2 Teoretická část. 2.1 Fytochemie a fytochemikálie

Obsah 1 Úvod ................................................................................................................................... 1 2 Teoretická část ................................................................................................................... 2 2.1 Fytochemie a fytochemikálie ........................................................................................ 2 2.1.1 Studované fytochemikálie a kyselina hippurová .................................................... 5 2.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie .................................................................... 7 2.2.1 Systém reverzních fází.......................................................................................... 9 2.2.2 Systém normálních fází ....................................................................................... 13 2.2.3 Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) .............................................. 16 3 Experimentální část .......................................................................................................... 20 3.1 Chemikálie ................................................................................................................. 20 3.2 Přístroje a vybavení ................................................................................................... 20 3.2.1 Kapalinový chromatograf..................................................................................... 20 3.2.2 Hmotnostní spektrometr ...................................................................................... 20 3.2.3 Ostatní laboratorní příslušenství.......................................................................... 21 3.3 Příprava směsí standardů .......................................................................................... 21 3.4 Příprava mobilní fáze a optimalizace retence ............................................................. 22 3.4.1 Systém reverzních fází........................................................................................ 22 3.4.2 Systém normálních fází ....................................................................................... 22 3.4.3 Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) .............................................. 23 4 Výsledky a diskuse ........................................................................................................... 25 4.1 Systém reverzních fází............................................................................................... 25 4.1.1 Kinetex C18......................................................................................................... 25 4.1.2 Gemini C18 ......................................................................................................... 26 4.2 Systém normálních fází.............................................................................................. 27 4.2.1 Pinnacle DB Silica ............................................................................................... 27 4.3 Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) ..................................................... 35 4.3.1 LUNA HILIC ........................................................................................................ 36 4.3.2 TSKgel Amide-80 ................................................................................................ 39 4.3.3 Porovnání LUNA HILIC a TSKgel Amide-80........................................................ 42 5 Závěr ................................................................................................................................ 44 6 Použitá literatura............................................................................................................... 46

1 Úvod Kapalinová chromatografie je v analytických laboratořích běžně používanou technikou pro analýzu většiny netěkavých organických látek. Nejčastěji se pracuje v systému reverzních fází, které poskytují účinné, robustní a reprodukovatelné analýzy. V případě špatné rozpustnosti analytů ve vodě či z důvodu jejich vysoké polarity (a tedy i malé retence v systému reverzních fází) bývá zvykem analýzu provádět v systému normálních fází, tedy v nevodných prostředích. Velký nárůst zájmu a aplikací zažívají kolony s hydrofilními interakcemi (HILIC). Jejich výhodou je možnost separace polárních a hydrofilních látek v mobilních fázích, jež se používají v systému reverzních fází (obsahují vodu a organická rozpouštědla - acetonitril, methanol atd.). Tato rozpouštědla jsou výhodná jak pro UV/VIS, tak i hmotnostní detekci. O blahodárných účincích některých rostlin se ví již po mnoho staletí. Navzdory masivnímu výzkumu podporovanému nejen vědeckými motivy, ale i zájmem farmaceuticky zaměřených komerčních subjektů, není ve velké řadě případů objasněno, které složky rostlin jsou za léčebné účinky odpovědny. Velmi často za těmito vlastnostmi stojí fytochemikálie (sekundární metabolity). Vývoj analytických technik, dovolujících věrohodnou analýzu těchto látek ve velkém rozsahu koncentrací a v různě komplikovaných matricích, patří mezi velmi žádané oblasti výzkumu. Vzhledem ke komplexnosti rostlinného materiálu (a/nebo materiálu vznikajícího při interakci složek rostliny s živočišnou buňkou) bude nezbytné pracovat na vývoji vysoce selektivních analytických nástrojů. Zde nesporně bude významnou technikou kapalinová chromatografie. Cílem

této

práce

je

studium

selektivity

polárních

stacionárních

fází

pro chromatografickou separaci směsi vybraných fytochemikálií a kyseliny hippurové a porovnání výsledků se separací na reverzních fázích. Sledované polární fáze zahrnují nemodifikovaný silikagel v systému normálních fází a HILIC systému a silikagel s navázanou karbamoylovou skupinou v systému HILIC. Analýzy v systému reverzních fází byly provedeny na koloně Kinetex C18, které jsou naplněny povrchově porézním sorbentem druhé generace. Pro srovnání účinnosti a reprodukovatelnosti analýz byla použita kolona Gemini C18 s plně porézním sorbentem.

1

2 Teoretická část 2.1 Fytochemie a fytochemikálie Interdisciplinární obor zabývající se studiem fytochemikálií se nazývá fytochemie. Tato věda studuje rostliny z pohledu chemie, biosyntézy, metabolismu a jejich vlivu na fyziologii a patologii živočichů. V užším slova smyslu se fytochemie zabývá studiem širokého spektra sekundárních metabolitů, především pro jejich protektivní účinky například vůči hmyzu nebo nemocem. Tyto protektivní účinky jsou často využívány v humánní medicíně. Rozdělení metabolitů na primární a sekundární odlišuje látky vznikající běžně u všech rostlin (bílkoviny, sacharidy, lipidy, chlorofyl atd.) od těch, které jsou vlastní jen určitým (vývojem určeným) čeledím nebo druhům, a které mají konkrétnější metabolický význam (terpeny, glykosidy, alkaloidy atd.). Do primárního metabolismu zahrnujeme základní metabolické dráhy a jejich funkce, jež jsou společné pro všechny organismy. Jedná se o glykolýzu, pentosový cyklus a cyklus trikarboxylových kyselin. Od tohoto primárního metabolismu se odvíjí biosyntéza a degradace látek zahrnovaných do tzv. sekundárního metabolismu (Obr. 1). K významným vlastnostem sekundárních metabolitů patří ochrana před hmyzem a zvířaty, houbovými či bakteriálními patogeny, vábení opylovačů a roznašečů semen nebo mohou mít funkci fytohormonů. Hraniční linie mezi primárním a sekundárním metabolismem není ostrá, protože existují některé aminokyseliny (AMK), jež jsou již sekundárními metabolity. Naproti tomu se však vyskytuje i řada sterolů, které mají esenciální úlohu ve většině organismů, a tudíž je řadíme mezi primární metabolity. Za startovní body sekundárního metabolismu jsou považovány 3 látky: kyselina šikimová (prekurzor aromatických látek), aminokyseliny (zdroj alkaloidů a peptidových antibiotik) a kyselina octová (prekurzor polyacetylenů, polyfenolů, steroidů, karotenoidů a isoprenoidních terpenů)1. Již primitivní lidé užívali přírodních látek pro dosažení úlevy při bolestech a nemocech, jako loveckých jedů, narkotik a halucinogenů, stimulantů, koření, ochucovadel a vonných látek. Postupem času přibývala využití přírodních látek i v medicíně. Například již v 16. století francouzský chirurg Ambrosie Paré léčil střelné rány směsí heřmánku, levandule, rozmarýnu, šalvěje, komonice a extraktu červených růží svařenou v bílém víně. V 17. století Thomas Sydenham léčil malárii směsí drcené kůry chinovníku a hřebíčkového sirupu. V roce 1804 objevil německý lékárník Friedrich W. A. Sertürner morfin a jako první jej i izoloval. Doposud nebyla vyřešena totální syntéza morfinu, známá je jen enzymatická

2

cesta, proto je stále tento alkaloid izolován z rostlin. V roce 1828 byl německými chemiky Posseltem a Reimannem izolován z rostlin tabáku nikotin a až v roce 1893 byl prvně syntetizován Piketem a Crepieuxem. Nikotin je silný nervový jed, který byl a stále je častou složkou insekticidů. Součástí těchto insekticidů může být nikotin samotný, soli nikotinu ale i jeho deriváty. Nikotin sulfát se z listů tabáku extrahuje horkou vodou po dobu 24 hodin. Příkladem používaného derivátu je 1-[(6-chloro-3-pyridinyl)methyl]-N-nitroimidazolidinimin, který je součástí přípravku Imidacloprid©2.

Obr. 1: Biosyntetické vztahy mezi metabolity1. O výhodách diet bohatých na ovoce nebo zeleninu bylo napsáno nepřeberné množství literatury, ale o tom, které fytochemikálie jsou odpovědny za ony pozitivní účinky, je relevantních informací nepoměrně méně. Sekundární metabolity mohou mít rozličnou

3

chemickou strukturu jako jsou: steroidy, aminy, neproteinogenní AMK, karotenoidy, ω-3-mastné kyseliny, chinony, kumariny, alkaloidy, glukosináty, polyketidy, polyacetyleny, terpeny, fenoly a flavonoidy. Takto široká paleta chemických struktur naznačuje, jak složitý problém bude představovat analytické sledování jejich přítomnosti a osudu v biosféře3. Další možností, jak dělit přírodní látky je podle jejich funkce, která se samozřejmě odvíjí od jejich struktury. Látky různé struktury mohou mít stejnou funkci a účinky na živý organismus.

Například

přírodními

barvivy

mohou

být

flavonoidy,

anthokyaniny,

anthrachinonová barviva, betalainy a nebo indigoidní barviva. Přírodní látky slouží také jako vonné a chuťové látky, komunikační látky hmyzu, bioluminiscenční látky a další1. Za nejvýznamnější účinek přírodních látek považujeme jejich příznivé, často i léčivé působení na lidský organismus. Přírodní léčiva a produkty z nich odvozené jsou široce užívaná terapeutika v mnoha zemích a jejich význam v posledních desetiletích roste. Většina přírodních léčiv se připravuje ze surových rostlinných extraktů, které se skládají z komplexní směsi různých rostlinných sekundárních metabolitů. V této směsi se mohou vyskytovat tisíce aktivních sloučenin, jejichž chemická povaha bude naprosto odlišná, a navíc se jejich obsah může měnit v závislosti na období sklizně, původu rostliny, sušícím procesu a mnoha dalších faktorech. S tímto souvisí obtížnost kontroly kvality přírodních léčiv. Přehledně jsou aspekty fytochemické analýzy přírodních léčiv rozebrány například v článku4. V minulém století byly přírodní produkty aplikovány především jako antibiotika, v současné době jsou používána také jako imunosupresiva, látky snižující hladinu cholesterolu, léky tlumící migrénu, inhibitory enzymů, přípravky proti parazitům, ale také jako bioinsekticidy. V neposlední řadě patří přírodní produkty mezi důležité zdroje látek působící protektivně proti vzniku maligního nádorového bujení4 a také proti chronickým onemocněním jako jsou kardiovaskulární nemoci5. Bylo prokázáno, že důležitou roli při chronických zdravotních potížích hrají volné radikály a reaktivní kyslíkové částice (ROS), jako jsou superoxidový anion (O2˙¯), hydroxylový radikál (OH˙) či peroxidový radikál (ROO˙)6. Tyto částice mohou zapříčinit vznik rakoviny, autoimunitních chorob, diabetu, vaskulárních chorob, hypertenze či mozkové disfunkce. Konzumace čerstvého ovoce, zeleniny a bylin má protektivní účinky vůči těmto chorobám. Vedle vitaminů C a E jsou pro ochranu vůči ROS nezbytné antioxidanty typu fenolických kyselin a flavonoidů. Diety bohaté na ovoce a zeleninu jednoznačně zvyšují antioxidační kapacitu krevní plazmy. Antioxidační aktivita flavonoidů je převážně dána jejich strukturou, která umožňuje delokalizaci elektronu na aromatickém jádře. Tento stav je stabilizován rezonančním efektem aromatického jádra, který zabraňuje dalšímu pokračování

4

volného radikálu v reakčním řetězci. Nejdůležitějšími antioxidanty vyskytující se v rostlinách jsou karotenoidy a polyfenolické sloučeniny5.

