3.2. Mikroorganizmusok tápanyagigénye, C-forrás hasznosulás a fermentáció során 3.2.1 Mikroorganizmusok tápanyagigénye A fermentációs iparokban alkalmazott mikroorganizmusok termeloképessége alapvetoen két tényezotol függ: meghatározó szerepu a mikrobát jellemzo genom, de ugyancsak dönto az a környezet, amelyben a mikroorganizmusokat tenyésztjük. Úgy is fogalmazhatunk, hogy a mikroba igen nagyszámú "lehetosége" közül (amely a genom által meghatározott), az adott környezetnek megfelelo véges számú "tulajdonság" fog manifesztálódni. Adott mikroba törzs esetén tehát már a környezet az elsodleges meghatározó. A környezet fogalmába értjük a táptalajok minoségi és mennyiségi összetételét, (beleértve az oldott oxigén szintet is aerob fermentációk esetén) és az ún. környezeti paramétereket: pH, homérséklet, redoxpotenciál viszonyok stb. Csak a mikroba tevékenysége szempontjából kedvezo környezet biztosíthat kedvezo termelési szinteket. A "kedvezo" környezet meghatározása igen soktényezos, bonyolult optimálási feladat, amelynek egyes elemeivel a következokben foglalkozunk. Egy fermentációs folyamat optimálásának egyik legfontosabb lépése a megfelelo növekedést és/vagy termékképzodést biztosító táptalaj megtervezése. A tápoldat-táptalaj funkciója a mikroba táplálkozási és környezeti igényeinek egyideju kielégítése, de ezen túlmenoen gazdasági szempontokat is figyelembe kell venni a tápoldat-tervezése, optimalizálása során. A táptalajnak mindazon elemeket megfelelo (a mikroba anyagcseréje során hasznosítható-metabolizálható) formában és mennyiségben kell tartalmaznia, amelyek a mikroorganizmus testanyagainak felépítésében és a termék(ek) szintézisében részt vesznek. A 23. táblázat néhány mikroba átlagos elemi összétételét mutatja be. A 24. táblázat néhány fontos ipari fermentációs termék összetételét szemlélteti. A táptalaj komponenseinek hasznosulását jelzo (gazdasági jelentoségu) méroszám a hozam értéke. Ez a következoképpen definiálható:
188
Yx /i =
∆x ∆S i
(102)
ahol:. Yx/I az i-edik táptalajkomponensre, vagy elemre vonatkoztatott eredo hozam. ∆x a keletkezett új sejttömeg szárazanyagban kifejezve ∆Si a felhasznált táptalajkomponens (elem) mennyisége.
23.táblázat Néhány mikroorganizmus elemi összetétele összetétel a sejt szárazanyag százalékában Mikroorganizmus Saccharomyces cerevisiae Methylomonas methanolica Penicillium chrysogenum
E1em
C 45 45,9 43
H 6,8 7,2 6,9
0 30,6 35,0
N 9,0 14,0 8,0
S 2,6
%(szárazanyag tarHoz am talomra vonatkozóan) (g sz.anyag/g elem) éleszto baktérium
Szén 47 53 Nitrogén 7,5 12 P(P04 3- -ben számolva) 1,5 3,0 S 1,0 l,0 0 30,0 20,0 Mg 0,5 o,5 H 6,5 7,0 hamu 8,0 7,0 A hamu elem tartalma:P, Mg, Cu,Co, Fe, Mn,Mo, Zn,Ca, K,Na
* 8-13 33-66 100 * 200 ** **
* e hozamokról részletesen késobb szólunk ** e hozam nem definiálható, mivel itt az összetétellel, nem pedig a valódi felhasználással történik összevetés 189
A táptalajtervezés elso lépése a fermentációs folyamat sztöhiometriáján alapul: valamennyi szükséges elemet biztosítjuk, amely a kívánt termék és az új sejttömeg adott mennyiségében meg fog jelenni.
C-forrás + N-forrás + O2+ ásványi sók + speciális tápanyagok (pl. vitamin)→ →új sejttömeg + termék(ek) + CO2 + H2O
E formális egyenlet alapján azonban a minimális tápanyagmennyiség állapítható meg, optimális fermentációs folyamathoz az nem feltétlenül elegendo (vö.: növekedés kinetikája, limitáló szubsztrát fogalma). E megállapítás elsosorban a C-forrás, N-forrás és oxigén esetén igaz, ásványi sók esetében a folyamat sztöhiometriája sokkal jobb közelítést ad. 24. táblázat Néhány fontosabb fermentációs termék elemi összetétele
Antibiotikumok Bacitracin Cefalosporin Eritromicin PenicillinG Streptomicin
C66H103N17016S C16H21N308S C37H67N013 C16H18N204S C21H39N7012
Citromsav Glükonsav Tejsav
C6H807 C6H1207 C3H603
Szerves savak
Oldószerek Aceton Butanol Etanol Vitaminok, aminosavak B12 Riboflavin Glutaminsav Lizin Triptofán
C3H6O C4H100 C2H60 C63H88CoN14014P C17H20N406 C5H9N04 C6H14N202 C11H12N202
190
1975-ben Haggström széles köru vizsgálatot végzett e területen. Eredményeinek lényegét a 25. táblázat tartalmazza, amelyben igen sok különbözo baktérium fermentáció jellemzo sejt- és tápoldat összetételét hasonlíthatjuk össze. Láthatóan néhány elem a tápoldatban nagy feleslegben van a szükséglethez képest (pl. P, K), míg mások közel a minimális szükséges szinten mozognak (Zn, Cu). Ennek több oka van: - az elemösszetételbol meghatározott szükséges minimum limitálója lehet a növekedési sebességnek (l. kritikus koncentráció fogalmát), - az egyes elemek, pontosabban elemhordozó ionok és vegyületek egymásra is hatnak, kölcsönhatásban vannak: Pl. alacsony K-ion koncentráció esetén Na-ion helyettesítheti a K-szükségletet. A fenti formális sztöhiometriai egyenlet utal a speciális tápanyagigényekre is. Ilyenek lehetnek auxotróf mikrobák esetén azok az aminosavak, vitaminok, vagy egyéb vegyületek, amelyeket a mikroba nem képes szintetizálni, de életmuködéséhez nélkülözhetetlenek. A fermentációk során felhasznált táptalajok-tápoldatok félszintetikusak és természetes alapúak lehetnek.
