SELEKSI BAKTERI KANDIDAT PROBIOTIK UNTUK PENGHAMBATAN PATOGEN

SELEKSI BAKTERI KANDIDAT PROBIOTIK UNTUK PENGHAMBATAN PATOGEN Streptococcus agalactiae TIPE NON-HEMOLITIK PADA IKAN NILA Oreochromis niloticus SECARA IN VITRO DAN IN VIVO

RAHMAT FIRDAUS

DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2012

ABSTRACT RAHMAT FIRDAUS. Selection of Probiotics Candidate Bacteria to Inhibiting Non-hemolytic Type Streptococcus agalactiae Pathogen on Tilapia Oreochromis niloticus by In Vitro and In Vivo Experiments. Supervised by MUNTI YUHANA and WIDANARNI. Non-hemolytic type Streptococcus agalactiae is one of pathogenic bacterial strains causing the Streptococcosis in Tilapia. One of alternative Streptococcosis control is using probiotics bacteria. This research aimed to isolate and to select candidate bacteria as well as to evaluate their antagonistic capability against non-hemolytic type S. agalactiae. In vitro antagonistic test by co-culture of S. agalactiae StR with 10 isolates of probiotics candidate and control with two replications; in vivo antagonistic test by co-injection method of non-hemolytic type S. agalactiae and a isolate of chosen probiotic candidate. The treatments applied including preventing simulation (A), co-injection (B), curative simulation (C), negative control (D), and positive control (E) each with three replications. All data analyzed statistically by one-way ANOVA. Based on in vitro test, isolate L1k showed the best antagonistic activity and showed as nonpathogenic to Tilapia. Observation results of in vivo test showed that the highest survival rate (SR) showed by treatment D (90,0±10,0 %) and significantly different (P<0,05) compared to those of other treatments. Treatment C showed the SR 43,3±15,3 % and not significantly different to that of treatment A (33,3±11,5 %) and E (26,7±5,8 %), but significantly different to that of treatment B (20,0±10,0 %). Clinical symptoms descriptively were not significantly different between treatments injected by non-hemolytic type S. agalactiae, but significantly different with negative control. Feed consumption decreased in fish injected by non-hemolytic type S. agalactiae, although control was normal. Fish haematology did not show significantly different (P>0,05) at all treatments. Key words: Non-hemolytic type Streptococcus agalactiae, probiotics bacteria, in vitro, in vivo, Tilapia

ABSTRAK RAHMAT FIRDAUS. Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik untuk Penghambatan Patogen Streptococcus agalactiae Tipe Non-hemolitik pada Ikan Nila Oreochromis niloticus secara In Vitro dan In Vivo. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA dan WIDANARNI. Streptococcus agalactiae tipe non-hemolitik merupakan salah satu strain bakteri patogen penyebab penyakit Streptococcosis yang menyerang ikan nila. Salah satu alternatif pengendalian penyakit Streptococcosis yang dapat dilakukan adalah menggunakan bakteri probiotik. Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri kandidat probiotik dari media budidaya dan usus berbagai jenis ikan air tawar serta menguji kemampuan antagonistik kandidat tersebut terhadap S. agalactiae tipe non-hemolitik. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yaitu uji antagonitik in vitro dengan metode kultur bersama S. agalactiae StR dengan 10 isolat kandidat probiotik dan kontrol dengan dua ulangan; serta uji antagonistik in vivo dengan metode injeksi bersama S. agalactiae tipe non-hemolitik dan satu isolat kandidat probiotik terpilih dengan perlakuan simulasi pencegahan (A), injeksi bersama (B), simulasi pengobatan (C), kontrol negatif (D), dan kontrol positif (E) dengan tiga ulangan. Berdasarkan hasil uji in vitro, isolat L1k menunjukkan aktivitas antagonis terbaik dan terbukti tidak patogen terhadap ikan nila. Hasil pengamatan pada uji in vivo menunjukkan bahwa tingkat kelangsungan hidup (SR) perlakuan D paling tinggi (90,0±10,0 %) dibandingkan perlakuan lainnya (P<0,05). Perlakuan C mampu mempertahankan SR sebesar 43,3±15,3 % tidak berbeda nyata dengan perlakuan A (33,3±11,5 %) dan E (26,7±5,8 %), namun berbeda nyata terhadap perlakuan B (20,0±10,0 %). Gejala klinis secara deskriptif tidak berbeda antar perlakuan yang diinjeksi dengan S. agalactiae tipe non-hemolitik, namun berbeda dengan kontrol negatif. Konsumsi pakan terjadi penurunan pada ikan yang diinjeksi dengan S. agalactiae tipe non-hemolitik, sedangkan konsumsi pakan pada kontrol negatif normal. Hematologi ikan tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (P>0,05) pada semua perlakuan. Kata kunci: Streptococcus agalactiae tipe non-hemolitik, bakteri probiotik, uji in vitro, uji in vivo, ikan nila

SELEKSI BAKTERI KANDIDAT PROBIOTIK UNTUK PENGHAMBATAN PATOGEN Streptococcus agalactiae TIPE NON-HEMOLITIK PADA IKAN NILA Oreochromis niloticus SECARA IN VITRO DAN IN VIVO

RAHMAT FIRDAUS

SKRIPSI sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Program Studi Teknologi dan Manajemen Perikanan Budidaya Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik untuk Penghambatan Patogen Streptococcus agalactiae Tipe Non-hemolitik pada Ikan Nila Oreochromis niloticus secara In Vitro dan In Vivo” adalah benar merupakan karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka pada bagian akhir skripsi ini.

Bogor,

Agustus 2012

Rahmat Firdaus C14060213

PENGESAHAN

Judul Skripsi

: Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik untuk Penghambatan Patogen Streptococcus agalactiae Tipe Non-hemolitik pada Ikan Nila Oreochromis niloticus secara In Vitro dan In Vivo

Nama Mahasiswa

: Rahmat Firdaus

Nomor Pokok

: C14060213

Menyetujui, Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Munti Yuhana, S.Pi, M.Si. NIP. 19691220 199403 2 002

Dr. Ir. Widanarni, M.Si. NIP. 19670927 199403 2 001

Mengetahui, Ketua Departemen Budidaya Perairan

Dr. Ir. Sukenda, M.Sc. NIP. 19671013 199302 1 001

Tanggal lulus:

KATA PENGANTAR

Puji serta syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini dengan baik. Penelitian dengan judul “Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik untuk Penghambatan Patogen Streptococcus agalactiae Tipe Non-hemolitik pada Ikan Nila Oreochromis niloticus secara In Vitro dan In Vivo” dilaksanakan sejak Januari 2011 sampai dengan April 2012 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Munti Yuhana, S.Pi, M.Si. dan Dr. Ir. Widanarni, M.Si. selaku Komisi Pembimbing, Dr. Ir. Mia Setiawati, M.Si. selaku Dosen Penguji serta Dr. Ir. Tatag Budiardi, M.Si. selaku Komisi Pendidikan yang telah membantu pembimbingan serta perbaikan skripsi ini. Tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih tak berhingga kepada kedua orang tua (Ibu Ir. Eka Meinarsih dan Ayah Ir. Wittari Heiza) yang selalu memberikan dukungan terbaik kepada penulis. Terima kasih kepada laboran LKI (Pak Ranta dan Kang Adna) serta staf TU BDP (Mbak Yuli, Pak Maryanta, Kang Asep, Mang Adi, dan Opie) atas perhatian dan bantuan yang sangat berarti. Terkhusus kepada adik-adik tercinta (Mukhlis Pribadi, Taufik Hikmatriyadi, Ridho Nasrullah, dan Annisa Rizki Mardiah), Al„izzers, DPMers, Buroq43ers, Warga FPIK, serta Awak Samudra 43 terima kasih atas semangat, pengingatan serta keceriaan yang selalu diberikan kepada penulis. Terima kasih sedalam-dalamnya kepada LKIers 2009-2012 (Bang Rahman, Bu Ayu, Bang Rusli, Ewa, Ulfi, Dwi, Trian, Ghita, Hendar, Ezy, Vika, Kak Eza, Fariq, Andini, Isni, Ikbal, Uyung, Kak Arif, Dama, Ririn, Nurlita, Dijah, Yue, Mumun, Kak Wika, Bang Abi, Bu Dian, Bu Lani, Bu Woro, Bu Rini, Dendi, Titi, Retno, Jeni, Lita, Nora, Wahyu, Kak Manda, dan lainnya yang tak bisa disebut satu per satu) dan BDP 40-47 atas bantuan, ilmu dan persahabatan yang telah diberikan kepada penulis selama perkuliahan, penelitian dan penyusunan skripsi. Semoga skripsi ini dapat memberi manfaat bagi penulis, pembaca dan perkembangan pengetahuan di bidang perikanan budidaya. Bogor,

Agustus 2012 Rahmat Firdaus

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kota Agung, Kabupaten Tanggamus, Lampung pada tanggal 25 Mei 1988, merupakan anak pertama (5 bersaudara) dari pasangan ibu Ir. Eka Meinarsih dan ayah Ir. Wittari Heiza. Pendidikan formal terakhir yang dilalui penulis adalah SMAN 3 Padang, Gunung Pangilun, Kota Padang, Sumatera Barat (lulus tahun 2006). Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2006 melalui jalur Seleksi Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SMPTN) dan menyelesaikan Tingkat Persiapan Bersama (TPB) pada tahun 2007 lalu diterima

pada

Mayor

Teknologi

dan

Manajemen

Perikanan

Budidaya,

Depertemen Budidaya Perairan, FPIK IPB pada tahun yang sama. Selama menjalani studi di IPB, penulis pernah menjadi asisten pada mata kuliah Pendidikan Agama Islam semester genap TA. 2008/2009, Manajemen Kesehatan Akuakultur

TA. 2009/2010, Penyakit Organisme Akuatik TA.

2010/2011 dan 2011/2012. Selain itu, penulis juga tergabung sebagai anggota Organisasi Mahasiswa Daerah Sumatera Barat (IPMM Bogor), aktif dalam kepengurusan organisasi intrakampus Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM) TPB IPB tahun kepengurusan 2006/2007, DPM FPIK IPB 2007/2008 dan 2008/2009, Majelis Permusyawaratan Mahasiswa Keluarga Mahasiswa (MPM KM) IPB 2008/2009 dan 2009/2010, serta DPM KM IPB 2009/2010. Penulis pernah melaksanakan kegiatan Praktik Lapangan Akuakultur pada usaha Pembenihan Ikan Koi Cyprinus carpio di Kelompok Pembudidaya Ikan Koi “Sumber Harapan” Desa Kemloko, Kabupaten Blitar, Jawa Timur. Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana dalam bidang perikanan dari FPIK IPB, penulis melakukan penelitian dan menyusun skripsi dengan judul “Seleksi Bakteri Kandidat Probiotik untuk Penghambatan Patogen Streptococcus agalactiae Tipe Non-hemolitik pada Ikan Nila Oreochromis niloticus secara In Vitro dan In Vivo”.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL..................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ xiii I. PENDAHULUAN ................................................................................................ 1 1.1 Latar Belakang .......................................................................................... 1 1.2 Tujuan ....................................................................................................... 2 II. METODE ............................................................................................................ 3 2.1 Rancangan Penelitian............................................................................... 3 2.2 Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik ............................................................. 3 2.3 Uji Aktivitas Amilolitik dan Proteolitik ........................................................ 4 2.4 Uji Sensitivitas Antibiotik ........................................................................... 4 2.5 Penyiapan Bakteri Resisten Antibiotik...................................................... 5 2.6 Uji Antagonistik In Vitro............................................................................. 5 2.7 Uji Patogenisitas Kandidat Probiotik......................................................... 6 2.8 Uji Antagonistik In Vivo ............................................................................. 6 2.9 Parameter Pengamatan............................................................................ 9 2.9.1 Konsumsi Pakan ........................................................................... 9 2.9.2 Survival Rate (SR)......................................................................... 9 2.9.3 Gejala Klinis .................................................................................. 9 2.9.4 Hematologi Ikan ............................................................................ 9 2.9.4.1 Perhitungan Total Eritrosit ............................................ 10 2.9.4.2 Perhitungan Total Leukosit ........................................... 10 2.9.4.3 Perhitungan Kadar Hematokrit ..................................... 11 2.9.4.4 Perhitungan Kadar Hemoglobin ................................... 11 2.10 Identifikasi Isolat Bakteri ......................................................................... 11 2.11 Analisis Data ........................................................................................... 11 III. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 13 3.1 Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik ........................................................... 13 3.2 Uji Aktivitas Amilolitik dan Proteolitik ...................................................... 14 3.3 Uji Sensitivitas Antibiotik ......................................................................... 16 3.4 Penyiapan Bakteri Resisten Antibiotik.................................................... 18 3.5 Uji Antagonistik In Vitro........................................................................... 18 3.6 Uji Patogenisitas Kandidat Probiotik....................................................... 21 3.7 Uji Antagonistik In Vivo ........................................................................... 24 3.7.1 Konsumsi Pakan ......................................................................... 24 3.7.2 Survival Rate (SR)....................................................................... 25 3.7.3 Gejala Klinis ................................................................................ 26 3.7.4 Hematologi Ikan .......................................................................... 31 3.7.4.1 Total Eritrosit ................................................................. 31 3.7.4.2 Total Leukosit ................................................................ 33 3.7.4.3 Kadar Hematokrit .......................................................... 34 3.7.4.4 Kadar Hemoglobin ........................................................ 36 3.8 Identifikasi Isolat Bakteri ......................................................................... 38

ix

IV. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................ 39 4.1 Kesimpulan ............................................................................................. 39 4.2 Saran ....................................................................................................... 39 DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 40 LAMPIRAN ............................................................................................................ 44

x

DAFTAR TABEL Halaman 1.

Karakteristik anatomi mikroskopis isolat bakteri kandidat probiotik hasil pewarnaan Gram............................................................................................ 13

2.

Sepuluh isolat terpilih yang menunjukkan aktivitas amilolitik dan proteolitik terbesar .......................................................................................................... 15

3.

Sensitivitas kandidat probiotik dan Sa5 terhadap beberapa jenis antibiotik . 16

4.

Sensitivitas kandidat probiotik dan Sa5 terhadap beberapa jenis antibiotik pada konsentrasi 100 μg/mℓ .......................................................................... 17

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1.

Jadwal perlakuan dan sampling selama uji antagonistik in vivo ..................... 8

2.

Hasil uji aktivitas enzim (a) Amilolitik (b) Proteolitik ...................................... 14

3.

Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik Streptomisin 50 μg/mℓ................. 16

4.

Isolat patogen Sa5 resistensi terhadap antibiotik Streptomisin pada media BHIA + Strep50 .............................................................................................. 18

5.

Kepadatan patogen S. agalactiae StR hasil uji antagonistik in vitro dengan metode kultur bersama kandidat probiotik..................................................... 20

6.

Zona hambat yang dihasilkan kandidat probiotik terhadap patogen dengan metode cawan gores......................................................................... 21

7.

Survival rate (SR) harian selama uji patogenisitas........................................ 22

8.

Ikan perlakuan injeksi NB21b yang mengalami kematian pascainjeksi........ 22

9.