2.1.1 Studované fytochemikálie a kyselina hippurová Studovaná

modelová

směs

se

skládala

z vybraných

fenolických

kyselin,

polyfenolických látek a kyseliny hippurové, jako významného metabolitu jejich přeměny živočišnou buňkou. Obecně, fenolické látky jsou předmětem zájmu obzvláště z důvodů jejich antioxidační aktivity, velkého množství různých prokázaných pozitivních efektů na lidské zdraví a hojného výskytu téměř v jakékoliv zelenině, ovoci a v jakékoliv části rostliny (ale v proměnlivém množství)3. Zpracováním těchto surovin se mohou následně vyskytovat také v potravinách a pochutinách, jako jsou vína, čokolády, ovocné šťávy a podobně. Kyselina 4-hydroxybenzoová je hydroxyderivátem kyseliny benzoové se strukturním vzorcem uvedeným na obrázku 2. Je to bílá krystalická látka, částečně rozpustná ve vodě a chloroformu, více je rozpustná v polárních organických rozpouštědlech (alkoholy, aceton). Kyselina 4-hydroxybenzoová je prekurzorem koenzymu Q, jehož funkcí je přenos elektronu v mitochondriích a hraje důležitou roli jako antioxidant7. Kyselina vanilová (4-hydroxy-3-methoxybenzoová kyselina, Obr. 2) je methoxyhydroxyderivátem kyseliny benzoové a také oxidovanou formou vanilinu. Je to bílá, jemně krystalická látka. Spolu s ostatními fenolickými kyselinami se vyskytuje například v oříšcích, v různých druzích ovoce a zeleniny, bobulích, obilninách, olejninách8. Kyselina galová (3,4,5-trihydroxybezoová kyselina, Obr. 2) je fenolická kyselina běžně se vyskytující v rostlinách, oříšcích a čajových lístcích ve volné formě i jako vázaná v taninech. Polyfenoly obsahující epigalokatechin galát inhibují podněty k apoptóze (buněčné smrti) a zvyšují přežití nervových buněk9,

10

. V potravinářství je užívaná jako antioxidační

přísada. Kyselina kávová je dihydroxyderivátem kyseliny skořicové (3-(3,4-dihydroxyfenyl)-2propenová kyselina, Obr. 2). Hydroxyderiváty kyseliny skořicové byly nalezeny téměř ve všech druzích jídla, přičemž jejich obsah převažuje v obilninách, olejninách, ovoci a zelenině. Oplývají antioxidační aktivitou tím, že vychytávají hydroxylový radikál, superoxidový radikál, peroxidový radikál a další vysoce reaktivní částice. Kyselina kávová má z hydroxyderivátů kyseliny skořicové antioxidační aktivitu nejvyšší. Mezi další pozitivní účinky na lidské zdraví patří ochrana před rakovinovým bujením, antibakteriální a antiproliferativní účinky. Hydroxyderiváty kyseliny skořicové se mohou vyskytovat v cis a trans formě, avšak v přírodě je běžná pouze trans forma11. Katechin (Obr. 2) patří k jedněm z nejznámějších polyfenolických látek. Tato látka je řazena mezi prokyanidiny (flavan-3-oly), které se nacházejí například v čokoládových

5

bobech, jablcích, mandlích, grepech, chmelu, vinné révě a jahodách. Rostliny obsahují jak monomerní jednotky (katechin, epikatechin), tak i odpovídající oligo- a polymery, které se tvoří během růstu. Chuť ovoce závisí na složení směsi prokyanidinů, jichž vzájemný poměr určuje míru trpkosti a hořkosti. Vyváženost těchto chutí silně závisí na jejich molekulové hmostnosti12. Pozitivních účinků, které prokyanidiny mají, je několik: antioxidační, antimikrobiální, antibakteriální a hepatoprotektivní aktivita, antidiabetický a kardioprotektivní efekt a další13. Kvercetin (Obr. 2) patří do skupiny flavonoidů a má vysokou antioxidační aktivitu. Hojně se vyskytuje v potravinách a pochutinách (ovoce, zelenina, čaj a víno), které mají díky němu pozitivní účinky na lidské zdraví. Jedná se o ochranu proti mnohým nemocem, například: osteoporóze, některým formám rakoviny, kardiovaskulárním nemocem, ale i proti stárnutí. Kvercetin má důležitou schopnost vychytávat vysoce reaktivní částice (např. peroxynitril, hydroxylový radikál)14. Rutin je glykosidem kvercetinu (3-β-rutinosid) a jeho struktura je znázorněna na obrázku 2. Jelikož spadá také do skupiny flavonoidů a strukturou z kvercetinu vychází, i mnohé jejich vlastnosti jsou obdobné14. V rostlinných extraktech bývá často přítomen kvercetin i jeho glykosidy ve směsi. Kyselina hippurová (N-benzoylglycin, Obr. 2) je fyziologickou součástí krevního séra a je tvořena v játrech z kyseliny benzoové a glycinu. Kyselina benzoová vzniká při zpracování potravy živočišnou buňkou (ovoce, zelenina), konkrétně při mitochondiální β-oxidaci fenolických mastných kyselin a při oxidativním odbourání fenylalaninu bakteriemi ve střevech15. Hippurová kyselina patří mezi dominantní metabolity při konzumaci potravin bohatých na polyfenoly. OH

O

HO

OH

O O

O

HO OH HO

CH3

HO

(A)

OH

(B)

(C) OH

O

HO

O OH

O

OH

HN

HO OH

O

OH HO

OH

(D)

(E)

6

(F)

OH HO

O OH O

OH OH

OH

O

O HO

O

HO

O

H OH OH

H

OH

H

H

OH

HO OH

O

H

H

H

O

H

OH

(G)

(H)

Obr. 2: Struktury kyseliny 4-hydroxybenzoové (A), vanilové (B), galové (C), kávové (D), katechinu (E), kyseliny hippurové (F), kvercetinu (G) a rutinu (H).

2.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie je separační technika, která využívá dělení složek mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je mobilní (kapalina) a druhá stacionární. Při dělení dochází k opakovanému transportu molekul složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní. Tento děj se natolik přiblíží rovnováze, že je možné distribuci složky A mezi dvě fáze popsat distribuční (rozdělovací) konstantou16 K D ( A) uvedenou v rovnici 1,

K D ( A) =

[A]S [A]M

=

( n A ) S VM ( n A ) M VS

(1)

kde [A]S a [A]M jsou rovnovážné koncentrace složky A ve stacionární a v mobilní fázi; (nA)S a (nA)M jsou látková množství složky A ve stacionární a mobilní fázi; VS a VM jsou objemy stacionární a mobilní fáze v chromatografickém systému. Základy chromatografie položil ruský botanik M. S. Cvět počátkem 20. století. Ten jako první rozdělil na sloupci sorbentu (CaCO3) listová barviva. Zpočátku kapalinová chromatografie stála poněkud v pozadí za ostatními chromatografickými metodami, ale již koncem šedesátých let došlo k prudkému vývoji této techniky v moderní a vysokoúčinnou formu. O tyto pokroky se postarali badatelé Horvath, Kirkland a Huber. Vedle technického pokroku umožnily rozvoj HPLC i poznatky z plynové chromatografie, které objasnily podstatu pochodů v koloně a jejich souvislost s účinností chromatografického procesu. Za tyto poznatky vděčíme především Martinovi a Syngemu, kteří za své práce dostali v roce 1952

7

Nobelovu cenu. Velice významným průlomem bylo zavedení náplní kolon s chemicky vázanými fázemi, které umožňují vysoce selektivní separace s dobrou reprodukovatelností. Kapalinový chromatograf se skládá z následujících částí (Obr. 3): zásobníky mobilní fáze (a), programování gradientu (b), směšovač mobilní fáze (c), vysokotlaké čerpadlo (d), dávkovací zařízení (e), chromatografická kolona (f), detektor (g), počítač (h), nádoba na odpad (i)16. Dalším vybavením může být odplyňovač MF (j), filtr (k), předkolonka (l), termostat kolon (m), frakční kolektor (n).

Obr. 3: Schematické znázornění HPLC systému.

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie zahrnuje soubor metod, založených na různém mechanismu separace, jejichž společným pojítkem je použití kapalné mobilní fáze, vysokotlaké techniky a účinných kolon pro rychlou analýzu. Mechanismus separace je dán interakcemi mezi analyty, složkami mobilní fáze a fází stacionární. Hlavními principy chromatografického dělení jsou adsorpce, rozdělování, chemisorpce a sítový efekt16. Všechny interakce mezi stacionární fází a analyty jsou významně ovlivňovány složením mobilní fáze. Adsorpce je proces, ke kterému dochází na povrchu stacionární fáze. Pro její efektivní využití v chromatografii je nezbytné zajistit dostatečný počet aktivních míst dostupných pro analyt(y). Rozdělování mezi dvě nemísitelné kapalné fáze je významným a v moderní HPLC patrně převládajícím separačním procesem. Při tomto procesu difundují analyty z jedné fáze do druhé tak, aby byl zachován určitý poměr jeho množství v obou fázích. Tento poměr je pro daný systém a fyzikálněchemické podmínky charakteristický16. Určení přesné hranice mezi adsorpční a rozdělovací chromatografií je komplikované, protože oba mechanismy se mohou uplatňovat současně. Na principu chemisorpce je založena iontově výměnná chromatografie. Při iontové výměně difundují ionty z okolního roztoku do měniče přítomného ve stacionární fázi a vytěsňují ekvivalentní množství jiných iontů, chemisorbovaných účinnými výměnnými skupinami. Sítový efekt je uplatňován u gelové

8

permeační chromatografie. Dělení látek souvisí s pórovitou strukturou gelu. Rozměry pórů a velikost solvatovaných molekul analytů potom určují retenci. Menší molekuly difundují hlouběji do kvazistacionární fáze v póru, a tudíž jsou více zadržovány. Naopak velké molekuly zůstávají při povrchu fáze a největší molekuly (jejich průměr je větší než průměr pórů) nepronikají do pórů vůbec a dochází k totální exkluzi. Charakter vzorku a zejména charakter mobilní fáze pak rozhodne, který z mechanismů více či méně převládá. Příkladem je silikagel deaktivovaný vodou, který můžeme považovat za adsorbent či za nosič se zakotvenou stacionární fází (rozdělování analytu mezi mobilní fázi a vrstvu vody adsorbovanou na povrchu silikagelu). Naopak náplně s chemicky vázanými fázemi můžeme považovat za nosiče s imobilizovanou kapalnou stacionární fází či za adsorbenty s chemicky modifikovaným povrchem17. Tyto interakce budou dále diskutovány podrobněji. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je v současné době běžná analytická metoda využívající kolony plněné malými částicemi (s vnitřním průměrem 3 - 5 µm), které zaručují většinou dostatečně účinné analýzy. Prozatím nejvyšší účinnosti v oboru kapalinové chromatografie bylo dosaženo použitím částic s velikostí pod 2 µm, což je samozřejmě spojeno s nárůstem pracovních tlaků, a tudíž i nezbytností vývoje instrumentace umožňující práci při těchto tlacích. Tyto systémy nazýváme UHPLC nebo UPLC. HPLC je všestranná a rychlá analytická metoda používaná pro analýzy léčiv, biomolekul, polymerů a mnoha organických a iontových sloučenin. Pomocí této metody lze řešit v zásadě tyto hlavní úkoly: dělení a identifikace látek ve směsích; kontrola čistoty preparátů; kvantitativní analýza látek ve směsi; kontrola výroby (kontrola surovin, meziproduktů a finálních výrobků); kontrola životního prostředí; analýza v klinické praxi (analýza komponent v tělních tekutinách); kontrola technologie výroby a finální kvality potravin (čistota výrobků, množství vitamínů, …); biochemické analýzy; analytická kontrola v různých průmyslových odvětvích, zemědělství, stavebnictví a elektrotechnice. Kromě výše uvedených analýz může být použita k čištění a izolaci složek směsí (preparativní chromatografie)17.

2.2.1 Systém reverzních fází Chromatografie v systému reverzních fází (RP) je první volbou pro separaci většiny běžných vzorků. RP-HPLC je běžnější a robustnější než ostatní formy LC a častěji vede k uspokojující konečné separaci. Práce na kolonách s RP vedou k účinné, stabilní a reprodukovatelné analýze. V systému RP se používají nepolární stacionární fáze a polární

9

fáze mobilní. Náplněmi kolon jsou nejčastěji nepolární fáze chemicky vázané na silikagelu jako nosiči16. Tyto náplně se nejčastěji připravují chemickými reakcemi silikagelu s chlorodimethylsilanem příslušné skupiny, která má tvořit hydrofobní povrch. Takovými skupinami mohou být C18, C8, fenyl atd. Pro minimalizaci nechtěných interakcí s nezreagovanými silanolovými skupinami se nejčastěji používá proces zvaný „endcapping“. Jedná se o zreagování zbývajících –Si-OH skupin, například s trimethylchlorosilanem, způsobující dokonalejší pokrytí povrchu silikagelu. Jako mobilní fáze se používá voda s příměsí organického rozpouštědla (methanol, acetonitril, ethanol, tetrahydrofuran, dioxin). Detekce je v tomto systému často jednodušší, obzvláště UV detekce, díky používaným rozpouštědlům18. Separace v systému RP je přirovnávána k extrakci sloučenin z vody do organického rozpouštědla jako je oktanol. Hydrofobnější (méně polární) sloučeniny se extrahují do nepolární oktanolové fáze lépe než sloučeniny polární (Obr. 4). Proto se zvyšováním lipofility (snižováním polarity) analytu dochází ke zvyšování jeho retence. Hydrofilní (polární) sloučeniny jsou tedy méně zadržovány a eluují jako první z kolony, látky střední polarity eluují následně a jako poslední z kolony eluují velmi hydrofobní látky.