szintetikusak,
25. táblázat Átlagos baktérium-összetétel és “átlag" tápoldat N-re vonatkoztatott összehasonlítása (HAGGSTRÖM, 1975)
Elem N P K S Mg Na Ca Cl Fe Zn Cu Mn Co Mo B
Relatív mennyiség az átlag baktérium sejtben 100 23 14 8,9 4,9 3,2 3,2 2,5 0,3 0,14 0,03 0,05 0,003 0,002 0,006
Relatív mennyiség a tápoldatban 100 176 201 59 15 66 11 123 2,2 0,13. 0,04 0,15 0,02 0,09 0,01 191
26. táblázat Fermentációs táptalajok 1. Szintetikus táptalaj A megadott összetételu táptalaj 30 g/dm3 Candida utilis éleszto eloállítására alkalmas szakaszos tenyészetben
C-forrás :
N-forrás: P-forrás
metanol vagy etanol 0,75 vagy glükóz vagy hexadekán (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4
g/dm3 60
Hozam 0,5 40
60 30 12 1,3 1,5
0,5* 1,0**
Elemnyomok: Cu, Co, Fe, Ca, Zn, Mo, Mn 10-4 mol/dm3 mennyiségben. *jellemzo érték szénhidrátokra (glükóz, keményíto, cellulóz stb.) **jellemzo érték telített szénhidrogénekre (n-paraffinok) 2. Félszintetikus táptalaj gomba eredetu proteáz termelésére Kukoricakeményíto 30g/dm3 Kukoricalekvár 5 Szójaliszt 10 Kazein 12 Zselatin 5 Szeszmoslék por 5 KH2PO4 2,4 NaNO3 1 NH4C1 1 FeSO4 0,01 3. Természetes alapú táptalaj baktériumok eltartására húskivonat (BACTO BEEF EXTRACT) 10g/dm3 pepton (BACTO PEPTONE) 10 élesztokivonat (BACTO YEAST EXTRACT) 5 NaCl 1 agar 20 192
A 26. táblázatban egy-egy példát közlünk a háromféle táptalajra. Megjegyezzük, hogy míg laboratóriumi szinten eloszeretettel alkalmazunk szintetikus táptalajokat, addig az üzemi (foképp gyógyszeripari fermentációs) gyakorlatban legtöbbször félszintetikus táptalajokat használnak fel. A teljesen természetes eredetu táptalajok foképpen a mikrobák eltartása, elotenyésztése során fordulnak elo. A továbbiakban a mikroorganizmusok, állati és növényi sejtek ipari tenyésztése során a táptalajösszetevok vonatkozásában néhány kvalitatív tapasztalatra térünk ki, majd a legfontosabb tápanyag, a szénforrás hasznosulását kvantitatív szemlélettel tárgyaljuk. 3.2.1.1. Ipari nyersanyagok Minden élolénynek növekedéséhez (és termékképzéséhez) energiaforrásra, Cés N-forrásra, makro-és mikroelemekre, valamint vagylagosan vitaminokra és hormonokra van szüksége. Ezen tápanyagígény a minoség és a mennyiség szempontjából is jelentosen változhat élolényenként, s ezt esetenként kell meghatározni. A mikrobák (és a különbözo szövetek) tenyésztésénél kezdetben "természetes" anyagokból (növényi és állati anyagok extraktumaiból: élesztokivonatból, húslevesbol, tejbol, vérsavóból, stb.) készített tápoldatokat (komplex tápodatokat) használtak. Ezek a tápoldatok azért voltak kedveltek, mivel gyakorlatilag minden (vagy csaknem minden) organizmus számára megfelelo tápanyagokat tartalmaznak. Nagy hátrányuk azonban, hogy kémiailag nem jól definiáltak, összetételük széles határok között ingadozhat (a tenyésztés vagy termesztés helyétol, az idotol és idojárástól valamint egyéb tényezoktol függoen). Jórészt azért törekedtek a kémiailag definiált, un. szintetikus tápközegek megkonstruálására, hogy az álandó minoségu táptalajt biztositani lehessen. A fermentációs ipar C- és energiaforrása általában valamilyen növényi eredetu szénhidrát. Tiszta glükózt vagy szaharózt a költségtényezok miatt ritkán használnak egyedüli szénforrásként, legtöbbször csak olyan folyamatokban, amelyek rendkívül pontos fermentációvezetést követelnek meg. A szaharózgyártás mellékterméke, a melasz a legolcsóbb szénforrások közé tartozik. Nagy, kb. 50 %-os cukortartalma mellett jelentos mennyiségu nitrogéntartalmú anyagot, vitaminokat és elemnyomokat is tartalmaz. A melasz összetételének esetenként jelentos változásai a termesztési területtol, az idojárástól és az egyes cukorgyárakban alkalmazott technológiák 193
különbözoségébol adódnak. Egy jellemzo melaszösszetételt mutat be a 27.táblázat 27.táblázat Répacukor melasz összetétele és néhány jellemzoje (Szolnoki Cukorgyár, 1993/94. évi kampány adatai) Szárazanyag tartalom 81 % Hamu tartalom 11.9% Viszkozitás 7644 cP pH 8.16 Összes cukor tartalom 46.9% invert cukor 0.9% raffinóz 1.24% Összes N tartalom 2.3% asszimilálható N 0.87% NO3 0.62% Ecetsav 1.1% K tartalom 2.6% Na tartalom 0.7% Ca tartalom 0.7% Biotin 0.0584 mg/kg A kukorica alapú keményíto-cukor gyártásakor a glükóz kikristályosítása után visszamaradó mellékterméket ugyancsak széles körben és nagy mennyiségben használják C/energiaforrás alapanyagként. (Ez az un."Hydrol"). A malátakivonat, az elcukrosított árpa vizes kivonata, kimondottan kedvezo táptalaja számos élesztonek, gombának és fonalas baktériumnak. A szárazanyag szénhidráttartalma kb. 90-92 %, amely hexózokból (glükóz, fruktóz), diszaharidokból (maltóz, szaharóz), triszaharidokból (maltotrióz) és dextrinekbol áll. Fehérjéket, peptideket, aminosavakat, purinokat, pirimidineket, valamint vitaminokat is tartalmaz. A malátakivonat tartalmú táptalajokat kiméletesen kell sterilezni. A savanyú pH-érték, a redukáló cukrok és az aminosavak együttes jelenléte Maillard-reakcióhoz vezet. A barna kondenzációs termékek kialakulásával járó folyamatok során az aminosavak (mindenekelôtt a lizin), vagy a fehérjék aminocsoportjai a redukáló cukrok karbonilcsoportjaival reagálnak. Az így létrejött kötéseket a mikroorganizmusok már nem képesek megbontani. Ezért a karamellizálódás mellett, a Maillard reakció a fo oka annak, hogy a táptalajok a sterilezés során 194
károsodnak. Ennek következtében jelentosen csökkenhet.