Survival rate (SR) akhir uji patogenisitas....................................................... 23

10. Konsumsi pakan harian selama uji antagonistik in vivo ................................ 24 11. Survival rate (SR) harian selama uji antagonistik in vivo .............................. 25 12. Survival rate (SR) pada akhir uji antagonistik in vivo .................................... 26 13. Perubahan pola renang ikan nila pascainjeksi S. agalactiae ........................ 28 14. Gejala klinis pada organ mata dan tubuh ikan nila........................................ 29 15. Gejala klinis berupa pembengkakan perut dan organ dalam ikan nila ......... 30 16. Total eritrosit selama uji antagonistik in vivo ................................................. 32 17. Total leukosit selama uji antagonistik in vivo................................................. 33 18. Kadar hematokrit selama uji antagonistik in vivo .......................................... 35 19. Kadar hemoglobin selama uji antagonistik in vivo......................................... 36

xii

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1.

Asal dan kode isolat serta hasil identifikasi jenis Gram dan morfologi sel ... 45

2.

Analisis statistik uji antagonistik in vitro dengan metode kultur bersama kandidat probiotik dan patogen S. agalactiae StR ........................................ 47

3.

Hubungan kekeruhan sampel terhadap kepadatan sel dari isolat asal kolam pembesaran ikan nila merah (K2ic); asal usus ikan nila hitam (NB13a, NB13b, NB21b); asal usus ikan nila merah (RN11a, RN21c, RN21f, RN21g); asal usus ikan lele (L1k, L2m); dan patogen S. agalactiae tipe non-hemolitik (Sa5) ................................................................................. 48

4.

Analisis statistik survival rate (SR) ikan nila pada akhir uji patogenisitas kandidat probiotik ........................................................................................... 52

5.

Analisis statistik survival rate (SR) ikan nila pada akhir uji antagonistik in vivo ............................................................................................................. 53

6.

Gejala klinis harian selama uji antagonistik in vivo ....................................... 54

7.

Analisis statistik total eritrosit ikan nila selama uji antagonistik in vivo ......... 58

8.

Analisis statistik total leukosit ikan nila selama uji antagonistik in vivo......... 59

9.

Analisis statistik kadar hematokrit ikan nila selama uji antagonistik in vivo.. 60

10. Analisis statistik kadar hemoglobin ikan nila selama uji antagonistik in vivo 61 11. Hasil uji dan identifikasi isolat kandidat probiotik .......................................... 63

xiii

I. PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang Ikan nila Oreochromis niloticus merupakan ikan konsumsi yang digemari masyarakat Indonesia dan termasuk dalam 10 komoditas yang menjadi target peningkatan produksi perikanan budidaya nasional. Target produksi perikanan budidaya nasional hingga tahun 2014 adalah 353%. Produksi ikan nila pada tahun 2008 sebesar 291.037 ton, 2009 meningkat menjadi 323.389 ton dan pada tahun 2010 menjadi 469.173 ton. Angka kenaikan produksi ikan nila dari tahun 2009-2010 adalah 45,08% dengan kenaikan rata-rata tahun 2006-2010 sebesar 29,75% (KKP 2010). Berdasarkan data tersebut, angka produksi ikan nila nasional per tahun masih diharapkan untuk dapat bertambah hingga akhir 2014. Kegiatan budidaya ikan nila masih mengalami berbagai kendala. Salah satu kendala tersebut yaitu serangan penyakit yang sedang mewabah di berbagai wilayah Indonesia pada lima tahun terakhir ini yakni penyakit Streptococcosis, yang sebagian besar disebabkan oleh bakteri patogen Streptococcus agalactiae dan Streptococcus iniae (Hardi 2011). Gejala klinis penyakit Streptococcosis akibat serangan kedua jenis bakteri patogen tersebut hampir sama yaitu berenang lemah, cara berenang yang abnormal, exopthalmia pada salah satu ataupun kedua mata, dan warna tubuh yang menghitam (Eldar et al. 1994a). Kedua jenis bakteri ini merupakan bakteri penyebab penyakit yang sering ditemukan sepanjang waktu hampir pada seluruh sentra budidaya ikan nila. Dari hasil pemeriksaan 1000 isolat bakteri yang berasal dari 74 lokasi di 14 negara termasuk Indonesia, kedua jenis bakteri ini ditemukan hampir setengah dari bakteri yang teridentifikasi (Sheehan et al. 2009). Lebih lanjut juga dilaporkan bahwa akhir-akhir ini S. agalactiae lebih sering ditemukan dengan virulensi lebih tinggi dibandingkan S. iniae. Menurut Hardi (2011), S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik merupakan salah satu strain S. agalactiae dengan virulensi tinggi. Dengan demikian kematian massal yang disebabkan oleh serangan patogen tersebut dikhawatirkan akan menjadi salah satu penyebab kerugian atau kegagalan produksi ikan nila. Solusi penanggulangan penyakit Streptococcosis yang disebabkan oleh S. agalactiae terutama tipe non-hemolitik telah menjadi prioritas pengembangan teknologi penanggulangan penyakit pada perikanan budidaya saat ini. Salah satu metode penanggulangan penyakit bakterial pada ikan adalah penggunaan 1

bakteri biokontrol sebagai probiotik. Vine et al. (2004) menyebutkan, dari usaha yang telah dilakukan, penggunaan bakteri probiotik merupakan cara yang dianggap paling aman. Penggunaan probiotik secara luas untuk meningkatkan produksi telah memberikan hasil yang lebih baik, murah dan efektif dalam meningkatkan kesehatan hewan dibandingkan penggunaan antibiotik atau bahan kimia lainnya. Penggunaan antibiotik secara terus menerus juga dikhawatirkan dapat menyebabkan terjadinya resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik tersebut. Selain itu, meningkatnya isu mengenai keamanan pangan dan keamanan lingkungan menjadi faktor pembatas dalam penggunaan antibiotik. Perlu diketahui bahwa mekanisme kerja probiotik pun didefinisikan secara beragam. Menurut Fuller (1992) probiotik merupakan makanan tambahan dalam bentuk mikroba hidup yang memberi pengaruh yang menguntungkan bagi inang dengan meningkatkan keseimbangan mikroba dalam saluran pencernaan, seperti Lactobacillus sp., Bacillus sp., Saccharomyces cerevisiae, serta Aspergillus oryzae. Irianto (2003) menyampaikan bahwa pada dasarnya terdapat tiga mekanisme kerja probiotik antara lain, menekan populasi mikroba melalui kompetisi dengan memproduksi senyawa-senyawa antimikroba atau melalui kompetisi nutrisi dan tempat pelekatan pada saluran pencernaan; mengubah metabolisme mikrobial dengan meningkatkan atau menurunkan aktivitas enzim; dan menstimulus imunitas melalui peningkatan kadar antibodi atau aktivitas makrofag. 1.2 Tujuan Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat kandidat probiotik dari lingkungan budidaya dan saluran pencernaan berbagai jenis ikan air tawar yang memiliki aktivitas enzimatis (amilolitik dan proteolitik) serta menguji aktivitas antagonistik kandidat probiotik tersebut terhadap patogen S. agalactiae tipe nonhemolitik secara in vitro dan in vivo pada ikan nila O. niloticus.

2

II. METODE 2.1 Rancangan Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 6 perlakuan dan 2 ulangan pada uji patogenisitas, serta 4 perlakuan dan 3 ulangan pada uji antagonistik in vivo. Model statistik RAL yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1982):

Dimana: Yij

= Data respon yang diamati pada perlakuan ke-i dan ulangan ke- j

µ

= Nilai tengah data

βi

= Pengaruh perlakuan ke- i

εij

= Galat percobaan pada perlakuan ke- i dan ulangan ke- j

2.2 Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik Bakteri kandidat probiotik diisolasi dari air kolam pembesaran ikan nila merah Departemen BDP, FPIK IPB dan saluran pencernaan (usus) berbagai macam ikan budidaya air tawar. Kolam pembesaran tersebut menggunakan sistem budidaya intensif, terdapat satu kincir air listrik pada bagian tengah serta inlet dan outlet yang terus dialiri air. Ikan yang digunakan adalah ikan nila Oreochromis niloticus yang berasal dari daerah Ciseeng, Kabupaten Bogor, ikan nila merah Oreochromis sp. yang berasal dari daerah Parung, Kabupaten Bogor, ikan lele Clarias batrachus yang berasal dari daerah Parung, Kabupaten Bogor, serta ikan mas Cyprinus carpio yang berasal dari daerah Ciherang, Kabupaten Bogor. Air kolam sebagai larutan stok diencerkan dengan phosphat buffer saline (PBS) hingga menjadi pengenceran 10-5. Sampel air kolam yang diencerkan pada 10-3, 10-4, dan 10-5 disebar sebanyak 0,1 mℓ pada cawan petri berisi media trypticase soy agar (TSA) lalu diinkubasi pada suhu 27-30 °C selama 24 jam. Pengambilan organ pencernaan (usus) ikan dilakukan dengan cara dibedah. Usus dipotong menjadi beberapa bagian, setiap 0,1 g usus dicampurkan dengan 0,9 mℓ PBS dalam Eppendorf lalu digerus hingga halus. Hasil gerusan usus ini yang menjadi stok inokulum, kemudian 0,1 mℓ stok diencerkan ke dalam 0,9 mℓ PBS hingga pengenceran 10-6. Suspensi sampel pada pengenceran 10-4, 10-5,

3

dan 10-6 disebar sebanyak 0,1 mℓ pada cawan petri berisi media TSA lalu diinkubasi pada suhu 27-30 °C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni tunggal yang tumbuh pada media kultur dan memiliki profil berbeda diambil menggunakan ose lalu digores pada cawan petri berisi media TSA steril dengan metode gores kuadran. Isolat yang telah digores tersebut diinkubasi kembali pada suhu 27-30 °C selama 24 jam untuk mendapatkan isolat tunggal yang murni. Isolat murni dipindahkan ke tabung reaksi berisi media TSA steril untuk disimpan sebagai stok isolat bakteri kandidat probiotik dan digunakan untuk uji selanjutnya. 2.3 Uji Aktivitas Amilolitik dan Proteolitik Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim amilase dan protease yang dihasilkan oleh masing-masing isolat, untuk menunjukkan kemampuannya dalam menghidrolisis karbohidrat dan protein. Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media brain heart infusion agar (BHIA) yang telah ditambahkan pati sebanyak 2% untuk uji amilolitik. Kemampuan menghidrolisis karbohidrat ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang tumbuh, setelah agar digenangi dengan reagen KI 1%. Koloni yang tidak mampu menghidrolisis karbohidrat tidak terdapat zona bening di sekitar koloni yang tumbuh. Pada uji aktivitas proteolitik, bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media BHIA yang telah ditambahkan susu skim sebanyak 2%. Kemampuan menghidrolisis protein ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang tumbuh. Isolat dengan aktivitas amilolitik dan proteolitik paling besar dipilih untuk diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik (Sa5). 2.4 Uji Sensitivitas Antibiotik Uji ini dilakukan untuk menguji sensitivitas bakteri kandidat probiotik serta Sa5 pada beberapa jenis antibiotik serta membantu dalam pembuatan penanda untuk memonitor keberadaan bakteri yang akan digunakan pada uji in vitro sehingga dapat dibedakan dengan jenis bakteri lain. Jenis antibiotik yang digunakan adalah Rifampisin, Streptomisin, Kanamisin, dan Penisilin G. Konsentrasi yang digunakan untuk setiap jenis antibiotik tidak sama. Antibiotik Rifampisin diuji pada konsentrasi 25 dan 100 μg/mℓ, Streptomisin pada 4

konsentrasi 50 dan 100 μg/mℓ, Kanamisin pada konsentrasi 50 dan 100 μg/mℓ, serta Penisilin G pada konsentrasi 50 dan 100 μg/mℓ. Kandidat probiotik digoreskan pada media BHIA yang telah ditambahkan antibiotik dengan metode streak plate lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 °C . Bakteri yang sensitif terhadap antibiotik ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni pada media BHIA yang mengandung antibiotik, sedangkan bakteri yang resisten akan tetap tumbuh pada media tersebut. 2.5 Penyiapan Bakteri Resisten Antibiotik Bakteri Sa5 yang digunakan pada uji antagonistik in vitro terlebih dahulu diberi penanda resistensi antibiotik berdasarkan hasil uji sensitivitas. Penanda resistensi antibiotik dipilih berdasarkan konsentrasi terendah yang dapat menumbuhkan Sa5 pada uji sensitivitas sedangkan kandidat probiotik tidak tumbuh pada agar dengan penambahan antibiotik dengan konsentrasi tersebut. Pemberian penanda resistensi antibiotik dilakukan dengan menumbuhkan Sa5 pada media BHIA yang mengandung antibiotik dengan konsentrasi rendah, 25 atau 50 μg/mℓ. Pemberian penanda ini dilakukan untuk memonitor populasi Sa5 pada uji in vitro yang dikultur bersama dengan kandidat probiotik terpilih. 2.6 Uji Antagonistik In Vitro Aktivitas antagonistik (penghambatan) bakteri kandidat probiotik terhadap Sa5 diuji secara in vitro menggunakan metode kultur bersama. Bakteri Sa5 yang diberi penanda resistensi antibiotik Streptomisin 50 µg/mℓ diganti kode menjadi S. agalactiae StR (Sa-StR). Bakteri kandidat probiotik dan S. agalactiae StR masing-masing sebanyak satu ose dikultur pada media cair brain heart infusion broth (BHIB) 10 mℓ dalam labu erlenmeyer dan diinkubasi menggunakan shaker water bath pada suhu 29 °C dengan putaran 140 rpm selama 24 jam. Kemudian inokulum tersebut diencerkan hingga mencapai kepadatan yang sama yakni mencapai 106 CFU/mℓ (Tepu 2006). Sebanyak 100 μℓ bakteri kandidat probiotik dan S. agalactiae StR dimasukkan ke dalam 10 mℓ media BHIB. Sebagai kontrol, bakteri S.agalactiae StR ditambah larutan fisiologis (larfis) steril ditumbuhkan pada media yang sama. Kemudian semua sampel diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 29 °C dengan putaran 140 rpm selama 24 jam. Bakteri yang tumbuh dihitung menggunakan metode hitungan cawan. Kemampuan bakteri kandidat probiotik dalam menghambat pertumbuhan bakteri S.agalactiae StR 5

ditandai dengan rendahnya jumlah koloni S.agalactiae StR yang tumbuh dari labu kultur bersama dibandingkan dengan yang tidak dikultur bersama kandidat probiotik terpilih. 2.7 Uji Patogenisitas Kandidat Probiotik Uji patogenisitas dilakukan dengan cara menyuntikkan kandidat probiotik yang diperoleh secara intraperitonial pada ikan nila dengan konsentrasi 10 8 CFU/mℓ dengan dosis 1 mℓ per 100 g bobot tubuh ikan (Sukenda 2000). Sebagai pembanding digunakan kontrol positif, yakni ikan nila yang disuntik Sa5 dengan konsentrasi 107 CFU/mℓ dengan dosis yang sama. Konsentrasi kandidat probiotik dan patogen yang digunakan adalah konsentrasi optimum bakteri-bakteri tersebut dalam kultur cair pada 10 mℓ BHIB dengan lama inkubasi 24 jam pada suhu 29 °C dengan putaran 140 rpm. Ikan nila dipelihara dalam akuarium berukuran (60x35x30) cm dengan volume air 40 ℓ dan kepadatan 10 ekor per akuarium. Ikan yang digunakan memiliki bobot 10,93±0,77 g dengan parameter pengamatan tingkat kelangsungan hidup (survival rate) ikan hingga hari ke-8 pascainfeksi. 2.8 Uji Antagonistik In Vivo Bakteri kandidat probiotik potensial yang telah diuji antagonistik secara in vitro dan tidak bersifat patogen diuji lagi kemampuan antagonistiknya dalam menghambat pertumbuhan atau perkembangan Sa5 secara in vivo pada ikan nila dengan metode injeksi (penyuntikan). Bakteri kandidat probiotik yang digunakan adalah isolat non-patogenik yang berhasil mempertahankan survival rate (SR) paling tinggi dalam uji patogenisitas. Ikan yang digunakan adalah ikan nila dengan bobot 12,48±0,29 g yang dipelihara dalam akuarium berukuran (60x35x30) cm dengan volume air 40 ℓ dan kepadatan 10 ekor per akuarium. Konsentrasi (kepadatan) bakteri kandidat probiotik dan Sa5 yang digunakan dalam uji antagonistik in vivo adalah 106 CFU/mℓ, sesuai dengan konsentrasi yang digunakan dalam uji antagonistik in vitro. Injeksi bakteri dilakukan secara intraperitonial pada ikan nila dengan dosis 1 mℓ per 100 g bobot tubuh ikan (Sukenda 2000). Ikan dipelihara selama 17 hari dengan berbagai perlakuan (Gambar 1). Perlakuan yang diberikan pada uji antagonistik in vivo antara lain:

