12. Genotypering A. Inleiding ∗
Genotypering: o Elk onderzoek naar afwijking in het aantal of de hoedanigheid van de chromosomen of DNA (celkern of mitochondrieën)
∗
Cytogenetisch onderzoek: o Karyotypering o Chromosomenonderzoek
∗
Indicaties voor verrichten van chromosomenonderzoek: o Herhaalde miskramen o Vroeggeboorte of doodgeboren gepaard met misvormingen o Onverklaarde verstandelijke handicap of lichamelijke ontwikkelingsstoornissen o Lichamelijke afwijkingen die Down doen vermoeden o Abnormale geslachtelijke ontwikkeling en functie o
∗
Kans op dragerschap van chromosomale afwijkingen bij gezonde individuen
In-situ-hybridisatie of chromosome painting o Aanwezigheid van specifieke DNA-sequenties op de chromosomen microscopisch zichtbaar maken
B. Bereiding en kleuring van chromosomenpreparaten ∗
Eisen voor succesvol cytogenetisch onderzoek op een bepaald weefsel: o Cellen moeten in deling zijn Dan worden chromosomen zichtbaar o Goede spreiding van chromosomen Om chromosomen goed te kunnen onderscheiden Zo weinig mogelijk achtergrond van cytoplasmatisch en kernmateriaal o Individuele herkenning van elk chromosoom moet mogelijk zijn
Met behulp van specifieke vorm- of kleurenkenmerken (bandering)
∗
Band o Een chromosoomgedeelte dat duidelijk te onderscheiden is van de aangrenzende segmenten door een donkere of lichte kleur
∗
Soorten bandering: o Q-bandering Gekleurd met quinacrine o G-bandering Voorbehandeling met zoutoplossing of bepaald enzym Kleuring met Giemsa o R-bandering Verhitting voor behandeling met Giesma Omgekeerde kleuring als G-bandering Donkere gebieden bevatten DNA dat GC-rijk is
55
1. Profasebandering ∗
Prometafase of profase chromosomen banderen: o 1000 tot 2000 banden zichtbaar
∗
Celsynchronisatie: o Nodig voor: prometafase chromosomen in celkweek te verkrijgen o Proces: Een bepaalde stof wordt aan de kweek toegevoegd Celcycli wordt geblokkeerd in de overgang van G1 naar S
Na zoveel uur wordt de blokkade opgegeven door uitwassen en toedienen van een kweekmedium Groot aantal cellen zal nu de cyclus synchroon voltooien
Daarna fixeren van de delingsstadia (alle cellen zijn in dezelfde delingsstadia)
∗
Wordt ook high-resolution cytogenetica genoemd omdat na kleuring van deze cellen er een grotere resolutie kan bereikt worden
∗
Na de kleuring: o Preparaten onder microscoop geanalyseerd o Digitale opnamen gemaakt van de meta- of prometafasen o
Karyogram maken: rangschikken van de afbeelding van de chromosomen
C. Enkele onderzoeksmethoden ∗
Tijdens S-fase wordt DNA gedupliceerd
∗
Een aantal technieken kunnen dat proces beïnvloeden waardoor het onderzoek van chromosomen in de daaropvolgende mitose sterk wordt verbeterd.
1. DNA-replicatie ∗
Twee typen chromosomen zichtbaar na kleuring van een interfasekern: o Euchromatine Heeft lichte, gedeprivatiseerde DNA o Heterochromatine
∗
Functionele eigenschappen van vorm van heterochromatine o Er vindt geen transcriptie plaats o
∗
Heeft donkere, gecondenseerde DNA
DNA wordt laat gerepliceerd
Soorten heterochromatine o Constitutieve Geen transcriptieactiviteit
Oorzaak: enkel repetitief DNA, dus geen unieke sequentie die nodig is voor eiwit te maken AT- of GC-rijk
Donkere kleur bij G-bandering
56
o
Facultatieve Geen bijzondere samenstelling Bijvoorbeeld: de twee X-chromosomen van een vrouw zijn identiek
Één van de twee X-chromosomen is in elke cel aanwezig als gecondenseerd lichaampje: X-chromatine of Barr-lichaampje
2. Zuster-chromatide-uitwisseling (SCE) ∗
De frequentie van is sterk verhoogd bij: o Bepaalde erfelijke instabiliteit van de chromosomen (Bloom-syndroom) o
∗
Na behandeling met een aantal mutagene of carcinogene stoffen
De uitwisselingen treden hoofdszakelijk op tijdens DNA-synthese (vooral in de eerste helft van de S-fase)
3. Fragile-sites ∗
Fragile site: o Specifieke chromosoom gebied o Kenmerken: Niet gekleurd, variabel in grootte en omvat meestal beide chromatiek Potentieel bij alle cellen van een individu aanwezig en identiek Dominant erfelijk Fragiel: acentrische fragmenten, gedeleteerde chromosomen, enz worden geproduceerd
∗
Bijvoorbeeld: fragiele X-syndroom: het kleine fragile site is duidelijk aan het uiteinde van de lange arm
∗
De aan of afwezigheid van deze sites lijkt niet te correleren met een bepaald fenotype, maar wel met de verworven translocaties die voorkomen bij kwaadaardige processen.