a fermentáció végtermék kihozatala
A keményítot és a dextrint az amiláz enzimet termelo törzsek szénforrásként közvetlenül is hasznosítják. Az utóbbi idoben a keményíto az etanol eloállítás kiindulási anyagaként vált igen jelentossé. (Az eddigi ilyenirányú legnagyobb vállalkozás a brazil kormány maniókára alapozott nemzeti alkohol programja) A szulfitlúg a cellulózipar cukortartalmú mellékterméke. Szárazanyagtartalma mintegy 9-13 %, és elsosorban élesztok tenyésztésére használatos. A tulevelu fák feldolgozásakor visszamaradó szulfitlúgok mintegy 2-3 % cukrot tartalmaznak, amibol kb. 80 % hexóz (glükóz, mannóz, galaktóz), a többi pentóz (xilóz, arabinóz). A lombos fák feldolgozása során képzodo szulfitlúgok elsosorban pentózokban gazdagok. A cellulóz fermentációs alapanyagként történo felhasználása lehetoségének megteremtésén napjainkban nagyon intenzíven dolgoznak. Az világban évenként újratermelodo cellulóz mennyisége mintegy 1011 tonna. Ebbol igen nagy mennyiség hulladékként elvész (pl. szalma, kukoricaszár és -csutka, fahulladék). A cellulózt nem lehet közvetlenül szénforrásként hasznosítani, eloször kémiailag vagy enzimesen hidrolizálni kell. A keletkezett cukorszirupot ma elsosorban etanol fermentációra használják. A növényi olajok (szója-, gyapotmag- és pálmaolaj) foként mint kiegészíto anyagok jöhetnek szóba. Széntartalmát tekintve napjainkban a metanol az egyik legolcsóbb fermentációs alapanyag, de csak kevés baktérium és éleszto képes azt metabolizálni. Eddig a metanolt elsosorban az SCP (egysejt fehérje=single cell protein) eloállítás és a B12 vitamin gyártás alapanyagaként használták. A cellulóz valamint a keményíto elcukrosítása és fermentációja révén keletkezo etanol kielégíto menyiségben áll rendelkezésre. Elonye, hogy sok mikroszervezet egyedüli szénforrásként is képes metabolizálni. Várható, hogy sok, ma szénhidrát bázison megvalósuló eljárást állítanak át erre a nyersanyagra, illetve egy sor kémiai szintézisnek is kiindulási anyaga lehet. A paraffin szénhidrogének közül elsosorban C12 - C18 lánchosszúságú alkánokat képesek a mikroorganizmusok metabolizálni. A 60-as évek elején az 195
alkánokban a szénhidrátok alternatív anyagait látták. A megnövekedett olajárak miatt azonban az alkánok mint fermentációs alapanyagok napjainkban már nem jöhetnek szóba. A mikroorganizmusok közül sok képes szervetlen ill. egyszeru nitrogéntartalmú vegyületeket (ammóniát, ammóniumsókat, karbamidot) N-forrásként hasznosítani, míg mások növekedésükhöz szerves N-forrást igényelnek. Ipari léptékben használatos N-források lehetnek: szója, kukoricalekvár, maláta, búzasikér, desztillációs maradék, valamint tiszta fehérjék, mint amilyen a halliszt, vér, húsgyári hulladék ill. -hidrolizátum, valamint a tejsavó. Nagyon jól metabolizálható szerves nitrogénforrás a kukoricalekvár ( az angolnyelvu irodalomban corn steep liquor, CSL), amely a kukoricakeményíto eloállítás mellékterméke. Ez sok aminosavat (alanint, arginint, glutaminsavat, izoleucint, treonint, valint, fenil-alanint, metionint és cisztint), valamint vitaminokat is tartalmaz. A cukortartalom dönto többségét a tejsavbaktériumok az eloállítás során tejsavvá alakították.A kukoricalekvárral kapcsolatban is igazak a melasznál emlitettek a változó összetételre vonatkozóan. Egy jellemzo kukoricalekvár összetételt mutatunk be a 28.táblázatban. Az élesztokivonat igen sok mikroorganizmus számára jó táptalaj. Az élesztokivonatot foképpen pékélesztobol állítják elo (50-55oC-ra melegítve, autolízissel, vagy NaCl jelenlétében plazmolizissel): aminosavakat, peptideket vízoldékony vitaminokat és szénhidrátokat tartalmaz. Az élesztoben lévo glikogén és a trehalóz az eloállítás folyamán glükózzá alakul. A peptonokat (fehérje hidrolizátumokat) igen sok mikroorganizmus képes hasznosítani. Ipari felhasználásukat jórészt az korlátozza, hogy drágák. A zselatinból származó pepton gazdag prolinban és hidroxi-prolinban, de szinte egyáltalán nem tartalmaz kéntartalmú aminosavakat. A keratinból származó peptonban sok prolin és cisztein van, de a lizin hiányzik belole. A növényi eredetu peptonok (szójapepton) sok szénhidrátot tartalmaznak. A hidrolízis módja - savas vagy enzimes - is befolyásolja a végtermék összetételét. A szójaliszt, lényegében orölt szójamagpogácsa, amely az olaj kivonása után visszamaradó komplex tápanyag. A szójaliszt fehérjetartalma 50 %, szénhidráttartalma mintegy 30 %, a maradék anyagok közül fontos a zsír illetve a lecitin tartalom (1 ill. 1,8 %). A szójalisztet elsosorban az antibiotikum fermentációkhoz használják, mert a viszonylag lassú metabolizálódás miatt nem okoz katabolit-repressziót. 196