6

A

= simulasi pencegahan, kandidat probiotik diinjeksikan ke ikan uji terlebih dahulu pada H-4 dan patogen diinjeksi pada H0,

B

= injeksi bersama, kandidat probiotik dan patogen diinjeksikan ke ikan uji secara bersamaan pada H0,

C

= simulasi pengobatan, patogen diinjeksikan ke ikan uji terlebih dahulu pada H0 dan kandidat probiotik diinjeksi pada H+4,

D

= kontrol negatif, ikan uji diinjeksi dengan larfis pada H0, dan

E

= kontrol positif, ikan uji diinjeksi dengan patogen pada H0.

7

Keterangan: (SB) Sampling Bobot; (GD) Sampling Gambaran Darah; (K-) Kontrol Negatif; (K+) Kontrol Positif; (InjPro) Injeksi Probiotik; (InjPat) Injeksi Patogen; (InjLarfis) Injeksi Larutan Fisiologis.

Gambar 1 Jadwal perlakuan dan sampling selama uji antagonistik in vivo

8

8

2.9 Parameter Pengamatan 2.9.1 Konsumsi Pakan Pakan harian diberikan secara ad satiation dengan stok pakan sebanyak 5 g per akuarium dan frekuensi pemberian 3 kali sehari. Jumlah konsumsi pakan harian selama uji antagonistik in vivo dihitung dengan mengurangkan stok pakan harian (a) dengan sisa pakan (b). Sisa pakan merupakan pakan yang tidak dikonsumsi oleh ikan pada setiap akuarium.

2.9.2 Survival Rate (SR) Tingkat kelangsungan hidup atau survival rate (SR) ikan nila pada uji patogenisitas dan uji antagonistik in vivo diamati setiap hari selama pemeliharaan lalu dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Keterangan: SR = survival rate (%) Nt = jumlah ikan hidup pada hari pengamatan No = jumlah ikan hidup pada hari pengamatan 2.9.3 Gejala Klinis Gejala klinis selama uji antagonistik in vivo diamati secara visual setiap hari sejak pemeliharaan dalam akuarium hingga akhir pengamatan uji in vivo selama kurun waktu 17 hari. Gejala klinis yang diamati merupakan modifikasi metode pengamatan Aryanto (2011) dan Hardi (2011) meliputi perubahan pola renang dan tingkah laku, respons terhadap pakan, serta patologi makroskopis organ luar ikan. 2.9.4 Hematologi Ikan Pengamatan hematologi ikan dilakukan sebanyak 5 kali selama pemeliharaan uji antagonistik in vivo dengan selang waktu sampling setiap 4 hari yaitu 2 hari sebelum injeksi perlakuan A (H-6), 2 hari setelah injeksi perlakuan A (H-2), 2 hari setelah injeksi patogen untuk setiap perlakuan selain kontrol negatif, 2 hari setelah injeksi probiotik perlakuan C (H6), dan pada akhir masa pemeliharaan (H10). Ikan uji adalah stok khusus yang digunakan untuk 9

pengamatan hematologi ikan. Sampel yang digunakan setiap sampling berjumlah 2 ekor ikan. Sebelum pengambilan sampel darah ikan, syringe dibilas dengan antikoagulan (natrium sitrat 3,8%) untuk mencegah pembekuan darah. Darah ikan diambil melalui vena caudal menggunakan syringe. Darah yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf secara perlahan. Parameter hematologi ikan yang diamati adalah total eritrosit dan total leukosit (Blaxhall dan Daisley 1973), kadar hematokrit (Anderson dan Siwicki 1993), kadar hemoglobin (Wedemeyer dan Yasutake 1977). 2.9.4.1 Perhitungan Total Eritrosit Darah dihisap menggunakan pipet bulir merah sampai skala 0,5 lalu diencerkan dengan larutan Hayem sampai skala maksimum 101. Kedua ujung ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka 8 selama 3-5 menit. Setelah itu, tetesan darah yang pertama dibuang lalu darah tersebut diteteskan ke hemasitometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar pada hemasitometer dengan faktor pengencer 202. Berikut ini adalah rumus perhitungan total eritrosit:

2.9.4.2 Perhitungan Total Leukosit Darah dihisap menggunakan pipet bulir putih sampai skala 0,5 lalu diencerkan dengan larutan Turk’s sampai skala maksimum 11. Kedua ujung ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka 8 selama 3-5 menit. Setelah itu, tetesan darah yang pertama dibuang lalu darah tersebut diteteskan ke hemasitometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar pada hemasitometer dengan faktor pengencer 22. Berikut ini adalah rumus perhitungan total leukosit:

10

2.9.4.3 Perhitungan Kadar Hematokrit Darah dihisap dengan tabung kapiler (mikrohematokrit) hingga ¾ bagian tabung lalu ujung tabung ditutup dengan ditancapkan pada crytoceal. Setelah itu, tabung mikrohematokrit yang berisi darah disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit lalu dilihat endapan darahnya. Perhitungan kadar hematokrit dengan cara membandingkan panjang endapan darah (a) terhadap panjang total seluruh darah (b). Berikut ini adalah rumus perhitungan kadar hematokrit:

2.9.4.4 Perhitungan Kadar Hemoglobin Perhitungan kadar hemoglobin (Hb) diawali dengan memasukkan HCl 0,1 N ke dalam Hb meter sampai skala 10 (skala merah) menggunakan pipet. Setelah itu darah dihisap menggunakan pipet Sahli hingga skala 0,2 mℓ lalu dimasukkan ke dalam tabung Hb meter dan dibiarkan sambil diaduk selama 3-5 menit dan dincerkan dengan ditambahkan akuades sedikit demi sedikit hingga warnanya sama dengan warna standar yang ada pada tabung Hb meter. Kadar hemoglobin dilihat pada skala berwarna kuning yang dinyatakan dalam satuan gram per 100 mℓ darah (g%). 2.10 Identifikasi Isolat Bakteri Identifikasi yang dilakukan meliputi pengamatan morfologi koloni antara lain bentuk sel, penataan dan jenis Gram. Karakterisasi secara biokimia meliputi uji oksidatif/fermentatif, uji motilitas, uji katalase, dan uji oksidase. 2.11 Analisis Data Analisis data dilakukan dengan metode ANOVA single factor untuk menjawab hipotesis penelitian apakah pengaruh perlakuan berbeda nyata atau tidak terhadap penghambatan pertumbuhan patogen oleh kandidat probiotik pada uji in vitro, SR pada uji patogenisitas dan uji in vivo, serta parameter hematologi ikan nila pada uji in vivo. Hasil analisis yang menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap respons yang diamati dengan taraf nyata atau alpha (α) sebesar 5%, selanjutnya diuji lanjut dengan uji Duncan untuk mengetahui kelompok perlakuan

11

yang memberikan pengaruh berbeda terhadap masing-masing parameter pengamatan. Data hasil uji ditabulasi menggunakan program MS. Excel 2010 dan dianalisis secara statistik menggunakan program SPSS 14.0. Data identifikasi isolat bakteri dianalisis secara deskriptif, yaitu membandingkan hasil uji dengan literatur pendukung berdasarkan Cowan dan Steel (1974).

12

III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik Bakteri kandidat probiotik yang berhasil diisolasi dari air kolam pembesaran ikan nila merah dan usus ikan nila merah, usus ikan nila hitam, usus ikan lele, serta usus ikan mas berjumlah 78 isolat. Seluruh isolat tersebut telah diidentifikasi melalui perwarnaan Gram dengan karakteristik anatomi mikroskopis seperti pada Tabel 1. Sebanyak 17 isolat berasal dari air kolam pembesaran ikan nila merah; 14 isolat dari usus ikan nila merah; 10 isolat dari usus ikan nila hitam; 20 isolat dari usus ikan lele; dan 17 isolat dari usus ikan mas. Berdasarkan hasil pewarnaan Gram diketahui 68 isolat diantaranya memiliki sifat Gram negatif dan 10 isolat sisanya memiliki sifat Gram positif, dengan 19 isolat diantaranya memiliki morfologi sel bulat (coccus) dan 59 isolat lainnya berbentuk batang (bacil). Tabel 1

Karakteristik anatomi mikroskopis isolat bakteri kandidat probiotik hasil pewarnaan Gram

Asal isolat Air di sekitar inlet kolam pembesaran ikan nila merah Air di sekitar outlet kolam pembesaran ikan nila merah

Lokasi

Morfologi sel Bacil Coccus

Dept. BDP, FPIK IPB

2

8

5

5

Dept. BDP, FPIK IPB

0

7

5

2

5

9

9

5

1

9

9

1

2

18

15

5

0

17

16

1

68

59

Daerah Parung, Kabupaten Bogor Daerah Usus ikan Ciseeng, nila hitam Kabupaten Bogor Daerah Usus ikan Parung, lele Kabupaten Bogor Daerah Usus ikan Ciherang, mas Kabupaten Bogor Subtotal Total

Usus ikan nila merah

Jenis Gram Positif (+) Negatif (-)

10 78

19 78

13

Tidak semua isolat bakteri yang berhasil diisolasi dapat digunakan. Karena dalam 2 hingga 3 kali pemurnian dengan metode gores kuadran tidak semua isolat dapat dimurnikan menjadi koloni tunggal. Salah satu faktor yang menyebabkan sulitnya mendapatkan koloni tunggal adalah koloni bakteri yang tumbuh menyebar pada media agar. Dengan demikian, hanya isolat yang teridentifikasi merupakan koloni tunggal saja (Lampiran 1) yang diuji lebih lanjut. 3.2 Uji Aktivitas Amilolitik dan Proteolitik Pada Gambar 2a ditampilkan contoh hasil uji aktivitas amilolitik, koloni dengan tanda (+) memperlihatkan terbentuknya zona bening dan koloni dengan tanda (-) tidak membentuk zona bening. Gambar 2b menampilkan koloni yang menunjukkan aktivitas proteolitik.

+

+

+

+ A

b

Keterangan: (+) terdapat aktivitas; (-) tidak terdapat aktivitas.

Gambar 2 Hasil uji aktivitas enzim (a) Amilolitik (b) Proteolitik Uji aktivitas enzim (amilolitik dan proteolitik) menjadi salah satu tahap seleksi yang menentukan kandidat probiotik yang digunakan pada penelitian ini. Masing-masing 5 isolat yang menunjukkan aktivitas amilolitik dan proteolitik terbesar (Tabel 2) akan diujikan lebih lanjut. Aktivitas amilolitik dan proteolitik menandakan adanya kemampuan bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dan protein, artinya bakteri tersebut mampu memanfaatkan sumber energi berupa pati dan protein yang ditambahkan pada media kultur sebagai sumber karbon. Amilolitik merupakan aktivitas bakteri dalam merombak pati dengan bantuan enzim amilase. Enzim amilase adalah enzim yang mampu menghidrolisis pati menjadi senyawa lebih sederhana seperti maltosa dan glukosa. Enzim ini dapat memecah atau menghidrolisis pati, glikogen dan turunan polisakarida dengan cara memecah ikatan glikosidik pati. (Rehm dan Reed 1987). 14

Tabel 2

Sepuluh isolat terpilih yang menunjukkan aktivitas amilolitik dan proteolitik terbesar

Diameter Diameter zona aktivitas zona aktivitas amilolitik (mm) proteolitik (mm) K2ic 21,5 NB13a 18,0 13,0 NB13b 18,0 NB21b 18,5 RN11a 12,5 RN21c 10,0 RN21f 14,0 RN21g 6,0 L1k 5,0 L2m 19,5 8,0 Keterangan: (-) tidak menunjukkan adanya aktivitas. Isolat

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan hasil akhirnya juga beragam. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, mampu memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana (Durham et al. 1987). Menurut Price dan Stevens (1996) dalam Yandri et al. (2008) protease merupakan enzim yang berfungsi memecah ikatan peptida untuk menghasilkan asam amino dan peptida sederhana lainnya. Enzim ini dapat diisolasi dari berbagai sumber seperti tanaman, hewan dan mikroba (fungi atau bakteri). Protease atau yang disebut endopeptidase merupakan salah satu enzim pencernaan yang penting, termasuk di dalamnya tripsin dan kemotripsin (Lemos et al. 2000). Protease selain digunakan untuk metabolisme dan regulasi di dalam sel (intraseluler) juga mampu mendegradasi senyawa polimer sehingga mudah larut dan diserap oleh dinding sel apabila enzim tersebut dihasilkan secara ekstraseluler. Hal tersebut dapat memberikan pengaruh positif bagi ikan sebagai sumber

mikronutrien

dan

menghasilkan

kontribusi

dalam

melancarkan

pencernaan ikan. Kemampuan suatu bakteri untuk menjadi sumber makro dan mikronutrien serta kontribusi enzimatiknya bagi pencernaan ikan merupakan bagian dari cara kerja probiotik (Verschuere et al. 2000). Karakteristik kandidat 15

probiotik dengan aktivitas enzimatik (amilolitik dan proteolitik) menjadi nilai lebih karena bermanfaat dalam merombak makronutrien, selain itu kandidat probiotik terpilih diharapkan juga memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan patogen sebagai parameter utama dalam penelitian ini. 3.3 Uji Sensitivitas Antibiotik Pada Gambar 3 berikut diperlihatkan contoh hasil uji sensitivitas kandidat probiotik pada media agar dengan metode streak plate pada media agar dengan penambahan antibiotik Streptomisin 50 μg/mℓ.

Keterangan: (a) bakteri resisten antibiotik; (b) bakteri sensitif antibiotik.