4. Fluorescentie-in-situ-hybridisatie (FISH) 4.1 FISH ∗
Geeft informatie over de aanwezigheid of expressie van specifieke nucleïnezuurfrequenties in de preparaten van delende als niet-delende cellen.
∗
De gekloneerde DNA-fragmenten die als probe worden gebruikt, zijn voorzien van een merkstof waardoor de plaats van de hybridisatie kan gezien worden.
∗
Hybridisatie: o Eis: de strengen van het DNA en de probes moeten enkelstrengs zijn door verhitting o
∗
Probe wordt bij DNA gevoegd, waardoor de complementaire strengen aan elkaar kunnen binden (dus een probe-streng en DNA-streng).
Na FISH: o Chromosomen zichtbaar maken door: Uniforme tegenkleuring (DAPI of propidiumjodide gebruikt)
Banderingstechniek
57
4.2 Probes ∗
Probes: o Biotine gelabelde probe Aan de probe wordt biotine toegevoegd waaraan fluorochromen binden o Fluorochroom gelabelde probe
Fluorochromen worden rechtstreeks aan de probe toegevoegd
∗
Aantal probes dat tegelijk kan bestudeerd worden is afhankelijk van het aantal verschillende fluorochomen (blauw, rood, groen) dat gelijktijdig microscopisch kan herkend worden
∗
Soorten probes die gebruikt kunnen worden bij FISH (figuren pg 258-259): o Probes voor chromosoomspecifieke repetitieve sequenties Voor elke chromosoom is er een of meerdere probe(s) Hybridiseren in de buurt van centromeren Wat te zien? Oplichten van de centromeren Bepalen van het aantal kopieën van een bepaald chromosoom o Painting probes Bestaat uit een groot aantal individuele probes voor één chromosoom Wat te zien? Oplichten van het hele chromosoom Bepalen van structurele afwijkingen waarbij meerdere chromosomen betrokken zijn Unieke sequentieprobes of locusspecifieke probes o
Bepalen van specifieke structurele afwijkingen zoals deletie, breukpunten van translocaties, ...
Voornamelijk opsporen van microdeleties (cri du Chat syndroom, Williams syndroom, Prader Willi syndroom) Subtelomeerprobes Hybridiseren in of in de nabijheid van de voornoemde genenrijke regio
o
∗
Telomeren: o Distale uiteinde van elke chromosoomarm o Bestaat uit veel TTAGGG-sequenties o
∗
Bepalen van deleties in subtelomeergebieden of cryptische translocaties
Belangrijk voor stabiliteit van chromosoom
Cryptische translocaties: o
Translocaties die zelf niet in profasechromosomen na bandering te onderscheiden zijn
4.3 Interfasecytogenetica ∗
Voordeel van FISH: o Toepasbaar om afwijkingen in chromosomen te zoeken bij niet delende cellen (cellen in interfase). o
Van groot belang bij prenatale diagnostiek, onderzoek van tumoren en zaadcellen
58
∗
Prenatale diagnostiek: o Indien met niet met FISH zou kunnen werken, zou men 14 dagen moeten wachten op de uitslag. Dit wordt gereduceerd tot 2 dagen met behulp van FISH. o Wat kan men zien? Aan- of afwezigheid van een aantal numerieke chromosomenafwijkingen. o
∗
Onderzoek van tumoren: o Nadelen bij celkweek van tumoren: Werkt selectie van bepaalde celtypes in de hand Het percentage delende cellen is zeer gering o
∗
Deze onderzoeksuitslagen zijn betrouwbaar, maar vaak worden mozaïeken en structurele afwijkingen gemist waarbij karyotypering kan helpen.