28.táblázat A kukoricalekvár összetétele (Demain&Solomon:Manual of Ind.Microbiology and Biotechnology,1986) Szárazanyag tartalom Fehérjetartalom Szénhidrát Zsírok Rost tartalom Hamu tartalom Biotin Piridoxin Tiamin Pantoténsav riboflavin Szabad aminosavak ezen belül arginin cisztin glicin hisztidin i-leucin leucin lizin metionin fenilalanin tirozin 0.1 valin
50% 24% 5.8% 1% 1% 8.8% 0.88 mg/kg 19.36 mg/kg 0.88 mg/kg 74.8 mg/kg 5.5 mg/kg 4.9% 0.4% 0.5 1.1 0.3 0.9 0.1 0.2 0.5 0.3 0.5
Aerob mikroorganizmusoknál az oxigén is létfontosságú szubsztrátnak számít, amelynek megfelelo koncentrációban való jelenlétérol gondoskodni szükséges. Az oxigén szerepérol, a levegoztetés megvalósitásáról igen részletesen szólunk a késobbiekben. A különbözo mikrobák növekedési faktor igénye ritka esetben kvantitatíve meghatározott. Van olyan mikroba, amely egyáltalán nem igényli ezeket a vegyületeket, képes valamennyi fontos vitamint szintetizálni. Érdekes hatása van a biotin hiánynak a Corynebacterium glutamicum-ra: biotinhiány esetén a sejtmembrán permeabilitása megváltozik, a sejt nem képes a szintetizálódott 197
glutaminsavat a sejtben tartani, az a fermentlébe diffundál. A vitaminokat szintetikus közegbe tiszta kémiai vegyület formájában adják, gyakran az élesztofozet egyben növekedési faktor forrásként is szolgál. (Az éleszto tiamint, riboflavint, piridoxint, pantoténsavat, niacint és biotint is tartalmaz.) Bizonyos fermentációk (citromsav, riboflavin) nagyon érzékenyek - rendszerint a természetes tápanyagokkal bevitt - fémekre, bizonyos elemnyomokra. A nagy termékhozam biztosítása érdekében ezeket a fémeket el kell a tápoldatból távolítani. Ez történhet kicsapással (foszfáttal, karbonáttal, ferrocianiddal), folyadék extrakcióval és adszorpcióval. Bizonyos esetekben elemnyomhiányt lehet úgy is elérni, hogyha a fermentációs tápoldatba kelátképzo vegyületet adnak (pl. o-fenantrolin-adagolás a tápoldat Fe-tartalmát csökkenti, ezáltal a B2 -vitamin termelés jelentosen fokozódik.) Az elmondottakból talán kiviláglik, hogy a fermentációs ipar nyersanyaga csaknem 100 %-ban az évenként megújuló növényvilágból származik, ez ad ennek az iparágnak óriási perspektikus jelentoséget! A fokozatosan kimerülo szénhidrogén bázist képes ez az iparág az évenként megújuló szénhidrát és fehérje szubsztrát bázissal kiváltani. 3.2.1.2. Az egyes fermentációs típusok tápanyagigénye Üzemi léptékben a fermentációs tápoldatfejlesztésnél a gazdasági megfontolás dönto kérdés. Olcsó végtermék esetén csak olcsó alapanyagok jöhetnek szóba, míg nagyértéku produktumnál a hozam elsorendu fontosságú, ezért ezeknél (szteroid hormonoknál, monoklonális ellenanyagoknál) a nyersanyagok ára nem játszik olyan fontos szerepet. Az antibiotikumot termelo törzsek szaporításához általában komplex tápoldatokat alkalmaznak. Az ultranagy antibiotikum-titert produkáló törzsek törzsfejlesztésével párhuzamosan folyik az ezeknek legjobban megfelelo tápoldat komponensek meghatározása. Minden új "szuperklón" optimális tápoldat-összetételét újra és újra meg kell határozni. Néha az új, fejlesztett törzsnek speciális igénye van (pl.az auxotrófok speciális igényei), amellyel a szülo törzs nem rendelkezett. A komplex N-forrásokat a legtöbb antibiotikum-fermentációnál szervetlen Nforrással egészítik ki.((NH4)2SO4, NH4Cl, és néha valamilyen nitrátsó.) Nem ritka azonban az éleszto ill. éleszto hidrolizátum alkalmazása sem, amely egyben növekedési faktor forrásként is szerepel. A C-források széles skálája 198