(a)

(b)

Obr. 4: Schéma (a) rozdělování18 a (b) retence látek v systému RP19. Retence sloučenin v RP-HPLC je určována jejich polaritou a experimentálními podmínkami: složením MF, typem reverzní fáze a teplotou. Snižování polarity mobilní fáze (zvyšování obsahu organického rozpouštědla v mobilní fázi) vede ke snižování retence analytu. Polarita rozpouštědla je popisována indexem polarity P´, který je pro mnoho látek tabelován. Eluční síla mobilní fáze závisí jak typu organického rozpouštědla (polaritě), tak i na jeho obsahu v MF. Důkaz tohoto tvrzení byl experimentálně prokázán na směsích 3 nejhojněji používaných organických rozpouštědlech s vodou: stejných hodnot kapacitních

10

poměrů (k) a retenčních časů jako v 40% acetonitrilu můžeme dosáhnout v 50% methanolu a 30% tetrahydrofuranu (THF)18. Pomocí výsledků z experimentálních studií20,

21

je možné

vytvořit škálu organických rozpouštědel od nejslabšího po nejsilnější: voda – methanol – acetonitril – ethanol – THF – propanol – methylenchlorid. Poněvadž je methylenchlorid nejsilnějším rozpouštědlem v systému RP a není mísitelný s vodou, používá se především pro čištění kolon s RP. První volbou při výběru organického rozpouštědla bývá acetonitril, díky tomu, že jeho směs s vodou umožňuje detekci při nízkých vlnových délkách (185 - 210 nm) a nízká viskozita těchto směsí umožňuje práci za nízkých zpětných tlaků. Změna selektivity je často dosažena náhradou acetonitrilu methanolem, který ovšem tvoří s vodou viskóznější směsi, což vede k nárůstu pracovních tlaků. Větší eluční sílu než výše uvedená rozpouštědla má THF, jehož nevýhodami je vyšší UV absorbance, reaktivita s kyslíkem a pomalejší ekvilibrace kolony při změně MF. Problematičtější, než separace neutrálních vzorků, je separace analytů nesoucích v molekule ionizovatelnou skupinu. Jak již bylo výše uvedeno, retence vzorku v systému RP roste spolu s rostoucí hydrofobicitou sloučenin. Kyseliny nebo zásady jsou patřičnou změnou pH ionizovány, stávají se méně hydrofobní (hydrofilnější) a jejich retence se snižuje. Jak vyplývá z předchozího textu, pH mobilní fáze významně ovlivňuje retenci kyselin a zásad. Pokud se pH roztoku kyseliny či báze bude rovnat hodnotě pK sloučeniny, je tato sloučenina jen „z poloviny“ ionizována (koncentrace neutrální a ionizované formy jsou stejné). Největší změny retence se uskutečňují, když se pH mobilní fáze pohybuje v intervalu pK ± 1,5. Jinými slovy, v této oblasti dochází malou změnou pH k výrazné změně retenčních časů (horší reprodukovatelnost retence) v porovnání s oblastí pH, kde jsou analyty plně ionizovány nebo naopak ve své neutrální formě. Na druhou stranu, u látek s velmi podobnou strukturou, lze prací v oblasti pK analytů dosáhnout jemného nastavení selektivity (Obr. 5).

Obr. 5: Idealizovaný průběh závislosti mezi hodnotou pH mobilní fáze a retencí18.

11

Stabilita retenčních časů slabých elektrolytů souvisí rovněž se schopností mobilní fáze tlumit výkyvy pH dané analyty. V chromatografické praxi jsou tedy často používány jako složky mobilní fáze pufry. Koncentrace pufru v MF bývá obvykle od 10 do 50 mmol/l, jelikož vyšší koncentrace již mohou být nerozpustné ve vysokém obsahu organického rozpouštědla (především u gradientové eluce) či způsobovat korozi konstrukce chromatografu. Dalšími vlastnostmi složek mobilní fáze, které je třeba uvažovat, je absorpce UV záření (rozsah použití UV detekce) či rozpustnost a stabilita analytů18. Vzhledem k velkému množství různých typů komerčně dostupných kolon s reverzními fázemi, je často možné dosáhnout zlepšení separace i právě výměnou kolony. Je to ale samozřejmě dražší metoda než pouhá úprava mobilní fáze. Výjimkou je separace velmi hydrofobních látek, které jsou příliš zadržovány na „silné“ koloně (C18) a není možná jejich eluce bez použití velmi silných rozpouštědel (jako je THF). U tohoto případu je jediným řešením použití „slabší“ kolony (C8)18.

V posledních desetiletích jsme svědky bouřlivého rozvoje různých technologií přípravy vysokoúčinných kolon. Přes pestrost v literatuře se objevujících technických řešení lze úspěšné trendy rozdělit do tří skupin: 1. postupy vedoucí k dalšímu zmenšování průměru částic sorbentu („sub 2 µm“) 2. příprava povrchově porézních materiálů (velikost částic od 3 do 1,7 µm) 3. příprava monolitických materiálů (chromatografické lože je tvořeno „jednou porézní částicí“)

V této práci bude pozornost věnována možnostem povrchově porézních sorbentů. V roce 2007 Kirkland získal povrchově porézní částici Halo-C18, která byla připravena z pevného křemenného jádra (1,7 µm) pokrytého porézní vrstvou (0,5 µm). U tohoto sorbentu bylo dosaženo výšky teoretického patra 1,5 µm pro nízkomolekulární látky, kdežto pro běžně používané celoporézní sorbenty se výška teoretického patra pohybuje okolo 2,0 µm. Použití povrchově porézních částic vede ke snížení odporu proti převodu hmoty ve stacionární fázi22. Kinetex C18 je novým typem kolony od firmy Phenomenex. Tato kolona je naplněna druhou generací povrchově porézních částic. Výhodou těchto částic je velice úzká distribuce jejich velikosti vedoucí ke snížení vířivé difúze Oproti koloně Halo-C18 jsou zde částečky téměř kulovité a mají jednotnou tloušťku porézní vrstvy kolem pevného jádra22. Výrobce Kinetex C18 slibuje vysokou účinnost analýz, zpětné pracovní tlaky pod 300 bar, zkrácení

12

analýz ve srovnání s tradičními kolonami (částice 3 µm), zlepšení rozlišení a selektivity a kompatibilitu těchto kolon s běžným kapalinovým chromatografem23.

2.2.2 Systém normálních fází V systému normálních fází (NP) je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní. Klasickými příklady normální stacionární fáze jsou nemodifikovaný silikagel, oxid hlinitý či silikagel s chemicky vázanými diolovými, aminovými či kyanidovými skupinami. V této kapitole bude s ohledem na zaměření práce blíže probírán pouze nemodifikovaný silikagel. Vzhledem k povaze stacionární fáze, je mobilní fáze tvořena nejčastěji směsí nepolárního (hexan, oktan, dichlormethan) a polárního rozpouštědla (methanol, ethanol či propanol). Zvýšení obsahu polární složky vede ke zvýšení eluční síly mobilní fáze (snížení retence). Při práci v systému normálních fází je klíčová kontrola obsahu vody v rozpouštědlech tvořících mobilní fáze. Přítomnost vody způsobuje změny v retenčním mechanismu a obvykle jej komplikuje. I poměrně malé změny v obsahu vody v průběhu analýz často vedou k výrazným změnám retence, a tím k nereprodukovatelným změnám retenčních časů. Proto v „klasické chromatografii v systému NP“ je dávána přednost práci s bezvodými rozpouštědly. Zejména kritická je vlhkost při práci s nemodifikovaným silikagelem. U modifikovaného silikagelu není kontrola obsahu vody tak kritická. Pro analýzu iontových (a snadno ionizovatelných) analytů může být přídavek vody do mobilní fáze nezbytný, s ohledem na jejich rozpustnost a akceptovatelnou retenci. Polární stacionární fáze s inkorporovanou vrstvičkou vody řadíme mezi tzv. HILIC systémy. Mechanismus retence je odlišný od mechanismu na normální fázi a bude popsán v kapitole 2.2.3. Retence separovaných látek v systému normálních fází je zapříčiněna adsorpcí. Separace je dána rozdílnou adsorpcí molekul analytů v aktivních místech stacionární fáze (u nemodifik. silikagelu jsou aktivními místy Si-OH skupiny). Přednostně dochází k pokrytí povrchu adsorbentu vrstvou molekul mobilní fáze (M). Retence molekul vzorku (A) vyžaduje přemístění molekul (M), aby mohlo dojít k adsorpci molekul (A). Během separace se tedy uplatňuje vzájemné soutěžení molekul vzorku a mobilní fáze o aktivní centra na povrchu adsorbentu (Obr. 6)18.

13

Obr. 6: Schéma mechanismu adsorpce v systému NP18.

Snyder zevrubně prostudoval a popsal proces adsorpční chromatografie a navrhl výpočet distribuční konstanty podle rovnice16 (2),

log K D = log Va + α ( S − AS ε )

(2)

kde α kvantitativně vyjadřuje aktivitu adsorbentu; AS je plocha, kterou zaujímá adsorbovaná molekula

na

povrchu

adsorbentu;

Va

je

povrchový

objem

adsorbentu

(objem

monomolekulární vrstvy rozpouštědla adsorbovaného hmotnostní jednotkou adsorbentu);

S vyjadřuje volnou energii adsorpce látky na adsorbentu o aktivitě α =1 a ε je eluční síla mobilní fáze. Ze vztahu vyplývá, že velikost adsorpce roste s rostoucí aktivitou a specifickým povrchem adsorbentu a klesá s rostoucí eluční silou (polaritou) mobilní fáze a s rostoucí plochou adsorbentu potřebnou k adsorpci jedné molekuly analytu. Rozmístění adsorpčních center je neměnné, a proto interakce funkčních skupin analytů s adsorbentem závisejí na geometrickém rozmístění funkčních skupin v těchto molekulách. K nejsilnější interakci dochází, pokud rozmístění funkčních skupin odpovídá poloze adsorpčních center. Výsledkem jsou značné rozdíly adsorpčních energií různých izomerů, a tudíž lepší selektivita pro dělení izomerů než v systému RP. Síla polárních interakcí s adsorbentem, a tudíž i velikost retence v systému NP, je určena počtem a polaritou funkčních skupin analytů (Obr. 7). Spolu s rostoucí polaritou funkční skupiny roste i retence látek v přibližném pořadí: alifatické uhlovodíky – aromáty – halogensloučeniny – ethery – terciární aminy – nitrosloučeniny – ketony – primární aminy – alkoholy – fenoly – karboxylové kyseliny16.

14

Obr. 7: Schématické znázornění retence polární a nepolární látky na povrchu porézní silikagelové částice19. Oproti systému RP systém NP dovoluje více ovládat selektivitu změnou rozpouštědla či kolony. Záměna jednoho rozpouštědla ve směsi může znamenat velmi výraznou změnu v selektivitě. Tato změna souvisí s rozdílnou sílou vazby molekul analytu a rozpouštědla na aktivní centra sorbentu. Molekuly rozpouštědla, které jsou vázány silněji, soutěží o místo s molekulami analytu, a tudíž snižují jejich retenci. Velikost vlivu rozpouštědla klesá spolu se snižující se velikostí vazby, jakou jsou molekuly analytu vázány. Sílu různých rozpouštědel a směsí rozpouštědel určuje relativní síla rozpouštědla ε°, která m ůže být experimentálně změřena. Hodnoty ε° vybraných b ěžně používaných rozpouštědel pro silikagel jsou uvedeny v tabulce 1. Pro ostatní kolony systému NP mají hodnoty ε° obdobný trend jako u silikagelu. Tab. 1: Hodnoty relativní síly rozpouštědla (ε°) 24, 25 Rozpouštědlo Hexan, heptan, oktan Chloroform Methylenchlorid Methyl-t-butylether Ethylacetát Dioxan Acetonitril THF Propanol Methanol

Vazba na ε° aktivní centrum 0,00 Ne 0,26 Ne 0,30 Ne 0,48 Ano 0,48 Ano 0,51 Ano 0,52 Ano 0,53 Ano 0,60 Ano 0,70 Ano

V systému RP selektivitu ovlivňuje především zásaditost, kyselost a polarita MF, kdežto v systému NP se jedná o schopnost vázat se na aktivní centra sorbentu. Proto lze při změně rozpouštědla, které tuto schopnost nemá (např. methylenchlorid), za rozpouštědlo

15

vázající se na sorbent (např. acetonitril), očekávat rapidní změnu v selektivitě (často výraznější než je tomu u RP)18. V současné době není chromatografie v systému NP příliš používána z důvodu vyšších nákladů na vysoce čistá a bezvodá organická rozpouštědla. Nevýhodou práce v systému NP je rovněž nižší účinnost kolon oproti systému RP, větší náchylnost tvorbě bublinek v MF (vzhledem k nízké teplotě varu rozpouštědel), nestálost retenčních časů (souvislost s nekontrolovaným obsahem vody) a obtížné provedení gradientové eluce. I přes to má chromatografie v systému NP určité výhody a v některých případech není možné dosáhnout separace jiným způsobem, než použitím systému NP. Navíc tento systém je užitečný při analýzách sloučenin, které jsou ve vodném prostředí nestabilní. Nespornou výhodu práce v systému NP, co se týče používaných rozpouštědel tvořících MF, jsou nižší pracovní tlaky (související s jejich malou viskozitou) a jejich snadné odpaření, což je využitelné pro preparativní chromatografii18.