Gambar 3 Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik Streptomisin 50 μg/mℓ Pada Tabel 3 disajikan hasil uji sensitivitas 10 bakteri kandidat probiotik terpilih dan bakteri Sa5 terhadap antibiotik Penisilin-G dengan konsentrasi 50 μg/mℓ, Streptomisin 50 μg/mℓ, Kanamisin 50 μg/mℓ, dan Rifampisin 25 μg/mℓ. Tabel 3

Sensitivitas kandidat probiotik dan Sa5 terhadap beberapa jenis antibiotik

Isolat PG50 Strep50 Kan50 Rif25 K2ic R S S S NB13a R S S S NB13b R S S S NB21b R S S S RN11a R S S S RN21c R S S S RN21f R S S S RN21g S S S S L1k S S S S L2m R S S S Sa5 R S S S Keterangan: (R) Resisten; (S) Sensitif; (PG50) media agar ditambahkan antibiotik Penisilin-G dengan konsentrasi 50 μg/mℓ; (Strep50) media agar + Streptomisin 50 μg/mℓ; (Kan50) media agar + Kanamisin 50 μg/mℓ; (Rif25) media agar + Rifampisin 25 μg/mℓ; (Sa5) S. agalactiae tipe non-hemolitik.

16

Berdasarkan Tabel 3 diketahui bahwa semua isolat sensitif terhadap antibiotik Strep50, Kan50 dan Rif25, sedangkan terhadap PG50, hampir semua isolat bersifat resisten kecuali RN21g dan L1k. Sifat resistensi terhadap antibiotik pada bakteri dapat disebabkan oleh dua jenis mekanisme yaitu mutasi kromosom dan akuisisi plasmid. Mutasi pada kromosom tidak dapat ditransfer pada bakteri lain, tetapi pada akuisisi plasmid mampu mentrasfer dengan cepat sifat resisten tersebut (Lewin 1922 dalam Schnick 2001). Sifat resisten pada mikroorganisme juga diakibatkan oleh, (1) kemampuan menghasilkan enzim yang mampu mengaktivasi antibiotik; (2) adanya penambahan substansi kimia pada struktur lain oleh sel bakteri sehingga antibiotik tidak dapat masuk ke dalam ribosom; (3) perubahan struktur protein pada dinding sel; (4) berkurangnya permeabilitas dinding sel sehingga antibiotik tidak dapat masuk ke dalam sel (Guilfoile 2007). Pada Tabel 4 diketahui bahwa pada konsentrasi 100 μg/mℓ semua jenis isolat sensitif terhadap antibiotik jenis Penisilin-G, Streptomisin, Kanamisin, dan Rifampisin. Hal tersebut menurut Guilfoile (2007) berkaitan dengan kemampuan antibiotik dalam membunuh bakteri dengan mekanisme, antara lain (1) merusak kerja ribosom dalam mensintesis protein; (2) menghambat sintesis DNA sebagai sumber informasi genetik; (3) menghambat proses biokimia dalam sel; (4) menghambat sintensis komponen penyusun dinding sel; serta (5) mengganggu fungsi kerja membran sel. Dengan demikian, konsentrasi yang lebih pekat akan meningkatkan kemampuan antibiotik dalam merusak sistem dalam tubuh bakteri. Tabel 4

Sensitivitas kandidat probiotik dan Sa5 terhadap beberapa jenis antibiotik pada konsentrasi 100 μg/mℓ

Isolat PG100 Strep100 Kan100 Rif100 K2ic S S S S NB13a S S S S NB13b S S S S NB21b S S S S RN11a S S S S RN21c S S S S RN21f S S S S RN21g S S S S L1k S S S S L2m S S S S Sa5 S S S S Keterangan: (R) Resisten; (S) Sensitif; (PG100) media agar ditambahkan antibiotik Penisilin-G dengan konsentrasi 100 μg/mℓ; (Strep100) media agar + Streptomisin 100 μg/mℓ; (Kan100) media agar + Kanamisin 100 μg/mℓ; (Rif100) media agar + Rifampisin 100 μg/mℓ ; (Sa5) S. agalactiae tipe nonhemolitik.

17

3.4 Penyiapan Bakteri Resisten Antibiotik Menurut Madigan et al. (2003) sifat resistensi pada bakteri dapat dipindahkan baik secara horizontal maupun vertikal. Baticados et al. (1990) dalam Tendencia dan de la Pena (2001) melaporkan bahwa patogen penyebab luminous disease seperti Vibrio harveyi dan Vibrio splendidus yang diisolasi dari larva udang resisten terhadap antibiotik Erythromycin, Kanamycin, Pencillin-G, dan Streptomycin. Berdasarkan hasil uji sensitivitas pada Tabel 3, isolat Sa5 yang digunakan pada uji antagonistik in vitro dapat diberi penanda Strep50, Kan50 atau Rif25. Namun, pada penyiapan isolat resisten secara spontan, isolat Sa5 lebih cepat tumbuh pada media dengan penambahan Strep50 (Gambar 4) sehingga penanda yang digunakan adalah Strep50 dan kode isolat patogen diubah menjadi S.agalactiae StR.

Gambar 4 Isolat patogen Sa5 resistensi terhadap antibiotik Streptomisin pada media BHIA + Strep50 3.5 Uji Antagonistik In Vitro Uji antagonistik dengan metode kultur

bersama dilakukan untuk

membandingkan kemampuan berbagai isolat kandidat probiotik yang paling baik dalam menghambat pertumbuhan patogen S. agalactiae StR secara in vitro. Berdasarkan analisis

statistik diketahui semua isolat mampu menekan

pertumbuhan S. agalactiae StR secara signifikan (P<0,05) jika dibandingkan dengan kontrol, Sa-StR (Lampiran 2). Isolat dengan penghambatan terbaik adalah L1k yang mampu menghambat pertumbuhan S. agalactiae StR hingga kepadatan 102 CFU/mℓ sedangkan isolat-isolat lain yakni RN21f, K21c dan NB21b mampu menghambat hingga kepadatan 103-104 CFU/mℓ. Selain itu, isolat dengan kode RN11a, NB13a, NB13b, RN21c, RN21g, dan L2m juga mampu 18

menghambat pertumbuhan S. agalactiae StR dengan kemampuan berbeda (Gambar 5). Empat isolat (L1k, RN21f, K21c, dan NB21b) dengan kemampuan penghambatan paling baik diantara isolat yang telah diuji akan diuji sifat patogenitasnya terhadap ikan nila. Lactid Acid Bacteria (LAB) yang diisolasi dari saluran pencernaan mampu memproduksi komponen bakteriosin yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya dan secara tidak langsung akan mempengaruhi kompetisi dalam memperoleh energi di lingkungannya. Isolat LAB yang ditemukan dalam saluran pencernaan organisme akuatik seperti ikan mampu meningkatkan status kesehatan organisme tersebut (Verschuere et al. 2000). Penghambatan bakteri kandidat probiotik terhadap bakteri patogen berbeda karena sejumlah probion sering memiliki inang dan patogen yang spesifik (Gram et al. 2001), sehingga media tumbuh dan patogen yang diujikan juga dapat mempengaruhi hasil uji antagonistik. Pelczar dan Chan (1998) menyatakan bahwa daya hambat yang berbeda dapat dipengaruhi beberapa faktor atau keadaan yang akan mempengaruhi efek antimikrobial. Penelitian yang dilakukan Sugita et al. (1996) menghasilkan beberapa bakteri mikroflora usus ikan air tawar yang mempunyai kemampuan antibakterial terhadap beberapa isolat patogen antara lain Aeromonas hydrophilla. Pengaruh zat antibakteri yang diproduksi bakteri umumnya berkaitan dengan faktor-faktor yang berperan tunggal maupun kombinasi seperti produksi antibiotik, bakteriosin, siderofor, lisozim atau protease, mengubah nilai pH dengan dihasilkannya asam organik. Penelitian yang dilakukan ini tidak sampai menentukan faktor utama yang berperan dalam aktivitas antibakterial dari bakteri asal usus ikan air tawar. Dengan pengujian aktivitas antagonistik secara in vitro cukup untuk menentukan pengaruh penghambatan bakteri kandidat probiotik terhadap bakteri patogen. Pada penelitian ini, uji antagonistik in vitro yang dilakukan tidak menggunakan media padat berupa agar sebagai media tumbuh. Hal ini dikarenakan

tidak semua jenis

bakteri mampu memproduksi

inhibitory

metabolites (senyawa penghambat) pada media padat (agar). Terdapat kemungkinan produksi inhibitory metabolites akan lebih banyak jika kultur dilakukan pada media cair (broth).

19

Keterangan: Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 5 Kepadatan patogen S. agalactiae StR hasil uji antagonistik in vitro dengan metode kultur bersama kandidat probiotik

20

20

Perbedaan komposisi media juga mempengaruhi produksi senyawa penghambat (Verschuere et al. 2000). Selain itu, percobaan yang telah dilakukan sebelum uji antagonistik in vitro memperlihatkan hasil secara visual yang kurang baik, zona hambat yang dihasilkan oleh bakteri kandidat probiotik yang digoreskan terhadap bakteri patogen secara streakplate tidak terlihat jelas (Gambar 6). Hal tersebut membuktikan bahwa penghambatan pertumbuhan populasi tidak selalu dapat dilihat melalui metode zona bening (metode KirbyBauer), sehingga metode uji antagonistik in vitro yang digunakan adalah metode kultur bersama patogen dan kandidat probiotik pada media broth. Sasanti (2008) juga melaporkan bahwa dari 110 isolat hasil isolasi dari terumbu karang, hanya 10 isolat saja yang potensial sebagai kandidat probiotik. Lima diantaranya terbukti mampu menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi MR 5339 Rf R walaupun tidak menunjukkan adanya zona hambat pada uji in vitro dengan metode Kirby-Bauer.

Keterangan: Panah merah ( jelas.

) menunjukkan zona bening yang dihasilkan tidak terlihat

Gambar 6 Zona hambat yang dihasilkan kandidat probiotik terhadap patogen dengan metode cawan gores Kepadatan bakteri kandidat probiotik serta S. agalactiae StR yang diuji dengan metode kultur bersama sebelumnya diukur dengan metode total plating count (TPC)

dan optical density (OD) menggunakan spektrofotometer.

Pengukuran OD dilakukan pada panjang gelombang (λ) 600 nm. Kepadatan bakteri diketahui dengan membandingkan nilai OD dengan jumlah koloni bakteri yang dikultur selama 24 jam (Lampiran 3). 3.6 Uji Patogenisitas Kandidat Probiotik Uji patogenisitas kandidat probiotik dilakukan untuk menguji sifat patogen dari kandidat yang diisolasi dari alam. Paramater yang diamati adalah SR ikan 21

nila yang diinjeksi dengan isolat kandidat probiotik. Sebagai pembanding adalah perlakuan kontrol yang diinjeksikan patogen S. agalactiae isolat 5 (Sa5) yang dikultur selama 24 jam. Kandidat probiotik yang diuji antara lain L1k, RN21f, K21c dan NB21b yang memiliki kemampuan terbaik dalam menghambat pertumbuhan patogen. Gambar 7 menyajikan kondisi SR harian setiap perlakuan selama uji patogenisitas.

Keterangan: (K2ic) perlakuan injeksi kandidat probiotik kode K2ic; (NB21b) injeksi NB21b; (L1k) injeksi L1k; (RN21f) injeksi RN21f; (Sa5) injeksi patogen S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik.

Gambar 7 Survival rate (SR) harian selama uji patogenisitas Hal menarik dari Gambar 7 adalah pada perlakuan injeksi NB21b. Survival rate pada perlakuan tersebut turun hingga 0% pada hari pertama. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan setiap 4 jam selama 24 jam pertama pascainjeksi, diketahui bahwa ikan pada perlakuan NB21b mulai mengalami kematian sejak 4 jam pertama dan berakhir pada 4 jam ke-2 tanpa mengalami gejala klinis yang jelas (Gambar 8), sehingga sementara dapat disimpulkan bahwa isolat NB21b bersifat mematikan ikan nila pada kepadatan injeksi 108 CFU/mℓ.

A b C Keterangan: (a) ikan mati tidak menunjukkan gejala klinis; (b) ikan mati dikumpulkan dalam baskom; (c) ikan mati dalam akuarium perlakuan.

Gambar 8 Ikan perlakuan injeksi NB21b yang mengalami kematian pascainjeksi 22

Gambar 9 memperlihatkan SR perlakuan NB21b pada akhir pemeliharaan adalah 0%. Analisis statistik juga menunjukkan SR perlakuan NB21b berbeda nyata (P<0,05) terhadap semua perlakuan. Sedangkan tiga perlakuan lainnya yakni K2ic, L1k dan RN21f dapat mempertahankan SR ikan nila masing-masing sebanyak 80%, 100% dan 90%. Berdasarkan analisis statistik perlakuan K2ic berbeda nyata (P<0,05) terhadap L1k, namun tidak berbeda nyata (P>0,05) terhadap RN21f. Perlakuan L1k juga tidak berbeda nyata (P>0,05) terhadap RN21f. Kontrol positif Sa5 berbeda nyata (P<0,05) terhadap semua perlakuan (Lampiran 4).

Keterangan: (K2ic) perlakuan injeksi kandidat probiotik kode K2ic; (NB21b) injeksi NB21b; (L1k) injeksi L1k; (RN21f) injeksi RN21f; (Sa5) injeksi patogen S. agalactiae isolat 5 tipe non-hemolitik; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 9 Survival rate (SR) akhir uji patogenisitas Kontrol positif yang digunakan (Sa5) menunjukkan gejala klinis sejak hari pertama pascainjeksi yakni stres yang ditandai dengan perubahan warna tubuh ikan nila menjadi lebih gelap dan garis-garis hitam vertikal pada tubuh ikan yang terlihat lebih jelas. Selanjutnya, ikan nila yang diinjeksi dengan patogen S. agalactiae menunjukkan gejala-gejala penyakit Streptococcosis hingga hari ke-8 pemeliharaan. Berdasarkan hasil uji patogenisitas ini, dipilih satu isolat yang akan diuji kemampuan antagonistiknya secara in vivo yakni isolat L1k yang mampu mempertahankan SR paling tinggi. Selain itu, L1k dipilih karena pada uji antagonistik secara in vitro isolat ini juga memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan patogen paling optimal diantara isolat-isolat yang diujikan.

23

3.7 Uji Antagonistik In Vivo Isolat L1k yang menunjukkan SR paling tinggi pada uji patogenisitas, diujikan lebih lanjut pada uji antagonistik secara in vivo untuk mengetahui kemampuannya dalam menghambat serangan penyakit Streptococcosis dari bakteri patogen S. agalactiae tipe non-hemolitik secara langsung pada tubuh ikan nila dengan metode injeksi bersama dengan berbagai perlakuan. Parameter pengamatan pada uji antagonistik in vivo meliputi konsumsi pakan harian, SR harian, gejala klinis harian, dan hematologi ikan. 3.7.1 Konsumsi Pakan Pakan yang diberikan adalah pakan komersil dengan merk dagang F999. Konsumsi pakan harian setiap perlakuan selama uji antagonistik in vivo disajikan pada Gambar 10.