jöhet szóba az antibiotikum fermentációknál. A C-forrás fermentáció közben történo adagolása adagolása kezd általánossá válni. A glükóz nagy koncentrációban ui. nagyon sok antibiotikum bioszintézisét katabolit represszióval akadályozza. A glükóz szintet ezért megfeleloen alacsony értéken szükséges tartani a tenyésztés során, különösen a fermentáció második szakaszában, ahol az antibiotikum szintézis történik. Gyakran használnak keverék C-forrásokat is pl.: glükóz és keményíto keverék C-forrással indítják a fermentációt. A sejtnövekedést a könnyen asszimilálható glükóz biztosítja, míg a termelési szakaszban a biomassza amiláz-rendszere a keményítobol lassan szabadítja fel az asszimilálható glükózt, és így a katabolit-represszió nem érvényesül. Hasonló megfontolás alapján alkalmaztak laktózt is (glükóz helyett) a penicillin eloállítás kezdeti korszakában. Gyakran adagolnak növényi olajokat is az antibiotikum termelési szakaszban C-forrásként. A növényi és állati zsíradékok (szója,- kukorica,- napraforgóolaj, metiloleát, hal- és disznózsír) a következo elonyös tulajdonságokkal rendelkeznek: lassan asszimilálódnak, viszonylag olcsók, jól adagolhatók, habzásgátló tulajdonságúak, bizonyos esetekben -különösen nyíróhatásra érzékeny mikrobáknál - védo hatásúak és nem utolsó sorban nincs katabolit-represszív hatásuk. Az elmondottak szerint az antibiotikumok fermentációs tápoldata komplex természetu, melynek készítésénél természetes anyagokat használnak C-és Nforrásként. Ebbôl adódik, hogy a tápoldatok ásványi anyagainak optimálását csaknem lehetetlen elvégezni, mivel a természetes nyersanyagok ásványi anyag összetétele jelentosen változhat. (A kukoricalekvárban bizonyos fémek koncentrációja tizszeres nagyságban is ingadozhat.) Ennek ellenére ez fontos kérdés, hiszen pl. az Upjohn Co. kutatói egy antibiotikum-fermentációnál négyszeres termékhozam-növekedést értek el az ásványi komponensek optimalizálásával. Az optimalizálási stratégia az un. major ásványokra (Ca, K, Na, Mg) és a minor ásványokra (Mn, Fe, Zn, Co, Cu, Mo) is kiterjedt. Bizonyos major komponenseket foszfát formában szokták adagolni. A foszfátról viszont közismert, hogy a szekunder metabolitok képzodését döntoen befolyásolja, ezért a foszfátszint hatását külön és alaposan kell tanulmányozni minden antibiotikum fermentációnál. Az alkoholtartalmú italok (sör, bor) ill. az ipari szesz elállítására, továbbá takarmány- és sütoélesztô gyártáshoz egyaránt növényi szénhidrátokat és nitrogéntartalmú vegyületeket, valamint szervetlen nitrogénforrást használnak alapanyagként (árpát, kukoricát, gyümölcslevet, melaszt). Mivel az éleszto a 199
keményítot nem képes lebontani asszimilálható és erjesztheto cukorrá, ezért a keményíto tartalmú alapanyagokat elozetesen el kell hidrolizálni egyszeru cukrokká (maltózzá, glükózzá). A fa hidrolizisénél pentózok is képzodnek, ezek felhasználására csak bizonyos élesztok (pl. Candida utilis) képesek, így az szulfitlúg "élesztosítésénél" ezt az élesztot használják. Szükséges megjegyezni, hogy az alkohol gyártási eljárások néhány olyan mellékterméket produkálnak, amelyeket, mint tápanyagokat lehet más fermentációknál felhasználni (sörélesztô, alkohol-desztillációs maradék stb.) A növényi, de különösen az állati sejtek, növekedésükhöz vitaminokat, növekedési faktorokat is igényelnek: általában a teljes oldható vitamin spektrumot tartalmazzák a növényi és az állati szövetek szaporítására szolgáló tápoldatok.A következo 29., 30. táblázatokban egy-egy jellemzo növényi sejttenyésztésre és állati sejtek tenyésztésére alkalmas tápoldat összetétele látható. 29.táblázat MURASHIGE-SKOOG (1962) tápoldat növényi sejtek szuszpenziós és kallusz kultúrájához Összetevo mg/dm3 Összetevo mg/dm3 Ásványi anyagok Szerves összetevok NH4NO3 1650 Szaharóz 30.000 KNO3 1900 Agar 10.000 CaCl2.2H2O 440 Glicin 2 MgSO4.7H2O 370 Indolecetsav 1-30 KH2PO4 170 Kinetin 0,04-10 Na2-EDTA 37,3 myo-inozit 1 FeSO4 .7 H2O 27,8 Nikotinsav.HCl 0,5 H3BO3 6,2 Piridoxin.HCl 0,5 Mn SO4 .4H2O 22,3 Tiamin.HCl 0,1 Zn SO4 .4H2O 8,6 KI 0,83 Na2MoO4 2H2O 0,25 Cu SO4 .5H2O 0.025 CoCl2 6H2O 0,025
200
Több mint 30 éve foglalkoznak már állati sejtvonalak in vitro tenyésztésével. Az emlos sejtek, - mint amilyen a HeLa (emberi karcinoma) és az L-sejtek (egér fibroplaszt) - tenyésztéséhez nagyon komplex tápoldatokra van szükség, amelyek többek között 10 % szérumot is tartalmaznak (ami igen-igen drága médium komponensnek számít). Az antitestet termelo hibridómák felfedezése kihívást fogalmazott meg a kutatók számára: olcsóbb, kémiailag definiált, szérummentes tápoldatot kellett kidolgozni, amelyen a hibridómákat (és egyéb emlos szöveteket) lehet ipari léptékben, olcsón szaporítani. 30. táblázat EAGLE tápoldat állati sejtek tenyésztésére ÖSSZETEVOK L-aminosavak arginin cisztine glutamin hisztidin izoleucin leucin lizin metionin fenilalanin treonin triptofán tirozin valin Szénhidrátok glükóz Szérum