Problemen niet bij FISH omdat je daar kan werken met interfasecellen
Onderzoek van zaadcellen: o Kan men enkel maar onderzoeken in niet-delende toestand o Onderzoek kan tonen: Procentuele verdeling van X en Y dragende zaadcellen Afleiden hoe vaak meiotische non-disjunctie bij spermatogenese voorkomt
5. Comparative genomic hybridisation (CGH) ∗
Variant van FISH
∗
Veel gebruikt in de tumorcytogenetica
∗
Bepalen van het te veel of te weinig chromosomaal materiaal in het te onderzoeken weefsel
∗
Werkwijze: o Genomisch DNA van de patiënt en genomisch DNA van een niet-patiënt worden beide gekoppeld met een ander fluorochroom. o Hybridisatie van beide DNA’s op metafasechromosomen van normale cellen o
∗
Vergelijken van de fluorescentie-intensiteit van beide DNA’s
Resultaten en interpretatie: o Sterkere fluorescentie van het chromosoom Te veel aan materiaal o Verminderde fluorescentie van het chromosoom
∗
Te weinig materiaal
Array-CGH o Variant van CGH o o
Afwijkende signaalintensiteit: verandering van het aantal kopieën van het betreffende stukje DNA (deletie of duplicatie) Voordeel: kleine veranderingen worden nauwkeurig in kaart gebracht
59
6. Chromosoommicrodissectie in combinatie met FISH ∗
Wordt ook micro-FISH genoemd
∗
Gebruikt voor het karakteriseren van: o Markerchromosomen o Ongebalanceerde translocaties o Deleties o
∗
Vier stappen: o Uit een metafasepreparaat wordt een stukje chromosoom of markerchromosoom uitgesneden
o
Dit deel wordt door een polymerasekettingreactie vermeerderd (adhv universele primer) Er wordt een merkstof ingebouwd
o
Het gekenmerkte DNA wordt gehybridiseerd op een controle (normale metafase)
o
∗
Duplicaties
Resultaat: o Fluorescentiesignaal zichtbaar op één of meer chromosomen o Wanneer er een stukje chromosoom van onbekende afkomst werd afgesneden kan men bepalen van welk chromosoom dit oorspronkelijk afkomstig was
D. Afwijkingen van het DNA ∗
Beschermingsmechanismen voor DNA-beschadiging: o Reparatie van DNA o
Apoptose (geprogrammeerde dood)
∗
Mutatie: o Wanneer de verandering/schade in het DNA niet kan worden verwijderd
∗
Opmerking: ontstaanswijze van DNA-mutaties is verschillend van die van chromosomale mutaties!
∗
Processen die een rol hebben in de ontstaanswijze van mutaties in DNA: o DNA-beschadigingen o Replicatiefouten
1. De rol van DNA-beschadigingen ∗
Oorzaken van schade: o Thermodynamische instabiliteit van het DNA-molecuul waarbij twee processen van belang zijn: Deaminering Depurinering o Genotoxische stoffen: Roken Ioniserende straling
Ultraviolet licht
60
∗
Opmerking: o Een DNA-beschadiging kan een mutatie worden tijdens de replicatie o
∗
Het is dus van het grootste belang dat voorafgaand aan de replicatie de DNAbeschadiging wordt hersteld, want eenmaal gefixeerd in een mutatie, is er geen herstel meer mogelijk.
DNA-herstel: o Wat? Een gecoördineerde actie van een groot aantal enzymen o Hoe? Helicases gaan het DNA lokaal ontwinden om het toegankelijk te maken Een specifiek enzym gaat de beschadigde DNA-base uit het DNA verwijderen
∗
Het ontstane gat wordt door het excisieherstelsysteem groter gemaakt en gerepareerd
Apoptose: o Geprogrammeerde celdood waardoor er geen cellen meer blijven voortbestaan met een overmatig aantal mutaties. o Wanneer? Als de cel zoveel DNA-schade heeft opgelopen dat het herstel niet meer mogelijk is. o Is vaak van belang bij verwijdering van potentiële tumorcellen o Nadelige effecten: Overmatige apoptose in weefsels met een gering regeneratief vermogen (bv. hersenen) kan resulteren in een ernstig functieverlies.
2. De rol van replicatiefouten ∗
Kleine kopieerfoutjes kunnen leiden tot mutaties (indien groot worden ze genomische mutaties genoemd).