2.2.3 Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Příliš hydrofilní vzorky nemusí být v systému RP zadržovány, kdežto v systému NP mohou být velmi dobře zadržovány. Naneštěstí, velmi hydrofilní vzorky mohou být špatně rozpustné v nevodných rozpouštědlech, typicky používaných v systému NP. Řešením tohoto problému může být použití speciálních kolon, na kterých je možné pracovat s MF obsahující vodu. Například sacharidy jsou běžně separovány na amino-koloně s MF obsahující 60% až 80% acetonitrilu s vodou. Chromatografie v systému NP s mobilní fází obsahující vodu byla definována jako chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC). Pro tento typ separací byly navrženy speciální HILIC kolony. Tyto kolony jsou obvykle používány s gradientem, kde se snižuje obsah organického rozpouštědla či se zvyšuje obsah soli. Eluční pořadí analytů je od nejméně polárních po nejvíce polární18. Zjednodušeně lze říci, že tato metoda vznikla spojením NP-HPLC a RP-HPLC, přičemž je zde separace zaměřena na polární a ve vodě dobře rozpustné látky. Stacionární fáze vycházejí ze systému NP, jedná se tedy například o nemodifikovaný silikagel, modifikovaný silikagel s navázanými nejrůznějšími skupinami (diolové, kyanopropylové, karbamoylové, amidové, kyanové, zwitterionové atd.). Mobilní fáze obsahuje vodu s vysokým podílem organického rozpouštědla (>60%). Stacionární fáze je polárnější než mobilní, a tudíž je možné s vysokým rozlišením dělit polární analyty. Aby docházelo výhradně k hydrofilním interakcím, je nutné pracovat s mobilními fázemi, které mají vysoký obsah organického rozpouštědla. Pokud by však byl obsah vody jen stopový, docházelo by ke změně

16

separačního mechanismu (zvyšující se vliv adsorpce) a jednalo by se spíše o systém NP nebo systém na pomezí NP a HILIC26. HILIC materiály obsahující chemicky modifikované stacionární fáze (např. karbamoylové skupiny kovalentně vázané na nosič alkylovým řetězcem) se mohou při použití malého množství organického rozpouštědla v mobilní fázi naopak chovat podobně jako reverzní fáze27 (Obr. 8). Typické „HILIC chování“ znamená snížení retence se zvyšováním obsahu vody. Pokud je retenční chování jiné, jedná se s největší pravděpodobností o příspěvek dalších interakcí, například o iontově-výměnné reakce mezi analytem (např. kyseliny) a stacionární fází (silikagel s navázanou aminoskupinou)28.

Obr. 8: Silikagel s navázanou karbamoylovou skupinou (kolona TSKgel Amide-80)27.

Mechanismus retence v HILIC systému není stejně jako v případě systému RP doposud detailně objasněn. Podle původní práce A. Alperta29 je mechanismem separace rozdělování, oproti tomu v souhrnné práci P. Hemströma30 jsou prezentovány výsledky svědčící spíše ve prospěch adsorpčního modelu26. V ideálním případě je separace řízena hydrofilními interakcemi (dipól-dipól interakce a vodíkové vazby) mezi analytem a polární stacionární fází27. Mohou se uplatňovat i další interakce, žádoucí je ovšem převaha interakcí hydrofilních. Předpokladem pro hydrofilní interakci je vznik hydratované vrstvy na povrchu sorbentu (inkorporovaná vrstva vody; angl. „water-rich layer“). Schematické znázornění HILIC stacionární fáze s hydratovanou vrstvou je na obrázku 9 a schéma rozdělovacího mechanismu v HILIC systému na obrázku 10.

Obr. 9: Schéma dioly modifikované stacionární fáze26.

17

(a)

(b) Obr. 10: Znázornění rozdělovacího mechanismu v systému HILIC (a) na silikagelu31, (b) na silikagelu s navázanou karbamoylovou skupinou27. Bylo již zmíněno, že při určitých podmínkách separace na HILIC fázích, může k retenci přispívat i iontová výměna. K tomuto ději dochází obzvláště na nemodifikovaném silikagelu. Přítomnost vody usnadní disociaci silanolových skupin. Negativně nabitý povrch přitahuje kationty, ale zároveň snižuje retenci negativně nabitých analytů elektrostatickou repulzí. Přídavek elektrolytu (pufru) umožní kontrolu smíšeného módu separace30. Podobně jako v systému RP má hodnota pH mobilní fáze zásadní vliv na retenci a selektivitu tím, že ovlivní ionizaci analytu v MF. Stejně jako v systému RP je doporučeno

18

(pro větší reprodukovatelnost) nejprve upravit pH vodného roztoku, a až poté přidat organické

rozpouštědlo28.

Navíc

elektrostatické

odpuzování

(druhotné

interakce)

separovaných složek a negativně nabité stacionární fáze (na bázi silikagelu) je možné minimalizovat právě přídavkem amonných solí organických kyselin (např. mravenčan či octan amonný). Při volbě vhodné amonné soli je třeba brát v úvahu její rozpustnost v mobilní fázi a případnou prospěšnost pro další aplikace, jako může být zvýšení ionizace při spojení s MS detekcí26. Bylo prokázáno, že se zvyšujícím se obsahem soli se zvyšuje retence analytů na 4 různých typech sorbentů v systému HILIC. Tyto experimenty potvrzují, že nárůst retence může souviset spíše s hydrofilními interakcemi (rozdělování), než se specifickými interakcemi s funkčními skupinami sorbentu. Vzhledem k vysokému obsahu organického rozpouštědla v MF se sůl z mobilní fáze koncentruje v inkorporované vrstvě vody na povrchu sorbentu, kde vznikají hydratované ionty soli. Tato skutečnost vede ke zvýšení hydrofilnosti vodné vrstvy, a tudíž k větší retenci polárních analytů28. Retence může být dále ovlivněna teplotou, aciditou MF a koncentrací použité soli v MF. Současným trendem je využití HILIC pro separaci aminokyselin a peptidů32. Své uplatnění HILIC nalézá i v separaci oligonukleotidů, složek nukleových kyselin, cukrů (oligoa polysacharidy), glykanů, toxinů. V tomto systému je možné separovat jak nízkomolekulární organické látky, tak i ve vodě dobře rozpustné biopolymery. Mezi obory, pro které HILIC fáze nabývají na významu, patří proteomika33, metabolomika30, 34 a farmacie. Obrovskou výhodou HILIC systému je možnost snadného spojení s hmotnostním spektrometrem (typicky pro ionizaci elektrosprejem).

19

3 Experimentální část 3.1 Chemikálie Standardy fytochemikálií (kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, kávová, galová, katechin, kvercetin a rutin) a kyseliny hippurová byly zakoupeny od firmy FLUKA (p.a., Buchs, Švýcarsko). Standardy na ověření kvality kolony (anisol, methyl- a ethylester kyseliny benzoové) byly dodány firmou LACHEMA (p.a., Neratovice, ČR). Pro přípravu mobilních fází a roztoků standardů byla použita následující rozpouštědla a chemikálie: deionizovaná voda získaná z dvoustupňové deionizační stanice Elga (Bucks, Velká Británie) (18 MΩ/cm), acetonitril čistoty gradient grade (SIGMA-ALDRICH; St. Louis, USA), methanol čistoty gradient grade (BIOSOLVE; Valkensward, Nizozemí), kyselina mravenčí 99,7% čistoty p.a. (LACHEMA), hexan pro stopovou organickou analýzu (FLUKA), ethylacetát čistoty p.a. (LACHEMA), 2-propanol pro UV spektrometrii (SIGMA-ALDRICH), kyselina trifluoroctová (TFA) > 99% p.a. (FLUKA), kyselina octová 99,8% a octan amonný p.a. (SIGMA-ALDRICH).

3.2 Přístroje a vybavení 3.2.1 Kapalinový chromatograf Analýzy byly

realizovány na

kapalinovém

chromatografu Knauer

Smartline

s detektorem diodového pole (Obr. 11), který je vybavený nízkotlakým kvartérním gradientem a vestavěným průtokovým odplyňovačem. Ve vysokotlaké části kapalinového chromatografu je instalován dynamický mixér. Dávkování vzorku je realizováno šesticestným vysokotlakým ventilem s dávkovací smyčkou o objemu 20 µl. Po dobu analýz byla snímána UV/VIS spektra v rozmezí 210 - 450 nm. Pro sledování většiny analýz postačily 2 vlnové délky a to 210 a 280 nm, dodatečně byl pro hodnocení výsledků v systému NP extrahován chromatogram při 325 nm. Směšování komponent mobilní fáze u všech gradientových elucí je řízeno manažerem kapalinového chromatografu. Retence složek modelové směsi byla studována na pěti kolonách: Pinnacle DB Silica, 3 µm (150 x 4,6 mm, Restek, USA), LUNA 3u HILIC 200 A (150 x 2,0 mm, Phenomenex, USA), TSKgel Amide-80, 3 µm (150 x 2,0 mm, TOSOH Bioscience, Japonsko), Kinetex 2,6u C18 100A (100 x 2,1 mm, Phenomenex, USA), Gemini 5u C18 110A (150 x 2,0 mm, Phenomenex, USA).

3.2.2 Hmotnostní spektrometr Pro studium LC/MS kompatibility a jednoznačnou identifikaci byl k detekci využit hmotnostní spektrometr Q-TOF Premier od firmy Waters vybavený hybridním analyzátorem

20

založeným na kombinaci kvadrupólu a průletového analyzátoru a ionizací elektrosprejem (Zsprej) (Obr. 11). Jelikož analyty obsahují karboxylové skupiny, byly k ionizaci použity záporné potenciály. Teplota kapiláry byla nastavena na 120 °C a nap ětí na kapiláře bylo -3,2 kV. Detekce hmotnostním spektrometrem byla prováděna skenováním hodnot m/z v rozsahu 50 – 1000 hmotnostních jednotek a pro identifikaci analytů byly rekonstruovány chromatogramy pro konkrétní hodnoty m/z (Tab. 2). Tab. 2: Sledované hodnoty m/z látek modelové směsi analyt kys. 4-hydroxybenzoová kys. vanilová kys. galová kys. hippurová

m/z 137,1207 167,1467 169,0215 178,1727

analyt kys. kávová katechin kvercetin rutin

m/z 179,0423 289,0790 301,0427 609,1534

Obr. 11: Kapalinový chromatograf Knauer a hmotnostní spektrometr Q-TOF Premier.

3.2.3 Ostatní laboratorní příslušenství Pro navážení standardů byly použity analytické váhy Sartorius (Sartorius AG, Goettingen, Německo). Na měření pH roztoků byl použit pH metr InoLab (WTW, Praha, ČR). Při přípravě mobilní fáze byla pro dodatečné odplynění použita ultrazvuková lázeň Elma, S 40 H, Elmasonic (Elma Hans Schmidbauer, Singen, Německo).

3.3 Příprava směsí standardů Zásobní roztoky standardů pro práci v systému reverzních fází byly připraveny rozpuštěním 1 mg standardu v 1 ml okyselené deionizované vody. Modelová směs byla připravena naředěním zásobních roztoků na konečnou koncentraci každého standardu 50 mg/l. Jako standardy byly u tohoto systému zvoleny kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, galová, kávová a hippurová, katechin a kvercetin. Katechin, anisol, methyl- a ethylester kyseliny benzoové byly pro studii v systému normálních fází rozpuštěny i ředěny do mobilní fáze (MF) hexan-methanol (96:4, v/v) a jejich konečná koncentrace byla 70 mg/l každé látky. Dále byl připraven roztok katechinu ve 2-

21

propanolu o koncentraci 1 mg/ml a následně naředěn příslušnou MF na konečnou koncentraci 100 mg/l. V okyselených mobilních fázích obsahujících 2-propanol a hexan byl připraven roztok katechinu o koncentraci 1 mg/ml v příslušné MF a toutéž byl následně naředěn na koncentraci 100 mg/l. Analyzovanými standardy v mobilní fázi hexan-methanol-ethylacetát (systém NP) byly kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, galová, kávová a hippurová, katechin a rutin. Koncentrace standardů u prvních analýz (původní analýzy s MF okyselenou TFA) se pohybovala od 10 do 100 mg/l, u opakovaných analýz po jednom roce byla koncentrace všech analytů sjednocena na 50 mg/l. Všechny zásobní roztoky i roztoky modelových směsí byly rozpuštěny v příslušné mobilní fázi, v případě gradientu byly rozpuštěny v mobilní fázi s menší eluční silou (hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 + 0,5% TFA, v/v). V HILIC systému fází byly zásobní roztoky standardů a modelová směs připraveny rozpuštěním a ředěním v příslušné mobilní fázi (koncentrace každé látky 50 mg/l), v případě gradientu byla směs rozpuštěna v mobilní fázi s menší eluční silou (95% acetonitril obsahující acetátový pufr, pH 6). Jako standardy byly u tohoto systému použity kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, galová, kávová a hippurová, katechin a kvercetin.

3.4 Příprava mobilní fáze a optimalizace retence 3.4.1 Systém reverzních fází Složky mobilní fáze gradientu byly připraveny okyselením deionizované vody (složka A) a acetonitrilu či methanolu (složka B) kyselinou mravenčí na celkovou koncentraci kyseliny 0,1% (v/v). Pro analýzu modelové směsi u kolony Kinetex C18 byly zvoleny následující podmínky s průtokem MF 0,25 ml/min (složka B = okys. acetonitril). Grad.1: 0 5 min 100% A; 5 - 8 min 100% - 95% A; 8 - 20 min 95% - 10% A; 20 - 30 min 10% A; 30 - 40 min 10% - 100% A. Dále byl u obou kolon použit gradient (grad.2) s průtokem mobilní fáze 0,25 ml/min (složka B = okys. methanol). Grad.2: 0 - 5 min 100% A; 5 - 20 min 100% - 55% A; 20 -23 min 55% - 10% A; 23 – 35 min 10% A; 35 - 45 min (F = 0,2 ml/min) 10% - 100% A. U kolony Gemini C18 byla modelová směs analyzována také pomocí dalšího gradientu (grad.3) s průtokem mobilní fáze 0,4 ml/min (složka B = okyselený methanol). Grad.3: 0 3 min 100% A; 3 - 23 min 100% - 10% A; 23 - 32 min 10% A; 32 - 42 min 10% - 100% A. Nastřikované množství směsi bylo 5 µl.