mg/dm3 105 24 292 31 52 52 58 15 32 48 10 36 46 1000 5-10%
ÖSSZETEVOK Vitaminok kolin fólsav inozit nikotinamid pantoténsav piridoxin riboflavin tiamin Ásványi sók NaCl KCl CaCl2 MgCl2.6H2O NaH2PO4.2H2O NaHCO3
mg/dm3 1 1 2 1 1 1 0,1 1 6.800 400 200 200 150 2.000
A komplex tápközeg helyettesítésére azért is volt szükség, mivel ilyen tápoldatból nagyon nagy nehézségbe ütközött az antitest izolálása. (Ennél a feladatnál ismét bebizonyosodott, hogy a feldolgozás szempontja alapvetoen befolyásolja az optimális tápoldat-összetételt. Más szóval az optimális összetétel keresésénél a mikrobanövekedés és termékképzodés szempontjai mellett, a termék izolálásra is figyelemmel kell lenni.) A kidolgozott szérummentes közeg aminosavakat (elsosorban glutamint), vitaminokat, koenzimeket, nukleinsav komponenseket, hormonokat (inzulint, transzferint), szénhidrátokat, lipideket (pl. linolsavat), és sókat tartalmaz. Amint látható ez sem egyszeru tápoldat. A lépték növelésekor (az inokulumtól a termelo 201
léptékig haladva) a szérumot tartalmazó komplex közegtol fokozatosan csökkentett szérumszinten keresztül jutnak el a szérummentes, ipari léptékben alkalmazott tápoldatig. Az egyes sejtvonalakhoz eltéro összetételu tápoldatok optimálisak. A növényi sejtek, szövetek tápanyagigénye - hasonlóan az állati sejtekéhez igen komplex: nagyon nagyszámú szerves vegyületet igényelnek növekedésükhöz. Többek között növényi hormonokat, regulátorokat ( gibberellint, kinetint, indol-ecetsavat, naftol-ecetsavat, 2,4-diklór-fenoxiecetsavat). A növényi sejtek még az optimális körülmények között is nagyon lassan növekednek ( a generációs ido 2 nap vagy ennél is nagyobb) és jórészt ennek tulajdonítható, hogy a növényi sejttenyészetekkel eloállított szekunder anyagcseretermékek száma ma még nagyon korlátozott. 3.2.2 C-forrás és hasznosulás A fermentációs gyakorlatban alkalmazott hagyományos C-források a szénhidrátok: tiszta kristályos glükóz, glükóztartalmú keményíto hidrolizátum, a kukoricakeményíto alapú glükózgyártás során a glükóz kristályosításakor visszamaradó anyalúg:hidrol, szaharóz vagy szaharóztartalmú melléktermékek (nád- és répacukormelasz), esetenként egyéb cukortartalmú anyagok. Az ún. nem konvencionális C-források közé sorolhatók a különbözö alkánok, alkanolok mint az etanol és metanol, valamint a cellulóz és cellulóztartalmú ipari vagy mezogazdasági huIladékok, melléktermékek. Cellulóz esetén tulajdonképpen szintén glükóz-hasznosításról beszélhetünk. A cellulóztartalmú anyagok hasznosítása elott természetesen nagy perspektíva áll. Úgyszintén a nem konvencionális szubsztrátok közé sorolhatók a különbözo szénhidrogének, metán és n-paraffinok. Utóbbiak a 70-es évek olajválsága elott ígéretes fermentációs -ipari alapanyagoknak mutatkoztak, ma jelentoségük kisebb. A mikroorganizmusok szénforrás hasznosításának mértéke a fentiekben definiált és Monod illetve Herbert által bevezetett hozam, Yx/s. Ezt régebben hozamkonstansnak nevezték és állandó értéknek tartották. Kiderült azonban, hogy értéke nem csupán az alkalmazott C-forrástól (l. 26. táblázat) és az alkalmazott mikroorganizmustól függ, hanem a tenyésztési körülményeknek is függvénye. Hogy ezt mélyebben megérthessük, vizsgáljuk meg a mikroba által felhasznált C-forrás "sorsát": mire fordítódik, mire használja fel az élo sejt?
202
A C-forrás egy része beépül az újonnan képzodött sejtekbe, az új sejttömeg szeneként jelenik meg. Tudjuk továbbá, hogy nem csekély része arra fordítódik, hogy az anaerob, vagy aerob lebontás során felszabaduló és ATP formájában "raktározott" energia a mikroba energiaigényu anyagcserefolyamatai részére rendelkezésre álljon. A teljes szubsztrát fogyásnak (∆S) beépült részét jelöljük ∆Sc, az energiatermelésre fordított részét ∆SE mennyiségekkel. Ekkor felírható a teljes szubsztrátfogyásra, hogy: ∆S = ∆S c + ∆S E (103) Az egyenletet ∆x új sejttömeggel elosztva az eredo hozam reciprokát nyerjük: ∆S ∆S C ∆SE = + ∆x ∆x ∆x
(104)
1 1 1 = + Y x/s YC YE
(105)
ahol:
YC YE
a beépülésre ill. az energiatermelésre jellemzo hozamkifejezések.