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif.

Gambar 10 Konsumsi pakan harian selama uji antagonistik in vivo Pada Gambar 10 dapat dilihat bahwa sebelum uji tantang dengan patogen S. agalactiae yakni, antara H-6 hingga H-1 konsumsi pakan terjadi fluktuasi, tetapi masih relatif sama pada setiap perlakuan. Berbeda kondisi setelah uji tantang pada H0, konsumsi pakan masih terlihat fluktuatif, namun terdapat perbedaan yang signifikan antara kontrol negatif (perlakuan D) dengan perlakuan lainnya. Selain perlakuan D, perlakuan lain memperlihatkan penurunan konsumsi pakan hingga H4 pasca uji tantang. Pada H5 dan H6, perlakuan A dan B memperlihatkan peningkatan konsumsi pakan, namun kembali turun hingga hari terakhir pemeliharaan. Berbeda dengan perlakuan C, pada H5 ke H6 terjadi penurunan konsumsi pakan. Ini diperkirakan akibat pengaruh injeksi kandidat 24

probiotik pada perlakuan tersebut, namun hingga hari terakhir konsumsi pakan relatif stabil. Pada hari terakhir (H7 hingga H10), semua perlakuan selain perlakuan D memperlihatkan jumlah konsumsi pakan yang stabil dan relatif sama. Hal ini disebabkan SR dari setiap perlakuan yang tersisa berkisar antara 20,0% hingga 43,3% kecuali pada perlakuan D (Gambar 11). 3.7.2 Survival Rate (SR) Berdasarkan

hasil

pengamatan

harian

secara

berkala

selama

pemeliharaan, kondisi SR harian setiap perlakuan selama uji antagonistik in vivo dapat dilihat pada Gambar 11.

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif.

Gambar 11 Survival rate (SR) harian selama uji antagonistik in vivo Survival rate harian menunjukkan gambaran kematian ikan pada perlakuan A dimulai pada H-1, 3 hari setelah injeksi kandidat probiotik dan terus berlangsung hingga H7 uji antagonistik in vivo dan setelah itu SR relatif stagnan, artinya tidak terhitung adanya kematian. Pada perlakuan B, kematian mulai terjadi H1 pascainjeksi bersama patogen dan kandidat probiotik dan terus berlangsung hingga hari terakhir pemeliharaan selama uji antagonistik in vivo. Kematian ikan pada perlakuan C baru terjadi setelah H2 pascainjeksi patogen. Kematian terjadi secara signifikan antara H4 dan H5 (pascainjeksi kandidat probiotik) dari SR 83,3% hingga angka 63,3% dalam 1 hari, kematian terus terjadi hingga H8 dan stagnan hingga H10. Pada perlakuan D, kematian terjadi antara H0 sampai H4 pascainjeksi dengan larutan fisiologis (larfis). Kematian pada perlakuan D bukan disebabkan serangan penyakit Streptococcosis melainkan stres pascainjeksi karena ikan 25

tidak menunjukkan gejala klinis selain garis hitam yang tampak jelas. Pada perlakuan E kematian terjadi antara H1 sampai H7, sedangkan antara H7 sampai akhir pengamatan uji antagonistik in vivo (H10) tidak terjadi lagi kematian dengan SR 26,7%. Pada Gambar 12 dapat dilihat bahwa perlakuan dengan SR tertinggi adalah D (kontrol negatif) yaitu 90,0±10,0%. Angka tersebut memiliki perbedaan yang signifikan (P<0,05) jika dibandingkan dengan perlakuan lainnya (Lampiran 5). Survival rate terkecil pada perlakuan B (20,0±10,0%) yang berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan C (43,4±15,3%) dan D, namun tidak berbeda nyata (P>0,05) terhadap perlakuan A (33,3±11,5%) dan E (26,7±5,8%). Perlakuan A dan E tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan B dan C, namun berbeda nyata terhadap perlakuan D.

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 12 Survival rate (SR) pada akhir uji antagonistik in vivo 3.7.3 Gejala Klinis Gejala klinis yang ditunjukkan oleh ikan nila selama uji in vivo meliputi perubahan tingkah laku renang, aktivitas makan serta patologi anatomi makroskopis organ luar ikan. Sejak pemeliharaan H6 hingga H0, tidak terjadi perubahan baik pada tingkah laku renang, aktivitas makan serta patologi anatomi makroskopis organ luar ikan nila, semuanya terlihat normal. Pakan dihentikan hanya pada H0 pemeliharaan, yakni saat semua ikan yang digunakan dalam perlakuan diberi injeksi dengan kandidat probiotik, patogen, larfis maupun kombinasi perlakuan, sedangkan pada injeksi perlakuan lainnya pemberian pakan tidak dihentikan. 26

Pascainjeksi pada H0, mulai terjadi perubahan aktivitas makan, serta anatomi makro pada setiap perlakuan. Pada H1 dan H2, hampir semua perlakuan mengalami penurunan aktivitas makan dan terjadi stres pascainjeksi yakni garis vertikal pada tubuh ikan yang terlihat hitam dan jelas. Kemudian pada H3, gejala klinis mulai terlihat dengan terjadinya perubahan patologi anatomi makroskopis pada perlakuan yang diberi injeksi patogen yakni mulai terjadi exopthalmia (mata menonjol) pada beberapa perlakuan. Pada H4, semua perlakuan kecuali D menunjukkan perubahan gejala klinis seperti aktivitas makan (respons terhadap pakan) lemah, garis vertikal tubuh terlihat jelas, sirip dorsal tegak, exopthalmia, opacity (kekeruhan pada mata), clear operculum, tingkah laku renang lemah dan terkadang agresif, whirling, serta tubuh membengkok, selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 5. Hampir semua gejala klinis penyakit Streptococcosis ditunjukkan pada H4 pascainjeksi. Gejala klinis pada H4 lebih banyak dibandingkan hari lainnya, sehingga dapat disimpulkan bahwa pada

H4

pascainjeksi

S.

agalactiae

non-hemolitik

(isolat

5)

penyakit

Streptococcosis dapat didiagnosa berdasarkan gejala-gejala yang timbul. Aryanto (2011) melaporkan bahwa bakteri S. agalactiae non-hemolitik lebih cepat menyebabkan perubahan pada pola berenang ikan (pada hari ke-6 pascainfeksi ikan cenderung berenang lemah, gasping dan whirling) sedangkan gejala yang sama baru muncul hari ke-7 pascainfeksi dengan bakteri tipe β-hemolitik. Perubahan pada mata diawali dengan mata mengkerut, kemudian pupil mata mengecil, mata seperti berkabut (opacity), purulens hingga sebelah mata dapat hilang (Hardi 2011). Aryanto (2011) melaporkan perubahan mata berkabut atau keruh (opacity) terjadi pada hari ke-2 pada saat infeksi tipe non-hemolitik, sedangkan

pada

tipe

β-hemolitik

perubahan

terjadi

pada

hari

ke-4.

Pembengkakan mata atau exopthalmia yang disertai dengan pendarahan terjadi pada hari ke-4 untuk tipe non-hemolitik dan pada hari ke-5 untuk tipe β-hemolitik. Lateral

exopthalmia

lebih

sering

terjadi

dibandingkan

dengan

bilateral

exopthalmia. Gejala Streptococcosis spesifik pada ikan nila adalah clear operculum dengan berbagai tanda. Gejala clear operculum muncul rata-rata pada hari ke-3 dan clear operculum yang disertai pendarahan pada hari ke-4 untuk bakteri tipe non-hemolitik dan hari ke-5 pascainjeksi bakteri tipe β-hemolitik tanpa disertai pendarahan. Selain perubahan gejala pada mata, perubahan gejala klinis lainnya pada uji in vivo ini juga terjadi pada H4 atau lebih cepat dibandingkan dengan 27

perlakuan yang diberikan Aryanto (2011). Hal ini diduga karena perbedaan dosis injeksi. Dosis yang diberikan pada uji in vivo ini adalah 106 CFU/mℓ sesuai dengan dosis pada uji in vitro sedangkan Aryanto (2011) menggunakan dosis 104,8 CFU/mℓ berdasarkan perhitungan LD 50. Pemberian dosis tersebut sesuai dengan Sukenda (2000), ikan uji dengan berat 100 g menerima 1 mℓ suspensi bakteri dari 3x103 hingga 3x106 CFU/mℓ sebagai standar dari injeksi bakteri. Gejala klinis yang teramati juga sesuai dengan gejala yang berhasil diamati oleh Evans et al. (2006), pada ikan nila yang terinfeksi S. agalactiae sebelum mati yaitu berenang lemah dan berada di dasar akuarium, respons terhadap pakan lemah, whirling, dan tubuh membentuk huruf ”C”. Gambar 13 menyatakan beberapa perubahan tingkah laku renang ikan nila yang teramati selama uji antagonistik in vivo.

Keterangan: (a) Normal; (b) Normal; (c) Berdiam di dasar; (d) Berkumpul di sudut; (e) Berenang agresif; (f) Whirling; (g) Bergerak lemah; (h) Berenang di permukaan; (i) Gasping.

Gambar 13 Perubahan pola renang ikan nila pascainjeksi S. agalactiae Hardi (2011) melaporkan perubahan tingkah laku makan ikan nila akibat serangan bakteri S. agalactiae karena terganggunya sistem pencernaan ikan 28

akibat adanya infeksi bakteri S. agalactiae yang menyerang bagian hipotalamus (otak) sebagai pusat yang mengatur rasa lapar dan juga pencernaan ikan. Perubahan tersebut terlihat jelas pada aktivitas makan ikan nila pascainjeksi pada H3 hingga H7. Ikan mulai lambat merespons pakan yang diberikan dan jumlah pakan yang dimakan juga berkurang. Umumnya

respons ikan

pascainjeksi S. agalactiae lemah, bahkan ikan uji yang diinjeksi dengan bakteri tipe non-hemolitik teramati tidak mengonsumsi pakan yang diberikan sejak H3. Hingga H7, gejala klinis yang ditunjukkan masih jelas terlihat serta menyebabkan kematian pada ikan. Gejala klinis yang terlihat saat pengamatan tetap terlihat pasca kematian ikan seperti exopthalmia, opacity, clear operculum, purulens (mata menjadi putih), mata mengkerut, hemorragi (pendarahan) pada tubuh, ulcer pada kepala, serta tubuh membengkok seperti ditunjukkan pada Gambar 14.

Keterangan: (a) Normal; (b) Normal; (c) Sirip punggung mengembang; (d) Garis vertikal tubuh menghitam; (e) Clear operculum (penjernihan operkulum); (f) Lateral exopthalmia (penonjolan sebelah mata); (g) Bilateral exopthalmia (penonjolan dua belah mata); (h) Purulens (mata memutih); (i) Mata mengkerut; (j) Tubuh membengkok; (k) Opacity (mata berkabut); (l) Warna tubuh pucat; (m) Ulcer pada kepala.

Gambar 14 Gejala klinis pada organ mata dan tubuh ikan nila Menurut Irianto (2005) penyakit infeksius bisa bersifat akut dengan mortalitas tinggi dalam jangka waktu singkat dan sedikit tanda-tanda yang terlihat, sub-akut maupun kronis serta laten dengan mortalitas berlangsung 29

hingga beberapa minggu sejak munculnya wabah. Bakteri S. agalactiae merupakan patogen yang menyebabkan septicemia dengan tipikal infeksi yang kronis pada ikan nila (Conroy 2009). Penyakit Streptococcosis memiliki karakteristik yaitu septicemia dan meningoencephalitis (Mian et al. 2009). Gejala klinis dari penyakit ini adalah kelesuan, perut bengkak, lambung dan usus diisi dengan cairan gelatinous atau kekuning-kuningan dan pada beberapa ikan terjadi hemorragi kecil di mata, exopthalmia dan kornea keburaman (opacity), selain itu hati membesar, kongesti ginjal dan limpa, dan adanya cairan di rongga peritoneal (Eldar et al. 1994b). Gejala klinis tersebut juga teramati selama uji in vivo walaupun tidak dilakukan pencatatan, seperti ditunjukkan pada Gambar 15.

Keterangan: (a) Ikan mati dengan perut membengkak, bagian perut kecokelatan dan tubuh pucat; (b) Ikan hidup dengan perut membengkak dan tidak dapat berbalik badan; (c) Ikan mati segar dengan perut membengkak; (d) Bagian sekitar sirip pectoral berwarna kuning kehijuan; (e) Usus berisi cairan kekuning-kuningan; (f) Beberapa organ dalam mengalami pembengkakan. Panah kuning ( ) menunjukkan organ dalam ikan nila: (Gj) Ginjal, (Ht) Hati, (Pk) Pankreas, (Us) Usus, (Lb) Lambung

Gambar 15 Gejala klinis berupa pembengkakan perut dan organ dalam ikan nila Menurut Hardi (2011), bakteri S. agalactiae tipe non-hemolitik lebih virulen dibandingkan dengan tipe β-hemolitik dilihat dari kematian, munculnya gejala klinis, perubahan tingkah laku, perubahan patologi anatomi baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Aryanto (2011) juga melaporkan, pascainjeksi bakteri S. agalactiae tipe non-hemolitik lebih banyak menimbulkan gejala klinis dibandingkan dengan tipe β-hemolitik. Sejak H8 hingga H10 (hari terakhir pengamatan) gejala klinis yang tercatat dalam penelitian ini semakin berkurang, menyisakan gejala patologi makroskopis organ luar seperti beberapa gejala klinis 30

pasca kematian. Selain itu, pada H8 hingga H10 aktivitas makan ikan mulai normal walaupun tidak terjadi pada setiap perlakuan. Permukaan sel bakteri tipe β-hemolitik tidak seperti sel bakteri tipe nonhemolitik (berkapsul) yang selain tersusun atas protein, juga tersusun atas karbohidrat yang lebih banyak, sehingga lebih sulit untuk difagosit. Sel bakteri tipe non-hemolitik lebih cepat tumbuh dan berkembangbiak serta menyebarkan virulensi di sel atau jaringan dibandingkan bakteri tipe β-hemolitik yang mudah dikenali dan mampu dilawan oleh sistem imun (Hardi 2011). Winarti

(2010)

menyatakan,

bahwa

pemaparan

antigen

pada

intramuscular menyebabkan bakteri langsung masuk ke dalam jaringan dan pembuluh darah (kapiler) kemudian menyebar ke seluruh organ tubuh sehingga dengan dosis lebih rendah menyebabkan kematian ikan nila yang lebih banyak dan cepat. Menurut Cipriano (2001) dalam Winarti (2010), keganasan penyakit dipengaruhi oleh jumlah dari faktor yang saling berhubungan, meliputi virulensi bakteri, macam dan derajat stres yang dipengaruhi populasi ikan, kondisi fisiologi dari inang dan derajat resistensi genetik yang tidak bisa dipisahkan dalam populasi spesifik dari ikan. 3.7.4 Hematologi Ikan Data lain yang diambil adalah data gambaran darah (hematologi) ikan. Pengamatan hematologi ikan dilakukan sebanyak 5 kali. Secara umum darah berfungsi untuk mengedarkan nutrien yang berasal dari pencernaan makanan ke sel-sel tubuh, membawa oksigen ke sel-sel tubuh (jaringan) dan membawa hormon dan enzim ke organ tubuh yang memerlukannya (Lagler et al., 1977). Amlacher (1970) menyatakan bahwa darah akan mengalami perubahan khususnya bila terkena penyakit infeksius. Beberapa parameter yang dapat memperlihatkan perubahan patologi pada darah adalah kadar hemoglobin, kadar hematokrit, jumlah eritrosit, dan jumlah leukosit. Berikut hasil pengamatan parameter beberapa hematologi ikan yang didapatkan dalam penelitian ini: 3.7.4.1 Total Eritrosit Jumlah eritrosit ikan nila sebelum perlakuan injeksi (H-6) sebesar 1,27x106 sel/mm 3 dan berdasarkan analisis statistik tidak ada perbedaan nyata (P>0,05) pada semua perlakuan (Lampiran 7). Pada sampling H-2, setelah injeksi probiotik untuk perlakuan A, jumlah eritrosit pada perlakuan A melonjak 31

hingga 3,46x106 sel/mm 3, sedangkan pada perlakuan B, C, D dan E masingmasing sama yakni 1,93x106 sel/mm 3 (Gambar 16). Perlakuan A berbeda nyata (P<0,05) terhadap perlakuan lainnya.