3.4.2 Systém normálních fází Pro vývoj metody analýzy bylo potřeba otestovat několik mobilních fází a jejich modifikací. První testovaná mobilní fáze se skládala ze směsi hexanu a methanolu (96:4,

22

v/v). Průtok izokratické eluce s předmíchanou mobilní fází byl 0,5 ml/min. Tato metoda byla převzata z certifikátu o analýze na koloně Pinnacle DB Silica. Pro ověření kvality a parametrů této kolony byla zvolena směs standardů (anisol, methyl- a ethylester kyseliny benzoové). Dále v tomto systému byla zjišťována retence katechinu. Nastřikované množství katechinu či směsi bylo 20 µl. Další MF byl 2-propanol a 2-propanol s příměsí hexanu (v různých poměrech (v/v): 50:50, 25:75, 80:20) (průtok 0,5 ml/min). První modifikací MF bylo okyselení 2-propanolu kyselinou octovou (2% v/v). Testovány byly MF s různým množstvím okyseleného 2propanolu a hexanu (v/v): 25:75, 40:60, 45:55, 50:50, 80:20. Směšování komponent mobilní fáze izokratické eluce bylo zajištěno manažerem kapalinového chromatografu. Mobilní fáze s nejvhodnějším poměrem komponent (tj. 40:60, resp. 30:70 2-propanol:hexan) byla předmíchána a okyselena na konečnou koncentraci kyseliny octové 2% (v/v). U optimálního složení MF 2-propanol-hexan = 35:65 byl testován vliv obsahu kyseliny octové (4% a 6%, v/v) na retenci katechinu (100 mg/l). Nastřikované množství roztoku katechinu bylo 20 µl. Posledním testovaným typem MF byla směs obsahující hexan, methanol a ethylacetát (průtok 1 ml/min). Byl testován i vliv okyselení (v/v, 2% kys. octová) u MF hexan:methanol:ethylacetát 2:3:1 a 8:3:1 (v/v). U MF hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 byl vedle toho testován i vliv obsahu kyseliny trifluoroctové (0,12%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% a 0,6% TFA; v/v). Nejlepší separace bylo dosaženo s 0,5% TFA, proto s tímto obsahem TFA byly testovány i MF o složení hexan:methanol:ethylacetát 8:2:1 a 8:1:1. Na základě těchto výsledků byla navržena gradientová eluce (grad.4) s průtokem MF 1 ml/min, kde složkou A je hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 s 0,5% TFA (v/v) a složkou B hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 s 0,5% TFA (v/v). Grad.4: 0 - 3 min 100% A; 3 - 3,5 min 100% - 0% A; 3,5 - 16 min 0% A; 16 - 18 min 0% - 100% A. Nastřikované množství směsi bylo 20 µl.

3.4.3 Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Při vývoji metod analýzy na těchto kolonách jsem provedla nejprve izokratickou eluci směsí 80%, 90%, 95% a 98% (v/v) acetonitrilu s vodou. Mobilní fáze byla připravena navážením komponent dle hodnot uvedených v tabulce 3 (hustota vody ρV = 0,998 g/cm-3, hustota acetonitrilu ρA = 0,782 g/cm-3). Komponenty byly smíchány a mobilní fáze odplyněna na ultrazvukové lázni.

23

Tab. 3: Vypočtené obsahy acetonitrilu a vody pro přípravu 100 ml MF obsah acetonitrilu (%) 98 95 90 80

obsah acetonitrilu (g) 76,6 74,3 70,4 62,6

obsah vody (g) 2 5 10 20

V další fázi vývoje metody byla testována izokratická eluce mobilních fází pufrovaných octanem amonným na pH = 6 či 7 (80%-, 90%- a 95%-ní acetonitril). Konečná celková koncentrace octanu amonného v objemu mobilní fáze byla zvolena na 12,5 mmol/l. Jelikož pH má být upravováno ve vodném roztoku (bez přídavku acetonitrilu), bylo potřeba pro každé složení mobilní fáze připravit vodné roztoky pufrů o různých koncentracích (Tab. 4) tak, aby konečná koncentrace pufru po přidání acetonitrilu byla konstantní v MF, a tudíž i výsledky porovnatelné. Pro úpravu pH pufru byla použita koncentrovaná kyselina octová. Postup při přípravě pufrovaných mobilních fází byl následující: 1) příprava roztoku octanu amonného a úprava pH, 2) navážení komponent dle Tab. 3 (hustota pufru ρP ≈ ρV = 0,998 g/cm-3), 3) smíchání komponent a odplynění na ultrazvukové lázni. Tab. 4: Vypočtené obsahy octanu amonného v příslušné pufrované mobilní fázi vodná fáze (%) 20 10 5

obsah pufru ve vodě (mmol/l) 62,5 125 250

obsah pufru ve vodě (g/100 ml) 0,4813 0,9625 1,9250

Nejlepších podmínek separace bylo dosaženo použitím gradientové eluce jak pro kolonu LUNA HILIC (grad.5), tak i pro kolonu TSKgel Amide-80 (grad.6), kde složkou A je 95% acetonitril obsahující pufr a složkou B je 80% acetonitril obsahující pufr. Profil gradientu 5: 0 - 10 min 100% A; 10 - 17 min 100% - 0% A; 17 - 25 min 0% A; 25 - 27 min 0% - 100% A. Profil gradientu 6: 0 - 9 min 90% A; 9 - 11 min 90% - 0% A; 11 - 27 min 0% A; 27 - 28 min 0% - 100% A. Nastřikované množství směsi bylo 5 µl. Všechny přípravné i chromatografické experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě.

24

4 Výsledky a diskuse 4.1 Systém reverzních fází V tomto systému fází byly testovány kolony: Kinetex 2,6u C18 100A (100 x 2,1 mm, Phenomenex) a Gemini 5u C18 110A (150 x 2,0 mm, Phenomenex).

4.1.1 Kinetex C18 Byla optimalizována separace složek modelové směsi. Jako složka s menší eluční silou (složka A) byla použita voda okyselená kyselinou mravenčí (0.1% v/v). Tato složka je všeobecně používaná a lze ji použít jako referenční, pro účely porovnání různých chromatografických systémů. Pro gradientovou eluci byly jako složky s vyšší eluční silou (složka B) použity okyselený acetonitril nebo okyselený methanol (kyselinou mravenčí, 0,1%, v/v). Tento postup je modifikací metody převzaté z literatury35. Nejlepší výsledky poskytoval Gradient 1 podrobně popsaný v tabulce Tab. 5. Výsledná analýza je uvedena na obrázku 12 a. Záměnou acetonitrilu za methanol ve složce B je možno po úpravě profilu Gradientu 2 dosáhnout lepšího vzájemného rozlišení všech složek modelové směsi (Tab. 6 a Obr. 12 b). Tab. 5: Schéma gradientové eluce na kolonách s RP s acetonitrilem čas (min) 0 5 8 20 30

složka A (%) 100 100 95 10 10

složka B (%) 0 0 5 90 90

Tab. 6: Schéma gradientové eluce na kolonách s RP s methanolem čas (min) 0 5 20 23 35 45

složka A: 0,1% HCOOH ve vodě, složka B: acetonitril s 0,1% HCOOH (v/v)

složka A (%) 100 100 55 10 10 100

složka B (%) 0 0 45 90 90 0

průtok (ml/min) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,20

složka A: 0,1% HCOOH ve vodě, složka B: methanol s 0,1% HCOOH (v/v)

(a)

(b)

Obr. 12: Chromatogramy separace modelové směsi gradientovou elucí s (a) acetonitrilem (b) methanolem; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál).

25

Zejména bylo dosaženo zlepšení separace kyseliny kávové od směsného píku kyseliny vanilové a katechinu a lepšího tvaru základní linie. Nevýhodou použití methanolu je difúznější tvar píků, obzvláště u kvercetinu. Odezvu kyseliny hippurové je možné zvýšit změnou vlnové délky na 280 nm. U kolony Kinetex C18 s povrchově porézní stacionární fází byly během analýz pozorovány poměrně vysoké zpětné tlaky během gradientové eluce i horší opakovatelnost retenčních časů v porovnání s běžnými stacionárními fázemi. Proto byl testován i zástupce plně porézních sorbentů od stejného výrobce (Gemini C18) a výsledky jsou diskutovány v následující kapitole.

4.1.2 Gemini C18 Použitím výše zmíněných složek mobilní fáze a grad.2 bylo dosaženo stejného elučního pořadí analytů jako na koloně Kinetex C18 (Obr. 13 a) s lepší reprodukovatelností retenčních časů a nižšími zpětnými tlaky, avšak s horší účinností separace a horším tvarem píků (chvostování). I u této kolony nabízí methanol ve složce B mobilní fáze lepší selektivitu než acetonitril. Úpravou gradientu a zvýšením průtoku MF (Tab. 7) bylo možno analýzu zkrátit o 10 minut (Obr. 13 b). Tab. 7: Schéma gradientové eluce (Gemini C18), průtok 0,4 ml/min čas (min) složka A (%) složka B (%) 0 100 0 3 100 0 23 10 90 35 10 90 40 100 0 složka A: 0,1% HCOOH ve vodě, složka B: methanol s 0,1% HCOOH (v/v)

(a)

(b)

Obr. 13: Chromatogram analýzy modelové směsi grad. elucí s průtokem (a) 0,25 ml a (b) 0,4 ml/min; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál). Porovnání chování obou testovaných kolon lze tedy shrnout takto: Kolona Kinetex C18 s povrchově porézními částicemi o velikosti průměru 2.6 µm poskytuje vyšší účinnost, je

26

však nutno počítat s výrazně vyššími zpětnými tlaky a horší reprodukovatelností retenčních časů. Kolona Gemini C18 s celoporézním sorbentem o velikosti částic 5 µm dovoluje práci za nižších zpětných tlaků a umožňuje výrazné zkrácení analýzy. Opakovatelnost retenčních časů je lepší. Bylo pozorováno chvostování píků a nižší účinnost separace související s větším průměrem částic sorbentu. Ani u jedné z kolon s reverzní fází se nepodařilo, s využitím jednoduchých (generických) mobilních fází separovat kritický pár kyselina vanilová-katechin. Potenciál k separaci všech složek této modelové směsi, včetně kritického páru, představuje gradientová eluce (průtok 0,45 ml/min), jež tvořena složkami A = 5 mM octan amonný (pH 3, upraveno kys. mravenčí) a B = složka A:acetonitril (1:2) a s profilem gradientu: 0 - 27 min 98% A izokraticky; 27 - 72 min 98% - 93% A, nakonec promývání a reekvilibrace kolony36. Další možností je využití gradientové eluce (průtok 0,46 ml/min) s mobilními fázemi A = methanol/voda (0,2% kys. octová; pH 3) 10:90 a B = methanol/voda (0,2% kys. octová; pH 3,4) 90:10 a profilem gradientu: 0 - 30 min 100% A; 30 - 60 min 85% 50% A; 60 - 62 min 50% - 100% A37.

4.2 Systém normálních fází Práce v tomto systému byla nejnáročnější z hlediska nalezení vhodných komponent mobilní fáze (mísitelnost složek a jejich těkavost, absorpce v UV oblasti spektra atd.). Dalším problémem byla rozpustnost analytů v nevodných a málo polárních rozpouštědlech, obzvláště rutinu. V neposlední řadě bylo problematické spojení systému NP s hmotnostní detekcí, jejíž detailní optimalizace však nebyla náplní této práce.

4.2.1 Pinnacle DB Silica Pro ověření kvality a parametrů této kolony byla otestována směs anisolu, ethyl- a methylesteru kyseliny benzoové s mobilní fází hexan-methanol = 96:4 (Obr. 14). Všechny tři složky byly separovány a poskytují symetrické píky. Kvalita kolony byla tedy dostatečná pro následné studium retence směsi fytochemikálií. Prvním úkolem bylo prostudovat retenci katechinu, která v mobilní fázi hexanmethanol = 96:4 byla příliš velká a pík nebyl pozorován. Efektivní zvýšení eluční síly jednoduše změnou poměru hexanu a methanolu nebylo možné z důvodu omezené vzájemné mísitelnosti těchto složek (maximální možný obsah methanolu v hexanu je 4%38).