Az YC
érték könnyen számítható az alábbi anyagmérleg egyenlettel: α 2 ∆x = α1∆ S C
(106)
ahol: α 2 a mikroba (szárazanyag) C-tartalma, amely átlagosan 0,46-0,55 (46-50%) körüli érték, α 1 a szubsztrát C-tartalma, (pl. glükóz esetén: 72/180 =0,40 etanol esetén: 24/46 =0,52) A (103) egyenletbol átrendezve kapjuk a szénhozamot(beépülés): ∆x α = YC = 1 ∆ Sc α2
(107)
YC beépülést jellemzo szénhozam tehát a mikroba és a szubsztrát széntartalmának ismeretében könnyen számítható, és így (105)-bol YE-t kifejezve az energiahozam is becsülheto, ha ismerjük Yx/s eredo hozam értékét:
203
Yx/ s . YE =
α1 α2
=
Yx/s . α 1 α 1 − Yx/ s .α 2
(108) α1 − Yx/s α2 Yx/s értéke kísérleti módszerekkel meghatározható. Néhány fermentáció esetén a termék mennyiségébol becsülheto YE értéke. E fermentációk esetén a termék olyan primer anyagcseretermék, amely egyértelmuen az energiafelszabadítás során képzodik. Ilyen fermentáció az alkoholos erjedés glükózon élesztovel, hiszen itt a mikroba csak az etanol képzodéséért felelos glikolízis során felszabaduló energiát hasznosítja, az etanolból Acetobacter aceti segítségével aerob körülmények között történo ecetsav fermentáció (hagyományos ecet technológia): itt eloször az etanol dehidrogénezodik, majd a NADH + H+ oxidálódik és energia termelodik a terminális oxidáció során. Ilyen a glükonsav fermentáció is glükóz alapon pl. Acetobacter suboxydans törzzsel, ahol az elobbihez hasonló dehidrogenezés történik (ezekkel és más hasonló folyamatokkal foglalkozik a 2.fejezet). Az asszimilált (beépült) és disszimilált (energiatermelésre fordított) szubsztrát megoszlását különbözo esetekben szemlélteti a 30. táblázat. Az adatok igen érdekesek és tipikusak, a levonható általános következtetések az alábbiak: - az aerob energiafelszabadítás hatásfoka jobb az anaerobnál, több szubsztrát "marad" új sejttömeg felépítésére, - komplett táptalajon a szénforrás (szénhidrát) legnagyobb része csak energiatermelésre fordítódik, a beépült szén fotömege a természetes táptalaj komponensekbol származik, - szintetikus tápoldaton a beépülés és az energiatermelés részesedése sokszor összemérheto nagyságú. Az energiatermelésre fordított szubsztrát hányad, ∆SE is felbontható két részre, ha a termelt energia felhasználását tekintjük. Az ATP-ben raktározott energia egy része a növekedéssel szorosan összefüggo biokémiai folyamatok energia igényének fedezésére szolgál, mivel az új sejttömeg új sejt anyagainak (aminosavak, nukleotidok, makromolekulák: fehérjék, zsírok, nukleinsavak) szintézise energiát emészto folyamatok.
204
Másrészt a mikrobák anyagcsere-tevékenysége során egy sor olyan energiaigényes folyamat is lejátszódik, amelyek látszólag nincsenek közvetlen kapcsolatban a növekedéssel, az energiafelhasználással nem jár együtt "új" anyagok szintézise. Ilyen folyamatok pl. a sejtmozgás, ozmotikus munkavégzés, aktív transzportfolyamatok stb. Ugyancsak a nem építo jellegu energia felhasználás körébe sorolhatók azok a folyamatok, amelyek során az állandóan lebomló makromolekulák újraszintézise történik meg. Termodenamikai értelemben ezt úgy is fogalmazhatjuk, hogy a sejteknek akkor is munkát kell végezniük (energiát kell felhasználniuk), ha látszólag nyugalmi állapotban vannak, nem növekednek, azért, hogy alacsony entrópiaszinttel jellemezheto igen összetett, rendezett állapotukat, életképességüket fenntarthassák. Utóbbi energia felhasználásukat "fenntartási" (maintenance) energiának nevezzük összefoglalóan, s beleértjük az összes olyan energia igényt, ami nem hozható közvetlen összefüggésbe a növekedéssel. 30. táblázat Néhány mikroba energiatermelésre
glükózfelhasználásának
Törzs
Táptalaj
Streptococcus faecalis anaerob tenyészet
komplett*
megoszlása
beépülésre
és
Asszimilált Disszimilált szubsztrát hányad % %
Saccharomyces cerevisiae aerob tenyészet anaerob tenyészet
komplett*
Aerobacter cloaceae
minimál** 55
2
98
10 2
90 98 45
*komplett táptalaj: természetes összetevoket (aminosav- és vitaminforrásokat) is tartalmazó félszintetikus vagy tisztán természetes alapú táptalaj **minimál táptalaj: a C-forráson kívül csak anorganikus összetevoket tartalmazó szintetikus táptalaj.
A fentiek alapján az energiahozam a következoképpen bontható a növekedéssel kapcsolatos és a fenntartási energiahányadokra :
205
YE =
∆x ∆x = ∆SE ∆Sg + ∆S m
(109)
ahol: ∆Sg a ∆x új mikrobatömeg létrehozásához energiatermelésre fogyott szubsztrát, és ∆Sm a fenntartási (maintenance) energiatermelés céljára fordított szubsztrát mennyisége. Ismert, hogy a szubsztrátfogyási sebesség a növekedési sebességgel az alábbi módon fejezheto ki: dS 1 dx µx =− =− dt Y dt Y
(110)
A (110) egyenletet az energiatermelésre fordított szubsztrát fogyási sebességére felírva: µx dS g dS m dS = + = (111) dt dt dt E YE Az utóbbi egyenletben felhasználható a következo kifejezés: dS g µx = dt YEG (112) ahol YEG az un. "maximális növekedési energiahozam", amely akkor jellemezné a folyamatokat, ha nem lenne fenntartási energiahányad (∆Sm = 0 esetben).