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 16 Total Eritrosit selama uji antagonistik in vivo Setelah uji tantang pada H0 dilakukan 3 kali sampling pada H2, H6 dan H10 (Gambar 16). Pada H2 jumlah eritrosit tidak jauh berbeda dibandingkan sampling sebelumnya, berkisar antara 1,10x106 sel/mm 3 hingga 1,93x106 sel/mm 3 dan tidak berbeda nyata (P>0,05) untuk semua perlakuan. Pada H6 jumlah eritrosit turun pada semua perlakuan, berkisar antara 0,61x106 sel/mm 3 hingga 0,97x106 sel/mm 3, namun tidak berbeda nyata (P>0,05) untuk semua perlakuan. Pada H10 jumlah eritrosit kembali naik pada semua perlakuan, berkisar antara 2,03x106 sel/mm 3 hingga 2,74x106 sel/mm 3, dan tidak berbeda nyata (P>0,05) untuk semua perlakuan (Lampiran 7). Jumlah eritrosit berkaitan erat dengan kadar hemoglobin dan hematokrit (Fujaya 2004). Berdasarkan hasil penelitian, jumlah eritrosit setelah injeksi kandidat probiotik perlakuan A (H-2) tren dari ketiga parameter tersebut hampir sama, peningkatan jumlah eritrosit (Gambar 16) disertai juga peningkatan kadar hemoglobin (Gambar 18) dan hematokrit (Gambar 19). Jumlah eritrosit pada sampling H2 dan H6 mengalami penurunan setelah uji tantang (pada H0) jika dibandingkan dengan jumlah eritrosit pada sampling H-6 dan H-2 sebelumnya. Penurunan ini disertai penurunan kadar hemoglobin dan hematokrit. Penurunan jumlah eritrosit setelah uji tantang (injeksi patogen S. agalactiae pada H0) diduga karena bakteri S. agalactiae yang diinfeksikan menyebabkan kerusakan pada 32

ginjal. Ginjal merupakan organ penghasil eritrosit. Rusaknya ginjal menyebabkan kemampuan ikan untuk memproduksi eritrosit menurun. Rendahnya jumlah eritrosit menandakan ikan menderita anemia dan kerusakan ginjal (Nabib dan Pasaribu 1989). Jumlah eritrosit kembali normal seperti semula pada sampling terakhir (H10) dan tidak terdapat perbedaan nyata (P>0,05) antar perlakuan. 3.7.4.2 Total Leukosit Jumlah leukosit ikan nila sebelum perlakuan injeksi (H-6) sebesar 12,63x105 sel/mm 3 dan berdasarkan analisis statistik tidak berbeda nyata (P>0,05) pada semua perlakuan. Pada sampling H-2, setelah injeksi probiotik untuk perlakuan A, jumlah leukosit tidak mengalami kenaikan yang signifikan. Perlakuan A naik menjadi 16,99x105 sel/mm 3, sedangkan pada perlakuan B, C, D, dan E tidak jauh berubah yakni 12,56x105 sel/mm 3 (Gambar 17). Berdasarkan analisis statistik, jumlah leukosit tidak ada perbedaan nyata (P>0,05) pada setiap perlakuan (Lampiran 8).

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 17 Total Leukosit selama uji antagonistik in vivo Setelah uji tantang pada H0 dilakukan 3 kali sampling pada H2, H6 dan H10. Pada H2 jumlah leukosit tidak jauh berbeda dibandingkan sampling sebelumnya, berkisar antara 6,21x105 sel/mm 3 hingga 14,05x105 sel/mm 3 dan tidak berbeda nyata (P>0,05) untuk semua perlakuan. Pada H6 jumlah leukosit juga tidak jauh berbeda dibandingkan sampling H2, berkisar antara 4,91x105 sel/mm 3 hingga 15,99x105 sel/mm 3. Terdapat perbedaan nyata (P<0,05) antara perlakuan A, B dab D, namun perlakuan C dan E tidak berbeda nyata (P>0,05) 33

terhadap perlakuan A dan B. Sedangkan pada H10 jumlah leukosit naik pada setiap perlakuan kecuali perlakuan D. Secara statistik jumlah leukosit perlakuan A (12,14x105 sel/mm 3) dan B (21,71x105 sel/mm 3) berbeda nyata (P<0,05), namun total leukosit kedua perlakuan tersebut tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan C, D dan E. Analisis statistik jumlah leukosit selama uji antagonistik in vivo dapat dilihat pada Lampiran 8. Anderson (1993), menyatakan leukosit merupakan salah satu komponen darah yang berfungsi sebagai pertahanan non-spesifik yang akan melokalisasi dan mengeliminir patogen melalui mekanisme fagositosis. Jumlah leukosit pada pengamatan H-6, H-2 dan H2 tidak berbeda nyata (P>0,05) pada semua perlakuan. Akan tetapi pada pengamatan H2 dan H6, tren menunjukkan penurunan jumlah leukosit dan peningkatan terjadi pada H10 hampir pada semua perlakuan kecuali kontrol negatif yang tidak mengalami perubahan signifikan. Peningkatan jumlah leukosit ini terkait dengan kinerja sistem imun ikan dalam mereduksi serangan patogen. Semakin meningkatnya serangan patogen maka akan semakin meningkat pula produksi leukosit dalam darah. Hal ini didukung oleh Martin et al. (2004) yang menyatakan bahwa respons ikan terhadap stresor bergantung pada jenis stres yang dialami oleh ikan tersebut, dimana peningkatan jumlah sel darah putih, penurunan kadar hematokrit dan peningkatan neutrofil bergantung pada jenis stres yang dialami. 3.7.4.3 Kadar Hematokrit Kadar hematokrit ikan nila sebelum perlakuan injeksi (H-6) sebesar 16,57% dan berdasarkan analisis statistik tidak berbeda nyata (P>0,05) pada semua perlakuan. Pada sampling H-2, kadar hematokrit pada perlakuan A naik menjadi 25,16% setelah injeksi probiotik, sedangkan pada perlakuan B, C, D, dan E masing-masing sama yakni 22,71%. Berdasarkan alalisis statistik tidak ada perbedaan nyata (P>0,05) pada semua perlakuan (Lampiran 9). Setelah uji tantang pada H0 dilakukan 3 kali sampling pada H2, H6 dan H10 (Gambar 18). Pada H2 kadar hematokrit mulai beragam dibandingkan sampling sebelumnya. Kadar hematokrit perlakuan A (11,99%), B (16,34%) dan D (15,19%) tidak berbeda nyata (P>0,05). Perlakuan C dengan kadar hematokrit paling tinggi (21,51%) berbeda nyata (P<0,05) terhadap perlakuan E (10,26%), namun kadar hematokrit kedua perlakuan tersebut tidak berbeda nyata (P>0,05) terhadap perlakuan lain (Lampiran 9). 34

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 18 Kadar hematokrit selama uji antagonistik in vivo Kadar hematokrit pada sampling H6 juga bervariasi, perlakuan A (12,66%) dan C (11,64%) tidak berbeda nyata (P>0,05) terhadap perlakuan B dan E. Perlakuan B (17,52%) tidak berbeda nyata (P>0,05) terhadap perlakuan E (15,93%). Sedangkan perlakuan D dengan kadar hematokrit paling tinggi (26,24%) berbeda nyata (P<0,05) terhadap perlakuan A, B, C, dan E. Pada sampling H10 kadar hematokrit naik pada semua perlakuan yang berkisar antara 22,49% hingga 33,87%. Berdasarkan analisis statistik, kadar hematokrit tidak berbeda nyata (P>0,05) pada setiap perlakuan (Lampiran 9). Hematokrit adalah perbandingan antara padatan sel-sel darah (eritrosit) dalam darah yang dinyatakan dalam persen (Angka et al. 1985). Menurut Bond (1979) kisaran kadar hematokrit darah ikan adalah sebesar 20-30%. Tidak terjadi perubahan signifikan antar perlakuan pascainjeksi kandidat probiotik perlakuan A (pengamatan H-2). Pasca uji tantang (pengamatan H2), kadar hematokrit cenderung mengalami penurunan. Menurunnya kadar hematokrit diduga karena menurunnya jumlah eritrosit dalam darah. Dengan kata lain, penurunan jumlah eritrosit akan diikuti oleh penurunan kadar hematokrit. Menurut Fujaya (2004), kadar hemoglobin berkorelasi kuat dengan kadar hematokrit dan eritrosit. Hasil analisis statistik menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05) terjadi antara perlakuan C dan E, sedangkan perlakuan lain tidak berbeda nyata. Pada pengamatan H2 tersebut perlakuan C dan E masih dalam kondisi yang sama, yakni hanya diinjeksi dengan patogen pada H0. Menurut Dellman dan Brown (1989), faktor-faktor yang mempengaruhi jumlah sel darah merah adalah 35

spesies, perbedaan induk, kondisi nutrisi, aktivitas fisik, dan umur. Dengan demikian dapat diduga sampel yang teramati memang memiliki kondisi yang berbeda. Selain itu, menurunnya kadar hematokrit setelah injeksi patogen diduga akibat nafsu makan ikan yang menurun karena infeksi S. agalactiae tersebut. Dugaan ini diperkuat oleh Wedemeyer dan Yasutake (1977) yang menyatakan bahwa, menurunnya kadar hematokrit dapat dijadikan petunjuk mengenai rendahnya kandungan protein pakan, defisiensi vitamin atau ikan mendapat infeksi sehingga nafsu makan menurun. Kadar hematokrit kembali normal dan mengalami peningkatan pada pengamatan H10, serta tidak berbeda nyata (P>0,05) antar perlakuan (Gambar 18). 3.7.4.4 Kadar Hemoglobin Kadar hemoglobin ikan nila selama uji antagonistik in vivo tidak terlalu bervariasi (Gambar 19). Sebelum perlakuan injeksi sampling pada H-6, kadar hemoglobin adalah 4,7 g% dan berdasarkan analisis statistik tidak berbeda nyata (P>0,05) pada semua perlakuan. Pada sampling H-2, setelah injeksi probiotik, kadar hemoglobin pada perlakuan A meningkat secara signifikan menjadi 10,0 g% berbeda nyata (P<0,05) terhadap perlakuan B, C, D, dan E yang turun menjadi 4,0 g% (Lampiran 10).

Keterangan: (A) simulasi pencegahan; (B) injeksi bersama; (C) simulasi pengobatan; (D) kontrol negatif; (E) kontrol positif; Huruf superscript yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05).

Gambar 19 Kadar hemoglobin selama uji antagonistik in vivo Setelah uji tantang pada H0 dilakukan 3 kali sampling pada H2, H6 dan H10 (Gambar 19). Pada H2 kadar hemoglobin berkisar antara 2,3 hingga 3,9 g% dan berdasarkan analisis statistik tidak berbeda nyata (P>0,05) antar perlakuan. 36

Kadar hemoglobin tertinggi pada H6 adalah perlakuan D, yakni 5,7 g% yang berbeda nyata (P<0,05) terhadap perlakuan A, B, C, dan E masing-masing 2,7; 3,7; 3,2; dan 2,8 g%. Berdasarkan analisis statistik kadar hemoglobin untuk perlakuan A, B, C, dan E tidak berbeda nyata (P>0,05). Pada sampling terakhir H10, kadar hemoglobin berkisar antara 4,6 hingga 7,9 g%. Berdasarkan analisis statistik, tidak terdapat perbedaan nyata (P>0,05) pada setiap perlakuan (Lampiran 10). Hemoglobin adalah protein dalam eritrosit yang tersusun atas protein globin tidak berwarna dan pigmen heme. Hemoglobin berfungsi untuk mengikat oksigen kemudian digunakan dalam proses katabolisme untuk menghasilkan energi. Kemampuan darah untuk mengangkut oksigen bergantung pada kadar hemoglobin dalam darah (Lagler et al. 1977). Pada Gambar 19, hasil pengamatan H-2 menunjukkan kadar hemoglobin perlakuan A meningkat secara signifikan (P<0,05) dibandingkan perlakuan lain. Peningkatan kadar hemoglobin pascainjeksi kandidat probiotik pada perlakuan A tersebut diduga berkaitan dengan meningkatnya aktivitas fisik dari ikan. Seperti dinyatakan Dellman dan Brown (1989) bahwa, faktor-faktor yang mempengaruhi jumlah sel darah merah adalah spesies, perbedaan induk, kondisi nutrisi, aktivitas fisik, dan umur. Sedangkan setelah injeksi patogen (pengamatan H2), kadar hemoglobin pada setiap perlakuan terutama perlakuan A mengalami penurunan dan mendekati kadar

hemoglobin perlakuan lainnya, sehingga kadar hemoglobin antar

perlakuan tidak berbeda nyata (P>0,05). Rendahnya kadar hemoglobin diduga disebabkan karena jumlah eritrosit juga mengalami penurunan. Secara fisiologis, hemoglobin

menentukan

tingkat

ketahanan

tubuh

ikan

dikarenakan

hubungannya yang erat dengan adanya daya ikat terhadap oksigen oleh darah. Kadar hemoglobin dalam darah berkorelasi kuat dengan nilai hematokrit. Semakin rendah jumlah sel-sel darah merah, maka akan semakin rendah pula kadar hemoglobin dalam darah (Lagler et al. 1977). Pendapat ini didukung oleh Snieszko et al. (1960) yang menyatakan bahwa apabila ikan terserang penyakit atau kehilangan nafsu makan, maka nilai hematokrit akan menjadi lebih rendah. Kadar hematokrit darah dibawah 30% menunjukkan terjadinya defisiensi eritrosit. Berkurangnya jumlah eritrosit, hemoglobin dan hematokrit juga disebabkan karena terjadinya anemia pada ikan. Blaxhall (1971) menyatakan penurunan kadar hemoglobin merupakan indikator anemia. Anemia berdampak pada terhambatnya

pertumbuhan

ikan,

karena

rendahnya

jumlah

eritrosit 37

menyebabkan suplai makanan ke sel, jaringan dan organ akan berkurang sehingga proses metabolisme ikan menjadi terhambat (Roberts 1978). 3.8 Identifikasi Isolat Bakteri Isolat yang diidentifikasi adalah kandidat probiotik yang diuji adalah isolat dengan kode L1k, NB21b, RN21f, dan K2ic (Lampiran 11). Identifikasi dilakukan dengan pengujian fisik dan biokimia. Berdasarkan hasil pengujian tersebut diduga bahwa isolat L1k berasal dari genus Staphylococcus, NB21b dari genus Enterobacteria, RN21f dari genus Neisseria atau Branhamella, dan K2ic dari genus Bacillus.