27

Obr. 14: Chromatogram separace anisolu, ethyl- a methylesteru kyseliny benzoové; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál). Mísitelnost hexanu se zlepšuje se zvyšující se délkou alkylového řetězce použitého alkoholu. 2-propanol je mísitelný s hexanem ve všech poměrech a v dalších experimentech byl použit místo methanolu. Mobilní fáze obsahující směs 2-propanolu s hexanem (0, 25, 50 a 80% hexanu, v/v) má příliš malou eluční sílu na vytěsnění katechinu, jelikož nebyl pozorován pík ani v mrtvém čas, ani při půlhodinové analýze. Proto byl 2-propanol okyselen kyselinou octovou (2%, v/v). Kyselá mobilní fáze posouvá rovnováhu protolytických forem katechinu směrem k nenabité a méně polární formě. Protonizovaná forma má potom v systému normálních fází velmi malou retenci. S rostoucím obsahem hexanu je sice možno retenci katechinu mírně zvýšit, avšak dochází rovněž k většímu chvostování a rozšiřování píku (Obr. 15). Tento jev je možné vysvětlit snižováním celkové koncentrace kyseliny octové v důsledku přimíchávání neokyseleného hexanu.

Obr. 15: Překrytí chromatogramů analýz katechinu při různých poměrech hexanu a okyseleného 2-propanolu v mobilní fázi (280 nm). Z tohoto důvodu bylo další úpravou předmíchání a okyselení MF na konečnou koncentraci kyseliny octové 2% (v/v). Jelikož katechin měl největší retenci v MF obsahující 60% hexanu a 40% 2-propanolu, byla tato směs testována jako první. Jako další byl testován 70% hexan s 30% 2-propanolu (Obr. 16).

28

Obr. 16: Překrytí chromatogramů analýz katechinu při různých poměrech hexanu a 2propanolu v okyselené mobilní fázi (280 nm). Nejlepších výsledků je dosaženo s mobilní fází hexan:2-propanol:kyselina octová 65:35:2. Zvýšením koncentrace kyseliny octové nedochází ke zvýšení retence ani zlepšení tvaru píku katechinu (Obr. 17).

Obr. 17: Překrytí chromatogramů analýz katechinu v mobilní fázi hexan a 2-propanol obsahující 4 a 6% (v/v) kyseliny octové (280 nm). Doposud nejlepší dosažené podmínky retence byly obdrženy při použití MF obsahující hexan, methanol a ethylacetát. Tento typ MF byl převzat z literatury39. Jelikož obě neutrální mobilní fáze (hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 a 2:3:1) neměly dostatečnou eluční sílu a pík katechinu nebyl pozorován, bylo další úpravou okyselení na konečnou koncentraci 2% (v/v) kyseliny octové (Obr. 18).

29

Obr. 18: Překrytí chromatogramů analýz katechinu hexan:methanol:ethylacetát 2:3:1 a 8:3:1 (280 nm).

v okyselené

mobilní

fázi

V této mobilní fázi byl studován každý ze standardů samostatně a separace modelové směsi nebyla realizována. Jelikož píky analytů velmi chvostovaly a navíc píky kyselin 4-hydroxybenzoové, hippurové a vanilové byly rozštěpeny, zvolila jsem jako další úpravu okyselení MF silnější kyselinou, a to 0,12% TFA (v/v). V této mobilní fázi byly analyzovány jednotlivé analyty samostatně i ve směsi (Obr. 19). Kvercetin nebyl v tomto systému detekovaný.

Obr. 19: Chromatogram separace modelové směsi v MF hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 s 0,12% TFA; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál). Dále byly sledovány změny v retenci analytů při zvyšování obsahu TFA v mobilní fázi (0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% a 0,6%; v/v). Retenční časy i tvary píků jsou bez větších změn, kromě píku rutinu (Obr. 20).

30

Obr. 20: Chromatogram separace modelové směsi v MF hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 s různým obsahem TFA (280 nm). Pro porovnání změn retence a tvarů píků byly využity tyto parametry: retenční čas (tR), redukovaný retenční čas (t´R), relativní retence (r1,2) – vztažena ke kyselině kávové, šířka v polovině výšky píku (w0,5), asymetrie (AS), účinnost (n) a rozlišení (R1,2) (Tab. 8). Tab. 8: Hodnoty charakteristik píků analytů

0,12% TFA

0,2% TFA

0,3% TFA

0,4% TFA

analyt 4-hydroxybenz. k. vanilová k. hippurová k. kavová k. gallová k. katechin rutin 4-hydroxybenz. k. vanilová k. hippurová k. kavová k. gallová k. katechin rutin 4-hydroxybenz. k. vanilová k. hippurová k. kavová k. gallová k. katechin rutin 4-hydroxybenz. k. vanilová k. hippurová k. kavová k. gallová k. katechin

tR 2,80 2,93 3,08 3,22 3,77 4,57 9,00 2,80 2,92 3,10 3,20 3,75 4,52 8,47 2,78 2,92 3,08 3,20 3,73 4,50 7,38 2,78 2,90 3,07 3,18 3,72 4,47

t´R 0,62 0,75 0,90 1,03 1,58 2,38 6,82 0,67 0,78 0,97 1,07 1,62 2,38 6,33 0,63 0,77 0,93 1,05 1,58 2,35 5,23 0,62 0,73 0,90 1,02 1,55 2,30

31

r1,2 0,60 0,73 0,87 1,00 1,53 2,31 6,59 0,63 0,73 0,91 1,00 1,52 2,23 5,94 0,60 0,73 0,89 1,00 1,51 2,24 4,98 0,61 0,72 0,89 1,00 1,53 2,26

w0,5 0,07 0,12 0,13 0,17 0,20 0,12 3,20 0,07 0,13 0,13 0,17 0,17 0,12 2,40 0,07 0,13 0,10 0,18 0,17 0,13 1,80 0,07 0,12 0,12 0,18 0,15 0,12

AS 0,50 0,50 0,67 4,25 3,14 1,00 1,57 0,50 1,00 0,50 5,33 2,67 1,33 1,47 0,50 0,67 0,33 2,00 1,83 1,00 1,44 0,50 0,80 0,33 2,40 1,43 1,17

n 9773 3502 2963 2064 1965 8488 44 9773 2651 2995 2042 2805 8303 69 9657 2651 5267 1688 2780 6310 93 9657 3423 3828 1670 3401 8121

R1,2 0,86 0,71 0,52 1,77 2,98 1,58 0,69 0,81 0,39 1,95 3,19 1,85 0,79 0,84 0,49 1,80 3,02 1,76 0,75 0,84 0,46 1,89 3,32

Pokračování Tab. 8: Hodnoty charakteristik píků analytů

0,4% TFA

0,5% TFA

0,6% TFA

analyt

tR

t´R

r1,2

w0,5

AS

n

R1,2

rutin 4-hydroxybenz. k. vanilová k. hippurová k. kavová k. gallová k. katechin rutin 4-hydroxybenz. k. vanilová k. hippurová k. kavová k. gallová k. katechin rutin

6,63 2,77 2,90 3,05 3,17 3,68 4,45 5,90 2,77 2,88 3,03 3,13 3,65 4,42 5,10

4,47 0,62 0,75 0,90 1,02 1,53 2,30 3,75 0,63 0,75 0,90 1,00 1,52 2,28 2,97

4,40 0,61 0,74 0,88 1,00 1,51 2,26 3,69 0,63 0,75 0,90 1,00 1,52 2,28 2,97

1,63 0,07 0,13 0,10 0,17 0,15 0,12 1,45 0,07 0,13 0,12 0,17 0,15 0,13 1,30

1,43 0,50 0,67 0,40 2,20 1,38 1,00 1,71 0,50 0,80 0,40 3,00 1,67 1,29 3,47

91 9541 2621 5154 2000 3340 8060 92 9541 2591 3745 1958 3280 6079 85

1,46 0,79 0,76 0,52 1,93 3,39 1,09 0,69 0,71 0,42 1,93 3,19 0,56

Z výše uvedených hodnot vyplývá, že nejlepší podmínky separace byly dosaženy, při obsahu TFA 0,5%. Analýzy s obsahem 0,3% a 0,5% TFA byly zopakovány po roce. Analýza s 0,3% TFA se s původní (loňskou) shodovala v retenčních časech, zvýšená odezva signálů byla způsobena zvýšením koncentrací analytů (Obr. 21). Ekvilibrace kolony byla prováděna přes noc nižším průtokem, který po přepočtení odpovídal tříhodinové ekvilibraci průtokem 1 ml/min. Opakované experimenty se shodnými retenčními časy prokázaly dostatečné ustálení rovnováhy na koloně.

Obr. 21: Porovnání chromatogramů analýz modelové směsi v MF s 0,3% TFA po 1 roce, kde jsou původní analýza (černý záznam) a opakovaná analýza (zelený záznam). Při analýzách s MF obsahující 0,5% TFA bylo prokázáno zdlouhavé ustalování rovnováhy na normálních fázích. Po 30-ti minutové ekvilibraci kolony se analýza shodovala s původní v retenčních časech (před rokem, Obr 22 a), ale během dalších 3 analýz v této MF došlo ke zlepšení tvaru píku rutinu (Obr. 22 b). Zvýšení odezvy je opět způsobeno zvýšením koncentrace analytů.

32

(a)

(b)

Obr. 22: Porovnání chromatogramů analýz modelové směsi v MF s 0,5% TFA po 1 roce (a) neustálená a (b) ustálená rovnováha na koloně, kde jsou původní analýza (černý záznam) a opakovaná analýza (zelený záznam). Z důvodu špatného rozlišení píků na začátku analýzy, bylo logickým krokem zvyšování retence snížením eluční síly MF, a to snížením obsahu methanolu. Nutné bylo ověřit rozpustnost analytů ve směsích hexan:methanol:ethylacetát v poměru 8:2:1, 8:1:1 a 8:0:1 s 0,5% TFA (v/v). Největší problémy byly s rozpustností rutinu, který se srážel již ve směsi hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 s 0,5% TFA. Izokratická analýza ve směsi hexan:methanol:ethylacetát 8:2:1 s 0,5% TFA potvrdila, že snižování methanolu zlepšuje rozlišení píků na počátku analýzy (Obr. 23 a). Z předchozích výsledků byla navržena gradientová eluce, jejíž schéma je uvedeno v tabulce 9 a chromatogram na obrázku 23 b. Tab. 9: Schéma gradientové eluce pro Pinnacle DB Silica čas (min) složka A (%) složka B (%) 0 100 0 2 100 0 4 0 100 10 0 100 12 100 0 složka A: hexan:methanol:ethylacetát 8:2:1 s 0,5% TFA, složka B: hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 s 0,5% TFA

(a)

(b)

Obr. 23: Chromatogram analýzy modelové směsi (a) izokratickou elucí v MF hexan:methanol:ethylacetát 8:2:1 s 0,5% TFA (v/v) a (b) gradientovou elucí (Tab. 9); detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál).

33

Pozitivem této gradientové oproti izokratické eluci je kratší retenční čas a lepší tvar píku rutinu. Protože rozlišení kyselin 4-hydroxybenzoové, vanilové a hippurové není v těchto mobilních fázích dosaženo, byla snaha dále snížit eluční sílu mobilní fáze. Tyto kyseliny nejsou rozpustné ve směsi hexan:methanol:ethylacetát v poměru 8:0,5:1 (s 0,5% TFA), proto nebylo možno dále pokračovat v optimalizaci dalším snižováním obsahu methanolu. Nejlepších možných podmínek separace bylo dosaženo pomocí gradientu (Tab. 10), který začínal směsí hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 s 0,5% TFA. Jak bylo uvedeno, ve směsi hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 s 0,5% TFA není rozpustný rutin. Rychlá výměna složek mobilní fáze ve třetí minutě (rychlé zvýšení obsahu methanolu) umožňuje použití této mobilní fáze, nicméně silné chvostování rutinu může souviset s krátkodobým vysrážením rutinu ve stacionární fázi. Po dostatečném promytí však nebyl rutin pozorován v následující analýze. Chromatogram této gradientové eluce je na obrázku 24. Tab. 10: Schéma gradientové eluce pro Pinnacle DB Silica čas (min) složka A (%) složka B (%) 0 100 0 3 100 0 3,5 0 100 13 0 100 15 100 0 složka A: hexan-methanol-ethylacetát = 8:1:1 s 0,5% TFA, složka B: hexan-methanol-ethylacetát = 8:3:1 s 0,5% TFA

Obr. 24: Chromatogram optimalizované analýzy modelové směsi gradientovou elucí (Tab. 10); detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál). Identifikace jednotlivých analytů byla realizována standardními přídavky. Identifikace pomocí hmotnostního spektrometru byla možná, ale problematická byla detekce kyseliny 4-hydroxybenzoové, vanilové a katechinu z důvodu vysokého pozadí (tyto kyseliny mohly být

34

detekovány až na koncentrační úrovni 200 mg/l). MS detekci je možno zlepšit zmenšením izolační šířky z 1 Da na 0,06 Da při rekonstrukci chromatogramu pro danou hodnotu m/z. Do budoucna by mohlo být dosaženo zlepšení signálu přimícháváním methanolu do eluátu za kolonou (před jeho vstupem do iontového zdroje). Výsledky ukazují, že i přes pečlivou optimalizaci složení mobilní fáze nelze v systému "klasických" normálních fází (s použitím běžných bezvodých mobilních fází) dosáhnout separace všech složek směsi na základní linii. Za povšimnutí stojí i rozštěpení píku kyseliny kávové, který bude diskutován v dalších kapitolách. Studovaný systém normálních fází dovoluje separaci páru kyseliny vanilové a katechinu na základní linii během devíti minut.