∗
Ontstaan van genomische mutaties: o Fouten in de verdeling van de chromosomen bij de celdeling of non-disjuncties o
∗
Recombinatiefouten
Recombinatiefouten o Recombinatie gebeurt tijdens de meiose: grote stukken DNA worden uitgewisseld tussen homologe chromosomen o o
Bij mutaties gaat er dan een chromosoom zijn waar het DNA dubbel is, terwijl dat deel van het DNA ontbreekt in het andere chromosoom. Gevolgen: Geslachtscellen met een deletie of duplicatie
Als het geen letale mutatie is kan het door gegeven worden aan het nageslacht
61
E. Effecten van mutaties 1. Substituties in de coderende sequenties ∗
Samenvatting pagina 39-40
2. Mutaties in de niet-coderende gebieden ∗
Genoom: o Klein deel coderende DNA-stukken o Groot deel niet-coderende of niet-regulerende DNA-stukken
∗
Mutaties in niet-coderende gebieden die GEEN fenotypisch effect hebben: o In de loop van de opeenvolgende generaties zal er variatie in de DNA-sequentie van deze gebieden ontstaan. o
∗
Deze variatie kan gebruikt worden om de overerving van stukken chromosoom in families op te volgen en te vergelijken met overerving van een erfelijke eigenschap op ziektebeeld.
Mutaties in niet-coderende gebieden die WEL fenotypisch effect hebben: o Sequenties kunnen betrokken zijn bij: Regulatie van de expressie van genen Splicing van pre-messenger RNA o Regulerende sequenties bevinden zich over het algemeen aan de 5’ kant o
Regulerende sequenties hebben basenvolgorde waaraan specifieke eiwitten (transcriptiefactoren) kunnen binden, deze kunnen ervoor zorgen dat: Transcriptie van een gen versterkt of mogelijk gemaakt wordt (enhancers) Transcriptie van een gen verhindert wordt (repressors)
o
Mutaties in deze gebieden kunnen dus verandering brengen in de eiwitbinding en daardoor de expressie van het betrokken gen positief of negatief beïnvloeden.
3. Mutaties in splice-sites ∗
Mutaties kunnen ontstaan op twee plaatsen: introns en exons
∗
Introns o Aan de uiteinden: DNA-sequenties die instaan voor herkenning van exons en introns => staan in voor de correcte splicing van het gen o Soorten: Splice-donor: aan de 5’ kant van intron Splice-acceptor: aan de 3’ kant van intron Branch-point-sequentie: op enige afstand van de 3’ kant van het intron o Bij mutaties in deze sequenties zal er een foutieve splicing ontstaan: Korter mRNA Frameshift wanneer ontbrekende deel geen veelvoud van drie is
∗
Exons: mutaties die leiden tot o Ontstaan van nieuwe splice-sites => deel van exon als intron herkend o Een stopcodon in een exon => probleem bij herkenning exon o
Een splice-site midden in het intron => deel van het intron wordt herkend als een exon
62
4. Dynamische mutaties ∗
Anticipatie: o Een aantal ziektebeelden die in de volgende generaties steeds op jongere leeftijd optreedt en waarbij er soms ook een toename is in ernst van het ziektebeeld.
∗
Oorzaak: o Dynamische mutatie: toename in het aantal herhaalde eenheden in trinucleotiderepeats in of dichtbij genen. o
Als door de replicatiefouten de lengte van de repeat toeneemt, kan deze sequentie boven een bepaalde lengte instabiel worden. En boven een bepaalde drempel komt het ziektebeeld tot uiting.
5. Mutaties en dominante of recessieve overerving ∗
De begrippen dominant en recessief hebben betrekking op de expressie/fenotype, dus eigenlijk op een erfelijke eigenschap of ziektebeeld.
∗
Effect van mutaties: o Afhankelijk van de functie van het betrokken gen
∗
Mutaties in genen die coderen voor een enzym: o Recessief overervend beeld o
∗
Mutaties in genen die coderen voor structurele eiwitten: o Dominante overerving o
∗
Door: het ongemuteerde gen op het andere chromosoom voldoende normaal product levert, terwijl het gemuteerde gen meestal niet storend werkt
Door: het defecte eiwit is in de intracellulaire matrix ingebouwd
Er zijn ook genen bekent die zowel dominant als recessief kunnen optreden
6. Mitochondriële mutaties ∗
Cel bevat: o Twee kopieën van het genomisch DNA o
∗
Honderden kopieën van het mitochondriëel DNA
Mutaties in het mitochondriëel DNA: o Meestal niet direct effect hebben door hun grote aantal o Erfelijkheid wordt bepaald door het percentage gemuteerde kopieën o Het aantal mutaties kan toenemen in de loop van de tijd: In opeenvolgende generaties Binnen één individu tijdens opeenvolgende celdelingen
63
