Pada uji aktivitas proteolitik, bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media BHIA yang telah ditambahkan susu skim sebanyak 2%. Kemampuan menghidrolisis protein ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang tumbuh. Isolat dengan aktivitas amilolitik dan proteolitik paling besar dipilih untuk diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik (Sa5). 2.4 Uji Sensitivitas Antibiotik Uji ini dilakukan untuk menguji sensitivitas bakteri kandidat probiotik serta Sa5 pada beberapa jenis antibiotik serta membantu dalam pembuatan penanda untuk memonitor keberadaan bakteri yang akan digunakan pada uji in vitro sehingga dapat dibedakan dengan jenis bakteri lain. Jenis antibiotik yang digunakan adalah Rifampisin, Streptomisin, Kanamisin, dan Penisilin G. Konsentrasi yang digunakan untuk setiap jenis antibiotik tidak sama. Antibiotik Rifampisin diuji pada konsentrasi 25 dan 100 μg/mℓ, Streptomisin pada 4
konsentrasi 50 dan 100 μg/mℓ, Kanamisin pada konsentrasi 50 dan 100 μg/mℓ, serta Penisilin G pada konsentrasi 50 dan 100 μg/mℓ. Kandidat probiotik digoreskan pada media BHIA yang telah ditambahkan antibiotik dengan metode streak plate lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 °C . Bakteri yang sensitif terhadap antibiotik ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni pada media BHIA yang mengandung antibiotik, sedangkan bakteri yang resisten akan tetap tumbuh pada media tersebut. 2.5 Penyiapan Bakteri Resisten Antibiotik Bakteri Sa5 yang digunakan pada uji antagonistik in vitro terlebih dahulu diberi penanda resistensi antibiotik berdasarkan hasil uji sensitivitas. Penanda resistensi antibiotik dipilih berdasarkan konsentrasi terendah yang dapat menumbuhkan Sa5 pada uji sensitivitas sedangkan kandidat probiotik tidak tumbuh pada agar dengan penambahan antibiotik dengan konsentrasi tersebut. Pemberian penanda resistensi antibiotik dilakukan dengan menumbuhkan Sa5 pada media BHIA yang mengandung antibiotik dengan konsentrasi rendah, 25 atau 50 μg/mℓ. Pemberian penanda ini dilakukan untuk memonitor populasi Sa5 pada uji in vitro yang dikultur bersama dengan kandidat probiotik terpilih. 2.6 Uji Antagonistik In Vitro Aktivitas antagonistik (penghambatan) bakteri kandidat probiotik terhadap Sa5 diuji secara in vitro menggunakan metode kultur bersama. Bakteri Sa5 yang diberi penanda resistensi antibiotik Streptomisin 50 µg/mℓ diganti kode menjadi S. agalactiae StR (Sa-StR). Bakteri kandidat probiotik dan S. agalactiae StR masing-masing sebanyak satu ose dikultur pada media cair brain heart infusion broth (BHIB) 10 mℓ dalam labu erlenmeyer dan diinkubasi menggunakan shaker water bath pada suhu 29 °C dengan putaran 140 rpm selama 24 jam. Kemudian inokulum tersebut diencerkan hingga mencapai kepadatan yang sama yakni mencapai 106 CFU/mℓ (Tepu 2006). Sebanyak 100 μℓ bakteri kandidat probiotik dan S. agalactiae StR dimasukkan ke dalam 10 mℓ media BHIB. Sebagai kontrol, bakteri S.agalactiae StR ditambah larutan fisiologis (larfis) steril ditumbuhkan pada media yang sama. Kemudian semua sampel diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 29 °C dengan putaran 140 rpm selama 24 jam. Bakteri yang tumbuh dihitung menggunakan metode hitungan cawan. Kemampuan bakteri kandidat probiotik dalam menghambat pertumbuhan bakteri S.agalactiae StR 5