38

IV. KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan Kandidat probiotik yang berhasil diisolasi sebanyak 78 isolat dan terdapat 10 isolat dengan aktivitas amilolitik dan proteolitik terbesar. Isolat L1k merupakan bakteri proteolitik sebagai kandidat probiotik terpilih yang mampu menghambat pertumbuhan patogen S. agalactiae tipe non-hemolitik hingga 102 CFU/ml secara in vitro, diduga berasal dari genus Staphylococcus dan tidak bersifat patogen. Hasil uji antagonistik in vivo secara keseluruhan menunjukkan bahwa berbagai perlakuan dengan metode injeksi bersama (kandidat probiotik terpilih L1k dan patogen S. agalactiae tipe non-hemolitik) tidak menunjukkan pengaruh signifikan dalam menghambat serangan penyakit Streptococcosis dalam tubuh ikan nila. 4.2 Saran Mengacu pada hasil uji antagonistik in vitro dan uji patogenisitas, diketahui bahwa isolat dengan kode K2ic dan RN21f menunjukkan performa yang mendekati L1k, sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui potensi kedua isolat ini sebagai kandidat probiotik. Selain itu, perlu dilakukan penyesuaian metode injeksi antara perlakuan (dua kali injeksi) dengan kontrol (satu kali injeksi), sehingga kontrol yang ada sesuai dengan perlakuan injeksi bersama dan bias dari hasil penelitian dapat dihilangkan.

39

DAFTAR PUSTAKA

[KKP] Kementerian Kelautan dan Perikanan. 2010. Kelautan dan perikanan dalam angka tahun 2010. Kementerian Kelautan dan Perikanan. Jakarta. Amlacher E. 1970. Textbook of Fish Disease. Conroy D.A., Herman R.L. (Penerjemah). TFH Publ. Neptune. New York. 302 hlm. Anderson D.P., Siwicki A.K. 1993. Basic hematology and serology for fish health programs. Paper presented in second symposium on diseases in Asian Aquaculture “Aquatic Animal Health and the Environment”. Phuket, Thailand. October 25-29th, 1993. p185-202. Angka S.L., Wongkar G.T., Karwani W. 1985. Blood picture and bacteria isolated from ulcered and crooked back Clarias batrachus. Biotrop Special Publishing (2). Bogor. 129 hlm. Aryanto E.W. 2011. Patogenisitas Streptococcus agalactiae pada ikan nila Oreochromis niloticus. [Skripsi]. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Blaxhall P.C., Daisley K.W. 1973. Routine haemotological methods for use with fish blood. Journal Fish Biology 5: 577-581. Blaxhall P.C. 1971. The Haematological Assesment of The Health of Fresh Water Fish. A Review of Selected Literature. Journal Fish Biology 4: 593-608. Bond C.E. 1979. Biology of Fishes. Saunders College Publishing. Philadelphia. Conroy G. 2009. Tilapia streptococcosis: Prevalence of Streptococcus Species in Latin America and their pathological manifestations. Proceedings Managing Streptococcus in Warmwater Fish. p15-20. Cowan S.T., Steel K.J. 1974. Manual for The Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press. New York. Dellman H.D., Brown E.M. 1989. Buku Teks Histologi Veteriner 1. Hartono (Penerjemah). UI Press. Jakarta. Durham D.R., Stewart D.B., Stellwag E.J. 1987. Novel alkaline and heat stable serine proteases from alkalaphilic Bacillus sp. strain GX6638. Journal Bacterial 169 (6): 2762-2768. Eldar A., Bejerano Y., Livoff A., Horovitcz A., Bercovier H. 1994a. Experimental streptococcal meningo-encephalitis in cultured fish. Vet. Microbial 43: 33-40. Eldar

A., Bejerano Y., Bercovier H. 1994b. Streptococcus shiloi and Streptococcus difficile: two new streptococcal species causing meningoencephalitis in fish. J. Curr. Microbiol 28 (3): 139-143.

40

Evans J.J., Pasnik D.J., Klesius P.H., Al-Ablani S. 2006. First report of Streptococcus agalactiae and Lactococcus garvieae from a wild bottlenose dolphin Tursiops truncates. Journal of Wildlife Diseases 42 (3): 561-569. Fujaya Y. 2004. Fisiologi Ikan: Dasar Pengembangan Teknologi Perikanan. Rineka Cipta. Jakarta. Fuller R. 1992. Probiotics. The Scientific Basic. London, New York, Tokyo, Melbourne, Madras: Chapman & Hall. Guilfoile P.G. 2007. Antibiotic-Resistant Bacteria. New York: Infobase Publishing. Gram L., Løvold T., Nielsen J., Melchiorsen J., Spanggaard B. 2001. In Vitro antagonism of the probiont Pseudomonas fluorescens strain AH2 against Aeromonas salmonicida does not confer protection of salmon against furunculosis. Aquaculture 199: 1-11. Hardi E.H. 2011. Kandidat vaksin potensial Streptococcus agalactiae untuk pencegahan penyakit Streptococcosis pada ikan nila Oreochromis niloticus. [Disertasi]. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Irianto A. 2003. Probiotik Akuakultur. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 125 hlm. Irianto A. 2005. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Lagler K.F., Bardach J.E., Miller R.R., Passino D.R.M. 1977. Ichthyology. New York-London: John Wiley and Sonc Inc. Lemos D., Ezquerra J.M., Carreno Gracia F.L. 2000. Protein digestion in penaeid shrimp: digestive proteinases, proteinase inhibitors and feed digestibility. Aquaculture 186: 89-105. Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms Tenth Edition. Prentice-Hall Inc. USA. Martin M.L., Namura D.T., Miyazaki D.M., Pilarsky F., Ribero K., De Castro M.P., De Campos C.M. 2004. Physiological and haemotological response of Oreochromis niloticus exposed to single and consecutive stress of capture. Animal Science. p449-456. Mian G.F., Godoy D.T., Leal C.A.G., Yuhara T.Y., Costa G.M., Figueiredo. 2009. Aspect of the natural history and virulence of S. agalactiae infection in nile tilapia. Journal of Veterinary Microbiology 136: 180-183. Nabib R., Pasaribu F.H. 1989. Patologi dan Penyakit Ikan. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Pelczar M.J., Chan E.C.S. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. Hadioetomo R.S., Imas T., Tjitrosomo S.S., Angka S.L. (Penerjemah). UI Press. Jakarta. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. 41

Rehm H.J., Reed G. 1987. Biotechnology. Vol 8: Enzyme Technology. VCH Verlags gessell schaff, mbH, Weinhaim. Roberts R.J. 1978. Fish Pathology. London: Bailliere Tindai. Sasanti A.D. 2008. Penapisan bakteri probiotik asal terumbu karang untuk pengendalian Vibriosis pada larva udang windu (Penaeus monodon). [Tesis]. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor. Sukenda. 2000. Studies on Pseudomonas plecoglossicida infection in ayu Plecoglossus altivelis. [Theses]. Tokyo: The University of Tokyo in Partial Fulfilment of the Requirements for the Degree of Ph.D. in Fisheries Science. Schnick R.A. 2001. International harmonization of antimicrobial sensitivity determination for aquaculture drugs. Aquaculture 196: 277-288. Sheehan B., Lauke L., Lee Y.S., Lim W.K., Wong F., Chan J., Komar C., Wendover N., Grisez L. 2009. Streptococcal diseases in farmed tilapia. Aquaculture Asia Pacific 5 (6): 26-29. Sniezko S.F. 1960. Microhematocrit as a tool in fishery research and management. Fish and Wildlife Service Special Scientific Report. p341-315. Steel R.G.D., Torrie J.H. 1982. Principles and Procedures of Statistics a Biometrical Approach 2nd ed. Japan: McGraw-Hill International Book Company. Sugita H., Shibuya K., Shimooka H., Deguchi Y. 1996. Antibacterial abilities of intestinal bacteria in freshwater cultured fish. Aquaculture 145: 195-203. Tendencia E.A., de la Pena L.D. 2001. Antibiotic resistance of bacteria from shrimp ponds. Aquaculture 195: 193-204. Tepu I. 2006. Seleksi bakteri probiotik untuk biokontrol Vibriosis pada larva udang windu Paneus monodon menggunakan cara kultur bersama. [Skripsi]. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraetel W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology And Molecular Biology Reviews 64: 655-671. Vine N.G., Leukes W.D., Kaiser H., Daya S., Baxter J., Hecht T. 2004. Competition for attachement of aquaculture candidate probiotic and pathogenic bacteria on fish intestinal mucus. Fish Diseases 27: 319-326. Winarti. 2010. Kerentanan ikan jelawat Leptobarbus hoevenii Blkr terhadap infeksi bakteri patogen. [Tesis]. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

42

Wedemeyer G.A., Yasutake W.T. 1977. Clinical methods for the assessement of the effect environmental stress on fish health. Technical Papers of the U.S. Fish and Wildfield Service. U.S. Department of the Interior Fish and Wildlife Service 89: 1-17. Yandri, Suhartati T., Herasari D., Hadi S. 2008. The chemical modification of protease enzyme isolated from locale bacteria isolate, Bacillus subtilis ITBCCB148 with cyanuric chloride-polyethylenglycol. European Journal of Scientific Research 23: 177-186.

43

LAMPIRAN

44

Lampiran 1

No

Asal dan kode isolat serta hasil identifikasi jenis Gram dan morfologi sel Asal Isolat

Lokasi

Kode Isolat

Gram

Morfologi Sel

1

K1ia

-

Bacil

2

K1ib

-

Coccus

K1ic

-

Coccus

K1id

-

Coccus

K1ie

+

Bacil

K2ia

-

Bacil

3 4 5 6 7

Air di sekitar inlet kolam pembesaran ikan nila merah

Dept. BDP, FPIK IPB

K2ib

-

Coccus

8

K2ic

+

Bacil

9

K3ia

-

Bacil

10

K3ib

-

Coccus

11

K1ua

-

Bacil

12

K1ub

-

Bacil

K1uc

-

Bacil

K2ua

-

Coccus

K2ub

-

Bacil

K3ua

-

Coccus

17

K3uc

-

Bacil

18

RN11a

-

Coccus

19

RN11d

-

Bacil

20

RN12a

+

Coccus

21

RN21b

-

Bacil

22

RN21c

-

Coccus

RN21d

-

Bacil

RN21e

-

Bacil

RN21f

-

Bacil

RN21g

+

Bacil

27

RN21h

+

Bacil

28

RN22a

-

Bacil

29

RN22b

-

Coccus

30

RN22e

+

Bacil

31

RN22f

+

Coccus

32

NB11a

-

Bacil

33

NB13a

+

Bacil

34

NB13b

-

Bacil

NB21a

-

Bacil

NB21b

-

Bacil

NB21c

-

Bacil

NB21g

-

Basil

39

NB22a

-

Bacil

40

NB22b

-

Coccus

41

NB22c

-

Bacil

13 14 15 16

Air di sekitar outlet kolam pembesaran ikan nila merah

23 24 25

Usus ikan nila merah

26

35 36 37 38

Usus ikan nila hitam

Dept. BDP, FPIK IPB

Daerah Parung, Kabupaten Bogor

Daerah Ciseeng, Kabupaten Bogor

45

Lampiran 1 No

Lanjutan Kode Isolat

Gram

Morfologi Sel

42

Asal Isolat

Lokasi

L1a

-

Bacil

43

L1b

-

Bacil

44

L1d

-

Bacil

45

L1e

-

Bacil

46

L1f

-

Bacil

47

L1h

-

Bacil

48

L1i

-

Bacil

49

L1j

-

Bacil

50

L1k

+

Coccus

L2a

-

Bacil

L2b

-

Bacil

L2c

-

Coccus

54

L2e

-

Bacil

55

L2f

-

Bacil

56

L2g

-

Bacil

57

L2i

-

Bacil

58

L2j

-

Bacil

59

L2l

-

Coccus

60

L2m

+

Coccus

61

L2n

-

Coccus

62

M11

-

Bacil

63

M12

-

Bacil

64

M13

-

Coccus

65

M21

-

Bacil

66

M22

-

Bacil

67

M23

-

Bacil

M24

-

Bacil

M25

-

Bacil

M31

-

Bacil

51 52

Usus ikan lele

53

Daerah Parung, Kabupaten Bogor

68 69 70 71

Usus ikan mas

Daerah Ciherang, Kabupaten Bogor

M32

-

Bacil

72

M33

-

Bacil

73

M35

-

Bacil

74

M36

-

Bacil

75

M41

-

Bacil

76

M43

-

Bacil

77

M44

-

Bacil

78

M46

-

Bacil

Keterangan: = Negatif + = Positif

Bacil Coccus

= =

Batang Bulat

46

Lampiran 2

Analisis statistik uji antagonistik in vitro dengan metode kultur bersama kandidat probiotik dan patogen S. agalactiae StR

ANOVA Sumber Keragaman

Jumlah Kuadrat

Perlakuan Sisa Total

Kuadrat Tengah

db

94,859 0,197 95,056

10 22 32

F hitung

9,486 0,009

Sig.