4.3 Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Byly testovány dvě kolony určené pro separace v HILIC systému: LUNA 3u HILIC 200 A (150 x 2,0 mm, Phenomenex) a TSKgel Amide-80, 3 µm (150 x 2,0 mm, TOSOH Bioscience). Optimalizace metody analýzy probíhala na každé koloně samostatně, přesto nejlepších výsledků bylo dosaženo při analogických podmínkách. Je zajímavé, že i eluční pořadí analytů bylo stejné přes výrazné odlišnosti v chemické povaze stacionárních fází. V případě kolony TSKgel Amide-80 je volba pH mobilní fáze limitována stabilitou stacionární fáze, jejíž doporučené rozmezí pH je 2 - 7. Poněkud širší rozmezí nabízí kolona LUNA HILIC (pracovní pH 2 – 8). Práce v tomto systému fází byla zprvu nezvyklá a výrazně odlišná od běžně používané reverzní fáze. Eluční síla solventů je opačná než v systému RP, a tudíž se pracuje s malým obsahem vody na počátku gradientu. Pro vyšší retenci polárních analytů je třeba udržovat látky v disociované formě, a proto je třeba pracovat s kyselinami v oblastech pH vyšších než je jejich hodnota pK. Z malého obsahu vody v mobilní fázi vyplývá další problém, a tím je omezená rozpustnost pufrů v organických rozpouštědlech. Nedaří se rozpustit více než 12,5 mmol octanu amonného v 1 litru směsi 95% acetonitrilu s vodou. Nicméně dostatečná retence analytů i stabilita jejich retenčních časů naznačují, že tato koncentrace pufru pro daný chromatografický systém postačuje. V případě potřeby je možno nahradit acetonitril methanolem. Bylo ale experimentálně ověřeno, že optimální směs methanolu a vody má vysokou viskozitu a při použití běžných průtoků se zpětné tlaky přibližují tlakovým limitům testovaných kolon. Ustalování rovnováhy na polárních stacionárních fázích bylo zdlouhavější než u RP. Na druhou stranu, díky velkému obsahu acetonitrilu (či methanolu) v mobilní fázi, je snadné spojení s hmotnostním spektrometrem nebo využití těchto fází v preparativní kapalinové chromatografii, kdy je nutné velkou část rozpouštědel odpařit.

35

4.3.1 LUNA HILIC Jak bylo popsáno v teoretické části, v kolonách LUNA HILIC se tvoří na povrchu silikagelu polární vrstva s vysokým obsahem vody. Ta usnadňuje transfer polárních látek do stacionární fáze a takto je dosahováno jejich zvýšené retence. Separace je dosahováno rozdělováním analytů z organické mobilní fáze do hydrofilního prostředí a retence roste s jejich rostoucí hydrofilitou. Jako první byla studována retence neutrálních a nepufrovaných mobilních fází, a to směsi 90%, 95%, 97% a 98% (v/v) acetonitrilu s deionizovanou vodou. Nejlepší separace byla pozorována při práci se směsí 98% (v/v) acetonitrilu s vodou (Obr. 25 a). Při směšování komponent mobilních fází manažerem kapalinového chromatografu nedochází

k

dostatečně

stabilnímu

míchání

a

jednotlivé

analýzy

jsou

obtížně

reprodukovatelné. Proto byla tato i všechny následující mobilní fáze připraveny navážením a předmícháním acetonitrilu s vodou. Okyselením 98% acetonitrilu 0,12% TFA (v/v) došlo ke zkrácení retence látek a ke zvýšení účinnosti píků (Obr. 25 b). Obzvláště u kyseliny galové je pík symetričtější a výrazně méně chvostuje, což je v souladu s předpokládanou teorií: TFA je silná kyselina, která zajistí převahu protonizované formy fenolických kyselin. Naproti tomu v neutrálním prostředí mohou vedle sebe být přítomny forma disociovaná i protonizovaná, což se projeví rozmytím či rozštěpením píku a zvýšením retence. Rozštěpení píku kyseliny kávové by mohlo být způsobené částečnou separací jejích cistrans izomerů. Retenční chování kyseliny kávové na nemodifikovaném silikagelu je zajímavým námětem pro další studii.

(a)

(b)

Obr. 25: Chromatogram separace látek modelové směsi (a) v 98% acetonitrilu a (b) v 98% acetonitrilu s 0,12% TFA; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál). Další možnou úpravou mobilní fáze je přídavek vhodného pufru s hodnotou pH vyšším, než odpovídá disociačním konstantám studovaných kyselin. Tím je zajištěna přítomnost nabitých forem těchto kyselin a dochází ke zvýšení retence. Volba pH vycházela ze stability stacionární fáze této kolony a z hodnot pK analytů (Tab. 11). Dostatečné pH pro udržení disociovaných kyselin je pH 5,63 (požadavek na pH ≥ pK + 1,5 pro sledované

36

karboxylové kyseliny). Pro dostatečnou disociaci katechinu a kvercetinu alespoň do prvního stupně by bylo potřeba pH 9,36, které není použitelné z důvodu rozpouštění stacionární fáze v takto alkalickém prostředí. Nejvyšší pH, při kterém bylo měření realizováno, je pH 7. Z důvodu porovnání chování obou HILIC kolon za identických podmínek byly provedeny analýzy i při pH 6 (Obr. 26). Porovnání chromatogramů analýz při pH 6 a 7 v 95% acetonitrilu je na obrázku 27. Tab. 11: Hodnoty disociačních konstant analytů

Kyseliny

Průměr

analyt 40 kávová 40 galová 40 4-hydroxybenzoová 40 vanilová 15 hippurová 41 katechin 41 kvercetin celkový katechin a kvercetin bez katechinu a kvercetinu

(a)

pK1 4,48 4,24 4,22 4,04 3,70 8,68 7,10 5,20 7,89 4,13

pK2

pK3

9,70 9,09 9,40 9,40

11,55 11,12 11,34 11,34

(b)

(c) Obr. 26: Chromatogramy separace modelové směsi (a) v 95%, (b) v 90% a (c) v 80% acetonitrilu obsahující pufr (pH6); detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál).

37

V pufrovaných mobilních fázích se změnilo eluční pořadí analytů, jelikož se zvýšila retence všech kyselin, kdežto retenční časy kvercetinu a katechinu zůstaly stejné. V 95% acetonitrilu obsahující pufr byl pík kvercetinu málo účinný a retence kyseliny galové a kávové tak velká, že jejich píky byly rozmyty (nebyly pozorovány). Retence zvláště těchto dvou kyselin se rapidně snížila již v 90% acetonitrilu obsahující pufr. Příkladem obrovského nárůstu eluční síly 90% acetonitrilu obsahující pufr může být retenční čas kyseliny hippurové, který se snížil na 6 minut, přičemž v 95% acetonitrilu obsahující pufr byl 20 minut. Analýza s mobilní fází obsahující směs acetonitrilu a pufru 80:20 poskytla nejlepší dosažený tvar píků analytů a došlo již ke koeluci kyseliny 4-hydroxybenzoové, vanilové a hippurové, které byly částečně separovány ve směsi acetonitril:pufr 90:10.

Obr. 27: Porovnání analýz modelové směsi v 95% acetonitrilu při pH 6 (černý záznam) a pH 7 (zelený záznam) při (210 nm). V tomto systému obecně platí, že retence kyselin roste spolu s rostoucím pH mobilní fáze. Tento předpoklad dokazuje analýza modelové směsi při pH 6 a 7 (Obr. 27), i přestože pH 6 je dostačující pro úplnou disociaci kyseliny vanilové, 4-hydroxybenzoové a hippurové. S vyšším pH může docházet ke změnám vlastností inkorporované vrstvičky vody na povrchu silikagelu, a to ke zvýšení jejího „pH“, případně se zde mohou uplatňovat další interakce kyselin s povrchem silikagelu. Z výše uvedených poznatků získaných při izokratických analýzách při pH 6 byla navržena gradientová eluce (Tab. 12), která zaručila dostatečnou separaci látek modelové směsi (Obr. 28). Tab. 12: Schéma gradientové eluce pro LUNA HILIC čas (min) složka A (%) složka B (%) 0 100 0 10 100 0 17 0 100 25 0 100 27 100 0 složka A: 95% acetonitril s 5% 250 mM - octanem amonným (pH 6), složka B: 80% acetonitril s 20% 62,5 mM - octanem amonným (pH 6 )

38

Obr. 28: Chromatogram optimalizované gradientové eluce pro LUNA HILIC; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál). Nárůst absorbance v tomto gradientu při 210 nm je pravděpodobně způsoben změnou absorbance acetátu v různých prostředích. Pro identifikaci látek směsi byla použita MS detekce. Chromatogram (Obr. 29) byl získán překrytím jednotlivých chromatogramů rekonstruovaných pro příslušné hodnoty m/z. MS analýza potvrzuje, že pík eluující mezi kvercetinem a katechinem má stejnou hodnotu m/z jako kvercetin. Vzhledem ke struktuře kvercetinu lze v tomto případě uvažovat o látce ke kvercetinu izomerní.

Obr. 29: Chromatogram optimalizované gradientové eluce pro LUNA HILIC (MS detekce).

4.3.2 TSKgel Amide-80 Stacionární fáze TSKgel Amide-80 je, jak bylo uvedeno v teoretické části, tvořena sférickým silikagelem, na kterém je kovalentně navázána karbamoylová skupina. Výrobce kolony uvádí27, že i tato fáze vytváří na svém povrchu stagnantní vrstvičku bohatou na vodu. Stejně jako u kolony LUNA HILIC by tato fáze měla umožňovat hydrofilní interakce. První testovaná mobilní fáze byla tvořena směsí 90% acetonitrilu (Obr. 30 a), resp. 95% acetonitrilu (Obr. 30 b) s deionizovanou vodou. Ze zkušeností s předcházející HILIC kolonou

39

byla mobilní fáze opět navážena a předmíchána, což vedlo k dostatečné opakovatelnosti retence i tvaru píku. Zobrazené chromatogramy u obou analýz (černý a červený záznam) odpovídají dvěma po sobě jdoucím analýzám (Obr. 30 a, b).

(a)

(b)

Obr. 30: Chromatogramy separace modelové směsi (a) v 95%, (b) v 90% acetonitrilu.

Zvýšení obsahu acetonitrilu v MF o pouhých 5% významně zvyšuje retenci analytů. Důkazem je například katechin, který má retenční čas v 90% acetonitrilu 3,6 minuty a v 95% acetonitrilu již 6 minut. Jelikož se jedná o nepufrované mobilní fáze, pozorujeme výrazné chvostování píků, především u kyseliny galové a kávové. Dále již byly testovány mobilní fáze s upraveným pH, tedy obsahující octan amonný o pH 6 s přídavkem 80%, 90% a 95% acetonitrilu. Pufrováním mobilní fáze se zvýšila retence analytů a změnilo se jejich eluční pořadí. Při práci se směsí 95% acetonitrilu s pufrem o pH=6 (Obr. 31 a) byla retence látek příliš veliká. Dochází k rozmytí a chvostování píků (především kvercetinu a katechinu). V porovnání s kolonou LUNA HILIC je retence zejména kyseliny galové a kávové tak velká, že jejich píky nebyly pozorovány (přílišné rozmytí). Zvýšením eluční síly mobilní fáze (použití 90% acetonitrilu obsahujícího pufr, Obr. 31 b) dochází k významnému snížení retence, kde je již pozorovatelný pík kyseliny kávové. Spolu s klesajícím obsahem acetonitrilu v mobilní fázi se zlepšuje tvar píků, chvostování však přetrvává. Píky kyselin vanilové, 4-hydroxybenzoové a hippurové jsou symetrické (faktor symetrie se pohybuje v rozmezí od 0,860 do 1,226). Dostatečnou eluční silou pro vymytí kyseliny kávové a galové ze stacionární fáze disponuje 80% acetonitril obsahující pufr (Obr. 31 c).

40

(a)

(b)

(c) Obr. 31: Chromatogramy separace modelové směsi (a) v 95%, (b) v 90% a (c) v 80% acetonitrilu obsahující pufr (pH 6); detekce při 210 nm (černý sig.) a při 280 nm (zelený sig.). Z výše uvedených poznatků bylo možné navrhnout profil gradientu (Tab. 13), který zaručil dostatečnou separaci látek modelové směsi (Obr. 32). Tab. 13: Schéma gradientové eluce pro TSKgel Amide-80 Čas (min) složka A (%) složka B (%) 0 90 10 9 90 10 11 0 100 27 0 100 28 90 10 složka A: 95% acetonitril s 5% 250 mM - octanem amonným (pH 6) složka B: 80% acetonitril s 20% 62,5 mM - octanem amonným (pH 6 )

Obr. 32: Chromatogram optimalizované gradientové eluce pro TSKgel Amide-80; detekce při 210 nm (černý signál) a při 280 nm (zelený signál).

41

Nárůst absorbance v tomto gradientu při 210 nm je pravděpodobně opět způsoben změnou absorbance acetátu v různých prostředích. Pro identifikaci látek směsi byla dále použita hmotnostní detekce. Chromatogram (Obr. 33) byl sestaven překrytím jednotlivých rekonstruovaných chromatogramů při odpovídajících hodnotách m/z. Na tomto záznamu je patrné rozštěpení píků kyseliny kávové a galové.