ditandai dengan rendahnya jumlah koloni S.agalactiae StR yang tumbuh dari labu kultur bersama dibandingkan dengan yang tidak dikultur bersama kandidat probiotik terpilih. 2.7 Uji Patogenisitas Kandidat Probiotik Uji patogenisitas dilakukan dengan cara menyuntikkan kandidat probiotik yang diperoleh secara intraperitonial pada ikan nila dengan konsentrasi 10 8 CFU/mℓ dengan dosis 1 mℓ per 100 g bobot tubuh ikan (Sukenda 2000). Sebagai pembanding digunakan kontrol positif, yakni ikan nila yang disuntik Sa5 dengan konsentrasi 107 CFU/mℓ dengan dosis yang sama. Konsentrasi kandidat probiotik dan patogen yang digunakan adalah konsentrasi optimum bakteri-bakteri tersebut dalam kultur cair pada 10 mℓ BHIB dengan lama inkubasi 24 jam pada suhu 29 °C dengan putaran 140 rpm. Ikan nila dipelihara dalam akuarium berukuran (60x35x30) cm dengan volume air 40 ℓ dan kepadatan 10 ekor per akuarium. Ikan yang digunakan memiliki bobot 10,93±0,77 g dengan parameter pengamatan tingkat kelangsungan hidup (survival rate) ikan hingga hari ke-8 pascainfeksi. 2.8 Uji Antagonistik In Vivo Bakteri kandidat probiotik potensial yang telah diuji antagonistik secara in vitro dan tidak bersifat patogen diuji lagi kemampuan antagonistiknya dalam menghambat pertumbuhan atau perkembangan Sa5 secara in vivo pada ikan nila dengan metode injeksi (penyuntikan). Bakteri kandidat probiotik yang digunakan adalah isolat non-patogenik yang berhasil mempertahankan survival rate (SR) paling tinggi dalam uji patogenisitas. Ikan yang digunakan adalah ikan nila dengan bobot 12,48±0,29 g yang dipelihara dalam akuarium berukuran (60x35x30) cm dengan volume air 40 ℓ dan kepadatan 10 ekor per akuarium. Konsentrasi (kepadatan) bakteri kandidat probiotik dan Sa5 yang digunakan dalam uji antagonistik in vivo adalah 106 CFU/mℓ, sesuai dengan konsentrasi yang digunakan dalam uji antagonistik in vitro. Injeksi bakteri dilakukan secara intraperitonial pada ikan nila dengan dosis 1 mℓ per 100 g bobot tubuh ikan (Sukenda 2000). Ikan dipelihara selama 17 hari dengan berbagai perlakuan (Gambar 1). Perlakuan yang diberikan pada uji antagonistik in vivo antara lain:
6
A
= simulasi pencegahan, kandidat probiotik diinjeksikan ke ikan uji terlebih dahulu pada H-4 dan patogen diinjeksi pada H0,
B
= injeksi bersama, kandidat probiotik dan patogen diinjeksikan ke ikan uji secara bersamaan pada H0,
C
= simulasi pengobatan, patogen diinjeksikan ke ikan uji terlebih dahulu pada H0 dan kandidat probiotik diinjeksi pada H+4,
D
= kontrol negatif, ikan uji diinjeksi dengan larfis pada H0, dan
E
= kontrol positif, ikan uji diinjeksi dengan patogen pada H0.
7
Keterangan: (SB) Sampling Bobot; (GD) Sampling Gambaran Darah; (K-) Kontrol Negatif; (K+) Kontrol Positif; (InjPro) Injeksi Probiotik; (InjPat) Injeksi Patogen; (InjLarfis) Injeksi Larutan Fisiologis.
Gambar 1 Jadwal perlakuan dan sampling selama uji antagonistik in vivo
8
8
2.9 Parameter Pengamatan 2.9.1 Konsumsi Pakan Pakan harian diberikan secara ad satiation dengan stok pakan sebanyak 5 g per akuarium dan frekuensi pemberian 3 kali sehari. Jumlah konsumsi pakan harian selama uji antagonistik in vivo dihitung dengan mengurangkan stok pakan harian (a) dengan sisa pakan (b). Sisa pakan merupakan pakan yang tidak dikonsumsi oleh ikan pada setiap akuarium.