1057,192

0,000

Nilai Sig < α maka terima H1 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Uji Lanjut Duncan Pasangan untuk α = 0,05 *)

Perlakuan

N

L1k

3

NB21b

3

3,5100

RN21f

3

3,6067

K2ic NB13a

3 3

3,6600

NB13b RN11a

3 3

RN21g RN21c

3 3

L2m Sa-StR

3 3

Sig.

a

b

c

d

e

f

g

2,1100

4,0633 4,2500 4,3400 5,7567 5,8767 7,4867 7,9067 1,000

0,079

1,000

0,257

0,135

1,000

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

47

Lampiran 3

Hubungan kekeruhan sampel terhadap kepadatan sel dari isolat asal kolam pembesaran ikan nila merah (K2ic); asal usus ikan nila hitam (NB13a, NB13b, NB21b); asal usus ikan nila merah (RN11a, RN21c, RN21f, RN21g); asal usus ikan lele (L1k, L2m); dan patogen S. agalactiae tipe non-hemolitik (Sa5)

3.1 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat K2ic

3.2 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat NB13a

3.3 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat NB13b 48

Lampiran 3

Lanjutan

3.4 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat NB21b

3.5 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat RN11a

3.6 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat RN21c

49

Lampiran 3

Lanjutan

3.7 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat RN21f

3.8 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat RN21g

3.9 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat L1k

50

Lampiran 3

Lanjutan

3.10 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat L2m

3.11 Hubungan kekeruhan (absorbansi) sampel dan kepadatan sel isolat Sa5

51

Lampiran 4

Analisis statistik survival rate (SR) uji patogenisitas kandidat probiotik

ikan nila pada akhir

ANOVA Sumber Keragaman Perlakuan Sisa Total

Jumlah Kuadrat

db

13040,000 200,000 13240,000

4 5 9

Kuadrat Tengah 3260,000 40,000

F hitung 81,500

Sig. 0,000

Nilai Sig < α maka terima H1 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Uji Lanjut Duncan Pasangan untuk α = 0,05 *)

Perlakuan

N

NB21b

2

Sa5

2

K2ic

2

80,0000

RN21f L1k

2 2

90,0000

90,0000 100,0000

0,175

0,175

Sig.

a

b

c

d

0,0000 50,0000

1,000

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

52

Lampiran 5

Analisis statistik survival rate (SR) uji antagonistik in vivo

ikan nila pada akhir

ANOVA Sumber Keragaman Perlakuan Sisa Total

Jumlah Kuadrat

db

9293,333 1200,000 10493,333

4 10 14

Kuadrat Tengah 2323,333 120,000

F hitung 19,361

Sig. 0,000

Nilai Sig < α maka terima H1 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Uji Lanjut Duncan Pasangan untuk α = 0,05 *)

Perlakuan

N

B

3

20,0000

E

3

26,6667

26,6667

A

3

33,3333

33,3333

C D

3 3

Sig.

a

b

c

43,3333 90,0000 0,185

0,105

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

53

Lampiran 6

No

1

2

3

4

5

Perlakuan & Ulangan

Gejala klinis harian selama uji antagonistik in vivo

H-6

H-5

H-4

H-3

H-2

H-1

H0

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

H8

H9

H10

Rabu

Kamis

Jum'at

Sabtu

Minggu

Senin

Selasa

Rabu

Kamis

Jum'at

Sabtu

Minggu

Senin

Selasa

Rabu

Kamis

Jum'at

11-Apr

12-Apr

13-Apr

14-Apr

15-Apr

16-Apr

17-Apr

18-Apr

19-Apr

20-Apr

21-Apr

22-Apr

23-Apr

24-Apr

25-Apr

26-Apr

27-Apr

Rpl Exo Bdd Gvh Srp Clo Rpc Clo Mkrt Bkc Gvh Srp Exo Opa Rpl Exo Agr Bdd Gvh Srp Rpl Agr Gvh Exo Opa Srp Rpl Bdd Tpc Hmg Srp Mkrt Gvh Clo

Rpl Bds Exo Opa Srp Gvh

Rpl Exo Bds Gvh

Rpn Pur Exo Gvh

Rpn Gvh Srp Pur

Rpn Gvh Srp Pur

Rpn Gvh Srp Pur

Rpl Bds Gvh Bkc

Rpl Opa Hmg Bkc

Rpn Nor Gvh

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpl Gas Exo Gvh Agr Clo

Rpl Bdd Gvh Exo Opa

Rpn Pur Exo Gvh Bdd

Rpn Gas Exo Opa

Rpn Gas Exo Opa

Rpn Gas Exo Opa

Rpn Exo Opa Gvh Srp

Rpn Exo Gvh Srp Opa

Rpl Gvh Bds

Rpl Nor Gvh

Rpl Clo

Rpl Clo

Rpn Gvh Exo Opa Srp

Rpn Nor

Rpl Nor Gvh

Rpl Nor

Rpl Nor

Rpl Nor

A1

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

A2

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

A3

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

B1

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

B2

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Nor

Rpl Nor

Rpl Nor

Rpl Gvh Exo

Nor

Rpl Nor

Rpl Nor

Rpc Gvh Exo

Nor

Rpl Nor

Rpl Nor

Rpl Gvh

Nor

Rpn Gvh

Rpn Gvh

Rpl Gvh Exo

Nor

Rpn Gvh

Rpl Gvh

Rpl Gvh Exo

54

Lampiran 6

No

6

7

8

Perlakuan & Ulangan

Lanjutan

H-6

H-5

H-4

H-3

H-2

H-1

H0

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

H8

H9

H10

Rabu

Kamis

Jum'at

Sabtu

Minggu

Senin

Selasa

Rabu

Kamis

Jum'at

Sabtu

Minggu

Senin

Selasa

Rabu

Kamis

Jum'at

11-Apr

12-Apr

13-Apr

14-Apr

15-Apr

16-Apr

17-Apr

18-Apr

19-Apr

20-Apr

21-Apr

22-Apr

23-Apr

24-Apr

25-Apr

26-Apr

27-Apr

Rpn Clo Gas Exo Gvh Opa Pur

Rpl Wr Bkc Pur Exo Opa Gvh

Rpl Pur Exo Gvh

Rpl Pur Gvh

Rpl Pur Hmg

Rpl Hmg

Rpl Exo Opa Gvh Srp

Rpl Exo Gvh Opa Agr

Rpn Gvh Srp Exo

Rpn Gvh Agr

Rpn Gvh Agr

Rpn Gvh Agr

Rpl Clo Bkc Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd Clo

Rpn Gvh Bdd

Rpn Gvh Bdd

Rpn Gvh Bdd

Rpn Gvh Bdd

Rpl Gvh Exo Opa Wr Agr Srp Pur

Rpl Gvh Bdd Exo Opa Bkc

Rpl Gvh Wr Bkc Exo Clo Pur

Rpn Gvh Exo Bkc

Rpn Gvh Exo Bkc

Rpn Gvh Exo Bkc

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

B3

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

C1

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

C2

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Nor

Rpn Gvh

Rpl Gvh

Rpl Agr Gvh

Nor

Rpl Gvh

Rpn Gvh

Rpl Gvh Exo

Nor

Rpl Gvh

Rpn Gvh

9

C3

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Nor

Rpn Gvh

Rpn Gvh

10

D1

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

11

D2

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpl Gvh

Rpl Gvh Exo

Rpn Gvh Bdp Rpn Gvh Bdp

Rpl Agr Gas Wr Exo Opa Mkrt Gvh Srp Rpl Agr Exo Pur Gvh Wr Opa Rpl Gas Lmh Srp Gvh Exo Rpl Gas Wr Exo Opa Srp Pur Clo Bkc

55

Lampiran 6

No

12

13

14

15

Perlakuan & Ulangan D3

E1

E2

E3

Lanjutan

H-6

H-5

H-4

H-3

H-2

H-1

H0

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

H8

H9

H10

Rabu

Kamis

Jum'at

Sabtu

Minggu

Senin

Selasa

Rabu

Kamis

Jum'at

Sabtu

Minggu

Senin

Selasa

Rabu

Kamis

Jum'at

11-Apr

12-Apr

13-Apr

14-Apr

15-Apr

16-Apr

17-Apr

18-Apr

19-Apr

20-Apr

21-Apr

22-Apr

23-Apr

24-Apr

25-Apr

26-Apr

27-Apr

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor Rpl Bkc Exo Gvh Srp Agr Pur Opa Clo

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpl Gvh Exo Bds

Rpl Bds Gvh Srp Bkc Pur

Rpl Gvh Srp

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Exo Mkrt

Rpl Bkc Exo Gvh Srp Agr

Rpl Agr Exo Opa Pur Gvh Srp

Rpl Wr Exo Gvh Opa Agr

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Lmh

Rpl Bdd Gvh Exo Srp Bkc

Rpl Exo Opa Gas

Rpl Gvh Bdd Exo

Rpl Gvh Nor

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpl Gvh Bdd

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Rpn Nor

Keterangan: Modifikasi Hardi (2011) a. Perubahan Pola Renang Nor : Berenang teratur di dasar dan kolom air Lmh : Berenang lemah Mel : Melayang di kolom air Gas : Gasping Wr : Whirling

Nor

Nor

Nor

Rpl Gvh

Rpl Gvh

Rpl Gvh

Rpl Gvh

Rpl Gvh

Rpl Gvh

Bdp Bdd Bds Agr Srp

: : : : :

Rpl Gvh Exo

Berenang di permukaan air Berenang di dasar berkumpul di sudut akuarium Agresif Sirip punggung mengembang

56

b. Perubahan Rpn : Rpc : Rpl :

Aktivitas Makan 3-4 detik waktu yang dibutuhkan untuk mengambil pakan berikutnnya. Dalam 1 waktu mengambil makanan biasannya 1-3 pelet yang di makan. < 3 detik waktu yang dibutuhkan untuk mengambil pakan berikutnnya, biasannya hanya 1 pelet yang di makan dalam 1 waktu makan. 5 detik atau lebih waktu yang dibutuhkan untuk mengambil pakan berikutnnya. Dalam 1 waktu mengambil makanan biasannya 1-2 pelet yang di makan.

Modifikasi Aryanto (2011) c. Patologi anatomi makroskopis organ luar Nor : Normal Gvh : Garis vertikal tubuh menghitam Tpc : Warna tubuh pucat Hmg : Pendarahan tubuh (hemorragi) Ulk : Ulcer dikepala Clo : Clear operculum Mkrt : Mata mengkerut Exo : Mata menonjol (exopthalmia) Pur : Mata putih (purulens) Opa : Kekeruhan mata (opacity) Bkc : Tubuh berbengkok membentuk “C”

57

Lampiran 7

Analisis statistik total eritrosit ikan nila selama uji antagonistik in vivo

ANOVA Sumber Keragaman

Sampling

H-6

H-2

H2

H6

db

Kuadrat Tengah

F hitung

Sig.

Perlakuan Sisa Total

0,000 6,4x10 12 6,4x1012

4 5 9

0,000 1,280x10 12

0,000

1,000

Perlakuan Sisa

3,8x10 14 8,8x10 13

4 5

9,548x10 13 1,759x10 13

5,427

0,046

Total Perlakuan

4,7x10 14 9,6x10 13

9 4

2,394x10 13

0,369

0,822

Sisa Total

14

3,2x10 4,2x10 14

5 9

6,495x10

Perlakuan Sisa

1,5x10 13 5,1x10 13

4 5

3,749x10 12 1,016x10 13

0,369

0,822

Total

6,6x10 13

9

13

4

1,310x10 13

0,400

0,802

14

5 9

3,275x10 13

Perlakuan H10

Jumlah Kuadrat

5,2x10

Sisa Total

1,6x10 2,2x10 14

13

Nilai Sig < α maka terima H1 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Uji Lanjut Duncan H-2 Perlakuan

N

Pasangan untuk α = 0,05 *) a

b

B C

2 2

1,93x10 7 1,93x10 7

D

2

1,93x10 7

E

2

1,93x10 7

A

2

Sig.

3,48x10 7 1,000

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

58

Lampiran 8

Analisis statistik total leukosit ikan nila selama uji antagonistik in vivo

ANOVA Sumber Keragaman

Sampling

H-6

H-2

H2

H6

Kuadrat Tengah

db

F hitung

Sig.

Perlakuan Sisa Total

0,000 2,2x1013 2,2x1013

4 5 9

0,000 4,351x10 12

0,000

1,000

Perlakuan Sisa

3,1x1013 2,2x1013

4 5

7,832x10 12 4,379x10 12

1,789

0,268

Total Perlakuan

5,3x1013 7,0x1013

9 4

1,754x10 13

0,653

0,650

Sisa Total

14

1,3x10 2,0x1014

5 9

2,687x10

Perlakuan Sisa

1,4x1014 1,9x1013

4 5

3,387x10 13 3,807x1012

8,896

0,017

Total

1,5x1014

9

14

4

3,484x10 13

3,208

0,117

13

5 9

1,086x10 13

Perlakuan H10

Jumlah Kuadrat

1,4x10

Sisa Total

5,4x10 1,9x1014

13

Nilai Sig < α maka terima H1 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Uji Lanjut Duncan H6 Pasangan untuk α = 0,05 *)

Perlakuan

N

A E

2 2

4910000 7615000

C

2

9535000

B

2

D

2

Sig.

a

b

c

7615000 9535000 1,066x10 7 1,599x107

0,070

0,189

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

59

Lampiran 9

Analisis statistik kadar hematokrit ikan nila selama uji antagonistik in vivo

ANOVA Sampling

H-6

H-2

H2

H6

H10

Sumber Keragaman

Jumlah Kuadrat

db

Kuadrat Tengah

F hitung

Sig.

Perlakuan Sisa Total

0,000 3,249 3,249

4 5 9

0,000 0,650

0,000

1,000

Perlakuan Sisa

9,565 391,875

4 5

2,391 78,375

0,031

0,998

Total Perlakuan

401,440 151,134

9 4

37,783

2,860

0,140

Sisa Total

66,065 217,199

5 9

13,213

Perlakuan Sisa

268,102 86,971

4 5

67,026 17,394

3,853

0,086

Total

355,073

9

Perlakuan

185,679

4

46,420

2,074

0,222

Sisa Total

111,920 297,599

5 9

22,384

Nilai Sig > α maka terima H0, tidak dilakukan uji lanjut

60

Lampiran 10 Analisis statistik kadar hemoglobin ikan nila selama uji antagonistik in vivo ANOVA Sumber Keragaman

Sampling

H-6

H-2

H2

H6

H10

Jumlah Kuadrat

db

Kuadrat Tengah

F hitung

Sig.

Perlakuan Sisa Total

0,000 0,100 0,100

4 5 9

0,000 0,020

0,000

1,000

Perlakuan Sisa

56,644 4,805

4 5

14,161 0,961

14,736

0,006

Total Perlakuan

61,449 3,800

9 4

0,950

0,876

0,538

5,420 9,220

5 9

1,084

Perlakuan Sisa

12,056 1,580

4 5

3,014 0,316

9,538

0,015

Total

13,636

9

Perlakuan

13,696

4

3,424

1,810

0,264

Sisa Total

9,460 23,156

5 9

1,892

Sisa Total

Nilai Sig < α maka terima H1 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Uji Lanjut Duncan H-2 Pasangan untuk α = 0,05 *)

Perlakuan

N

B C

2 2

4,0000 4,0000

D

2

4,0000

E

2

4,0000

A

2

Sig.

a

b

9,9500 1,000

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

61

Lampiran 10 Lanjutan H6 Pasangan untuk α = 0,05 *)

Perlakuan

N

A

2

a 2,7000

E C

2 2

2,8000 3,2000

B D

2 2

3,7000

Sig.

b

5,7000 0,147

1,000

*) Perlakuan pada kolom yang sama tidak memiliki perbedaan yang signifikan (P>0,05).

62

Lampiran 11 Hasil uji dan identifikasi isolat kandidat probiotik No 1 2 3

Uji Morfologi Mikroskopik

6

Biokimia

7 8

K2ic

NB21b

L1k

RN21f

(+)

(-)

(+)

(-)

Bacil

Bacil

Coccus

Coccus

Diplobacil

Streptobacil

Diplococcus

Monococcus

F

F

F

F

Katalase

(+)

(+)

(+)

(+)

Oksidase

(-)

(-)

(-)

(+)

Motil

Motil

Non-motil

Non-motil

Bacillus

Enterobacteria

Staphylococcus

Gram Morfologi Sel Penataan Koloni Sel Oksidatif – Fermentatif

4 5

Parameter

Motilitas Hasil Identifikasi

Keterangan: (+) = Reaksi positif (-) = Reaksi negatif )* = Hasil belum keluar

Genus (Cowan dan Steel 1974)

F O

= =

Fermentatif Oksidatif

Neisseria, Branhamella

63