Obr. 33: Chromatogram optimalizované gradientové eluce pro TSKgel Amide-80 (MS detekce).

4.3.3 Porovnání LUNA HILIC a TSKgel Amide-80 Kolona TSKgel v analogických podmínkách způsobuje větší retenci studovaných látek než kolona LUNA HILIC. To dobře demonstrují obrázky 34 a-c, na kterých jsou zobrazena porovnání retence na obou typech sorbentů (každý obrázek ukazuje analýzu na obou kolonách). V 95% acetonitrilu obsahujícím pufr o pH 6 (Obr. 34 a) je retence látek taková, že u kolony TSKgel dochází k velkému rozmytí píků (kyselina galová a kávová nebyly pozorovány) a analýza trvala 60 minut (3krát delší než analýza na koloně LUNA HILIC). Při analýze v 90% acetonitrilu obsahujícím pufr o pH 6 (Obr. 34 b) je na koloně TSKgel rozlišení píků kyseliny vanilové, 4-hydroxybenzoové a hippurové ještě dostatečné, kdežto u kolony LUNA HILIC je rozlišení výrazně horší. Retence látek v tomto systému již není tak velká, proto i rozmytí píků je menší. U kolony LUNA HILIC má 90% acetonitril dostatečnou eluční sílu pro vymytí kyseliny kávové, ale ne pro kyselinu galovou. U kolony TSKgel kyselina kávová ani galová nejsou pozorovány. V 80% acetonitrilu obsahující pufr o pH 6 (Obr. 34 c) nejsou již rozdíly v retenci látek u obou kolon tak markantní, i přesto kolona TSKgel poskytuje lepší rozlišení píků, především u kyseliny kávové a píku koeulujících kyselin (vanilová, 4-hydroxybenzoová a hippurová). Za povšimnutí stojí velmi podobný tvar píku kyseliny galové v obou chromatografických systémech (Obr. 34 c).

42

(a)

(b)

(c) Obr. 34: Porovnání izokratických analýz na HILIC kolonách (a) v 95%, (b) v 90% a (c) v 80% acetonitrilu obsahující pufr (pH 6) při 210 nm. Černý záznam přísluší koloně TSKgel a červený záznam koloně LUNA HILIC. Větší retenci v pufrované mobilní fázi u kolony TSKgel Amide 80 je možno vysvětlit jednak hydrofobními interakcemi alkylového můstku připojujícího karbamoylovou skupinu k povrchu silikagelu a interakcí s karbamoylovou skupinou samotnou. Vedle toho je možno uvažovat i větší repulzi aniontů kyselin od záporně se nabíjejícího povrchu silikagelu u LUNA HILIC oproti fázi TSKgel Amide 80 (rozsáhlejší disociace silanolových skupin na povrchu nemodifikovaného silikagelu).

43

5 Závěr Hlavní náplní předkládané diplomové práce bylo studium retence vybraných fytochemikálií a metabolitů na polárních stacionárních fázích a získané výsledky porovnat s reverzní fází, jež má v současnosti nejširší použití. Podmínky separace byly studovány u čtyř různých typů kolon: nemodifikovaný silikagel v systému normálních fází a v HILIC systému, HILIC fáze s navázanou karbamoylovou skupinou a reverzní fáze (C18). V teoretické části je stručně popsána biosyntéza a funkce fytochemikálií a jejich význam pro lidský organismus, konkrétně fenolických kyselin a polyfenolických látek a produktů jejich biotransformace živočišnou buňkou. Dále jsou v teoretické části popsány používané stacionární fáze a mechanismy, které jsou uplatňovány při retenci látek. Byla testována nová kolona s reverzní fází Kinetex C18, která se vyznačuje vysokou účinností, díky povrchově porézním částicím o průměru 2,6 µm. U této fáze nebylo s využitím generických mobilních fází dosaženo separace kyseliny vanilové a katechinu. Stejný výsledek, při zachování podmínek, jsme obdrželi i na koloně Gemini C18 naplněné běžnějším celoporézním sorbentem (průměr částic 5 µm), se kterou byla kolona Kinetex C18 porovnávána. Při práci na koloně Kinetex C18 (2,1 mm vnitřního průměru) byly pozorovány poměrně vysoké zpětné tlaky už při průtoku 250 µl.min-1. Ve studovaném systému mobilních fází nebylo možno na koloně Kinetex C18 dosáhnout retenčních časů srovnatelných s optimalizovanými analýzami na koloně Gemini C18 (se stejným vnitřním průměrem). Podle předpokladů byly pozorovány nižší zpětné tlaky u kolony Gemini C18, kde díky zvýšením průtoku bylo možné analýzu zkrátit o 10 minut. U HILIC kolon docházelo k nárůstu retence i selektivity spolu s nárůstem obsahu nepolární složky mobilní fáze (acetonitrilu). Nejlepší separace na obou HILIC kolonách byly dosaženy v pufrovaných mobilních fázích. Kolona TSKgel Amide-80 vykazovala větší retenci látek při stejných izokratických podmínkách (acetonitril obsahující octanový pufr, pH 6) oproti koloně LUNA HILIC. Tento jev je možné vysvětlit interakcí analytů s karbamoylovou skupinou či s alkylovým řetězcem spojující silikagel s touto funkční skupinou. Obě HILIC fáze poskytly stejné eluční pořadí látek. Optimální složení mobilní fáze pro obě kolony je následující: složka A = acetonitril:octanový pufr (pH 6) 95:5, složka B = acetonitril:octanový pufr (pH 6) 80:20. Optimálních výsledků lze dosáhnout úpravou profilu gradientu. Bylo rovněž zjištěno, že retentivita studovaných látek je vyšší u kolony TSKgel Amide-80. U všech studovaných HILIC fází bylo optimalizací dosaženo separace všech komponent modelové směsi (včetně páru kyselina vanilová-katechin). Obrovskou výhodou HILIC systémů oproti nemodifikovanému silikagelu v běžném systému normálních fází (použití bezvodých

44

mobilních fází na bázi směsí hexan-methanol-ethylacetát) bylo bezproblémové spojení s hmotnostním spektrometrem Kolona Pinnacle DB Silica (nemodifikovaný silikagel použitý v bezvodých mobilních fázích) způsobovala eluci sledovaných látek modelové směsi v jiném pořadí než LUNA HILIC. Přestože jde v případě obou kolon o nemodifikovaný silikagel, je patrné, že přítomnost relativně malého obsahu vody způsobuje změny v selektivitě (klíčovou roli hraje právě inkorporovaná vrstvička vody v HILIC systému). Zde se nabízí otázka otevírající pole pro další experimenty, zda je možné běžné silikagelové kolony používat v HILIC systému pouhým přídavkem vody do mobilní fáze. Problematické bylo, vzhledem k testovaným mobilním fázím, spojení kolony Pinnacle DB Silica s hmotnostním spektrometrem. MS detekce byla možná, ale v budoucnu bude nutná její optimalizace. Přimíchávání methanolu za kolonu, před vstupem eluentu do iontového zdroje, by mohlo být vhodným řešením.

45

6 Použitá literatura 1

Macholán L.: Sekundární metabolity, Masarykova universita v Brně, Brno 2002.

2

Rodgman A., Perfetti T.A.: The chemical components of tobacco and tobacco smoke, Taylor & Francis Group, LLC, Boca Raton 2009.

3

Robards K.: J. Chromatogr. A 1000, 657 (2003).

4

Yang M., Sun J., Lu Z., Chen G., Guan S., Liu X., Jiang B., Ye M., Guo D.: J. Chromatogr. A 1216, 2045 (2009).

5

Tsao R., Deng Z.: J. Chromatogr. B 812, 85 (2004).

6

Keher J.P.: Critic. Rev. Toxicol. 23, 21 (1993).

7

Clarke C.F.: Protoplasma 213, 134 (2000).

8

Crozier A., Jaganath I.B., Clifford M.N.: Nat. Prod. Rep. 26, 1001 (2009).

9

Hwang S.I., Yen G.C.: J. Agric. Food Chem. 56, 859 (2008).

10

Cai L., Wang H., Li Q., Qian Y., Yao W.: Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai) 40, 796 (2008).

11

Shahidi F., Chandrasekara A.: Phytochem. Rev. 9, 147 (2010).

12

Hümmer W., Schreier P.: Mol. Nutr. Food Res. 52, 1381 (2008).

13

Tapas A.R., Sakarkar D.M., Kakde R.B.: Trop. J. Pharm. Res. 7, 1089 (2008).

14

Boots A.W., Haenen G.R.M.M., Bast A.: Eur. J. Pharmacol. 585, 325 (2008).

15

Křivánková L., Vraná A., Gebauer P., Boček P.: J. Chromatogr. A 772, 283 (1997).

16

Churáček J. a kolektiv: Analytická separace látek, SNTL – Nakladatelství technické literatury, Praha 1990.

17

Churáček J., Jandera P.: Úvod do vysokoúčinné kapalinové kolonové chromatografie, SNTL – Nakladatelství technické literatury, Praha 1984.

18

L.R., Kirkland J.J, Glajch J.L.: Practical HPLC Metod development (2nd edition), John Wiley & Sons, Inc., New Jersey 1997.

19

Dong M.W.: Modern HPLC for practicing scientists, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey 2006.

20

Schoenmakers P.J., Billiet H.A.H., de Galan L.: J. Chromatogr. 185, 179 (1979).

21

Schoenmakers P.J., Billiet H.A.H., de Galan L.: J. Chromatogr. 218, 259 (1981).

22

Gritti F., Leonardis I., Shock D., Stevenson P., Shalliker A., Guiochon G.: J. Chromatogr. A 1217, 1589 (2010).

23

http://phenomenex.com/cms400min/litlib/kinetex/kinetex_brochure.pdf (staženo 19.4.2010).

46

24

Snyder L.R.: High-performance liquid chromatography: Advances and perspectives, Academic Press, San Diego 1983.

25

Snyder L.R., Glajch J.L., Kirkland J.J.: J. Chromatogr. 218, 299 (1981).

26

Vacek J., Onofrejová L., Klejdus B., Kubáň V.: Chem. Listy 103, 381 (2009).

27

http://www.separations.eu.tosohbioscience.com/NR/rdonlyres/39E21C5A-8D6B45F2-8E4E-CDCC9B1F5357/0/B09L12B_HILIC_Brochure.pdf (staženo 8.3.2010)

28

Guo Y., Gaiki S.: J. Chromatogr. A 1074, 71 (2005).

29

Alpert A.J.: J. Chromatogr. 499, 177 (1990).

30

Hemström P., Irgum K.: J. Sep. Sci. 29, 1784 (2006).

31

http://www.waters.com/webassets/cms/category/media/detail_page_images/atlantis_ hilic_detail_1.gif (staženo 13.4.2010).

32

Yoshida T.: J. Biochem. Biophys. Methods 60, 265 (2004).

33

Boersema P.J., Mohammed S., Heck A.J.R.: Anal. Bioanal. Chem. 391, 151 (2008).

34

Hsieh Y.: J. Sep. Sci. 31, 1481 (2008).

35

Rodríguez-Medina I.C., Segura-Carretero A., Fernández-Gutiérrez A.: J. Chromatogr. A 1216, 4736 (2009).

36

Kahoun D., Řezková S., Veškrnová K., Královský J., Holčapek M.: J. Chromatogr. A 1202, 19 (2008).

37

Rodríguez-Díaz R.C., Aguilar-Caballos M.P., Gómez-Hens A.: J. Sep. Sci. 29, 2772 (2006).

38

Alessi P., Fermeglia M., Kikic I.: J. Chem. Eng. 34, 236 (1989).

39

Shoji T., Masumoto S., Moriichi N., Kanda T., Ohtake Y.: J. Chromatogr. A 1102, 206 (2006).

40

Ozkorucuklu S.P., Beltrán J.L., Fonrodona G., Barrón D., Alsancak G., Barbosa J.: J. Chem. Eng. Data 54, 807 (2009).

41

Herrero-Martínez J.M., Sanmartin M., Rosés M., Bosch E., Ràfols C.: Electrophoresis 26, 1886 (2005).

47

7 Seznam použitých zkratek AMK – Aminokyselina HILIC – Hydrophilic interaction chromatography (Chromatografie s hydrofilními interakcemi) HPLC – High performance liquid chromatography (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) LC – Liquid chromatography (Kapalinová chromatografie) MF – Mobilní fáze MS – Mass spectrometer (Hmotnostní spektrometr) NP – Normal phase (Normální fáze) NP-HPLC – Normal phase high performance liquid chromatography (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie v systému normálních fází) Q-TOF – Quadrupole time of flight (Hybridní analyzátor založený na kombinaci kvadrupólu a průletového analyzátoru) ROS – Reactive oxygen species (Reaktivní kyslíkové částice) RP – Reverse phase (Reverzní fáze) RP-HPLC – Reverse phase high performance liquid chromatography (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie v systému reverzních fází) TFA – Trifluoroacetic acid (Kyselina trifluoroctová) THF – Tetrahydrofuran UHPLC – Ultrahigh performance liquid chromatography („Ultra“ vysokoúčinná kapalinová chromatografie) UPLC – Ultra performance liquid chromatography („Ultra“ účinná kapalinová chromatografie)

48