2.9.2 Survival Rate (SR) Tingkat kelangsungan hidup atau survival rate (SR) ikan nila pada uji patogenisitas dan uji antagonistik in vivo diamati setiap hari selama pemeliharaan lalu dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan: SR = survival rate (%) Nt = jumlah ikan hidup pada hari pengamatan No = jumlah ikan hidup pada hari pengamatan 2.9.3 Gejala Klinis Gejala klinis selama uji antagonistik in vivo diamati secara visual setiap hari sejak pemeliharaan dalam akuarium hingga akhir pengamatan uji in vivo selama kurun waktu 17 hari. Gejala klinis yang diamati merupakan modifikasi metode pengamatan Aryanto (2011) dan Hardi (2011) meliputi perubahan pola renang dan tingkah laku, respons terhadap pakan, serta patologi makroskopis organ luar ikan. 2.9.4 Hematologi Ikan Pengamatan hematologi ikan dilakukan sebanyak 5 kali selama pemeliharaan uji antagonistik in vivo dengan selang waktu sampling setiap 4 hari yaitu 2 hari sebelum injeksi perlakuan A (H-6), 2 hari setelah injeksi perlakuan A (H-2), 2 hari setelah injeksi patogen untuk setiap perlakuan selain kontrol negatif, 2 hari setelah injeksi probiotik perlakuan C (H6), dan pada akhir masa pemeliharaan (H10). Ikan uji adalah stok khusus yang digunakan untuk 9
pengamatan hematologi ikan. Sampel yang digunakan setiap sampling berjumlah 2 ekor ikan. Sebelum pengambilan sampel darah ikan, syringe dibilas dengan antikoagulan (natrium sitrat 3,8%) untuk mencegah pembekuan darah. Darah ikan diambil melalui vena caudal menggunakan syringe. Darah yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf secara perlahan. Parameter hematologi ikan yang diamati adalah total eritrosit dan total leukosit (Blaxhall dan Daisley 1973), kadar hematokrit (Anderson dan Siwicki 1993), kadar hemoglobin (Wedemeyer dan Yasutake 1977). 2.9.4.1 Perhitungan Total Eritrosit Darah dihisap menggunakan pipet bulir merah sampai skala 0,5 lalu diencerkan dengan larutan Hayem sampai skala maksimum 101. Kedua ujung ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka 8 selama 3-5 menit. Setelah itu, tetesan darah yang pertama dibuang lalu darah tersebut diteteskan ke hemasitometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar pada hemasitometer dengan faktor pengencer 202. Berikut ini adalah rumus perhitungan total eritrosit:
2.9.4.2 Perhitungan Total Leukosit Darah dihisap menggunakan pipet bulir putih sampai skala 0,5 lalu diencerkan dengan larutan Turk’s sampai skala maksimum 11. Kedua ujung ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka 8 selama 3-5 menit. Setelah itu, tetesan darah yang pertama dibuang lalu darah tersebut diteteskan ke hemasitometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar pada hemasitometer dengan faktor pengencer 22. Berikut ini adalah rumus perhitungan total leukosit:
10
2.9.4.3 Perhitungan Kadar Hematokrit Darah dihisap dengan tabung kapiler (mikrohematokrit) hingga ¾ bagian tabung lalu ujung tabung ditutup dengan ditancapkan pada crytoceal. Setelah itu, tabung mikrohematokrit yang berisi darah disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit lalu dilihat endapan darahnya. Perhitungan kadar hematokrit dengan cara membandingkan panjang endapan darah (a) terhadap panjang total seluruh darah (b). Berikut ini adalah rumus perhitungan kadar hematokrit:
2.9.4.4 Perhitungan Kadar Hemoglobin Perhitungan kadar hemoglobin (Hb) diawali dengan memasukkan HCl 0,1 N ke dalam Hb meter sampai skala 10 (skala merah) menggunakan pipet. Setelah itu darah dihisap menggunakan pipet Sahli hingga skala 0,2 mℓ lalu dimasukkan ke dalam tabung Hb meter dan dibiarkan sambil diaduk selama 3-5 menit dan dincerkan dengan ditambahkan akuades sedikit demi sedikit hingga warnanya sama dengan warna standar yang ada pada tabung Hb meter. Kadar hemoglobin dilihat pada skala berwarna kuning yang dinyatakan dalam satuan gram per 100 mℓ darah (g%). 2.10 Identifikasi Isolat Bakteri Identifikasi yang dilakukan meliputi pengamatan morfologi koloni antara lain bentuk sel, penataan dan jenis Gram. Karakterisasi secara biokimia meliputi uji oksidatif/fermentatif, uji motilitas, uji katalase, dan uji oksidase. 2.11 Analisis Data Analisis data dilakukan dengan metode ANOVA single factor untuk menjawab hipotesis penelitian apakah pengaruh perlakuan berbeda nyata atau tidak terhadap penghambatan pertumbuhan patogen oleh kandidat probiotik pada uji in vitro, SR pada uji patogenisitas dan uji in vivo, serta parameter hematologi ikan nila pada uji in vivo. Hasil analisis yang menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap respons yang diamati dengan taraf nyata atau alpha (α) sebesar 5%, selanjutnya diuji lanjut dengan uji Duncan untuk mengetahui kelompok perlakuan
11
yang memberikan pengaruh berbeda terhadap masing-masing parameter pengamatan. Data hasil uji ditabulasi menggunakan program MS. Excel 2010 dan dianalisis secara statistik menggunakan program SPSS 14.0. Data identifikasi isolat bakteri dianalisis secara deskriptif, yaitu membandingkan hasil uji dengan literatur pendukung berdasarkan Cowan dan Steel (1974).
12