A dSm/dt-rol logikusan felteheto, hogy arányos a sejttömeg mennyiségével (kétszerannyi sejttömeg kétszerannyit mozog, kétszerannyira rendezett, tehát kétszerannyi energiát használ a rendezettség fenntartására stb.) tehát: dS m = mx dt
(113)
ahol m az ún. fajlagos fenntartási (maintenance) koefficiens, egysége [g energiaforrás/g sejttömeg*óra=h-1]. 206
A (112) és (113) kifejezéseket (111)-be helyettesítve a következo összefüggést nyerjük: µx µx = + mx YE YEG
(114) 1 1 m = + YE YEG µ
vagy (115)
Végeredményben egy szintetikus tápoldaton növekedo mikroorganizmus teljes szubsztrát felhasználását, illetve eredo hozamkifejezését az alábbiak szerint adhatjuk meg: 1 1 1 m = + + (116) Yx/ s Yc YEG µ E hozamkifejezésbol láthatóan az állandónak tartott Yx/s hozam valójában nem állandó, hiszen legalábbis függ a növekedés fajlagos sebességétol. Az egyenlet állandóinak meghatározásához ábrázoljuk 1/Yx/s -t a faljagos növekedési sebesség reciprokának függvényében a 84.ábra szerint.
1 Yx / s m 1 1 + Yc YEG
1 µ 84.ábra A maintenance koefficiens grafikus meghatározása
207
A fenntartási energiaszükséglet és az m koefficiens nagyságára vonatkozóan tájékoztatást nyújt a 31. Táblázat. Vegyük észre például, hogy pékéleszto esetén a tápoldat NaCl tartalmának 10-szeres növekedése (amely ugyancsak tízszeres ozmózisnyomás növekedéssel egyenértéku) az m értékét is 10szeresére növeli. A szénforrásból történo energiatermelésre, ill. a termelt energia hasznosulására nyújt felvilágosítást egy másik hozam kifejezés, az ATP-hozam, amely megadja, hogy egy mol ATP felhasználásakor hány g új mikrobatömeg képzodik. Az ATP-hozam definíciószeruen: YATP =
Yx′/ s ∆x = ∆ ATP YATP /s
(117)
g g g ahol: Yx′/ s = MYx/ s (szubsztrát móltömeg).(eredo hozam) . = mol g mol YATP/S = egy mol energiaforrásból nyerheto ATP mólok száma (pl. l mol glükózból anaerob körülmények között 2 mol ATP képzodhet, tehát YATP/S= 2).
Sok kísérleti tapasztalat arra utalt, hogy függetlenül a mikrobától és a tenyésztési körülményektol, 1 mol ATP felhasználásakor átlagosan 10,5 g szárazanyagnyi új mikrobatömeg képzodik. Az ATP felhasználás ugyanúgy növekedéshez és fenntartáshoz felhasznált részre bontandó, mint a szén/energiaforrás esetében tettük, vagyis: ∆ATP = ∆ATP + ∆ATP (118)
(
1 YATP
=
)g (
1 max YATP
+
m ATP µ
)m
(119)
208
31. táblázat Különbözo mikrobák m és mATP értékei tenyésztési körülmények Aerobacter cloaceae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Penicillium chrysogenum Lactobacillus casei
fajlagos maintenance koefficiensek *m **mATP 0,094 14 0,036 0,52
aerob, glükóz anaerob glükóz + 0,1 mol/dm3 NaCl anaerob, glükóz +1,0 mol/dm3 NaCl 0,360 aerob 0.,022 aerob, glükóz 0,135
2,2 3,2 1,5
* g energiaforrás/g sejt szárazanyag.h **mmol ATP/g sejt szárazanyag.h
A (119) egyenletet más formában is szokás alkalmazni, a fajlagos ATP képzodési sebességet felirva: µ µ QATP = = max + m ATP (120) YATP YATP A fenti egyenletekben alkalmazott jelölések, sorrendben: max YATP - (hipotetikus) maximális ATP hozam, amely akkor lenne jellemzô a folyamatra, ha az ATP csak növekedésre forditódnék, azaz mATP=0 esetén. mATP - fajlagos ATP maintenance koefficiens (értékére példákat szolgáltat a 31. táblázat) QATP fajlagos ATP képzodési sebesség. A (119) egyenlet alapján belátható, hogy az YATP érték sem konstans, a 10,5 g/mol érték csak tájékoztató jellegu, valójában a mikroba által folytatott anyagcsere, az energia felszabadításban hasznosított anyagcsere utak és a tenyésztési körülmények függvénye. Sokak véleménye szerint értéke 8,3-12,6 között változik, de találkozhatunk 5-32-ig megadott tartománnyal is a szakirodalomban. Anaerob energiafelszabadítás esetén a 10,5-ös érték megfelelo becslésnek látszik, aerob esetben nagy eltérések lehetnek. A mikrobák C-forrás hasznosításával, illetve az energiafelszabadítás módjával és hatékonyságával kapcsolatos fogalom az ún P/0 hányados, amely definíciószeruen egyenlo az oxidatív foszforilezés (tehát csak aerob 209
fermentácíók esetén használatos!) során a felvett oxigénatomonként termelt ATP molekulák számávál. Ennek nagyságára tájékoztatóul álljon itt a sok esetben tapasztalt 1,9-es érték . A C-forrás hasznosulásra, a C-anyagforgalomra jellemzo a 85. ábra, amelyben a szubsztrát-C "sorsát" vázoltuk fel. SZUBSZTRÁT TELJES FELVETT ÉK RM E T C
P
C
SEJ TBE ÉPÜ LT C
TELJES CO 2 TERMELÉS
CO2
X
S LÁ Á X FI
FIZIKAILAG KÖTÖTT CO2 GÁZFÁZISBAN MÉRHETÕ CO2
85.ábra C-forgalom a fermentáció során
210
